JP6130438B2 - ピリミジンアナログを用いた色素原の沈着増強 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、２０１０年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／４６０，３４９号の利益を主張する。該仮出願の全開示は本出願の一部と見なされ、参照として組み込まれる。

（発明の分野）
本開示は、組織の標的分子の検出可能な部分の沈着を増加させるのに使用される、ピリミジンアナログを含む新規組成物に関する。

免疫組織化学（ＩＨＣ）及びインサイツハイブリダイゼーション分析（ＩＳＨ）を含む細胞染色法は、組織学的診断や組織形態学の研究に有益なツールである。ＩＨＣは、抗体などの特異的な結合剤や部分を用いて組織試料中に存在しうる目的の抗原を検出する。ＩＨＣは、特定の疾病状態や症状の診断などの臨床及び診断用途に広く使用されている。例えば、特定の種類の癌は、対象から得られた試料中の特定のマーカー分子の存在に基づき診断されうる。ＩＨＣはまた、基礎研究において様々な組織のバイオマーカーの分布や局在性を理解するのにも広く使用されている。生体試料はまた、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などまとめてＩＳＨと呼ばれるインサイツハイブリダイゼーション法により検査されうる。ＩＨＣはタンパク質を検出するが、ＩＳＨは組織中の核酸を検出するという点でＩＨＣと区別される。

組織や細胞学的試料のＩＨＣアッセイやＩＳＨアッセイなどのインサイツアッセイ、特にこのような試料のマルチプレックスアッセイでは、バックグラウンドの干渉なしに所望の結果を提供する方法を同定し開発することが非常に望ましい。このような方法は、特許取得の触媒作用によるリポーター堆積（ＣＡＲＤ）に基づくチラミドシグナル増殖法（ＴＳＡ）の使用を伴う。「触媒作用によるリポーター堆積の増強」と題される米国特許第６，５９３，１００号は、標識したフェノールコンジュゲートを酵素と反応させることにより、ＣＡＲＤ又はＴＳＡ法における酵素の触媒作用の増強を開示しており、反応は増強剤の存在下で実施される。

上述したような方法はアッセイで得られたシグナルを増強するために使用されているが、これらの方法の結果は、シグナル増幅が対応するバックグラウンドのシグナル増幅によって阻害されることを示している。従って、バックグラウンドシグナルが対応して増強することなく最適な結果を得られるシグナル増強に対する継続的なニーズがある。

本開示は、近位にマーカーを沈着させることにより試料中の標的を検出する方法に関し、該方法は、標的に対し特異性のある特異的結合部分を含む識別液を試料と接触させることと、特異的結合部分を酵素で標識することと、酵素基質を含むのでマーカーが式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分及び水素より選択され；Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２と結合して融合した芳香環系を形成してよく；Ｒ^５はヘテロ原子含有部分であり；Ａは炭素原子、イオウを除くヘテロ原子及びそれらの任意の組合せより選択され；ｎは１〜５である）を有する沈着エンハンサーの存在下で標的の近位に沈着する検出液と試料を接触させることと、マーカーを検出することを含む。この方法に関し、試料を検出液と接触させることは、酸化剤を用いて酵素基質を酵素的に酸化してマーカーを形成することを含みうる。開示の特定の実施態様では、酸化剤を用いて酵素基質を酵素的に酸化することは、酵素基質の可溶性又は安定性を低下させて酵素基質がマーカーとして沈着するようにすることを含む。

開示の特定の実施態様では、酵素基質は色素原及びチラミド-コンジュゲートからなる群より選択され、沈着エンハンサーは式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は水素及びヒドロキシルより選択され、各Ａは炭素原子である）を有しうる。開示の特定の実施態様では、Ｒ^１、Ｒ^３及びＲ^４は水素、Ｒ^２はヒドロキシルである。

沈着エンハンサーの他の例は、式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は独立してアルキル、アルケン、アルキン、水素、ヨード、臭素、塩素、フッ素及びそれらの組合せより選択される）を有するものを包含する。

開示の特定の実施態様は、酵素の使用に関し、酵素はオキシドレダクターゼ又はペルオキシダーゼでありうる。加えて、酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びマイクロオキシダーゼより選択されうる。開示の特異的結合部分は典型的には抗体又は核酸を有する。

開示の方法に関し、沈着エンハンサーの存在下で標的の近位にマーカーを沈着させることは、約５ｍＭから約１５ｍＭの濃度範囲の沈着エンハンサーを含む。

開示の特定の実施態様では、酵素基質は１,３-ジアミノベンジジン、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、テトラメチルベンジジン、フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン、ローダミン又はそれらの誘導体より選択されうる。より典型的には、酵素基質はチラミン誘導体である。

試料が検出液と接触する場合、典型的には０ｍＭより高い濃度から約８ｍＭの濃度範囲で酵素基質に曝露される。また、検出液はさらに、ヘテロアリール化合物、ボロン酸、フェノール化合物又はそれらの組合せより選択される促進剤を含みうる。ヘテロアリール化合物は、イミダゾール、Ｌ-ヒスチジン、ピリジンＮ-オキシド、ピリミジンＮ-オキシド、Ｎ-メチルモルホリンオキシド及び２,２,６,６-テトラメチルピペリジン-１-オキシルより選択されうる。また、検出液はさらに、式(Ｃ_２Ｈ_４Ｏ)_２３Ｃ_１２Ｈ_２５ＯＨを有するポリオキシエチレンラウリルエーテル；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノアルキレート、８から１４の炭素を有するモノアルキレート；式Ｃ_{１２-１４}Ｈ_{２５-２９}Ｏ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ]_ｘ（式中、ｘは２から１２の整数）を有する直鎖２級アルコールのポリオキシエチレン；及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルより選択される非イオン性の界面活性物質を含みうる。開示の特定の実施態様では、検出液はさらに、重硫酸ナトリウム、スズ酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム及びそれらの組合せより選択される抗酸化剤及び／又は式ＭＸ_２又はＭＸ（ここでＭはＩ族若しくはＩＩ族の金属リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム及びバリウムより選択され；Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボネート、水酸化物及びホスフェートより選択される）を有するＩ族若しくはＩＩ族の金属を含む塩を含みうる。

本開示ではまた、マーカーを近位に沈着させることにより試料の標的を検出するための組成物も意図し、該組成物は式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分及び水素より選択され；Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２に結合して融合した芳香環系を形成してよく；Ｒ^５はヘテロ原子含有部分であり；Ａは炭素原子、イオウを除くヘテロ原子及びそれらの任意の組合せより選択され；Ｎは１〜５である）を有する沈着エンハンサー及び酵素基質を含む。

開示の特定の実施態様では、沈着エンハンサーは、式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分及び水素より選択され；Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２に結合して融合した芳香環系を形成してよく；Ａはイオウを除くヘテロ原子、炭素原子及びそれらの組合せより選択される）を有する。典型的には、沈着エンハンサーは、約５ｍＭから約１５ｍＭの範囲の濃度を有してよく、酵素基質は約０ｍＭより高い濃度から約８ｍＭの範囲の濃度を有してよく、酵素基質は１,３-ジアミノベンジジン、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、テトラメチルベンジジン、フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン、ローダミン、チラミド又はそれらの誘導体より選択される。

開示の特定の実施態様では、組成物はさらにヘテロアリール化合物、ボロン酸、フェノール化合物又はそれらの組合せより選択される促進剤；Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ツイーン（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ及びＴｒｉｔｏｎ^ＴＭより選択される非イオン性界面活性剤；及び重硫酸ナトリウム、スズ酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム及びそれらの組合せより選択される抗酸化剤を含みうる。

沈着エンハンサー及び酵素基質を含む検出液を有するキットも開示され、沈着エンハンサーは、式

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分及び水素より選択され；Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２に結合して融合した芳香環系を形成してよく；Ｒ^５はヘテロ原子含有部分であり；Ａは炭素原子、イオウを除くヘテロ原子及びそれらの任意の組合せより選択され；Ｎは１〜５である）を有する。

特定の実施態様では、ヘテロアリール化合物は、式

及び／又は式

及び／又は式

を有し、式中Ｒ^８〜Ｒ^２２は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分、水素又はそれらの任意の組合せであり；Ｒ^２３は[Ｏ]^・又は[Ｏ]⁻であり；Ａは炭素原子、イオウ以外のヘテロ原子又はそれらの任意の組み合わせであり；Ｂは酸素、炭素又は窒素であり；ｍは０〜２である。ハロゲンは、ヨード、臭素、塩素又はフッ素から選択されてよく、ヘテロ原子含有部分はヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド、及びＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）から選択されうる。特定の実施態様では、Ｒ^１７とＲ^２１はそれぞれメチル基を有し、ｍは２である。例示的なヘテロアリール化合物としては、限定ではなく、イミダゾール、Ｌ-ヒスチジン、ピリジンＮ-オキシド、ピリミジンＮ-オキシド、Ｎ-メチルモルホリンオキシド及び２,２,６,６-テトラメチルピペリジン-１-オキシルが挙げられる。

特定の実施態様では、任意のエンハンサーは有機ボロン酸などのホウ素含有化合物である。例示的な有機ボロン酸としては、限定ではなく、ホウ酸が挙げられる。

特定の実施態様では、任意のエンハンサーは、式

を有するフェノール化合物であり、式中、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１は、水素、脂肪族、アリール、ヘテロ原子含有部分又はそれらの任意の組合せより独立して選択されうる。ヘテロ原子含有部分は、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド及びＮＲ^５Ｒ^６（ここでＲ^５及びＲ^６は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール及びそれらの任意の組合せである）である。特定の実施態様では、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１より選択される任意の２つの隣接基は、結合して融合した芳香又は非芳香環系を形成しうる。例示的なフェノール化合物としては、限定ではなく、ピロカテコールが挙げられる。

特定の実施態様では、本方法はさらに、試料中の標的に特異的結合部分−酵素コンジュゲートを固定すること；試料をチラミド−ハプテンコンジュゲートを含む溶液と接触させること；試料を増強液と接触させること；試料を酸化剤と接触させること；及びチラミド−ハプテンコンジュゲートを検出することで試料中の標的の局在を明らかにすること、を含みうる。特定の実施態様では、チラミド−ハプテンコンジュゲートの検出はさらに、沈着法又は蛍光法を用いて試料をチラミド−ハプテンコンジュゲートを識別し結合する能力のある抗ハプテン抗体及び検出されうる検出可能な部分と接触させることと、検出可能な部分を検出することを含む。特定の実施態様では、チラミド−ハプテンコンジュゲートは直接チアミンに結合するか又はリンカーを介して結合するハプテンを含む。典型的には、リンカーは脂肪族又はヘテロ脂肪族である。

