JP2024504944A - 保存安定なケージドハプテン - Google Patents

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ユリ ベロスルドツェフ，
ブライアン ディー． ケリー，
ネイサン ダブリュ． ポーラスク，
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ヴェンタナ メディカル システムズ， インク．
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Abstract

試料中の互いに近接して位置する標的の検出を容易にするのに有用なケージドハプテンおよびケージドハプテン－抗体コンジュゲートが本明細書において開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１３７，８０５号の出願日の恩典を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
開示される実施形態は、試料中の近くに位置する標的を含む、試料中の標的を検出することに関する。開示される実施形態はまた、ケージドハプテンまたはケージドハプテンコンジュゲートを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織中のタンパク質二量体を検出するための近接アッセイを提供する。
産業上の利用可能性の記載
本開示は、化学および診断の分野において産業上の利用可能性を有する。
本開示の背景
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、特定の抗原に対して特異的な抗体を使用して、生物学的試料中のタンパク質などの抗原を検出し、局在化し、および／または定量化する方法を指す。ＩＨＣは、特定のタンパク質が組織試料内のどこに位置するかを正確に特定するという多大な利点を提供する。ＩＨＣは、組織自体を調べるための効果的な方法でもある。インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸を検出し、局在化し、および定量化する方法を指す。ＩＨＣとＩＳＨはいずれも、組織（例えば、新鮮凍結、ホルマリン固定、パラフィン包埋された）および細胞学的試料などの様々な生物学的試料に対して実施され得る。標的の認識は、標的が核酸であるか抗原であるかに関わらず、様々な標識（例えば、発色性、蛍光性、発光性、放射性）を使用して検出され得る。診断目的で存在量の少ない細胞マーカーを確実に検出する能力がますます重要になるにつれて、臨床現場で標的を確実に検出し、局在化し、定量化するために、認識イベントの増幅が望まれている。例えば、単一の抗原検出イベントに応答してマーカーの部位に数百または数千の標識分子を沈着させると、増幅を通じて、その認識イベントを検出する能力が増強される。
タンパク質－タンパク質相互作用のネットワークは、生物系の顕著な特徴である。タンパク質－タンパク質間相互作用は、正常細胞および癌性細胞における細胞機能の全ての態様を調節するシグナル経路を形成する。細胞外増殖因子活性化後の一過性の受容体チロシンキナーゼ二量体化および複合体形成などのタンパク質－タンパク質相互作用を検出するための方法が開発されているが、これらの方法は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対して使用されるように特に設計されていない。
癌生物学における重要な決定因子であることが知られているバイオマーカーについて特異的な分子間相互作用の存在および分布を調べる能力は、新しい診断能力の文脈において、および医薬開発の文脈において治療効果を決定するために非常に興味深い。凍結およびパラフィン包埋された組織上での分子の相互作用の分布を探索し、記録する能力には、なお到達することができず、この問題にアプローチするための代替技術が提案されているが、解決策は実際の使用下で有効かつ信頼性があることが証明されていない。
近接ライゲーションアッセイが、Ｏｌｉｎｋ ＡＢによって開発された。これは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上でのタンパク質－タンパク質相互作用をインサイチュ検出するための唯一の公知の市販製品である。近接ライゲーションアッセイ技術は、パドロック環状ＤＮＡ鋳型を生成するためのＤＮＡリガーゼの他、ローリングサークル増幅のためのＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの酵素は高価である。さらに、これらの酵素は、自動化されたシステムおよび方法との使用には適していない。これらの理由から、近接ライゲーションアッセイは、商業的用途に一般的に有用であるとは考えられていない。
本開示の簡単な概要
本開示の第１の態様は、式（ＩＡ）および（ＩＢ）：
Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＡ）
Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＢ）
（式中、
Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであり、
［ホスホリル］は、式：
Figure 2024504944000002
（Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
によって表され、
前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
の任意の１つを有する、ケージドハプテンである。
いくつかの実施形態において、Ｑ１はＳである。
いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、両方のＱ２基がＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000003
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、結合である。いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの両方がＨである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000004
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、両方のＱ２基がＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯである。
本開示の第２の態様は、式（ＩＩＩＤ）：
Figure 2024504944000005
（式中、
Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
Ｒ３は、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
Ｒ４は、Ｈ、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、または直鎖もしくは分岐の、または置換されたもしくは置換されていないＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｏは、それぞれ独立して、０または１～４の範囲の整数であり、
Ｙは、－ＣＨ２－、－Ｃ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｈ）－、－Ｎ（Ｒ７）－、－Ｏ－、または－Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ７は、Ｃ１～Ｃ４直鎖または分岐の、置換されたまたは置換されていないアルキル基である）
を有する、ケージドハプテンである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000006
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000007
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、結合である。いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの両方がＨである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、Ｒ３、Ｒ４またはＲ６の少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｙは、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、Ｒ２はＨであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000008
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
本開示の第３の態様は、（ｉ）上記第１および第２の態様に記載されるケージドハプテンの任意の１つと、（ｉｉ）一次抗体とを含むコンジュゲートである。いくつかの実施形態において、ケージドハプテンは、一次抗体に間接的に結合されている。いくつかの実施形態において、一次抗体はインタクトな一次抗体である。
本開示の第４の態様は、（ｉ）上記第１および第２の態様に記載されるケージドハプテンの任意の１つと、（ｉｉ）二次抗体とを含むコンジュゲートである。いくつかの実施形態において、ケージドハプテンは、二次抗体に間接的に結合されている。いくつかの実施形態において、二次抗体はインタクトな二次抗体である。
本開示の第５の態様は、式（ＩＶＡ）および（ＩＶＢ）：
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＶＡ）
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＶＢ）
（式中、
Ｗ１は、結合であるか、または１～１０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｗ２は、反応性官能基に由来し、
［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであり、
［ホスホリル］は、式：
Figure 2024504944000009
（Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
によって表され、
［特異的結合実体］は、特異的結合実体であり、
前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
の任意の１つを有する、コンジュゲートである。
いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、抗体である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、一次抗体である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、二次抗体である。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＶＡ）を有し、［特異的結合実体］は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＶＢ）を有し、［特異的結合実体］は、モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する。いくつかの実施形態において、両方のＱ２基がＨである。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000010
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ２アルキル基である。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｒ８は、結合である。いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの両方がＨである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000011
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ２アルキル基である。
いくつかの実施形態において、ＲａまたはＲｂの少なくとも１つは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｚは、結合または－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態において、両方のＱ２基がＨである。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基に由来する。いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯである。
本開示の第６の態様は、第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析する方法であって、前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記試料を本開示の第３、第４および第５の態様に関して上述されたケージドハプテン－抗体コンジュゲートの任意の１つと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記試料を第１の検出試薬と接触させて、前記第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または前記第１の標的を標識すること、および前記標識された第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または標識された第１の標的を検出すること、を含む、方法である。いくつかの実施形態において、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートはモノクローナル抗体を含む。
いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、（ｉ）前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体の前記脱マスク化ハプテンに対して特異的な二次抗体であって、前記二次抗体が前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体を第１の酵素で標識するように、前記第１の酵素にコンジュゲートされている、二次抗体と、（ｉｉ）前記第１の酵素に対する第１の基質とを含む。
いくつかの実施形態において、第１の基質は、発色基質または蛍光基質である。
いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の脱マスク化酵素を複数の第１のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む。
いくつかの実施形態において、複数の第１のレポーター部分はハプテンである。
いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体をさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている。
本開示の第７の態様は、第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析するための方法であって、前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記試料を本開示の第３、第４および第５の態様に関して上述されたケージドハプテン－抗体コンジュゲートの任意の１つと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、シグナル増幅工程を実施して、前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を複数のレポーター部分で標識すること、前記複数のレポーター部分を検出すること、を含む、方法である。いくつかの実施形態において、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートはモノクローナル抗体を含む。
いくつかの実施形態において、複数のレポーター部分はハプテンであり、前記方法は、複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体を導入することをさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、第２のレポーター部分は増幅酵素であり、前記方法は増幅酵素に対する発色基質または蛍光基質を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、試料中の標的の総量を検出することをさらに含む。
本開示の第８の態様は、第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析するための方法であって、前記試料を第１の検出プローブと接触させることであって、前記第１の検出プローブは、本開示の第３、第４および第５の態様に関して上述されたケージドハプテン－抗体コンジュゲートまたは脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートのうちの一方を含む、接触させること、前記試料を第２の検出プローブと接触させることであって、前記第２の検出プローブは、本開示の第３、第４および第５の態様に関して上述されたケージドハプテン－抗体コンジュゲートのいずれか１つまたは前記脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートのうちの他方を含む、接触させること、前記試料を少なくとも第１の検出試薬と接触させて、形成された脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート標的複合体を標識すること、および前記標識された脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート標的複合体からのシグナルを検出すること、を含む、方法である。
いくつかの実施形態において、前記方法は、試料内の標的の総量を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の脱マスキング酵素を複数の第１のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む。いくつかの実施形態において、複数の第１のレポーター部分はハプテンである。いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体をさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、第２のレポーター部分は、増幅酵素またはフルオロフォアからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２のレポーター部分は増幅酵素であり、第１の検出試薬は増幅酵素に対する第１の発色基質または蛍光基質をさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、脱ケージ化工程をさらに含む。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。本特許または特許出願公開のカラー図面付きの写しは、申請および必要な料金の支払いに応じて庁に提供される。
図１は、ジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」の炭素のナンバリングを示す。この例では、ホスファート基がジゴキシゲニンの１２の位置に結合されている。
図２は、（標的２に結合した）アルカリホスファターゼを含む脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと（標的１に結合した）ケージドハプテン－抗体コンジュゲートとの間の相互作用を例示する概略図であり、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素は、（標的１と標的２とが互いに近接しているために）ケージドハプテン－抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応して、それぞれの脱マスク化ハプテンを提供し、これは検出され得る。
図３は、（標的２に結合した）脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートおよび（標的１に結合した）ケージドハプテン－抗体コンジュゲートを示す概略図であり、２つの標的は互いに近接しておらず、その結果、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素は、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートの酵素基質部分と相互作用せず、したがって、ケージドハプテンはマスクされたままであり、検出することができない。
図４は、試料中のタンパク質二量体および／または総タンパク質を検出する工程を示すフローチャートを提供する。
図５は、ケージドＤＩＧで標識された二次抗体を用いて単一の抗原が検出されるＩＨＣ染色プロトコルの一実施形態を示す概略図である。
図６は、天然型ＤＩＧハプテンを提供するためのケージドＤＩＧ、すなわちリン酸化ＤＩＧの脱ケージ化（または脱マスク化）を示す概略図である。
図７は、近接したタンパク質（標的１および標的２）および総タンパク質（標的２）の両方の多重検出を例示する概略図である。
図８は、ケージドハプテン、すなわちリン酸化ＤＩＧへの抗体の結合を示す。
図９は、天然型ハプテン（ＮＰおよびＤＩＧ）を形成するためのケージドニトロフェニル（ＮＰ）およびケージドＤＩＧ上のケージング基の加水分解を示す。
図１０は、２つの異なるケージドＮＰ分子およびケージドＤＩＧについて、元の材料の百分率として表される、天然型ハプテンに加水分解された（水によって非酵素的に切断された）ケージドハプテンの量をモニタリングする実験を示す。
図１１Ａは、ケージドＮＰを使用した扁桃組織上のＥ－カドヘリンおよびβ－カテニンに対する陽性近接アッセイの代表的な画像を示す。
図１１Ｂは、ケージドＤＩＧを使用した扁桃組織上のＥ－カドヘリンおよびβ－カテニンに対する陽性近接アッセイの代表的な画像を示す。
詳細な説明
ケージドハプテンおよびそれらの合成方法が本明細書に開示されている。ケージドハプテンを含むコンジュゲートも本明細書に開示されている。本明細書でより詳細に説明されているように、ケージドハプテンコンジュゲートは、組織試料中の近位抗原を検出するために使用され得る。これらおよび他の実施形態が、本明細書において記載されている。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。
ここで明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとする、すなわち、いくつかの要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、いくつかの要素または要素のリストのうちの複数も含み、リストに記載されていない追加の項目を任意に含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対のことが明確に示される用語のみが、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書において使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な択一（すなわち、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものと解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書で使用される場合、「備える」、「含む」、「有する」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、これらの用語の各々は、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義されており、したがって、「少なくとも以下のもの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」を意味する非限定的な用語として解釈され、また、追加の特徴、限定、態様などを除外しないように解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂおよびｃを有するデバイス」は、デバイスが少なくとも構成要素ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」という語句は、その方法が少なくとも工程ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。さらに、工程および過程は、本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付けられた工程および過程が変化し得ることを認識するであろう。
ここで明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストを参照する「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列記されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含むとは必ずしも限らず、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、少なくとも１つの、任意に１つより多くのＡを含み、Ｂが存在しない（および任意に、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態において、少なくとも１つの、任意に１つより多くのＢを含み、Ａが存在しない（および任意に、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態において、少なくとも１つの、任意に１つより多くのＡを含み、少なくとも１つの、任意に１つより多くのＢを含む（および任意に、他の要素を含む）を指すことができるなどである。
