CN116783485A - 储存稳定的笼状半抗原 - Google Patents

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CN116783485A CN202280010201.2A CN202280010201A CN116783485A CN 116783485 A CN116783485 A CN 116783485A CN 202280010201 A CN202280010201 A CN 202280010201A CN 116783485 A CN116783485 A CN 116783485A
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B·D·凯利
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Abstract

本文公开了笼状半抗原和笼状半抗原‑抗体缀合物，其可用于促进检测样品中彼此邻近的靶标。

Description

储存稳定的笼状半抗原
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月15日提交的美国临时专利申请第63/137,805号的权益，其公开内容据此通过引用整体并入本文。
技术领域
公开的实施例涉及检测样品中的靶标，该靶标包括邻近地位于样品中的靶标。公开的实施例还提供了用于使用笼状半抗原或笼状半抗原缀合物检测福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中蛋白质二聚体的邻近测定。
工业适用性声明
本公开在化学和诊断学领域具有工业适用性。
背景技术
免疫组织化学(IHC)是指使用对特定抗原具有特异性的抗体检测、定位和/或定量生物学样品中的抗原(例如蛋白质)的方法。IHC具有准确鉴定组织样品中特定蛋白质的位点的实质性优点。这也是一种检查组织本身的有效的方法。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH均可用于各种生物学样品，诸如组织(例如新鲜冷冻、福尔马林固定、石蜡包埋)和细胞学样品。无论靶标是核酸还是抗原，均可使用各种标记物(例如，发色、荧光、发光、放射标记)来检测靶标的识别。为了在临床环境中可靠地检测、定位和定量靶标，期望扩增识别事件，因为可靠地检测低丰度细胞标志物的能力对于诊断用途变得越来越重要。例如，响应于单个抗原检测事件，在标志物位点沉积数百个或数千个标记物分子，通过扩增增强了检测识别事件的能力。
蛋白质-蛋白质相互作用的网络为生物系统的标志。蛋白质-蛋白质相互作用形成信号通路，该信号通路调节正常细胞和癌细胞中细胞功能所有方面。已经开发出用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，例如细胞外生长因子活化后瞬时受体酪氨酸激酶二聚化和复合物形成；然而，这些方法并非特定被设计用于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
询问已知是癌症生物学中重要决定簇的生物标志物的特定分子间相互作用的存在和分布的能力在新的诊断能力的背景下令人很感兴趣并且在药物开发的背景下用于确定治疗效果方面。探查和记录冷冻和石蜡包埋组织上的分子相互作用的分布的能力仍然无法获得；已经提出了解决该问题的替代性技术，尽管该解决方案在实际使用中尚未证明是有效和可靠的。
由Olink AB开发了邻位连接测定。这是唯一已知的用于原位检测在福尔马林固定石蜡包埋组织上的蛋白质-蛋白质相互作用的商业产品。邻位连接测定技术使用DNA连接酶以生成锁式(padlock)环状DNA模板，以及用于滚环扩增的Phi29 DNA聚合酶。这些酶很昂贵。此外，这些酶不适用于自动化系统和方法。由于这些原因，邻位连接测定通常不被认为对商业应用有用。
发明内容
本公开的第一方面为一种具有式(IA)和(IB)中的任一者的笼状半抗原：
R2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IA)，
R2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IB)，
其中
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
[DIG]为地高辛；
[磷酰基]由下式表示：
Q1为O或S；并且
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置。
在一些实施例中，Q1为S。
在一些实施例中，Q1为O，并且至少一个Q2为H。在一些实施例中，R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。
在一些实施例中，两个Q2基团均为H。在一些实施例中，R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，R8为O。在一些实施例中，R8为键。在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Ra和Rb两者均为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。
在一些实施例中，R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。在一些实施例中，两个Q2基团均为H。在一些实施例中，R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
在一些实施例中，R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。在一些实施例中，其中Q1为O。
本公开的第二方面为一种具有式(IIID)的笼状半抗原：
其中
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
R3为H、-CH3、-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R4为H、-CH3或-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R6为H或者直链或支链或者取代或未取代的C1-C6烷基基团；
m、n和o各自独立地为0或1至4范围内的整数；并且
Y为-CH2-、-C(R7)-、-N(H)-、-N(R7)-、-O-或-S-或-C(O)-，其中R7为C1-C4直链或支链、取代或未取代的烷基基团。
在一些实施例中，R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。在一些实施例中，R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。在一些实施例中，R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，R8为O。在一些实施例中，R8为键。在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Ra和Rb两者均为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。在一些实施例中，R3、R4或R6中的至少一者为-CH3。在一些实施例中，R3和R4中的至少一者为-CH3。在一些实施例中，R6为H。在一些实施例中，R2为H。在一些实施例中，Y为-C(O)-。在一些实施例中，R2为H并且Y为-C(O)-。在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
本公开的第三方面为一种缀合物，其包含(i)上文第一方面和第二方面中所述的笼状半抗原中的任何一种笼状半抗原，以及(ii)和一抗。在一些实施例中，笼状半抗原间接地偶联至一抗。在一些实施例中，一抗为完整一抗。
本公开的第四方面为一种缀合物，其包含(i)上文第一方面和第二方面中所述的笼状半抗原中的任何一种笼状半抗原，以及(ii)和二抗。在一些实施例中，笼状半抗原间接地偶联至二抗。在一些实施例中，二抗为完整二抗。
本公开的第五方面为一种具有式(IVA)和(IVB)中的任一者的缀合物：
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IVA)，
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IVB)，
其中
W1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与10个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
W2衍生自反应性官能团；
[DIG]为地高辛；
[磷酰基]由下式表示：
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；并且
[特异性结合实体]为特异性结合实体；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置。
在一些实施例中，[特异性结合实体]为抗体。在一些实施例中，[特异性结合实体]为单克隆抗体。在一些实施例中，[特异性结合实体]为一抗。在一些实施例中，[特异性结合实体]为二抗。
在一些实施例中，缀合物具有式(IVA)，并且其中[特异性结合实体]为单克隆抗体。在一些实施例中，缀合物具有式(IVB)，并且其中[特异性结合实体]为单克隆抗体。
在一些实施例中，Q1为O，并且至少一个Q2为H。在一些实施例中，W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。在一些实施例中，两个Q2基团均为H。在一些实施例中，W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。
在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb各自独立地为H、C1-C2烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)。在一些实施例中，Ra和Rb各自独立地为H或C1-C2烷基基团。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，R8为O。在一些实施例中，R8为键。在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Ra和Rb两者均为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。
在一些实施例中，R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb各自独立地为H、C1-C2烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)。在一些实施例中，Ra和Rb各自独立地为H或C1-C2烷基基团。
在一些实施例中，Ra或Rb中的至少一者为H。在一些实施例中，Z为键或-CH2-。在一些实施例中，两个Q2基团均为H。在一些实施例中，W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。在一些实施例中，W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。在一些实施例中，Q1为O。
本公开的第六方面为一种分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，该方法包括：使样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；将样品与上文关于本公开的第三方面、第四方面和第五方面所述的笼状半抗原-抗体缀合物中的任何一种笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物；将靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；以及检测经标记的第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施例中，笼状半抗原-抗体缀合物包含单克隆抗体。
在一些实施例中，第一检测试剂包含：(i)对靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物的去掩蔽的半抗原具有特异性的二抗，二抗缀合至第一酶，使得二抗用第一酶标记靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物；以及(ii)用于第一酶的第一底物。
在一些实施例中，第一底物为显色底物或荧光底物。
在一些实施例中，第一检测试剂包括扩增组分，以用多个第一报告子(reporter)部分标记靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的去掩蔽的酶。
在一些实施例中，该多个第一报告子部分为半抗原。
在一些实施例中，第一检测试剂进一步包含对该多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。
本公开的第七方面为一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，该方法包括：使样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；将样品与上文关于本公开的第三方面、第四方面和第五方面所述的笼状半抗原-抗体缀合物中的任何一种笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物；将靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽化半抗原-抗体缀合物复合物；进行信号放大步骤，以用多个报告子部分标记靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；以及检测该多个报告子部分。在一些实施例中，笼状半抗原-抗体缀合物包含单克隆抗体。
在一些实施例中，该多个报告子部分为半抗原；并且其中该方法进一步包括引入对该多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。在一些实施例中，第二报告子部分为扩增酶并且其中该方法进一步包括引入用于扩增酶的显色底物或荧光底物。在一些实施例中，该方法进一步包括检测样品中靶标的总量。
本公开的第八方面为一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，该方法包括：使样品与第一检测探针接触，第一检测探针包含上文关于本公开的第三方面、第四方面和第五方面所述的笼状半抗原-抗体缀合物中的任何一种笼状半抗原-抗体缀合物或去掩蔽酶-抗体缀合物中的一者；使样品与第二检测探针接触，第二检测探针包含上文关于本公开的第三方面、第四方面和第五方面所述的笼状半抗原抗体缀合物中的任何一种笼状半抗原-抗体缀合物或去掩蔽酶-抗体缀合物中的另一者；使样品与至少第一检测试剂接触，以标记所形成的去掩蔽的半抗原-抗体缀合物靶标复合物；以及检测来自经标记的去掩蔽的半抗原-抗体缀合物靶标复合物的信号。
在一些实施例中，该方法进一步包括检测样品内靶标的总量的步骤。在一些实施例中，第一检测试剂包括扩增组分，以用多个第一报告子部分标记第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的去掩蔽酶。在一些实施例中，该多个第一报告子部分为半抗原。在一些实施例中，第一检测试剂进一步包含对该多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。在一些实施例中，第二报告子部分选自由扩增酶或荧光团组成的组。在一些实施例中，第二报告子部分为扩增酶并且其中第一检测试剂进一步包含用于扩增酶的第一显色底物或荧光底物。在一些实施例中，该方法进一步包括去笼步骤。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，将向专利局提供带有彩色附图的专利或专利申请公布的拷贝。
图1示出地高辛(“DIG”)的碳编号。在该实例中，磷酸酯基团偶联至地高辛的12位。
图2为示出包含碱性磷酸酶的去掩蔽酶-抗体缀合物(结合至靶标2)与笼状半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1)之间的相互作用的示意图，其中去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶与笼状半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应(由于靶标1和靶标2彼此邻近)以提供相应的去掩蔽的半抗原，这可以被检测到。
图3为示出去掩蔽酶-抗体缀合物(结合至靶标2)和笼状半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1)的示意图，其中两个靶标彼此不非常邻近，使得去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶不与笼状半抗原-抗体缀合的酶底物部分相互作用，因此笼状半抗原保持掩蔽并且无法被检测到。
图4提供了示出检测样品中蛋白质二聚体和/或总蛋白质的步骤的流程图。
图5为示出IHC染色方案的实施例的示意图，其中用标记有笼状DIG的二抗检测单个抗原。
图6为示出将笼状DIG(即磷酸化DIG)解笼(或去掩蔽)以提供天然DIG半抗原的示意图。
图7为示出对非常邻近的两种蛋白质(靶标1和靶标2)和总蛋白质(靶标2)的多重检测的示意图。
图8示出抗体与笼状半抗原(即磷酸化DIG)的偶联。
图9示出笼状硝基苯基(NP)和笼状DIG上的笼化基团的水解，该水解用于形成天然半抗原(NP和DIG)。
图10示出监测水解(非酶促地被水切割)为天然半抗原的笼状半抗原的量的实验，该量表达为两种不同的笼状NP分子和笼状DIG的原始材料的百分比。
图11A描绘了使用笼状NP对扁桃体组织上的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白进行正邻近测定的代表性图像。
图11B描绘了使用笼状DIG对扁桃体组织上的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白进行正邻近测定的代表性图像。
具体实施方式
本文公开了笼状半抗原和它们的合成方法。本文还公开了包含笼状半抗原的缀合物。如本文将更详细地描述的，笼状半抗原缀合物可以用于检测组织样品中的邻近抗原。这些实施例和其他实施例在本文中描述。
定义
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。例如，在分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为具有包容性，即包含若干元素或元素列表中的至少一个元素，但也包含一个以上元素，以及任选地包含额外的未列出的项目。只有指明与之相反的术语，如“只有一个”或“恰好一个”，或者在权利要求中使用的“由…组成”，将指包含若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般来说，本文使用的术语“或者”只有在前面有“或”、“其中之一”、“只有一个”或“恰好一个”等排他性术语时，才应解释为表示排他性的替代选择(即“一个或另一个，但不是两个”)。在权利要求书中使用的“基本上由…组成”应具有在专利法领域使用的普通含义。
