ES2678211T3 - Conjugados de señalización y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar una primera diana en una muestra biológica, que comprende: poner en contacto la muestra biológica con una primera sonda de detección que comprende un fragmento de oligonucleótido o un anticuerpo de una especie particular capaz de unirse específicamente a la primera diana, en la que el fragmento de oligonucleótido incluye un hapteno; poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de marcaje que incluye un anticuerpo antiespecie o antihapteno acoplado a una primera enzima, en el que la primera enzima es una 10 oxidorreductasa o peroxidasa, y en el que el primer conjugado de marcaje, mediante su inclusión de un anticuerpo antiespecie o antihapteno, se une selectivamente a la primera sonda de detección; poner en contacto la muestra biológica con un primer conjugado de señalización que comprende un primer resto reactivo latente y un primer resto cromógeno; iluminar la muestra biológica con una fuente de luz espectralmente estrecha que tiene una emisión espectral con una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 250 nm; y detectar la primera diana detectando una primera señal coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, añil o violeta, estando asociada la primera señal coloreada asociada con una absorbancia espectral con el primer resto cromógeno del primer conjugado de señalización; en la que la primera enzima cataliza la conversión del primer resto reactivo latente en un primer resto reactivo, que se une covalentemente a la muestra biológica proximalmente a o directamente sobre la primera diana al reaccionar con un residuo de tirosina de la muestra biológica, el primer conjugado de marcaje, la primera sonda de detección o combinaciones de los mismos; en el que el primer resto reactivo latente tiene la fórmula general **Fórmula** en la que R25 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, éter, amina y amina sustituida; R26 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -ORm, -NRm y -SRm, en la que m es 1-20; n es 1-20; Z se selecciona del grupo que consiste en oxígeno, azufre y NRa en la que Ra se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alifático, arilo, y alquilarilo; y en el que la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromógeno del primer conjugado de señalización tiene una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 250 nm.

Description

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DESCRIPCION

Conjugados de senalizacion y procedimientos de uso CAMPO

La presente divulgacion se refiere a conjugados, composiciones, procedimientos y kits utiles en la realization de ensayos para detectar una o mas dianas en una muestra biologica.

ANTECEDENTES

La inmunohistoquimica, o IHC, se refiere al proceso de deteccion, localizacion y cuantificacion de antigenos, tales como una proteina, en una muestra biologica, tal como un tejido, y usando restos de union especificos, tales como anticuerpos especificos para los antigenos particulares. Esta tecnica de deteccion tiene la ventaja de poder mostrar exactamente donde se encuentra una proteina dada dentro de la muestra de tejido. Tambien es una forma eficaz de examinar los tejidos en si mismos. La hibridacion in situ, o ISH, se refiere al proceso de deteccion, localizacion y cuantificacion de acidos nucleicos. Tanto la IHC como la ISH se pueden realizar en diversas muestras biologicas, tales como tejido (por ejemplo, congelado en fresco, incluido en parafina y fijado con formol) y muestras citologicas. Tras el reconocimiento de las dianas, tanto si las dianas son acidos nucleicos o antigenos, el evento de reconocimiento se puede detectar mediante el uso de varias etiquetas (por ejemplo, cromogenica, fluorescente, luminiscente, radiometrics).

La hibridacion in situ (ISH) en tejido incluye la deteccion de un acido nucleico mediante la aplicacion de una cadena complementaria de acido nucleico a la que esta acoplada una molecula indicadora. La visualizacion de la molecula indicadora permite a un observador localizar secuencias especificas de ADN o ARN en una poblacion de celulas heterogeneas, como una muestra histologies, citologica o ambiental. Las tecnicas de ISH disponibles actualmente incluyen hibridacion in situ con plata (SISH), hibridacion cromogenica in situ (CISH) e hibridacion fluorescente in situ (FISH).

El interrogatorio de la expresion genica en secciones de tejido mediante PCR o micromatrices se ha utilizado con exito para clasificar la probabilidad de recidiva tumoral de los pacientes e identificar a aquellos que se pueden beneficiar de terapias especificas. Sin embargo, la especificidad tisular y el contexto celular, que mejoran el valor de los ensayos basados en tejidos, se pierden durante la extraction de ARNm para PCR o analisis de micromatrices. Ademas, se pueden generar resultados falsos positivos o negativos debido a la presencia de celulas no tumorales “contaminantes” en la section. Como resultado, existe la necesidad de ensayos de hibridacion in situ automatizados que se dirijan a ARNm (ISH-ARNm) que permitan una evaluation robusta y reproducible de la expresion de biomarcadores mientras se preserva el contexto y especificidad tisular, asi como las relaciones entre celulas.

Los sustratos cromogenos se han utilizado ampliamente para inmunohistoquimica desde hace muchos anos y para la hibridacion in situ mas recientemente. La deteccion cromogenica ofrece un procedimiento de deteccion sencillo y rentable. Tradicionalmente, los sustratos cromogenos precipitan cuando son activados por la enzima apropiada. Es decir, la sustancia cromogena tradicional se convierte de un reactivo soluble en un precipitado coloreado insoluble al entrar en contacto con la enzima. El precipitado coloreado resultante no requiere ningun equipo especial para su procesamiento o visualizacion. Hay varias cualidades que comparten los sustratos cromogenos exitosos para IHC o ISH. Primero, la sustancia debe precipitar como una sustancia coloreada, preferentemente con una absortividad molar muy alta. El sustrato enzimatico deberia tener una alta solubilidad y estabilidad del reactivo, pero los productos cromogenos precipitados deberian ser muy insolubles, preferentemente en soluciones tanto acuosas como alcoholicas. Las tasas de renovation de la enzima deben ser muy altas para una gran amplificacion de la serial de una sola enzima en un corto periodo de tiempo. Las limitaciones particulares de las tecnicas cromogenicas actuales incluyen la capacidad de multiplexacion, la incompatibilidad con el procesamiento posterior a la tincion (por ejemplo, lavados con disolvente, secado, tincion posterior) y las limitadas opciones de color.

Para ensayos in situ, tales como ensayos de ISH y ensayos de IHC, de muestras tisulares y citologicas, especialmente ensayos multiplexados de dichas muestras, es muy deseable identificar y desarrollar procedimientos que proporcionen resultados deseables sin interferencia de fondo. La amplificacion de la serial de tiramida (TSA) es un procedimiento conocido basado en la deposicion catalizada de indicadores (CARD). La patente de EE. UU. n.° 5.583.001 divulga un procedimiento para la deteccion o cuantificacion de un analito usando un sistema de activacion de enzima dependiente de analito que se basa en la deposicion catalizada de indicadores para amplificar la serial indicadora potenciando la catalisis de una enzima en un procedimiento CARD o TSA haciendo reaccionar la molecula de fenol marcada con una enzima. Como resultado, la patente de EE. UU. n.° 5.583.001 A divulga el concepto de amplificacion de la serial de tiramida “clasico”, es decir, la activacion de enzima dependiente de analito de un conjugado de tiramida a una forma activada que se deposits y enriquece cerca del analito, enriqueciendo o amplificando de este modo, respectivamente, una serial indicadora conjugada con esa tiramida.

El documento WO 2008/128352 A1 divulga la deteccion de analitos en muestras biologicas utilizando agentes de union especificos de analito inmovilizados. El analito se detecta mediante difraccion optica despues de la deposicion de

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derivados de tiramida marcados activados por enzimas en el sitio en el que el analito interactua con el agente de union. Ademas de la difraccion optica, el documento WO 2008/128352 A1 sugiere el uso de la absorbancia, la fluorescencia, la dispersion Raman, la fosforescencia, la luminiscencia, la radioactividad o la resonancia de plasmon superficial para detectar la serial especifica del analito.

El documento WO 2010/094283 A1 divulga conjugados de marcadores detectables y sustratos de peroxidasa para detectar dianas moleculares en muestras biologicas, en particular para la deteccion de dianas que tienen actividad de peroxidasa. En presencia de una actividad de peroxidasa en la muestra, los conjugados se convierten de una forma soluble en agua a un precipitado insoluble que se deposits cerca del sitio diana. De acuerdo con el documento WO 2010/094283 A1, se puede utilizar cualquier molecula fluorescente, luminiscente, bioluminiscente o radioactiva como marcador.

El documento WO 2008/133729 A2 divulga procedimientos para la deteccion secuencial de multiples dianas en una muestra biologies usando una sonda de fluorescencia especifica para cada diana. Despues de la deteccion de una diana dada, la sonda se inactiva con un agente oxidante y la sonda de fluorescencia para la siguiente diana se une, y el proceso se repite hasta que se detectan todas las dianas. En un modo de realizacion, el documento sugiere una amplificacion de la serial impulsada por enzimas para detectar las dianas, por ejemplo, mediante la deposicion de tiramida usando peroxidasa de rabano picante.

El documento WO 2009/012140 A2 divulga procedimientos para detectar los estados de activacion de componentes de rutas de transduccion en celulas tumorales. En particular, los extractos celulares de celulas aisladas se incuban con anticuerpos de captura especificos de analito que se inmovilizan sobre un soporte solido. El estado de activacion de cualquiera de los analitos capturados se determina finalmente mediante la deteccion de la union posterior de anticuerpos dependientes del estado de activacion que son especificos para los analitos correspondientes. De acuerdo con el documento WO 2009/012140 A2, los anticuerpos dependientes del estado de activacion unidos se pueden detectar con un fluoroforo o un reactivo cromogeno despues de un paso de amplificacion de la serial de tiramida impulsada por peroxidasa de rabano picante.

El documento WO 2012/003476 A2 divulga conjugados de hapteno que incluyen un hapteno, un conector opcional y un resto arilo activable por peroxidasa. Tambien se divulgan procedimientos en los que una peroxidasa que es capaz de reaccionar con el resto arilo activable por peroxidasa se une a una diana en una muestra y, en presencia de peroxido, el conjugado de hapteno forma un enlace covalente de forma directa o proximal a la peroxidasa inmovilizada, y la diana se detecta finalmente al detectar el hapteno con una etiqueta detectable.

Si bien se sabe que la amplificacion de la serial de tiramida amplifica la visibilidad de las dianas, tambien se asocia con una tincion de fondo elevada (por ejemplo, amplificacion de eventos de reconocimiento no especificos).

SUMARIO

En el presente documento se divulgan procedimientos para usar conjugados de cromogeno para detectar dianas en las muestras. En modos de realizacion preferentes, las dianas son de una muestra biologica. Dianas ilustrativas incluyen proteinas y acidos nucleicos que se analizan en el contexto de citologia o anatomia patologica. Un aspecto de la divulgacion es que los conjugados de cromogeno son totalmente compatibles con los instrumentos y procedimientos de tincion automatizada de portaobjetos. Los conjugados de cromogeno permiten una deteccion anteriormente inalcanzable de la sensibilidad y la capacidad de multi plexacion, entre otras ventajas, lo que representa un avance significativo en el estado de la tecnica.

En modos de realizacion ilustrativos, un procedimiento para detectar una diana en una muestra biologica incluye poner en contacto la muestra biologica con una sonda de deteccion, poner en contacto la muestra biologica con un conjugado de marcaje y poner en contacto la muestra biologica con un conjugado de senalizacion. El conjugado de marcaje incluye una enzima. El conjugado de senalizacion incluye un resto reactivo latente y un resto cromogeno. La enzima cataliza la conversion del resto reactivo latente en un resto reactivo que se une covalentemente a la muestra biologica de forma proximal a o directa sobre la diana. El procedimiento incluye ademas iluminar la muestra biologica con luz y detectar la diana a traves de la absorbancia de la luz por el resto cromogeno del conjugado de senalizacion. En un modo de realizacion, el resto reactivo reacciona con un residuo de tirosina de la muestra biologica, el conjugado de enzima, la sonda de deteccion o combinaciones de los mismos.

En modos de realizacion ilustrativos, la sonda de deteccion es una sonda de oligonucleotido o una sonda de anticuerpo. En modos de realizacion ilustrativos adicionales, el conjugado de marcaje incluye un anticuerpo acoplado a la enzima. Las enzimas ilustrativas incluyen oxidorreductasas o peroxidasas. Un anticuerpo ejemplar para el conjugado de marcaje seria un anticuerpo antiespecie o antihapteno. La sonda de deteccion puede incluir un hapteno seleccionado del grupo que consiste en un hapteno de oxazol, hapteno de pirazol, hapteno de tiazol, hapteno de nitroarilo, hapteno de benzofurano, hapteno de triterpeno, hapteno de urea, hapteno de tiourea, hapteno de rotenoide, hapteno de cumarina, hapteno de ciclolignano, hapteno de dinitrofenilo, hapteno de biotina, hapteno de digoxigenina, hapteno de fluoresceina y hapteno de rodamina. En otros ejemplos, la sonda de deteccion es un anticuerpo monoclonal derivado de una segunda especie tal como cabra, conejo, raton o similar. El conjugado de marcaje se configura,

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mediante su inclusion de un anticuerpo antiespecie o antihapteno para unirse selectivamente a la sonda de deteccion.

Un aspecto de la presente divulgacion es que los conjugados de cromogeno se pueden configurar para absorber luz de forma mas selectiva que los cromogenos disponibles tradicionalmente. La deteccion se Neva a cabo mediante la absorbancia de la luz por el conjugado de senalizacion; por ejemplo, la absorbancia de al menos aproximadamente un 5 % de la luz incidente facilitaria la deteccion de la diana. En otras manchas mas oscuras, se absorberia al menos aproximadamente un 20 % de la luz incidente. La absorbancia no uniforme de la luz dentro de los espectros visibles da como resultado que el resto cromoforo aparezca coloreado. Los conjugados de senalizacion divulgados en el presente documento pueden aparecer coloreados debido a su absorbancia; los conjugados de senalizacion pueden proporcionar cualquier color cuando se usan en el ensayo, con ciertos colores particulares que incluyen rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta dependiendo de la absorbancia espectral asociada con el resto de cromoforo. De acuerdo con otro aspecto, los restos cromoforos pueden tener absorbancias espectrales mas estrechas que las absorbancias de cromogenos usados tradicionalmente (por ejemplo, DAB, Fast Red, Fast Blue). En modos de realizacion ilustrativos, la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromoforo del primer conjugado de senalizacion tiene una anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm.

Las absorbancias espectrales estrechas permiten que el resto cromoforo del conjugado de senalizacion se analice de forma diferente que los cromogenos tradicionales. Si bien tiene caracteristicas mejoradas en comparacion con los cromogenos tradicionales, la deteccion de los conjugados de senalizacion sigue siendo sencilla. En modos de realizacion ilustrativos, la deteccion comprende usar un microscopio de campo claro o un escaner digital equivalente. Las absorbancias espectrales estrechas permiten la multiplexacion cromogenica a un nivel que va mas alia de la capacidad de los cromogenos tradicionales. Por ejemplo, los cromogenos tradicionales son en cierto modo aplicaciones duplex de forma rutinaria (por ejemplo, Fast Red y Fast Blue, Fast Red y Black (plateado), Fast Red y DAB). Sin embargo, las aplicaciones triplex o tricolores, o mayores, son atipicas, ya que es dificil distinguir un cromoforo de otro. En modos de realizacion ilustrativos de la tecnologia divulgada en la actualidad, el procedimiento incluye detectar de dos a al menos aproximadamente seis dianas diferentes usando diferentes conjugados de senalizacion o combinaciones de los mismos. En un modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz comprende iluminar la muestra biologica con una fuente de luz espectralmente estrecha, teniendo la fuente de luz espectralmente estrecha una emision espectral con una segunda anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm. En otro modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz incluye iluminar la muestra biologica con una fuente de luz LED. En otro modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz incluye iluminar la muestra biologica con una fuente de luz filtrada.

En un modo de realizacion, el conjugado de senalizacion se deposits covalentemente de forma proximal a la diana a una concentration superior a aproximadamente 1 x 1011 moleculas por cm2*pm hasta aproximadamente 1 x 1016 moleculas por cm2*pm de la muestra biologica. En un modo de realizacion, la primera diana y la segunda diana son acidos nucleicos geneticos. La deteccion la primera diana a traves de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de senalizacion incluye la deteccion de una primera serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta, estando asociada la primera serial coloreada asociada con la absorbancia espectral con el primer resto cromogeno del primer conjugado de senalizacion. La deteccion la segunda diana a traves de la absorbancia de la luz por el segundo conjugado de senalizacion incluye la deteccion de una segunda serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta, estando asociada la segunda serial coloreada asociada con la absorbancia espectral con el segundo resto cromogeno del segundo conjugado de senalizacion. Detectar una superposition en proximidad a traves de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de senalizacion que se superpone en proximidad con el segundo conjugado de senalizacion, de modo que una tercera serial coloreada se asocie con la absorbancia espectral superpuesta de la primera absorbancia espectral y la segunda absorbancia espectral. De acuerdo con un ejemplo, este tercer color indica una disposition genetica normal y el primer y el segundo color indican una reordenacion o translocation genetica.

Los conjugados de senalizacion estan configurados para unirse de forma proximal o directa a la una o mas dianas en la muestra biologica y estan configurados para proporcionar una serial de campo claro.

En modos de realizacion divulgados particulares, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende la absorcion de un 5 % o mas de luz incidente. En otro modo de realizacion de la composition, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende la absorcion de un 20 % o mas de luz incidente. En modos de realizacion divulgados particulares, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un pico de absorbancia con una Amax. de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 800 nm. En un modo de realizacion, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un pico de absorbancia con una Amax de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 750 nm. En otro modo de realizacion, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un pico de absorbancia con una Amax de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 700 nm. En otro modo de realizacion mas, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un primer pico de absorbancia con una primera Amax de

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entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 500 nm y un segundo pico de absorbancia con una segunda Amax. de entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 800 nm. En otro modo de realizacion, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un primer pico de absorbancia con una primera Amax de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 500 nm y un segundo pico de absorbancia con una segunda Amax de entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 750 nm. En otro modo de realizacion mas, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un primer pico de absorbancia con una primera Amax de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 450 nm y un segundo pico de absorbancia con una segunda Amax de entre aproximadamente 450 nm y aproximadamente 600 nm. En otro modo de realizacion, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende tener un primer pico de absorbancia con una primera Amax de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 450 nm y un segundo pico de absorbancia con una Amax de entre aproximadamente 600 nm y aproximadamente 800 nm.

En modos de realizacion divulgados particulares, una pluralidad de conjugados de senalizacion estan configurados para proporcionar un color opticamente evidente bajo iluminacion de campo claro. El color opticamente evidente se selecciona entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil, violeta y mezclas de los mismos. En modos de realizacion divulgados particulares, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende impartir un primer color opticamente diferenciado y un segundo color opticamente diferenciado. En un modo de realizacion, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende impartir un tercer color opticamente diferenciado del primer color opticamente diferenciado y del segundo color opticamente diferenciado. En otro modo de realizacion mas, “configurado para proporcionar una serial de campo claro” comprende impartir un cuarto color opticamente diferenciado del primer color opticamente diferenciado, el segundo color opticamente diferenciado y el tercer color opticamente diferenciado.

En modos de realizacion divulgados particulares, la muestra biologica es una muestra de tejido o citologia. La muestra de tejido o citologia, tal como una muestra incluida en parafina y fijada en formol, se puede montar en un portaobjetos de vidrio de microscopio para su uso con un instrumento de tincion automatizada de portaobjetos. En ciertos modos de realizacion, la muestra biologica comprende una primera diana y la pluralidad de conjugados de senalizacion estan situados proximalmente a la primera diana. La muestra biologica tambien puede comprender ademas una segunda diana y una segunda poblacion de la pluralidad de conjugados de senalizacion que estan situados proximalmente a la segunda diana, en la que la primera diana y la segunda diana son diferentes. En un modo de realizacion se usa una primera sonda de deteccion para detectar una primera diana y se usa una segunda sonda de deteccion para detectar la segunda diana.

Los anteriores y otros objetos, caracteristicas y ventajas de la invencion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que precede con referenda a las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

El documento de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujo(s) en color seran proporcionadas por la Oficina previa peticion y pago de la tasa necesaria.

La figura 1 es un diagrams de flujo que proporciona las etapas de un modo de realizacion del procedimiento.

Las figuras 2(A-B) son diagramas esquematicos de modos de realizacion de dos conjugados de senalizacion. La figura 2(A) ilustra un conjugado de senalizacion que comprende un resto reactivo latente y un resto cromoforo. La figura 2(B) ilustra un conjugado de senalizacion alternativo que comprende ademas un conector.