本明細書中で使用される場合、「アルカリホスファターゼ」（ＡＰ）という用語は、ホスファート－酸素結合を切断し、一時的に中間の酵素－基質結合を形成することによって、ホスファート基有機エステルを（加水分解によって）除去し、転移させる酵素を指す。例えば、ＡＰは、ナフトールホスファートエステル（基質）をフェノール化合物およびホスファートに加水分解する。フェノールは、無色のジアゾニウム塩（色素原）に結合して、不溶性の着色したアゾ染料を生成する。
本明細書で使用される場合、「アルキル」、「芳香族」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」などの用語は、示されたラジカルの置換された形態および置換されていない形態の両方を含む。その点に関して、基または部分が「置換された」または「任意に置換された」（または「任意に有する」または「任意に含む」）と記載されるときはいつでも、その基は非置換であるか、または示された置換基の１つ以上で置換され得る。同様に、基が「置換されたまたは置換されていない」と記載されている場合に、基が置換されていれば、置換基は、示された置換基のうちの１つ以上から選択され得る。置換基が示されていない場合、示された「任意に置換された」または「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、シアナート、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、保護されたＣ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、エーテル、アミノ（例えば、一置換アミノ基または二置換アミノ基）、およびそれらの保護された誘導体から個別にかつ独立して選択される１つ以上の基で置換され得ることを意味する。上記の基のいずれも、Ｏ、Ｎ、またはＳを含む１つ以上のヘテロ原子を含み得る。例えば、部分がアルキル基で置換されている場合、そのアルキル基は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択されるヘテロ原子を含み得る（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３））。
本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を指す。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがこれらに限定されない一般的に知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」という用語は、例として、天然に存在する抗体と天然に存在しない抗体の両方モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体；キメラ抗体およびヒト化抗体；ヒト抗体または非ヒト抗体；完全合成抗体；および一本鎖抗体を含む。ヒトにおけるその免疫原性を低下させるために、非ヒト抗体は組換え法によってヒト化され得る。明示的に述べられていない場合、および文脈が別段の指示をしない限り、「抗体」という用語はまた、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合断片または抗原結合部分を含み、一価および二価の断片または部分、ならびに一本鎖抗体を含む。
「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）という用語は、単一の分子組成の抗体分子、すなわちその一次配列が本質的に同一であり、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体分子の天然に存在しない調製物を指す。ｍＡｂは、単離された抗体の一例である。ＭＡｂは、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニックまたは当業者に公知の他の技術によって産生され得る。
本明細書で使用される場合、「抗体コンジュゲート」という語句は、１つ以上の標識に（直接的または間接的に）コンジュゲートされた抗体を指し、抗体コンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、標識は、二次抗体（抗標識抗体）などで（直接的または間接的に）検出することが可能である。例えば、抗体コンジュゲートは、ポリマーリンカーおよび／またはスペーサーなどを介してハプテンに結合され得、抗体コンジュゲートは、ハプテンによって間接的に検出され得る。代替例として、抗体コンジュゲートは、ポリマーリンカーおよび／またはスペーサーなどを介して色素原に結合され得、抗体コンジュゲートは、直接検出され得る。抗体コンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１４／０１４７９０６号ならびに米国特許第８，６５８，３８９号；同第８，６８６，１２２号；同第８，６１８，２６５号；同第８，８４６，３２０号；および同第８，４４５，１９１号にさらに記載されている。さらなる例として、「抗体コンジュゲート」という用語は、酵素、例えばＨＲＰまたはＡＰにコンジュゲートされた抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートはモノクローナル抗体を含む。他の実施形態において、抗体コンジュゲートはポリクローナル抗体を含む。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体などの特異的体液性または細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質およびホルモン、ならびに複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、核酸およびタンパク質などの高分子を含む任意の種類の分子であり得る。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、フェニルもしくはナフチルまたはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ、アロイル、ハロ、ニトロ、トリハロメチル、シアノ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アルキルチオ、アリールチオ、アルキレンまたは－ＮＹＹ’（ＹおよびＹ’は、独立して、水素、アルキル、アリールまたはアラルキルである）によって構成される群において選択される置換基の少なくとも１つで任意に置換されている、フェニルもしくはナフチルなどの、好ましくは６～１０個の炭素原子を含む芳香族炭素環式ラジカルまたは置換された炭素環式ラジカルを意味する。
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」という用語は、限定されないが、とりわけ細菌、酵母、原虫、およびアメーバなどの単細胞生物、多細胞生物（植物または動物など、健康もしくは見かけ上健康なヒト対象または癌などの診断もしくは調査される症状もしくは疾患に罹患しているヒト患者からの試料を含む）を含む任意の生物から得られるか、任意の生物によって排出されるか、または任意の生物によって分泌される任意の固体または流体試料であり得る。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の身体分泌物、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍、または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られた流体）、または関節（例えば、正常な関節または疾患に罹患した関節）から得られた流体から得られた生物学的流体であり得る。生物学的試料はまた、任意の器官もしくは組織（腫瘍生検などの生検または剖検検体を含む）から得られた試料であり得るか、または細胞（初代細胞または培養細胞であるかを問わない）もしくは任意の細胞、組織もしくは器官によって馴化された培地を含むことができる。いくつかの例では、生物学的試料は核抽出物である。特定の例では、試料は、開示された細胞ペレット切片試料の１つなどの品質管理試料である。他の例では、試料は試験試料である。試料は、当業者に公知の任意の方法を用いて調製され得る。試料は、定期的なスクリーニングのための対象から、または遺伝的異常、感染もしくは新生物などの障害を有することが疑われる対象から取得され得る。開示される方法の記載される実施形態はまた、「正常な」試料と呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害などを有さない試料に適用することができる。試料は、１つ以上の検出プローブによって特異的に結合され得る複数の標的を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ｂ」が整数である「Ｃａ～Ｃｂ」は、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基中の炭素原子の数、またはシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルもしくはアリール基の環中の炭素原子の数、またはヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールもしくはヘテロアリシクリル基中の炭素原子およびヘテロ原子の総数を指す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルの環、シクロアルケニルの環、シクロアルキニルの環、アリールの環、ヘテロアリールの環またはヘテロアリシクリルの環は、「ａ」個および「ｂ」個を含む「ａ」～「ｂ」個の炭素原子を含有することができる。したがって、例えば、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」基は、１～４個の炭素を有する全てのアルキル基、すなわち、ＣＨ３－、ＣＨ３ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－、（ＣＨ３）２ＣＨ－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－および（ＣＨ３）３Ｃ－を指す。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルシクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロアリシクリル基に関して「ａ」および「ｂ」が指定されていない場合、これらの定義に記載されている最も広い範囲が想定される。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、より大きな構築物に共有結合している２つ以上の分子または部分（高分子または超分子分子を含む）を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、１つ以上の他の分子部分に共有結合された１つ以上の生体分子（ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質およびリポタンパク質など）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、１つ以上の検出可能な標識（フルオロフォア、ルミノフォア、蛍光ナノ粒子、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせなど）に共有結合した１つ以上の特異的結合分子（抗体など）を含む。
本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、本明細書では以下と互換的に使用される：と組み合わせられる、に添加される、と混合される、の上を通る、とインキュベートされるなど。
本明細書で使用される場合、「結合する」または「結合」という用語は、ある分子または原子の別の分子または原子への結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（例えば、共有結合）、または連結を指す。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」または同様の用語（例えば、環状アルキル基）は、完全に飽和した（二重結合または三重結合がない）単環式または多環式炭化水素環系を指す。２つ以上の環から構成される場合、環は縮合様式で一緒に結合され得る。シクロアルキル基は、環に３～１０個の原子または環に３～８個の原子を含むことができる。シクロアルキル基は、非置換であってもよく、または置換されていてもよい。典型的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「発色団」という用語は、その色の原因となる分子または分子の一部（例えば発色基質）を指す。色は、分子が特定の波長の可視光を吸収し、他の波長を透過または反射するときに生じる。可視スペクトルの範囲内にある２つの異なる分子軌道間のエネルギー差を有する分子は、可視光を吸収し、したがって発色団として適切に特徴付けられ得る。発色団に入射した可視光は吸収され、したがって、基底状態の分子軌道から励起状態の分子軌道に電子を励起し得る。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、より大きな構築物へと共有結合されている２つ以上の分子または部分（高分子または超分子分子を含む）を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、１つ以上の他の分子部分に共有結合された１つ以上の生体分子（ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質およびリポタンパク質など）を含む。
本明細書で使用される場合、「検出可能部分」という用語は、試料中の標識の存在（すなわち、定性分析）および／または濃度（すなわち、定量分析）を示す（視覚的に、電子的に、またはその他の方法などで）検出可能なシグナルを生成することができる分子または材料を指す。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗原性である、すなわち特異的免疫応答を誘発する分子上の連続または非連続ペプチド配列などの抗原決定基を指す。抗体は、特定の抗原性エピトープに結合する。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン原子」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素などの元素の周期表の第７列の放射線安定性原子の任意の１つを意味する。
本明細書で使用される場合、「ハプテン」という用語は、抗体と特異的に結合することができるが、典型的には、担体分子と結合されている場合を除いて免疫原性であることが実質的に不可能である小分子を指す。いくつかの実施形態において、ハプテンとしては、限定されるものではないが、ピラゾール（例えば、ニトロピラゾール）、ニトロフェニル（ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ）化合物、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素（例えば、フェニル尿素）、チオ尿素（例えば、フェニルチオ尿素）、ロテノンおよびロテノン誘導体、オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）、チアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）、クマリン誘導体、ならびにシクロリグナンが挙げられる。ハプテンの追加の非限定的な例としては、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペンおよびシクロリグナンが挙げられる。ハプテンの具体例としては、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセイン、ならびにこれらの任意の誘導体または類似体が挙げられる。他のハプテンは、米国特許第８，８４６，３２０号、同第８，６１８，２６５号、同第７，６９５，９２９号、同第８，４８１，２７０号および同第９，０１７，９５４号に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ハプテン自体が、直接的な検出に適していることがあり得る、すなわち、検出に適した信号を発し得る。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」という用語は、ホウ素（Ｂ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、「複素環」は、１つ以上のヘテロ原子を含み得る。他の実施形態において、脂肪族基は、１つ以上のヘテロ原子を含み得るか、または１つ以上のヘテロ原子で置換され得る。
本明細書で使用される場合、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、標識された分子にコンジュゲートされ得る酵素である。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、適切な基質とインキュベートされると、標識された分子の有色誘導体、蛍光誘導体または発光性誘導体を生成し、検出および定量が可能になる。ＨＲＰは、電子供与体の存在下で作用して、まず酵素基質複合体を形成し、その後、電子供与体を酸化するように作用する。例えば、ＨＲＰは、３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）に作用して、検出可能な色を生成し得る。ＨＲＰはまた、標識されたチラミドコンジュゲートまたはチラミド様反応性コンジュゲート（すなわち、フェルラート、クマリン酸、カフェイン酸、シンナマート、ドーパミンなど）に作用して、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）のための有色または蛍光または無色のレポーター部分を沈着させ得る。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、原子もしくは分子、または原子もしくは分子の集合体であり得る検出可能部分を指す。標識は、検出され得る光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導性、容量性）のシグネチャを提供し得る。
本明細書で使用される場合、「多重化」、「多重化された」または「多重化している」という用語は、試料中の複数の標的を同時に、実質的に同時に、または順次検出することを指す。多重化は、複数の異なる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）およびポリペプチド（例えば、タンパク質）を個別に、および任意の組み合わせおよび全ての組み合わせの両方で同定および／または定量化することを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸またはポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾され得る。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示された配列のみならず、それらの保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（または、全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを指し、オリゴマーは、非ヌクレオチドモノマー単位、ならびに／またはオリゴマーの内部および／もしくは外部位置に結合した他の化学基を任意に含む。オリゴマーは天然または合成であり得、天然に存在するオリゴヌクレオチド、または天然に存在しない（または修飾された）塩基、糖部分、ホスホジエステル－類似体結合を有するヌクレオチド、ならびに／もしくは代替のモノマー単位キラリティーおよび異性体構造（例えば、５’から２’への結合、Ｌ－ヌクレオシド、α－アノマーヌクレオシド、β－アノマーヌクレオシド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を含むオリゴマーを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「一次抗体」という用語は、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は通常、免疫組織化学的手法で使用される第１の抗体である。いくつかの実施形態において、一次抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書で使用される場合、「反応性基」または「反応性官能基」という用語は、異なる部分の官能基と化学的に会合し、相互作用し、ハイブリダイズし、水素結合し、または結合することができる官能基を指す。いくつかの実施形態において、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間の「反応」は、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間で共有結合が形成されることを意味し得、または２つの反応性基もしくは２つの反応性官能基が互いに会合し、互いに相互作用し、互いにハイブリダイズし、互いに水素結合するなどを意味し得る。
例えば、反応性基は、アミン反応性基、例えばイソチオシアナート、イソシアナート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、酸塩化物、例えばスルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリコール、エポキシドおよびオキシラン、カーボナート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ならびにこれらの組み合わせであり得る。適切なチオール反応性官能基としては、ハロアセチルおよびハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール－ジスルフィド交換試薬、例えばピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオールおよびジスルフィド還元剤、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。適切なカルボキシラート反応性官能基としては、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール化合物およびカルボジイミド（ｃａｒｂｏｎｄｉｉｍｉｄｅｓ）が挙げられる。適切なヒドロキシル反応性官能基としては、エポキシドおよびオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボナートまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルマート、過ヨウ素酸酸化化合物、酵素酸化、アルキルハロゲンおよびイソシアナートが挙げられる。アルデヒドおよびケトン反応性官能基としては、ヒドラジン、シッフ塩基、還元的アミノ化生成物、マンニッヒ縮合生成物およびこれらの組み合わせが挙げられる。活性水素反応性化合物としては、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合生成物、ヨウ素化反応生成物およびこれらの組み合わせが挙げられる。光反応性化学官能基としては、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾホノン（ｂｅｎｚｏｐｈｏｎｏｎｅｓ）、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される場合、本明細書での「二次抗体」という用語は、一次抗体に特異的に結合し、それにより、もし後続の試薬が存在すれば、一次抗体と後続の試薬（例えば、標識、酵素など）との間に架橋を形成する抗体を指す。二次抗体は、一般的に免疫組織化学的手法で使用される第２の抗体である。
本明細書で使用される場合、「特異的結合実体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０－３Ｍ大きい、１０－４Ｍ大きいまたは１０－５Ｍ大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジンおよびプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（またはその部分）を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、有機化合物の全ての許容可能な置換基を含むことが想定される。基または部分が「置換された」または「任意に置換された」（または「任意に有する」または「任意に含む」）と記載されるときはいつでも、その基は非置換であり得、または１つ以上の示される置換基で置換され得る。同様に、基が置換されている場合に「置換されたまたは置換されていない」と記載されている場合に、基が置換されていれば、置換基は、１つ以上の示される置換基から選択され得る。