如本文所用，“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。
如本文在说明书和权利要求书中所用，就一个或多个元素的列表而言，短语“至少一个”应理解为选自元素列表中任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，也不排除元素列表中的任何元素组合。除了在短语“至少一个”所涉及的元素列表中具体确定的元素之外，该定义还允许其他元素任选地存在，无论这些元素与具体确定的元素相关与否。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者等效地，“A或B中的至少一个”，或者等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以指至少一个任选地包括一个以上的A，但没有B(以及任选地包括B以外的元素)；在另一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的B，但没有A(以及任选地包括A以外的元素)；在又一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的A，以及至少一个任选地包括一个以上的B(以及任选地包括其他元素)等。
如本文所用，术语“碱性磷酸酶”(AP)是指一种通过破坏磷酸酯-氧键并且暂时形成中间酶-底物键来去除(通过水解)并且转移磷酸酯基团有机酯的酶。例如，AP将萘酚磷酸酯(底物)水解为酚类化合物和磷酸酯。酚类与无色重氮盐(色原)偶联，以产生不溶性有色偶氮染料。
如本文所用，术语“烷基”、“芳族”、“杂烷基”、“环烷基”包括所示自由基的取代和未取代形式就这一点而言，每当基团或部分被描述为“取代的”或“任选取代的”(或“任选地具有”或“任选地包含”)时，该基团可以未取代的或被一个或多个所示取代基取代。同样，当一个基团被描述为“取代或未取代的”，如果被取代时，取代基可以选自一个或多个所示取代基。如果没有指示取代基，则是指所指示的“任选取代的”或“取代的”基团可以被一个或多个基团单独地并且独立地选自由以下项组成的组的基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、氰酸酯、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、保护的C-羧基、O-羧基、异氰硫基、氰硫基、异硫氰硫基、硝基、甲硅烷基、硫基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰胺基、醚、氨基(例如单取代的氨基基团或二取代的氨基基团)及其保护的衍生物。上述任何基团可包括一个或多个杂原子，包括O、N或S。例如，当部分被烷基基团取代时，该烷基基团可包含选自O、N或S的杂原子(例如-(CH2-CH2-O-CH2-CH3))。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指糖蛋白免疫球蛋白，其与抗原特异性结合；并且包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL均包含三个CDR和四个FR，其按照以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
免疫球蛋白可以衍生自通常已知的同种型中的任何同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG子类也是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或子类(例如，IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；完全合成抗体；和单链抗体。可以通过重组方法来将非人抗体人源化，以减少其在人体中的免疫原性。在没有明确说明的情况下，并且除非上下文另有指示，否则术语“抗体”还包括上述免疫球蛋白中的任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链抗体。
术语“单克隆抗体”(“mAb”)是指单一分子组成的抗体分子的非天然存在制剂，即，其一级序列基本相同并且对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。mAb为经分离的抗体的实例。MAb可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术来产生。
如本文所用，短语“抗体缀合物”是指那些与一种或多种标记缀合(直接或间接)的抗体，其中抗体缀合物对特定靶标具有特异性并且其中标记能够被检测(直接或间接)，例如用二抗(抗标记抗体)。例如，抗体缀合物可以与半抗原偶联，诸如通过聚合物接头和/或间隔物，并且可以借助于半抗原间接检测抗体缀合物。作为替代实例，抗体缀合物可与色原偶联，诸如通过聚合物接头和/或间隔物，并且可直接检测抗体缀合物。抗体缀合物进一步描述于美国公开第2014/0147906号和美国专利第8,658,389号；第8,686,122号；第8,618,265号；第8,846,320号；和第8,445，191号。进一步举例来说，术语“抗体缀合物”包括缀合至酶的那些抗体，例如HR或AP。在一些实施例中，抗体缀合物包含单克隆抗体。在其他实施例中，抗体缀合物包含多克隆抗体。
如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性体液或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如：半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(诸如复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白质)。
如本文所用，术语“芳基”意指优选地含有6个至10个碳原子的芳族碳环自由基或取代的碳环自由基，诸如苯基或萘基或苯基或萘基，其任选地被选自由以下项组成的组的取代基中的至少一个取代基取代：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、芳酰基、卤代、硝基、三卤甲基、氰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、烷硫基、芳硫基、亚烷基或-NYY′(其中Y和Y′独立地为氢、烷基、芳基或芳烷基)。
如本文所用，术语“生物学样品”可为从包括但不限于单细胞生物体(诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等)、多细胞生物体(诸如植物或动物)的任何活生物体获得、由其排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括来自健康或表观健康人类受试者或受待诊断或研究的病状或疾病诸如癌症影响的人类患者的样品。例如，生物学样品可为从例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、房水或玻璃体获得的生物体液或任何身体分泌物、漏出液、渗出物(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的流体)或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节)获得的流体。生物学样品也可为从任何器官或组织获得的样品(包括活检或尸检标本，诸如肿瘤活组织切片)，或者可包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物学样品为细胞核提取物。在某些实例中，样品为质量控制样品，诸如所公开的细胞沉淀切片样品中的一者。在其他实例中，样品为测试样品。样品可使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行制备。样品可得自接受常规筛查的受试者，或得自疑似患有病症的受试者，诸如遗传异常、感染或瘤形成。本发明所公开的方法的所述实施例还可应用于无遗传异常、疾病、病症等的样品，这些样品称为“正常”样品。样品可包括可由一种或多种检测探针特异性结合的多个靶标。
如本文所用，Ca至Cb(其中“a”和“b”是整数)是指烷基、烯基或炔基中的碳原子数，或环烷基、环烯基、环炔基或芳基基团的环中的碳原子数，或杂烷基、杂环基、杂芳基或杂脂环基中的碳原子和杂原子的总数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的环、环烯基的环、环炔基的环、芳基的环、杂芳基的环或杂脂环基的环可含有“a”至“b”(包含a和b)个碳原子。因此，例如，“C1至C4烷基”基团是指具有1个至4个碳的所有烷基基团，即，CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。如果对于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基未指定“a”和“b”，则假定这些定义中所述的最广泛的范围。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子)。在一些实施例中，缀合物包括共价连接至一个或多个其他分子部分的一种或多种生物分子(诸如肽、蛋白质、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。在其他实施例中，缀合物包括共价连接至一种或多种可检测标记(诸如荧光团、发光体、荧光纳米颗粒、半抗原、酶以及它们的组合)的一种或多种特异性结合分子(例如抗体)。
如本文所用，术语“接触”在本文中可与以下项互换使用：与……组合、添加至、与……混合、传递、与……一起孵育等。
如本文所用，术语“偶联”是指一个分子或原子与另一分子或原子的结合、键合(例如共价键合)或连接。
如本文所用，类似于“环烷基”的术语(例如，环烷基基团)是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环体系。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式连接在一起。环烷基基团可在一个或多个环中含有3至10个原子，或在一个或多个环中含有3至8个原子。环烷基基团可未被取代或被取代。典型的环烷基基团包括但决不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
如本文所用，术语“发色团”是指负责其颜色的分子或分子的一部分(例如显色底物)。当分子吸收特定波长的可见光并且透射或反射其他波长的可见光时，就会产生颜色。在两个不同分子轨道之间具有能量差的分子落在可见光谱范围内，可以吸收可见光，因此被恰当地表征为发色团。可以吸收入射在发色团上的可见光，从而将电子从基态分子轨道激发至激发态分子轨道中。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子)。在一些实施例中，缀合物包括共价连接至一个或多个其他分子部分的一种或多种生物分子(诸如肽、蛋白质、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。
如本文所用，术语“可检测部分”可产生可检测(诸如视觉、电子或其他方式)信号的分子或材料，该可检测信号指示在样品中的标记的存在(即，定性分析)和/或浓度(即，定量分析)。
如本文所用，术语“表位”是指抗原决定簇，诸如分子上的连续或非连续肽序列，该抗原决定簇具有抗原性，即引发特异性免疫应答。抗体与特定的抗原表位结合。
如本文所用，术语“卤素原子”或“卤素”意指元素周期表第7主族的放射性稳定原子中的任一者，诸如氟、氯、溴和碘。
如本文所用，术语“半抗原”是指可以与抗体特异性组合的小分子，但是除与载体分子组合外，通常基本上不能具有免疫原性。在一些实施例中，半抗原包括但不限于：吡唑(例如硝基吡唑)；硝基苯基化合物；苯并呋咱；三萜烯；脲(例如苯基脲)；硫脲(例如苯基硫脲)；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物；噁唑(例如噁唑磺酰胺)；噻唑(例如噻唑磺酰胺)；香豆素衍生物；以及环木脂体。半抗原的其他非限制性实例包括：噻唑；硝基芳基化合物；苯并呋喃；三萜烯；以及环木脂体。半抗原的具体实例包括二硝基苯基、生物素、地高辛和荧光素及其任何衍生物或类似物。其他半抗原描述于美国专利第8,846,320号、第8,618,265号、第7,695,929号、第8,481,270号以及第9,017,954号中，这些美国专利的公开内容通过引用整体并入本文。半抗原本身可能适用于直接检测，即它们可能发出用于检测的合适信号。
如本文所用，术语“杂原子”是指包括硼(B)、氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。在一些实施例中，“杂环”可包含一个或多个杂原子。在其他实施例中，脂肪族基团可以包含一个或多个杂原子或被一个或多个杂原子取代。
如本文所用，辣根过氧化物酶(HRP)是一种可以缀合至带标记分子的酶。当与适当的底物一起孵育时，其产生带标记分子的有色、荧光或发光衍生物，使其能够得到检测和定量。HRP在电子供体存在下发挥作用，首先形成酶底物复合物，然后作用以氧化电子供体。例如，HRP可作用于3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)以产生可检测的颜色。HRP也可以作用于带标记的酪酰胺缀合物或酪酰胺样反应性缀合物(即，阿魏酸盐、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸盐、多巴胺等)，以沉积有色或荧光或无色报告子部分，用于酪酰胺信号放大(TSA)。
如本文所用，术语“标记”是指可检测部分，其可以是原子或分子，或原子或分子的集合。标记可以提供可以被检测到的光学、电化学、磁性或静电(例如，感应、电容)标记。
如本文所用，术语“多重”、“多重化的”或“多重化”是指同时、基本上同时或顺序检测样品中的多个靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白质)。
如本文所用，术语“核酸分子”或“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者它们的类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。除非特别限定，否则该术语涵盖包括天然核苷酸的已知类似物的核酸或多核苷酸，该天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析中定义的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、合成多核苷酸、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合来修饰。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、同源基因序、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核苷酸或核苷单体单元的寡聚物，其中该寡聚物任选地包括非核苷酸单体单元和/或在该寡聚物的内部和/或外部位置连接的其他化学基团。寡聚物可以是天然的或合成的，并且可以包括天然存在的寡核苷酸，或包括具有非天然存在(或修饰的)碱基、糖部分、磷酸二酯-类似物键和/或替代性单体单元手性和异构结构的核苷的寡聚物(例如5′-键至2′-键，L-核苷，α-异头物核苷、β-异头物核苷、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA))。
如本文所用，术语“一抗”是指与组织样品中的靶蛋白抗原特异性结合的抗体。一抗通常是免疫组织化学程序中使用的第一抗体。在一些实施例中，一抗为单克隆抗体。
如本文所用，术语“反应性基团”或“反应性官能团”是指能够与不同部分的官能团化学缔合、相互作用、杂交、氢键合或偶联的官能团。在一些实施例中，两个反应性基团或两个反应性官能团之间的“反应”可以意指在两个反应性基团或两个反应性官能团之间形成共价键；或者可以意指两个反应性基团或两个反应性官能团彼此缔合、彼此相互作用、彼此杂交、彼此氢键合等。
在一些实施例中，反应性基团可以为胺反应性基团，诸如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、酰氯例如磺酰氯、醛和乙二醇、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化剂、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐以及它们的组合。合适的硫醇反应性官能团包括卤代乙酰基和卤代烷、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂、硫醇-二硫化物交换试剂，例如吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂及其组合。合适的羧酸酯反应性官能团包括重氮烷烃、重氮乙酰化合物、羰基二咪唑化合物和碳二亚胺。合适的羟基反应性官能团包括环氧化物和环氧乙烷、羰基二咪唑、N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、高碘酸盐氧化化合物、酶促氧化、烷基卤素和异氰酸酯。醛和酮反应性官能团包括肼、席夫碱、还原胺化产物、曼尼希缩合产物及其组合。活性氢反应性化合物包括重氮衍生物、曼尼希缩合产物、碘化反应产物及其组合。光反应性化学官能团包括芳基叠氮化物、卤代芳基叠氮化物、苯甲酮、重氮化合物、双吖丙啶衍生物及其组合。
如本文所用，术语“二抗”在本文中是指与一抗特异性结合，从而在一抗与随后的试剂(如有的话，例如标记物、酶等)之间形成桥的抗体。二抗通常是免疫组织化学程序中使用的第二抗体。
如本文所用，术语“特异性结合实体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于彼此结合以实质性地排除与其他分子结合的分子对(例如，特异性结合对的结合常数可以比生物学样品中其他分子的结合对的两个成员中的任一者的结合常数大至少10- 3M、10-4M或10-5M)。特异性结合部分的特定实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白(诸如链霉抗生物素蛋白)和蛋白A)。特异性结合部分也可以包括由这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有允许的取代基。每当基团或部分被描述为“取代的”或“任选取代的”(或“任选地具有”或“任选地包含”)时，该基团可以未取代的或被一个或多个所示取代基取代。同样，当基团被描述为“取代或未取代的”，如果被取代，则一个或多个取代基可以选自一个或多个所示取代基。