本開示のここまでの記述並びに特徴及び利点は、添付の図面を参照しながらの以下の詳述により、さらに明白になろう。

標準的なｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットを用いての扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色を示すデジタル画像。 扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色用のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色液中塩基バッファーとして１０ｍＭイミダゾールの使用を示すデジタル画像。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合に４-アセチルアミドフェニルボロン酸がＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合にイミダゾールが西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合にＬ-ヒスチジンがＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合にホウ酸がＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合にピリミジンがＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに添加された場合に２-ヒドロキシピリミジンがＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに順次添加された場合に潜在的なエンハンサーがＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 １０ｍＭのイミダゾールベースのＤＡＢ色素原液を用いてのｂｃｌ２（扁桃）組織のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ染色のデジタル画像。 １０ｍＭのＬ-ヒスチジンベースのＤＡＢ色素原液を用いてのｂｃｌ２組織のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ染色のデジタル画像。 １０ｍＭのＬ-ヒスチジンベースのＤＡＢ色素原液中１０ｍＭピリミジン-Ｎ-オキシドを用いてのｂｃｌ２組織のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ染色のデジタル画像。 １０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンのＤＡＢ色素原液中１０ｍＭピリミジンＮ-オキシドを用いてのｂｃｌ２組織のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ染色のデジタル画像。 ＤＡＢ「増強液」を用いる又は用いない標準的なＶＭＳＩ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットを用いての扁桃組織のＢＣＬ２のＩＨＣ染色のデジタル画像：ＤＡＢ増強液：図１４：なし；図１５：１００ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのホウ酸；図１６：５０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１０ｍＭのピリミジン；図１７：１０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸。シグナル／バックグラウンドの病理学的スコア：図１４：３．７５／０．５；図１５：４．０／０．７５；図１６：４＋／０．５；図１７：４／０．５。 １０ｍＭのピリミジンと併用した場合にイミダゾール及びＬ-ヒスチジンＤＡＢ色素原液がＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 １０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジン、１０ｍＭのホウ酸及び１０ｍＭの塩化カルシウムと併用した場合にイミダゾール及びＬ-ヒスチジンＤＡＢ色素原液がＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 ５０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭの塩化カルシウム及び１０ｍＭのホウ酸と併用した場合にエンハンサーがＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響を示すグラフである。酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。 図２１：ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットを用いたＨＥＲ-２陽性ＣａＬｕ３癌細胞株のＨＥＲ-２スリーインワンマウス異種移植片のＨＥＲ-２プローブのＤＡＢ ＩＳＨ染色のデジタル画像。図２２：ＤＡＢ色素原液と１０ｍＭのＬ-ヒスチジン増強を用いたＨＥＲ-２陽性ＣａＬｕ３癌細胞株のＨＥＲ-２スリーインワンマウス異種移植片のＨＥＲ-２プローブのＤＡＢ ＩＳＨ染色のデジタル画像。 チラミドとＤＡＢ両方の沈着のＨＲＰ酸化増強を用いた又は用いないチラミド増幅システムを使用しての扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色のデジタル画像。図２３：チラミドとＤＡＢの沈着増強なし；図２４：チラミド沈着の増強なし、ＤＡＢの沈着増強あり；図２５：チラミド沈着の増強あり、ＤＡＢの沈着増強なし；図２６：チラミド沈着及びＤＡＢの沈着増強あり。 １０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンを用いた、チラミド沈着にチラミド増幅システムを使用しての扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色のデジタル画像。 ＨＲＰ酸化の増強を用いない、扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色のデジタル画像。 １８ｓリボプローブを用いたＣａＬｕ-３異種移植片組織の１８ｓリボソームのＩＳＨ染色のデジタル画像。図２９：１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン及び１０ｍＭのＬ-ヒスチジンの両方を用いてのＤＡＢ増強あり；図３０：増強なし。 ハプテン化ＨＰＶプローブを用いたＣａＳｋｉ異種移植片組織のＨＰＶのＩＣＨ染色のデジタル画像。図３１：１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン及び１０ｍＭのＬ-ヒスチジンの両方を用いてのＤＡＢ増強あり；図３２：増強なし。 ハプテン化ＨＰＶプローブを用いたＨｅＬａ異種移植片組織のＨＰＶのＩＨＣ染色のデジタル画像。図３３：１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン及び１０ｍＭのＬ-ヒスチジンの両方を用いてのＤＡＢ増強あり；図３４：増強なし。 ハプテン化ＨＰＶプローブを用いたＣ３３異種移植片組織のＨＰＶのＩＨＣ染色のデジタル画像。図３５：１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン及び１０ｍＭのＬ-ヒスチジンの両方を用いてのＤＡＢ増強あり；図３６：増強なし。 抗ＣＤ２０プローブを用いた扁桃組織のＣＤ２０のＩＨＣ染色のデジタル画像。図３７：１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン及び１０ｍＭのＬ-ヒスチジンの両方を用いてのＤＡＢ増強あり；図３８：増強なし。 抗ＣＤ２０プローブを用いた扁桃組織のＣＤ２０のＩＨＣ染色のデジタル画像。図３９：５０ｍＭのＬ-ヒスチジン及び１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンの両方を用いてＡＥＣ沈着を増強；図４０：増強なし。 抗Ｋｉ６７プローブを用いた扁桃組織のＫｉ６７のＩＨＣ染色のデジタル画像。図４１：５０ｍＭのＬ-ヒスチジン及び１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンを用いてＡＥＣ沈着を増強；図４２：増強なし。 チラミドとＤＡＢ両方の沈着用にＨＲＰ酸化増強を用いた又は用いないチラミド増幅システムを使用した扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色のデジタル画像。図４３：チラミド又はＤＡＢの増強なし；図４４：チラミド沈着の増強なし、ＤＡＢ沈着を増強。 チラミドとＤＡＢ両方の沈着用にＨＲＰ酸化増強を用いた又は用いないチラミド増幅システムを使用した扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色のデジタル画像。図４５：チラミド沈着増強あり、ＤＡＢ沈着の増強なし；図４６：チラミドとＤＡＢの沈着増強。

発明の詳細な説明

Ｉ．序
癌などの疾患は多様な方法で診断されうる。一つには、組織や細胞内の癌バイオマーカーなどの特定の種類の癌と相関がある又は相関があると考えられるバイオマーカーの存在を同定する方法がある。免疫組織化学が特定の癌の種類と関連づけられるタンパク質バイオマーカーを標的化するのにしばしば使用される一方で、インサイツハイブリダイゼーション法は特定の癌の種類と関連づけられる核酸配列を標的化するのにしばしば使用される。

標的を同定する免疫組織化学法及びインサイツハイブリダイゼーション法は、研究用途や、医師らの例えば診断及び／又は予後判定などの目的で、重要性が増している。しかし、これらの方法は、タンパク質及び／又は核酸標的分子などの組織試料に存在するか又は存在すると考えられる標的分子と相互作用するか又はその上に沈着した検出部分により放射される検出可能シグナルによって制限されうる。理論上は、得られるシグナルを増加する一方法として、標的分子上の検出可能な部分を例えば沈着速度の増加により増やすことで、短時間で増強シグナルが得られる。

本明細書で開示のとおり、新規ＤＡＢ色素原製剤は、ＩＨＣ又はＩＳＨ組織染色の間協働作用して最大限のＤＡＢ沈着を提供する。新規ＤＡＢ色素原製剤は、バッファー塩として有機エンハンサーを様々な有機／無機エンハンサー及び界面活性剤と組み合わせて利用し、これらが協働してＤＡＢ沈着を最大化しシグナルを増強する。また、本明細書では、ＩＨＣ及び／又はＩＳＨ組織染色を増強するために開示の製剤を使用する方法も開示する。

本明細書に開示の方法は診断に利用でき、本開示の方法によりもたらされた結果は診断のみならず、臨床的背景での最適な治療の決定や、このような治療の進行や成功の追跡にも使用される。

ＩＩ．用語
特に断りがなければ、専門用語は一般的な用法に準じて使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊, 2000; Kendrew ら（編）, The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊, 1994); Robert A. Meyers（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc. 刊, 1995; 及び George P. Redei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2版, 2003に見られる。

単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈内で特に明記しないかぎりは１または複数を意味する。例えば、「comprising a cell（細胞を有する）」という語は１個又は複数個の細胞を包含し、「少なくとも１個の細胞を有する」と同等とみなされる。「又は」という用語は、文脈内で特に明記しないかぎりは記載の代替要素又は２つ以上の要素の組合せのうちの１要素を意味する。波線（「

」）は結合の切断を示すのに使用され、破線（「---」）は結合が特定の位置で形成されうることを示すのに使用される。

本明細書に開示のものに類似または同等の方法や材料は、開示の技術を実施又は試験するのに使用されうるが、適切な方法及び材料を以下に記述する。材料、方法及び例は単なる例示であって、限定を意図するものではない。

以下の用語や方法の説明は、本開示をより良く記述するため並びに当業者が本開示を実施する手引きとして提供される。

脂肪族：アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル及びシクロアルキル基を含む部分。「低級脂肪族」基とは、炭素原子数１から１０の分岐又は非分岐脂肪族基である。この用語は、置換脂肪族化合物、飽和脂肪族化合物及び不飽和脂肪族化合物を包含する。

アルキル：炭素原子数１から２４の分岐又は非分岐飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｔ-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。「低級アルキル」基は、炭素原子数は１から１０の飽和の分岐又は非分岐炭化水素である。「ハロゲン化アルキル」又は「ハロアルキル基」とは、上記定義のアルキル基に存在する１または複数の水素原子がハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたものを意味する。「シクロアルキル」という用語は、少なくとも３個の炭素原子からなる非芳香族の炭素ベースの環を意味する。シクロアルキルの例としては、限定ではなく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。