いくつかの実施形態において、許容され得る置換基としては、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の置換基が挙げられる。いくつかの実施形態において、許容可能な置換基は、適切な有機化合物に対して１つ以上であり得、同一でありまたは異なり得る。いくつかの実施形態において、置換基が示されていない場合、示された「任意に置換された」または「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、シアナート、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、保護されたＣ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、エーテル、アミノ（例えば、一置換アミノ基または二置換アミノ基）およびこれらの保護された誘導体から個別にかつ独立して選択される１つ以上の基で置換され得ることを意味する。上記の基のいずれも、Ｏ、ＮまたはＳを含む１つ以上のヘテロ原子を含み得る。例えば、部分がアルキル基で置換されている場合、そのアルキル基は、Ｏ、ＮまたはＳから選択されるヘテロ原子を含み得る（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）－）。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、それについて存在、位置および／または濃度が決定されるか、または決定されることができる任意の分子を指す。標的分子の例は、タンパク質、核酸配列、およびタンパク質に共有結合したハプテンなどのハプテンを含む。標的分子は通常、特異的な結合分子と検出可能な標識との、１つ以上のコンジュゲートを用いて検出される。
本明細書で使用される場合、「チラミドシグナル増幅」または「ＴＳＡ」という用語は、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）の触媒活性を利用してインサイチュで標的分子（タンパク質または核酸配列など）の高密度標識を生成する、酵素によって媒介される検出方法を指す。ＴＳＡは、典型的には３つの基本工程：（１）特異的結合メンバー（例えば、モノクローナル抗体などの抗体）の標的への結合、続いて、第２のペルオキシダーゼ標識された特異的結合メンバーによる前記特異的結合メンバーの二次検出；（２）ペルオキシダーゼによる複数コピーの標識されたチラミド誘導体（例えば、ハプテン標識されたチラミド）の活性化；および（３）得られた高反応性チラミドラジカルをペルオキシダーゼ－標的相互作用部位の近位の残基（例えば、タンパク質チロシン残基のフェノール部分）に共有結合させ、標的の近位にハプテンを沈着させること（拡散および反応性による媒介）、を含む。ＴＳＡのいくつかの例では、より多くのまたはより少ない工程が含まれる。例えば、信号を増加させるためにＴＳＡ法を順次繰り返すことができる。ＴＳＡを実施する方法ならびにＴＳＡを実施するための市販のキットおよび試薬が利用可能である（例えば、Ａｍｐ Ｍａｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＴＳＡ（商標），カタログ番号７６０－１２１、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＳＡキット番号Ｔ－２０９１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。他の酵素触媒される反応種、ハプテンまたはシグナル伝達が連結された反応種は、入手可能になり得るので、代替的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、
Figure 2024504944000012
は、部分が別の部分に結合している位置を指す。
概要
本開示は、「ケージドハプテン」、特異的結合実体と「ケージドハプテン」とを含むコンジュゲート、および試料内の１つ以上の標的（例えば、互いに近接している試料内の１つまたは複数のタンパク質標的）を検出するためにこれらを使用する方法に関する。本明細書でより詳細に記載されるように、本明細書に記載のケージドハプテンまたはケージドハプテン－コンジュゲートは、タンパク質二量体または互いに近接したタンパク質の検出を容易にする。
「ケージドハプテン」は、適切な抗ハプテン抗体がもはやハプテンを認識せず、結合事象が起こらないように、その構造が修飾されているハプテンである。例えば、リン酸基に結合されているＤＩＧハプテンは、もはや抗ＤＩＧ抗体によって認識されないことがあり得る。実際には、ハプテンの同一性および／または機能は、「マスクされる」か、または「保護される」。このマスキングまたは保護を達成するために、本開示のハプテンは、酵素的に切断可能なケージング基（酵素的に切断可能なマスキング基とも呼ばれる）を含む。
酵素的に切断可能なケージング基またはマスキング基に対して作用する酵素を導入すると、ケージング基またはマスキング基が放出されて、「天然型」ハプテン（「非ケージ化ハプテン」または「脱マスク化ハプテン」とも呼ばれる。）を再生する。次いで、この天然型ハプテンは、抗ハプテン抗体によって認識され得る。したがって、適切な酵素の存在下で、ケージドハプテンは脱マスク化されており、抗ハプテン抗体はそれに自由に結合する。上記の例では、ＤＩＧのホスファート基がアルカリホスファターゼ酵素によって切断されると、天然型ＤＩＧハプテンが曝露され、抗ＤＩＧハプテンがそれに結合することができる。図６は、抗ハプテン抗体によって認識可能な天然型ハプテンを提供するための酵素処理を介したケージドハプテンの脱マスク化を示す。
ケージドハプテン
いくつかの実施形態において、本開示のケージドハプテンは、式（ＩＡ）または（ＩＢ）：
Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＡ）
Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＢ）
（式中、
Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであるか、または［ＤＩＧ］に由来し、
［ホスホリル］は、式：
Figure 2024504944000013
（Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
によって表され得、
前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
の任意の１つの構造を有する。
いくつかの実施形態において、［ホスホリル］または－ＰＯ４Ｈ２は、ジゴキシゲニンの炭素１２の位置において結合される（図１参照）。いくつかの実施形態において、［ホスホリル］または－ＰＯ４Ｈ２は、ジゴキシゲニンの誘導体または類似体の炭素１２の位置において結合される。
いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯである。いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯであり、各Ｑ２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２は－ＣＨ３である。
上記のように、いくつかの実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。他の実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または５～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。さらなる実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または８～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、カルボニル、アミン、エステル、エーテル、アミド、イミン、チオンまたはチオール基を含み得る。他の実施形態において、Ｒ１は、アミン、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、イミン、チオンまたはチオールから選択される１つ以上の末端基を含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000014
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つは、アミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０のうちの少なくとも１つはアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＢ）：
Figure 2024504944000015
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、少なくとも１つまたはＲ９およびＲ１０はアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000016
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＤ）：
Figure 2024504944000017
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６であり、Ｒ９はアミドである。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＥ）：
Figure 2024504944000018
（式中、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。他の実施形態において、ｖは３～６の範囲の整数である。さらに他の実施形態において、ｖは４～６の範囲の整数である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２はカルボニル反応性基である。適切なカルボニル反応性基としては、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびアミンが挙げられる。
他の実施形態において、Ｒ２はアミン反応性基である。適切なアミン反応性基としては、ＮＨＳまたはスルホ－ＮＨＳなどの活性エステル、イソチオシアナート、イソシアナート、アシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボナート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、無水物などが挙げられる。
さらに他の実施形態において、Ｒ２はチオール反応性基である。適切なチオール反応性基には、非重合性Ｍｉｃｈａｅｌアクセプタ、ハロアセチル基（ヨードアセチルなど）、ハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、フルオロベンゼン基（テトラおよびペンタフルオロベンゼン基など）などの求核置換を受けることができる芳香族基ならびにピリジルジスルフィド基およびＥｌｌｍａｎ試薬で活性化されたチオールなどのジスルフィド基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、クリックケミストリー反応に関与することができる官能基または官能基を含む部分である。「クリックケミストリー」は、ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＭｅｌｄａｌのグループによって独自に定義された化学哲学であり、小さなユニットを結合することによって物質を迅速かつ確実に生成するように調整された化学を説明する。「クリックケミストリー」は、信頼性が高く自律的な有機反応のコレクションに適用されている（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ）．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４－２０２１）。例えば、水中での信頼性の高い分子結合として銅触媒によるアジド－アルキン［３＋２］環化付加を特定することが（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６－２５９９）、生体分子相互作用のいくつかのタイプの調査を補強するために使用されてきた（Ｗａｎｇ，Ｑ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２－３１９３；Ｓｐｅｅｒｓ，Ａ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，４６８６－４６８７；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１１６４－１１１６５；Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１７８２－１１７８３）。さらに、有機合成（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，９５８８－９５８９）、創薬（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ２００３，８，１１２８－１１３７；Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，１０５３－１０５７）、および表面の官能化（Ｍｅｎｇ，Ｊ．－Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４３，１２５５－１２６０；Ｆａｚｉｏ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１４３９７－１４４０２；Ｃｏｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００４，ＡＳＡＰ，印刷中；Ｌｕｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ，Ｔ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００４，印刷中）への応用も登場している。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、結合であるか、または１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基である。他の実施形態において、Ｒ１は、結合であるか、または１～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、結合であるか、または１～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、結合であるか、または１～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、結合であるか、または４～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、チオール反応性基、カルボニル反応性基またはアミン反応性基を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基は、本明細書に記載されている。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基は、本明細書に記載されている。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基は、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨであり、Ｒ２は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基を含む基または部分を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、炭素原子の１つの上に少なくとも１つの置換をさらに含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基であり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は結合であり、Ｒ２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｑ１はＯである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｑ１はＯであり、少なくとも１つのＱ２はＨである。
いくつかの実施形態において、本開示のケージドハプテンは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＦ）：
Figure 2024504944000019
Figure 2024504944000020
（式中、
Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり、
Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
Ｒ３は、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
Ｒ４は、Ｈ、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、ハロゲンまたは－Ｃ（Ｏ）Ｈであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、または直鎖もしくは分岐の、または置換されたもしくは置換されていないＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
ｍ、ｎおよびｏは、それぞれ独立して、０または１～４の範囲の整数であり、
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１～３の範囲の整数であり、
ｓは、１または２であり、および
ＸおよびＹは、それぞれ独立して、－ＣＨ２－、－Ｃ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｈ）－、－Ｎ（Ｒ７）－、－Ｏ－、または－Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ７は、Ｃ１～Ｃ４直鎖または分岐の、置換されたまたは置換されていないアルキル基である）
の任意の１つの構造を有する。
上記のように、いくつかの実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。他の実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または５～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。さらなる実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または６～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。さらなる実施形態において、Ｒ１は、結合であり得、または８～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に有する、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、カルボニル、アミン、エステル、エーテル、アミド、イミン、チオンまたはチオール基を含み得る。他の実施形態において、Ｒ１は、アミン、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、イミン、チオンまたはチオールから選択される１つ以上の末端基を含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮまたはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、ＯまたはＮからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、１～３０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。他の実施形態において、Ｒ１は、１～２０個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらに他の実施形態において、Ｒ１は、１～１５個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～１２個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、１～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。さらなる実施形態において、Ｒ１は、４～８個の炭素原子を有し、１個以上の酸素ヘテロ原子を任意に含み、少なくとも１個の炭素原子上に少なくとも１つの置換を含む非分岐脂肪族基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000021
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つは、アミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０のうちの少なくとも１つはアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８は－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）－であり、ＲｃおよびＲｄの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１である。いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、Ｒ８はＯであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＢ）：
Figure 2024504944000022
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、少なくとも１つまたはＲ９およびＲ１０はアミド基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも１であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含み、両方のＺ基は異なる。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６であり、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアミド基を含む。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000023
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＤ）：
Figure 2024504944000024
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｔ＋ｕは少なくとも２であり、ｖは少なくとも３である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６である。
いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも２であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも４であり、Ｒ９はアミドである。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂの少なくとも１つはＨであり、ｕは０であり、ｖは少なくとも６であり、Ｒ９はアミドである。
他の実施形態において、Ｒ１は、式（ＩＩＩＥ）：
Figure 2024504944000025
（式中、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、ｖは１～６の範囲である。他の実施形態において、ｖは１～４の範囲である。さらに他の実施形態において、ｖは２～６の範囲である。さらなる実施形態において、ｖは２～４の範囲である。他の実施形態において、ｖは３～６の範囲の整数である。さらに他の実施形態において、ｖは４～６の範囲の整数である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２はカルボニル反応性基である。適切なカルボニル反応性基としては、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体およびアミンが挙げられる。他の実施形態において、Ｒ２はアミン反応性基である。適切なアミン反応性基としては、ＮＨＳまたはスルホ－ＮＨＳなどの活性エステル、イソチオシアナート、イソシアナート、アシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボナート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、無水物などが挙げられる。さらに他の実施形態において、Ｒ２はチオール反応性基である。適切なチオール反応性基には、非重合性Ｍｉｃｈａｅｌアクセプタ、ハロアセチル基（ヨードアセチルなど）、ハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、フルオロベンゼン基（テトラおよびペンタフルオロベンゼン基など）などの求核置換を受けることができる芳香族基ならびにピリジルジスルフィド基およびＥｌｌｍａｎ試薬で活性化されたチオールなどのジスルフィド基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、クリックケミストリー反応に関与することができる官能基または官能基を含む部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは－ＣＨ３であり、Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは－ＣＨ３であり、Ｒ６はＣ１～Ｃ２アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは－ＣＨ３であり、Ｒ６はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の両方が－ＣＨ３であり、Ｒ６はＣ１～Ｃ４アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の両方が－ＣＨ３であり、Ｒ６はＣ１～Ｃ２アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ３およびＲ４の少なくとも両方が－ＣＨ３であり、Ｒ６はＨである。
いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択される。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択され、少なくとも１つのＲ３またはＲ４は－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択され、Ｒ３およびＲ４の両方が－ＣＨ３である。
いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択され、ｓは１である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択され、ｓは１であり、少なくとも１つのＲ３またはＲ４は－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、各Ｒ５はＨまたは－ＣＨ３から選択され、ｓは１であり、Ｒ３およびＲ４の両方が－ＣＨ３である。
いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ１であり、少なくとも１つのＲ５は－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０であり、少なくとも１つのＲ３またはＲ４は－ＣＨ３である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ０であり、Ｒ３およびＲ４の両方が－ＣＨ３である。
いくつかの実施形態において、ＸはＯである。いくつかの実施形態において、ＸはＯであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、ＸはＯである。いくつかの実施形態において、ＸはＯであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－であり、ｓは１である。いくつかの実施形態において、ＸはＯであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－であり、ｓは１であり、Ｑ１はＯである。いくつかの実施形態において、ＸはＯであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－であり、ｓは１であり、Ｑ１はＳである。いくつかの実施形態において、ＸはＯであり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－であり、ｓは１であり、Ｑ１はＯであり、各Ｑ２はＨである。
式（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＦ）の化合物の非限定的な例には、
Figure 2024504944000026
が含まれるが、これらに限定されない。
ケージドハプテンコンジュゲート
本開示はまた、ケージドハプテンを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、特異的結合実体およびケージドハプテン、例えば式（ＩＡ）、（ＩＢ）または（ＩＩＡ）～（ＩＩＦ）の任意の１つの構造を有するケージドハプテンを含む。特異的結合実体、例えば抗体、核酸分子、オリゴヌクレオチドなどをケージドハプテンに結合させる方法が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＡ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＢ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＡ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＢ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＣ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＤ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＥ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＦ）の構造を有するケージドハプテンに結合された抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）を含む。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、一次抗体または二次抗体はモノクローナル抗体である。
一次抗体の例としては、抗Ｈｅｒ２、抗Ｈｅｒ３、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗Ｅ－カドヘリン、抗β－カテニン、抗ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、抗ｃＭＥＴ、抗ＧＲＢ２、抗ＴＩＧＩＴ、抗ホスホチロシン、抗ユビキチンが挙げられる。二次抗体の例としては、抗ウサギ、抗マウス、抗ラット、抗ヤギ、抗ラクダ科動物、抗ＤＩＧ、抗ＤＮＰ、抗フルオレセインが挙げられる。
本開示のケージドハプテンは、抗体の任意の部分またはモノクローナル抗体の任意の部分に結合され得る。当業者は、抗体が、（ｉ）アミン（－ＮＨ２）、（ｉｉ）チオール基（－ＳＨ）および（ｉｉｉ）炭水化物残基を含む、共有結合修飾に適した３つの異なる種類の官能基を含むことを理解するであろう。したがって、本明細書に開示されているケージドハプテンのいずれもが、アミン残基、チオール残基および炭水化物残基またはこれらの任意の組み合わせに結合され得る。いくつかの実施形態において、ケージドハプテンは、抗体のＦｃ部分に結合される。
いくつかの実施形態において、特異的結合実体は、核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、核酸分子は、５～約５０のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５～約４０のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５～約３０のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５～約２５のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５～約２０ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、核酸分子は、５～約１５ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示のケージドハプテンコンジュゲートは、式（ＩＶＡ）または（ＩＶＢ）：
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＶＡ）
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＶＢ）
（式中、
［特異的結合実体］は、特異的結合実体であり、
Ｗ１は、結合であるか、または１～１０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｗ２は、結合であるか、または反応性官能基に由来し、
「反応性官能基、」Ｒ１、［ＤＩＧ］および［ホスホリル］は、本明細書に記載されているとおりである）
の任意の１つの構造を有する。
いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、一次抗体（例えば、β－カテニンに対して特異的な抗体にコンジュゲートされたケージドハプテン）である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、二次抗体（例えば、抗β－カテニン抗体に対して特異的な抗体にコンジュゲートされたケージドハプテン）である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ケージドハプテンコンジュゲートは、式（ＶＡ）または（ＶＦ）：
Figure 2024504944000027
Figure 2024504944000028
（式中、
［特異的結合実体］は、特異的結合実体であり、
Ｗ１は、結合であるか、または１～１０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｗ２は、結合であるか、または（本明細書に記載されているような）反応性官能基に由来し、
Ｑ１、Ｑ２、Ｒ１、Ｒ３～Ｒ７、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｓ、ＸおよびＹは、本明細書で定義されているとおりである）
の任意の１つの構造を有する。
いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、一次抗体（例えば、β－カテニンに対して特異的な抗体にコンジュゲートされたケージドハプテン）である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、二次抗体（例えば、抗β－カテニン抗体に対して特異的な抗体にコンジュゲートされたケージドハプテン）である。いくつかの実施形態において、［特異的結合実体］は、核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。
Ｗ１およびＷ２基の非限定的な例を以下に示す。
Figure 2024504944000029
本開示のコンジュゲートの非限定的な例には、以下のものが含まれる。
Figure 2024504944000030
ケージドハプテンコンジュゲートの合成
本開示のケージドハプテンコンジュゲートは、当業者に公知の任意の方法に従って合成され得る。いくつかの実施形態において、ケージドハプテン（式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＩＡ）～（ＩＩＦ）のもののいずれかを含む、本明細書に記載されているもののいずれかなど）は、抗体のチオール基、例えばモノクローナル抗体のチオール基にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジチオエリスリトール（ＤＴＥ）などの還元剤で抗体を処理することによって、まず、チオール基が抗体に導入される。ＤＴＥまたはＤＴＴなどの穏やかな還元剤の場合、抗体をインタクトな状態に保ちながら（これは、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる）、限定された数のチオール（約２～約６など）を抗体に導入するために、約１ｍＭ～約４０ｍＭの濃度（例えば、約５ｍＭ～約３０ｍＭまたは約１５ｍＭ～約２５ｍＭの濃度）が使用される。還元剤での処理後、それぞれのケージドハプテン－抗体コンジュゲートを形成するために、チオール反応性基（例えば、マレイミド基）を有する過剰なケージドハプテンが導入される。１つ以上のチオール基を導入する他の方法は、米国特許出願公開第２０１６／０１８７３２４号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
他の実施形態においては、ケージドハプテンは抗体のＦｃ部分にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態においては、アルデヒドを形成するために、まず、抗体のＦｃ部分を酸化し、その後、ケージドハプテンは、ケージドハプテン上の反応性官能基を通じて（例えば、ヒドラジド基などのカルボニル反応性基によって）、抗体の酸化されたＦｃ部分に結合される。
さらに他の実施形態において、ケージドハプテンは、抗体のリジン残基、例えばモノクローナル抗体のリジン残基にコンジュゲートされ得る。以下の合成スキーム（スキーム２）に示されているように、いくつかの実施形態において、過剰の適切に官能化されたケージドハプテン（例えば、マレイミド基などのチオール反応性基を有するもの）を添加する前に、まず、過剰のトラウト試薬（２－イミノチオラン塩酸塩）で抗体を処理する。
ケージドハプテンコンジュゲートの合成後、コンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などによって精製され、次いで、ゲル電気泳動および／またはＵＶ－Ｖｉｓなどによって特徴付けられ得る。
ケージドハプテンコンジュゲートを用いた近接検出
ここでより詳細に記載されるように、本開示は、タンパク質－タンパク質複合体、例えば互いに近接したタンパク質二量体またはタンパク質（例えば、５０００ｎｍ以下の近接を有するもの）の検出を容易にする。いくつかの実施形態において、アッセイは、４０００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。他の実施形態において、アッセイは、３０００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。他の実施形態において、アッセイは、２５００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。他の実施形態において、アッセイは、２０００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。他の実施形態において、アッセイは、１５００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。さらに他の実施形態において、アッセイは、１０００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。さらなる実施形態において、アッセイは、５００ｎｍ以下の近接を有するタンパク質二量体またはタンパク質を検出することができる。
タンパク質－タンパク質複合体（ＰＰＣ）は、細胞疾患状態および癌を含む全ての生理学的過程において分子ネットワークのシグナル伝達ノードおよびハブを形成する。再プログラムされた癌開始細胞は、新たな物理的および分子的特徴を獲得し、分子シグナル伝達経路を変化させることによって癌の全ての特徴を獲得および維持し、病理学的結果をもたらす。ＰＰＣは、それらの細胞において発癌性シグナルを伝達することに関与していると考えられている。ＰＰＣは、シグナル伝達を増大させることおよび増殖抑制因子の回避に関与し、その結果、癌の発生および進行をもたらすとも考えられている。タンパク質－タンパク質複合体の非限定的な例としては、Ｈｅｒ１／２／３／４タンパク質のいずれか同志
；ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１；および／またはＰＤ－Ｌ２、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）とそれに関連するリガンド（ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ）のいずれか；アダプタータンパク質ＧＲＢ２とＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ２、ＭＵＣ１などのリン酸化チロシンタンパク質；ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５が挙げられる。
出願人は、ＰＰＣが、免疫組織化学（ＩＨＣ）における機能的診断のみならず、治療開発のための標的の極めて有望なクラスであると考える。従来のＩＨＣは、従来の光学顕微鏡法の回折限界のために、２００ナノメートルの範囲の解像限界で単一のエピトープの存在を検出する。結果として、数十ナノメートルのオーダーで存在する複合体ではなく、共局在化に関してタンパク質を記載することが可能であるに過ぎない。凍結組織およびパラフィン包埋組織上での特定の分子間複合体の存在および分布を調べることが可能であることによって、ＩＨＣは構造的診断から機能的診断に移行することが可能になる。したがって、ＰＰＣおよびそれらが表すヒトインタラクトーム内の分子ネットワークを含めることで、バイオマーカーの定義はより広くなる。
開示された近接アッセイは、単にタンパク質－タンパク質相互作用を測定することより一般的であると考えられる。実際に、開示されるアッセイは、結合部分の近接性の測定を可能にする。実際には、結合部分（例えば、抗体）は、それらの間の距離が最小であるかまたは距離が全く存在しない標的に対して作られ得る。この例には、タンパク質のリン酸化のようなシグナル伝達事象が含まれ得る。この場合、１つの抗体がタンパク質（例えば、ＨＥＲ２）上のエピトープに対して作られたものであり、第２の抗体が全てのホスホ－チロシンに対して作られたものであるならば、近接シグナルは全てのリン酸化されたＨＥＲ２タンパク質を表すであろう。この種のアッセイは、互いに相互作用するタンパク質の対より二値性（あり／なし）である。
本開示のケージドハプテン－コンジュゲートのいずれもが、（ｉ）タンパク質二量体またはタンパク質近接の検出のための単式アッセイ；ならびに（ｉｉ）タンパク質二量体またはタンパク質近接の検出および総タンパク質の検出のための多重式アッセイのいずれにおいても使用され得る。「総タンパク質」は、任意の所与のタンパク質の通常のＩＨＣ可視化を指すのに対して、近接シグナルは、所与の相互作用に関与するこのタンパク質の一部である。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アッセイの場合、近接シグナルはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間での相互作用のみを可視化するのに対して、総タンパク質シグナルは試料中の全てのＰＤ－１を可視化する。近接性に対するスコアを分子として表し、総タンパク質に対するスコアを分母として表すと、相互作用に関与するＰＤ－１の割合または百分率を与えることができる。これは、タンパク質の発現が相互作用するタンパク質の数より重要ではない場合に、タンパク質－タンパク質相互作用を妨害する医薬品有効成分を検出するための診断法として重要であり得る。このことは、上記のようにリン酸化にも当てはまると考えられ、リン酸化シグナルについて単に任意のスコアを受け取る代わりに、与えられたタンパク質の何パーセントがリン酸化されているかを定量することが可能であり得る。
図４を参照すると、タンパク質二量体の検出は、２つの一般的な段階で行われる。第１の段階１５０では、試料は、少なくとも２種類の異なる抗体コンジュゲート、例えば少なくとも２種類の異なるモノクローナル抗体コンジュゲートで標識される。第２の段階１６０では、試料を第１のセットの検出試薬（例えば、単式アッセイの場合）と接触させ、任意に第２のセットの検出試薬（例えば、多重式アッセイの場合）と接触させる。第２の段階１６０の後に、第１および任意に第２のセットの検出試薬からの信号が検出される（工程１４０）。シグナルは、米国特許第１０，０４１，９５０号、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号および米国特許出願公開第２０１９／０１８７１３０号、ならびに国際公開第２０１４／１４３１５５号に記載されているものなど、当業者に公知の方法に従って検出され得、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
第１の段階１５０では、試料を第１の標的に対して特異的なケージドハプテン－抗体コンジュゲートと接触させて、第１の標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成させる（工程１００）。いくつかの実施形態において、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートは、式（ＩＶＡ）、（ＩＶＢ）または（ＶＡ）～（ＶＦ）の任意の１つを有する。本明細書にさらに記載されるように、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートのケージドハプテン部分は、マスク化されていない状態になって、それぞれの脱マスク化ハプテン、すなわち、「天然型ハプテン」または「非ケージ化ハプテン」を提供することができる。例えば、天然型ＤＩＧハプテンを提供するために、ケージドＤＩＧハプテンはマスク化されていない状態にされ得る。同様に、天然型ステロイドを提供するために、ケージ化されたステロイドはマスク化されていない状態にされ得る。
続いて、第２の標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成するために、まず、試料を第２の標的に対して特異的な脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させる（工程１１０）。いくつかの実施形態において、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素（例えば、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ）は、工程１００で導入されたケージドハプテン－抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応性である。例えば、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素は、式（ＩＶＡ）の［ホスホリル］基、式（ＩＶＢ）のＰＯ４Ｈ２基、または式（ＶＡ）～（ＶＦ）の任意の１つのホスファート含有基のいずれかと反応性であり得る。
いくつかの実施形態において、工程１００および１１０は、任意の順序で実行され得、または同時に実行され得る。いくつかの実施形態において、工程１００が最初に実行され、工程１１０が２番目に実行される。他の実施形態において、工程１１０が最初に実行され、工程１００が２番目に実行される。
いくつかの実施形態において、第１の段階１５０は、酵素活性を増強するためにスライド上の条件が変更される１つ以上の「脱ケージ化工程」も含む。「脱ケージ化工程」には、１つ以上の洗浄工程またはｐＨを調整するための工程（例えば、約７～約８．５の範囲のｐＨ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、脱ケージ化は、約３７℃の温度のトリス緩衝液中、約７．４～約７．６の範囲のｐＨで、約４分～約３２分の範囲の時間行われる。各脱ケージ化酵素は、それ独自の最適条件（緩衝剤、塩、補因子、温度）を有すると考えられ、任意の脱ケージ化工程のパラメータは、抗体コンジュゲートの特異的結合を妨害することなしに、酵素の活性を増強し、「脱ケージ化」を促進するように選択され得る。
いくつかの実施形態において、第１の段階１５０は、ケージング基に対する酵素の作用を防ぐために、試料を１つ以上の可逆的酵素阻害剤と接触させることも含む。いくつかの実施形態において、脱マスク化抗体コンジュゲートおよびケージドハプテン抗体コンジュゲートの両方の導入後に、１つ以上の可逆的酵素阻害剤が添加される。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）との関連において、これらの可逆的酵素阻害剤には、種々の機構によって酵素活性を低下させることができると考えられているホスファート、フェニルアラニンおよびＥＤＴＡが含まれ得る。
第２の段階１６０において、次いで、試料を、ケージドハプテン－抗体コンジュゲートの天然型ハプテンに特異的な検出試薬の第１のセットと接触させる（すなわち、検出試薬の第１のセットは、ケージドハプテンコンジュゲートのハプテンの非ケージ化された形態に対して特異的である）（工程１２０）。任意に、試料を、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素に対して特異的な検出試薬の第２のセットと接触させる（工程１３０）。いくつかの実施形態において、工程１２０および１３０は、任意の順序で実行され得、または同時に実行され得る。
本開示のタンパク質近接アッセイを図２、図３および図５～７にさらに例示する。例えば、図２は、（標的２に結合した）アルカリホスファターゼを含む脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと（標的１に結合した）ケージドハプテン－抗体コンジュゲートとの間の相互作用を例示する概略図であり、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）は、（標的１と標的２とが互いに近接しているために）ケージドハプテン－抗体コンジュゲートの酵素基質部分（例えば、ホスファート基またはその誘導体）と反応して、それぞれの脱マスク化ハプテンを提供し、これは検出され得る。同様に、図７は、近接したタンパク質（標的１および標的２）および総タンパク質（標的２）の両方の多重検出を例示する概略図である。
図２および図７を参照すると、第１の標的１０１が第２の標的１０２に十分に近接していれば、ケージドハプテン－抗体コンジュゲート１０３Ａは、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート１０４の脱マスキング酵素が、ケージドハプテン－抗体コンジュゲート１０３Ａの酵素基質と反応し得るように、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート１０４に十分に近接して提供される（近接は標識１０５される）。これは、続いて、第１の標的脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の形成をもたらす（１０３Ｂ）。図２、図５および図７に例示されるように、第１の標的である脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体（１０３Ｂ）は、他の特異的結合実体（例えば、二次抗体１０６）を結合することができるか、または他の特異的結合実体（例えば、二次抗体１０６）によって認識され得る。