在一些实施例中，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状的、支链和非支链的、碳环和杂环的以及芳族和非芳族的取代基。在一些实施例中，对于适当的有机化合物，允许的取代基可以为一个或多个并且为相同或不同的。在一些实施例中，如果没有指示取代基，则意指所指示的“任选取代的”或“取代的”基团可以被单独地并且独立地选自由以下项组成的组的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、氰酸酯、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、硫基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰氨基、氨基、醚、氨基(例如单取代的氨基基团或二取代的氨基基团)以及它们的保护的衍生物。上述任何基团可包括一个或多个杂原子，包括O、N或S。例如，当部分被烷基基团取代时，该烷基基团可包含选自O、N或S的杂原子(例如-(CH2-CH2-O-CH2-CH2)-)。
如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白质、核酸序列和半抗原，例如与蛋白质共价结合的半抗原。通常，使用一个或多个特异性结合分子的缀合物和一个可检测标记来检测靶分子。
如本文所用，术语“酪酰胺信号放大”或“TSA”是指酶介导的检测方法，该检测方法利用过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)的催化活性以原位生成靶分子(诸如蛋白质或核酸序列)的高密度标记。TSA通常涉及三个基本步骤：(1)将特异性结合成员(例如抗体，例如单克隆抗体)与靶标结合，然后用第二过氧化物酶标记的特异性结合成员对特异性结合成员进行二次检测；(2)由过氧化物酶来活化标记的酪酰胺衍生物(例如，半抗原标记的酪酰胺)的多个拷贝；以及(3)将所得的高反应性酪酰胺自由基共价偶联至与过氧化物酶-靶标相互作用位点邻近的残基(例如，蛋白质酪氨酸残基的苯酚部分)，从而导致半抗原在靶标邻近(扩散和反应性介导的)沉积。在TSA的一些实例中，涉及更多或更少的步骤；例如，可以按顺序重复TSA方法以增加信号。执行TSA的方法和用于执行TSA的商业试剂盒和试剂为可用的(参见例如，AmpMap Detection Kit with TSATM，目录号760-121，Ventana MedicalSystems，Tucson，Ariz.；Invitrogen；TSA kit No.T-20911，Invitrogen Corp，Carlsbad，Calif.)。其他酶催化的、半抗原或信号传导连接的反应性种类可以替代性地使用，因为它们可能变得可用。
如本文所用，符号是指一个部分与另一部分键合的位置。
概述
本公开涉及“笼状半抗原”、包含特异性结合实体和“笼状半抗原”的缀合物，以及使用以上物质以检测样品内的一个或多个靶标(例如，样品内的彼此非常邻近的一个或多个蛋白质靶标)的方法。如本文将更详细地描述的，本文所述的笼状半抗原或笼状半抗原缀合物有助于检测彼此非常邻近的蛋白质二聚体或蛋白质。
“笼状半抗原”是一种半抗原，其结构已被修饰，使得合适的抗半抗原抗体不再识别该半抗原并且不发生结合事件。例如，偶联至磷酸酯基团的DIG半抗原可能不再被抗DIG抗体识别。实际上，半抗原的身份和/或功能被“掩蔽”或“保护”。为实现该掩蔽或保护，本公开的半抗原包括可酶促切割的笼化基团(也称为可酶促切割的掩蔽基团)。
在引入作用于可酶促切割的笼化或掩蔽基团的酶后，笼化基团或掩蔽基团被释放以再生“天然”半抗原(也称为“解笼的半抗原”或“去掩蔽的半抗原”。然后，该天然半抗原可以被抗半抗原抗体识别。因此，在适当的酶的存在下，笼状半抗原被去掩蔽，并且抗半抗原抗体可以自由地与其结合。在上述实例中，一旦DIG的磷酸酯基团被碱性磷酸酶切割，则天然DIG半抗原就会显露出来，并且抗DIG半抗原能够与其结合。图6示出经由酶促处理来将笼状半抗原去掩蔽以提供天然半抗原，该天然半抗原可以被抗半抗原抗体识别。
笼状半抗原
在一些实施例中，本公开的笼状半抗原具有式(IA)和(IB)中的任一者的结构：
R2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IA)，
R2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IB)，
其中
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
[DIG]为地高辛或衍生自[DIG]；
[磷酰基]可以由下式表示：
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置。
在一些实施例中，[磷酰基]或-PO4H2在地高辛的碳12位处偶联(参见图1)。在一些实施例中，[磷酰基]或-PO4H2在地高辛的衍生物或类似物的碳12位处偶联。
在一些实施例中，Q1为O。在一些实施例中，Q1为O并且至少一个Q2为H。在一些实施例中，Q1为O并且每个Q2为H。在一些实施例中，Q1为O并且至少一个Q2为-CH3。
如上所述，在一些实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在其他实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在又一些实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于5个与15个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在进一步的实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于8个与12个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在一些实施例中，R1可以包含羰基、胺、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇基团。在其他实施例中，R1可以包含选自胺、羰基、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇的一个或多个末端基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至更进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至更进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在甚至更进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在甚至进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在甚至更进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在其他实施例中，R1具有式(IIIB)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少2，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少4，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少6，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在其他实施例中，R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在其他实施例中，R1具有式(IIID)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为O，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少2，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少4，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少6，并且R9为酰胺。
在其他实施例中，R1具有式(IIIE)中所描绘的结构：
其中
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-，
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。在其他实施例中，v为3至6范围内的整数。在又一些实施例中，v为4至6范围内的整数。
在一些实施例中，R2为羰基反应性基团。合适的羰基反应性基团包括肼、肼衍生物和胺。
在其他实施例中，R2为胺反应性基团。合适的胺反应性基团包括活性酯，诸如NHS或磺基-NHS、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、酰亚胺酯、酸酐等。
在又一些实施例中，R2为硫醇反应性基团。合适的硫醇反应性基团包括不可聚合的Michael受体、卤代乙酰基基团(例如碘代乙酰基)、卤代烷、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基基团、乙烯基砜、苯醌、可以进行亲核取代的芳族基团例如氟苯基团(诸如四氟苯基团和五氟苯基团)以及二硫化物基团(诸如吡啶基二硫基团和用Ellman′s试剂活化的硫醇)。
在一些实施例中，R2为能够参与点击化学反应的官能团或包括官能团的部分。“点击化学”是一种化学原理，其由Sharpless和Meldal的研究组独立地定义，描述了经定制以通过将小单元连接在一起而快速且可靠地生成物质的化学过程。“点击化学”已应用于一组可靠并且自主的有机反应(Kolb，H.C.；Finn，M.G.；Sharpless，K.B.Angew.Chem.Int.Ed.2001，40，2004-2021)。例如，将铜催化的叠氮化物-炔烃[3+2]环加成反应鉴定为水中高度可靠的分子连接(Rostovtsev，V.V.等人，Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，2596-2599)，其已经用于增强多种类型的生物分子相互作用的研究(Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，3192-3193；Speers，A.E.等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，4686-4687；Link，A.J.；Tirrell，D.A.J.Am.Chem.Soc.2003，125，11164-11165；Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，11782-11783)。此外，还已出现在有机合成(Lee，L.V.等人，J.Am.Chem.Soc.2003，125，9588-9589)、药物发现(Kolb，H.C.；Sharpless，K.B.DrugDisc.Today 2003，8，1128-1137；Lewis，W.G.等人，Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，1053-1057)以及表面功能化(Meng，J.-C.等人，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，1255-1260；Fazio，F.等人，J.Am.Chem.Soc.2002，124，14397-14402；Collman，J.P.等人，Langmuir 2004，ASAP，in press；Lummerstorfer，T.；Hoffmann，H.J.Phys.Chem.B 2004，in press)方面的应用。
在一些实施例中，R2为二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
在一些实施例中，R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在其他实施例中，R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在又一些实施例中，R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在又一些实施例中，R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在又一些实施例中，R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括硫醇反应性基团、羰基反应性基团或胺反应性基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。本文描述了能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。本文描述了能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。本文描述了能够参与“点击化学”反应的官能团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团，Q1为O，至少一个Q2为H，并且其中R2包括基团或部分，该基团或部分包括能够参与“点击化学”反应的官能团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且进一步包含在碳原子中的一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团，并且其中Q1为O，至少一个Q2为H。
在一些实施例中，R1为键并且R2为H。在一些实施例中，R1为键，R2为H，并且其中Q1为O。在一些实施例中，R1为键，R2为H，Q1为O，并且至少一个Q2为H。
在一些实施例中，本公开的笼状半抗原具有式(IIA)-(IIF)中的任一者的结构：
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其中
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
R3为H、-CH3、-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R4为H、-CH3或-CH2CH3、-OH或-O-Me；
每个R5独立地为H、-CH3、-CH2CH3、卤素或-C(O)H；
R6为H或者直链或支链或者取代或未取代的C1-C6烷基基团；
m、n和o各自独立地为0或1至4范围内的整数；
p和q各自独立地为0或1至3范围内的整数；
s为1或2；并且
X和Y各自独立地为-CH2-、-C(R7)-、-N(H)-、-N(R7)-、-O-或-S-或-C(O)-，其中R7为C1-C4直链或支链、取代或未取代的烷基基团。
如上所述，在一些实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在其他实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在又一些实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于5个与15个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在进一步的实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于6个与12个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在进一步的实施例中，R1可以为键；或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于8个与12个之间的碳原子，并且任选地具有选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子。在一些实施例中，R1可以包含羰基、胺、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇基团。在其他实施例中，R1可以包含选自胺、羰基、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或硫醇的一个或多个末端基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O或N组成的组的一个或多个杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1为具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在其他实施例中，R1为具有介于1个与20个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在又一些实施例中，R1为具有介于1个与15个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与12个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于1个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。在进一步的实施例中，R1为具有介于4个与8个之间的碳原子，并且任选地包含一个或多个氧杂原子，并且包含在至少一个碳原子上的至少一个取代的非支链脂肪族基团。
在一些实施例中，R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为-C(Rc)(Rd)-，Rc和Rd中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少1。在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，R8为O，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，R8为O，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在其他实施例中，R1具有式(IIIB)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，v为至少1，R9和R10中的至少一者包含酰胺基团，并且其中两个Z基团为不同的。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为O，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少2，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少4，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少6，并且R9和R10中的至少一者包含酰胺基团。
在其他实施例中，R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在其他实施例中，R1具有式(IIID)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且t+u为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，t+u为至少2，并且v为至少3。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，并且u为0。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少2。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少4。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且v为至少6。