Las figuras 3(A-F) son diagramas esquematicos que ilustran una forma de detectar una diana en una muestra. La figura 3(A) muestra una sonda de deteccion que se une a la diana. La figura 3(B) muestra un conjugado de marcaje que se une a la sonda de deteccion. La figura 3(C) muestra un conjugado de senalizacion que se deposits enzimaticamente sobre la muestra. La figura 3(D) muestra un modo de realizacion alternativo en el que se usa una sonda de deteccion basada en anticuerpo para detectar una diana diferente. La figura 3(E) muestra un enfoque para detectar una diana usando un conjugado de amplificacion. La figura 3(F) muestra que el conjugado de amplificacion se unio a la muestra y se marco con un conjugado de marcaje secundario.

Las figuras 4(A-B) son diagramas esquematicos que ilustran (A) una representacion de seccion transversal de la distribucion de conjugados de marcaje proximales a la diana (T) y (B), un grafico que representa la relacion entre potencia de radiacion incidente (Po) a traves de la muestra mostrada en (A) y la potencia de radiacion transmitida (P) a traves de la muestra, en el que el eje y representa la potencia de radiacion y el eje x representa la distancia lineal a traves de la muestra.

Las figuras 5(A-B) son esquemas que muestran las diferencias entre las senales obtenidas con cromogenos y las senales obtenidas con fluoroforos. La figura 5(A) ilustra la deteccion de un cromogeno en la que se detecta la luz transmitida. La figura 5(B) ilustra la deteccion de un fluoroforo en la que se detecta la luz emitida.

Las figuras 6(A-B) son imagenes que ilustran las caracteristicas de color analizadas en el presente documento. La

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figura 6(A) es una rueda de colores que representa la relation entre un color observado y la figura 6(B) es una imagen de la radiation absorbida para el conjugado de senalizacion.

Las figuras 7(A-B) son imagenes que ilustran los resultados de un modo de realizacion particular del procedimiento divulgado. La figura 7(A) es un grafico que ilustra el espectro de absorcion de un conjugado 5-TAMRA-tiramida, y la figura 7(B) es una microfotografia que ilustra una muestra biologica que tiene dianas detectadas por este conjugado de senalizacion particular.

Las figuras 8(A-B) son imagenes que ilustran los resultados obtenidos de un modo de realizacion particular del procedimiento divulgado. La figura 8(A) es una microfotografia de una tincion doble de dos sondas genicas en una section de tejido pulmonar que analiza los reordenamientos de ALK asociados con cancer de pulmon no microcitico y la figura 8(B) es un espectro de UV-Vis de Fast Red y Fast Blue en soluciones de acetato de etilo, asi como de las trazas obtenidas de muestras de tejido.

Las figuras 9(A) y 9(B) son graficos de absorbancia frente a longitud de onda e ilustran los dos conjuntos de trazas proporcionados en la figura 8(B). La figura 9(A) ilustra las trazas obtenidas de muestras de tejido, mientras que la figura 9(B) ilustra trazas obtenidas a partir de soluciones de acetato de etilo de Fast Red y Fast Blue.

Las figuras 10(A-B) son imagenes y un esquema que ilustra la diferencia entre una deteccion cromogenica doble de ISH, en la que la figura 10(A) muestra un protocolo de deteccion combinado SISH/Red y la figura 10(B) muestra un conjugado de senalizacion purpura y amarillo como se describe en el presente documento. La serial producida al combinar estos dos cromogenos se detecta como un tercer color unico.

Las figuras 11 (A-B) son microfotografias que muestran dos ejemplos de deposition proximal de dos colores para crear un tercer color visualmente diferenciado.

Las figuras 12(A-C) son microfotografias que muestran el uso de iluminacion LED para separar la serial de una doble tincion cromogenica en la que la figura 12(A) muestra la iluminacion con luz blanca, la figura 12(B) muestra la iluminacion con luz verde y la figura 12(C) muestra la iluminacion con luz roja.

Las figuras 13(A-B) son microfotografias que muestran la figura 13(A) un portaobjetos de control al que no se anadio BSA-BF y la figura 13(B) un portaobjetos en el que BSA-BF se habia unido a la muestra.

Las figuras 14(A-B) son microfotografias que muestran una muestra tenida con un conjugado de senalizacion, la figura 14(A) sin potenciacion de tirosina y la figura 14(B) con potenciacion de tirosina.

Las figuras 15(A-B) son microfotografias que muestran una IHC de HER2 (4B5) en xenoinjertos Calu-3 tenidos con dos conjugados de senalizacion diferentes que tienen los espectros de absorcion mostrados en la figura 16.

La figura 16 ilustra los espectros de absorbancia de dos conjugados de senalizacion en solution y como se usan para tenir las muestras mostradas en las figuras 15(A-B).

Las figuras 17(A-E) muestran microfotografias (figuras 17(A-D)) de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 17(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada.

Las figuras 18(A-E) muestran microfotografias (figuras 18(A-D)) de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 18(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada.

Las figuras 19(A-E) muestran microfotografias (figuras 19(A-D)) de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 19(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada.

Las figuras 20(A-E) muestran microfotografias (figuras 20(A-D)) de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 20(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada.

Las figuras 21 (A-B) son microfotografias de una muestra de tejido de amigdala que comprende linfocitos B normales no cancerosos, en las que la figura 21(A) es una vista ampliada 40x de una tincion positiva para ARNm KAPPA (marron) y LAMBDA (purpura) y la figura 21(B) es una vista ampliada 20x de la misma.

La figura 22 es un esquema que muestra los numeros de copias de Kappa / Lambda esperados asociados con diferentes tipos de linfomas de linfocitos B no Hodgkins.

Las figuras 23(A-B) son microfotografias, en las que la figura 23(A) es una primera muestra de tejido de linfoma que

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muestra una tincion doble de ARNm KAPPA (marron) y ARNm LAMBDA (purpura, mmimamente observada) que muestra muy pocas celulas que expresan ARNm LAMBDA, y la figura 23(B) es una segunda muestra de tejido de linfoma que muestra una tincion doble de ARNm KAPPA (marron, mmimamente observado) y ARNm LAMBDA (purpura) que muestra muy pocas celulas que expresan ARNm KAPPA.

Las figuras 24(A-B) son microfotografias que demuestran la doble ISH cromogenica de ARNm para una muestra que resultaria confusa para los procedimientos moleculares de diagnostico.

Las figuras 25(A-B) son microfotografias de muestras de tejido mamario, en las que la figura 25(A) es una tincion negativa para ARNm de ACTB y la figura 25(B) es una tincion positiva para ARNm de ACTB.

Las figuras 26(A-C) son microfotografias de muestras de tejido mamario que muestran tincion doble de ACTB, en las que la figura 26(A) es una tincion negativa (0+) para ARNm de HER2, la figura 26(B) es una tincion positiva (1/2+) para ARNm de HER2 y la figura 26(C) es una tincion positiva (3+) para ARNm de HER2.

La figura 27 son datos de varios bloques de tejido que comparan los resultados del analisis por ISH de HER2, el analisis por IHC de HER2 y la ISH bicolor de ARNm de HER2.

Las figuras 28(A-B) son microfotografias que ilustran la deteccion directa del gen PTEN usando un ensayo de ISH de ADN que incorpora la deposicion directa de un conjugado Rod-tiramida. La figura 28(A) es una microfotografia con un aumento de 40x y la figura 28(B) es una microfotografia de un area separada con un aumento de 63x.

La figura 29 es una microfotografia que ilustra la deteccion directa de una diana de ERG5' en celulas de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 usando un ensayo de ISH de ADN con un conjugado de senalizacion Rod- ti ramida.

La figura 30 es una microfotografia que ilustra la deteccion directa de una diana de ERG3' en celulas de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 usando un ensayo de ISH de ADN con un conjugado de senalizacion DABSYL-tiramida.

La figura 31 es una microfotografia que ilustra la deteccion amplificada de las dianas del gen ERG3' y ERG5' en celulas de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 usando un ensayo de ISH de ADN con un conjugado de senalizacion Rod-tiramida y un conjugado de senalizacion DABSYL-tiramida.

La figura 32 es una microfotografia obtenida usando un ensayo de ISH de ADN multiplexado que muestra el reordenamiento del gen ERG en celulas epiteliales de cancer de prostata VCaP.

La figura 33 es una microfotografia obtenida usando un ensayo de ISH de ADN multiplexado que ilustra la reordenacion del gen que codifica la cinasa del linfoma anaplasico en un sedimento de celulas CARPUS.

La figura 34 es una microfotografia obtenida usando un ensayo de ISH de ADN multiplexado que ilustra el reordenamiento del gen que codifica la cinasa del linfoma anaplasico en una seccion de adenocarcinoma de pulmon.

Las figuras 35(A-C) son microfotografias que ilustran la deteccion directa de dianas genicas en celulas Calu-3 usando un ensayo de ISH de ARNm. La figura 35(A) muestra la deteccion de la diana de ARN 18S usando un conjugado Rod- tiramida. La figura 35(B) muestra la deteccion de la diana de ARN 18S usando deposicion directa de un conjugado DABSYL-tiramida. La figura 35(C) ilustra un doble ensayo usando el conjugado DABSYL-tiramida y el conjugado Rod- ti ramida.

La figura 36 es una microfotografia que ilustra la deteccion directa de proteinas HER2 y P53 en celulas Calu-3 usando un ensayo de IHC multiplexado. HER2 se detecta por deposicion directa del conjugado DABSYL-tiramida. P53 se detecta por deposicion directa del conjugado Rodamina-tiramida.

DESCRIPCION DETALLADA

I. Definiciones y abreviaturas

A menos que se indique lo contrario, los terminos tecnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de terminos comunes en biologia molecular se pueden encontraren Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); y otras referencias similares.

Tal como se usan en el presente documento, las formas del singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra “o” tiene por objeto incluir “y” a

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menos que el contexto indique claramente lo contrario. El termino “incluye” se define de forma inclusiva, de modo que “incluye A o B” significa que incluye A, B o A y B. Ademas, tambien se entiende que todos los tamanos de nucleotidos o tamanos de aminoacidos, y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, dados para los acidos nucleicos o polipeptidos u otros compuestos son aproximados, y se proporcionan con fines descriptivos. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la presente divulgacion, se describen a continuacion procedimientos y materiales adecuados.

En caso de conflicto con la divulgacion de publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluidas las explicaciones de los terminos. Ademas, los materiales, procedimientos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

En el presente documento se divulgan una o mas formulas quimicas genericas. Para las formulas generales proporcionadas en el presente documento, si no se indica un sustituyente, un experto en la tecnica apreciara que el sustituyente es hidrogeno. Un enlace que no esta conectado a un atomo, pero se muestra, por ejemplo, extendiendose hacia el interior de un sistema de anillo, indica que la posicion de dicho sustituyente es variable. Una linea curva trazada a traves de un enlace indica que alguna estructura adicional esta unida a esa posicion, tipicamente un conector o el grupo o resto funcional utilizado para unir dos restos (por ejemplo, un cromoforo y una tiramida o derivado de tiramida). Ademas, si no se indica una estereoquimica para los compuestos que tienen uno o mas centros quirales, se incluyen todos los enantiomeros y diastereomeros. De forma similar, para una recitation de grupos alifaticos o alquilo, tambien se incluyen todos sus isomeros estructurales. A menos que se indique lo contrario, los grupos R (por ejemplo, R1-R24) en las formulas generales que figuran a continuacion se seleccionan independientemente de: hidrogeno; acilo; aldehido; alcoxi; alifatico, particularmente alifatico inferior (por ejemplo, alquilo C1-10, alquileno C1-10, alquino C1-10); alifatico sustituido; heteroalifatico (por ejemplo, cadenas organicas que tienen heteroatomos, tales como oxigeno, nitrogeno, azufre, alquilo, particularmente alquilo que tiene 20 o menos atomos de carbono, e incluso mas tipicamente alquilo inferior que tiene 10 o menos atomos, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo); alquilo sustituido, tal como haluro de alquilo (por ejemplo, -CX3 donde X es un haluro, y combinaciones de los mismos, ya sea en la cadena 0 unido al mismo); oxima; eter de oxima (por ejemplo, metoxiimina, CH3-0-N=); alcoholes (es decir, hidroxilo alifatico 0 alquilo, particularmente hidroxilo de alquilo inferior); amido; amino; aminoacido; arilo; alquilarilo, tal como bencilo; carbohidratos; monosacaridos, tales como glucosa y fructosa; disacaridos, tales como sacarosa y lactosa; oligosacaridos; polisacaridos; carbonilo; carboxilo; carboxilato (incluyendo sus sales, tales como carboxilatos de metales del Grupo I 0 de iones de amonio); ciclico; ciano (-CN); ester, tal como ester alquilico; eter; exometileno; halogeno; heteroarilo; heterociclico; hidroxilo; hidroxilamina; ceto, como cetonas alifaticas; nitro; sulfhidrilo; sulfonilo; sulfoxido; exometileno; y combinaciones de los mismos.

“Absorbancia” 0 “Absorcion” se refiere a la relation logaritmica entre la radiation incidente sobre un material (Po) y la radiacion transmitida a traves de un material (P). La absorbancia A de un material varia con la longitud del recorrido de la luz a traves de el (z) de acuerdo con la ecuacion 1.

A = tog§ = - (1ogT) = etc

r

Ecuacion 1

Po y Pson las intensidades de luz incidente y transmitida, Tes la transmision optica, y ees el coeficiente de extincion molar (M1 cnr1), / es la longitud 0 profundidad del area iluminada (cm), y c es la concentration de la molecula absorbente.

“Amplificacion” se refiere al acto 0 resultado de hacer que una serial sea mas fuerte.

“Conjugado de amplificacion” se refiere a una molecula que comprende una especie reactiva latente acoplada a un hapteno, tal como, por ejemplo, un conjugado hapteno-tiramida. El conjugado de amplificacion puede servir como un miembro de un par de union especifico, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-hapteno que se une especificamente al hapteno. El aspecto de amplificacion se refiere a la especie reactiva latente que se convierte enzimaticamente en una especie reactiva de modo que una sola enzima puede generar una multiplicidad de especies reactivas. Se hace referenda a la patente de EE. UU. n.° 7.695.929.

“Anticuerpo”, ocasionalmente abreviado “Ab”, se refiere a inmunoglobulinas 0 moleculas de tipo inmunoglobulina (incluyendo a modo de ejemplo y sin limitation, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinaciones de las mismas y moleculas similares producidas durante una respuesta inmunitaria en cualquier vertebrado (por ejemplo, en mamiferos como humanos, cabras, conejos y ratones) y fragmentos de anticuerpos que se unen especificamente a una molecula de interes (0 un grupo de moleculas de interes muy similares) para la exclusion sustancial de la union a otras moleculas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tienen una constante de union por la molecula de interes que es al menos 103 M-1 mayor, al menos 104 M-1 mayor 0 al menos 105 M-1 mayor que una constante de union por otras moleculas en una muestra biologica. Un anticuerpo se refiere ademas a un ligando polipeptido que comprende

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al menos una region variable de inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada que reconoce y se une especificamente a un epitopo de un antigeno. Los anticuerpos se pueden componer de una cadena pesada y una cadena ligera, cada una de las cuales tiene una region variable, denominadas la region variable pesada (VH) y la region variable ligera (VL). En conjunto, la region VH y la region VL son responsables de la union al antigeno reconocido por el anticuerpo. El termino anticuerpo tambien incluye inmunoglobulinas intactas y las variantes y partes de ellas bien conocidas en la tecnica. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos proteoliticos [tales como fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH y fragmentos Fab como se conocen en la tecnica], fragmentos de anticuerpos recombinantes (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespecificos, fragmentos dsFv biespecificos, fragmentos F(ab')2, proteinas Fv monocatenarias (“scFv”), proteinas Fv estabilizadas con disulfuro (“dsFv”), diacuerpos y triacuerpos (como se conocen en la tecnica) y anticuerpos camelidos (veanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.015.695, 6.005.079, 5.874.541, 5.840.526, 5.800.988 y 5.759.808).

El termino “anticuerpo” incluye un anticuerpo monoclonal que se caracteriza porque es producido por un unico cion de linfocitos B o por una celula en la que se han transfectado los genes de las cadenas ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante procedimientos conocidos para los expertos en la tecnica. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.

“Antigeno” se refiere a un compuesto, composicion o sustancia que se puede unir especificamente a los productos de inmunidad humoral o celular especifica, tal como una molecula de anticuerpo o receptor de linfocitos T. Los antigenos pueden ser cualquier tipo de molecula, incluidos, por ejemplo, haptenos, metabolitos intermedios simples, azucares (por ejemplo, oligosacaridos), lipidos y hormonas, as! como macromoleculas tales como carbohidratos complejos (por ejemplo, polisacaridos), fosfolipidos, acidos nucleicos y proteinas.

“Cromoforo” se refiere a una molecula o una parte de una molecula responsable de su color. El color surge cuando una molecula absorbe ciertas longitudes de onda de la luz visible y transmite o refleja otras. Una molecula que tiene una diferencia de energia entre dos orbitales moleculares diferentes que estan dentro del intervalo del espectro visible puede absorber la luz visible y, por lo tanto, caracterizarse adecuadamente como un cromoforo. La luz visible incidente en un cromoforo puede ser absorbida, excitando as! un electron desde un orbital molecular en el estado fundamental a un orbital molecular en estado excitado.

“Conjugar”, “ensamblar”, “unir”, “acoplar” o “enlazar” se usan como sinonimos para referirse a unir un primer atomo o molecula con otro atomo o molecula para formar una molecula mas grande directa o indirectamente.

“Conjugado” se refiere a dos o mas moleculas que estan unidas covalentemente en una construccion mas grande. En algunos modos de realizacion, un conjugado incluye una o mas biomoleculas (tales como peptidos, acidos nucleicos, proteinas, enzimas, azucares, polisacaridos, lipidos, glicoproteinas y lipoproteinas) unidas covalentemente a una o mas moleculas diferentes, tales como una o mas de otras biomoleculas. En otros modos de realizacion, un conjugado incluye una o mas moleculas de union especifica (tales como anticuerpos y secuencias de acido nucleico) unidas covalentemente a uno o mas marcadores detectables (haptenos, enzimas y combinaciones de los mismos). En otros modos de realizacion, un conjugado incluye uno o mas restos reactivos latentes unidos covalentemente a marcadores detectables (haptenos, restos cromoforos, restos fluorescentes).

“DABSYL” se refiere a 4-(dimetilamino)azobenceno-4'-sulfonamida, un cromoforo amarillo-naranja.

“Derivado” se refiere a un compuesto que se deriva de un compuesto similar al reemplazar un atomo o grupo de atomos por otro atomo o grupo de atomos.

“Epitopo” se refiere a un determinante antigenico. Estos son grupos quimicos particulares o secuencias peptidicas contiguas o no contiguas en una molecula que son antigenicas, es decir, que provocan una respuesta inmunitaria especifica. Un anticuerpo se une a un epitopo antigenico particular.

“Potenci(ar/ador/acion)”. Un potenciador o reactivo potenciador es cualquier compuesto o cualquier combinacion de compuestos suficiente para aumentar la actividad catalitica de una enzima, en comparacion con la actividad enzimatica sin dicho(s) compuesto(s). El(los) potenciador(es) o reactivo(s) potenciador(es) tambien se puede(n) definir como un compuesto o combinacion de compuestos que aumentan o aceleran la velocidad de union de un conjugado activado a un sitio receptor. Potenci(ar/aci6n) es un proceso mediante el cual la actividad catalitica de una enzima se incrementa mediante un potenciador, en comparacion con un proceso que no incluye dicho potenciador. Potenci(ar/aci6n) tambien se puede definir como el aumento o la aceleracion de la velocidad de union de un conjugado activado a un sitio receptor. La potenciacion se puede medir visualmente, por ejemplo, mediante puntuacion de un anatomopatologo. En modos de realizacion particulares, las puntuaciones varian de mas de 0 a mas de 4, y un numero mas alto indica una mejor deteccion visual. Mas tipicamente, las puntuaciones varian de mas de 0 a aproximadamente 4++, como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 3,75, 4, 4+ y 4++. Ademas, la potenciacion se puede medir mediante la determinacion de la Vmax. aparente de una enzima. En modos de realizacion particulares, el termino abarca valores de Vmax aparente (medidos como densidad optica/minuto) que varian de mas de 0 mOD/min a aproximadamente 400 mOD/min, tales como aproximadamente 15 mOD/min, 18 mOD/min, aproximadamente 20 mOD/min, aproximadamente 40 mOD/min,

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aproximadamente 60 mOD/min, aproximadamente 80 mOD/min, aproximadamente 100 mOD/min, aproximadamente 120 mOD/min, aproximadamente 140 mOD/min, aproximadamente 160 mOD/min, aproximadamente 200 mOD/min , aproximadamente 250 mOD/min, aproximadamente 300 mOD/min, aproximadamente 350 mOD/min y aproximadamente 400 mOD/min. Mas tipicamente, la Vmax varia de mas de 0 mOD/min a aproximadamente 160 mOD/min, tal como aproximadamente 20 mOD/min, aproximadamente 40 mOD/min, aproximadamente 60 mOD/min, aproximadamente 80 mOD/min, aproximadamente 100 mOD/min, aproximadamente 120 mOD/min, aproximadamente 140 mOD/min y aproximadamente 160 mOD/min. Ademas, se puede producir una potenciacion usando cualquier concentracion de un potenciador mayor que 0 mM. Se hace referenda a la publicacion de patente de EE. UU. n.° 2012/0171668, que divulga potenciadores utiles dentro de la presente divulgacion.