「ヘテロシクロアルキル基」という用語は、環の炭素原子のうち少なくとも１個が、限定ではなく窒素、酸素、イオウ又はリンなどのヘテロ原子で置換されたシクロアルキル基である。「置換アルキル」などの任意の置換基は、アルコキシ、任意の置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、アリール、カルボキシアルキル、任意の置換シクロアルキル、任意のシクロアルケニル、任意の置換ヘテロアリール、任意の置換ヘテロシクリル、ヒドロキシ、チオール及びチオアルコキシから選択される、１〜５の置換基、典型的には１〜３の置換基を有するアルキル基などの基を記述する。

増幅：増幅とは、シグナルを強化する行為又は結果を意味する。増幅はシグナルの振幅の増加及び／又はバックグラウンドに対するシグナルの増加、例えばシグナル対ノイズの比率の増加でありうる。

抗体：まとめて免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子（限定ではなく例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、それらの組合せ、並びに、任意の的対動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギ及びマウスなどの哺乳動物の免疫反応の間に産生される類似の分子）及び目的とする分子（又は目的とする分子に酷似した分子群）に特異的に結合し、他の分子との結合は実質的に排除する抗体断片（例えば、生体試料中の他の分子に対する結合定数よりも目的とする分子に対する結合定数が少なくとも１０^３Ｍ^−１、少なくとも１０^４Ｍ^−１又は少なくとも１０^５Ｍ^−１大きい抗体及び抗体断片）を意味する。

より具体的には、「抗体」とは、抗原のエピトープを特異的に識別し結合する、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を有するポリペプチドのリガンドを意味する。抗体は、重鎖と軽鎖からなり、それぞれ、重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域、軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。Ｖ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域は、抗体により識別された抗原の結合を共に担う。

抗体は、当分野で公知のインタクトな免疫グロブリン並びにそのバリアント及び部分を包含する。抗体断片としては、タンパク質分解抗体断片［Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦａｂ断片など当分野で既知のものなど］、組換え抗体断片（ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二特異性ｓＦｖ断片、二特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ及びトリアボディ（当分野で既知のとおり）、並びにラクダ科の抗体が挙げられる（例えば米国特許第6,015,695号、6,005,079号、5,874,541号、5,840,526号、5,800,988号及び5,759,808号を参照）。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーにより結合した融合タンパク質であり、ｄｓＦｖｓでは、鎖は変異してジスルフィド結合を導入し、鎖の結合を安定化させている。この用語はまた、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二特異性抗体など）などの遺伝子操作された形態も包含する。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 第3版., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照されたい。

典型的には、天然の免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で相互に連結した重鎖と軽鎖を有する。軽鎖にはラムダとカッパの２種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な鎖クラス（又はアイソタイプ）としてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。

重鎖も軽鎖もそれぞれ定常領域と可変領域を有し、これらの領域は「ドメイン」としても知られる。重鎖と軽鎖の可変領域は共に抗原に特異的に結合する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域に遮断される「フレームワーク」領域を有する。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲が定義されている（Kabat ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。Kabatのデータベースは、現在はインターネット上で保持されている。異なる軽鎖や重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち抗体を構成する軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の組合せ部は、ＣＤＲを三次元スペースで位置決めし整列させる働きがある。

ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主として担う。各鎖のＣＤＲは典型的にはＮ末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と番号が付けられ、また、典型的には特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、Ｖ_ＨＣＤＲ３はこれが出現する抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、Ｖ_ＬＣＤＲ１はこれが出現する抗体の軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ１である。

抗原：免疫応答を刺激する分子。抗原は通常はタンパク質又は多糖類である。エピトープは化学基又はペプチド配列からなる分子上の抗原決定基であり、特異的な免疫応答を誘発する。抗体は特定の抗原又はエピトープを結合する。抗体が特定の抗原又はエピトープに結合することは、例えば生体試料の中又は上の抗原の位置を突き止めたり、特定の抗原が生体試料中に存在するかを決定するのに使用されうる。目的とする抗原とは、試験試料中でその抗原を検出するようＩＨＣアッセイが設計される抗原である。例えば、目的とする抗原を検出するために、ＩＨＣアッセイで使用される一次抗体は、目的とする抗原に特異的に結合する。

エピトープとは、標的分子（例えばタンパク質や核酸分子などの抗原）上の部位であって、抗原結合分子（例えば抗体、抗体断片、抗体結合領域を含むスカフォルドタンパク質又はアプタマー）が結合する。エピトープは、標的分子（例えばタンパク質−タンパク質界面）の連続した又は並列し連続していない残基（例えばアミノ酸又はヌクレオチド）のどちらでも形成されうる。連続した残基で形成されるエピトープ（例えばアミノ酸又はヌクレオチド）は典型的には変性液に曝露しても保持されるが、３次折りたたみで形成されたエピトープは典型的には変性液での処置で欠失する。エピトープは典型的には少なくとも３の、通常は少なくとも５又は８ １０残基（例えばアミノ酸又はヌクレオチド）を含む。典型的には、エピトープはまた、２０残基未満（例えばアミノ酸又はヌクレオチド）の長さ、例えば１５残基未満又は１２残基未満である。

芳香族：不飽和結合、孤立対又は空の軌道を有する結合環を記述する用語であり、結合のみの安定化に予想されるよりも強い安定化を呈する。また、環の非局在化及び共鳴の現れとも考えられる。

アリール：実質的に炭化水素ベースの芳香族化合物又はそのラジカル（例えばＣ_６Ｈ_５）が置換基として別の基に結合したもので、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、アントラセンなどに例示される環構造を有する。この用語は置換アリール化合物も包含する。

アリールアルキル：化合物又はそのラジカル（トルエンではＣ_７Ｈ_７）が置換基として別の基、特に他の有機基に結合したもので、脂肪族と芳香族両方の構造を有する。

結合又は安定な結合：特異的な結合剤又は部分（例えば抗体）と抗原との結合などの、２つの物質又は分子間の結合。

結合親和性：特異的結合対の一方のメンバーの他方のメンバーに対する傾向などの、ある分子が別の分子と（典型的には非共有）結合する傾向。結合親和性は結合定数として計測可能であり、特異的な結合対（抗体／抗原対又は核酸プローブ／核酸配列対）の結合親和性は少なくとも１×１０^５Ｍ^−１、例えば少なくとも１×１０^６Ｍ^−１、少なくとも１×１０^７Ｍ^−１又は少なくとも１×１０^８Ｍ^−１でありうる。一実施態様では、結合親和性をFrankel ら, Mol. Immunol., 16:101-106, 1979に記載の改訂スキャッチャード法により計算する。別の実施態様では、結合親和性を抗原／抗体解離速度により測定する。さらに別の実施態様では、高結合親和性を競合放射免疫測定法により測定する。いくつかの例では、抗原／抗体対の抗結合親和性は、少なくとも約１×１０^８Ｍ^−１である。別の実施態様では、抗結合親和性は、少なくとも約１．５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約２．０×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約２．５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約３．０×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約３．５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約４．０×１０^８Ｍ^−１、少なくとも約４．５×１０^８Ｍ^−１又は少なくとも約５．０×１０^８Ｍ^−１である。

色素原：顔料や色素などの着色産物に転換しうる物質。特定の色素原は、電子供与体であり、酸化されると着色産物になる。色素原が着色産物を生産し、化学的転換後は不溶性になる特性は、ＩＨＣにとって有用である。発色性化合物の特定の例として、限定ではなく、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２,２’-アジノ-ジ-[３-エチルベンゾチアゾリンスルホネート]（ＡＢＴＳ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー及びテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。

ＤＡＢは、アルコールや他の有機溶媒中で高不溶性の茶色い最終産物を生産する色素原である。いくつかの例では、ＤＡＢはＨＲＰなどの酵素の基質である。

検出の十分条件：所望の活性を許容する任意の環境、例えば、プローブが標的と結合でき、検出される相互作用が可能な環境。例えば、このような条件としては適切な温度、緩衝液並びに顕微鏡やデジタル画像処理機器などの検出手段が挙げられる。

接触させること：２つ以上の部分の結合を可能にする配置、特に、例えば固体及び／又は液体の両形態での直接的物理的結合（例えば、スライドに接着させた生体試料などの生体試料を、本明細書に開示の組成物を含む溶液などの組成物と接触するように配置）。

コントロール：試料または試験の妥当性を評価するために行う手順。一例では、コントロールはポジティブコントロールなどの質コントロールである。例えば、ポジティブコントロールは、手順又は組織や細胞などの試料であって、実際の試験試料と類似しているが、以前の経験から正の結果を得られることがわかっている。ポジティブコントロールは、実際のどの試験試料も正の結果が得られなくても、試験の基本的条件で正の結果が得られることを確認する。特定の例では、ポジティブコントロールは、疑わしい抗原を含んでいることが以前の試験からわかっている。

他の例では、コントロールはネガティブコントロールである。ネガティブコントロールは、負の結果が得られることが以前の経験からわかっている手順又は試験試料である。ネガティブコントロールは、試験が測定可能な正の結果を示さない場合に得られるベースライン結果を示し、しばしばネガティブコントロールの値は、試験試料の結果から引かれる「バックグラウンド」値として扱われる。特定の例では、ネガティブコントロールは特定の一次抗体を含まない試薬である。他の例にはキャリブレーターコントロール、すなわちコントロール抗原を既知の量で含む試料を含む。このようなキャリブレーターコントロールは期待シグナル強度を有するので、インター又はイントラの染色のばらつきを補正するのに使用されうる。

結合（コンジュゲート）：結合（典型的には共有又はイオン結合）により連結している２つの独立した分子を含む分子。いくつかの例では、特異的な結合剤又は部分は、基質に作用する酵素と結合して検出可能な部分又は標識を生産する。

コンジュゲートする、連結する、結合する又はリンクする：ある分子を別の分子に連結して大分子を作ること。例えば、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にする、又はハプテンや他の分子を共有結合的にｓｃＦｖ抗体などのポリペプチドに付着させるなど。化学的又は組換え手段のいずれかにより連結がなされうる。「化学的手段」とは、抗体部分とエフェクター分子の間の反応を意味し、２つの分子の間に共有結合が形成されて１つの分子を形成する。

「カップルされる」という用語は、直接又は間接的に結合されることを意味する。第１の原子又は分子は、直接又は間接的に第２の原子又は分子にカップルされる。二次抗体は間接的カップリングの一例を提供する。間接的カップリングの具体例は、マウス−ウサギＩｇＧ抗体により結合されたウサギの抗ハプテン一次抗体であり、次に検出可能な標識に共有結合的に連結したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により結合される。