在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少2，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少4，并且R9为酰胺。在一些实施例中，Ra和Rb中的至少一者为H，u为0，v为至少6，并且R9为酰胺。
在其他实施例中，R1具有式(IIIE)中所描绘的结构：
/>
其中
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-，
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
在一些实施例中，v在1至6的范围内。在其他实施例中，v在1至4的范围内。在又一些实施例中，v在2至6的范围内。在进一步的实施例中，v在2至4的范围内。在其他实施例中，v为3至6范围内的整数。在又一些实施例中，v为4至6范围内的整数。
在一些实施例中，R2为羰基反应性基团。合适的羰基反应性基团包括肼、肼衍生物和胺。在其他实施例中，R2为胺反应性基团。合适的胺反应性基团包括活性酯，诸如NHS或磺基-NHS、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、酰亚胺酯、酸酐等。在再一些实施例中，R2为硫醇反应性基团。合适的硫醇反应性基团包括不可聚合的Michael受体、卤代乙酰基基团(例如碘代乙酰基)、卤代烷、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基基团、乙烯基砜、苯醌、可以进行亲核取代的芳族基团例如氟苯基团(诸如四氟苯基团和五氟苯基团)以及二硫化物基团(诸如吡啶基二硫基团和用Ellman′s试剂活化的硫醇)。
在一些实施例中，R2为能够参与点击化学反应的官能团或包括官能团的部分。在一些实施例中，R2为二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
在一些实施例中，R3和R4中的至少一者为-CH3。在一些实施例中，R3和R4中的至少一者为-CH3；并且R6为C1-C4烷基基团。在一些实施例中，R3和R4中的至少一者为-CH3；并且R6为C1-C2烷基基团。在一些实施例中，R3或R4中的至少一者为-CH3，并且R6为H。
在一些实施例中，R3和R4两者均为-CH3；并且R6为C1-C4烷基基团。在一些实施例中，R3和R4两者均为-CH3；并且R6为C1-C2烷基基团。在一些实施例中，R3或R4中的至少两者为-CH3；并且R6为H。
在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；并且每个R5均选自H或-CH3。在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；每个R5均选自H或-CH3；并且至少一个R3或R4为-CH3。在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；每个R5均选自H或-CH3；并且R3和R4两者均为-CH3。
在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；每个R5均选自H或-CH3，并且s为1。在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；每个R5均选自H或-CH3，s为1；并且至少一个R3或R4为-CH3。在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；每个R5均选自H或-CH3，s为1；并且R3和R4两者均为-CH3。
在一些实施例中，m、n、p和q各自为1；并且至少一个R5为-CH3。在一些实施例中，m、n、p和q各自为0。在一些实施例中，m、n、p和q各自为0；并且至少一个R3或R4为-CH3。在一些实施例中，m、n、p和q各自为0；并且R3和R4两者均为-CH3。
在一些实施例中，X为O。在一些实施例中，X为O并且Y为-C(O)-。在一些实施例中，X为O。在一些实施例中，X为O，Y为-C(O)-，并且s为1。在一些实施例中，X为O，Y为-C(O)-，s为1并且Q1为O。在一些实施例中，X为O，Y为-C(O)-，s为1并且Q1为S。在一些实施例中，X为O，Y为-C(O)-，s为1，Q1为O并且每个Q2均为H。
式(IIIA)至(IIIF)的化合物的非限制性实例包括但不限于：
笼状半抗原缀合物
本公开还提供了包含笼状半抗原的缀合物。在一些实施例中，缀合物包含特异性结合实体和笼状半抗原，诸如具有式(IA)、(IB)或(IIA)-(IIF)中的任一者的结构的笼状半抗原。本文描述了将特异性结合实体(例如抗体、核酸分子、寡核苷酸等)与笼状半抗原偶联的方法。
在一些实施例中，缀合物包含与具有式(IA)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IB)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IIA)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IIB)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IIC)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IID)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IIE)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在其他实施例中，缀合物包含与具有式(IIF)的结构的笼状半抗原偶联的抗体(例如，一抗或二抗)。在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，一抗或二抗为单克隆抗体。
一抗的实例包括抗Her2、抗Her3、抗PD-L1、抗PD-1、抗E-钙粘蛋白、抗β-连环蛋白、抗EGFR(Her1)、抗cMET、抗GRB2、抗TIGIT、抗磷酸酪氨酸、抗泛素。二抗的实例包括抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊、抗骆驼、抗DIG、抗DNP、抗荧光素。
本公开的笼状半抗原可以偶联至抗体的任何部分或单克隆抗体的任何部分。技术人员将理解，抗体包含三种不同类型的适用于共价修饰的官能团，该官能团包括(i)胺(-NH2)、(ii)硫醇基团(-SH)和(iii)碳水化合物残基。因此，本文所公开的笼状半抗原中的任何笼状半抗原可以偶联至胺残基、硫醇残基和碳水化合物残基或它们的任意组合。在一些实施例中，笼状半抗原偶联至抗体的Fc部分。
在一些实施例中，特异性结合实体为核酸分子或寡核苷酸。在一些实施例中，核酸分子包含介于5个与约50个之间的核苷酸。在其他实施例中，核酸分子包含介于5个与约40个之间的核苷酸。在其他实施例中，核酸分子包含介于5个与约30个之间的核苷酸。在其他实施例中，核酸分子包含介于5个与约25个之间的核苷酸。在其他实施例中，核酸分子包含介于5个与约20个之间的核苷酸。在其他实施例中，核酸分子包含介于5个与约15个之间的核苷酸。
在一些实施例中，本公开的笼状半抗原缀合物具有式(IVA)或(IVB)中的任一者的结构：
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IVA)，
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IVB)，
其中
[特异性结合实体]为特异性结合实体；
W1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与10个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
W2为键或衍生自反应性官能团；并且
“反应性官能团”、R1、[DIG]和[磷酰基]如本文所述。
在一些实施例中，[特异性结合实体]为抗体，例如单克隆抗体。在一些实施例中，[特异性结合实体]为一抗(例如与对β-连环蛋白具有特异性的抗体缀合的笼状半抗原)。在一些实施例中，[特异性结合实体]为二抗(例如与对抗β-连环蛋白抗体具有特异性的抗体缀合的笼状半抗原)。在一些实施例中，[特异性结合实体]为核酸分子或寡核苷酸。
在一些实施例中，笼状半抗原缀合物具有式(VA)或(VF)中的任一者的结构：
/>
/>
其中
[特异性结合实体]为特异性结合实体；
W1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与10个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
W2为键或衍生自反应性官能团(如本文所述)；
Q1、Q2、R1、R3-R7、m、n、o、p、q、s、X和Y如本文所定义。
在一些实施例中，[特异性结合实体]为抗体，例如单克隆抗体。在一些实施例中，[特异性结合实体]为一抗(例如与对β-连环蛋白具有特异性的抗体缀合的笼状半抗原)。在一些实施例中，[特异性结合实体]为二抗(例如与对抗β-连环蛋白抗体具有特异性的抗体缀合的笼状半抗原)。在一些实施例中，[特异性结合实体]为核酸分子或寡核苷酸。
W1和W2基团的非限制性实例如下所述：
本公开的缀合物的非限制性实例包括：
笼状半抗原缀合物的合成
可以根据本领域普通技术人员已知的任何方法合成本公开的笼状半抗原缀合物。在一些实施例中，笼状半抗原(诸如本文所述的那些笼状半抗原中的任何笼状半抗原，包括式(IA)、(IB)和(IIA)-(IIF)的那些笼状半抗原中的任何笼状半抗原)可以缀合至抗体的硫醇基团，例如，单克隆抗体的硫醇基团。在一些实施例中，首先通过用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇(DTE))处理抗体来向抗体引入硫醇基团。对于温和的还原剂，诸如DTE或DTT，利用介于约1mM与约40mM之间的浓度(例如，约5mM与约30mM之间或约15mM与约25mM之间的浓度)以向抗体引入有限数量的硫醇(例如约2个与约6个之间)，同时保持抗体完整(这可以通过尺寸排阻色谱法来确定)。在用还原剂进行处理后，引入过量的带有硫醇反应性基团(例如马来酰亚胺基团)的笼状半抗原，以形成相应的笼状半抗原-抗体缀合物。引入一个或多个硫醇基团的其他方法描述于美国专利公开第2016/0187324号中，其公开内容据此通过引用整体并入本文。
在其他实施例中，笼状半抗原可以缀合至抗体的Fc部分。在一些实施例中，抗体的Fc部分首先被氧化以形成醛，随后笼状半抗原通过笼状半抗原上的反应性官能团(例如，具有羰基反应性基团，例如酰肼基团)来偶联至抗体的氧化Fc部分。
在又一些实施例中，笼状半抗原可以缀合至抗体的赖氨酸残基，例如单克隆抗体的赖氨酸残基。如以下合成方案(方案2)所示，在一些实施例中，首先用过量的Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)处理抗体，然后添加过量的适当官能化的笼状半抗原(例如，带有硫醇反应性基团(例如马来酰亚胺基团)的半抗原)。
在笼状半抗原缀合物的合成后，可以将缀合物进行纯化(例如通过尺寸排阻色谱法(SEC))，然后进行表征(例如通过凝胶电泳和/或UV-Vis)。
使用笼状半抗原缀合物进行邻近检测
如本文将更详细地描述的，本公开有助于检测蛋白质-蛋白质复合物，例如彼此非常邻近的蛋白质二聚体或蛋白质(例如具有5000nm或更小的邻近度的那些蛋白质二聚体或蛋白质)。在一些实施例中，该测定能够检测具有4000nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在其他实施例中，该测定能够检测具有3000nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在其他实施例中，该测定能够检测具有2500nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在其他实施例中，该测定能够检测具有2000nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在其他实施例中，该测定能够检测具有1500nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在又一些实施例中，该测定能够检测具有1000nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。在进一步的实施例中，该测定能够检测具有500nm或更小的邻近度的蛋白质二聚体或蛋白质。
蛋白质-蛋白质复合物(PPC)在所有生理过程(包括细胞疾病状态和癌症)中形成分子网络的信号传导节点和枢纽。重新编程的癌症起始细胞通过获得新的物理特征和分子特征并且改变导致病理结果的分子信号传导通路来获得并维持癌症的所有特征。据信PPC负责在那些细胞中传递致癌信号。还据信，PPC参与增殖信号传导和生长抑制因子的逃避，并且因此导致癌症的发展和进展。蛋白质-蛋白质复合物的非限制性实例包括彼此复合的Her1/2/3/4蛋白质中的任一者；与PD-L1和/或PD-L2复合的PD-1；与其所缔合的配体(AREG、EREG)中的任一者复合的EGFR(Herl)；与磷酸化酪氨酸蛋白(诸如EGFR、cMET、Her2、MUC1)复合的衔接蛋白GRB2；与CD155复合的TIGIT。
申请人提出，PPC代表了针对治疗发展以及针对免疫组织化学(IHC)中的功能诊断学的一类非常有前途的靶标。由于传统光学显微镜的衍射极限，因此传统IHC检测到单个表位的存在，其中分辨率极限在200纳米的范围内。因此，只可能根据共定位来描述蛋白质，而不是发生在几十纳米数量级的复合物。询问特定分子间复合物在冷冻和石蜡包埋组织上的存在和分布的能力允许IHC从结构诊断学过渡至功能诊断学。因此，生物标志物的定义变得更广泛，包括PPC和它们所代表的人类相互作用组内的分子网络。
据信，所公开的邻近测定比仅测量蛋白质-蛋白质相互作用更普遍。实际上，所公开的测定允许测量结合部分的邻近度。在实践中，结合部分(例如抗体)可以直接针对靶标，其中它们之间的距离很小或没有距离。该方面的实例可能包括信号传导事件，如蛋白质的磷酸化。在该情况下，如果一种抗体针对蛋白质(例如HER2)上的表位，并且第二抗体针对所有磷酸酪氨酸，则邻近信号将代表所有磷酸化HER2蛋白。该类型的测定比彼此相互作用的蛋白质对更加二元(是/否)。
本公开的笼状半抗原缀合物中的任何笼状半抗原缀合物可以用于以下两者：(i)用于检测蛋白质二聚体或蛋白质邻近度的单纯测定；以及(ii)用于检测蛋白质二聚体或蛋白质邻近度并且检测总蛋白质的多重测定。“总蛋白质”是指任何给定蛋白质的正常IHC可视化，而邻近信号为该蛋白质中参与给定相互作用的部分。例如，并且在PD-1/PD-L1测定的情况下，邻近信号将仅可视化PD-1与PD-L1之间的相互作用，而总蛋白信号将可视化样品中的所有PD-1。将对于邻近度的评分表达为分子并且将对于总蛋白质的评分表达为分母，这可以给出参与相互作用的PD-1的分数或百分比。这作为用于检测干扰蛋白质-蛋白质相互作用的活性药物成分的诊断可能很重要，其中蛋白质的表达不如相互作用的蛋白质的数量重要。这被认为对磷酸化适用，如上所述，而不是仅仅接收对于磷酸化信号的任意评分，人们能够定量给定蛋白质被磷酸化的百分比。
参考图4，蛋白质二聚体的检测发生在两个一般阶段。在第一阶段150中，样品用至少两种不同类型的抗体缀合物(例如，至少两种不同类型的单克隆抗体缀合物)标记。在第二阶段160中，样品与第一组检测试剂(例如用于单纯测定)和任选的第二组检测试剂(例如用于多重测定)接触。在第二阶段160之后，检测来自第一组检测试剂和任选地第二组检测试剂的信号(步骤140)。信号可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行检测，诸如美国专利第10,041,950号以及美国公开第2019/0204330号、第2017/0089911号和第2019/0187130号以及PCT公开第WO/2014/143155号中所述的那些方法，其公开内容据此通过引用整体并入本文。
在第一阶段150中，样品与对第一靶标具有特异性的笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物(步骤100)。在一些实施例中，笼状半抗原-抗体缀合物具有式(IVA)、(IVB)或(VA)-(VF)中的任一者。如本文进一步所述的，笼状半抗原-抗体缀合物的笼状半抗原部分能够变得去掩蔽以提供相应的去掩蔽的半抗原，即“天然半抗原”或“解笼的半抗原”。例如，笼状DIG半抗原可以被去掩蔽以提供天然DIG半抗原。同样，笼状类固醇可以被去掩蔽以提供天然类固醇。
随后，样品首先与对第二靶标具有特异性的去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物(步骤110)。在一些实施例中，去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶(例如磷酸酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶)与在步骤100处引入的笼状半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应。例如，去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶可以与式(IVA)的[磷酰基]基团、式(IVB)的PO4H2基团或式(VA)-(VF)中的任一者的含磷酸酯基团反应。
在一些实施例中，步骤100和110可以以任何顺序进行或者可以同时进行。在一些实施例中，首先进行步骤100，然后进行步骤110。在其他实施例中，首先进行步骤110，然后进行步骤100。
在一些实施例中，第一阶段150还包括一个或多个“去笼步骤”，其中改变载玻片上的条件以增强酶活性。“去笼步骤”包括但不限于一个或多个洗涤步骤或用于调节pH的步骤(例如范围为约7至约8.5的pH)。在一些实施例中，在范围为约7.4至约7.6的pH下，在约37℃的温度下，在tris缓冲液中执行去笼，并且持续范围为介于约4分钟与约32分钟之间的时间段。据信，每种去笼酶均具有其自身的最佳条件(缓冲液、盐、辅因子、温度)，并且可以选择任何去笼步骤的参数以增强酶的活性并且促进“去笼”而不干扰抗体缀合物的特异性结合。
在一些实施例中，第一阶段150还包括使样品与一种或多种可逆酶抑制剂接触，以防止酶作用于笼化基团。在一些实施例中，在引入去掩蔽抗体缀合物和笼状半抗原抗体缀合物两者之后，添加该一种或多种可逆酶抑制剂。在碱性磷酸酶(AP)的情况下，这些可逆酶抑制剂可能包括磷酸酯、苯基丙氨酸和EDTA，它们被认为能够通过不同的机制来减少酶活性。
在第二阶段160中，然后将样品与对笼状半抗原-抗体缀合物的天然半抗原具有特异性的第一组检测试剂接触(即，第一组检测试剂对笼状半抗原缀合物的解笼的形式的半抗原具有特异性)(步骤120)。任选地，将样品与对去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶具有特异性的第二组检测试剂接触(步骤130)。在一些实施例中，步骤120和130可以以任何顺序进行或者可以同时进行。