他方、図３に示されるように、第１の標的１０１が第２の標的１０２に十分に近接していなければ、ケージドハプテン－抗体コンジュゲート１０３Ａは、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート１０４に近接して提供されない（近接は標識１０８される）。この例では、脱マスキング酵素は、ケージドハプテン－抗体コンジュゲート１０３Ａの酵素基質と反応せず、したがって、ケージドハプテンはマスクされたまたは保護された状態のままである、すなわち、他の特異的結合実体を結合することができないか、または他の特異的結合実体によって認識され得ない。
再び図２、図５および図７を参照すると、抗体コンジュゲートの導入および任意の脱ケージ化工程の後、次いで、試料を第１の検出試薬（１０６）と接触させ（工程１２０）、第１の検出試薬は、第１の標的である脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の脱マスク化ハプテン（１０３Ｂ）に対して特異的である。いくつかの実施形態において、第１の検出試薬は、脱マスク化ハプテン（１０３Ｂ）に対して特異的な二次抗体（１０６）、すなわち抗脱マスク化ハプテン抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗脱マスク化ハプテン抗体（１０６）は、検出可能部分にコンジュゲートされる（例えば、図２および図７では、検出可能部分はＨＲＰ酵素であり、ＨＲＰ酵素は銀発色性基質などの基質に作用する）。いくつかの実施形態において、第１の検出試薬（１０６）は、第１の標的である脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の天然型または脱マスク化ハプテン（１０３Ｂ）が、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート（１０４）の脱マスキング酵素によって脱マスク化されている場合にのみ結合する。したがって、第１の検出試薬（１０６）の検出可能部分からのシグナル（１０７）は、第１および第２の標的（１０１および１０２）が、したがって抗体コンジュゲート（１０３Ａおよび１０４）が互いに近接している場合にのみ工程１４０において検出することが可能である。ここで、検出されたシグナル（１０７）は、近接したタンパク質二量体またはタンパク質／標的を表す（標的が互いに十分に近接していなかった図３と比較せよ）。
いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルを増加させるために増幅工程が実施され得る。例えば、第１の標的である脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲートの脱マスク化ハプテンを追加のレポーター部分、例えば追加のハプテンまたは他の「検出可能部分」でさらに標識するために、増幅成分が導入され得る。例として、第１の標的である脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲートの脱マスク化ハプテンを複数の増幅ハプテンで標識するために、増幅ハプテンにコンジュゲートされた（または、他の実施形態においては、酵素にコンジュゲートされた）抗脱マスク化ハプテン抗体が導入され得る。続いて、それぞれ検出可能部分にコンジュゲートされた抗増幅ハプテン抗体が導入され得る。いくつかの実施形態において、抗増幅ハプテン抗体は酵素にコンジュゲートされ、酵素は導入された基質に作用してシグナルを生成する（例えば、視覚信号を生成するための発色基質または蛍光基質）。本明細書にそれぞれ記載されるＴＳＡおよびＱＭコンジュゲートは、任意の増幅工程において使用され得る。いくつかの例では、信号増幅は、ＯＰＴＩＶＩＥＷ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚ．、カタログ番号７６０－０９９）を使用して実行される。
多重検出
いくつかの実施形態において、脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素は、２つの機能、すなわち（ｉ）ケージドハプテンを脱マスク化するかまたは露出させること、および（ｉｉ）脱マスク化ハプテン（すなわち、脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体）によって生成されるシグナルとは独立したシグナルが検出され得るように、別の基質（例えば、発色基質または蛍光基質）と反応すること、を果たし得る。したがって、本明細書に開示されたシステムは、２つのタンパク質間の近接性を、これらのタンパク質の１つに対する総タンパク質染色という文脈の中で可視化することを可能にする。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、別のタンパク質染色の文脈の中で近接検出を多重化する能力は、迅速な、ガイドされたスライド読み取り（すなわち、総タンパク質内の近接シグナルのみを探す）を有する可能性または別のタンパク質と相互作用しているタンパク質の百分率を定量する能力（近接アッセイをスコア化する方法）を可能にする特徴であると考えられる。
第１の検出試薬（１０６）の導入後に再び図２、図４および図７を参照すると、総タンパク質が検出され得るように、第２の検出可能部分を含む第２の検出試薬が、工程１３０において、任意に試料に導入され得る。いくつかの実施形態において、第２の検出可能部分は、第１の検出可能部分（１０７）のシグナルとは異なるシグナル（１１２）を与える。いくつかの実施形態において、第２の検出可能部分は、脱マスキング酵素に対する基質、例えば、黄色シグナル（１０９）を与える発色基質を含む。他の実施形態において、第２の検出可能部分は、シグナル伝達コンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態において、内因性ペルオキシダーゼ活性を実質的にまたは完全に不活化するために、生物学的試料は酵素不活化組成物で前処理される。例えば、いくつかの細胞または組織は、内因性ペルオキシダーゼを含有する。ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用することは、高い非特異的バックグラウンド染色をもたらし得る。この非特異的バックグラウンドは、本明細書に開示される酵素不活化組成物で試料を前処理することによって低減させることができる。いくつかの実施形態において、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させるために、試料は過酸化水素のみ（適切な前処理溶液の約１重量％～約３重量％）で前処理される。内因性ペルオキシダーゼ活性が低下または不活化されたら、上記のように、検出キットが添加され、その後、検出キット中に存在する酵素が不活化され得る。開示される酵素不活化組成物および方法は、内因性酵素ペルオキシダーゼ活性を不活化するための方法としても使用され得る。さらなる不活化組成物は、米国特許出願公開第２０１８／０１２０２０２号に記載されており、その開示は、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、検体がパラフィン中に包埋された試料である場合には、適切な脱パラフィン流体を使用して試料を脱パラフィンすることができる。廃液除去剤が脱パラフィン液を除去した後、任意の数の物質が連続して検体に適用され得る。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸を露出させるなど）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密性洗浄）、検出（例えば、視覚的またはマーカー分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバーガラスなどのためのものであり得る。
ケージドハプテン抗体コンジュゲートの検出
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるケージドハプテンコンジュゲートのいずれか、またはケージドハプテンコンジュゲートと試料内の標的などの標的との複合体の検出を可能にするために、検出試薬が使用される。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、使用される検出試薬は、任意のケージドハプテン－コンジュゲートのケージドハプテンに対応する脱マスク化または天然型ハプテンに対して特異的である。例えば、ケージドハプテン－コンジュゲートがリン酸化ＤＩＧである場合、リン酸化ＤＩＧに対応する脱マスク化または天然型ハプテンであるＤＩＧの検出を可能にするために検出試薬が使用される。検出試薬は、シグナルを増加させるように設計された成分、例えばシグナル増幅成分またはシグナル増幅キットも含み得る。
いくつかの実施形態において、脱マスク化ハプテンに対して特異的な検出試薬は、ケージドハプテンコンジュゲートの脱マスク化ハプテンに対して特異的な二次抗体、すなわち抗脱マスク化ハプテン抗体であり、それ自体が検出可能部分にコンジュゲートされている。「検出可能部分」は、試料中のケージドハプテン－抗体コンジュゲートおよび／または脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの存在（すなわち、定性分析）および／または濃度（すなわち、定量分析）を示す（視覚的に、電子的に、またはその他の方法で）検出可能なシグナルを生成することができる分子または材料である。検出可能なシグナルは、光子の吸収、放出および／または散乱（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数および紫外周波数光子を含む）を含む、任意の公知または未発見の機構によって生成され得る。
いくつかの実施形態において、抗脱マスク化ハプテン抗体の検出可能部分には、発色性、蛍光性、りん光性、発光性の分子および材料、（無色の物質を着色された物質に変換するかもしくはその逆によって、または沈殿物を生成するか、試料の濁度を増加させることなどによって）ある物質を別の物質に変換して検出可能な差を与える触媒（酵素など）、追加の検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用して抗体－ハプテン結合相互作用を通じて検出され得るハプテン、ならびに常磁性および磁性分子または材料が含まれる。もちろん、検出可能部分自体を間接的に検出することも可能であり、例えば、検出可能な部分がハプテンである場合、当業者に知られているように、その検出可能部分に対して特異的なさらに別の抗体が検出可能部分の検出において使用され得る。
いくつかの実施形態において、抗脱マスク化ハプテン抗体は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅアセチルアジド；ダポキシルスルホン酸／カルボン酸ＤＹ－４０５；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５ Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ ピリジルオキサゾールスクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ）；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ ＤＹ－４１５；７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸ＤＹＱ－４２５；６－ＦＡＭホスホラミダイト；Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０ Ｄａｂｃｙｌ ＮＢＤクロリド／フルオリド；ＱＳＹ３５ ＤＹ－４８５ＸＬ；Ｃｙ２ＤＹ－４９０；Ｏｒｇｅｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ｃ３ ＤＹ－４８０ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－Ｘ ＤＹＱ－５０５；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４ ＤＹ－５１０ＸＬ；ＤＹ－４８１ＸＬ；６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）；ＤＹ－５２０ＸＬ；ＤＹ－５２１ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ Ｃ３エリスロシンイソチオシアネート；５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセインＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２ ６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＨＥＸ）；ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３ ＤＹ－５３０；ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘ ＤＹ－５５５；ＤＹＱ－１；ＤＹ－５５６；Ｃｙ３ ＤＹ－５４７；ＤＹ－５４９；ＤＹ－５５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ ＤＹ－５４８；ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８ Ｃ３ローダミンレッド－Ｘ ＱＳＹ ７ ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０ Ｃ３ ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９ Ｃ３カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ ＤＹ－５９０；ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１ Ｃ３ ＤＹ－５９１；ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ－Ｘ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ ＤＹ－５９４；カルボキシナフトフルオレセインＤＹ－６０５；ＤＹ－６１０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０ ＤＹ－６１５；ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０－Ｘ エリオグラウシン；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５スクシンイミジルエステル、；ＤＹ－６３４；ＤＹ－６３０；ＤＹ－６３１；ＤＹ－６３２；ＤＹ－６３３；ＤＹＱ－２；ＤＹ－６３６；ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５－Ｘ ＤＹ－６３５；Ｃｙ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＤＹ－６４７；ＤＹ－６４８；ＤＹ－６５０；ＤＹ－６５４；ＤＹ－６５２；ＤＹ－６４９；ＤＹ－６５１；ＤＹＱ－６６０；ＤＹＱ－６６１；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０ Ｃｙ５．５ ＤＹ－６７７；ＤＹ－６７５；ＤＹ－６７６；ＤＹ－６７８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ６８０ ＤＹ－６７９；ＤＹ－６８０；ＤＹ－６８２；ＤＹ－６８１；ＤＹＱ－３；ＤＹＱ－７００；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００ ＤＹ－７０３；ＤＹ－７０１；ＤＹ－７０４；ＤＹ－７００；ＤＹ－７３０；ＤＹ７３１；ＤＹ－７３２；ＤＹ－７３４；ＤＹ－７５０；Ｃｙ７ ＤＹ－７４９；ＤＹＱ－４；およびＣｙ７．５からなる群から選択される検出可能部分を含む。
フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類似体）、ローダミン、レゾルフィン、ルミノフォアおよびシアニンを含むいくつかの一般的な化学クラスに属する。蛍光分子の追加例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。他の実施形態において、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、およびテトラピロール誘導体から選択される。他の実施形態において、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、ＡｔｔｏおよびＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹ ａｎｄ ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ ｄｙｅｓ（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣ、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓから入手可能）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。
他の実施形態において、抗脱マスク化ハプテン抗体は酵素にコンジュゲートされる。これらの実施形態において、脱マスク化のために使用される酵素（例えば、本明細書中にさらに記載されている脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートの脱マスキング酵素）を除く、関連する抗脱マスク化ハプテン抗体にコンジュゲートされた任意の酵素によって最終の近接シグナルを生成することができる。いくつかの実施形態において、適切な酵素としては、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ノイラミニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－ラクタマーゼが挙げられる。他の実施形態において、酵素には、オキシドレダクターゼまたはペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ）が含まれる。これらの実施形態において、抗脱マスク化ハプテン抗体にコンジュゲートされた酵素は、発色基質、共有結合性ハプテン、共有結合性フルオロフォア、非共有結合性色素原および非共有結合性フルオロフォアの、標的の近くでまたは標的上で直接試料を標識する反応性部分への変換を触媒する。
発色性化合物／基質の具体的で非制限的な例には、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４－ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスファート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンゾチアゾリンスルホナート］（ＡＢＴＳ）、ｏ－ジアニシジン、４－クロロナフトール（４－ＣＮ）、ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵ－Ｇａｌ）、ｐ－ニトロフェニル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルーまたはテトラゾリウムバイオレットが含まれる。ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で酸化されるＤＡＢは、酵素活性の部位に褐色のアルコール不溶性沈殿物の沈着をもたらす。
いくつかの実施形態において、発色性基質は、潜在的反応性部分および発色性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分は、触媒活性化を受けて、試料または他の検出成分と共有結合することができる反応性種を形成するように構成される。触媒活性化は、１つ以上の酵素（例えば、オキシドレダクターゼ酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ酵素）によって駆動され、反応種の形成をもたらす。これらの反応種は、それらの生成の近く、すなわち酵素の近傍の発色部分と反応することができる。シグナル伝達コンジュゲートの具体例は、米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号に開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
他の基質としては、米国特許第５，５８３，００１号、米国特許出願公開第２０１２／０１７１６６８号、およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３５５６号に記載されているものが挙げられ、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。上記の組み入れられた参考文献に記載されているように、ＴＳＡまたはＱＭコンジュゲートに結合された適切な発色基質または蛍光基質としては、Ｎ，Ｎ’－ビスカルボキシペンチル－５，５’－ジスルホナート－インド－ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（Ｄａｂｓｙｌ）、テトラメチルローダミン（Ｔａｍｒａ）およびローダミン１１０（ローダミン）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、発色基質、蛍光基質またはシグナル伝達コンジュゲートは、任意の発色部分のピーク検出可能波長が互いに重複せず、病理学者または光学検出器（例えば、スキャナ）によって容易に検出可能であるように選択される。いくつかの実施形態において、発色部分は、異なる発色部分のピーク波長が少なくとも約５０ｎｍ分離されるように選択される。他の実施形態において、発色部分は、異なる発色部分のピーク波長が少なくとも約７０ｎｍ分離されるように選択される。さらに他の実施形態において、発色部分は、異なる発色部分のピーク波長が少なくとも約１００ｎｍ分離されるように選択される。クマリンコアを有する適切な検出可能部分の例は、米国特許第１０，０４１，９５０号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。他の適切な検出可能部分は、米国仮特許出願第６３／０７１，５１８号に開示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
なおさらなる実施形態において、発色部分は、発色部分が組織標本に導入されたときに異なる色（例えば、黄色、青、マゼンタ）を提供するように選択される。いくつかの実施形態において、発色部分は、それらが互いに良好なコントラスト、例えば、光学的に認識可能な色の分離を与えるように選択される。いくつかの実施形態において、発色部分は、互いに近接して配置されたときに、単独で観察されたときの発色部分のいずれかのシグナルまたは色とは異なるシグナルまたは色を与えるように選択される。
キット
いくつかの実施形態において、本開示のケージドハプテンコンジュゲートは、「検出キット」の一部として利用され得る。一般に、任意の検出キットは、１つ以上のケージドハプテンコンジュゲートおよび１つ以上のケージドハプテンコンジュゲートを検出するための検出試薬を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、式（ＩＶＡ）、（ＩＶＢ）または（ＶＡ）～（ＶＦ）のいずれかのケージドハプテンコンジュゲートを含む。
検出キットは、ケージドハプテンコンジュゲートが検出キットを介して検出され得るように、ケージドハプテンコンジュゲートを含む第１の組成物と、第１の組成物に特異的な検出試薬を含む第２の組成物とを含み得る。いくつかの実施形態において、検出キットは、複数のケージドハプテンコンジュゲート（緩衝液中で一緒に混合されるなど）を含み、検出キットは、複数のケージドハプテンコンジュゲートのそれぞれに対して特異的な検出試薬も含む。
もちろん、任意のキットは、手動または自動化された標的検出のために必要とされれば、緩衝液、対比染色剤、酵素不活化組成物、脱パラフィン溶液などを含む他の作用物質を含み得る。キットは、組織試料中の１つ以上の標的の検出を行うためにキット構成要素を組織試料に適用する方法を含む、キットの構成要素のいずれかを使用するための説明書も含み得る。
自動化
本開示のアッセイおよび方法は、自動化され得、検体処理装置と組み合わされ得る。検体処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ Ｕｌｔｒａ機器およびＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａ機器などの自動装置とすることができる。Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、第５，６５４，２００号、第６，２９６，８０９号、第６，３５２，８６１号、第６，８２７，９０１号および第６，９４３，０２９号、ならびに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号および第２００４００５２６８５号を含む、自動分析を実行するためのシステムおよび方法を開示する多数の米国特許の譲受人であり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。あるいは、検体は手動で処理され得る。
検体処理装置は、検体に固定剤を塗布することができる。固定剤は、架橋剤（アルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドならびに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンおよび複合体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノールおよびエタノール）、メカニズム不明の固定剤（例えば、塩化水銀、アセトンおよびピクリン酸）、配合試薬（例えば、カルノワの固定剤、メタカン、ブアン液、Ｂ５固定剤、ロスマンの液体およびジャンドルの液体）、マイクロ波、およびその他の固定剤（例えば、排除体積固定および蒸気固定）を含むことができる。