誘導体：化学では、誘導体とは、類似の化合物から誘導される化合物、又は、例えばある原子が別の原子若しくは原子の基で置き換えられた場合に別の化合物から生じると考えられる化合物である。後者の定義は有機化学では一般的である。生化学では、この用語は、少なくとも理論的には前駆化合物から形成されうる化合物に使用される。

検出可能な標識：組織試料などの試料中の標的分子などの標的の存在及び／又は濃度を示す、検出可能（視覚的、電子的など）なシグナルを生産できる分子又は材料。特異的結合分子に結合すると、検出可能な標識は、特異的結合分子が向かう標的の位置を突き止め及び／又は定量化するのに使用される。これによって、試料中の標的の存在及び／又は濃度は検出可能な標識に生産されたシグナルを検出することで検出されうる。検出可能な標識は、直接又は間接的に検出することができ、異なる特異的結合分子に結合された複数の異なる検出可能な標識は、組み合わせて１または複数の標的を検出するのに使用されうる。例えば、第１の検出可能な標識、例えば標的に特異的に結合する抗体に結合したハプテンなどは、第１の検出可能な標識に特異的に結合する分子に結合した第２の検出可能な標識を使用して検出されうる。別々に検出されうる複数の検出可能な標識は、異なる特異的結合分子と結合し、試料中の複数の標的を検出するマルチプレックスアッセイを提供しうる。

検出可能な標識は、着色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、ある物質を別の物質に転換し検出可能な差異を（無色の物質を着色物質に転換するか又はその逆、沈殿を生じさせる、又は試料の濁度増加などにより）提供する触媒（酵素など）、検出可能に標識された抗体コンジュゲートを追加使用しての抗体−ハプテン結合を通じて検出されうるハプテン、及び常磁性及び磁性分子又は材料を包含する。検出可能な標識の特定の例として、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ又はβ-グルクロニダーゼなどの酵素；フルオロフォア（蛍光分子の他の多くの例がThe Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, ORに見られる）；量子ドットなどのナノ粒子（例えば米国特許第6,815,064号、6,682596号及び6,649,138号）；Ｇｄ^３＋のような放射性又は常磁性金属イオンなどのＤＯＴＡやＤＰＴＡキレート金属キレート；色素原；及び例えばリポソームを含む捕捉蛍光分子などのリポソームが挙げられる。

検出可能な標識が酵素を含む場合、色素原、蛍光発生化合物又は発光化合物などの検出可能な基質を酵素と組み合わせて使用して、検出可能なシグナルを生成する（このような化合物は、例えばカリフォルニア州カールスバッドのLife Technologies社などから様々な種類が市販されている）。

あるいは、酵素は金属組織学的検出スキームにおいて使用されうる。金属組織学的検出法は、酵素と水溶性金属イオン及び酵素のレドックス不活性基質と併用することを含む。基質は酵素によりレドックス活性剤に転換され、レドックス活性剤は金属イオンを減じ、検出可能な沈殿物を形成させる（例えば2004年12月20日に出願された同時係属の米国特許出願第11/015,646号、ＰＣＴ公開番号第2005/003777号及び米国出願公開第2004/0265922号を参照のこと）。金属組織学的検出法は、オキシドレダクターゼ酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）を水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤とともに使用して、検出可能な沈殿物を再度形成することを含む。（例えば米国特許第6,670,113号を参照のこと）。

洗剤又は界面活性剤：水の表面張力を減ずる物質。特に、洗剤又は界面活性剤は表面活性剤又は界面活性剤であり、油−水界面に集中して乳化作用を及ぼす。洗剤は、化学作用の態様によりアニオン性、カチオン性又は非イオン性に分類される。非イオン性洗剤は、水素結合のメカニズムを介して機能する。さらに、界面活性剤又は洗剤は、２つの液体の間の表面張力を減ずる。界面活性剤分子は典型的には極性又はイオン性の「頭部」と非極性の炭化水素「尾部」を有する。水に溶けると、界面活性剤分子は凝集してミセルを形成し、ここで非極性の尾部は内側を向き、極性又はイオン性の頭部は外側の水性環境に向いている。非極性の尾部はミセルの中で非極性の「ポケット」を作る。溶液中の非極性化合物は、界面活性剤分子により形成されたポケット内に隔離されるので、非極性化合物は水溶液中に混合されたままである。

検出：（シグナル又は特定の抗原、タンパク質又は核酸などの）因子（agent）の例えば試料中の存在・不存在を決定すること。いくつかの例では、これはさらに、定量化及び／又は局在性、例えば細胞や特定の細胞コンパートメント内での局在性を含みうる。「検出する」とは、標的分子が生体試料中に存在するかどうか決定するなどの、何かが存在するか存在しないかを決定する任意の方法を意味する。例えば、「検出する」とは、視覚的又は機械的装置を用いて試料が具体的な特徴を示すか決定することを含みうる。特定の例では、検出は、標的に結合したプローブを視覚的に観察すること、又はプローブが標的に結合していないことを視覚的に観察することを意味する。例えば、光顕微鏡や他の顕微鏡手段は、ここに記載の方法で色素原の沈殿を検出するのに一般的に使用される。

電磁放射：電磁場強度の同時周期的変動により伝搬される、電波、赤外、可視光、紫外線、Ｘ線及びガンマ線を含む一連の電磁波。特定の例では、電磁放射は、単色性、方向性、コヒーレンス、極性及び強度の特性をもつレーザーにより放射される。

放射又は放射シグナル：源から生じる特定の波長の光。特定の例では、放射シグナルは、フルオロフォアが励起波長で光を吸収した後フルオロフォアから放射される。

増強（増強、エンハンサー、増強する）：エンハンサー又は増強剤は、任意の化合物又は化合物の任意の組合せであり、このような化合物を有さない酵素活性と比較して、酵素の触媒活性が十分に増加する。エンハンサー又は増強剤はまた、活性コンジュゲートが受容体部位に結合する速度を増加又は加速する化合物又は化合物の組合せ、とも定義されうる。増強（増強、エンハンサー、増強する）は酵素の触媒活性が、このようなエンハンサーを含まないプロセスと比べて増加されるプロセスである。増強（増強、エンハンサー、増強する）はまた、活性コンジュゲートが受容体部位に結合する速度の増加又は加速とも定義されうる。増強（増強、エンハンサー、増強する）はまた、病理学者が点数化するなどにより、視覚的に測定されうる。特定の実施態様では、点数は０より大きい数値から４より大きい数値の範囲であり、数字が大きいことは、視覚的検出が良好であることを意味する。より典型的には、点数は０より大きい数値から約４＋＋まで、例えば１、１．５、２、２．５、３、３．５、３．７５、４、４＋及び４＋＋の範囲である。加えて、増強（増強、エンハンサー、増強する）は、酵素の見かけＶ_ｍａｘを決定することで測定されうる。特定の実施態様では、この用語は、０ｍＯＤ／ｍｉｎより大きい値から約４００ｍＯＤ／ｍｉｎ、例えば約１５ｍＯＤ／ｍｉｎ、１８ｍＯＤ／ｍｉｎ、約２０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約４０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約６０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約８０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１００ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１２０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１４０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１６０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約２００ｍＯＤ／ｍｉｎ、約２５０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約３００ｍＯＤ／ｍｉｎ、約３５０ｍＯＤ／ｍｉｎ及び約４００ｍＯＤ／ｍｉｎの範囲の見かけＶ_ｍａｘ値（光学密度／分として測定）を包含する。より典型的には、Ｖ_ｍａｘの範囲は０ｍＯＤ／ｍｉｎより大きい値から約１６０ｍＯＤ／ｍｉｎ、例えば約２０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約４０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約６０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約８０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１００ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１２０ｍＯＤ／ｍｉｎ、約１４０ｍＯＤ／ｍｉｎ及び約１６０ｍＯＤ／ｍｉｎである。加えて、増強は、０ｍＭより大きいエンハンサーの任意の濃縮を用いて行ってよい。典型的には、増強は、０ｍＭより大きいエンハンサー濃度から約１００ｍＭまで；さらに典型的には、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１０ｍＭ、約０．２０ｍＭ、約０．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約２０．０ｍＭ、約３０．０ｍＭ、約４０．０ｍＭ、約５０．０ｍＭ、約７５．０ｍＭ又は約１００．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭから約０．１０ｍＭ、約０．０５ｍＭから約０．５０ｍＭ、約０．４ｍＭから約１．０ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭ、約５．０ｍＭから約５０．０ｍＭ及び約２０．０ｍＭから約１００．０ｍＭの範囲で行われる。

励起又は励起シグナル：高レベルのエネルギーで電子の転移を励起するのに必要及び／又は十分な特定の波長の光。特定の例では、励起は、フルオロフォアをある状態まで励起するのに必要及び／又は十分な特定の波長の光であり、フルオロフォアは、励起シグナルの波長の光と異なる（例えば長い）波長の光を放射する。

固定：細胞や組織の成分をなるべく生体の状態に近い状態で保存し、変性なしで調整手順に供するプロセス。固定は、細胞死の後に始まる自己融解と細菌分解のプロセスを阻止し、細胞及び組織の成分を安定化させて、ＩＨＣなどの次の段階の組織プロセシングに耐えられるようにする。

組織は、アルデヒド（ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）などの固定液を用いての灌流や固定液浸のいずれかで固定される。他の固定液としては、酸化剤（例えば四酸化オスミウムやクロム酸などの金属イオンや錯体）、タンパク質変性剤（例えば酢酸、メタノール及びエタノール）、機構が未解明の固定液（例えば昇汞、アセトン及びピクリン酸）、併用剤（例えばカルノア固定液、メタカーン、ブアン固定液、Ｂ５固定液、ロスマン固定液及びGendre固定液）、電子レンジ及びその他（例えば除体積固定や蒸気固定）が挙げられる。洗剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛やリチウム塩など）及びランタンなどの添加剤も固定液に含まれうる。

ＩＨＣの試料を調整するのに最も一般的に使用される固定液は、ホルムアルデヒドであり、通常はホルマリン液の形態である（緩衝液中４％ホルムアルデヒド、１０％緩衝ホルマリンと呼ばれる）。

蛍光：冷光の一種で、原子又は分子がエネルギーを吸収した後、高い電子状態から低い電子状態に移行するとき可視光を放射する。「蛍光」という用語は、エネルギーの吸収と放射の時間間隔が非常に短い現象に限定される。

蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：ＦＩＳＨは、染色体の特定のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの存在又は不存在を検出し局在化するのに使用される技法である。ＦＩＳＨは、規定の反応条件下で、染色体のなかでも高い配列類似性のある部分のみに結合する蛍光的に標識されたプローブを使用する。ＦＩＳＨはまた、組織試料の特定のｍＲＮＡ配列を検出するのにも使用されうる。

フルオロフォア：規定の光の波長などの特定の刺激に曝露されると励起し、例えば異なる波長（光の長波など）で光を放射する（蛍光を発する）化学的化合物。

フルオロフォアは、発光化合物の大きいクラスの一部である。発光化合物としては化学発光分子が挙げられるが、これは発光するのに特定の光の波長を必要とせず、化学的なエネルギー源を使用する。従って、（エクオリンなどの）化学発光分子を使用すると、レーザーなどの外部の電磁放射源の必要性が排除される。

ここで開示される、プローブで使用可能な特定のフルオロフォアは、Nazarenko らに許与された米国特許第５，８６６，３６６号に記載されており、例えば４-アセトアミド-４’-イソチオシアナトスチルベン-２,２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５-(２’-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸（EDANS）、４-アミノ-Ｎ-[３-ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-３,５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ-(４-アニリノ-１-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン（AMC, クマリン 120）、７-アミノ-４-トリフルオロメチルクルアリン（7-amino-4-trifluoromethylcouluarin）（クマラン151）；シアノシン；４’,６-ジアミニジノ-２-フェニルインドール（DAPI）；５’,５”-ジブロモプロガロール-スルホンフタレイン（ブロモピルガロールレッド）；７-ジエチルアミノ-３-(４’-イソチオシアナトフェニル)-４-メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタ酢酸；４,４’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-２,２’-ジスルホン酸；４,４’-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２’-ジスルホン酸；５-[ジメチルアミノ]ナフタレン-１-スルホニルクロリド（DNS, ダンシルクロリド）；４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４’-イソチオシアネート（DABITC）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５-カルボキシフルオレセイン（FAM）、５-(４,６-ジクロロトリアジン-２-イル）アミノフルオレセイン（DTAF）、２’７’-ジメトキシ-４’５’-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（JOE）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）及びＱＦＩＴＣ（XRITC）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４-メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザリニン；フェノールレッド；Ｂ-フィコエリトリン；Ｏ-フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及びサクシニミジル１-ピレンブチレート；リアクティブレッド４（CIBACRON^TMブリリアントレッド 3B-A）；ローダミン及び誘導体、例えば６-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、６-カルボキシローダミン（R6G）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Rhod）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトラメチル-６-カルボキシローダミン（TAMRA）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体；ライトサイクラーレッド６４０；Ｃｙ５．５；及びＣｙ５である。

ハプテン：分子、典型的には小分子であり、抗体と特異的に結合できるが、典型的には担体分子との組合せでなければ免疫原生となりえない。ハプテンの例としては、限定ではなく、フルオレセイン、ビオチン、限定ではなくジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含むニトロアリール、ジオキシゲニン、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラン、トリペルペン（triperpene）、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン及びシクロリグナンが挙げられる。

ヘテロ二官能性：多くの基に対し反応性を有する、限定ではなくスルフヒドリルやアミンなどを含む少なくとも２つの異なる反応基を各端部に含み、２つ以上の分子の間、例えば特定の結合剤又は部分（抗体など）と酵素（ＨＲＰなど）の間に化学的共有結合を形成する架橋剤。

ハイブリダイゼーション：ＤＮＡやＲＮＡの相補領域の間や、ＤＮＡとＲＮＡの間に塩基対を形成することで、二重分子を形成すること。特定のストリンジェンシー度となるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の特性や、ハイブリダイズする核酸配列の構成と長さによる。一般に、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（Ｎａ^＋の濃度など）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定のストリンジェンシー度を得るためのハイブリダイゼーション条件に関する計算がSambrook ら, (1989) Molecular Cloning, ２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY（９章及び１１章）で考察されている。

免疫組織化学（ＩＨＣ）：抗原と、抗体などの特異的結合剤又は部分との相互作用を検出することで、試料中の抗原の存在や分布を決定する方法。抗原（標的抗原など）を含む試料を、抗体抗原結合を可能にする条件下で抗体とインキュベートする。抗体抗原結合は、抗体に結合した検出可能な標識によって（直接的検出）、又は、一次抗体に対して産生した二次抗体に結合した検出可能な標識によって（例えば間接的検出）検出されうる。検出可能な標識としては、限定ではなく、放射性同位体、蛍光色素（フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート及びローダミン）、酵素及び色素原分子が挙げられる。

インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）：ハイブリダイゼーションの一種であり、標識した相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖（すなわちプローブ）を使用して、組織の一部または切片における（インサイツ）又は組織が十分に小さい場合（例えば植物の種やショウジョウバエの胚）は組織全体における（ホールマウントＩＳＨ）特定のＤＮＡ又はＲＮＡの局在を明らかにする。これは、組織切片中のタンパク質の局在を明らかにする免疫組織化学とは区別される。ＤＮＡ ＩＳＨは、医学的に染色体の完全性を診断するなど、染色体構造の決定に使用されうる。ＲＮＡ ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学）は、組織切片やホールマウント中のｍＲＮＡや他の転写産物を測定し局在を明らかにするのに使用される。

ハイブリダイゼーション組織化学では、通常、試料細胞及び組織を処理し、標的の転写産物を所定位置に固定し、標的分子に対するプローブのアクセスを増強させる。上述したように、プローブは、標識された相補的ＤＮＡ又は相補的ＲＮＡ（リボプローブ）のいずれかである。プローブは温度を上昇させると標的の配列にハイブリダイズし、その後余剰のプローブは洗い流される（ハイブリダイズしない余剰のＲＮＡプローブの場合は、事前にリボヌクレアーゼを用いての加水分解後）。温度、塩及び／又は洗剤の濃度などの溶液パラメーターを操作して、あらゆる不一致の相互作用を排除してよい（すなわち、完全一致のみ結合が維持される）。次いで、放射性、蛍光又は抗原標識塩基（例えばジオキシゲニン）などで効果的に標識された標識プローブの局在が明らかにされ、場合によってはオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡検査又は免疫組織化学などを用いてそれぞれ組織内で定量化される。

リンカー：ここでは、リンカーとは２つの部分の間に位置する分子又は分子の基である。典型的には、リンカーは二官能性、すなわちリンカーは各端部に官能基を有し、官能基はリンカーを２つの部分の間に連結するのに使用される。２つの官能基は同じ、すなわちホモ二官能リンカーでもよいし、又は異なる、すなわちヘテロ二官能リンカーでもよい。

リンカーペプチド：抗体結合断片内のペプチド（Ｆｖ断片など）であり、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合する働きがある。「リンカー」はまた、ｓｃＦＶなどの標的部分を細胞毒又は検出可能な標識などのエフェクター分子に連結する働きのあるペプチドも意味しうる。

目的とする分子又は標的分子：存在、位置及び／又は濃度を決定される分子。目的とする分子の例としては、組織試料に存在するタンパク質及び核酸配列が挙げられる。

マルチプレックス、マルチプレックスの、マルチプレクシング：本開示の実施態様は、複数の異なるコンジュゲートを用いて、試料中の複数の標的を所望により実質的に同時に又は連続して検出することを可能にする。マルチプレクシングには、一般には核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質を個別に及び任意の全ての組合せで同定すること及び／又は定量化することを含みうる。マルチプレクシングはまた、解剖学的文脈において細胞内の遺伝子、メッセンジャー及びタンパク質を２つ以上検出することも含みうる。

新形成及び腫瘍：異常な未制御の細胞成長プロセス。新形成は増殖性疾患の一例である。

新形成の産物は、新生物（腫瘍）であり、過剰な細胞分割の結果としての組織の異常成長である。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる。周囲の組織に浸潤する及び／又は転移しうる腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。血液学的な腫瘍の例としては、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤白血病）を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（インドレント及び抗悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病及び脊髄形成異常症が挙げられる。

肉腫及び細胞種などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び他の肉腫、滑膜腫、中被腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺ガン、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、直腸細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌及び中枢神経系腫瘍（グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。

オリゴヌクレオチド：天然のホスホジエステル結合により結合した複数のヌクレオチド結合であり、約６から約３００ヌクレオチド長。オリゴヌクレオチドのアナログとは、オリゴヌクレオチドと同様の働きをするが、非天然部分を有する部分を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのアナログは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなどの修飾された糖部分又は糖間の結合などの非天然の部分を含みうる。天然のポリヌクレオチドの機能的アナログはＲＮＡ又はＤＮＡに結合可能であり、ペプチド核酸分子を含みうる。

特定のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのアナログは、長さ約２００ヌクレオチドまでの直線配列を有しうるが、これは例えば少なくとも６塩基、例えば少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００又は２００塩基長、又は約６から約５０塩基、例えば１２、１５又は２０塩基などの約１０〜２５塩基の配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。

プローブ：検出可能な標識又はリポーター分子が接着された単離された核酸、単離された合成オリゴヌクレオチド。典型的な標識としては、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン及び酵素が挙げられる。標識の方法及び様々な目的に適した標識の選択の手引きが例えばSambrook ら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989）及びAusubel ら（Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992）で考察されている。

当業者であれば、特定のプローブの特異性は長さに伴い増大することを理解されよう。従って、プローブは所望の特異性を得るために選択することができ、所望のヌクレオチド配列の少なくとも１７、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれより多くの連続したヌクレオチドを含みうる。特定の例では、プローブは所望のヌクレオチド配列の少なくとも１００、２５０、５００、６００又は１０００の連続する核酸でありうる。

ポリペプチド：アミノ酸残基であるモノマーがアミノ結合を介して結合したポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸の場合は、Ｌ-光学異性体又はＤ-光学異性体が用いられうる。「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ここでは任意のアミノ酸配列及び糖タンパク質などの修飾配列を包含するものとする。「ポリペプチド」という用語は、具体的には、天然のタンパク質並びに組換え又は合成で生産されたタンパク質を包含するものとする。

「残基」又は「アミノ酸残基」という用語は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに組み込まれるアミノ酸を意味する。