“Grupo funcional” se refiere a un grupo especifico de atomos dentro de una molecula que es responsable de las reacciones quimicas caracteristicas de la molecula. Los grupos funcionales ilustrativos incluyen, sin limitacion, alcano, alqueno, alquino, areno, halo (fluoro, cloro, bromo, yodo), epoxido, hidroxilo, carbonilo (cetona), aldehido, ester de carbonato, carboxilato, eter, ester, peroxi, hidroperoxi, carboxamida, amina (primaria, secundaria, terciaria), amonio, imida, azida, cianato, isocianato, tiocianato, nitrato, nitrito, nitrilo, nitroalcano, nitroso, piridilo, fosfato, sulfonilo, sulfuro, tiol (sulfhidrilo) y disulfuro.

“AMA” se refiere a la anchura total de un pico de absorbancia a la mitad de la absorbancia maxima.

“Hapteno” se refiere a una molecula, tipicamente una molecula pequena, que se puede combinar especificamente con un anticuerpo, pero tipicamente es sustancialmente incapaz de ser inmunogenica por si misma.

“Conector” se refiere a una molecula o grupo de atomos colocados entre dos restos. Por ejemplo, un conjugado de senalizacion puede incluir un conector quimico entre el resto cromoforo y un resto reactivo latente. Tipicamente, los conectores son bifuncionales, es decir, el conector incluye un grupo funcional en cada extremo, en el que los grupos funcionales se usan para acoplar el conector a los dos restos. Los dos grupos funcionales pueden ser iguales, es decir, un conector homobifuncional, o diferentes, es decir, un conector heterobifuncional.

“MG” se refiere al verde malaquita.

“Resto” se refiere a un fragmento de una molecula, o una parte de un conjugado.

“Molecula de interes” o “diana” se refiere a una molecula para la cual se debe determinar la presencia, ubicacion y/o concentracion. Los ejemplos de moleculas de interes incluyen proteinas y secuencias de acidos nucleicos.

“Multiplex(acion/ado/ar)” se refiere a la deteccion de multiples dianas en una muestra de forma simultanea, de forma sustancialmente simultanea o de forma secuencial. La multiplexacion puede incluir identificar y/o cuantificar multiples acidos nucleicos distintos (por ejemplo, ADN, ARN, ARNm, miARN) y polipeptidos (por ejemplo, proteinas) tanto individualmente como en cualquiera y en todas las combinaciones.

“Proximal” se refiere a estar situado en o cerca del punto de referencia. Como se usa en el presente documento, proximal significa hasta una distancia de aproximadamente 5000 nm, hasta una distancia de aproximadamente 2500 nm, hasta una distancia de aproximadamente 1000 nm, hasta una distancia de aproximadamente 500 nm, hasta una distancia de aproximadamente 250 nm, hasta una distancia de aproximadamente 100 nm, hasta una distancia de aproximadamente 50 nm, hasta una distancia de aproximadamente 10 nm o hasta una distancia de aproximadamente 5 nm del punto de referencia.

“Grupos reactivos” se refiere a una variedad de grupos adecuados para acoplar una primera unidad a una segunda unidad como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el grupo reactivo podria ser un grupo reactivo de amina, tal como un isotiocianato, un isocianato, una azida de acilo, un ester de NHS, un cloruro de acido, tal como cloruro de sulfonilo, aldehidos y glioxales, epoxidos y oxiranos, carbonatos, agentes de arilacion, imidoesteres, carbodiimidas, anhidridos y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales reactivos de tiol adecuados incluyen haloacetiloy haluros de alquilo, maleimidas, aziridinas, derivados de acriloilo, agentes de arilacion, reactivos de intercambio tiol-disulfuro, tales como disulfuros de piridilo, TNB-tiol y reductores disulfuro, y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales reactivos de carboxilato adecuados incluyen diazoalcanos, compuestos de diazoacetilo, compuestos de carbonildiimidazol y carbodiimidas. Los grupos funcionales reactivos de hidroxilo adecuados incluyen epoxidos y oxiranos, carbonildiimidazol, N,N'-disuccinimidil carbonatos o N-hidroxisuccinimidil cloroformiatos, compuestos oxidantes de peryodato, oxidacion enzimatica, alquil halogenos e isocianatos. Los grupos funcionales reactivos de aldehido y cetona incluyen hidrazinas, bases de Schiff, productos de aminacion reductiva, productos de condensacion de Mannich y combinaciones de los mismos. Los compuestos reactivos de hidrogeno activo incluyen derivados de diazonio, productos de condensacion de Mannich, productos de reaccion de yodacion y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales quimicos fotorreactivos incluyen aril azidas, aril azidas halogenadas, benzofononas, diazocompuestos, derivados de diazirina y combinaciones de los mismos.

“Rod” se refiere a rodamina, un cromoforo.

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“Muestra” se refiere a una muestra biologica que contiene ADN genomico, ARN (incluyendo ARNm), proteina o combinaciones de los mismos, obtenida de un sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, sangre periferica, orina, saliva, biopsia de tejido, pieza quirurgica, muestras de amniocentesis y material de necropsia.

“Resto de union especifica” se refiere a un miembro de un par de union especifica. Los pares de union especifica son pares de moleculas que se caracterizan porque se unen entre si para la exclusion sustancial de la union a otras moleculas (por ejemplo, los pares de union especifica pueden tener una constante de union que es al menos 103 M1 mayor, 104 M1 mayor o 105 M1 mayor que una constante de union de cualquiera de los dos miembros del par de union con otras moleculas en una muestra biologica). Ejemplos particulares de restos de union especifica incluyen proteinas de union especifica (por ejemplo, anticuerpos, lectinas, avidinas tales como estreptavidinas y proteina A), secuencias de acidos nucleicos y acidos nucleicos de proteinas. Los restos de union especifica tambien pueden incluir las moleculas (o partes de las mismas) que estan especificamente unidas por dichas proteinas de union especifica. Los restos de union especifica a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos, nucleotidos, oligonucleotidos, proteinas, peptidos o aminoacidos.

“TAMRA” se refiere a carboxitetrametilrodamina, un cromoforo de rodamina rosado.

“TMR” se refiere a tetrametilrodamina, un cromoforo de rodamina rojo.

“TSA” se refiere a la amplificacion de la serial de tiramida.

“TYR” se refiere a tiramina, tiramida, derivados de tiramina y/o tiramida.

II. Procedimientos para detectar una diana en una muestra

En este documento se divulgan modos de realizacion de un procedimiento para usar los conjugados divulgados para detectar una o mas dianas en una muestra biologica. En modos de realizacion divulgados particulares, uno o mas de los conjugados se usan en ensayos estandar, tales como esquemas de deteccion por hibridacion in situ (ISH), inmunocitoquimica e inmunohistoquimica (IHC). En modos de realizacion divulgados particulares, cualquiera de estos ensayos se puede referir a multiplexacion en la que se pueden detectar multiples dianas diferentes. Los modos de realizacion del procedimiento tambien se pueden combinar. Por ejemplo, un procedimiento que usa un esquema de deteccion por IHC se puede combinar con un esquema de deteccion por ISH. Los modos de realizacion ejemplares del procedimiento divulgado se pueden usar para determinar la clonalidad celular (por ejemplo, una celula expresa cualquiera de dos biomarcadores, pero no ambos), predecir la respuesta de pacientes con cancer al tratamiento del cancer (por ejemplo, detectar biomarcadores predictivos para determinar si un paciente en particular respondera al tratamiento), analisis simultaneos de expresion de biomarcadores y expresion de genes de control interno para monitorizar el rendimiento del ensayo y la integridad de la muestra, y combinaciones de los mismos.

Los procedimientos se pueden usar en muestras biologicas que tienen una fase solida, tales como componentes proteicos de celulas o estructuras celulares que se inmovilizan sobre un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos de microscopio). En modos de realizacion ilustrativos, la muestra es una muestra de tejido o de citologia, tal como una muestra incluida en parafina y fijada en formol, montada en un portaobjetos de microscopio de vidrio. En un modo de realizacion, el procedimiento es particularmente para un instrumento de tincion automatizada de portaobjetos.

Un experto en la tecnica apreciara que se pueden detectar numerosos tipos de dianas usando el procedimiento divulgado. En ciertos modos de realizacion divulgados, la diana puede ser una secuencia particular de acido nucleico, una proteina o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, la diana puede ser una secuencia particular de ARN (por ejemplo, ARNm, microARN y ARNip), ADN y combinaciones de los mismos. Se puede sospechar que la muestra incluye una o mas moleculas diana de interes. Las moleculas diana pueden estar en la superficie de las celulas y las celulas pueden estar en una suspension o en una seccion de tejido. Las moleculas diana tambien pueden ser intracelulares y se detectan despues de la lisis celular o la penetracion de la celula por una sonda. Un experto en la tecnica apreciara que el procedimiento de deteccion de moleculas diana en una muestra variara dependiendo del tipo de muestra y de la sonda utilizada. En la tecnica se conocen procedimientos de preparacion y recogida de muestras.

Las muestras para uso en los modos de realizacion del procedimiento y con la composicion divulgada en el presente documento, tales como un tejido u otra muestra biologica, se pueden preparar usando cualquier procedimiento conocido en la tecnica por un experto en la materia. Las muestras se pueden obtener de un sujeto para el cribado de rutina o de un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno, tales como una anomalia genetica, una infeccion o una neoplasia. Los modos de realizacion descritos del procedimiento divulgado tambien se pueden aplicar a muestras que no tienen anomalias geneticas, enfermedades, trastornos, etc., que se conocen como muestras “normales”. Dichas muestras normales son utiles, entre otras cosas, como controles para la comparacion con otras muestras. Las muestras se pueden analizar para muchas finalidades diferentes. Por ejemplo, las muestras se pueden usar en un estudio cientifico o para el diagnostico de una enfermedad sospechosa, o como indicadores pronosticos de exito del tratamiento, supervivencia, etc. Las muestras pueden incluir dianas multiples que se pueden unir especificamente por una o mas sondas de deteccion. A lo largo de la presente divulgacion, cuando se hace referencia a una proteina diana, se entiende que las secuencias de acido nucleico asociadas a dicha proteina tambien se pueden utilizar como dianas.

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En algunos ejemplos, la diana es una proteina o molecula de acido nucleico de un patogeno, tal como un virus, bacteria o parasito intracelular, por ejemplo, de un genoma virico. Por ejemplo, una proteina diana se puede producir a partir de una secuencia de acido nucleico diana asociada a (por ejemplo, correlacionada con, causalmente implicada en, etc.) una enfermedad.

En algunos modos de realizacion, el procedimiento divulgado se puede usar para detectar microARN (miARN o miR). Los microARN son ARN pequenos, no codificantes, que regulan negativamente la expresion genica, por ejemplo, mediante la represion de la traduccion. Por ejemplo, miR-205 regula la transicion epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso que facilita la remodelacion tisular durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, la EMT tambien es una etapa temprana en la metastasis tumoral. La regulacion negativa de microARN, tal como miR-205, puede ser una etapa importante en la progresion tumoral. Por ejemplo, la expresion de miR-205 se regula negativamente o se pierde en algunos canceres de mama. El miR-205 tambien se puede usar para estratificar carcinomas de celulas escamosas y carcinomas de pulmon no microciticos (J. Clin Oncol., 2009, 27(12):2030-7). Se ha encontrado que otros microARN modulan las cascadas de senalizacion angiogenicas. La regulacion negativa de miR-126, por ejemplo, puede exacerbar la progresion del cancer a traves de la angiogenesis y el aumento de la inflamacion. Por lo tanto, los niveles de expresion de microARN pueden ser indicativos de un estado de enfermedad. Para los microARN que estan dentro del alcance de la presente divulgacion, se hace referenda a la solicitud de PCT n° PCT/EP2012/073984.

En un modo de realizacion divulgado particular, el procedimiento divulgado se puede usar para analizar bloques clinicos de tejido incluido en parafina y fijado en formol (IPFF) de cancer de mama que se han caracterizado por el numero de copias del gen HER2 y la expresion de proteina Fler2 usando ensayos INFORM HER2 Dual ISH e IHC (Ventana Medical Systems, Inc., “VMSI”), respectivamente. Los niveles de expresion de ARNm de HER2 en relacion con ACTB ((3-actina) se pueden determinar usando qPCR de acuerdo con procedimientos conocidos. Los resultados de los analisis de copia de genes, expresion de proteinas y qPCR se pueden comparar con los resultados obtenidos a traves de la deteccion por ISH-ARNm de ARNm de HER2y ACTB usando el procedimiento divulgado en el presente documento para analizar muestras IPFF. Otros resultados de este procedimiento se analizan a continuacion en el presente documento.

En otro modo de realizacion, el procedimiento divulgado se puede usar para identificar la proliferacion monoclonal de ciertos tipos de celulas. El cancer es el resultado del crecimiento incontrolado de una poblacion celular; esta poblacion puede surgir a partir de una unica celula madre mutante y, por lo tanto, comprender una poblacion clonal. Un ejemplo de cancer derivado de una poblacion clonal es el de los linfomas no Hodgkin de linfocitos B (LNH-B) que surgen de la proliferacion monoclonal de linfocitos B. La expansion clonal de una poblacion especifica de linfocitos B se puede detectar mediante expresion unica de proteina y ARNm de cadena ligera KAPPA o LAMBDA como parte de su anticuerpo contra receptores de linfocitos B. En consecuencia, un modo de realizacion del procedimiento divulgado en el presente documento se refiere a la identificacion de la proliferacion monoclonal de linfocitos B usando tincion doble cromogenica de ARNm de KAPPA y LAMBDA.

La expresion uniforme de cualquiera de las cadenas ligeras por los linfocitos B cancerosos permite la diferenciacion de los linfomas de linfocitos B monoclonales de las poblaciones de linfocitos B que expresan cadenas ligeras KAPPA y LAMBDA que resultan durante la respuesta inmunitaria normal. La determinacion de los patrones de expresion del ARNm de la cadena ligera se complica por el intervalo del numero de copias del ARNm de la cadena ligera y la proteina del anticuerpo expresados por neoplasias de linfocitos B derivadas de una variedad de estadios de linfocitos B (celulas indiferenciadas y de memoria: 10-100 copias por celula; celulas plasmaticas: ~ 100 mil copias por celula).

Procedimientos

En modos de realizacion ilustrativos, un procedimiento para detectar una diana en una muestra biologica incluye poner en contacto la muestra biologica con una sonda de deteccion, poner en contacto la muestra biologica con un conjugado de marcaje y poner en contacto la muestra biologica con un conjugado de senalizacion. La figura 1 es un diagrams de flujo que proporciona las etapas de un modo de realizacion de un procedimiento de acuerdo con la presente divulgacion. En particular, el procedimiento incluye una etapa 1 de poner en contacto la muestra con una(s) sonda(s) de deteccion. Esta etapa puede incluir una sonda de deteccion unica o una pluralidad de sondas de deteccion especificas para una pluralidad de dianas diferentes. Una etapa 2 posterior incluye poner en contacto la muestra con un conjugado de marcaje. Una etapa 7 posterior adicional incluye poner en contacto la muestra con un conjugado de senalizacion. Las lineas discontinuas a la etapa 3, que incluye poner en contacto la muestra con un conjugado de amplificacion, y a la etapa 5, que incluye poner en contacto la muestra con un conjugado de marcaje secundario, representan que estas etapas son opcionales. Las lineas discontinuas a la etapa 10, que incluye poner en contacto la muestra con un inhibidor enzimatico, indican que se puede usar un bucle opcional para detectar dianas multiples de acuerdo con un enfoque multiplexado. En modos de realizacion divulgados particulares, se pueden usar una o mas etapas en las que se anade un inhibidor enzimatico a la muestra biologica. Por ejemplo, en modos de realizacion en los que se anaden dos o mas conjugados de senalizacion a la muestra, se puede anadir un inhibidor enzimatico (por ejemplo, un inhibidor de peroxidasa) para evitar cualquier actividad enzimatica despues de que se haya depositado covalentemente un conjugado de senalizacion y antes de que se anada un segundo conjugado de senalizacion diferente.

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En modos de realizacion ilustrativos, la deteccion de dianas en la muestra incluye poner en contacto la muestra biologica con un primer conjugado de amplificacion que se asocia con el primer conjugado de marcaje. Por ejemplo, el conjugado de amplificacion se puede depositar covalentemente de forma proximal o directa sobre el primer conjugado de marcaje. El primer conjugado de amplificacion se puede seguir poniendo en contacto con la muestra biologica con un conjugado de marcaje secundario. De manera ilustrativa, la amplificacion de serial usando conjugados de amplificacion potencia la deposicion del conjugado de senalizacion. La deposicion potenciada del conjugado de senalizacion permite una identificacion visual mas facil de la serial cromogenica, es decir, la amplificacion hace que el color sea mas oscuro y mas facil de ver. Para dianas de baja expresion, esta amplificacion puede hacer que la serial se vuelva lo suficientemente oscura para ser visible, mientras que, sin amplificacion, la diana no seria apreciable. Se usan condiciones adecuadas para introducir los conjugados de senalizacion con la muestra biologica, e incluyen tipicamente proporcionar un tampon o solucion de reaccion que comprende un peroxido (por ejemplo, peroxido de hidrogeno), y tiene una concentration de sal y un pH adecuados para permitir o facilitar que la enzima lleve a cabo su funcion deseada En modos de realizacion divulgados particulares, esta etapa del procedimiento se realiza a temperaturas que varian de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C. Estas condiciones permiten que la enzima y el peroxido reaccionen y promuevan la formation de radicales en el resto reactivo latente del conjugado de senalizacion. El resto reactivo latente y, por lo tanto, el conjugado de senalizacion como un todo, se depositaran covalentemente sobre la muestra biologica, particularmente en uno o mas residuos de tirosina proximales al conjugado enzimatico inmovilizado, residuos de tirosina de la parte de enzima del conjugado enzimatico y/o residuos de tirosina de la parte de anticuerpo del conjugado enzimatico. La muestra biologica se ilumina entonces con luz y la diana se puede detectar a traves de la absorbancia de la luz producida por el resto cromogeno del conjugado de senalizacion.

Dependiendo del nivel de multiplexacion, el bucle opcional se puede repetir una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas veces dependiendo del numero de dianas que se vayan a detectar en la muestra. Durante las detecciones posteriores, el conjugado de marcaje puede ser el mismo o diferente dependiendo de los reactivos de bloqueo utilizados. Un ejemplo de diferentes conjugados de marcaje seria un primer conjugado de enzima-anticuerpo anti- hapteno y un segundo conjugado de enzima-anticuerpo anti-hapteno, en el que el primer anticuerpo anti-hapteno y el segundo anticuerpo anti-hapteno son especificos para diferentes haptenos. De acuerdo con otro ejemplo, la diferencia podria implicar diferentes anticuerpos antiespecie, en los que las dianas se detectaron usando anticuerpos primarios derivados de diferentes especies. Durante las detecciones posteriores, el conjugado de senalizacion utilizado para cada diana seria tipicamente diferente. Por ejemplo, las diferentes dianas se podrian detectar como colores diferentes.

Aunque la etapa 1 de la figura 1 de poner en contacto la muestra con la(s) sonda(s) de deteccion busca la deteccion simultanea de dianas multiples durante una etapa, la multiplexacion tambien se puede realizar de forma secuencial. Un procedimiento secuencial incluiria la adicion de una primera sonda de deteccion, seguida de llevar a cabo los diversas etapas posteriores del procedimiento (es decir, 2, 7, opcionalmente 3 y 5). A continuation, se puede anadir una segunda sonda de deteccion despues de que el primer conjugado de senalizacion se haya depositado covalentemente en o proximalmente a la primera diana, proporcionando asi la capacidad de detectar una segunda diana. Este proceso se puede entonces repetir iterativamente usando un conjugado de senalizacion diferente que comprende un resto cromoforo que difiere de los otros depositados.