本公开的蛋白质邻近测定在图2、图3和图5至图7中进一步示出。例如，图2为示出包含碱性磷酸酶的去掩蔽酶-抗体缀合物(结合至靶标2)与笼状半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1)之间的相互作用的示意图，其中去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶(例如碱性磷酸酶)与笼状半抗原-抗体缀合物的酶底物部分(例如磷酸酯基团或其衍生物)反应(由于靶标1和靶标2彼此邻近)以提供相应的去掩蔽的半抗原，这可以被检测到。同样，图7为示出对非常邻近的两种蛋白质(靶标1和靶标2)和总蛋白质(靶标2)的多重检测的示意图。
参考图2和图7，如果第一靶标101与第二靶标102足够邻近，则笼状半抗原-抗体缀合物103A将被提供为与去掩蔽酶-抗体缀合物104足够非常邻近(标记为105的邻近度)，使得去掩蔽酶-抗体缀合物104的去掩蔽酶可以与笼状半抗原-抗体缀合物103A的酶底物反应。这进而导致形成第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物(103B)。如图2、图5和图7所示，第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物(103B)能够结合其他特异性结合实体(例如二抗106)或被该其他特异性结合实体识别。
在另一方面，并且如图3所示，如果第一靶标101不与第二靶标102足够邻近，则笼状半抗原-抗体缀合物103A将不会被提供为与去掩蔽酶-抗体缀合物104邻近(标记为108的邻近度)。在这种情况下，去掩蔽酶将不会与笼状半抗原-抗体缀合物103A的酶底物反应，因此笼状半抗原将保持掩蔽或保护状态，即它不能够结合其他特异性结合实体或被该其他特异性结合实体识别。
再次参考图2、图5和图7，在抗体缀合物的引入和任何去笼步骤之后，然后将样品与第一检测试剂(106)接触(步骤120)，第一检测试剂对第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物(103B)的去掩蔽的半抗原具有特异性。在一些实施例中，第一检测试剂包含对去掩蔽的半抗原(103B)具有特异性的二抗(106)，即抗去掩蔽的半抗原抗体。在一些实施例中，抗去掩蔽的半抗原抗体(106)缀合至可检测部分(例如，在图2和图7中，可检测部分为HRP酶，其中HRP酶作用于底物，例如银显色底物。在一些实施例中，第一检测试剂(106)将仅在第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的天然或去掩蔽的半抗原(103B)被去掩蔽酶-抗体缀合物(104)的去掩蔽酶去掩蔽时才会结合。因此，如果第一靶标和第二靶标(101和102)以及因此抗体缀合物(103A和104)彼此非常邻近，则来自第一检测试剂(106)的可检测部分的信号(107)将仅能够在步骤140处被检测到。此处，检测到的信号(107)代表非常邻近的蛋白质二聚体或蛋白质/靶标(与图3相比，其中靶标彼此之间的不足够邻近)。
在一些实施例中，可进行扩增步骤以增加可检测信号。例如，可以引入扩增组分，以用附加的报告子部分(例如附加的半抗原或其他“可检测部分”)进一步标记第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物的去掩蔽的半抗原。举例来说，可以引入缀合至扩增半抗原(或者，在其他实施例中，缀合至酶)的抗去掩蔽的半抗原抗体，以用多个扩增半抗原标记第一靶标去掩蔽的半抗原-抗体缀合物的去掩蔽的半抗原。随后，可以引入各自缀合至可检测部分的抗扩增半抗原抗体。在一些实施例中，抗扩增半抗原抗体缀合至酶，其中酶作用于引入的底物以产生信号(例如显色底物或荧光底物以产生视觉信号)。TSA和QM缀合物，各自在本文中所述，可以用于任何扩增步骤中。在一些实例中，使用OPTIVIEW扩增试剂盒(VentanaMedical Systems，Inc.，Tucson，Ariz，目录号760-099)来执行信号放大。
多重检测
在一些实施例中，去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶可以发挥两种功能，即(i)用于将笼状半抗原去掩蔽或显露出来；以及(ii)用于与另一种底物(例如显色底物或荧光底物)反应，使得可以检测到与由去掩蔽的半抗原(即去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物)生成的信号无关的信号。因此，目前公开的系统允许在对于蛋白质中的一种蛋白质的总蛋白质染色的背景下，将两种蛋白质之间的邻近度可视化。不希望受任何特定理论的束缚，据信在另一种蛋白质染色的背景下进行多重邻近检测的能力为一种允许实现快速的、经引导的载玻片读取的特征(即仅在总蛋白质内寻找邻近信号)或定量与另一种蛋白质相互作用的蛋白质的百分比的能力(一种对邻近测定进行评分的方法)。
再次参考图2、图4和图7，在引入第一检测试剂(106)之后，可以任选地在步骤130处向样品引入包含第二可检测部分的第二检测试剂，使得可以检测到总蛋白质。在一些实施例中，第二可检测部分提供不同于第一可检测部分(107)的信号的信号(112)。在一些实施例中，第二可检测部分包含用于去掩蔽酶的底物，例如提供黄色信号的显色底物(109)。在其他实施例中，第二可检测部分包含信号传导缀合物。
在一些实施例中，将生物学样品用酶灭活组合物预处理，以基本上或完全灭活内源性过氧化物酶活性。例如，一些细胞或组织含有内源性过氧化物酶。使用HRP缀合的抗体可能导致高的、非特异性背景染色。该非特异性背景可通过用本文所公开的酶灭活组合物对样品进行预处理来减小。在一些实施例中，将样品仅用过氧化氢(约1重量％至约3重量％的适当的预处理溶液)进行预处理，以降低内源性过氧化物酶活性。一旦内源性过氧化物酶活性降低或失活，即可加入检测试剂盒，然后灭活检测试剂盒中存在的酶(如上所述)。所公开的酶失活组合物和方法也可用作灭活内源性酶过氧化物酶活性的方法。另外的灭活组合物描述于美国专利公开第2018/0120202号中，其公开内容据此通过引用全文并入本文。
在一些实施例中，如果标本是嵌入石蜡中的样品，则可使用一种或多种适当的去石蜡液对该样品进行脱蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至标本上。这些物质可以用于预处理(例如蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻片等。
笼状半抗原抗体缀合物的检测
在一些实施例中，利用检测试剂以能够检测本文所述的笼状半抗原缀合物中的任何笼状半抗原缀合物或者笼状半抗原缀合物和靶标(例如样品内的靶标)的复合物。如本文所述，在一些实施例中，所采用的检测试剂对去掩蔽的半抗原或天然半抗原具有特异性，该去掩蔽的半抗原或天然半抗原对应于任何笼状半抗原缀合物的笼状半抗原。例如，如果笼状半抗原缀合物为磷酸化DIG，则将利用检测试剂以能够检测DIG，这是对应于磷酸化DIG的去掩蔽的半抗原或天然半抗原。检测试剂还可以包含被设计用于增加信号的组分，例如信号放大组分或信号放大试剂盒。
在一些实施例中，对去掩蔽的半抗原具有特异性的检测试剂为对笼状半抗原缀合物的去掩蔽的半抗原具有特异性的二抗，即抗去掩蔽的半抗原抗体，并且它们本身缀合至可检测部分。“可检测部分”为可以产生指示在样品中的笼状半抗原-抗体缀合物和/或去掩蔽酶-抗体缀合物的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)的可检测(诸如视觉、电子或其他方式)信号的分子或材料。可以通过任何已知的或尚待发现的机制生成可检测信号，所述机制包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射。
在一些实施例中，抗去掩蔽的半抗原抗体的可检测部分包括：发色、荧光、磷光和发光分子和材料；催化剂(诸如酶)，其将一种物质转化为另一种物质以提供可检测的差异(诸如通过将一种无色物质转化为有色物质，反之亦然，或通过产生沉淀或提高样品浊度)；半抗原，其可使用其他可检测的带有标记的抗体缀合物通过抗体-半抗原结合相互作用进行检测；以及顺磁性和磁性分子或材料。当然，可检测部分本身也可间接检测，例如，如果可检测部分为半抗原，则可以利用对该可检测部分具有特异性的另一种抗体检测该可检测部分，如本领域的普通技术人员所知。
在一些实施例中，抗去掩蔽的半抗原抗体包含选自由以下项组成的组的可检测部分：Cascade Blue乙酰基叠氮化物；Dapoxyl磺酸/羧酸DY-405；Alexa Fluor 405CascadeYellow吡啶基噁唑琥珀酰亚胺酯(PyMPO)；太平洋蓝DY-415；7-羟基香豆素-3-羧酸DYQ-425；6-FAM亚磷酰胺；荧光黄；Alexa Fluor 430Dabcyl NBD氯化物/氟化物；QSY 35DY-485XL；Cy2 DY-490；俄勒冈绿488Alexa Fluor 488BODIPY 493/503C3 DY-480XL；BODIPYFL C3 BODIPY FL C5 BODIPY FL-X DYQ-505；俄勒冈绿514 DY-510XL；DY-481XL；6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(JOE)；DY-520XL；DY-521XL；BODIPY R6GC3赤藓红异硫氰酸酯；5-羧基-2′，4′，5′，7′-四溴磺酰荧光素Alexa Fluor 5326-羧基-2′，4，4′，5′7，7′-六氯荧光素琥珀酰亚胺酯(HEX)；BODIPY 530/550 C3 DY-530；BODIPY TMR-XDY-555；DYQ-1；DY-556；Cy3 DY-547；DY-549；DY-550；Alexa Fluor555 Alexa Fluor546DY-548；BODIPY 558/568C3罗丹明红-X QSY 7BODIPY 564/570 C3 BODIPY 576/589C3羧基-X-罗丹明(ROX)；Alexa Fluor568 DY-590；BODIPY 581/591 C3 DY-591；BODIPY TR-XAlexa Fluor 594DY-594；羧基萘荧光素DY-605；DY-610；Alexa Fluor 610 DY-615；BODIPY630/650-X亮蓝；Alexa Fluor 633 Alexa Fluor 635琥珀酰亚胺酯；DY-634；DY-630；DY-631；DY-632；DY-633；DYQ-2；DY-636；BODIPY 650/665-X DY-635；Cy5 Alexa Fluor 647DY-647；DY-648；DY-650；DY-654；DY-652；DY-649；DY-651；DYQ-660；DYQ-661；Alexa Fluor 660Cy5.5 DY-677；DY-675；DY-676；DY-678；Alexa Fluor 680 DY-679；DY-680；DY-682；DY-681；DYQ-3；DYQ-700；Alexa Fluor 700 DY-703；DY-701；DY-704；DY-700；DY-730；DY-731；DY-732；DY-734；DY-750；Cy7 DY-749；DYQ-4；和Cy7.5。
荧光团属于多种常见的化学类别，包括香豆素、荧光素(或荧光素衍生物及类似物)、罗丹明、试卤灵、发光体和花菁。荧光分子的其他实例可参见：Molecular ProbesHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，MolecularProbes，Eugene，OR，ThermoFisher Scientific，第11版。在其他实施例中，荧光团选自氧杂蒽衍生物、花菁衍生物、方酸衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物和四吡咯衍生物。在其他实施例中，荧光部分选自：CF染料(可得自Biotium)；DRAQ和CyTRAK探针(可得自BioStatus)；BODIPY(可得自Invitrogen)；Alexa Fluor(可得自Invitrogen)；DyLight F1uor(例如DyLight 649)(可得自Thermo Scientific，Pierce)；Atto和Tracy(可得自Sigma Aldrich)；FluoProbes(可得自Interchim)；Abberior染料(可得自Abberior)；DY和MegaStokes染料(可得自Dyomics)；Sulfo Cy染料(可得自Cyandye)；HiLyte Fluor(可得自AnaSpec)；Seta、SeTau和Square染料(可得自SETA BioMedicals)；Quasar和Cal Fluor染料(可得自BiosearchTechnologies)；SureLight染料(可得自APC、RPEPerCP、Phycobilisomes)(ColumbiaBiosciences)；以及APC、APCXL、RPE、BPE(可得自Phyco-Biotech、Greensea、Prozyme、Flogen)。
在其他实施例中，抗去掩蔽的半抗原抗体缀合至酶。在这些实施例中，最终的邻近信号可以用缀合至相关抗去掩蔽的半抗原抗体的任何酶生成，用于进行去掩蔽的酶除外(例如，去掩蔽酶-抗体缀合物的去掩蔽酶，其进一步描述于本文)。在一些实施例中，合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β-内酰胺酶。在其他实施例中，酶包括氧化还原酶或过氧化物酶(例如HRP)。在这些实施例中，缀合至抗去掩蔽的半抗原抗体的酶催化显色底物、共价半抗原、共价荧光团、非共价色原和非共价荧光团转化为反应性部分，该反应性部分与靶标邻近或直接在靶标上标记样品。
显色化合物/底物的特定非限制性实例包括：二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、固红、溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2，2’-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮-p-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、洋红、碘硝基氯化四氮唑蓝(INT)、四唑蓝和四唑紫。DAB在过氧化物酶和过氧化氢存在下发生氧化，导致不溶于乙醇的棕色沉淀物沉积在酶活性位点。
在一些实施例中，显色底物为信号传导缀合物，其包含潜在反应性部分和显色部分。在一些实施例中，信号传导缀合物的潜在反应性部分配置为发生催化活化，以形成可与样品或其他检测组分共价结合的反应性种类。催化活化由一种或多种酶(例如氧化还原酶和过氧化物酶，如辣根过氧化物酶)驱动，并且导致反应性种类的形成。这些反应性种类能够与显色部分反应，该显色部分与生成它们的位点邻近(即，在酶附近)。信号传导缀合物的具体实例公开于美国专利公开第2013/0260379号中，其公开内容通过引用整体并入本文。
其他底物包括美国专利第5,583,001号、美国申请公开第2012/0171668号和PCT/EP2015/0533556中所述的那些底物，其公开内容据此通过引用整体并入本文。偶联至TSA或QM缀合物的合适的显色底物或荧光底物，如以上并入的参考文献中所提到的，包括N，N′-双羧基戊基-5，5′-二磺酰氨基-吲哚-二羰花青(Cy5)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4′-磺酰胺(Dabsyl)、四甲基罗丹明(Tamra)和罗丹明110(罗丹明)。
在一些实施例中，选择显色底物、荧光底物或信号传导缀合物，使得任何显色部分的峰值可检测波长不彼此重叠并且易于由病理学家或光学检测器(例如扫描仪)检测。在一些实施例中，选择显色部分，使得不同显色部分的峰值波长分开至少约50nm。在其他实施例中，选择显色部分，使得不同显色部分的峰值波长分开至少约70nm。在又一些实施例中，选择显色部分，使得不同显色部分的峰值波长分开至少约100nm。合适的具有香豆素核的可检测部分的实例描述于美国专利第10,041,950号中，其公开内容据此通过引用整体并入本文。其他合适的可检测部分描述于美国临时专利申请第63/071，518号中，其公开内容据此通过引用整体并入本文。
在其他进一步的实施例中，选择显色部分，使得显色部分当被引入组织标本时提供不同的颜色(例如黄色、蓝色、洋红色)。在一些实施例中，选择显色部分，使得它们提供彼此之间的良好对比，例如可光学识别的颜色分离。在一些实施例中，选择显色部分，使得当放置得彼此非常邻近时，提供与当单独观察时任一显色部分的信号或颜色不同的信号或颜色。
试剂盒
在一些实施例中，本公开的笼状半抗原缀合物可以用作“检测试剂盒”的一部分。一般来说，任何检测试剂盒均可以包括：一种或多种笼状半抗原缀合物和用于检测该一种或多种笼状半抗原缀合物的检测试剂。在一些实施例中，该试剂盒包含式(IVA)、(IVB)或(VA)-(VF)中的任一者的笼状半抗原缀合物。
检测试剂盒可以包含：包含笼状半抗原缀合物的第一组合物和包含对第一组合物具有特异性的检测试剂的第二组合物，使得可以经由检测试剂盒来检测笼状半抗原缀合物。在一些实施例中，检测试剂盒包含多种笼状半抗原缀合物(例如在缓冲液中混合在一起)，其中检测试剂盒还包含对该多种笼状半抗原缀合物中的每一种笼状半抗原缀合物具有特异性的检测试剂。
当然，任何试剂盒均可能包含其他药剂，包括缓冲液；复染剂；酶失活组合物；脱蜡溶液等，其根据需要用于手动或自动靶标检测。该试剂盒还可以包括针对使用试剂盒的组分中的任何组分的说明，该说明包括将试剂盒组分应用于组织样品以实现其中的一个或多个靶标的检测的方法。
自动化
本公开的测定和方法可以是自动化的，并且可以与标本处理设备组合。标本处理设备可以是自动化设备，例如Ventana Medical Systems，Inc.销售的BENCHMARK Ultra仪器和DISCOVERY Ultra仪器。Ventana Medical Systems，Inc.是多项美国专利的代理人，这些专利公开了执行自动分析的系统和方法，包括美国专利第5,650,327号、第5,654,200号、第6,296,809号、第6,352,861号、第6,827,901号和第6,943,029号，以及美国已公布的专利申请第20030211630号和第20040052685号，其各自通过引用整体并入本文。替代地，还可以人工处理标本。
该标本处理设备可以将固定剂涂在标本上。固定剂可以包括交联剂(例如醛类，如甲醛、聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(如金属离子和络合物，例如四氧化二锇和铬酸)、蛋白质变性剂(如乙酸、甲醇和乙醇)、机理不明的固定剂(如氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(如Camoy固定剂、Methacam、Bouin液、B5固定剂、Rossman液和Gendre液)、微波以及其他固定剂(如排除体积固定和蒸汽固定)。
如果标本为嵌入石蜡中的样品，可通过标本处理设备使用相应的去石蜡流体对样品进行去石蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至标本上。这些物质可以用于预处理(例如蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻片等。