試料：「試料」という用語は、その中又は上に標的が存在しうる、任意の液体、半固体又は固体の物質（又は材料）を意味する。具体的には、試料は、生体試料又は生物学的物質由来の試料でありうる。生体試料の例としては、組織試料及び細胞学的試料が挙げられる。いくつかの例では、生体試料はヒト対象などの動物対象由来である。生体試料とは、単細胞生物、なかでも例えば細菌、酵母、原生動物及びアメーバ、多細胞生物（例えば植物、又は、健康な若しくは健康と思われるヒト対象又は診断若しくは検査される癌などの症状や疾患を発症しているヒト対象を含む動物）を限定ではなく包含する任意の生物から得られた、又は排泄若しくは分泌された任意の固体又は液体の試料である。例えば、生物学的試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、水性又は硝子体の体液、又は任意の体分泌、浸出液、滲出液（例えば膿瘍や任意の他の感染又は炎症部位から得られる液体）又は関節（例えば正常な関節又は疾患を発症している関節）由来の液体から得られた生物学的液体でありうる。生物学的試料はまた、任意の器官又は組織（腫瘍生検などの生検又は解剖学的試料を含む）から得られる試料であってよく、又は（一次細胞であれ培養細胞であれ）細胞若しくは任意の細胞、組織又は器官の条件培地を含みうる。いくつかの例では、生体試料は核抽出物である。いくつかの例では、生体試料は細菌の細胞質である。他の例では、試料は試験試料である。例えば、試験試料は、対象から得られた生物学的試料から調整された細胞、組織又は細胞ペレットの切片である。一例では、対象は、特定の症状又は疾患のリスクがあるか又は罹患している対象である。

特異的に結合する：規定の標的に選択的に結合する薬剤の結合を意味する用語（抗体と特定の抗原又は核酸プローブと特定の核酸配列など）。抗原に関しては、「特異的に結合する」とは、抗体又は他のリガンドが、全体的又は部分的に、特定のポリペプチドと会合することを意味する。核酸配列に関しては、「特異的に結合する」とは、核酸プローブが、全体的又は部分的に、特定の核酸配列と会合することを意味する。

特異的結合剤又は部分は、実質的に規定の標的のみに結合する。軽度の非特異的相互作用が、特異的結合剤又は部分などの分子と非標的ポリペプチド又は非標的核酸配列の間で生じうることが知られている。選択的反応性抗体は抗原を結合するものの、これは低親和性で可能である。抗体と抗原の特異的結合の結果は、典型的には、標的ポリペプチドに結合された抗体又は他のリガンドの量（単位時間当たり）は、非標的ポリペプチドと比べて２倍より多い、例えば５倍より多い、１０倍より多い又は１００倍より多い。特定のタンパク質と特異的に免疫応答する抗体を選択するのに様々な免疫測定のフォーマットが適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定がタンパク質と特異的に免疫応答するモノクローナル抗体を選択するのにルーチンに使用されている。特異的免疫応答性を決定するのに使用されうる免疫アッセイのフォーマット及び条件の記述については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988) を参照されたい。

核酸プローブと核酸配列の特異的結合の結果は、典型的には、標的核酸配列に結合された核酸プローブの量は、非標的核酸と比べて２倍より多い、例えば５倍より多い、１０倍より多い又は１００倍より多い。特定の核酸配列を特異的に結合する核酸プローブを選択するのに様々なＩＳＨ条件が適している。

特異的結合部分又は特異的結合剤：特異的結合対のメンバー。特異的結合対は、互いに結合し他の分子との結合を実質的に排除することを特徴とする分子の対である（例えば特異的結合対は、結合対の２メンバーのいずれかが生体試料中の他の分子を結合する結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^−１大きい又は１０^５Ｍ^−１大きい結合定数を有しうる）。特定結合部分の具体的な例としては、特異的結合タンパク質（例えば抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン及びタンパク質Ａ）、核酸配列及びタンパク質−核酸が挙げられる。特異的結合部分はまた、このような特異的結合タンパク質により特異的に結合する分子（又はその部分）も含みうる。

基質：酵素などの触媒に作用される分子。一例では、基質は４-クロロ-１-ナフトール（４-ＣＮ）又はジアミノベンジジン（ＤＡＢ）である。

組織：器官内で同様の機能を果たす相互接続した細胞の集合。

チラミン：式Ｃ_８Ｈ_１１ＮＯを有する化合物であり、４-(２-アミノエチル)フェノールとしても知られる。

チラミド：チラミン誘導体であり、チラミン分子のアミン官能基がカルボニルを含む官能基でアミド結合を形成している。

ＩＩＩ．いくつかの実施例の概要
Ａ．組成物
本開示の態様は、組織試料、例えば疾患マーカーなどのマーカーの存在が試験される組織切片の、検出可能な部分の沈着を増強する組成物に関する。従って、ここに開示されるのは、例えば組織切片などの組織試料の検出可能な部分の沈着を増強する組成物である。沈着が増強されると、例えば、組織試料の検出可能な部分の質、量及び／又はシグナル対ノイズ比を改善することにより、組織試料中の標的を容易に検出し同定することが可能になる。特定の実施態様では、ここに提供される開示の組成物と方法により、見かけ酵素酸化率を増加させることで、酵素の代謝回転が増大及び／又は改善し、酵素が組成物成分と反応する能力が増強され、試料中の標的分子の部位などの特定の標的部位で検出可能な部分の沈着が増加する。このような実施態様では、酵素産物は、組織試料に沈着した検出可能な部分である。例示的な組成物成分は、以下のセクションで詳述する。

１．エンハンサー
開示の実施態様は、エンハンサー又は増強液を使用して、検出可能な部分の沈着に向けての酵素活性を、例えばＨＲＰの場合は見かけ酵素反応動態を増加させてＤＡＢやＨＲＰの発色性反応産物などの酵素基質の沈着率を増加させることで、改善する。開示のエンハンサーは、他の組成物成分を含む溶液中で使用してもよく、又は別々の溶液を含んでもよく、ここで溶液は他の組成物成分に別に加えられる。溶液は水性溶液、水と混和可能な有機溶液又はそれらの任意の組合せでよい。例示的な有機溶液としては、限定ではなく、プロポレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド及びそれらの任意の組合せが挙げられる。

（ｉ）ピリミジン及びピリジンのアナログ
開示の組成物の特定の実施態様には、以下の一般式（式１と式２）

を有するピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログがエンハンサーとして含まれる。

式１について、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分及び水素でありうる。いくつかの例では、ハロゲンはヨウ素、臭素、塩素又はフッ素である。いくつかの例では、ヘテロ原子含有部分はヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）である。いくつかの例では、Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２に結合して融合環系を形成する。いくつかの例では、式２については、Ｒ^５は、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）などのヘテロ原子含有部分である。式１については、いくつかの例では、「Ａ」は（イオウ以外の）ヘテロ原子、炭素原子又はそれらの任意の組合せである。式２については、ｎは１、２、３、４又は５など１から５であり、例えば１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、１〜３、２〜４、３〜５、１〜４、２〜５又は１〜５である。特定の例では、Ａは炭素原子であり、ｎは１である。開示の組成物に含まれる例示的なピリミジンアナログは、ピリミジン及び２-ヒドロキシピリミジンであり、例示的なピリジンアナログは、ピリジン及び２-ヒドロキシピリジンである。

いくつかの例では、エンハンサーは溶液中に存在し、例えば自動機械からの分注を促進する。いくつかの例では、エンハンサーは、約０．０１ｍＭから約１００ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１０ｍＭ、約０．２０ｍＭ、約０．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約２０．０ｍＭ、約３０．０ｍＭ、約４０．０ｍＭ、約５０．０ｍＭ、約７５．０ｍＭ、又は約１００．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭから約０．１０ｍＭ、約０．０５ｍＭから約０．５０ｍＭ、約０．４ｍＭから約１．０ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭ、約５．０ｍＭから約５０．０ｍＭ及び約２０．０ｍＭから約１００．０ｍＭの濃度で溶液中に存在する。

（ｉｉ）任意のエンハンサー
特定の実施態様では、ピリミジン及びピリジンアナログのエンハンサーが追加の任意のエンハンサーと併用で使用される。いくつかの実施態様では、任意のエンハンサーはピリミジン及びピリジンアナログのエンハンサーと同じ溶液に含まれるので、単一の溶液などの単一の組成物として組織試料と接触しうる。いくつかの例では、例えば反応性及び／又は低溶解性を回避するために、任意のエンハンサーは別の溶液に含まれることが望ましい場合がある。従って、いくつかの実施多様では、任意のエンハンサーはピリミジン及びピリジンアナログのエンハンサーとは別の溶液に含まれるので、例えばステップワイズの送達又は同時送達として、別の溶液から組織試料と接触しうる。

開示の組成物の特定の実施態様では、数ある要因のなかでも特定の用途又は検出可能な部分又は酵素といった要因によりピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログとの併用で使用可又は使用不可の任意のエンハンサーを有する組成物が開示される。特定の実施態様では、開示の組成物は、任意のエンハンサーとして、一般式（式３）：

を有するヘテロアリールのエンハンサーを含む。

式３については、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１は独立して、脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分、水素又はそれらの任意の組合せである。特定の例では、ハロゲンはヨウ素、臭素、塩素又はフッ素である。特定の例では、ヘテロ原子含有部分は、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）である。式３については、「Ａ」は（イオウ以外の）ヘテロ原子、炭素原子又はそれらの任意の組合せである。式３については、「Ｂ」は酸素、炭素又は窒素である。特定の例では、Ａは炭素原子でありＢは窒素原子である。特定の実施態様では、開示の組成物に使用されるヘテロアリールのエンハンサーは、イミダゾール、Ｌ-ヒスチジン、チアゾール、オキサゾール又はそれらの任意の組合せから選択される。いくつかの例では、エンハンサーは溶液中に存在し、例えば自動機械からの分注を促進する。