El procedimiento tambien comprende una etapa 9 de iluminar la muestra con luz y una etapa 11 de detectar la(s) diana(s). La serial producida por el conjugado de senalizacion se detecta, proporcionando de ese modo la capacidad de detectar una diana particular. En modos de realizacion divulgados particulares, la serial producida por el conjugado de senalizacion puede ser fluorescente, cromogenica o combinaciones de las mismas. Los modos de realizacion a modo de ejemplo se refieren a la deteccion de una serial cromogenica. La serial se puede detectar usando procedimientos adecuados conocidos por los expertos en la tecnica, tales como procedimientos de deteccion cromogenica, procedimientos de deteccion fluorogenica y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la serial se puede detectar usando tecnicas de deteccion de campo claro o tecnicas de deteccion de campo oscuro.

Las figuras 2(A-B) son diagramas esquematicos de dos modos de realizacion de conjugados de senalizacion. La figura 2(A) ilustra un conjugado de senalizacion 12 que comprende un resto reactivo latente 4 y un resto cromoforo 6. La figura 2(B) ilustra un conjugado de senalizacion alternative 14, que comprende un resto cromoforo 6, un resto reactivo latente 4, y que comprende ademas un conector 8.

Las figuras 3(A-F) son diagramas esquematicos que ilustran un modo de realizacion de un procedimiento para detectar una diana 17 en una muestra 16. La figura 3(A) muestra una sonda de deteccion 18, que se muestra ilustrativamente como una molecula de acido nucleico con un hapteno 19, que se une a la diana 17, que, en este caso, seria una diana de acido nucleico. La figura 3(B) muestra un conjugado de marcaje 20 que se une a una sonda de deteccion 18. El conjugado de marcaje se represents como un anticuerpo anti-hapteno especifico para el conjugado de hapteno 19 para dos enzimas, representadas como los circulos que contienen una “E”. Aunque se muestra como un conjugado de un anticuerpo y dos moleculas de enzima, el numero de enzimas por anticuerpo puede ser alterado y optimizado para aplicaciones particulares por un experto en la tecnica. En particular, el numero de enzimas se podria modificar de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, dependiendo de diversos factores que incluyen el tamano del anticuerpo y el tamano de las enzimas. La figura 3(C) muestra el conjugado de senalizacion 12 que se deposita enzimaticamente sobre la muestra 16. En particular, las enzimas “E”, parte del conjugado de marcaje 20, catalizan la conversion del primer resto reactivo latente del conjugado de senalizacion 12 en una primera especie reactiva 13. Esta

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catalisis se representa mediante una primera flecha grande 21 que dirige el conjugado de senalizacion 12 hacia las enzimas “E” y una segunda flecha grande 22 que sale de las enzimas "“E” hacia la especie reactiva 13, que esta hecha del resto cromoforo 6 y un resto reactivo, que se representa mediante el punto, reemplazando la flecha como se muestra en el conjugado de senalizacion 6. La especie reactiva 13 se une covalentemente a la muestra biologica de forma proximal a o directa sobre la primera diana, para formar un cromoforo 15 unido covalentemente. La figura 3(D) muestra un modo de realizacion alternative en el que se usa una sonda de deteccion basada en anticuerpo 28 para detectar una diana de proteina 27. La figura 3(D) se incluye para mostrar que la deteccion de una diana de acido nucleico 17 y/o una diana de proteina 27 es analoga, excepto que la sonda de deteccion 28 se representa como un anticuerpo en oposicion a un acido nucleico (por ejemplo, sonda de deteccion 18). La sonda de deteccion 28 se muestra como no haptenada, lo que implica que el conjugado de marcaje 30 es un anticuerpo antiespecie conjugado con las enzimas “E”. Sin embargo, en modos de realizacion alternatives, la sonda de deteccion 28 podria estar haptenada y el conjugado de marcaje 30 podria incluir un anticuerpo anti-hapteno.

La figura 3(E) muestra un enfoque para detectar la diana que usa un conjugado de amplificacion 42. En particular, el conjugado de amplificacion 42 se deposits enzimaticamente sobre una muestra 36. En particular, las enzimas “E”, parte del conjugado de marcaje 40, catalizan la conversion del primer resto reactivo latente del conjugado de amplificacion 42 en una primera especie reactiva 43. Esta catalisis se representa mediante una primera flecha grande 31 que dirige el conjugado de amplificacion 42 hacia las enzimas “E” y una segunda flecha grande 32 que sale de las enzimas “E” hacia la especie reactiva 43, que esta hecha de un hapteno (mostrado como una cruz) y un resto reactivo, que se representa mediante el punto, reemplazando la flecha como se muestra en el conjugado de amplificacion 42. La especie reactiva 43 se une covalentemente a la muestra biologica de forma proximal a o directa sobre la primera diana, para formar un hapteno 45 unido covalentemente. El esquema representado en la figura 3(E) se muestra en el presente documento para hacer evidentes las similitudes entre el esquema de la figura 3(E) y el esquema de la figura 3(C). En particular, los esquemas son casi identicos, excepto por la sustitucion del resto cromoforo del conjugado de senalizacion 12 por el hapteno del conjugado de amplificacion 42. La figura 3(F) muestra que el conjugado de amplificacion unido a la muestra (hapteno 45 unido covalentemente como se ve en la figura 3(E)) se puede marcar con un conjugado de marcaje secundario 41. Aunque no se muestra, el esquema mostrado en la figura 3(C) se puede usar entonces para formar un cromoforo unido covalentemente. La deposition del conjugado de amplificacion 42 sobre la muestra proporciona un mayor numero de moleculas de enzima (es decir, las enzimas del conjugado de marcaje 40 y el conjugado de marcaje secundario 41 se muestran proximalmente a la diana en la figura 3(F)).

En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado de senalizacion se detecta usando procedimientos de deteccion de campo claro. Una vision general de este proceso se ilustra en las figuras 4(A-B). La figura 4(A) es un esquema de una vista en section transversal de la muestra 16 que incluye una superficie superior 48 y una superficie inferior 49 en la que una pluralidad de los conjugados de senalizacion 12 estan situados proximalmente a una diana (T); la muestra se muestra con una primera flecha 46 que representa la radiacion incidente dirigida hacia la superficie superior 48 y una segunda flecha 47 que representa la radiacion transmitida que emana de la superficie inferior 49. La figura 4(B) es un grafico que representa la relacion entre la potencia de la radiacion incidente (Po) a traves de la muestra 16 mostrada en la figura 4(A) y la potencia de la radiacion transmitida (P) a traves de la muestra, en el que el eje y es la potencia de radiacion y el eje x es la distancia lineal a traves de la muestra. Las figuras 4(A-B) representan como se podria visualizar una diana usando el conjugado de senalizacion 12. La ecuacion 1 proporciona la relacion matematica entre la potencia de la radiacion incidente y transmitida.

Las etapas del procedimiento divulgado se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, y no estan limitadas a las descritas en el presente documento. En modos de realizacion divulgados particulares, el procedimiento puede comprender etapas en las que los conjugados de marcaje se anaden a la muestra biologica, seguido del conjugado de senalizacion. Los conjugados divulgados en el presente documento se pueden anadir simultaneamente o secuencialmente. Los conjugados se pueden anadir en soluciones separadas o como composiciones que comprenden dos o mas conjugados. Ademas, cada clase de conjugados usados en el procedimiento divulgado puede comprender los mismos o diferentes componentes conjugados. Por ejemplo, cuando se anaden multiples conjugados de senalizacion a la muestra, los conjugados pueden comprender los mismos o diferentes restos cromogenos y/o restos reactivos latentes. Unicamente a modo de ejemplo, un conjugado de senalizacion puede comprender un cromoforo de cumarina acoplado a un resto de tiramina y otro conjugado de senalizacion puede comprender un cromoforo de rodamina acoplado a un resto de derivado de tiramina. El numero de conjugados de senalizacion adecuado para su uso en el ensayo de multiplexacion divulgado puede variar de uno a al menos seis o mas tipicamente de dos a cinco. En modos de realizacion divulgados particulares, el procedimiento se usa para detectar de tres a cinco dianas diferentes usando de tres a cinco conjugados de senalizacion diferentes. Se pueden detectar dianas multiples en un unico ensayo usando el procedimiento divulgado en el presente documento. En otro modo de realizacion, una o mas de las etapas divulgadas en el presente documento para el procedimiento se realizan mediante un instrumento de tincion automatizada de portaobjetos.

Cromogenesis frente a fluorescencia

Historicamente, el analisis de separacion se ha realizado utilizando FISH; sin embargo, la presente divulgation proporciona un ensayo de separacion de tres colores usando ISH cromogenica. Las diferencias entre deteccion cromogenica y deteccion de fluorescencia se ilustran graficamente en las figuras 5(A) y 5(B). La figura 5(A) muestra

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un ejemplo de cromogeno rojo 51, un ejemplo de cromogeno azul 53 y un ejemplo de cromogeno multiplexado rojo y azul 52. Cuando los cromogenos se exponen a la luz (es decir, se exponen a luz que tiene una potencia incidente de Po) que es tipicamente luz blanca, los cromogenos absorben varias longitudes de onda. La luz transmitida tendra una potencia particular (Pi, P2 y P3 en la figura 5(A)) dependiendo de la absorbancia del cromogeno y de la cantidad de cromogeno presente. El mejor evento de deteccion da como resultado que se deposite mas cromogeno, que absorbe mas luz y hace que la serial observada sea mas pequena. Incluso para los cromogenos coloreados, una reduction de la luz transmitida eventualmente hara que el cromogeno aparezca negro, ya que no se transmite luz. La multiplexacion agrava este efecto, como se muestra en el ejemplo de cromogeno multiplexado rojo y azul 52. Cuando un cromogeno rojo tradicional y un cromogeno azul se superponen en el espacio, la absorbancia es amplia y el evento de deteccion aparece negruzco y oscuro, como se ilustra con la serial P3, que es menor que Pi y P2 Esencialmente, la deteccion cromogenica con senales superpuestas dara como resultado un efecto sustractivo. Esto esta en contraste con la fluorescencia que se muestra en la figura 5(B). Con referenda a la figura 5(B), se muestra un ejemplo de fluor purpura 61, un ejemplo de fluor verde 63, y un ejemplo de fluor multiplexado purpura y verde 62. La luz de excitation (que se muestra como Aex en la figura) puede ser la misma en los tres ejemplos y 61 muestra An (fluorescencia purpura), 63 muestra Af2 (fluorescencia verde) y 62 muestra An (fluorescencia purpura) y Af2 (fluorescencia verde). Cuanto mas fluor se deposits sobre la muestra, mas fuerte es la serial de fluorescencia que se genera. De manera similar, en un escenario multiplexado, hay un efecto aditivo para los fluoroforos, mientras que se produce un efecto sustractivo con los cromoforos. Esta caracteristica sustractiva frente a aditiva aumenta significativamente la dificultad de la multiplexacion cuando se usan cromogenos. Por ello, la multiplexacion con cromogenos tradicionales no se ha aceptado ampliamente. La presente divulgation proporciona conjugados de serialization con bandas de absorbancia de longitud de onda estrecha que permiten combinaciones de colores que hasta ahora no eran posibles. Como resultado, la presente divulgacion proporciona una multiplexacion cromogenica sin precedentes a pesar de las desventajas inherentes que tiene la multiplexacion cromogenica en comparacion con la multiplexacion fluorescente.

Deteccion e iluminacion

El conjugado de senalizacion se configura para proporcionar una variedad de caracteristicas que facilitan la provision de una serial detectable. En modos de realization divulgados particulares, el conjugado de senalizacion comprende un resto cromoforo apropiado para proporcionar una serial de campo claro. Por ejemplo, el cromoforo divulgado en el presente documento se puede seleccionar para producir una serial optica adecuada para detectar la diana divulgada en el presente documento. En modos de realizacion divulgados particulares, el cromoforo tiene propiedades opticas, tales como las analizadas a continuation, que permiten que el conjugado de senalizacion se configure para proporcionar la serial deseada.

Cuando la luz (es decir, la radiation electromagnetica visible) atraviesa 0 es reflejada por una sustancia coloreada, se absorbe una parte caracteristica de la distribution de la longitud de onda espectral. La absorcion de esta parte caracteristica imparte al objeto un color complementario correspondiente a la luz restante. Las figuras 6(A) y 6(B) muestran una rueda de colores (figura 6 A)) que ilustra la relation entre un color observado y la radiacion absorbida. La rueda de colores incluye varias piezas de pastel que representan los colores rojo (R), naranja (O), amarillo (Y), verde (G), azul (B), anil (I) y violeta (V). Cada color se muestra como una pieza de pastel separada del siguiente color por una serie de lineas que terminan en numeros fuera de la rueda. Estos numeros designan la longitud de onda de la luz en nanometros (nm) de aquellas longitudes de onda tradicionalmente consideradas los puntos de transition entre los colores. La figura 6(B) muestra la misma distribucion de colores en un grafico lineal que tiene la longitud de onda de la luz en el eje x. Es decir, la region de 620 a 800 nm se muestra de color rojo, ya que esas longitudes de onda son longitudes de onda de luz “roja”. Tipicamente, los colores se perciben preferentemente y algunos colores se perciben solo para un intervalo muy estrecho de longitudes de onda. Por ejemplo, un laser que tiene una emision entre 490 nm y 560 nm se percibiria como verde (un intervalo de 70 nm). Para percibirse naranja, el laser deberia emitir luz en el intervalo de 580 nm y 620 nm (40 nm). El grafico se proporciona solo como representation, y un experto en la tecnica aprecia que el espectro electromagnetico es de naturaleza continua y no discreto como se muestra. Sin embargo, las clasificaciones de colores delineadas en el presente documento facilitan la comprension de la tecnologia como se reivindica en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, cuando una sustancia absorbe a una longitud de onda particular, la sustancia parece ser del color complementario, correspondiendo ese color a la luz restante. La rueda de colores de la figura 6(A) muestra colores complementarios diametralmente opuestos entre si. De acuerdo con la rueda de colores, la absorcion de luz a 420-430 nm imparte un color amarillo a la sustancia (425 nm es opuesto a la parte de la rueda que es amarilla). De manera similar, la absorcion de luz en el intervalo de 500-520 nm imparte un color rojo a la sustancia, ya que el area del pastel roja es opuesta al intervalo numerico de 500-520 nm. El verde es unico en que la absorcion cerca de 400 nm y la absorcion cerca de 800 nm pueden impartir un color verde a la sustancia.

El concepto de que la absorcion de luz a longitudes de onda entre 420-430 nm da como resultado que la sustancia parezca amarilla es una simplification excesiva de muchos de los fenomenos de absorcion descritos en el presente documento. En particular, el perfil espectral de absorcion tiene una gran influencia sobre el color observado. Por ejemplo, una sustancia que es negra se absorbe fuertemente en todo el intervalo de 420-430 nm, pero la sustancia negra no aparece amarilla. En este caso, el absorbente negro absorbera luz en todo el espectro visible, incluidos 420- 430 nm. Por lo tanto, aunque la absorcion de la luz a una longitud de onda particular es importante, las caracteristicas

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de absorcion en todo el espectro visible (es decir, la absorcion espectral) tambien son importantes.

La absorcion espectral se puede caracterizar de acuerdo con varios parametros medibles. La longitud de onda a la cual la fraccion maxima de luz es absorbida por una sustancia se conoce como Amax. Debido a que esta longitud de onda es la que se absorbe en mayor medida, se denomina tipicamente longitud de onda de absorbancia. La figura 7(A) es un espectro de absorcion de un conjugado de senalizacion particular, y la figura 7(B) ilustra una microfotografia de una proteina tenida usando el conjugado de senalizacion que produce el espectro de absorcion de la figura 7(A). La figura 7(A) incluye una primera flecha (70) que ilustra la magnitud de la absorbancia maxima. Una segunda flecha (71) muestra la magnitud de la mitad del maximo. Una tercera flecha (72) muestra la anchura del pico a la mitad de la absorbancia maxima. Para este conjugado de senalizacion a modo de ejemplo, Amax es 552 nm y la anchura del pico a la mitad de la absorbancia maxima (por ejemplo, AMA) es de aproximadamente 40 nm. Mientras que Amax designa la longitud de onda de absorcion maxima, la AMA designa la amplitud de la absorbancia espectral. Ambos factores son importantes para describir el color del cromoforo porque los espectros de absorcion amplios no parecen tener el color que se esperaria de su Amax. Por el contrario, parecen ser de color marron, negro o gris. Con referenda a la figura 7(B), la deposicion del conjugado de senalizacion es claramente evidente en aquellas ubicaciones en las que cabria esperar para la tincion positiva (IHC HER2 (4B5) en xenoinjertos Calu-3). Haciendo referenda de nuevo a la rueda de colores (figura 6(A)), una Amax de 552 nm deberia corresponder a un color complementario del rojo o rojo-violeta. Esto coincide con el color observado en la muestra de tejido mostrada en la figura 7(B) (observese que la muestra incluye ademas contratincion nuclear con hematoxilina, que es azul). Debido a que la contratincion esta confinada al nucleo, no parece interferir ni afectar sustancialmente la tincion de HER2 basada en la membrana celular.

Los cromoforos preferentes tienen fuertes caracteristicas de absorbancia. En algunos modos de realizacion, los cromoforos son no fluorescentes o debilmente fluorescentes. En virtud de sus caracteristicas de absorbancia, un cromoforo es una especie capaz de absorber la luz visible. Un cromoforo preferente es capaz de absorber una cantidad suficiente de luz visible con una especificidad de longitud de onda suficiente para que el cromoforo se pueda visualizar usando iluminacion de campo claro. En otro modo de realizacion, el cromoforo tiene una absortividad molar promedio superior de aproximadamente 5000 M1 crm1 a aproximadamente 90 000 M1 cm-1. Por ejemplo, la absortividad molar promedio puede ser superior a aproximadamente 5000 M'1 cm1, superior a aproximadamente 10 000 M'1 cm1, superior a aproximadamente 20 000 M'1 cm1, superior a aproximadamente 40 000 M'1 crrr1 o superior a aproximadamente 80 000 M'1 crrr1. Son preferentes las caracteristicas de absorbancia fuerte para aumentar la serial o el color proporcionado por el cromoforo.

La deposicion de conjugados de senalizacion en las proximidades de la diana crea absorcion de la luz incidente. Debido a que la absorcion ocurre de manera no uniforme a traves de la muestra, se puede identificar la ubicacion de la diana dentro de la muestra.

Ciertos, o todos los, aspectos de los modos de realizacion divulgados se pueden automatizar y facilitar mediante un analisis informatico y/o un sistema de analisis de imagenes. En algunas aplicaciones, se miden relaciones de color precisas. En algunos modos de realizacion, la microscopia optica se utiliza para el analisis de imagenes. Ciertos modos de realizacion divulgados implican la adquisicion de imagenes digitales. Esto se puede hacer acoplando una camara digital a un microscopio. Las imagenes digitales obtenidas de muestras tenidas se analizan utilizando un software de analisis de imagenes. El color se puede medir de diferentes maneras. Por ejemplo, el color se puede medir como valores de rojo, azul y verde; valores de matiz, saturacion e intensidad; y/o midiendo una longitud de onda especifica o un intervalo de longitudes de onda usando una camara de imagen espectral.

Los modos de realizacion ilustrativos implican usar imagenes de campo claro con los conjugados de senalizacion. La luz blanca en el espectro visible se transmite a traves del resto cromoforo. El cromoforo absorbe la luz de ciertas longitudes de onda y transmite otras longitudes de onda. Esto cambia la luz del bianco al color dependiendo de las longitudes de onda especificas de la luz transmitida.

Las absorbancias espectrales estrechas permiten la multiplexacion cromogenica a un nivel que va mas alia de la capacidad de los cromogenos tradicionales. Por ejemplo, los cromogenos tradicionales son en cierto modo aplicaciones duplex de forma rutinaria (por ejemplo, Fast Red y Fast Blue, Fast Red y Black (plateado), Fast Red y DAB). Sin embargo, las aplicaciones triplex o tricolor son atipicas. En modos de realizacion ilustrativos, el procedimiento incluye detectar de dos a aproximadamente seis dianas diferentes, tales como de tres a seis, o de tres a cinco, usando diferentes conjugados de senalizacion o combinaciones de los mismos. En un modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz comprende iluminar la muestra biologica con una fuente de luz espectralmente estrecha, teniendo la fuente de luz espectralmente estrecha una emision espectral con una segunda anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm. En otro modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz incluye iluminar la muestra biologica con una fuente de luz LED. En otro modo de realizacion, iluminar la muestra biologica con luz incluye iluminar la muestra biologica con una fuente de luz filtrada.

Las muestras tambien se pueden evaluar cualitativa y semicuantitativamente. La evaluacion cualitativa incluye la evaluacion de la intensidad de la tincion, la identificacion de las celulas con tincion positiva y los com parti mentos

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intracelulares implicados en la tincion, y la evaluacion de la calidad global de la muestra o portaobjetos. Se realizan evaluaciones separadas de las muestras de prueba y este analisis puede incluir una comparacion con valores promedio conocidos para determinar si las muestras representan un estado anormal.