标本处理设备可以将各种不同的化学物质应用到标本。这些化学物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调节剂。这些化学物质可以是流体(如气体、液体或气体/液体混合物)或类似物质。所述流体可以是溶剂(如极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(如水溶液或其他类型的溶液)或类似物质。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收液(如水基或非水基抗原修复液、抗原回收缓冲液等)或类似物质。探针可为分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其连接至可检测标记。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。
标本处理完毕后，用户可以将标本载片运送到成像设备上。本文所用的成像设备为明视野成像器幻灯扫描仪。一种明场成像器是由Ventana Medical Systems，Inc.销售的iScan CoreoTM明场扫描仪。在自动化实施例中，成像设备是名称为“IMAGING SYSTEM ANDTECHNIQUES”的国际专利申请第PCT/US2010/002772号(专利公开号：WO/201I/049608)或于2014年2月3日提交的名称为“IMAGING SYSTEMS，CASSETTES，AND METHODS OF USING THESAME”的美国专利公开第2014/0178169号中公开的数字病理学设备。国际专利申请第PCT/US2010/002772号和美国专利申请公开第2014/0178169号通过引用全文并入本文。在其他实施例中，成像设备包括耦接到显微镜的数码相机。
复染
复染是在样品已经用试剂染色以检测一个或多个靶标后对样品进行后处理，使得可以在显微镜下更容易地观察它们的结构的方法。例如，在盖玻片之前可任选地使用复染剂，以使免疫组织化学染色更明显。复染剂的颜色不同于初染剂。许多复染剂是众所周知的，诸如苏木精、伊红、甲基绿、亚甲蓝、姬姆色素、阿尔新蓝和核固红。可使用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)为荧光染色剂。
在一些实例中，可将一种以上的染色剂混合在一起以得到复染剂。这提供了灵活性和选择染色剂的能力。例如，可针对具有特定属性但不具有其他所需属性的混合物选择第一染色剂。可以将第二染色剂添加至混合物中，其显示缺少的所需属性。例如，可将甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝混合在一起以形成复染剂。
检测和/或成像
本发明所公开的实施例的某些方面或全部可实现自动化，并且由计算机分析和/或图像分析系统带来便利。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在一些实施例中，利用光学显微镜进行图像分析。某些公开的实施例涉及采集数字图像。这可以通过将数码相机耦接至显微镜来完成。使用图像分析软件对获得的染色样品的数字图像进行分析。可以通过多种不同的方法来测量颜色或荧光。例如，颜色可以用红色、蓝色和绿色值以及色相、饱和度和强度值来衡量；和/或通过使用光谱成像相机测量特定的波长或波长范围。还可对样品进行定性和半定量评估。定性评定包括评定染色强度、鉴定阳性染色细胞和参与染色的细胞内结构以及评估总体样品或载玻片质量。对检测样品进行单独评估，并且该分析可包括与已知平均值的比较，以确定样品是否代表异常状态。
合适的检测方法描述于PCT申请第WO/2014/143155号中，其公开内容据此通过引用整体并入本文。在一些实施例中，合适的检测系统包括成像设备、一个或多个镜头以及与成像设备通信的显示器。成像设备包括用于顺序发射能量的装置和用于捕获图像/视频的装置。在一些实施例中，定位用于捕获的装置以捕获标本图像，这些图像各自对应于暴露于能量的标本。在一些实施例中，用于捕获的装置可包括一个或多个定位在带有生物学样品的显微镜载玻片的正面和/或背面的相机。在一些实施例中，显示装置包括显示器或屏幕。在一些实施例中，用于顺序发射能量的装置包括多个能量发射器。每个能量发射器可包括一个或多个IR能量发射器、UV能量发射器、LED光发射器、它们的组合或其他类型的能量发射装置。成像系统可进一步包括用于基于通过用于捕获的装置所捕获的标本图像来产生对比度增强的彩色图像数据的装置。显示装置显示基于对比度增强的彩色图像数据来显示标本。
样品和靶标
样品包括生物成分，并且通常怀疑其包含一种或多种感兴趣的靶分子。靶分子可以在细胞表面，并且细胞可以在悬液或组织切片中。靶分子也可以在细胞内，并且在细胞裂解或通过探针穿透细胞后进行检测。本领域的普通技术人员将认识到，检测样品中靶分子的方法将根据样品类型和所用探针而变化。采集和制备样品的方法是本领域已知的。
可使用本领域的普通技术人员已知的任何方法来制备用于该方法的实施例中并且具有本文所公开的组合物的样品，诸如组织或其他生物学样品。样品可得自接受常规筛查的受试者，或得自疑似患有病症的受试者，诸如遗传异常、感染或瘤形成。本发明所公开的方法的所述实施例还可应用于无遗传异常、疾病、病症等的样品，这些样品称为“正常”样品。此类正常样品在诸多用途之外可用作与其他样品进行比较的对照。可出于多种不同的目的对样品进行分析。例如，样品可用于科学研究中，或用于诊断可疑的疾病，或用作治疗成功、生存期等的预后指标。
样品可能包含可由探针或报告分子特异性结合的多种靶标。靶标可以是核酸序列或蛋白质。在整个本公开中，当提及靶蛋白时，应当理解，与该蛋白质相关联的核酸序列也可用作靶标。在一些实例中，靶标为来自病原体(诸如病毒、细菌)或细胞内寄生物(诸如来自病毒基因组)的蛋白质或核酸分子。例如，靶蛋白可以由与疾病相关(例如，关联、存在因果关系等)的靶核酸序列产生。
靶核酸序列的大小可存在实质性差异。不受限制地，核酸序列可具有可变数量的核酸残基。例如，靶核酸序列可具有至少约10个核酸残基或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，靶多肽的大小可存在实质性差异。不受限制地，靶多肽将包括至少一个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。在一些实施例中，该多肽可包括至少两个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。
在具体的非限制性实例中，靶蛋白由与肿瘤(例如，癌症)相关联的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在肿瘤细胞中，尤其是在癌细胞(诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经系统癌等)中，已经鉴定出许多染色体异常(包括易位及其他重排、扩增或缺失)。因此，在一些实例中，靶分子的至少一部分由样品中的至少细胞亚群中扩增或缺失的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。
已知癌基因是导致若干人恶性肿瘤的原因。例如，涉及位于染色体18q11.2断点区的SYT基因的染色体重排常见于滑膜肉瘤软组织肿瘤中。可使用具有不同标记物的探针来鉴别t(18q11.2)易位：第一探针包括从SYT基因向远侧延伸的靶核酸序列所产生的FPC核酸分子，第二探针包括从延伸至SYT基因3′端或近侧的靶核酸序列所产生的FPC核酸。当与这些靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)对应的探针用于原位杂交程序时，在SYT基因区缺乏t(18q11.2)的正常细胞表现出两个融合(由非常邻近的两个标记物产生)信号，反映SYT的两个完整拷贝。具有t(18q11.2)的异常细胞表现出单一融合信号。
在其他实例中，选择的由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白为肿瘤细胞中缺失(丢失)的肿瘤抑制基因。例如，在某些膀胱癌中，位于染色体9p21上的p16区(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)缺失。涉及染色体1的短臂的远端区域(包括例如SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322)和19号染色体(包括MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1)的着丝粒区域(例如19p13-19q13)的染色体缺失是某些类型的中枢神经系统实体瘤的特征性分子特征。
上述实例仅出于举例说明的目的提供，并非旨在进行限制。与致瘤性转化和/或生长相关的许多其他细胞遗传学异常是本领域的普通技术人员所知的。由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的与致瘤性转化相关并且可用于本发明所公开的方法中的靶蛋白还包括EGFR基因(7p12；例如，GENBANKTM登录号NC-000007，核苷酸55054219-55242525)、C-MYC基因(8q24.21；例如，GENBANKTM登录号NC-000008，核苷酸128817498-128822856)、D5S271(5p15.2)、脂蛋白脂酶(LPL)基因(8p22；例如，GENBANKTM登录号NC-000008，核苷酸19841058-19869049)、RB1(13q14；例如，GENBANKTM登录号NC-000013，核苷酸47775912-47954023)、p53(17p13.1；例如，GENBANKTM登录号NC-000017，补体，核苷酸7512464-7531642)、N-MYC(2p24；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸151835231-151854620)、CHOP(12q13；例如，GENBANKTM登录号NC-000012，补体，核苷酸56196638-56200567)、FUS(16p11.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000016，核苷酸31098954-31110601)、FKHR(13p14；例如，GENBANKTM登录号NC-000013，补体，核苷酸40027817-40138734)，以及例如：ALK(2p23；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸29269144-29997936)、Ig重链、CCND1(11q13；例如，GENBANKTM登录号NC-000011，核苷酸69165054.69178423)、BCL2(18q21.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000018，补体，核苷酸58941559-59137593)、BCL6(3q27；例如，GENBANKTM登录号NC-000003，补体，核苷酸188921859-188946169)、MALF1、AP1(1p32-p31；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，补体，核苷酸59019051-59022373)、TOP2A(17q21-q22；例如，GENBANKTM登录号NC-000017，补体，核苷酸35798321-35827695)、TMPRSS(21q22.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000021，补体，核苷酸41758351-41801948)、ERG(21q22.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000021，补体，核苷酸38675671-38955488)；ETV1(7p21.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000007，补体，核苷酸13897379-13995289)、EWS(22q12.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000022，核苷酸27994271-28026505)；FLI1(11q24.1-q24.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000011，核苷酸128069199-128187521)、PAX3(2q35-q37；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸222772851-222871944)、PAX7(1p36.2-p36.12；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，核苷酸18830087-18935219)、PTEN(10q23.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000010，核苷酸89613175-89716382)、AKT2(19q13.1-q13.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000019，补体，核苷酸45431556-45483036)、MYCL1(1p34.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，补体，核苷酸40133685-40140274)、REL(2p13-p12；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，核苷酸60962256-61003682)以及CSF1R(5q33-q35；例如，GENBANKTM登录号NC-000005，补体，核苷酸149413051-149473128)。
在其他实例中，靶蛋白选自与疾病或病症相关联的病毒或其他微生物。检测细胞或组织样品中的病毒或微生物来源的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)，指示该生物体的存在。例如，靶肽、多肽或蛋白质可选自致癌或病源病毒、细菌或细胞内寄生虫(诸如恶性疟原虫和其他疟原虫种类、利什曼原虫种、细小隐孢子虫、溶组织内阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫以及弓形虫、艾美耳球虫、泰勒氏虫和巴贝虫种)的基因组。
在一些实例中，靶蛋白由来自病毒基因组的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。示例性病毒和相应的基因组序列(括号中为GENBANKTM RefSeq登录号)包括人腺病毒A型(NC-001460)、人腺病毒B型(NC-004001)、人腺病毒C型(NC-001405)、人腺病毒D型(NC-002067)、人腺病毒E型(NC-003266)、人腺病毒F型(NC-001454)、人星状病毒(NC-001943)、人BK多瘤病毒(V01109；GI：60851)、人博卡病毒(NC-007455)、人冠状病毒229E(NC-002645)、人冠状病毒HKU1 (NC-006577)、人冠状病毒NL63(NC-005831)、人冠状病毒OC43(NC-005147)、人肠道病毒A型(NC-001612)、人肠道病毒B型(NC-001472)、人肠道病毒C型(NC-001428)、人肠道病毒D型(NC-001430)、人红病毒属V9(NC-004295)、人泡沫病毒(NC-001736)、人疱疹病毒1型(单纯性疱疹病毒1型)(NC-001806)、人疱疹病毒2型(单纯性疱疹病毒2型)(NC-001798)、人疱疹病毒3型(水痘-带状疱疹病毒)(NC-001348)、人疱疹病毒4型1(艾巴氏病毒1型)(NC-007605)、人疱疹病毒4型2(爱泼斯坦-巴尔病毒2型)(NC-009334)、人疱疹病毒5型毒株AD 169(NC-001347)、人疱疹病毒5型毒株Merlin毒株(NC-006273)、人疱疹病毒6A型(NC-001664)、人疱疹病毒6B型(NC-000898)、人疱疹病毒7型(NC-001716)、人疱疹病毒8型M(NC-003409)、人疱疹病毒8型P(NC-009333)、人免疫缺陷病毒1型(NC-001802)、人免疫缺陷病毒2型(NC-001722)、人偏肺病毒(NC-004148)、人乳头瘤病毒-1(NC-001356)、人乳头瘤病毒-18(NC-001357)、人乳头瘤病毒-2(NC-001352)、人乳头瘤病毒-54(NC-001676)、人乳头瘤病毒-61(NC-001694)、人乳头瘤病毒-cand90(NC-004104)、人乳头瘤病毒RTRX7(NC-004761)、人乳头瘤病毒10型(NC-001576)、人乳头瘤病毒101型(NC-008189)、人乳头瘤病毒103型(NC-008188)、人乳头瘤病毒107型(NC-009239)、人乳头瘤病毒16型(NC-001526)、人乳头瘤病毒24型(NC-001683)、人乳头瘤病毒26型(NC-001583)、人乳头瘤病毒32型(NC-001586)、人乳头瘤病毒34型(NC-001587)、人乳头瘤病毒4型(NC-001457)、人乳头瘤病毒41型(NC-001354)、人乳头瘤病毒48型(NC-001690)、人乳头瘤病毒49型(NC-001591)、人乳头瘤病毒5型(NC-001531)、人乳头瘤病毒50型(NC-001691)、人乳头瘤病毒53型(NC-001593)、人乳头瘤病毒60型(NC-001693)、人乳头瘤病毒63型(NC-001458)、人乳头瘤病毒6b型(NC-001355)、人乳头瘤病毒7型(NC-001595)、人乳头瘤病毒71型(NC-002644)、人乳头瘤病毒9型(NC-001596)、人乳头瘤病毒92型(NC-004500)、人乳头瘤病毒96型(NC-005134)、人副流感病毒1型(NC-003461)、人副流感病毒2型(NC-003443)、人副流感病毒3型(NC一001796)、人副肠孤病毒(NC-001897)、人细小病毒4型(NC-007018)、人细小病毒B19型(NC-000883)、人呼吸道合胞病毒(NC-001781)、人鼻病毒A型(NC-001617)、人鼻病毒B型(NC-001490)、人泡沫反转录病毒(NC-001795)、人嗜T细胞病毒1型(NC-001436)、人嗜T细胞病毒2型(NC-001488)。
在某些实例中，靶蛋白由致癌病毒(例如，艾巴氏病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV，例如，HPV16、HPV18)的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在其他实例中，由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白来自病源病毒，诸如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒(例如，丙型肝炎病毒)、冠状病毒(例如，SARS病毒)、腺病毒、多瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)或单纯性疱疹病毒(HSV)。
实例
实例1-本公开的化合物的合成