いくつかの実施態様では、開示の組成物は、任意のエンハンサーとして、以下の一般式（式４及び式５）：

を有するヘテロアリールのエンハンサーを含む。

式４と５については、Ｒ^１２〜Ｒ^２３は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヘテロ原子含有部分、水素又はそれらの任意の組合せである。いくつかの例では、ハロゲン部分はヨウ素、臭素、塩素又はフッ素である。いくつかの例では、ヘテロ原子含有部分は、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）である。特定の実施態様では、Ｒ^２２は、[Ｏ]^・などのラジカル種又は[Ｏ]⁻などの負電荷をもつ種である。式５については、特定の実施態様では、Ｒ^２１及びＲ^１７はジェミナルなジ-メチル基を含む。式５及び／又は６については、「Ａ」は（イオウ以外の）ヘテロ原子、炭素原子又はそれらの任意の組合せである。特定の例では、Ａは窒素原子、酸素原子、炭素原子又はそれらの任意の組合せである。特定の実施態様では、ヘテロアリールのエンハンサーとして、限定ではなく、ピリミジンＮ-オキシド、ピリジンＮ-オキシド、Ｎ-メチルモルホリン（ＮＭＯ）及び２,２,６,６-テトラメチルピペリジン-１-オキシル（ＴＥＭＰＯ）が挙げられる。

いくつかの実施態様では、開示の組成物は、任意のエンハンサーとして、有機及び無機ボロン酸を含む。いくつかの実施態様では、有機ボロン酸は、以下の一般式（式６）を有する：

式６については、Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６は独立して脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである。特定の例では、２又は３などの２以上のＲ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６はヒドロキシルであり、残りのＲ^２４、Ｒ^２５又はＲ^２６は脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族又はヘテロアリールである。特定の実施態様では、Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６は独立してアルキル、アルケニル、アルキニル及びフェニルである。開示の組成物の特定の実施態様では、有機ボロン酸はホウ酸、フェニルボロン酸、４-ＡｃＨＮ-フェニルボロン酸又はそれらの任意の組合せである。

いくつかの実施態様では、開示の組成物は、任意のエンハンサーとしてフェノール化合物を含む。いくつかの実施態様では、フェノール化合物は以下の一般式（式７）を有する：

式７については、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ原子含有部分、ハロゲン又はそれらの任意の組合せである。いくつかの例では、ハロゲン部分はヨウ素、臭素、塩素又はフッ素である。いくつかの例では、ヘテロ原子含有部分はヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ^６Ｒ^７（Ｒ^６及びＲ^７は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである）である。特定の実施態様では、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１から選択される任意の２つの隣接基が結合して、融合した芳香又は非芳香環系を形成しうる。追加の特定の実施態様では、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１の少なくとも１つがヒドロキシルから選択される。特定の裏付けのある実施態様は、任意のエンハンサーとして、ピロカテコールなどのフェノール化合物に関する。

２．検出可能な部分
開示の組成物は、検出可能な部分の検出増加を可能にする。これらの検出可能な部分は、組織試料とともに使用できる任意の部分から選択されうる。特定の実施態様は、色素原、フルオロフォア、チラミンとハプテンの間に形成されるチラミドコンジュゲート、ナノ粒子、フルオロフォア及びタンパク質又はそれらの任意の組合せから選択される検出可能な部分を使用する。

特定の実施態様では、検出可能な部分として色素原を使用する。色素原は、例えば典型的には病理学的検査に使用される組織片などの組織試料などの組織上に沈着すると検出可能な色の変化を生成することができる任意の化合物から選択されうる。いくつかの例では、検出可能な部分は、酵素による作用を受けた後、試料組織に沈着する。例として、酵素は組織試料の標的分子に向けられ、酵素は検出可能な部分に作用し、次いで検出可能な部分は酵素のすぐ近位で試料に沈着し、組織試料の標的分子の検出、定量化及び／又は局在を明らかにすることを可能にする。検出可能な部分は、他の組成物成分を含む溶液中で使用してもよく、又は溶液は他の組成物成分に別に加えられる別の溶液を含みうる。

特異的結合部分は、標識が直接結合されるように設計されうる。このように使用されると、特異的結合／標識複合体（すなわちプローブ）は試料と接触し、標的が検出される。

特異的結合部分はまた、標識と間接的にも結合しうる。いくつかの例では、第１特異的結合部分が試料と接触する。特異的結合部分は、核酸ベースでもタンパク質ベースでもよい。特異的結合部分は他の部分に結合でき、次いで他の部分は例えば二次抗体又はビオチンなどの非ペプチドベースの結合部分により結合される。二次抗体又は非ペプチド結合対は次いで酵素などの標識に連結されうる。他の例では、特異的結合部分は、特異的結合部分を直接又は間接的に酵素活性をもつペプチドに結合することにより、間接的に標識と結合しうる。酵素活性は、基質（単数又は複数）を加えると基質（単数又は複数）が検出可能な部分に転換されるか又はより活性な標識になるように選択される。

例示的な非限定の酵素／基質対の例として、以下が挙げられる：ＨＲＰ／ＤＡＢと発色性基質又は蛍光発生基質。他にも多くの酵素−基質の組合せが当業者には知られている。これらの一般的な概説は、米国特許第４，２７５，１４９号及び４，３１８，９８０号を参照されたい。プローブが１または複数の追加の分子の間接的結合から作られる場合、追加の分子はプローブの構成要素と呼ばれうる。

いくつかの例では、標識は抗体と間接的に結合する。例えば、抗体はビオチンと結合してよく、ここでビオチンは選択的にアビジンと結合し、続いて検出される。あるいは、抗体は小さいハプテンと結合し、標識は抗ハプテン抗体と結合する。こうして標識と標的部分の間接的結合が得られうる。

プローブが基質と反応する酵素を含んで検出標識を生成する場合、基質は発色性化合物でありうる。このような基質の例は数多い。例えば、このような化合物の多くがInvitrogen, Eugene ORから購入できる。発色性化合物の特定の非限定例としては、ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（ONPG）、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-ガラクトピラノシド（X-Gal）、メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（MU-Gal）
、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシド（PNP）、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド（X-Gluc）、３-アミノ-９-エチルカルバゾール（AEC）、１０-アセチル-３,７-ジヒドロキシフェノキサジン（ADHP）、ジアミノベンジジン（DAB）、テトラメチルベンジジン（TMB）、２,２’-アジノ-ジ-[３-エチルベンゾチアゾリンスルホネート]（ABTS）、ｏ-ジアニシジン、４-クロロナフトール（4-CN）（Kidwell, ら Anal. Biochem., (1991), 192, 207によるとDMPDA/DEPDA/MBTH/ADETと組み合わせて使用される）及びｏ-フェニレンジアミン（OPD）が挙げられる。

特定の実施態様ではフルオロフォアを検出可能な部分として使用する。フルオロフォアは、限定ではなくフルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン及びローダミンを含む、蛍光を発する化合物から選択されうる。ここに開示されるプローブで使用されうる特定のフルオロフォアの例がNazarenkoらの米国特許第５，８６６，３６６号に記載されており、例えば４-アセトアミド-４’-イソチオシアナトスチルベン-２,２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５-(２’-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸（EDANS）、４-アミノ-Ｎ-[３-ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-３,５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ-(４-アニリノ-１-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン（AMC, クマリン 120）、７-アミノ-４-トリフルオロメチルクルアリン（7-amino-4-trifluoromethylcouluarin）（クマラン151）；シアノシン；４’,６-ジアミニジノ-２-フェニルインドール（DAPI）；５’,５”-ジブロモプロガロール-スルホンフタレイン（ブロモピルガロールレッド）；７-ジエチルアミノ-３-(４’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタ酢酸；４,４’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-２,２’-ジスルホン酸；４,４’-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２’-ジスルホン酸；５-[ジメチルアミノ]ナフタレン-１-スルホニルクロリド（DNS, ダンシルクロリド）；４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４’-イソチオシアネート（DABITC）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５-カルボキシフルオレセイン（FAM）、５-(４,６-ジクロロトリアジン-２-イル）アミノフルオレセイン（DTAF）、２’７’-ジメトキシ-４’５’-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（JOE）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）及びＱＦＩＴＣ（XRITC）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４-メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザリニン；フェノールレッド；Ｂ-フィコエリトリン；Ｏ-フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及びサクシニミジル１-ピレンブチレート；リアクティブレッド４（CIBACRON^TM ブリリアントレッド 3B-A）；ローダミン及び誘導体、例えば６-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、６-カルボキシローダミン（R6G）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Rhod）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトラメチル-６-カルボキシローダミン（TAMRA）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体；ライトサイクラーレッド６４０；Ｃｙ５．５；及びＣｙ５がある（蛍光分子の追加の例の多くがThe Handbook−A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, ORに記載されている）。

他の実施態様では、検出可能な部分はナノ粒子、フルオロフォア及びタンパク質より選択される検出可能な部分に結合したチラミン化合物を有するチラミドコンジュゲートを含みうる。特定の実施態様ではチラミドとハプテンを含むチラミドコンジュゲートを使用するが、ここでハプテンはオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン又はこれらの組合せより選択される。

本開示が意図する別の実施態様は、量子ドットなどのナノ粒子に結合するチラミド化合物を含むチラミドコンジュゲートを含む。他の特定の実施態様には、フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン及びローダミンより選択されるフルオロフォアに結合したチラミン化合物を含む。さらに他の特定の実施態様は、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-ラクタマーゼなどの酵素より選択されうるタンパク質に結合したチラミン化合物に関する。

特定の実施態様では、検出可能な標識又はハプテンは、脂肪族リンカー、ヘテロ脂肪族リンカー又は同等の反応性を有する任意他の可動性接着部分などのリンカーを通じてチラミン化合物に結合する。例えば、チラミン化合物は、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（PEG）リンカーなどのヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーにより検出可能な標識で共有結合的に修飾されうる。

開示のチラミン−検出可能な部分のコンジュゲート及びチラミド−ハプテンコンジュゲートを形成するのに適切なリンカーの１クラスは、１または複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖又はアルキル鎖などの脂肪族化合物である。脂肪族の鎖はまた、典型的には末端に官能基を含んでおり、例として、限定ではなく、カルボニル反応基、アミン反応基、チオール反応基又は光反応基などが挙げられ、これらは検出可能な部分及び他の所望の化合物とのカップリングを促進する。鎖の長さは様々でありうるが、典型的には実際的な上限は約３０原子である。鎖の連結が約３０炭素原子よりも多いものは、鎖の連結がより短いものよりも有効性が低いことが判明している。従って、脂肪族の鎖の連結の鎖長は、典型的には約１炭素原子から約３０炭素原子である。しかし、当業者であれば、特定のリンカーが３０原子より大きくても有効に機能して検出可能な部分をチラミン化合物に連結し、なおもコンジュゲートが所望どおりに機能する場合、このような鎖の連結は本発明の範囲内であることを理解されよう。開示のリンカーを含むチラミド−ハプテンコンジュゲートの典型的な濃度の範囲は、約５００ｐＭから約１００μＭである。より典型的な濃度の範囲は、約５μＭから約５５μＭである。