En un modo de realizacion, el conjugado de senalizacion se deposits covalentemente de forma proximal a la diana a una concentracion adecuada para producir una serial detectable, tal como a una concentracion superior a aproximadamente 1 x 1011 moleculas por cm2*pm hasta aproximadamente 1 x 1016 moleculas por cm2*pm de la muestra biologies. Un experto en la teenies podria calcular el numero de moleculas por cm2*pm de la muestra biologies usando la ecuacion 1 y las mediciones de absorbancia en la muestra, teniendo cuidado de sustraer la absorbancia correspondiente a la muestra. En un modo de realizacion del procedimiento divulgado, tal como un procedimiento de multi plexacion, detectar una serial incluye detectar una absorbancia de un 5 % o mas de luz incidente en comparacion con un fondo, y detectar una serial separada diferente incluye detectar una absorbancia de un 5 % o mas de luz incidente en comparacion con el fondo. En otro modo de realizacion, detectar una serial incluye detectar una absorbancia de un 20 % o mas de luz incidente en comparacion con un fondo, y detectar una serial separada diferente incluye detectar una absorbancia de un 20 % o mas de luz incidente en comparacion con el fondo.

En un modo de realizacion, la primers diana y la segunda diana son acidos nucleicos geneticos. La deteccion de la primers diana a traves de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de senalizacion incluye la deteccion de una primers serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violets. La primers serial coloreada se asocia con la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromogeno del primer conjugado de senalizacion. La deteccion de la segunda diana a traves de la absorbancia de la luz por el segundo conjugado de senalizacion incluye la deteccion de una segunda serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violets. La segunda serial coloreada se asocia con la absorbancia espectral asociada con el segundo resto cromogeno del segundo conjugado de senalizacion. Una superposicion en proximidad a traves de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de senalizacion que se superpone en proximidad con el segundo conjugado de senalizacion, de modo que se puede detectar una tercera serial coloreada que esta asociada con la absorcion espectral superpuesta de la primers absorbancia espectral y la segunda absorbancia espectral. De acuerdo con un ejemplo, este tercer color indica una disposicion genetics normal y el primer y el segundo color indican una reordenacion o translocacion genetics.

Sonda de separation de tres colores porlSH

Aunque proporcionar una gama de nuevos colores para el reconocimiento de dianas en muestras biologicas es util por si solo, los conjugados de senalizacion divulgados en el presente documento son particularmente utiles en ensayos multiplexados, asi como en ensayos que usan sondas de translocacion. La figura 8(A) es una microfotografia de una tincion doble de dos sondas genicas en una seccion de tejido pulmonar que analiza los reordenamientos de ALK asociados con cancer de pulmon no microcitico y la figura 8(B) es un espectro de UV-Vis de Fast Red y Fast Blue en soluciones de acetato de etilo. La sonda 3' se detecto usando Fast Red y la sonda 5' se detecto usando Fast Blue. Las figuras 9(A) y 9(B) ilustran las trazas de la figura 8(B) por separado. La figura 8(B) muestra que el Fast Red y el Fast Blue tienen caracteristicas de absorcion espectral amplias y bien definidas. El Fast Red muestra una fuerte absorcion entre aproximadamente 475 nm y aproximadamente 560 nm. Comparando este intervalo con la rueda de colores, el color esperado correspondiente a la caracteristica de absorcion espectral seria rojo o naranja. El intervalo de absorcion es tan grande que cubre esencialmente todas las longitudes de onda que se esperaria obtener en un color rojo o naranja. El Fast Blue muestra una fuerte absorcion entre aproximadamente 525 nm y aproximadamente 625 nm, un intervalo incluso mas amplio que el Fast Red. Nuevamente, haciendo referenda a la rueda de colores de la figura 6(A), la absorcion de 525-625 nm cubre casi la mitad de la rueda de colores, siendo el azul, anil y violeta complementarios.

Con referenda ahora a la figura 8(A), un punto de Fast Red se resalta con el circulo (R), un punto de Fast Blue se resalta con el circulo (B), un conjunto de puntos formado por un punto de Fast Red y un punto de Fast Blue se etiquetan como adyacentes con el circulo (A), y un punto de Fast Red y un punto de Fast Blue superpuestos entre si se etiquetan con el circulo (O). Como se preveia, el punto de Fast Red (A) es rojo y el punto de Fast Blue (B) aparece de un color azulado oscuro que cabria esperar del punto de azul, anil y violeta. Los puntos adyacentes dentro del circulo (A) se pueden distinguir claramente entre si como un punto rojo y un punto azul separados. Sin embargo, el punto que incluye una superposicion de un punto rojo y un punto azul da como resultado un color ambiguo. Parece algo azulado y tiene una franja roja en un lado. El color del punto es dificil de distinguir y dificil de caracterizar. Para un punto de superposicion, la absorcion del Fast Red y el Fast Blue seria aditiva y el perfil de absorcion espectral se extenderia desde aproximadamente 475 nm hasta aproximadamente 625 nm y tendria una Amax de alrededor de 550 nm. Con referenda nuevamente a la rueda de colores (figura 6(A)), este intervalo de longitudes de onda cubre casi toda la rueda. La absorcion de base amplia que cubre todo el espectro da tipicamente un aspecto negro o marron con un tinte de los colores menos absorbidos, en este caso anil y violeta. Un anatomopatologo que evalue la microfotografia de la figura 8(A) puede tener dificultad para distinguir entre un punto de azul a anil (B) y el punto de superposicion (O).

Por consiguiente, ciertos modos de realizacion divulgados proporcionan la capacidad de elegir diferentes conjugados de senalizacion para resolver este problema. Por ejemplo, se pueden seleccionar deliberadamente diferentes conjugados de senalizacion y hacer que comprendan restos cromogenos que producen luz en los extremos opuestos

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del espectro UV-vis. Las figuras 10(A) y 10(B) ilustran como los conjugados de senalizacion y el procedimiento divulgados se pueden usar para resolver el problema asociado con las sondas que comprenden dos restos cromogenos diferentes. Con referenda a la figura 10(A), un resto cromogeno capaz de producir un color negro (“B”) se usa en combinacion con un resto cromogeno que produce un color rojo (“R”). Cuando los dos conjugados de senalizacion se superponen, no queda claro si el color negro observado (“B”) es producido por el resto cromogeno negro o si se produce por la superposicion entre los restos cromogenos rojo y negro. Sin embargo, con referenda a la figura 10(B), este problema se puede resolver usando dos restos cromogenos que, cuando se combinan, producen un tercer color unico. Por ejemplo, se puede usar un resto cromogeno purpura (“P”) en combinacion con un resto cromogeno amarillo (“Y”). La superposicion entre los dos se observa facilmente, ya que se produce una serial naranja (“O”). Las figuras 11 (A-B) muestran ademas como se pueden depositar dos colores proximalmente para crear un tercer color visualmente distinto. En particular, la figura 11(A) muestra una serial amarilla, que se muestra con una letra “y”, combinada con la serial magenta, que se muestra con una letra “m”, para crear un color rojo cereza vibrante, que se muestra con una letra “r”. La figura 11(B) muestra una serial magenta, indicada por la letra “m”, y una serial turquesa, indicada por la letra “t”, que se combinan para crear una serial azul oscuro, que se muestra con una letra “b”.

Huminacidn

En modos de realizacion divulgados particulares, se puede usar un sistema tradicional de fuente de luz blanca y filtro, tal como los usados tipicamente por los expertos en la tecnica. En otros modos de realizacion divulgados se puede usar una fuente de luz LED en la etapa de deteccion para generar una luz de iluminacion mas estrecha. Dichas fuentes de luz se pueden usar en modos de realizacion en los que se usan uno o mas conjugados de senalizacion diferentes, particularmente cuando se usan tres o mas conjugados diferentes.

El procedimiento divulgado en el presente documento proporciona una deteccion mejorada en terminos de la serial producida, asi como de los medios por los cuales se detecta la serial. Las tecnicas de deteccion tradicionales tipicamente comprenden el uso de colorantes absorbentes estrechos con filtrado espectral en los que el colorante absorbe solo a un estrecho intervalo de luz que tiene una cierta longitud de onda, y el filtro solo deja pasar un pequeno intervalo de longitudes de onda. Por consiguiente, combinar el filtro con dicha absorbancia produce un punto negro en un campo por lo demas claro, u otros cromogenos pueden tener absorbancias que estan dentro de los intervalos de absorbancia espectral del filtro y, por lo tanto, ni siquiera son apreciables mediante deteccion de campo claro. Este tipo de tecnica de deteccion tipicamente se deconvula en imagenes separadas o puede usar ademas una imagen superpuesta que tiene una coloracion falsa. Usando modos de realizacion del procedimiento divulgado en el presente documento, la deteccion de campo claro se puede usar en el analisis de senales cromogenicas sin los problemas tipicamente asociados con esta tecnica particular. La variedad de conjugados de senalizacion contemplados por la presente divulgacion proporciona la capacidad de analizar la muestra biologica en el campo claro y de detectar visualmente la(s) senal(es) de color emitida(s) sin manipulacion adicional. Ademas, la capacidad de usar fuentes de luz LED con el procedimiento divulgado proporciona flexibilidad en el intervalo de longitudes de onda que puede ser absorbido por el conjugado de senalizacion divulgado. En modos de realizacion divulgados particulares, los conjugados de senalizacion se pueden visualizar independientemente iluminando la muestra con luz de una longitud de onda a la que el cromogeno absorbe, haciendo de este modo que el cromogeno se vea oscuro contra un fondo claro (la luz es absorbida por el cromogeno, reduciendo la intensidad de la luz en ese punto). En modos de realizacion divulgados particulares, iluminar la muestra con luz que no es absorbida por el cromogeno causa que el cromogeno “desaparezca” debido a que la intensidad de la luz no se altera (absorbe) cuando pasa a traves del punto cromogeno. Unicamente a modo de ejemplo, al iluminar un portaobjetos con una muestra biologica con luz verde, los cromogenos de rodamina aparecen oscuros, mientras que el cromogeno Cy5 desaparece. Por el contrario, al iluminar el portaobjetos con luz roja, el cromogeno Cy5 aparece oscuro y los cromogenos de rodamina desaparecen.

Los portaobjetos tenidos usando ciertos conjugados de senalizacion divulgados se iluminaron usando un iluminador de multiples LED que se adapto al microscopio optico BX-51 de Olympus. Se utilizaron dos iluminadores LED: 1) un iluminador de 3 LED incorporado que incluye un motor de luz Lamina RGB (EZ-43F0-0431) con 3 reguladores de corriente BuckPlus de LEDdynamics con potenciometros e interruptores para permitir el control de activacion/desactivacion y la variation de las intensidades de LED rojo, verde y azul de forma independiente; y 2) un iluminador LED controlado por ordenador RGBA de TOFRA, Inc. para microscopios verticales modificado para la conmutacion manual de los LED. Para visualizar solo los cromogenos de tiramida, iluminar la muestra con luz de una longitud de onda a la que el cromogeno absorbe hace que el cromogeno se vea oscuro contra un fondo claro (la luz es absorbida por el cromogeno, reduciendo la intensidad de la luz en ese punto). Iluminar la muestra con luz que no es absorbida por el cromogeno causa que el cromogeno '“desaparezca” debido a que la intensidad de la luz no se altera (absorbe) cuando pasa a traves del punto cromogeno.

Las figuras 12(A-B) son microfotografias de una muestra que ha sido tenida doblemente con un conjugado de senalizacion turquesa y magenta bajo (A) iluminacion con luz blanca, (B) iluminacion con luz verde y (C) iluminacion con luz roja. Al iluminar el portaobjetos con luz verde, los conjugados de senalizacion turquesa aparecen oscuros, mientras que el conjugado de senalizacion magenta desaparece. Por el contrario, al iluminar el portaobjetos con luz roja, el conjugado de senalizacion magenta aparece oscuro y el conjugado de senalizacion turquesa desaparece. La superposicion entre los conjugados de senalizacion magenta y turquesa es oscura bajo iluminacion con luz blanca, iluminacion con luz verde e iluminacion con luz roja. Uno de los beneficios percibidos de la microscopia de

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fluorescencia es la capacidad de utilizar filtros para alternar entre las senales individuales de la sonda. Usando los conjugados de senalizacion descritos en el presente documento, es posible habilitar la conmutacion usando compuestos cromogenos. Al hacer coincidir la longitud de onda de emision del LED con la longitud de onda de absorbancia del colorante de tiramida, la serial del cromogeno coincidente “desaparece”. Las fuentes de alimentacion LED se pueden anadir facilmente a un microscopio optico reemplazando el condensador. El usuario puede cambiar la longitud de onda de emision del LED con solo presionar un boton.

Potenciacion de tirosina

La amplificacion de la serial de la tiramida y los conjugados de senalizacion descritos en el presente documento reaccionan con residuos de tirosina disponibles en la muestra y/o las moleculas/conjugados usados para detectar y marcar las dianas. La cantidad de proteina que rodea al biomarcador que se va a detectar es variable en funcion de la variacion natural entre las muestras de tejido. Cuando se detectan biomarcadores presentes en niveles altos, o cuando se detecta la colocalizacion de multiples biomarcadores, la cantidad de proteina a la que las moleculas de tiramida se pueden unir puede ser un reactivo limitante en el proceso de deposicion. Una cantidad insuficiente de proteina en el tejido puede dar como resultado la deteccion basada en la difusion de tiramida, la posibilidad de infravalorar el nivel de expresion de los biomarcadores y la imposibilidad de detectar biomarcadores colocalizados. Una solucion a estos problemas es proporcionar mas sitios de union a proteinas (es decir, tirosina) recubriendo el tejido con una solucion proteinica y reticulando permanentemente la proteina al tejido usando formol u otros fijadores.

La mayoria del trabajo con TSA se ha realizado en el contexto de la deteccion fluorescente. La deteccion fluorescente de TSA se logra mediante una unica deposicion de tiramida de un fluoroforo, y los tiempos de deposicion son en general bastante cortos porque la sensibilidad de la deteccion fluorescente es alta, mientras que el fondo asociado con la TSA tradicional se vuelve problematico con tiempos de deposicion mas largos. Por el contrario, la deteccion cromogenica de TSA puede incluir deposiciones multiples de conjugados de tiramida con tiempos de deposicion prolongados. Como resultado, la tecnica de TSA fluorescente no sugiere soluciones a problemas de TSA cromogenica porque la naturaleza del problema es muy diferente. En particular, se cree que la saturacion de los sitios de union de tirosina de una muestra por especies reactivas a la tiramida es un problema unico particular de las quimicas de deteccion descritas en el presente documento. Las potenciaciones en TSA que se originan a partir de la investigacion de fluorescencia de TSA tipicamente abordaron la difusion de los restos de tiramida reactivos y la ausencia de serial de TSA. Las soluciones a estos problemas se han descrito en la tecnica. Por ejemplo, se describio un aumento de la viscosidad de la solucion de reaccion mediante la adicion de polimeros solubles para disminuir la difusion y se potencio la actividad de HRP mediante la adicion de vainillina y/o yodofenol. Estas soluciones no fueron suficientes para resolver algunos de los problemas observados para las quimicas de deteccion descritas en el presente documento.

Atraves de varios estudios, se descubrio que la gravedad del problema identificado varia segun la muestra utilizada. Por ejemplo, se descubrio que los tejidos de cancer de mama y los tejidos de cancer de prostata incluian diferentes niveles de sitios de union a tiramida disponibles. Tambien se sabe que existen diferencias en el contenido de proteinas en los compartimentos celulares (nucleo, membrana celular, citoplasma, etc.) que son la diana de varias pruebas de IHC y/o ISH. Por lo tanto, ademas de ser necesaria para la colocalizacion de TSA, la invencion propuesta normalizara el contenido de proteina (por ejemplo, sitios de union a tiramida) y reducira la variacion entre muestras y a traves de ellas. En modos de realizacion ilustrativos, la adicion de un agente potenciador de la tirosina puede aumentar la reproducibilidad inter e intramuestra de los ensayos descritos en el presente documento.

Cuando se usan conjugados de amplificacion, como se describe en el presente documento, especialmente en combinacion con los conjugados de senalizacion descritos en el presente documento, la cantidad de proteina que rodea la diana o las dianas puede ser insuficiente. Cuando se detectan biomarcadores presentes a altos niveles, o cuando se detecta la colocalizacion de multiples biomarcadores, la cantidad de proteina en la muestra a la que se pueden acoplar los reactivos de deteccion basados en tiramina puede ser el reactivo limitante. Una insuficiencia en los sitios de union a tiramida puede provocar una velocidad de reaccion reducida, permitir que las moleculas reactivas de tiramida se difundan fuera de la diana y, en general, da como resultado una respuesta mas debil debido a cantidades mas bajas de los conjugados de senalizacion que reaccionan en las proximidades de la diana. Se descubrio que proporcionar mas sitios de union a la muestra potenciaba la deteccion como se describe en el presente documento. Un enfoque para potenciar los sitios de union disponibles fue introducir una solucion de proteina en la muestra. Para que la proteina permanezca tras varios lavados y para que la proteina no se difunda durante o despues de las etapas de deteccion posteriores, la proteina se reticulo a la muestra usando un fijador (por ejemplo, formol).

En modos de realizacion ilustrativos, una cantidad adicional de un reactivo que contiene tirosina, tal como una proteina, se puede incubar y fijar a la muestra biologica para proporcionar sitios de union adicionales para multiples conjugados de senalizacion o amplificacion, tales como en multiplexacion o amplificacion. Por ejemplo, cuando se usa una sonda de translocacion, se puede obtener una tincion de tres colores mas clara al anadir una cantidad adicional de proteina a la muestra biologica. Ademas, la union a sonda no especifica se puede disminuir usando esta etapa adicional. Los modos de realizacion a modo de ejemplo se refieren a la adicion de BSA a la muestra biologica, seguida de la fijacion de la proteina usando un agente de reticulacion, tal como un fijador (por ejemplo, FTN al 10 %).

Para demostrar la eficacia de la solucion, primero se establecio que las proteinas exogenas se pueden fijar a una

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muestra (por ejemplo, una muestra de tejido incluida en parafina y preparada histologicamente). Para demostrar que la proteina adicional se puede unir covalentemente a secciones de tejido incluidas en parafina, se funcionalizo la albumina de suero bovino (BSA) con un hapteno (2,1,3-benzoxadiaol-carbamida, “BF”). La BSA-BF se anadio al tejido despues de una etapa de hibridacion en la que no se anadio ninguna sonda, y todos los experimentos se completaron en un dispositivo de tincion automatizada de portaobjetos Benchmark XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Se anadieron 10 pg del conjugado BSA-BF al portaobjetos y se incubaron durante 16 minutos. La proteina BSA marcada con BF se fijo covalentemente al tejido mediante la adicion de 100 pi de paraformaldehido al 4 %, y se incubo durante 16 minutos. La presencia de BSA-BF unido covalentemente se detecto mediante la adicion de un anticuerpo monoclonal anti-BF que se funcionalizo con la enzima peroxidasa de rabano picante (HRP). Las figuras 13(A-B) muestran una microfotografia (figura 13(A)) de un portaobjetos de control al que no se anadio BSA-BF, y la figura 13(B) es una microfotografia del portaobjetos en el que se habia usado BSA-BF. La enzima HRP catalizo la deposicion de tiramida-TAMRA que tine el portaobjetos con un cromogeno rosa donde el BSA-BF estaba unido al tejido. Sin la presencia del BSA-BF, en las mismas condiciones experimentales, el cromogeno rosa no se deposits (figura 13(A)), lo que sugiere que la proteina BSA anadida exogenamente se puede fijar permanentemente en secciones de tejido incluidas en parafina.

Se descubrio que la aplicacion de un conjugado de senalizacion, como se describe en el presente documento, para ciertos modos de realizacion es mas eficaz usando un agente potenciador de tirosina despues de ciclos de deposicion de tiramida que no tinen. Para confirmar esta hipotesis, las muestras de tejido se sometieron a multiples pases de TSA con un conjugado tiramida-hapteno. Las figuras 14(A-B) son microfotografias de una primera muestra (figura 14(A)) en la que se deposito un conjugado de senalizacion, como se describe en el presente documento, y la figura 14(B) es una segunda muestra en la que se uso una solucion de potenciacion de tirosina antes de la deteccion con el conjugado de senalizacion. La diferencia entre la figura 14(A) y la figura 14(B) apoya la hipotesis de que la disponibilidad de proteina en la muestra se ve disminuida por las deposiciones de TSA y que la adicion de potenciadores que contienen tirosina puede proporcionar una tincion mas fuerte. En ausencia de fijacion de proteina (figura 14(A)), la posterior deposicion del conjugado de senalizacion produjo un bajo nivel de serial cromogenica. Cuando la proteina exogena se fijo a la seccion de tejido usando paraformaldehido (figura 14(B)), el conjugado de senalizacion produjo senales significativamente mas intensas y numerosas. Los datos sugieren que la fijacion de la proteina exogena a las secciones de tejido potencia la amplificacion de la serial de tiramida al proporcionar sitios de union a proteinas adicionales para que los reactivos de tiramida se unan covalentemente.