在运行Empower 3(Waters)的Waters Acquity QDa(ESI)上收集MS数据。在运行Empower 3(Waters)的Waters Alliance e2695上使用Waters XBridge柱执行分析HPLC。在运行Empower 3(Waters)的Waters 2535上用Waters SunFire柱(制备型C18 OBD 10μun，50mm x 250mm)执行制备型HPLC。除非另有说明，否则所有化学品均购自商业供应商并且按原样使用。
方案1.磷酸酯笼状地高辛(DIG)的合成
化合物4通过以下方法来进行制备：将地高辛1进行乙酰化和酸水解以得到12-O-乙酰基地高辛2，其通过与重氮乙酸乙酯反应来转化为3-乙氧基羰基甲基醚3，随后其水解为地高辛-3-羧甲基醚4，如专利[美国专利5198537]中所述
化合物6。向地高辛-3-羧甲基醚4(1.0当量)在THF(6mL/mmol 4)中的搅拌溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(1.5当量)和1M的N，N′-二环己基碳二亚胺(1.5当量)在CH2C12中的溶液。将反应混合物在室温下保持20h(检查HPLC以确认反应完成)，过滤并且在减压下去除溶剂。将残余物用EtOAc稀释。将所得溶液再次过滤，然后用盐水洗涤。有机层经MgSO4干燥，并且在减压下去除溶剂，以得到NHS酯5，将其溶解在EtOAc(6mL/mmol 5)中，然后添加TEA(1.5当量)和N-Boc-乙二胺(1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌1h(检查HPLC以确认反应完成)，用EtOAc(6mL/mmol 5)稀释，然后添加1M HCl(10mL/mmol 5)。将有机层分离，然后用饱和NaHCO3和盐水洗涤。有机层经MgSO4干燥，并且在减压下去除溶剂，以得到化合物6，其不经进一步纯化即可使用。C31H51N2O6 +的MS(ESI)m/z(M+H-Boc)+计算值为547.3，实测值为547.3。
化合物7。向化合物6(1.0当量)、Ti(O-t-Bu)4(0.2当量)和TEA(3.5当量)在CH2Cl2(2mL/mmol 6)中的溶液添加氯磷酸二乙酯(2.5当量)。将反应容器密封并且在室温下搅拌16h(由HPLC监测以确认反应完成约30％)。将反应混合物用EtOAc(50mL/mmol 6)稀释，然后用0.5MHCl(50mL/mmol 6)洗涤。有机层经MgSO4干燥，并且在减压下去除溶剂，以得到灰白色泡沫。将反应重复2次以上，此时HPLC示出与起始材料6相比，反应完成约90％。粗制油通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H2O∶MeCN 95∶5至5∶95中的溶液，经历40min；40ml/min)来进行纯化，以得到磷酸二乙酯7，其为灰白色泡沫(来自4的产率为35％)。C35H60N2O9P+的MS(ESI)m/z(M+H-Boc)+计算值为683.4，实测值为683.5。
化合物8。将化合物7(1.0当量)溶解在CHCl3(2mL/mmol 7)中，然后添加EtOAc(0.2当量)和TMSBr(3.3当量)。将所得反应混合物在室温下搅拌18h(由HPLC监测以确认反应完成>95％)。在减压下去除溶剂，然后添加MeOH(6mL/mmol 7)。再次在减压下去除溶剂，并且将所得残余物通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H2O∶MeCN 95∶5至5∶95中的溶液，经历40min；40ml/min)来进行纯化，以得到磷酸酯8，其为白色固体(45％产率)。C31H52N2O9P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为627.3，实测值为627.4。
化合物10。将化合物8(1.0当量)悬浮在DMF(2mL/mmol8)中，然后添加三乙胺(5当量)，并且最后添加3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯9(1.1当量)。将反应容器密封并且将反应混合物在室温下剧烈搅拌4h(检查HPLC以确认反应完成)。然后将反应混合物用MeOH稀释并且通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H2O∶MeCN 99∶1至5∶95中的溶液，经历40min)来直接进行纯化，以得到化合物10，其为浅黄色固体。C38H57N3O12P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为778.4，实测值为778.5。
实例2-抗体缀合物制备
将2ml 1xPBS(pH 7.2)中的20mg山羊抗兔IgG添加至EDTA，以提供10mM的最终浓度，然后添加2mg Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)。将反应混合物在室温下保持1h，然后用含有10mM EDTA的1xPBS(pH 7.2)进行尺寸排阻色谱法纯化(AKTA，Superdex20010/300GL柱)。向硫醇化抗体的经合并的级分(6mg/ml)添加在0.2ml DMF中的4.2mg化合物10。将反应混合物在室温下保持3h，然后用1xPBS(pH 7.2)进行尺寸排阻色谱法纯化(AKTA，Superdex 20010/300GL柱)，以得到笼状地高辛修饰的抗体(3.7mg/ml)。图8示出抗体与本公开的笼状半抗原的缀合。
实例3-稳定性研究
为了研究具有式(IVA)、(IVB)或(VA)-(VF)中的任一者的笼状半抗原缀合物的水解稳定性(参见图9)，将模型化合物在升高的温度下进行稳定性研究。
经测试的模型化合物为具有两个不同的笼化基团的NP半抗原以及笼状DIG，如下所述：
笼状NP和笼状DIG的样品储存在37℃烘箱中的100mM PBS(pH 7.2)中。缓冲液和pH代表用于抗体缀合物的储存条件。选择37℃的温度以加压样品并且加速水解事件。正常储存条件或抗体缀合物被认为是约4℃。定期取出样品的等分试样，并且在运行Empower 3(Waters)的Waters Alliance e2695上通过反相HPLC在Waters XBridge柱上进行测试。检查每个样品HPLC痕量，以寻找去笼或其他形式的分解的证据。在37℃下储存50天后，第1代笼状NP示出约15.5％水解，第2代笼状NP具有约6％水解，而笼状DIG具有<0.5％水解(参见图10)。笼状DIG测试被监测至120天，并且在此时仍将观察到<0.5％水解。得出结论，本公开的笼状半抗原表现出优异的水解稳定性。
实例4-免疫组织化学
一般免疫组织化学(IHC)方案。
所有IHC染色实验均在VENTANAUltra自动化组织染色平台上执行。除非另有说明，否则这些方案中使用的试剂来自Roche Tissue Diagnostics(Tucson，AZ，USA；“RTD”)。/>
邻近IHC一般程序
所有福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织和细胞系样品均安装在SuperfrostPlus载玻片(Fisher Scientific，#12-550-15)上。使用EZ制备型(RTD，#950-101)来对这些样品进行去石蜡。用Cell Conditioning 1(CC1，RTD，#950-124)执行热诱导表位修复(HIER)或抗原修复(AR)。脱蜡和AR后的一般步骤为：(1)用抑制剂CM(RTD，760-4307)灭活内源性过氧化物酶；(2)与一抗共孵育(约37℃，时间在约8分钟至约32分钟的范围内，这取决于抗体)；(3)与缀合至碱性磷酸酶(AP)的山羊抗小鼠二抗一起孵育；(4)与缀合至笼状半抗原的山羊抗兔二抗一起孵育；(5)与小鼠抗半抗原HRP缀合物一起孵育；(6)用酪酰胺-HQ和H2O2(RTD，#760-052)进行信号放大；(7)与小鼠抗HQ HRP缀合物(RTD，#760-4602)一起孵育；(8)用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢(H2O2)进行检测，并且用铜进行调色；(9)用苏木精II(RTD，#790-2208)和Bluing(RTD，#760-2037)进行复染以染色细胞核；(10)用梯度醇和二甲苯脱水，然后盖玻片。在测定孵育步骤中的每个测定孵育步骤之间用反应缓冲液(RTD，#950-300)洗涤载玻片。
邻近IHC实验-E-钙粘蛋白：β-连环蛋白正邻近
对FFPE扁桃体组织去石蜡并且修复抗原(CC1，60分钟)。兔抗E-钙粘蛋白(RTD，760-4440)和小鼠抗β-连环蛋白(RTD，760-4242)共孵育(约37℃，约32分钟)。洗涤后，施加缀合至碱性磷酸酶的山羊多克隆抗小鼠抗体(约37℃；约12分钟)。洗涤后，将样品与缀合至多个笼状NP(图11A)或多个笼状地高辛(图11B)的山羊多克隆抗兔抗体一起孵育(约37℃；约12分钟)。洗涤后，将样品与小鼠抗DIG HRP缀合物孵育约(37℃；约12分钟)。用Amp HQ试剂盒(RTD，760-052，约37℃，约8分钟)执行酪酰胺扩增，然后与小鼠抗HQ HR缀合物(RTD，#760-4602，约37℃，约8分钟)一起孵育。用DAB使信号可视化，然后对组织切片进行复染。载玻片通过分级乙醇系列来进行脱水，用二甲苯清除，并且盖玻片。结果在图11A中示出，其表示使用笼状NP检测到的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的正邻近信号，并且图11B表示使用笼状DIG检测到的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的正邻近信号。
本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利公开均通过引用整体并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、应用和公开的概念来提供其他进一步的实施例。
尽管本文已参考具体实施例描述本公开，但应当理解，这些实施例仅说明性地表示本公开的原理和应用。因此，应当理解，可以对说明性实施例进行许多修改，并且可以在不脱离所附权利要求所限定本公开的精神和范围的情况下设计其他布置方式。
附加实施例
附加实施例1一种分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，该方法包括：
(a)使样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；
(b)将样品与笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物，其中笼状半抗原-抗体缀合物具有式(IVA)和(IVB)中的任一者：
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IVA)，
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IVB)，
其中
W1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，该脂肪族基团具有介于1个与10个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
W2衍生自反应性官能团；
[DIG]为地高辛；
[磷酰基]由下式表示：
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；并且
[特异性结合实体]为抗体；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置；
(c)将靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；
(d)使样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或第一靶标；以及
(e)检测经标记的第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。
附加实施例2.根据附加实施例1所述的方法，其中Q1为O，并且至少一个Q2为H。
附加实施例3.根据附加实施例2所述的方法，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
附加实施例4.根据附加实施例2所述的方法，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。
附加实施例5.根据附加实施例1所述的方法，其中两个Q2基团均为H。
附加实施例6.根据附加实施例5所述的方法，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
附加实施例7.根据附加实施例5所述的方法，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。
附加实施例8.根据附加实施例5所述的方法，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且v为1至8范围内的整数。
附加实施例9.根据附加实施例8所述的方法，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
附加实施例10.根据附加实施例9所述的方法，其中R8为O。
附加实施例11.根据附加实施例9所述的方法，其中R8为键。
附加实施例12.根据附加实施例11所述的方法，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
附加实施例13.根据附加实施例11所述的方法，其中Ra和Rb两者均为H。
附加实施例14.根据附加实施例12所述的方法，其中Z为键或-CH2-。
附加实施例15.根据附加实施例1所述的方法，其中R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
附加实施例16.根据附加实施例15所述的方法，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
附加实施例17.根据附加实施例15所述的方法，其中Z为键或-CH2-。
附加实施例18.根据附加实施例15所述的方法，其中两个Q2基团均为H。
附加实施例19.根据附加实施例18所述的方法，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
附加实施例20.根据附加实施例15所述的方法，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。
附加实施例21.根据附加实施例15所述的方法，其中Q1为O。

Claims (120)

1.一种具有式(IA)和(IB)中的任一者的笼状半抗原：
R2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IA)，
R2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IB)，
其中
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，所述脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
[DIG]为地高辛；
[磷酰基]由下式表示：
Q1为O或S；并且
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置。
2.根据权利要求1所述的笼状半抗原，其中Q1为S。
3.根据权利要求1所述的笼状半抗原，其中Q1为O，并且至少一个Q2为H。
4.根据权利要求3所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
5.根据权利要求3所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。
6.根据权利要求1所述的笼状半抗原，其中两个Q2基团均为H。
7.根据权利要求6所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
8.根据权利要求6所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。
9.根据权利要求6所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
10.根据权利要求9所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
11.根据权利要求9所述的笼状半抗原，其中R8为O。
12.根据权利要求9所述的笼状半抗原，其中R8为键。
13.根据权利要求12所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
14.根据权利要求12所述的笼状半抗原，其中Ra和Rb两者均为H。
15.根据权利要求14所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
16.根据权利要求1所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
17.根据权利要求16所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
18.根据权利要求16所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
19.根据权利要求16所述的笼状半抗原，其中两个Q2基团均为H。
20.根据权利要求19所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
21.根据权利要求19所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
22.根据权利要求19所述的笼状半抗原，其中Q1为O。
23.一种具有式(IIID)的笼状半抗原：
其中
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，所述脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
R3为H、-CH3、-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R4为H、-CH3或-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R6为H或者直链或支链或者取代或未取代的C1-C6烷基基团；
m、n和o各自独立地为0或1至4范围内的整数；并且
Y为-CH2-、-C(R7)-、-N(H)-、-N(R7)-、-O-或-S-或-C(O)-，
其中R7为C1-C4直链或支链、取代或未取代的烷基基团。
24.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
25.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
26.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