検体がパラフィン中に包埋された試料である場合、適切な脱パラフィン液を使用して、検体処理装置により試料を脱パラフィン化することができる。廃液除去剤が脱パラフィン液を除去した後、任意の数の物質が連続して検体に適用され得る。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸を露出させるなど）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密性洗浄）、検出（例えば、視覚的またはマーカー分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバーガラスなどのためのものであり得る。
検体処理装置は、検体に幅広い物質を塗布することができる。物質は、これらに限定されるものではないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス、および／またはコンディショナを含む。物質は、流体（例えば、気体、液体、または気体／液体混合物）などとすることができる。流体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液または他のタイプの溶液）などとすることができる。試薬には、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）、抗原回収流体（例えば、水性または非水性ベースの抗原回復溶液、抗原回収緩衝液など）などが含まれ得るが、これらに限定されない。プローブは、検出可能な標識に付着した、単離された核酸または単離された合成オリゴヌクレオチドとすることができる。標識は、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテンおよび酵素を含むことができる。
検体が処理された後、ユーザは、検体を含むスライドを画像化装置に輸送することができる。ここで使用する画像化装置は、明視野撮像装置スライドスキャナーである。１つの明視野撮像装置は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているｉＳｃａｎ Ｃｏｒｅｏ（商標）明視野スキャナである。自動化された実施形態において、画像化装置は、「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号（国際公開第２０１１／０４９６０８号）、または２０１４年２月３日に出願された「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」と題された米国特許出願公開第２０１４／０１７８１６９号に開示されているようなデジタル病理学装置である。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号および米国特許出願公開第２０１４／０１７８１６９号は、参照によりそれらの全体が組み入れられる。他の実施形態において、画像化装置は、顕微鏡に結合されたデジタルカメラを含む。
対比染色
対比染色は、顕微鏡下で標的の構造をより簡単に可視化できるように、１つ以上の標的を検出するために、試料を作用物質で既に染色した後に試料を後処理する方法である。例えば、免疫組織化学的染色をより明確にするために、カバーガラスで覆う前に対比染色が任意に使用される。対比染色は、一次染色とは色が異なる。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルーおよびニュークリアファストレッドなど、数多くの対比染色が周知である。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、使用され得る蛍光染色剤である。
いくつかの例では、複数の染色剤を一緒に混合して対比染色剤を生成することができる。これにより、柔軟性と染色を選択する能力が提供される。例えば、第１の染色は、特定の属性を有するが、異なる所望の属性を有していない混合物に対して選択され得る。第２の染色は、欠如した所望の属性を呈する混合物に追加され得る。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩおよびポンタミンスカイブルーが一緒に混合されて対比染色を形成することができる。
検出および／または画像化
開示される実施形態のある態様または全てをコンピュータ分析および／または画像分析システムによって自動化し、容易にすることができる。いくつかの適用では、正確な色または蛍光比が測定される。いくつかの実施形態において、光学顕微鏡法が画像分析に利用される。特定の開示される実施形態は、デジタル画像の取得を含む。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連関させることによって行うことができる。染色された試料から得られたデジタル画像は、画像分析ソフトウェアを使用して分析される。色または蛍光をいくつかの異なる方法で測定することができる。例えば、赤色、青色、緑色の値；色相、彩度、および強度の値として；および／またはスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長もしくは波長範囲を測定することによって色を測定することができる。試料はまた、定性的および半定量的に評価され得る。定性的評価には、染色強度の評価、染色に関与する陽性染色細胞および細胞内コンパートメントの特定、ならびに試料全体またはスライドの品質の評価が含まれる。試験試料に対して個別の評価が実行され、この分析には、試料が異常な状態を表しているかどうかを判断するための既知の平均値との比較を含めることができる。
適切な検出方法は、国際出願２０１４／１４３１５５号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施形態において、適切な検出システムは、画像化装置と、１つ以上のレンズと、画像化装置と通信するディスプレイとを備える。画像化装置は、エネルギーを順次放出するための手段と、画像／動画を捕捉するための手段とを含む。いくつかの実施形態において、捕捉するための手段は、それぞれがエネルギーに曝露されている検体に対応する検体画像を捕捉するように配置される。いくつかの実施形態において、捕捉するための手段は、生物学的試料を担持する顕微鏡スライドの前面および／または背面に配置された１つ以上のカメラを含むことができる。表示手段は、いくつかの実施形態において、モニタまたはスクリーンを含む。いくつかの実施形態において、エネルギーを順次放出するための手段は、複数のエネルギーエミッタを含む。各エネルギーエミッタは、１つ以上のＩＲエネルギーエミッタ、ＵＶエネルギーエミッタ、ＬＥＤ光エミッタ、それらの組み合わせ、または他のタイプのエネルギー放出デバイスを含むことができる。画像化システムは、捕捉するための手段によって捕捉された検体画像に基づいてコントラストが強調されたカラー画像データを生成するための手段をさらに含むことができる。表示手段は、コントラストが強調されたカラー画像データに基づいて検体を表示する。
試料および標的
試料には生物学的成分が含まれており、一般に、関心対象の１つ以上の標的分子が含まれていることが疑われる。標的分子は細胞の表面に存在することができ、細胞は懸濁液中または組織切片中に存在することができる。標的分子は細胞内に存在することもでき、細胞溶解またはプローブによる細胞の貫通時に検出することができる。当業者は、試料内の標的分子を検出する方法が、使用される試料およびプローブのタイプに応じて変化することを理解するであろう。試料を収集および調製する方法は当技術分野において公知である。
組織または他の生物学的試料など、本明細書に開示される方法の実施形態において、および本明細書に開示される組成物とともに使用するための試料は、当業者によって当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。試料は、定期的なスクリーニングのための対象から、または遺伝的異常、感染もしくは新生物などの障害を有することが疑われる対象から取得され得る。開示される方法の記載される実施形態はまた、「正常な」試料と呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害などを有さない試料に適用することができる。このような正常な試料は、他の試料と比較するための対照として、とりわけ有用である。試料は、多くの様々な目的のために分析され得る。例えば、試料は、科学的研究で、もしくは疑わしい病気の診断のために、または処置の成功、生存などの予後指標として使用され得る。
試料は、プローブまたはレポーター分子によって特異的に結合され得る複数の標的を含むことがあり得る。標的は、核酸配列またはタンパク質であり得る。本開示を通して、標的タンパク質に言及する場合、そのタンパク質に関連する核酸配列も標的として使用できることが理解される。いくつかの例では、標的は、ウイルス、細菌などの病原体、またはウイルスゲノムなどの細胞内寄生体に由来するタンパク質もしくは核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、相関する、因果関係があるなど）標的核酸配列から産生され得る。
標的核酸配列は、サイズが実質的に異なり得る。限定されないが、核酸配列は、可変数の核酸残基を有することができる。例えば、標的核酸配列は、少なくとも約１０個の核酸残基、または少なくとも約２０、３０、５０、１００、１５０、５００、１０００個の残基を有することができる。同様に、標的ポリペプチドは、サイズが実質的に異なり得る。限定されないが、標的ポリペプチドは、ペプチド特異的抗体またはその断片に結合する少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドは、ペプチド特異的抗体またはその断片に結合する少なくとも２つのエピトープを含むことができる。
特定の非限定的な例において、標的タンパク質は、新生物（例えば、癌）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。新生物細胞、特にＢ細胞およびＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、神経癌などの癌細胞において、多数の染色体異常（転座および他の再編成、増幅または欠失を含む）が特定されている。したがって、いくつかの例では、標的分子の少なくとも一部は、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅または欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。
癌遺伝子は、いくつかのヒト悪性腫瘍の原因であることが知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２の切断点領域に位置するＳＹＴ遺伝子を含む染色体再編成は、滑膜肉腫軟部組織腫瘍の間で一般的である。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば、異なる標識を有するプローブを使用して同定することができ、第１のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位に伸長する標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸分子を含み、第２のプローブは、ＳＹＴ遺伝子の３’側または近位に伸長する標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸を含む。これらの標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対応するプローブをインサイチュハイブリダイゼーション手順で使用すると、ＳＹＴ遺伝子領域にｔ（１８ｑ１１．２）を欠く正常細胞は、ＳＹＴの２つのインタクトなコピーを反映する２つの融合（近接した２つの標識によって生成される）シグナルを示す。ｔ（１８ｑ１１．２）を有する異常細胞は、単一の融合シグナルを示す。
他の例では、悪性細胞において欠失している（失われている）腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質が選択される。例えば、染色体９ｐ２１上に存在するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、およびＤ９Ｓ１７５２を含む）は、特定の膀胱癌で欠失される。第１染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１およびＳＨＧＣ－１３２２を包含する）、および第１９染色体のセントロメア周辺領域（例えば、１９ｐ１３－１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２およびＧＬＴＳＣＲ１を包含する）が関与する染色体欠失は、中枢神経系の特定のタイプの固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。
前述の例は、例示のみを目的として提供されており、限定することを意図するものではない。新生物性形質転換および／または増殖と相関する他の多くの細胞遺伝学的異常が、当業者に知られている。新生物性形質転換と相関しており、開示される方法において有用である、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質としては、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９－５５２４２５２５）、Ｃ－ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８－１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８－１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２－４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４－７５３１６４２））、Ｎ－ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１－１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８－５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４－３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７－４０１３８７３４）、と並んで、例えば、ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４－２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９－５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９－１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２－ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１－５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１－ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１－３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１－４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド３８６７５６７１－３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９－１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１－２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１－ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９－１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５－ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１－２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２－ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７－１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５－８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１－ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１９、補体、ヌクレオチド ４５４３１５５６－４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５－４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３－ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６－６１００３６８２）およびＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３－ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１－１４９４７３１２８）も挙げられる。
他の例では、標的タンパク質は、疾患または症状に関連するウイルスまたは他の微生物から選択される。細胞または組織試料中のウイルスまたは微生物由来の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出は、生物の存在を示す。例えば、標的ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、発癌性または病原性ウイルス、細菌または細胞内寄生生物（熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および他のプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（種）、小形クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、原虫である赤痢アメ－バ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、およびランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、ならびにトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）およびバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種など）のゲノムから選択され得る。
いくつかの例では、標的タンパク質は、ウイルスゲノムからの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例示的なウイルスおよび対応するゲノム配列（括弧内はＧＥＮＢＡＮＫ（商標）ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号）としては、ヒトアデノウイルスＡ（ＮＣ－００１４６０）、ヒトアデノウイルスＢ（ＮＣ－００４００１）、ヒトアデノウイルスＣ（ＮＣ－００１４０５）、ヒトアデノウイルスＤ（ＮＣ－００２０６７）、ヒトアデノウイルスＥ（ＮＣ－００３２６６）、ヒトアデノウイルスＦ（ＮＣ－００１４５４）、ヒトアストロウイルス（ＮＣ－００１９４３）、ヒトＢＫポリオーマウイルス（Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１）ヒトボカウイルス（ＮＣ－００７４５５）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＮＣ－００２６４５）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＮＣ－００６５７７）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＣ－００５８３１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＮＣ－００５１４７）、ヒトエンテロウイルスＡ（ＮＣ－００１６１２）、ヒトエンテロウイルスＢ（ＮＣ－００１４７２）、ヒトエンテロウイルスＣ（ＮＣ－００１４２８）、ヒトエンテロウイルスＤ（ＮＣ－００１４３０）、ヒトエリスロウイルスＶ９（ＮＣ－００４２９５）、ヒト泡沫状ウイルス（ＮＣ－００１７３６）、ヒトヘルペスウイルス１（単純ヘルペスウイルス１型）（ＮＣ－００１８０６）、ヒトヘルペスウイルス２（単純ヘルペスウイルス２型）（ＮＣ－００１７９８）、ヒトヘルペスウイルス３（水痘帯状疱疹ウイルス）（ＮＣ－００１３４８）、１型ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バー・ウイルス１型）（ＮＣ－００７６０５）、２型ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バー・ウイルス２型）（ＮＣ－００９３３４）、ヒトヘルペスウイルス５株ＡＤ１６９（ＮＣ－００１３４７）、ヒトヘルペスウイルス５株Ｍｅｒｌｉｎ株（ＮＣ－００６２７３）、ヒトヘルペスウイルス６Ａ（ＮＣ－００１６６４）、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＮＣ－０００８９８）、ヒトヘルペスウイルス７（ＮＣ－００１７１６）、ヒトヘルペスウイルス８型Ｍ（ＮＣ－００３４０９）、ヒトヘルペスウイルス８型Ｐ（ＮＣ－００９３３３）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ－００１８０２）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＮＣ－００１７２２）、ヒトメタニューモウイルス（ＮＣ－００４１４８）、ヒトパピローマウイルス－１（ＮＣ－００１３５６）、ヒトパピローマウイルス－１８（ＮＣ－００１３５７）、ヒトパピローマウイルス－２（ＮＣ－００１３５２）、ヒトパピローマウイルス－５４（ＮＣ－００１６７６）、ヒトパピローマウイルス－６１（ＮＣ－００１６９４）、ヒトパピローマウイルス－ｃａｎｄ９０（ＮＣ－００４１０４）、ヒトパピローマウイルスＲＴＲＸ７（ＮＣ－００４７６１）、ヒトパピローマウイルス１０型（ＮＣ－００１５７６）、ヒトパピローマウイルス１０１型（ＮＣ－００８１８９）、ヒトパピローマウイルス１０３型（ＮＣ－００８１８８）、ヒトパピローマウイルス１０７型（ＮＣ－００９２３９）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣ－００１５２６）、ヒトパピローマウイルス２４型（ＮＣ－００１６８３）、ヒトパピローマウイルス２６型（ＮＣ－００１５８３）、ヒトパピローマウイルス３２型（ＮＣ－００１５８６）、ヒトパピローマウイルス３４型（ＮＣ－００１５８７）、ヒトパピローマウイルス４型（ＮＣ－００１４５７）、ヒトパピローマウイルス４１型（ＮＣ－００１３５４）、ヒトパピローマウイルス４８型（ＮＣ－００１６９０）、ヒトパピローマウイルス４９型（ＮＣ－００１５９１）、ヒトパピローマウイルス５型（ＮＣ－００１５３１）、ヒトパピローマウイルス５０型（ＮＣ－００１６９１）、ヒトパピローマウイルス５３型（ＮＣ－００１５９３）、ヒトパピローマウイルス６０型（ＮＣ－００１６９３）、ヒトパピローマウイルス６３型（ＮＣ－００１４５８）、ヒトパピローマウイルス６ｂ型（ＮＣ－００１３５５）、ヒトパピローマウイルス７型（ＮＣ－００１５９５）、ヒトパピローマウイルス７１型（ＮＣ－００２６４４）、ヒトパピローマウイルス９型（ＮＣ－００１５９６）、ヒトパピローマウイルス９２型（ＮＣ－００４５００）、ヒトパピローマウイルス９６型（ＮＣ－００５１３４）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＮＣ－００３４６１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＮＣ－００３４４３）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＮＣ－００１７９６）、ヒトパレコウイルス（ＮＣ－００１８９７）、ヒトパルボウイルス４（ＮＣ－００７０１８）、ヒトパルボウイルスＢ１９（ＮＣ－０００８８３）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＮＣ－００１７８１）、ヒトライノウイルスＡ（ＮＣ－００１６１７）、ヒトライノウイルスＢ（ＮＣ－００１４９０）、ヒトスプーマレトロウイルス（ＮＣ－００１７９５）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＮＣ－００１４３６）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス２（ＮＣ－００１４８８）が挙げられる。
特定の例では、標的タンパク質は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）などの発癌性ウイルスからの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。他の例では、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの病原性ウイルスに由来する。
実施例
実施例１－本開示の化合物の合成