Un modo de realizacion divulgado de un procedimiento para detectar una diana en una muestra comprende: poner en contacto la muestra con una sonda de deteccion especifica para la diana; poner en contacto la muestra con un potenciador de tirosina; poner en contacto la muestra con un agente de reticulacion; poner en contacto la muestra con un reactivo de deteccion basado en tiramida; y detectar la diana en la muestra; en el que el reactivo de reticulacion une covalentemente el potenciador de tirosina a la muestra. En un modo de realizacion, el procedimiento comprende ademas poner en contacto la muestra con un conjugado de marcaje. En otro modo de realizacion, el procedimiento comprende ademas poner en contacto la muestra con un conjugado de amplificacion. En un modo de realizacion, el procedimiento comprende ademas detectar un segunda diana, en el que la puesta en contacto de la muestra con el potenciador de tirosina se produce despues de poner en contacto la muestra con los reactivos de deteccion basados en tiramida para la primera diana y antes de poner en contacto la muestra con reactivos de deteccion basados en tiramida para la segunda diana. En un modo de realizacion, el potenciador de tirosina incluye una proteina. En otro modo de realizacion, el potenciador de tirosina es un polimero que contiene residuos de tirosina. En un modo de realizacion, el agente de reticulacion es formol o formaldehido. En otro modo de realizacion, el agente de reticulacion es formol tamponado neutro (FTN). En otro modo de realizacion, el agente de reticulacion es un imidoester, un suberimidato de dimetilo o un ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS). En otro modo de realizacion, el agente de reticulacion es radiacion de luz. En un modo de realizacion, el agente de reticulacion es luz UV o radiacion de rayos X. En un modo de realizacion, la deteccion de la diana en la muestra incluye la obtencion de imagenes de al menos uno de los reactivos de deteccion basadosen tiramida. En otro modo de realizacion, la deteccion de la diana incluye la obtencion de imagenes fluorescentes de al menos uno de los reactivos de deteccion basados en tiramida. En otro modo de realizacion, la deteccion de la diana incluye la obtencion de imagenes de al menos uno de los reactivos de deteccion basadosen tiramida, en la que los reactivos de deteccion basadosen tiramida producen una serial cromogenica detectable usando microscopia de luz de campo claro. En otro modo de realizacion, la deteccion de la diana incluye la obtencion de imagenes de un conjugado de senalizacion. En otro modo de realizacion, la deteccion de la diana incluye la obtencion de imagenes de un cromogeno que se deposito en las proximidades de al menos uno de los reactivos de deteccion basados en tiramida.

Contratincion

La contratincion es un procedimiento de tratamiento posterior de las muestras despues de que ya se hayan tenido con agentes para detectar una o mas dianas, de forma que sus estructuras se puedan visualizar mas facilmente bajo un microscopio. Por ejemplo, se usa opcionalmente un contratinte antes de colocar el cubreobjetos para que la tincion inmunohistoquimica sea mas clara. Los contratintes difieren en el color de un tinte primario. Numerosos contratintes son bien conocidos, tales como hematoxilina, eosina, verde de metilo, azul de metileno, Giemsa, azul de Alcian y Fast Red nuclear. En algunos ejemplos, se puede mezclar mas de un tinte para producir el contratinte. Esto proporciona flexibilidad y la capacidad de elegir tintes. Por ejemplo, se puede seleccionar un primer tinte para la mezcla que tiene

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un atributo particular, pero aun no tiene un atributo deseado diferente. Se puede anadir un segundo tinte a la mezcla que muestre el atributo deseado que falta. Por ejemplo, azul de toluidina, DAPI y Pontamine Sky Blue se pueden mezclar para formar un contratinte. Un aspecto de la presente divulgacion es que los procedimientos de contratincion conocidos en la tecnica son combinables con los procedimientos y composiciones divulgados, de modo que la muestra tenida es facilmente interpretable por un lector.

III. Conjugados

En este documento se divulgan varios conjugados diferentes adecuados para su uso en el procedimiento divulgado. Las diversas clases de conjugados contemplados por la presente divulgacion se describen a continuacion.

A. Sondas de detection

La presente divulgacion se refiere a sondas de deteccion particulares que se pueden usar para detectar una diana en una muestra, por ejemplo, una muestra biologica. Las sondas de deteccion incluyen un resto de union especifica que es capaz de unirse especificamente a la diana. Las sondas de deteccion incluyen una o mas caracteristicas que permiten la deteccion a traves de un conjugado de marcaje. Las sondas de deteccion representatives incluyen sondas de acidos nucleicos y sondas de anticuerpos primarios.

En modos de realizacion ilustrativos, la sonda de deteccion es una sonda de oligonucleotido o una sonda de anticuerpo. Como se describe en el presente documento, las sondas de deteccion pueden ser sondas de deteccion indirecta. Las sondas de deteccion indirecta no estan configuradas para ser detectadas directamente. En particular, las sondas no estan configuradas con el proposito de visualizacion directa. En cambio, las sondas de deteccion seran en general de dos tipos, aunque estos no son tipos mutuamente excluyentes. El primer tipo de sonda de deteccion esta haptenada y el segundo tipo de sondas de deteccion se basa en una especie particular de anticuerpo. Se conocen otros tipos de sondas de deteccion en la tecnica y dentro del alcance de la presente divulgacion, pero estos se implementan con menos frecuencia, por ejemplo, sondas o anticuerpos marcados con aptamero, sondas o anticuerpos marcados con acido nucleico, anticuerpos que estan unidos covalentemente a otros anticuerpos a fin de proporcionar capacidades de doble union (por ejemplo, a traves de tecnicas de acoplamiento o a traves de proteinas de fusion). Si bien no estan configuradas como tales, algunas de las sondas de deteccion pueden tener propiedades que permitan su deteccion directa. Por ejemplo, el uso de fluoroforos de hapteno esta dentro del alcance de la presente divulgacion. De acuerdo con un modo de realizacion, la sonda de deteccion incluye un marcador de hapteno. Los expertos en la tecnica apreciaran que una sonda de deteccion se puede marcar con uno o mas haptenos usando diversos enfoques. La sonda de deteccion puede incluir un hapteno seleccionado del grupo que consiste en un hapteno de oxazol, hapteno de pirazol, hapteno de tiazol, hapteno de nitroarilo, hapteno de benzofurano, hapteno de triterpeno, hapteno de urea, hapteno de tiourea, hapteno de rotenoide, hapteno de cumarina, hapteno de ciclolignano, hapteno de dinitrofenilo, hapteno de biotina, hapteno de digoxigenina, hapteno de fluoresceina y hapteno de rodamina. En otros ejemplos, la sonda de deteccion es un anticuerpo monoclonal derivado de una segunda especie tal como cabra, conejo, raton o similar. Para marcar una sonda de deteccion marcada con hapteno, el conjugado de marcaje incluiria un anticuerpo anti-hapteno. Para marcar una sonda de deteccion basada en especies, el conjugado de marcaje se puede configurar con un anticuerpo antiespecie.

En modos de realizacion ilustrativos, la presente divulgacion describe sondas de acido nucleico que se hibridan con una o mas secuencias de acido nucleico diana. La sonda de acido nucleico se hibrida preferentemente con una secuencia de acido nucleico diana en condiciones adecuadas para la hibridacion, tales como condiciones adecuadas para hibridacion in situ, transferencia de Southern, o transferencia Northern. Preferentemente, la parte de sonda de deteccion comprende cualquier acido nucleico adecuado, tal como ARN, ADN, LNA, PNA o combinaciones de los mismos, y puede comprender nucleotidos estandar tales como ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos, asi como analogos de nucleotidos. LNA y PNA son dos ejemplos de analogos de acido nucleico que forman complejos de hibridacion que son mas estables (es decir, tienen una Tm aumentada) que los formados entre ADN y ADN o ADN y ARN. Los analogos LNA y PNA se pueden combinar con nucleosidos de ADN y ARN tradicionales durante la sintesis quimica para proporcionar moleculas de acido nucleico hibridas que se pueden usar como sondas. El uso de los analogos LNAy PNA permite modificar parametros de hibridacion tales como la Tm del complejo de hibridacion. Esto permite disenar sondas de deteccion que se hibridan con las secuencias diana de deteccion de las sondas de acido nucleico diana en condiciones que son iguales o similares a las condiciones requeridas para la hibridacion de la parte de sonda de la diana con la secuencia de acido nucleico diana.

Se pueden seleccionar sondas de acido nucleico adecuadas manualmente o con la ayuda de un algoritmo implementado por ordenador que optimiza la seleccion de la sonda en funcion de parametros deseados, tales como temperatura, longitud, contenido de GC, etc. Estan disponibles numerosos programas o algoritmos implementados por ordenador para su uso a traves de Internet o en un ordenador personal. Por ejemplo, para generar multiples regiones de union a partir de una secuencia de acido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de acido nucleico diana genomica), se identifican regiones de secuencia desprovistas de secuencias de acido nucleico repetitivas (u otras secuencias indeseables, por ejemplo, que producen fondo), por ejemplo, manualmente o usando un algoritmo informatico, tal como RepeatMasker. Los procedimientos para crear sondas sin repeticiones y unicamente especificas se encuentran, por ejemplo, en la publicacion de patente de EE. UU. n.° 2012/0070862. Dentro de una secuencia de

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acido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de acido nucleico diana genomica) que abarca de varias a varios cientos de kilobases, tipicamente se identifican numerosas regiones de union que estan sustancialmente o preferentemente completamente libres de secuencias de acido nucleico repetitivas (u otras secuencias indeseables, por ejemplo, que producen fondo).

En algunos modos de realizacion, se incorpora un hapteno en la sonda de acido nucleico, por ejemplo, mediante el uso de un nucleosido haptenilado. Los procedimientos para conjugar haptenos y otros marcadores a dNTP (por ejemplo, para facilitar la incorporacion en sondas marcadas) son bien conocidos en la tecnica. De hecho, numerosos dNTP marcados estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen Detection Technologies (Molecular Probes, Eugene, OR). Un marcador se puede unir directa o indirectamente a un dNTP en cualquier ubicacion del dNTP, tal como un fosfato (por ejemplo, fosfato a, p o y) o un azucar. Las sondas se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento de sintesis de acidos nucleicos conocido adecuado. En algunos modos de realizacion, las sondas de deteccion se sintetizan qulmicamente usando nucleosidos de fosforamidita y/o analogos de nucleosidos de fosforamidita. Por ejemplo, en algunos modos de realizacion, las sondas se sintetizan usando nucleosidos de fosforamidita de ARN o ADN estandar. En algunos modos de realizacion, las sondas se sintetizan utilizando fosforamiditas de FNA o fosforamiditas de PNA, solas o en combinacion con nucleosidos de fosforamidita estandar. En algunos modos de realizacion, se introducen haptenos en fosforamiditas abasicas que contienen los restos detectables deseados. Otros procedimientos tambien se pueden usar para la sintesis de sondas de deteccion. Por ejemplo, se puede usar un cebador hecho de analogos de FNA o una combinacion de analogos de FNA y nucleotidos estandar para la transcripcion del resto de la sonda. Como otro ejemplo, se utiliza un cebador que comprende restos detectables para la transcripcion del resto de la sonda. En otros modos de realizacion mas, los segmentos de la sonda producidos, por ejemplo, mediante transcripcion o sintesis quimica, se pueden unir mediante union enzimatica o quimica.

Se puede usar una variedad de haptenos en la parte del resto detectable de la sonda de deteccion. Dichos haptenos incluyen, pero no se limitan a, pirazoles, particularmente nitropirazoles; compuestos de nitrofenilo; benzofurazanos; triterpenos; ureas y tioureas, particularmente fenil ureas y, aun mas particularmente, fenil tioureas; rotenona y derivados de rotenona, tambien denominados en el presente documento rotenoides; oxazol y tiazoles, particularmente oxazol y tiazol sulfonamidas; cumarina y derivados de cumarina; ciclolignanos, ejemplificados por podofilotoxina y derivados de podofilotoxina; y combinaciones de los mismos, derivados de fluoresceina (FITC, TAMRA, Texas Red, etc.), digoxigenina (DIG), 5-nitro-3-pirozolcarbamida (nitropirazol, NP), 4,5-dimetoxi-2-nitrocinamida (nitrocinamida, NCA), 2-(3,4-dimetoxifenil)-quinolina-4-carbamida (fenilquinolona.DPQ), 2,1,3-benzoxadiazol-5-carbamida (benzofurazano, BF), 3-hidroxi-2-quinoxalinacarbamida (hidroxiquinoxalina, HQ), 4-(dimetilamino)azobenceno-4'- sulfonamida (DABSYL), rotenona isoxazolina (Rot), (E)-2-(2-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-4- il)fenozi)acetamida (benzodiazepina, BD), acido 7-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxllico (cumarina 343, CDO), 2-acetamido-4-metil-5-tiazolsulfonamida (tiazolsulfonamida, TS) y p-metoxifenilpirazopodofilamida (Podo). Estos haptenos y su uso en sondas se describen con mas detalle en la patente de EE. UU. n.° 7.695.929.

B. Conjugados de marcaje y conjugados de marcaje secundario

En modos de realizacion ilustrativos, el conjugado de marcaje se une especificamente a la sonda de deteccion y se configura para marcar la diana con una enzima. Como se describio anteriormente, las sondas de deteccion configuradas a partir de una segunda especie o para incluir un hapteno pueden ser detectadas por un anticuerpo antiespecie o un anticuerpo antihapteno. Un enfoque para configurar un conjugado de marcaje ha sido acoplar directamente una enzima al anticuerpo antiespecie o antihapteno. Los conjugados de este tipo, que pueden o no incluir diversos conectores, tambien se describen en la patente de EE. UU. n.° 7.695.929. El conjugado de marcaje incluye una o mas enzimas. Las enzimas ilustrativas incluyen oxidorreductasas o peroxidasas. El conjugado de senalizacion incluye un resto reactivo latente y un resto cromogeno. La enzima cataliza la conversion del resto reactivo latente en un resto reactivo que se une covalentemente a la muestra biologica de forma proximal a o directa sobre la diana.

El conjugado de marcaje secundario se usa en conexion con los conjugados de amplificacion, como se describe en el presente documento. Los conjugados de marcaje secundario se configuran de la misma manera que los conjugados de marcaje, excepto que estan configurados para marcar haptenos depositados a traves de un proceso de amplificacion en lugar de haptenos conjugados con conjugados de deteccion. En modos de realizacion ilustrativos, un conjugado de marcaje secundario comprende un anticuerpo antihapteno conjugado a una enzima. En un modo de realizacion, la enzima es una oxidorreductasa o una peroxidasa.

C. Conjugados de senalizacion

Otro tipo de conjugado divulgado en el presente documento es un conjugado de senalizacion. El conjugado de senalizacion proporciona la serial detectable que se usa para detectar la diana, de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento. En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado de senalizacion comprende un resto reactivo latente y un resto cromoforo.

Un aspecto de la presente divulgacion es que los conjugados de senalizacion se pueden configurar para absorber luz de forma mas selectiva que los cromogenos disponibles tradicionalmente. La deteccion se Neva a cabo mediante la

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absorbancia de la luz por el conjugado de senalizacion; por ejemplo, la absorbancia de al menos aproximadamente un 5 % de la luz incidente facilitaria la deteccion de la diana. En otras manchas mas oscuras, se absorberia al menos aproximadamente un 20 % de la luz incidente. La absorbancia no uniforme de la luz dentro de los espectros visibles da como resultado que el resto cromoforo aparezca coloreado. Los conjugados de cromogeno divulgados en el presente documento pueden aparecer coloreados debido a su absorbancia; los conjugados de cromogeno pueden aparecer de color rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta dependiendo de la absorbancia espectral asociada con el resto cromoforo. De acuerdo con otro aspecto, los restos cromoforos pueden tener absorbancias espectrales mas estrechas que las absorbancias de cromogenos usados tradicionalmente (por ejemplo, DAB, Fast Red, Fast Blue). En modos de realizacion ilustrativos, la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromoforo del primer conjugado de senalizacion tiene una anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm.

Las absorbancias espectrales estrechas permiten que el resto cromoforo del conjugado de senalizacion se analice de forma diferente que los cromogenos tradicionales. Si bien tiene caracteristicas mejoradas en comparacion con los cromogenos tradicionales, la deteccion de los conjugados de senalizacion sigue siendo sencilla. En modos de realizacion ilustrativos, la deteccion comprende usar un microscopio de campo claro o un escaner digital equivalente.

Un modo de realizacion del conjugado de senalizacion divulgado se ilustra en las figuras 2(A) y 2(B). Con referencia a las figuras 2(A-B), el conjugado de senalizacion 12 comprende un resto reactivo latente 4 y un resto cromoforo 6; en otro modo de realizacion, un conjugado de senalizacion alternative 14 puede incluir un conector 8 para conjugar el resto cromoforo 6 con el resto reactivo latente 4. En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado de senalizacion tiene la siguiente formula 1 general:

Crom6foro—

Conector opcional — Z-(-R26^-j^^j^

Formula 1

R25

El conjugado de senalizacion divulgado tipicamente comprende un resto reactivo latente como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el resto reactivo latente puede ser el mismo o diferente del conjugado de amplificacion divulgado; sin embargo, cada resto reactivo latente es capaz de formar una especie radical reactiva y tiene la formula general proporcionada en el presente documento. Como se muestra en la formula 1, el conjugado de senalizacion puede comprender un conector opcional. Si se utiliza un conector, se puede seleccionar de cualquiera de los conectores divulgados en el presente documento. En modos de realizacion divulgados particulares, el conector se selecciona para mejorar la solubilidad en una solucion hidrofila del conjugado de senalizacion y/o para mejorar la funcionalidad del conjugado en la muestra biologica. En un modo de realizacion divulgado particular, el conector es un conector de oxido de alquileno, tal como un conector de polietilenglicol; sin embargo, cualquiera de los conectores divulgados en el presente documento se puede usar para el conjugado de senalizacion.

1. Resto cromoforo

En general, un resto cromoforo se describe como la parte de una molecula responsable de su color. Los colores surgen cuando una molecula absorbe ciertas longitudes de onda de la luz visible y transmite o refleja otras. El cromoforo es una region de la molecula en la que la diferencia de energia entre dos orbitales moleculares diferentes esta dentro del intervalo del espectro visible, en el que la luz visible que interactua con esa region puede ser absorbida. En general, la absorbancia se asocia con una transicion de electrones desde su estado fundamental a un estado excitado. Las moleculas que tienen un estado fundamental para las diferencias de energia del estado excitado dentro del espectro visible a menudo son estructuras de carbono conjugadas. En estos compuestos, los electrones hacen la transicion entre niveles de energia que son orbitales pi extendidos, creados por una serie de enlaces simples y dobles alternados, a menudo en sistemas aromaticos. Los ejemplos comunes incluyen varios colorantes alimentarios, tintes de tejidos (compuestos azoicos), indicadores de pH, licopeno, (3-caroteno y antocianinas. La estructura de la molecula imparte la caracteristica de los orbitales pi que dan como resultado el nivel de energia. Tipicamente, alargar o extender un sistema conjugado con mas enlaces insaturados (multiples) en una molecula tendera a desplazar la absorcion a longitudes de onda mayores. Las reglas de Woodward-Fieser se pueden usar para aproximar la longitud de onda de absorcion maxima en el ultravioleta visible en compuestos organicos con sistemas de enlaces pi conjugados.

En modos de realizacion ilustrativos, los complejos metalicos pueden ser cromoforos. Por ejemplo, un metal en un complejo de coordinacion con ligandos a menudo absorbera la luz visible. Por ejemplo, la clorofila y la hemoglobina (el transportador de oxigeno de la sangre de los animales vertebrados) son cromoforos que incluyen complejos metalicos. En estos dos ejemplos, un metal esta complejado en el centra de un anillo de porfirina: el metal es hierro en el grupo hemo de la hemoglobina, o magnesio en el caso de la clorofila. El sistema de enlace pi altamente conjugado del anillo de porfirina absorbe la luz visible. La naturaleza del metal central tambien puede influir en el espectro de absorcion del complejo de metaloporfirina o en propiedades como la vida util del estado excitado.

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En modos de realizacion ilustrativos, el resto cromoforo es una cumarina o derivado de cumarina. A continuacion se proporciona una formula general para la cumarina o los derivados de cumarina.