27.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
28.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
29.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
30.根据权利要求24所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
31.根据权利要求29所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或--N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
32.根据权利要求31所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
33.根据权利要求31所述的笼状半抗原，其中R8为O。
34.根据权利要求31所述的笼状半抗原，其中R8为键。
35.根据权利要求34所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
36.根据权利要求34所述的笼状半抗原，其中Ra和Rb两者均为H。
37.根据权利要求36所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
38.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中R3、R4或R6中的至少一者为-CH3。
39.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中R3和R4中的至少一者为-CH3。
40.根据权利要求39所述的笼状半抗原，其中R6为H。
41.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中R2为H。
42.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中Y为-C(O)-。
43.根据权利要求23所述的笼状半抗原，其中R2为H并且Y为-C(O)-。
44.根据权利要求43所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
45.一种缀合物，其包含根据权利要求1至44中任一项所述的笼状半抗原以及一抗。
46.根据权利要求45所述的缀合物，其中所述笼状半抗原间接地偶联至所述一抗。
47.根据权利要求46所述的缀合物，其中所述一抗为完整一抗。
48.一种缀合物，其包含根据权利要求1至44中任一项所述的笼状半抗原以及二抗。
49.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述笼状半抗原间接地偶联至所述二抗。
50.根据权利要求48所述的缀合物，其中所述二抗为完整二抗。
51.一种具有式(IVA)和(IVB)中的任一者的缀合物：
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-[磷酰基] (IVA)，
[特异性结合实体]-W1-W2-R1-O-[DIG]-PO4H2 (IVB)，
其中
W1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，所述脂肪族基团具有介于1个与10个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
W2衍生自反应性官能团；
[DIG]为地高辛；
[磷酰基]由下式表示：
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；并且
[特异性结合实体]为特异性结合实体；
其中基团[磷酰基]或基团-PO4H2可以连接至[DIG]的任何位置。
52.根据权利要求51所述的缀合物，其中Q1为O，并且至少一个Q2为H。
53.根据权利要求52所述的缀合物，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
54.根据权利要求52所述的缀合物，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、l，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。
55.根据权利要求51所述的缀合物，其中两个Q2基团均为H。
56.根据权利要求55所述的缀合物，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
57.根据权利要求55所述的缀合物，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺或氨基基团。
58.根据权利要求55所述的缀合物，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
59.根据权利要求58所述的缀合物，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
60.根据权利要求59所述的缀合物，其中R8为O。
61.根据权利要求59所述的缀合物，其中R8为键。
62.根据权利要求61所述的缀合物，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
63.根据权利要求61所述的缀合物，其中Ra和Rb两者均为H。
64.根据权利要求62所述的缀合物，其中Z为键或-CH2-。
65.根据权利要求51所述的缀合物，其中R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
66.根据权利要求65所述的缀合物，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
67.根据权利要求65所述的缀合物，其中Z为键或-CH2-。
68.根据权利要求65所述的缀合物，其中两个Q2基团均为H。
69.根据权利要求68所述的缀合物，其中W2衍生自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
70.根据权利要求68所述的缀合物，其中W2衍生自二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺和氨基基团。
71.根据权利要求65所述的缀合物，其中Q1为O。
72.一种分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：
(f)使所述样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；
(g)使所述样品与根据权利要求45至50中任一项所述的笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物；
(h)将所述靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的所述笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；
(i)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；以及
(j)检测经标记的第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一检测试剂包含：(i)对靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物的去掩蔽的半抗原具有特异性的二抗，所述二抗缀合至第一酶，使得所述二抗用所述第一酶标记所述靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物；以及(ii)用于所述第一酶的第一底物。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一底物为显色底物或荧光底物。
75.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一检测试剂包括扩增组分，以用多个第一报告子部分标记所述靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的去掩蔽的酶。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述多个第一报告子部分为半抗原。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述第一检测试剂进一步包含对所述多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。
78.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；
(b)使所述样品与根据权利要求45至50中任一项所述的笼状半抗原-抗体缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物；
(c)将所述靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的所述笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；
(d)进行信号放大步骤，以用多个报告子部分标记所述靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；以及
(e)检测所述多个报告子部分。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述多个报告子部分为半抗原；并且其中所述方法进一步包括引入对所述多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述第二报告子部分为扩增酶并且其中所述方法进一步包括引入用于所述扩增酶的显色底物或荧光底物。
81.根据权利要求78所述的方法，其进一步包括检测所述样品中靶标的总量。
82.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与第一检测探针接触，所述第一检测探针包含根据权利要求45至50中任一项所述的笼状半抗原-抗体缀合物或去掩蔽酶-抗体缀合物中的一者；
(b)使所述样品与第二检测探针接触，所述第二检测探针包含根据权利要求45至50中任一项所述的笼状半抗原抗体缀合物或所述去掩蔽酶-抗体缀合物中的另一者；
(c)使所述样品与至少第一检测试剂接触，以标记所形成的去掩蔽的半抗原-抗体缀合物靶标复合物；以及
(d)检测来自经标记的去掩蔽的半抗原-抗体缀合物靶标复合物的信号。
83.根据权利要求82所述的方法，其进一步包括检测所述样品内靶标的总量的步骤。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述第一检测试剂包括扩增组分，以用多个第一报告子部分标记所述第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的去掩蔽酶。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述多个第一报告子部分为半抗原。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述第一检测试剂进一步包含对所述多个第一报告子部分具有特异性的二抗，每个二抗均缀合至第二报告子部分。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述第二报告子部分选自由扩增酶或荧光团组成的组。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述第二报告子部分为扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含用于所述扩增酶的第一显色底物或荧光底物。
89.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法进一步包括去笼步骤。
90.一种具有式(IIIA)的笼状半抗原：
其中
Q1为O或S；
Q2为H、-CH3或-CH2CH3；
R1为键，或为包含支链或非支链、取代或未取代、饱和或不饱和的脂肪族基团的基团，所述脂肪族基团具有介于1个与30个之间的碳原子，并且任选地包含选自由O、N或S组成的组的一个或多个杂原子；
R2为H或反应性官能团；
R3为H、-CH3、-CH2CH3、-OH或-O-Me；
R4为H、-CH3或-CH2CH3、-OH或-O-Me；
每个R5独立地为H、-CH3、-CH2CH3、卤素或-C(O)H；
R6为H或者直链或支链或者取代或未取代的C1-C6烷基基团；
m、n和o各自独立地为0或1至4范围内的整数；
p和q各自独立地为0或1至3范围内的整数；
s为1或2；并且
X和Y各自独立地为-CH2-、-C(R7)-、-N(H)-、-N(R7)-、-O-或-S-或-C(O)-，其中R7为C1-C4直链或支链、取代或未取代的烷基基团。
91.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIC)中所描绘的结构：
其中
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、C1或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
u和t各自独立地为0、1或2，前提是u+t为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
92.根据权利要求91所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
93.根据权利要求91所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
94.根据权利要求93所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
95.根据权利要求93所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
96.根据权利要求91所述的笼状半抗原，其中R2选自胺反应性基团、硫醇反应性基团和羰基反应性基团。
97.根据权利要求91所述的笼状半抗原，其中R2选自由以下项组成的组：二苯并环辛炔、反式环辛烯、炔烃、烯烃、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、硫醇、1，3-硝酮、醛、酮、肼、羟胺、氨基基团。
98.根据权利要求97所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
99.根据权利要求98所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
100.根据权利要求98所述的笼状半抗原，其中R8为O。
101.根据权利要求98所述的笼状半抗原，其中R8为键。
102.根据权利要求101所述的笼状半抗原，其中Ra或Rb中的至少一者为H。
103.根据权利要求101所述的笼状半抗原，其中Ra和Rb两者均为H。
104.根据权利要求103所述的笼状半抗原，其中Z为键或-CH2-。
105.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中R3、R4或R6中的至少一者为-CH3。
106.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中R3和R4中的至少一者为-CH3。
107.根据权利要求106所述的笼状半抗原，其中R6为H。
108.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中R2为H。
109.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中Y为-C(O)-。
110.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中R2为H并且Y为-C(O)-。
111.根据权利要求110所述的笼状半抗原，其中R1具有式(IIIA)中所描绘的结构：
其中
R8为键、-O-、-S-、-C(Rc)(Rd)-、-或-N(Rc)-；
Ra和Rb各自独立地为H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd各自独立地选自H或-CH3；
R9和R10各自独立地为键或为选自羰基、酰胺、酰亚胺、酯、醚、胺、硫酮、硫醇的基团；
每个Z独立地为键、-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-；
t和u各自独立地为0、1或2，前提是t+u为至少1；并且
v为1至8范围内的整数。
112.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中所述笼状半抗原具有式(IIB)：
113.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中所述笼状半抗原具有式(IIIC)：
114.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中所述笼状半抗原具有式(IIIE)：
115.根据权利要求90所述的笼状半抗原，其中所述笼状半抗原具有式(IIIF)：
116.一种缀合物，其包含根据权利要求90至115中任一项所述的笼状半抗原以及一抗。
117.根据权利要求116所述的缀合物，其中所述笼状半抗原间接地偶联至所述一抗。
118.根据权利要求117所述的缀合物，其中所述一抗为完整一抗。
119.一种分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与去掩蔽酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-去掩蔽酶-抗体缀合物复合物；
(b)使所述样品与根据权利要求116至118中任一项所述的笼状半抗原缀合物接触，以形成靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物；
(c)将所述靶标-笼状半抗原-抗体缀合物复合物的所述笼状半抗原去掩蔽，以形成靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；
(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；以及
(e)检测经标记的第一靶标-去掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述第一检测试剂包含：(i)对靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物的去掩蔽的半抗原具有特异性的二抗，所述二抗缀合至第-酶，使得所述二抗用所述第一酶标记所述靶标-去掩蔽的半抗原-抗体复合物；以及(ii)用于所述第一酶的第一底物。
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