ＭＳデータを、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３（Ｗａｔｅｒｓ）を実行しているＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＱＤａ（ＥＳＩ）で収集した。分析ＨＰＬＣは、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３を実行するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ）でＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅカラムを使用して行った。分取ＨＰＬＣは、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３を実行するＷａｔｅｒｓ ２５３５（Ｗａｔｅｒｓ）でＷａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅカラム（分取Ｃ１８ ＯＢＤ １０μｍ、５０ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いて行った。特に明記しない限り、全ての化学物質は商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。
Figure 2024504944000031
スキーム１。ホスファートケージドジゴキシゲニン（ＤＩＧ）の合成
ジゴキシン１のアセチル化および酸加水分解によって化合物４を調製して１２－Ｏ－アセチルジゴキシゲニン２を得、これをジアゾ酢酸エチルとの反応によって３－エチルオキシカルボニルメチルエーテル３に変換し、続いて、特許［米国特許第５１９８５３７号］に記載されているようにジゴキシゲニン－３－カルボキシメチルエーテル４に加水分解した。
化合物６。ＴＨＦ（６ｍＬ／ｍｍｏｌ４）中のジゴキシゲニン－３－カルボキシメチルエーテル４（１．０当量）の撹拌溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２中の、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量）および１ＭのＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５当量）を加えた。反応混合物を室温で２０時間保持し（ＨＰＬＣをチェックして反応の完了を確認し）、フィルタにかけ、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃで希釈した。得られた溶液を再びフィルタにかけ、続いて塩水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去してＮＨＳエステル５を得て、これをＥｔＯＡｃ（６ｍＬ／ｍｍｏｌ５）に溶解し、引き続いてＴＥＡ（１．５当量）およびＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン（１．５当量）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し（ＨＰＬＣをチェックして反応の完了を確認する）、ＥｔＯＡｃ（６ｍＬ／ｍｍｏｌ５）で希釈し、続いて１ＭＨＣｌ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ５）を添加した。有機層を分離し、続いて飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去して化合物６を得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ－Ｂｏｃ）＋Ｃ３１Ｈ５１Ｎ２Ｏ６＋の計算値５４７．３、実測値５４７．３。
化合物７。ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ／ｍｍｏｌ６）中の、化合物６（１．０当量）、Ｔｉ（Ｏ－ｔ－Ｂｕ）４（０．２当量）およびＴＥＡ（３．５当量）の溶液に、クロロリン酸ジエチル（２．５当量）を添加した。反応容器を密封し、室温で１６時間撹拌した（反応が約３０％完了したことを確認するためにＨＰＬＣによってモニターした）。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ／ｍｍｏｌ６）で希釈し、続いて０．５Ｍ ＨＣｌ（５０ｍＬ／ｍｍｏｌ６）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、灰白色の泡状物を得た。反応をさらに２回繰り返し、その時点で、ＨＰＬＣは、出発物質６と比較して反応が約９０％完了したことを示した。未精製の油状物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（４０分かけて９５：５から５：９５までのＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中０．０５％ＴＦＡ；４０ｍｌ／分）によって精製し、リン酸ジエチル７を灰白色の泡状物として得た（４からの収率３５％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ－Ｂｏｃ）＋Ｃ３５Ｈ６０Ｎ２Ｏ９Ｐ＋６８３．４の計算値、実測値６８３．５。
化合物８。化合物７（１．０当量）をＣＨＣｌ３（２ｍＬ／ｍｍｏｌ７）に溶解し、続いてＥｔＯＡｃ（０．２当量）およびＴＭＳＢｒ（３．３当量）を添加した。得られた反応混合物を室温で１８時間撹拌した（反応が＞９５％完了であることを確認するためにＨＰＬＣによってモニターした）。溶媒を減圧下で除去し、続いてＭｅＯＨ（６ｍＬ／ｍｍｏｌ７）を添加した。溶媒を再び減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（４０分かけて９５：５から５：９５までのＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中０．０５％ＴＦＡ；４０ｍｌ／分）によって精製し、ホスファート８を白色固体として得た（収率４５％）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３１Ｈ５２Ｎ２Ｏ９Ｐ＋６２７．３の計算値、実測値６２７．４。
化合物１０。化合物８（１．０当量）をＤＭＦ（２ｍＬ／ｍｍｏｌ８）に懸濁した後、トリエチルアミン（５当量）を添加し、最後に３－マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル９（１．１当量）を添加した。反応容器を密封し、反応混合物を室温で４時間激しく撹拌した（反応完了を確認するためにＨＰＬＣをチェックする）。次いで、反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（４０分かけて９９：１から５：９５までのＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ中０．０５％ＴＦＡ）によって直接精製して、化合物１０を淡黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３８Ｈ５７Ｎ３Ｏ１２Ｐ＋７７８．４の計算値、実測値７７８．５。
実施例２－抗体コンジュゲートの調製
２ｍｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｍｇのヤギ抗ウサギＩｇＧをＥＤＴＡに添加して、１０ｍＭの最終濃度を得た後、２ｍｇのトラウト試薬（２－イミノチオラン塩酸塩）を添加した。反応混合物を１時間室温に保った後、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）によるサイズ排除クロマトグラフィー精製（ＡＫＴＡ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラム）を行った。チオール化抗体の合わせた画分（６ｍｇ／ｍｌ）に、０．２ｍｌのＤＭＦ中の４．２ｍｇの化合物１０を添加した。反応混合物を３時間室温に保った後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）によるサイズ排除クロマトグラフィー精製（ＡＫＴＡ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム）を行い、ケージドジゴキシゲニン－修飾抗体（３．７ｍｇ／ｍｌ）を得た。図８は、本開示のケージドハプテンへの抗体のコンジュゲーションを示す。
実施例３－安定性試験
式（ＩＶＡ）、（ＩＶＢ）または（ＶＡ）～（ＶＦ）（図９参照）の任意の１つを有するケージドハプテンコンジュゲートの加水分解安定性を研究するために、モデル化合物を高温での安定性研究に供した。
試験したモデル化合物は、以下：
Figure 2024504944000032
に示すように、ケージドＤＩＧとともに、２つの異なるケージング基を有するＮＰハプテンであった
ケージドＮＰおよびケージドＤＩＧの試料を、３７℃のオーブン中、１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で保存した。この緩衝液およびｐＨは、抗体コンジュゲートの保存条件の代表であった。試料にストレスを与え、加水分解事象を加速させるために、３７℃の温度を選択した。通常の保存条件または抗体コンジュゲートは、約４℃であると考えられた。試料の一定分量を一定間隔で取り出し、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３を実行するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ）のＷａｔｅｒｓＸ Ｂｒｉｄｇｅカラムで逆相ＨＰＬＣによって試験した。脱ケージ化または他の形態の分解の証拠について、各試料ＨＰＬＣトレースを調べた。３７℃で５０日間保存した後、第１世代のケージドＮＰは約１５．５％の加水分解を示し、第２世代のケージドＮＰは約６％の加水分解を有したのに対して、ケージドＤＩＧは０．５％未満の加水分解を有した（図１０参照）。ケージドＤＩＧ試験を１２０日間まで監視し、この時点で＜０．５％の加水分解が依然として観察された。本開示のケージドハプテンは優れた加水分解安定性を示すと結論付けられた。
実施例４－免疫組織化学
一般的な免疫組織化学（ＩＨＣ）プロトコル。
全てのＩＨＣ染色実験は、ＶＥＮＴＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）Ｕｌｔｒａ自動組織染色プラットフォームで行った。これらのプロトコルで使用した試薬は、特に明記しない限り、Ｒｏｃｈｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ；「ＲＴＤ」）からのものであった。
近接ＩＨＣの一般的手順
全てのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織および細胞株試料をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２－５５０－１５）に載せた。ＥＺ Ｐｒｅｐ（ＲＴＤ、＃９５０－１０１）を用いてこれらを脱パラフィンした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１、ＲＴＤ、＃９５０－１２４）を用いて、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）または抗原賦活化（ＡＲ）を行った。脱パラフィンおよびＡＲ後の一般的な工程は以下のとおりであった：（１）阻害剤ＣＭによる内因性ペルオキシダーゼの不活化（ＲＴＤ、７６０－４３０７）；（２）一次抗体との同時インキュベーション（約３７℃、抗体に応じて約８～約３２分の範囲の時間）；（３）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートさせたヤギ抗マウス二次抗体とのインキュベーション；（４）ケージドハプテンにコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ二次抗体とのインキュベーション；（５）マウス抗ハプテンＨＲＰコンジュゲートとのインキュベーション；（６）チラミド－ＨＱおよびＨ２Ｏ２（ＲＴＤ、＃７６０－０５２）によるシグナル増幅；（７）マウス抗ＨＱ ＨＲＰコンジュゲート（ＲＴＤ、＃７６０－４６０２）とのインキュベーション；（８）３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）による検出、および銅による調色；（９）ヘマトキシリンＩＩ（ＲＴＤ、＃７９０－２２０８）および核を染色するためのＢｌｕｉｎｇ（ＲＴＤ、＃７６０－２０３７）による対比染色；（１０）勾配を有するアルコールおよびキシレンによる脱水、その後のカバーガラスでの被覆。各アッセイインキュベーション工程の間に、スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＴＤ、＃９５０－３００）で洗浄した。
近接ＩＨＣ実験－Ｅ－カドヘリン：β－カテニン陽性の近接
ＦＦＰＥ扁桃組織を脱パラフィンし、抗原を賦活化した（ＣＣ１、６０分）。ウサギ抗Ｅ－カドヘリン（ＲＴＤ、７６０－４４４０）およびマウス抗β－カテニン（ＲＴＤ、７６０－４２４２）を共インキュベートした（約３７℃、約３２分）。洗浄後、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたヤギポリクローナル抗マウス抗体を適用した（約３７℃；約１２分）。洗浄後、試料を、複数のケージドＮＰ（図１１Ａ）または複数のケージドジゴキシゲニン（図１１Ｂ）にコンジュゲートされたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体とインキュベートした（約３７℃；約１２分）。洗浄後、試料をマウス抗ＤＩＧ ＨＲＰコンジュゲートとインキュベートした（約３７℃；約１２分）。Ａｍｐ ＨＱキット（ＲＴＤ、７６０－０５２、約３７℃、約８分）を用いてチラミド増幅を行った後、マウス抗ＨＱ ＨＲＰコンジュゲート（ＲＴＤ、＃７６０－４６０２、約３７℃、約８分）とインキュベートした。シグナルをＤＡＢで可視化し、次いで組織切片を対比染色した。スライドを段階的エタノール系列で脱水し、キシレンで清澄化し、カバーガラスで覆った。ケージドＮＰを使用して検出されたＥ－カドヘリンおよびβ－カテニンについての陽性の近接シグナルを表す図１１ＡおよびケージドＤＩＧを使用して検出されたＥカドヘリンおよびβ－カテニンについての陽性の近接シグナルを表す図１１Ｂに、結果が示されている。
本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように変更され得る。
本明細書の開示は特定の実施形態を参照して説明されているが、これらの実施形態は本開示の原理および用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示的な実施形態に対して多数の修正を施し得ること、ならびに添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく他の構成が考案され得ることが理解される。
追加の実施形態
追加の実施形態１．第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析する方法であって、
（ａ）（ａ）前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
（ｂ）（ｂ）前記試料を前記ケージドハプテン－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、前記ケージドハプテン－抗体コンジュゲートは、式（ＩＶＡ）および（ＩＶＢ）：
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＶＡ）
［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＶＢ）
（式中、
Ｗ１は、結合であるか、または１～１０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
Ｗ２は、反応性官能基に由来し、
［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであり、
［ホスホリル］は、式：
Figure 2024504944000033
（Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
によって表され、
［特異的結合実体］は、抗体であり、
前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
の任意の１つを有する、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
（ｃ）（ｃ）前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
（ｄ）（ｄ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、前記第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または前記第１の標的を標識すること、および
（ｅ）（ｅ）前記標識された第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または標識された第１の標的を検出すること、
を含む、方法。
追加の実施形態２．Ｑ１がＯであり、少なくとも１つのＱ２がＨである、追加の実施形態１に記載の方法。
追加の実施形態３．Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、追加の実施形態２に記載の方法。
追加の実施形態４．Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する、追加の実施形態２に記載の方法。
追加の実施形態５．両方のＱ２基がＨである、追加の実施形態１に記載の方法。
追加の実施形態６．Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、追加の実施形態５に記載の方法。
追加の実施形態７．Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する、追加の実施形態５に記載の方法。
追加の実施形態８．Ｒ１が式（ＩＩＩＡ）：
Figure 2024504944000034
（式中、
Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する、追加の実施形態５に記載の方法。
追加の実施形態９．ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、追加の実施形態８に記載の方法。
追加の実施形態１０．Ｒ８がＯである、追加の実施形態９に記載の方法。
追加の実施形態１１．Ｒ８が結合である、追加の実施形態９に記載の方法。
追加の実施形態１２．ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１３．両方のＲａおよびＲｂがＨである、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１４．Ｚが結合または－ＣＨ２－である、追加の実施形態１２に記載の方法。
追加の実施形態１５．Ｒ１が式（ＩＩＩＣ）：
Figure 2024504944000035
（式中、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
ｖは、１～８の範囲の整数である）
に示される構造を有する、追加の実施形態１に記載の方法。
追加の実施形態１６．ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、追加の実施形態１５に記載の方法。
追加の実施形態１７．Ｚが結合または－ＣＨ２－である、追加の実施形態１５に記載の方法。
追加の実施形態１８．両方のＱ２基がＨである、追加の実施形態１５に記載の方法。
追加の実施形態１９．Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、追加の実施形態１８に記載の方法。
追加の実施形態２０．Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基に由来する、追加の実施形態１５に記載の方法。
追加の実施形態２１．Ｑ１がＯである、追加の実施形態１５に記載の方法。

Claims (120)

  1. 式（ＩＡ）および（ＩＢ）：
    Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＡ）
    Ｒ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＢ）
    （式中、
    Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
    Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
    ［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであり、
    ［ホスホリル］は、式：
    Figure 2024504944000036
    （Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
    Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
    によって表され、
    前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
    の任意の１つを有する、ケージドハプテン。
  2. Ｑ１がＳである、請求項１に記載のケージドハプテン。
  3. Ｑ１がＯであり、少なくとも１つのＱ２がＨである、請求項１に記載のケージドハプテン。
  4. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項３に記載のケージドハプテン。
  5. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基からなる群から選択される、請求項３に記載のケージドハプテン。
  6. 両方のＱ２基がＨである、請求項１に記載のケージドハプテン。
  7. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項６に記載のケージドハプテン。
  8. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基からなる群から選択される、請求項６に記載のケージドハプテン。
  9. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000037
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項６に記載のケージドハプテン
  10. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項９に記載のケージドハプテン。
  11. Ｒ８がＯである、請求項９に記載のケージドハプテン。
  12. Ｒ８が結合である、請求項９に記載のケージドハプテン。
  13. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項１２に記載のケージドハプテン。
  14. ＲａおよびＲｂの両方がＨである、請求項１２に記載のケージドハプテン。
  15. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項１４に記載のケージドハプテン。
  16. Ｒ１が、式（ＩＩＩＣ）：
    Figure 2024504944000038
    （式中、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項１に記載のケージドハプテン。
  17. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項１６に記載のケージドハプテン。
  18. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項１６に記載のケージドハプテン。
  19. 両方のＱ２基がＨである、請求項１６に記載のケージドハプテン。
  20. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項１９に記載のケージドハプテン。
  21. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される、請求項１９に記載のケージドハプテン。
  22. Ｑ１がＯである、請求項１９に記載のケージドハプテン。
  23. 式（ＩＩＩＤ）：
    Figure 2024504944000039
    （式中、
    Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
    Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
    Ｒ３は、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
    Ｒ４は、Ｈ、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
    Ｒ６は、Ｈであるか、または直鎖もしくは分岐の、または置換されたもしくは置換されていないＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
    ｍ、ｎおよびｏは、それぞれ独立して、０または１～４の範囲の整数であり、
    Ｙは、－ＣＨ２－、－Ｃ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｈ）－、－Ｎ（Ｒ７）－、－Ｏ－、または－Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ７は、Ｃ１～Ｃ４直鎖または分岐の、置換されたまたは置換されていないアルキル基である）
    を有する、ケージドハプテン。
  24. Ｒ１が、式（ＩＩＩＣ）：
    Figure 2024504944000040