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Con referenda a la formula 2, R1-R6 se definen en el presente documento. Al menos uno de los sustituyentes R1-R6 tambien se une tipicamente a un conector o al resto reactivo latente (por ejemplo, una tiramida o un derivado de tiramida). Ciertos modos de realizacion de trabajo han utilizado la posicion indicada como que tiene un sustituyente R5 para el acoplamiento a un conector o resto reactivo latente (por ejemplo, una tiramida o un derivado de tiramida). Se cree que los sustituyentes distintos de hidrogeno en la posicion 4 inactivan la fluorescencia, pero son utiles dentro del alcance de la presente divulgacion. Y se selecciona entre oxigeno, nitrogeno o azufre. Dos o mas de los sustituyentes R1-R6 disponibles para la formacion de dichos compuestos tambien pueden ser atomos, normalmente atomos de carbono, en un sistema de anillo unido o fusionado a los compuestos que tienen la formula general ilustrada. Los modos de realizacion a modo de ejemplo de estos tipos de compuestos incluyen:

R1

R6 R1 R6

V 8 1

Ay A \ „R5 A \ „R5

"Y^ *0 X ""r *0

R4

R4

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Un experto en la tecnica apreciara que los anillos tambien podrian ser heterociclicos y/o heteroarilos.

Los modos de realizacion de trabajo comprenden tipicamente sistemas de anillo A-D fusionados que tienen al menos una posicion de acoplamiento de conector, tiramida o derivado de tiramida, con una posicion de acoplamiento posible que se indica a continuacion:

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RR9 R10

Con referencia a la formula 3, los grupos variables R e Y son como se indica en el presente documento. Mas tipicamente, R1-R14 son, independientemente, hidrogeno o alquilo inferior. Los modos de realizacion particulares de cromoforos basados en cumarina incluyen acido 2,3,6,7-tetrahidro-11-oxo-1H,5H,11H-[1]benzopirano[6,7,8- ij]quinolizina-10-carboxilico

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y acido 7-(dietilamino)cumarin-3-carboxilico

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Otra clase de restos cromogenos adecuados para su uso en el presente documento incluye cromogenos que contienen diazo. Estos cromoforos particulares pueden tener una formula como se ilustra a continuacion.

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n

Con respecto a esta formula, el anillo E se puede seleccionar entre fenilo, imidazol, pirazol, oxazol y similares. Cada R2 se puede seleccionar independientemente de los grupos enumerados en el presente documento. En modos de realizacion divulgados particulares, cada R2 se selecciona independientemente entre amina, amina sustituida, fenilo, hidroxilo, cloruro de sulfonilo, sulfonato, carboxilato y combinaciones de los mismos; y n puede variar de cero a 5. Los modos de realizacion divulgados particulares se pueden seleccionar de los siguientes cromoforos diazoicos: DABSYL, que tiene una Amax. de aproximadamente 436 nm y tiene la siguiente estructura quimica

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’ Y

tartrazina, que tiene una Amax de aproximadamente 427 nm y tiene la siguiente estructura quimica

En otros modos de realizacion mas, el cromoforo puede ser un compuesto de triarilmetano. Los compuestos de triarilmetano dentro del alcance de la presente divulgacion pueden tener la siguiente formula.

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Ra Ra

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Con respecto a la formula 4, cada Ra se puede seleccionar independientemente entre hidrogeno, alifatico, arilo y alquilarilo; y cada R24 se puede seleccionar entre amina, amina sustituida, hidroxilo, alcoxi y combinaciones de los mismos; cada n puede variar independientemente de cero a 5. Los cromoforos ejemplares se proporcionan a continuacion:

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En otros modos de realizacion divulgados, el resto cromoforo puede tener la siguiente formula

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en la que cada Ra se puede seleccionar independientemente entre hidrogeno, alifatico, arilo y alquilarilo; cada R24 se puede seleccionar independientemente entre los grupos proporcionados en el presente documento, incluyendo arilo sustituido, que comprende un grupo arilo sustituido con uno o mas grupos seleccionados entre uno cualquiera de R1- R23, que se divulgan en el presente documento; Y puede ser nitrogeno o carbono; Z puede ser nitrogeno u oxigeno; y n puede variar de cero a 4. En modos de realizacion divulgados particulares, Z es nitrogeno y cada Ra puede estar fusionado a un atomo de carbono del anillo al que se une la amina que comprende Ra, o cada uno de Ra se puede unir para formar un anillo alifatico o aromatico de 4 o 6 miembros, que puede estar sustituido adicionalmente. A continuacion se proporcionan modos de realizacion a modo de ejemplo:

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otros derivados de rodamina, tales como tetrametilrodaminas (incluyendo TMR, TAMRA y derivados de isotiocianato reactivos) y derivados de diarilrodamina, tales como los colorantes QSY 7, QSY 9 y QSY 21.

Los cromoforos ejemplares se seleccionan del grupo que consiste en DAB; AEC; CN; BCIP/NBT; Fast Red; Fast Blue; fucsina; NBT; ALKGOLD; acetilazida Cascade Blue; ester succinimidilico del acido carboxilico/acido dapoxilsulfonico; DY-405; ester succinimidilico de Alexa Fluor 405; ester succinimidilico de Cascade Yellow; ester succinimidilico de piridiloxazol (PyMPO); ester succinimidilico de Pacific Blue; DY-415; ester succinimidilico del acido 7-hidroxicumarin- 3-carboxilico; DYQ-425; fosforamidita 6-FAM; Lucifer Yellow; yodoacetamida; ester succinimidilico de Alexa Fluor 430; ester succinimidilico de Dabcilo; cloruro/fluoruro de NBD; ester succinimidilico de QSY 35; DY-485XL; ester succinimidilico de Cy2; DY-490; ester succinimidilico del acido carboxilico Oregon Green 488; ester succinimidilico de Alexa Fluor 488; ester succinimidilico de BODIPY 493/503 C3; DY-480XL; ester succinimidilico de BODIPY FL C3; ester succinimidilico de BODIPY FL C5; ester succinimidilico de BODIPY FL-X; DYQ-505; ester succinimidilico del acido carboxilico Oregon Green 514; DY-510XL; DY-481XL; ester succinimidilico de 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'- dimetoxifluoresceina (JOE); DY-520XL; DY-521XL; ester succinimidilico de BODIPY R6G C3; isotiocianato de

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eritrosina; ester succinimidilico de 5-carboxi-2',4',5',7'-tetrabromosulfonafluoresceina; ester succinimidilico de Alexa Fluor 532; ester succinimidilico de 6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceina (HEX); ester succinimidilico de BODIPY 530/550 C3; DY-530; ester succinimidilico de BODIPY TMR-X; DY-555; DYQ-1; DY-556; ester succinimidilico de Cy3; DY-547; DY-549; DY-550; ester succinimidilico de Alexa Fluor 555; ester succinimidilico de Alexa Fluor 546; DY-548; ester succinimidilico de BODIPY 558/568 C3; ester succinimidilico de Rodamina Red-X; ester succinimidilico de QSY 7; ester succinimidilico de BODIPY 564/570 C3; ester succinimidilico de BODIPY 576/589 C3; ester succinimidilico de carboxi-X-rodamina (ROX); ester succinimidilico de Alexa Fluor 568; DY-590; ester succinimidilico de BODIPY 581/591 C3; DY-591; ester succinimidilico de BODIPY TR-X; ester succinimidilico de Alexa Fluor 594; DY- 594; ester succinimidilico de carboxinaftofluoresceina; DY-605; DY-610; ester succinimidilico de Alexa Fluor 610; DY- 615; ester succinimidilico de BODIPY 630/650-X; erioglaucina; ester succinimidilico de Alexa Fluor 633; ester succinimidilico de Alexa Fluor 635; DY-634; DY-630; DY-631; DY-632; DY-633; DYQ-2; DY-636; ester succinimidilico de BODIPY 650/665-X; DY-635; ester succinimidilico de Cy5; ester succinimidilico de Alexa Fluor 647; DY-647; DY- 648; DY-650; DY-654; DY-652; DY-649; DY-651; DYQ-660; DYQ-661; ester succinimidilico de Alexa Fluor 660; ester succinimidilico de Cy5.5; DY-677; DY-675; DY-676; DY-678; ester succinimidilico de Alexa Fluor 680; DY-679; DY- 680; DY-682; DY-681; DYQ-3; DYQ-700; ester succinimidilico de Alexa Fluor 700; DY-703; DY-701; DY-704; DY-700; DY-730; DY-731; DY-732; DY-734; DY-750; ester succinimidilico de Cy7; DY-749; DYQ-4; y ester succinimidilico de Cy7.5.

En modos de realizacion divulgados particulares, el resto cromoforo se puede seleccionar entre tartrazina, ester succinimidilico de acido 7-dietilaminocumarina-3-carboxilico, cloruro de sulfonilo de Dabsyl, ester carboxi succinimidilico de isotiocianato de fluoresceina (FITC) (DY-495), ester succinimidilico del acido carboxilico de Rhodamine Green (DY-505), isotiocianato de eosina (EITC), ester succinimidilico de 6-carboxi-2',4,7,7'- tetraclorofluoresceina (TET), ester succinimidilico de carboxirrodamina 6G, ester succinimidilico de carboxitetrametilrodamina (TMR, TAMRA) (DY-554), ester succinimidilico de QSY 9, cloruro de sulfonilo de sulforrodamina B (DY-560), Texas Red (sulforrodamina 101), galocianina, Fast Green FCF, verde malaquita, isotiocianato y ester succinimidilico de QSY 21. En ciertos modos de realizacion divulgados, el resto cromoforo del conjugado de senalizacion es distinto del cloruro de sulfonilo de Dabsyl, FITC, ester succinimidilico del acido 7- dietilaminocumarin-3-carboxilico, ester succinimidilico de acido carboxilico Rhodamine Green (DY-505), isotiocianato de eosina (EITC), ester succinimidilico de 6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceina (TET), ester succinimidilico de carboxitetrametilrodamina (TMR, TAMRA) (DY-554), cloruro de sulfonilo de sulforrodamina B (DY-560), Texas Red (sulforrodamina 101) y galocianina.

Otros restos cromogenos ejemplares que se usan para el conjugado de senalizacion se proporcionan a continuation:

H03S

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En modos de realizacion ilustrativos de la presente divulgacion, el conjugado de senalizacion tiene maximos de absorcion y amplitudes de absorcion particularmente adecuadas para la obtencion de imagenes de campo claro de dianas en muestras biologicas. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion esta configurado para proporcionar un pico de absorbancia que tiene una Amax. de entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 800 nm, entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 750 nm, o entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 700 nm. Estos intervalos de longitud de onda son de particular interes porque se traducen en colores visibles para los humanos. Sin embargo, los enfoques descritos en el presente documento tambien se podrian aplicar a restos cromoforos utiles para metodologias de diagnostico en el infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo (IR) o ultravioleta (UV).

En un modo de realizacion, el conjugado de senalizacion esta configurado para producir una serial coloreada seleccionada del grupo que consiste en rojo, naranja, amarillo, verde, anil, violeta o mezclas de los mismos. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 400 nm y 430 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial amarilla. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 430 nm y 490 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial naranja. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 490 nm y 560 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial roja. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 560 nm y 570 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial violeta. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 570 nm y 580 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial anil. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 580 nm y 620 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial azul. En un modo de realizacion, un conjugado de senalizacion tiene una Amax de entre aproximadamente 620 nm y aproximadamente 800 nm. En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion produce una serial verde.

En un modo de realizacion, el conjugado de senalizacion esta configurado para tener una anchura a media altura (AMA) de entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 60 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm, entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 150 nm, o entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 250 nm. En modos de realizacion divulgados particulares, la AMA es inferior a aproximadamente 300 nm, inferior a aproximadamente 250 nm, inferior a aproximadamente 200 nm, inferior a aproximadamente 150 nm, inferior a aproximadamente 100 nm, inferior a aproximadamente 50 nm. En modos de realizacion ilustrativos, se describe un conjugado de senalizacion que tiene una AMA inferior a aproximadamente 150 nm. En un modo de realizacion, la AMA es inferior a aproximadamente 150 nm, inferior a aproximadamente 120 nm, inferior a aproximadamente 100 nm, inferior a aproximadamente 80 nm, inferior a aproximadamente 60 nm, inferior a aproximadamente 50 nm, inferior a aproximadamente 40 nm, inferior a aproximadamente 30 nm, entre aproximadamente 10 nm y 150 nm, entre aproximadamente 10 nm y 120 nm, entre aproximadamente 10 nm y 100 nm, entre aproximadamente 10 nm y 80 nm, entre aproximadamente 10 nm y 60 nm, entre aproximadamente 10 nm y 50 nm o entre aproximadamente 10 nm y 40 nm.

En otro modo de realizacion, el conjugado de senalizacion tiene una absortividad molar promedio superior a de aproximadamente 5000 M1 cm1 a aproximadamente 90 000 M1 cm1. Por ejemplo, una absortividad molar promedio superior a aproximadamente 5000 M1 cm1, superior a aproximadamente 10 000 M1 cm1, superior a aproximadamente 20 000 M'1 cm1, superior a aproximadamente 40 000 M'1 crrr1 o superior a aproximadamente 80 000 M'1 crrr1. En otro modo de realizacion mas, el conjugado de senalizacion tiene una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 M. Por ejemplo, el conjugado de senalizacion tiene una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 0,1 mM, al menos aproximadamente 1 mM, al menos aproximadamente 10 mM, al menos aproximadamente 100 mM, o al menos aproximadamente 1 M. En un modo de realizacion, el conjugado de senalizacion es estable frente a la precipitacion en una solucion acuosa tamponada durante mas de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 30 meses. Por ejemplo, el conjugado de senalizacion es estable frente a la precipitacion en una solucion acuosa tamponada durante mas de aproximadamente 1 mes, mas de aproximadamente 3 meses, mas de aproximadamente 6 meses, mas de aproximadamente 12 meses, mas de aproximadamente 18 meses o mas de aproximadamente 24 meses.

Como se describe en el presente documento, la AMA del pico de absorcion contribuye significativamente al color observado del conjugado de senalizacion. Con referencia a la figura 6(A-B), se observan varios colores para la luz observada en un intervalo relativamente pequeno de longitudes de onda. En particular, la luz amarilla solo es aparente en un intervalo relativamente estrecho de 20 nm. Para impartir un color amarillo a una sustancia, se debe absorber a un intervalo relativamente estrecho de longitudes de onda visibles (400-430 nm). Con referencia a las figuras 7(A) y 7(B), el conjugado de senalizacion mostrado en las mismas tiene una AMA de aproximadamente 40 nm. La figura 15(A) es una primera microfotografia y la figura 15(B) es una segunda microfotografia de una proteina tenida (IHC de HER2 (4B5) en xenoinjertos Calu-3) usando el conjugado de senalizacion que tiene los espectros de absorcion mostrados en la figura 16. La linea A corresponde al conjugado de senalizacion utilizado para la figura 15(A) y la linea B corresponde al conjugado de senalizacion utilizado para la figura 15(B); observese que cada conjugado de senalizacion se analizo con espectrometria en solucion antes de la tincion y en el portaobjetos despues de haber detectado el HER2 (las lineas discontinues que representan los espectros obtenidos en el tejido). El conjugado de

senalizacion usado para tenir el tejido mostrado en la figura 15(A) tiene una Amax. de aproximadamente 456 nm y una AMA de aproximadamente 111 nm. El conjugado de senalizacion usado para tenir el tejido mostrado en la figura 15(B) tiene una Amax de aproximadamente 628 nm y una AMA de aproximadamente 70 nm.

5 La tabla 3 muestra un sistema de clasificacion para las propiedades espectrales de diversos conjugados de senalizacion de acuerdo con modos de realizacion ilustrativos de la presente divulgacion. De acuerdo con el sistema de clasificacion, hay seis colores diferentes en los que un cromogeno particular se podria clasificar como series numeradas mediante numeros romanos del uno al seis (es decir, I a VI). Para cada clasificacion de color, hay cinco clasificaciones de ancho de banda, realizandose esas clasificaciones de ancho de banda de acuerdo con mediciones 10 de AMA mas amplias. En consecuencia, la clasificacion de anchura de banda (a) es la mas estrecha e incluye aquellos conjugados de senalizacion que tienen anchuras AMA de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nm. La clasificacion de anchura de banda (e) es la mas amplia e incluye aquellos conjugados de senalizacion que tienen anchuras AMA de entre aproximadamente 130 y 160 nm. Un conjugado de senalizacion de color rojo que tiene una Amax de aproximadamente 530 nm y una AMA de aproximadamente 115 nm podria clasificarse como un conjugado de 15 senalizacion de serie lll(d).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 3: Sistema de clasificacion de las propiedades espectrales de conjugados de senalizacion

AMA (nm)

color Amax. (nm) 10-40 40-70 70-100 100-130 130-160

I.

amarillo 350-430 (a) (b) (c) (d) (e)

II.

naranja 430-490 (a) (b) (c) (d) (e)

III.

rojo 490-560 (a) (b) (c) (d) (e)

IV.

anil / violeta 560-580 (a) (b) (c) (d) (e)

V.

azul 580-620 (a) (b) (c) (d) (e)

VI.

verde 620-800 (a) (b) (c) (d) (e)

Las figuras 17(A-D) son microfotografias de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 17(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada. Como consecuencia, la linea (A) de la figura 17(E) corresponde al conjugado de senalizacion mostrado en la figura 17(A). Las otras lineas estan asociadas de manera similar con las microfotografias correspondientes. El color azul aparente en el portaobjetos es una solucion de azulado comercialmente disponible. La figura 17(A) y la linea “A” de la figura 17(E) muestran un conjugado de senalizacion de verde malaquita. Es clasificable como un conjugado de senalizacion l(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 17(B) y la linea “B” de la figura 17(E) muestran un conjugado de senalizacion de tartrazina. Es clasificable como un conjugado de senalizacion l(c) de acuerdo con la tabla 3. La figura 17(C) y la linea “C” de la figura 17(E) muestran un conjugado de senalizacion de sulforrodamina B. Es clasificable como un conjugado de senalizacion IV(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 17(D) y la linea “D” de la figura 17(E) muestran un conjugado de senalizacion de Victoria Blue. Es clasificable como un conjugado de senalizacion VI(c) de acuerdo con la tabla 3.

Las figuras 18(A-D) son microfotografias de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 18(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada. La figura 18(A) y la linea “A” de la figura 18(E) muestran un conjugado de senalizacion de cumarina (acido 4-(dietilamino)-2-oxo-2H-cromeno- 3-carboxilico). Es clasificable como un conjugado de senalizacion l(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 18(B) y la linea “B” de la figura 18(E) muestran un conjugado de senalizacion de Dabsyl (acido dimetilaminoazobencenosulfonico). Es clasificable como un conjugado de senalizacion ll(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 18(C) y la linea “C” de la figura 18(E) muestran un conjugado de senalizacion de TAMRA. Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 18(D) y la linea “D” de la figura 18(E) muestran un conjugado de senalizacion de 5-(y-6)-carboxirrodamina 110. Es clasificable como un conjugado de senalizacion V(a) de acuerdo con la tabla 3.

Las figuras 19(A-D) son microfotografias de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 19(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada. La figura 19(A) y la linea “A” de la figura 19(E) muestran un conjugado de senalizacion de FITC (1-(3',6'-dihidroxi-3-oxospiro(isobenzofuran- 1(3H),9'-(9H)xanten-5-ilo). Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 19(B) y la linea “B”"de la figura 19(E) muestran un conjugado de senalizacion de Rodamina 6G. Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(c) de acuerdo con la tabla 3. La figura 19(C) y la linea “C” de la figura 19(E) muestran un conjugado de senalizacion de Texas Red (sulforrodamina 101). Es clasificable como un conjugado de senalizacion IV(c) de acuerdo con la tabla 3. La figura 19(D) y la linea “D” de la figura 19(E) muestran un conjugado de senalizacion de Cy5. Es clasificable como un conjugado de senalizacion VI(c) de acuerdo con la tabla 3.

Las figuras 20(A-D) son microfotografias de tejidos tenidos con conjugados de senalizacion que tienen diferentes restos cromogenos. La figura 20(E) muestra los espectros de UV-Vis con trazas correspondientes a la absorbancia de los conjugados de senalizacion, correspondiendo las trazas a la microfotografia asociada. La figura 20(A) y la linea “A” de la figura 20(E) muestran un conjugado de senalizacion de Rodamina 110. Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(b) de acuerdo con la tabla 3. La figura 20(B) y la linea “B” de la figura 20(E) muestran un conjugado de senalizacion de JOE (ester succinimidilico de 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluorescema). Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(c) de acuerdo con la tabla 3. La figura 20(C) y la linea “C” de la figura 20(E) muestran un conjugado de senalizacion de galiocianina. Es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(c) de acuerdo con la tabla 3. La figura 19(D) y la linea “D” de la figura 19(E) muestran un conjugado de senalizacion de carboxirrodamina B. Tambien es clasificable como un conjugado de senalizacion lll(c) de acuerdo con la tabla 3.

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10

15

20

25

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60

En modos de realizacion ilustrativos, se divulga un procedimiento para detectar dianas multiples en una muestra usando conjugados de senalizacion espectralmente distintos. En un modo de realizacion, el procedimiento incluye usar dos o mas conjugados de senalizacion seleccionados entre aquellas clasificaciones mostradas en la tabla 3. En otro modo de realizacion, el procedimiento incluye usar tres o mas conjugados de senalizacion seleccionados entre aquellas clasificaciones mostradas en la tabla 3. En otro modo de realizacion, el procedimiento incluye usar un primer conjugado de senalizacion de una primera clasificacion l-VI y un segundo conjugado de senalizacion seleccionado de una segunda clasificacion l-VI, en el que la primera y la segunda clasificacion no son la misma. En otro modo de realizacion, el procedimiento incluye usar un primer conjugado de senalizacion de una primera clasificacion l-VI, un segundo conjugado de senalizacion de una segunda clasificacion l-VI y un tercer conjugado de senalizacion de una tercera clasificacion l-VI, en el que la primera, la segunda y la tercera clasificacion no son la misma. En otros modos de realizacion, al menos uno de los conjugados de senalizacion tiene una clasificacion de AMA de (e) o mas estrecha. En otro modo de realizacion, al menos uno de los conjugados de senalizacion tiene una clasificacion de AMA de (d) o mas estrecha. En otro modo de realizacion, al menos uno de los conjugados de senalizacion tiene una clasificacion de AMA de (c) o mas estrecha. En otro modo de realizacion, al menos uno de los conjugados de senalizacion tiene una clasificacion de AMA de (b) o mas estrecha. En otro modo de realizacion, al menos dos conjugados de senalizacion tienen una clasificacion de AMA de (e) o mas estrecha. En otro modo de realizacion, al menos tres conjugados de senalizacion tienen una clasificacion de AMA de (e) o mas estrecha.

2. Resto reactivo latente

El resto reactivo latente esta configurado para experimentar una activacion catalitica para formar una especie reactiva que se puede unir covalentemente a la muestra o a otros componentes de deteccion. La activacion catalitica es impulsada por una o mas enzimas (por ejemplo, enzimas oxidorreductasas y enzimas peroxidasas, como la peroxidasa de rabano picante). En presencia de peroxido, estas enzimas pueden catalizar la formacion de especies reactivas. Estas especies reactivas, por ejemplo, radicales libres, son capaces de reaccionar con compuestos fenolicos proximales a su generacion, es decir, cerca de la enzima. Los compuestos fenolicos disponibles en la muestra son con mayor frecuencia residuos de tirosilo de las proteinas. Como resultado, el resto reactivo latente se puede anadir a una muestra que contiene proteina en presencia de una enzima peroxidasa y un peroxido (por ejemplo, peroxido de hidrogeno), que puede catalizar la formacion de radicales y posteriormente hacer que el resto reactivo forme un enlace covalente con la muestra biologica.

En modos de realizacion divulgados particulares, el resto reactivo latente comprende al menos un resto aromatico. En modos de realizacion ejemplares, el resto reactivo latente comprende un resto fenolico y se une a un grupo fenol de un aminoacido tirosina. Sin embargo, es deseable unir especificamente el conjugado de marcaje a traves del resto reactivo latente en, o en estrecha proximidad con, una diana deseada a la muestra. Este objetivo se puede lograr inmovilizando la enzima en la region diana, como se describe en el presente documento. Solo los restos reactivos latentes que se encuentren muy proximos a la enzima inmovilizada reaccionaran y formaran enlaces con los residuos de tirosina en los alrededores de, o proximales a, la enzima inmovilizada, incluidos los residuos de tirosina en la enzima misma, los residuos de tirosina en el anticuerpo al que se conjuga la enzima y/o los residuos de tirosina en la muestra que son proximales a la enzima inmovilizada. En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado de marcaje se puede unir proximalmente, tal como hasta una distancia de aproximadamente 100 nm, hasta una distancia de aproximadamente 50 nm, hasta una distancia de aproximadamente 10 nm, o hasta una distancia de aproximadamente 5 nm de la enzima inmovilizada. Por ejemplo, el residuo de tirosina puede estar a una distancia de aproximadamente 10 angstroms hasta aproximadamente 100 nm, aproximadamente 10 angstroms hasta aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 angstroms hasta aproximadamente 10 nm o aproximadamente 10 angstroms hasta aproximadamente 5 nm de la enzima inmovilizada. Dicha union proximal permite que la diana se detecte con al menos el mismo grado de especificidad que los procedimientos de tincion convencionales usadoscon los procedimientos de deteccion divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los modos de realizacion del procedimiento divulgado permiten distinguir estructuras subcelulares, por ejemplo, la membrana nuclear frente a la region nuclear, la membrana celular frente a la region citoplasmica, etc.

En modos de realizacion divulgados particulares, el resto reactivo latente tiene la formula general ilustrada a continuacion.

imagen17

Formula 5

Con referencia a la formula 5, R25 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, eter, amina y amina sustituida; R26 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -ORm, -NRm y -SRm, en la que m es 1-20; n es 1-20; Z se selecciona del grupo que consiste en oxigeno, azufre y NRa en la que Ra se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alifatico, arilo y alquilarilo. Un modo de realizacion ejemplar del resto reactivo latente es tiramina (o tiramida, que es el nombre dado a una molecula de tiramina conjugada con el marcador

5

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20

25

detectable y/o el conector opcional) o un derivado de la misma.

En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado de senalizacion tiene una concentracion minima, cuando se deposita covalentemente sobre la muestra, de mas de aproximadamente 1 x 1011 moleculas por cm2*pm o de mas de aproximadamente 1 x 1013 moleculas por cm2*pm dentro de la muestra biologica. En modos de realizacion divulgados particulares, la concentracion de conjugado de senalizacion depositado varia de aproximadamente 1 x 1011 moleculas por cm2*pm a aproximadamente 1 x 1013 moleculas por cm2*pm.

Los modos de realizacion del conjugado de senalizacion divulgado se pueden realizar usando el procedimiento general ilustrado en el esquema 1. En modos de realizacion divulgados particulares, el conjugado se forma sin un conector opcional. Por ejemplo, un resto de acido carboxilico del cromoforo se puede acoplar con una molecula de tiramina o derivado de tiramina convirtiendo primero el acido carboxilico en un ester activado y luego formando un enlace amida entre el cromoforo y la molecula de tiramina o derivado de tiramina. Un procedimiento ejemplar para preparar un conjugado de senalizacion sin un conector se ilustra a continuacion en el esquema 2.

Cromoforo

O

A.

OH

NHS 1,5 eq 1,0 M DCC 1,5 eg

DCM, 16 h, t.a.

1. filtrar

2. concentrar

imagen18

H2N

imagen19

OH

1,2 eq

DMF, t.a., 16 h

flash 5-20 % MeOH/DCM

Esquema 1

imagen20

En modos de realizacion en los que el conector esta presente, el resto de acido carboxilico del cromoforo se puede acoplar con un conector terminado en amina (por ejemplo, un oxido de alquileno) convirtiendo primero el acido carboxilico en un ester activado y luego formando un enlace amida entre el cromoforo y el conector terminado en amina. El extremo restante del conector se puede activar y posteriormente acoplar con una molecula de tiramina o derivado de tiramina. Un procedimiento ejemplar para preparar el conjugado de senalizacion se proporciona a continuacion en el esquema 2.

O

Cromoforo

A

OH

NHS 1,5 eq 1,0 M DCC 1,5 eg

DCM, 16 h, t a

1. filtrar

2. concentrar

Cromofori

XX

O

imagen21

NHS 1,5 eq 1,0 M DCC 1,5 eq

1, filtrar

DCM, 16 h, t.a.

2. concentrar

imagen22

5

imagen23

Esquema 2

A continuacion se proporcionan conjugados de senalizacion a modo de ejemplo.

imagen24

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   Un procedimiento para detectar una primera diana en una muestra biologica, que comprende:

   poner en contacto la muestra biologica con una primera sonda de deteccion que comprende un fragmento de oligonucleotido o un anticuerpo de una especie particular capaz de unirse especificamente a la primera diana, en la que el fragmento de oligonucleotido incluye un hapteno;

   poner en contacto la muestra biologica con un primer conjugado de marcaje que incluye un anticuerpo antiespecie o antihapteno acoplado a una primera enzima, en el que la primera enzima es una oxidorreductasa o peroxidasa, y en el que el primer conjugado de marcaje, mediante su inclusion de un anticuerpo antiespecie o antihapteno, se une selectivamente a la primera sonda de deteccion;

   poner en contacto la muestra biologica con un primer conjugado de senalizacion que comprende un primer resto reactivo latente y un primer resto cromogeno;

   iluminar la muestra biologica con una fuente de luz espectralmente estrecha que tiene una emision espectral con una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 250 nm; y

   detectar la primera diana detectando una primera serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta, estando asociada la primera serial coloreada asociada con una absorbancia espectral con el primer resto cromogeno del primer conjugado de senalizacion;

   en la que la primera enzima cataliza la conversion del primer resto reactivo latente en un primer resto reactivo, que se une covalentemente a la muestra biologica proximalmente a o directamente sobre la primera diana al reaccionar con un residuo de tirosina de la muestra biologica, el primer conjugado de marcaje, la primera sonda de deteccion o combinaciones de los mismos;

   en el que el primer resto reactivo latente tiene la formula general

   imagen1

   en la que R25se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, eter, aminay aminasustituida; R26se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -ORm, -NRm y -SRm, en la que m es 1- 20; n es 1-20; Z se selecciona del grupo que consiste en oxigeno, azufre y NRa en la que Ra se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alifatico, arilo, y alquilarilo; y en el que la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromogeno del primer conjugado de senalizacion tiene una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 250 nm.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el primer resto reactivo latente es tiramina.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el hapteno se selecciona del grupo que consiste en un hapteno de oxazol, hapteno de pirazol, hapteno de tiazol, hapteno de nitroarilo, hapteno de benzofurano, hapteno de triterpeno, hapteno de urea, hapteno de tiourea, hapteno de rotenoide, hapteno de cumarina, hapteno de ciclolignano, hapteno de dinitrofenilo, hapteno de biotina, hapteno de digoxigenina, hapteno de fluoresceina y hapteno de rodamina.

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la absorbancia de la luz por el conjugado de senalizacion incluye una absorbancia de al menos un 5 % de luz incidente o al menos un 20 % de luz incidente.

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la absorbancia espectral asociada con el primer resto cromogeno del primer compuesto de senalizacion tiene una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 150 nm o entre 30 nm y 100 nm

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la deteccion comprende usar un microscopio de campo claro o un escaner digital equivalente.

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que iluminar la muestra biologica con luz comprende iluminar la muestra biologica con una fuente de luz espectralmente estrecha que tiene una emision espectral con una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 150 nm o entre 30 nm y 100 nm.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que iluminar la muestra biologica con luz incluye

   5

   10

   15

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   25

   30

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   40

   45

   50

   55

   60

   iluminar la muestra biologica con una fuente de luz LED o con una fuente de luz filtrada.
2. 9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende: poner en contacto la muestra biologica con un inhibidor enzimatico;

   poner en contacto la muestra biologica con una segunda sonda de deteccion que comprende un fragmento de oligonucleotido o un anticuerpo de una especie particular capaz de unirse especificamente a una segunda diana, en la que el fragmento de oligonucleotido incluye un hapteno;

   poner en contacto la muestra biologica con un segundo conjugado de marcaje que incluye un anticuerpo antiespecie o antihapteno acoplado a una segunda enzima, en el que la segunda enzima es una oxidorreductasa o peroxidasa, y en el que el segundo conjugado de marcaje, mediante su inclusion de un anticuerpo antiespecie o antihapteno, se une selectivamente a la segunda sonda de deteccion;

   poner en contacto la muestra biologica con un segundo conjugado de senalizacion que comprende un segundo resto reactivo latente y un segundo resto cromogeno, en el que la segunda enzima cataliza la conversion del segundo resto reactivo latente en un segundo resto reactivo, que se une covalentemente a la muestra biologica proximalmente a o directamente sobre la segunda diana al reaccionar con un residuo de tirosina de la muestra biologica, el segundo conjugado de marcaje, la segunda sonda de deteccion o combinaciones de los mismos;

   en el que el segundo resto reactivo latente tiene la formula general

   imagen2

   en la que R25se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, eter, aminay aminasustituida; R26se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -ORm, -NRm y -SRm, en la que m es 1- 20; n es 1-20; Z se selecciona del grupo que consiste en oxigeno, azufre y NRa en la que Ra se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alifatico, arilo, y alquilarilo; y en el que la absorbancia espectral asociada con el segundo resto cromogeno del segundo conjugado de senalizacion tiene una anchura a media altura (AMA) de entre 30 nm y 250 nm.
3. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el segundo resto reactivo latente es tiramina.
4. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en el que la primera enzima y la segunda enzima son

   las mismas.
5. 12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende ademas detectar

   una tercera, cuarta, quinta o sexta diana, en el que la deteccion de la tercera, cuarta, quinta o sexta diana comprende:

   poner en contacto la muestra biologica con un total de tres a seis sondas de deteccion que comprenden un fragmento de oligonucleotido o un anticuerpo de una especie particular capaz de unirse especificamente a la tercera, cuarta, quinta o sexta diana, en la que el fragmento de oligonucleotido incluye un hapteno;

   poner en contacto la muestra biologica con un total de tres a seis conjugados de marcado, en el que cada uno de los tres a seis conjugados de marcado incluye un anticuerpo antiespecie o antihapteno acoplado a una enzima, en el que la enzima es una oxidorreductasa o peroxidasa, y en el que cada uno de los tres a seis conjugados de marcaje, mediante su inclusion de un anticuerpo antiespecie o antihapteno, se une selectivamente a una de las tres a seis sondas de deteccion;

   poner en contacto la muestra biologica con un total de tres a seis conjugados de senalizacion, en el que cada uno de los tres a seis conjugados de senalizacion comprende un resto reactivo latente y un resto cromogeno, en el que las enzimas de los tres a seis conjugados de marcaje catalizan la conversion de los tres a seis restos reactivos latentes en tres a seis restos reactivos que se unen covalentemente a la muestra biologica proximalmente a o directamente sobre la tercera, cuarta, quinta o sexta diana, respectivamente, al reaccionar con un residuo de tirosina de la muestra biologica, el conjugado de marcaje, la sonda de deteccion o combinaciones de los mismos;

   poner en contacto la muestra biologica con un inhibidor enzimatico antes de poner en contacto la muestra biologica con uno de los tres a seis conjugados de senalizacion;

   en el que los tres a seis restos reactivos latentes tienen la formula general

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   imagen3

   en la que R25se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, eter, aminay aminasustituida; R26se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, -ORm, -NRm y -SRm, en la que m es 1- 20; n es 1-20; Z se selecciona del grupo que consiste en oxigeno, azufre y NRa en la que Ra se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alifatico, arilo y alquilarilo; y

   en el que la detection de las tres a seis dianas incluye detectar la absorbancia de la luz por los tres a seis conjugados de serialization detectando un total de tres a seis senales coloreadas seleccionadas entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta, el total de tres a seis senales coloreadas asociadas con absorbancias espectrales asociadas con el total de tres a seis restos cromogenos de los tres a seis conjugados de senalizacion, en el que las absorbancias espectrales de los tres a seis restos cromogenos son distintas entre si y tienen una AMA de entre 30 nm y 250 nm.
6. 13. El procedimiento de acuerdo con la revindication 12, en el que los tres a seis restos reactivos latentes son tiramina.
7. 14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la primera diana y la segunda diana son acidos nucleicos geneticos, en el que

   detectar la segunda diana a traves de la absorbancia de la luz por el segundo conjugado de senalizacion comprende detectar una segunda serial coloreada seleccionada entre rojo, naranja, amarillo, verde, anil o violeta, estando asociada la segunda serial coloreada asociada con la absorbancia espectral con el segundo resto cromogeno del segundo conjugado de senalizacion; y

   detectar una superposition en proximidad a traves de la absorbancia de la luz por el primer conjugado de senalizacion que se superpone en proximidad con el segundo conjugado de senalizacion, de modo que se genera una tercera serial coloreada asociada con la absorbancia espectral superpuesta de la primera absorbancia espectral y la segunda absorbancia espectral.
8. 15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que la tercera serial coloreada senala un ordenamiento genetico normal y la primera y la segunda serial coloreada indican un reordenamiento o translocation genetica.

   imagen4

   FIG. 1

   imagen5

   imagen6

   imagen7

   FIG, 3(A)

   FIG. 3(B)

   imagen8

   FIG, 3(C)

   FIG. 3(D)

   FIG. 3(E)

   imagen9

   imagen10

   imagen11

   FIG, 4(6)

   imagen12

   51 52 53

   FIG. 5(A)

   imagen13

   FIG. 5(B)

   Absorcion

   imagen14

   FIG. 6(A)

   V I B G Y 0 R

   imagen15

   400 500 600 700 800

   Longitud de onda (nm)

   Absorcion

   imagen16

   imagen17

   imagen18

   Longitud de onda (nm)

   FIG. 8(B)

   Absorbancia

   imagen19

   imagen20

   FIG. 9(B)

   imagen21

   imagen22

   imagen23

   FIG. 12(A)

   FIG. 12(B)

   FIG, 12(C)

   imagen24

   FIG. 14(A) FIG. 14(B)

   uojojosqv

   FIG. 15(A)

   FIG. 15(B)

   imagen25

   400

   450

   500

   550

   600

   650

   700

   750

   Longitud de onda (nm)

   FIG. 16

   imagen26

   Longitud de onda (nm) ^ * •— » —

   300 350 400 450 500 550

   FIG. 17(E)

   600

   650

   700

   750

   imagen27

   <

   300 350 400 450 500 550 600 650

   onda (nm,

   700

   750

   imagen28

   imagen29

   ( -Am , N \ ^li;v * ■: ■ \ .. ..*

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   400

   450

   500

   550

   600

   FIG. 19(E)

   650

   700

   750

   800

   imagen30

   * - ^ ^ I

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   450 500 550

   600

   650

   FIG. 20(E)

   imagen31

   imagen32

   FIG- 21(A)

   FIG. 21(B)

   94 % de linfoma de linfocitos B no Hodgkins

   DLBCL (37 %)_______

   Folicular (29 %)

   LLC (12%)

   MALT (9 %)

   MZL (7 %)

   105 104 103 102 101 10°

   FIG. 22

   imagen33

   FIG. 23(A) FIG. 23(B)

   imagen34

   FfG, 24(A)

   imagen35

   FJG- 24(B)

   imagen36

   imagen37

   imagen38

   imagen39

   FIG. 26(A)

   FIG, 26(B)

   FIG. 26(C)

   N.° ID lab bloque

   Numero de copias de ADN de HER2 Estado de proteina Her2 (IHC) Relacion HER2IACTB (qPCR) Serial de ISH- ARNm de ACTB Serial de ISH- ARNm de HER2

   26

   Normal 0 0,00 Positiva 0+

   28

   Normal 0 0,42 Positiva 0+

   32

   Amplificado 3+ 3,14 0+

   35

   Normal 0 0,52 Positiva 1/2+

   36

   Normal 1 + 0,94 Positiva 1/2+

   48

   Amplificado 1 + 0,06 Positiva 1/2+

   20

   Amplificado 3+ 94,59 1/2+

   40

   Normal 2+ 4,81 Positiva 1/2+

   41

   Normal 2+ 2,65 Positiva 1/2+

   43

   Normal 2+ 2,99 Positiva 1/2+

   54

   Normal 0 0,33 Positiva 1/2+

   7

   Normal 3+ 7,41 Positiva 3+

   8

   Amplificado 3+ 93,38 Positiva 3+

   23

   Amplificado 3+ 0,81 Positiva 3+

   27

   Amplificado 3+ 34,68 Positiva 3+

   30

   Amplificado 3+ 7,78 Positiva 3+

   33

   Amplificado 3+ 7,48 Positiva 3+

   51

   Amplificado 1 + 8,19 Positiva 3+

   56

   Amplificado 3+ 4,78 Positiva 3+

   57

   Amplificado 3+ 5,47 Positiva 3+

   FIG. 27

   imagen40

   FIG, 29 FIG. 30

   imagen41

   FIG. 32

   imagen42

   FIG. 34

   imagen43

   FIG. 35(C) FIG, 36