    （式中、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  25. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  26. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  27. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  28. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  29. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  30. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される、請求項２４に記載のケージドハプテン。
  31. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000041
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項２９に記載のケージドハプテン。
  32. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項３１に記載のケージドハプテン。
  33. Ｒ８がＯである、請求項３１に記載のケージドハプテン。
  34. Ｒ８が結合である、請求項３１に記載のケージドハプテン。
  35. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項３４に記載のケージドハプテン。
  36. ＲａおよびＲｂの両方がＨである、請求項３４に記載のケージドハプテン。
  37. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項３６に記載のケージドハプテン。
  38. Ｒ３、Ｒ４またはＲ６の少なくとも１つが－ＣＨ３である、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  39. Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが－ＣＨ３である、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  40. Ｒ６がＨである、請求項３９に記載のケージドハプテン。
  41. Ｒ２がＨである、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  42. Ｙが－Ｃ（Ｏ）－である、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  43. Ｒ２がＨであり、およびＹが－Ｃ（Ｏ）－である、請求項２３に記載のケージドハプテン。
  44. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000042
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項４３に記載のケージドハプテン。
  45. 請求項１～４４のいずれか一項に記載のケージドハプテンと一次抗体とを含むコンジュゲート。
  46. 前記ケージドハプテンが前記一次抗体に間接的に結合されている、請求項４５に記載のコンジュゲート。
  47. 前記一次抗体がインタクトな一次抗体である、請求項４６に記載のコンジュゲート。
  48. 請求項１～４４のいずれか一項に記載のケージドハプテンと二次抗体とを含むコンジュゲート。
  49. 前記ケージドハプテンが前記二次抗体に間接的に結合されている、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  50. 前記二次抗体がインタクトな二次抗体である、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  51. 式（ＩＶＡ）および（ＩＶＢ）：
    ［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－［ホスホリル］（ＩＶＡ）
    ［特異的結合実体］－Ｗ１－Ｗ２－Ｒ１－Ｏ－［ＤＩＧ］－ＰＯ４Ｈ２（ＩＶＢ）
    （式中、
    Ｗ１は、結合であるか、または１～１０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
    Ｗ２は、反応性官能基に由来し、
    ［ＤＩＧ］は、ジゴキシゲニンであり、
    ［ホスホリル］は、式：
    Figure 2024504944000043
    （Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
    Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である）
    によって表され、
    ［特異的結合実体］は、特異的結合実体であり、
    前記基［ホスホリル］または前記基－ＰＯ４Ｈ２は、［ＤＩＧ］の任意の位置に結合され得る）
    の任意の１つを有する、コンジュゲート。
  52. Ｑ１がＯであり、少なくとも１つのＱ２がＨである、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  53. Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、請求項５２に記載のコンジュゲート。
  54. Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する、請求項５２に記載のコンジュゲート。
  55. 両方のＱ２基がＨである、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  56. Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  57. Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンまたはアミノ基に由来する、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  58. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000044
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  59. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項５８に記載のコンジュゲート。
  60. Ｒ８がＯである、請求項５９に記載のコンジュゲート。
  61. Ｒ８が結合である、請求項５９に記載のコンジュゲート。
  62. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項６１に記載のコンジュゲート。
  63. ＲａおよびＲｂの両方がＨである、請求項６１に記載のコンジュゲート。
  64. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項６２に記載のコンジュゲート。
  65. Ｒ１が、式（ＩＩＩＣ）：
    Figure 2024504944000045
    （式中、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  66. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  67. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  68. 両方のＱ２基がＨである、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  69. Ｗ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基に由来する、請求項６８に記載のコンジュゲート。
  70. Ｗ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびアミノ基に由来する、請求項６８に記載のコンジュゲート。
  71. Ｑ１がＯである、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  72. 第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析する方法であって、
    （ｆ）前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｇ）前記試料を請求項４５～５０のいずれか一項に記載のケージドハプテン－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｈ）前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｉ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、前記第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または前記第１の標的を標識すること、および
    （ｊ）前記標識された第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または標識された第１の標的を検出すること
    を含む、方法。
  73. 前記第１の検出試薬が、（ｉ）前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体の前記脱マスク化ハプテンに対して特異的な二次抗体であって、前記二次抗体が前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体を第１の酵素で標識するように、前記第１の酵素にコンジュゲートされている、二次抗体と、（ｉｉ）前記第１の酵素に対する第１の基質とを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第１の基質が、発色基質または蛍光基質である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記第１の検出試薬が、前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記脱マスク化酵素を複数の第１のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記複数の第１のレポーター部分がハプテンである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記第１の検出試薬が、前記複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体をさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている、請求項７６に記載の方法。
  78. 第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析するための方法であって、
    （ａ）前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｂ）前記試料を請求項４５～５０のいずれか一項に記載のケージドハプテン－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｃ）前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｄ）シグナル増幅工程を実施して、前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を複数のレポーター部分で標識すること、および
    （ｅ）前記複数のレポーター部分を検出すること
    を含む、方法。
  79. 前記複数のレポーター部分がハプテンであり、前記方法が、前記複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体を導入することをさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記第２のレポーター部分が増幅酵素であり、前記方法が前記増幅酵素に対する発色基質または蛍光基質を導入することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記試料中の標的の総量を検出することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
  82. 第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析するための方法であって、
    （ａ）前記試料を第１の検出プローブと接触させることであって、前記第１の検出プローブは、請求項４５～５０のいずれか一項に記載のケージドハプテン－抗体コンジュゲートまたは脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートのうちの一方を含む、接触させること、
    （ｂ）前記試料を第２の検出プローブと接触させることであって、前記第２の検出プローブは、請求項４５～５０のいずれか一項に記載のケージドハプテン－抗体コンジュゲートまたは前記脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートのうちの他方を含む、接触させること、
    （ｃ）前記試料を少なくとも第１の検出試薬と接触させて、形成された脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート標的複合体を標識すること、および
    （ｄ）前記標識された脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート標的複合体からのシグナルを検出すること
    を含む、方法。
  83. 前記試料中の標的の総量を検出する工程をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記第１の検出試薬が、前記第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記脱マスキング酵素を複数の第１のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記複数の第１のレポーター部分がハプテンである、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記第１の検出試薬が、前記複数の第１のレポーター部分に対して特異的な二次抗体をさらに含み、各二次抗体は第２のレポーター部分にコンジュゲートされている、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記第２のレポーター部分が、増幅酵素またはフルオロフォアからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記第２のレポーター部分が増幅酵素であり、前記第１の検出試薬が前記増幅酵素に対する第１の発色基質または蛍光基質をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
  89. 脱ケージ化工程をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  90. 式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000046
    （式中、
    Ｑ１は、ＯまたはＳであり、
    Ｑ２は、Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり、
    Ｒ１は、結合であるか、または１～３０個の炭素原子を有し、Ｏ、ＮもしくはＳからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を任意に含む、分岐もしくは非分岐の、置換されたもしくは置換されていない、飽和もしくは不飽和脂肪族基を含む基であり、
    Ｒ２は、Ｈまたは反応性官能基であり、
    Ｒ３は、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
    Ｒ４は、Ｈ、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＨまたは－Ｏ－Ｍｅであり、
    各Ｒ５は、独立して、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、ハロゲンまたは－Ｃ（Ｏ）Ｈであり、
    Ｒ６は、Ｈであるか、または直鎖もしくは分岐の、または置換されたもしくは置換されていないＣ１～Ｃ６アルキル基であり、
    ｍ、ｎおよびｏは、それぞれ独立して、０または１～４の範囲の整数であり、
    ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１～３の範囲の整数であり、
    ｓは、１または２であり、および
    ＸおよびＹは、それぞれ独立して、－ＣＨ２－、－Ｃ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｈ）－、－Ｎ（Ｒ７）－、－Ｏ－、または－Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ７は、Ｃ１～Ｃ４直鎖または分岐の、置換されたまたは置換されていないアルキル基である）
    を有する、ケージドハプテン。
  91. Ｒ１が、式（ＩＩＩＣ）：
    Figure 2024504944000047
    （式中、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｕおよびｔは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｕ＋ｔは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  92. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項９１に記載のケージドハプテン。
  93. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項９１に記載のケージドハプテン。
  94. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項９３に記載のケージドハプテン。
  95. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される、請求項９３に記載のケージドハプテン。
  96. Ｒ２が、アミン反応性基、チオール反応性基およびカルボニル反応性基から選択される、請求項９１に記載のケージドハプテン。
  97. Ｒ２が、ジベンゾシクロオクチン、トランス－シクロオクテン、アルキン、アルケン、アジド、テトラジン、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、チオール、１，３－ニトロン、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミノ基からなる群から選択される、請求項９１に記載のケージドハプテン。
  98. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000048
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項９７に記載のケージドハプテン。
  99. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項９８に記載のケージドハプテン。
  100. Ｒ８がＯである、請求項９８に記載のケージドハプテン。
  101. Ｒ８が結合である、請求項９８に記載のケージドハプテン。
  102. ＲａまたはＲｂの少なくとも１つがＨである、請求項１０１に記載のケージドハプテン。
  103. ＲａおよびＲｂの両方がＨである、請求項１０１に記載のケージドハプテン。
  104. Ｚが結合または－ＣＨ２－である、請求項１０３に記載のケージドハプテン。
  105. Ｒ３、Ｒ４またはＲ６の少なくとも１つが－ＣＨ３である、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  106. Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが－ＣＨ３である、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  107. Ｒ６がＨである、請求項１０６に記載のケージドハプテン。
  108. Ｒ２がＨである、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  109. Ｙが－Ｃ（Ｏ）－である、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  110. Ｒ２がＨであり、およびＹが－Ｃ（Ｏ）－である、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  111. Ｒ１が、式（ＩＩＩＡ）：
    Figure 2024504944000049
    （式中、
    Ｒ８は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｒｃ）（Ｒｄ）、または－Ｎ（Ｒｃ）－であり、
    ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌまたは－Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり、
    ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは－ＣＨ３から選択され、
    Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、結合であるか、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、チオールから選択される基であり、
    各Ｚは、独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－であり、
    ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０、１または２であり、但し、ｔ＋ｕは、少なくとも１であり、
    ｖは、１～８の範囲の整数である）
    に示される構造を有する、請求項１１０に記載のケージドハプテン。
  112. 前記ケージドハプテンが、式（ＩＩＢ）：
    Figure 2024504944000050
    を有する、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  113. 前記ケージドハプテンが、式（ＩＩＩＣ）：
    Figure 2024504944000051
    を有する、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  114. 前記ケージドハプテンが、式（ＩＩＩＥ）：
    Figure 2024504944000052
    を有する、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  115. 前記ケージドハプテンが、式（ＩＩＩＦ）：
    Figure 2024504944000053
    を有する、請求項９０に記載のケージドハプテン。
  116. 請求項９０～１１５のいずれか一項に記載のケージドハプテンと一次抗体とを含むコンジュゲート。
  117. 前記ケージドハプテンが前記一次抗体に間接的に結合されている、請求項１１６に記載のコンジュゲート。
  118. 前記一次抗体がインタクトな一次抗体である、請求項１１７に記載のコンジュゲート。
  119. 第１の標的が第２の標的に近接しているかどうかを決定するために試料を分析する方法であって、
    （ａ）前記試料を脱マスキング酵素－抗体コンジュゲートと接触させて、標的－脱マスキング酵素－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｂ）前記試料を請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載のケージドハプテンコンジュゲートと接触させて、標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｃ）前記標的－ケージドハプテン－抗体コンジュゲート複合体の前記ケージドハプテンを脱マスク化して標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体を形成すること、
    （ｄ）前記試料を第１の検出試薬と接触させて、前記第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または前記第１の標的を標識すること、および
    （ｅ）前記標識された第１の標的－脱マスク化ハプテン－抗体コンジュゲート複合体または標識された第１の標的を検出すること
    を含む、方法。
  120. 前記第１の検出試薬が、（ｉ）前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体の前記脱マスク化ハプテンに対して特異的な二次抗体であって、前記二次抗体が前記標的－脱マスク化ハプテン－抗体複合体を第１の酵素で標識するように、前記第１の酵素にコンジュゲートされている、二次抗体と、（ｉｉ）前記第１の酵素に対する第１の基質とを含む、請求項１１９に記載の方法。
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