便利なリンカーの別のクラスは、アルキレン酸化物である。本明細書ではアルキレン酸化物は、参照によりエチレングリコールなどのグリコールに代表される。当業者であれば、酸素原子の数の増加に伴い化合物の親水性も上昇することを理解されよう。従って、本開示のリンカーは典型的には式（-ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ-）_ｎを有し、ここでｎは約２から約１５、より具体的には約２から約８である。いくつかの例では、検出可能な部分は溶液中に約０．０１ｍＭから約１０．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１０ｍＭ、約０．２０ｍＭ、約０．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５．０ｍＭ又は約１０．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭから約０．１０ｍＭ、約０．０５ｍＭから約０．５０ｍＭ、約０．４ｍＭから約１．０ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭ及び約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭの濃度で存在する。

３．特異的結合部分のコンジュゲート
特定の実施態様は、特異的結合部分及び酵素を含むコンジュゲートを使用することに関し、ここで特異的結合部分は試料中の特定の標的を識別しこれに結合する能力がある。特異的結合部分は、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質及びペプチドより選択されうる。特定の実施態様は、特異的結合部分として抗体などのタンパク質を使用することに関する。

特定の実施態様では、特異的結合部分は酵素に結合する。方法において意図される酵素の例としては、ペルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼが挙げられる。特定の実施態様は、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ又はヘム部分を含む任意の他のペルオキシダーゼを使用することに関する。

特定の実施態様では、特異的結合部分及びハプテンを含むコンジュゲートを、抗ハプテン抗体及び酵素を含む第２コンジュゲートと組み合わせて使用してよい。これらの特定の実施態様では、特異的結合部分、典型的には抗体は、試料中の標的を識別しそれに結合することができる。特異的結合部分はハプテンに結合し、抗ハプテン抗体及び酵素を含む第２コンジュゲートにより識別される。この第２抗体コンジュゲートが第１コンジュゲートを結合することで、酵素を標的に結合する。ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン又はそれらの組合せより選択されうる。例示的な抗体としては、限定ではなく、ウサギＩｇＧ、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ及びヤギＩｇＧが挙げられる。例示的酵素は先に開示したとおりである。いくつかの例では、特異的結合部分及び酵素のコンジュゲートは溶液中約０．０１ｍＭから約１０．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１０ｍＭ、約０．２０ｍＭ、約０．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５．０ｍＭ又は約１０．０ｍＭ、例えば約０．０１から約０．１０、約０．０５から約０．５０、約０．４から約１．０、約０．５から約２．０及び約１．０から約１０．０の濃度で存在する。

４．他の成分
特定の実施態様は、式ＭＸ_ｎ又はＭＸ（ＭはＩ族又はＩＩ族の金属であり、Ｘはフッ化物、臭化物、塩化物及びヨウ化物などのハロゲン化物である）を有するＩ族又はＩＩ族の金属含有塩と、炭酸、水酸化物及びリン酸などの酸素を含むイオンをさらに含む組成物に関する。特定の実施態様は、ナトリウム、リチウム、セシウム及びカリウムより選択されたＩ族の金属を使用することに関する。他の特定の実施態様は、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムより選択されたＩＩ族の金属を使用することに関する。特定の実施態様では、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及び炭酸カルシウムより選択されたカルシウム及び／又はマグネシウム塩のエンハンサーを使用する。いくつかの例では、任意のエンハンサーは溶液中約０．０１ｍＭから約１００ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１０ｍＭ、約０．２０ｍＭ、約０．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約２０．０ｍＭ、約３０．０ｍＭ、約４０．０ｍＭ、約５０．０ｍＭ、約７５．０ｍＭ又は約１００．０ｍＭ、例えば約０．０１ｍＭから約０．１０ｍＭ、約０．０５ｍＭから約０．５０ｍＭ、約０．４ｍＭから約１．０ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭ、約５．０ｍＭから約５０．０ｍＭ及び約２０．０ｍＭから約１００．０ｍＭの濃度で存在する。

特定の実施態様は、先に開示した任意の成分と任意の組合せで使用されうる成分として、オキシダント、阻害剤及び界面活性剤をさらに含む組成物に関する。オキシダントは、酵素を効果的に活性化する能力のある任意の化合物を含みうる。特定の実施態様は、水素ペルオキシドなどのペルオキシドをオキシダントとして使用して酵素を活性化することに関する。典型的には、オキシダントは０．０３％の水素ペルオキシドである。

阻害剤は、検出可能な部分が沈着するように酵素が十分に反応した後で酵素を効果的に阻害する能力のある任意の化合物より選択されうる。特定の実施態様は、ペルオキシダーゼより選択された阻害剤に関する。典型的には、水素ペルオキシドが阻害剤として使用される。特定の実施態様は、３％の水素ペルオキシドを阻害剤として使用することに関する。特定の実施態様では、阻害剤は、他の組成物成分の添加に次いで試料に添加される。

本開示の特定の実施態様は、組織試料などの試料中の標的分子を検出するのに使用される組成物に関する。いくつかの実施態様では、商業的に実行可能な（commercially viable）組成物は、ピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログ、任意のエンハンサー、検出可能な部分、特異的結合部分のコンジュゲート、酵素、オキシダント及び界面活性剤を含む。これらの組成物成分は、結果として試料中の標的に検出可能な部分が効果的に沈着する、任意の順序で任意の組合せで添加してよい。組成物は、酵素、オキシダント及び色素が結合された二次抗体と組み合わせて使用してよい。

特定の裏付けのある実施態様では、ピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログは２-ヒドロキシピリミジン及び／又は２-ヒドロキシピリジンより選択される。特定の裏付けのある実施態様では、特異的結合部分のコンジュゲートはハプテン化ＩｇＧ抗体コンジュゲートであり、二次抗体は抗ハプテン多量体ＨＲＰコンジュゲーを含む。

開示の特定の実施態様は、界面活性剤を使用することに関する。界面活性剤は、化学作用の態様によりアニオン性、カチオン性又は非イオン性に分類される。非イオン性界面活性剤は、水素結合のメカニズムを介して機能する。さらに、界面活性剤は、２つの液体の間の表面張力を減ずる。界面活性剤分子は典型的には極性又はイオン性の「頭部」と非極性の炭化水素「尾部」を有する。水に溶けると、界面活性剤分子は凝集してミセルを形成し、ここで非極性の尾部は内側を向き、極性又はイオン性の頭部は外側の水性環境に向いている。非極性の尾部はミセルの中で非極性の「ポケット」を作る。溶液中の非極性化合物は、界面活性剤分子により形成されたポケット内に隔離されるので、非極性化合物は水溶液中に混合されたままである。開示の特定の実施態様では、界面活性剤は組織切片全体に試薬を均一に広げるため、並びにバックグラウンドの染色を減ずるために使用されうる。

界面活性剤の例としては、限定ではなく、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが挙げられ、ここでアルキルは(ＣＨ_２)_Ｍであり、オキシエチレンは(Ｃ_２Ｈ_４Ｏ)_Ｎであり、ここでＭは５から１６、８から１４又は１０から１２の整数であり、Ｎは１０から４０、１５から３０又は２０から２８の整数である。一実施態様では、界面活性剤は、式(Ｃ_２Ｈ_４Ｏ)_２３Ｃ_１２Ｈ_２５ＯＨを有するポリオキシエチレンラウリルエーテルである。別の実施態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノアルキレートであり、モノアルキレートは８から１４の炭素を有する。別の実施態様では、界面活性剤は、式Ｃ_{１２-１４}Ｈ_{２５-２９}Ｏ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ]_ｘ（式中、ｘは２から１２の整数に等しい）を有する直鎖２級アルコールポリオキシエチレンである。さらに別の実施態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである。例示的な界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ツイーン（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ、トリトン^ＴＭ、Ｅｃｏｓｕｒｆ^ＴＭ、Ｄｏｗｆａｘ^ＴＭ、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＢｉｇＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ ＢｉｇＣＨＡＰ、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）、サポニン、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）、プルロニックＦ−６８、ジギトニン、デオキシコール酸などの名称で販売されている。開示の特定の裏付けのある実施態様は、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ツイーン（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ、トリトン^ＴＭより選択された界面活性剤を使用することに関する。

Ｂ．標的分子を検出する方法
開示の組成物は、ＩＨＣ又はＩＳＨ組織染色の間、協働で作用し最大の沈着をもたらすので、試料中の標的分子の検出に特に便利である。従って、本開示は、組織試料などの試料中の標的分子を検出する方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、前のセクション（セクションＡ）に記載のように試料をピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログを含む増強液と接触させることと、試料を酵素と接触させることと、試料を沈着や蛍光法を使用して検出できる検出可能な部分と接触させることを含む。いくつかの例では、酵素は基質に作用して、標的分子の位置で試料上に沈着する検出可能な部分の産生を触媒し、従って標的分子の検出が可能になる。検出可能な部分が検出され、これにより試料中の標的分子が検出される。いくつかの例では、検出可能な部分により算出されるシグナルの強度及び／又は位置は、例えば組織試料の標的分子の量及び／又は位置を決定するために、測定される。標的は、その存在、位置及び／又は濃度が決定される対象の任意の分子でありうる。対象の分子の例としては、タンパク質及び核酸配列が挙げられる。いくつかの実施態様では、ピリミジンアナログは、ピリミジン及び／又は２-ヒドロキシピリミジンである。いくつかの実施態様では、ピリジンアナログは２-ヒドロキシピリジンである。

いくつかの実施態様では、酵素は、標的に結合する酵素コンジュゲートと共に試料をインキュベートすることにより、標的上に固定化される。酵素は、標的結合能のある任意の部分に、例えば、標的分子を特異的に識別する抗体又は核酸に結合されうる。適切な部分としては、限定ではなく、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸が挙げられる。

他の実施態様では、酵素の固定化は複数ステップのプロセスである。例えば、試料は、標的に結合する第１部分（例えば抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド又はアミノ酸）と共にインキュベートされうる。試料は次いで、第１部分に結合する能力のある部分を含む酵素コンジュゲートと共にインキュベートされる。いくつかの実施態様では、第１部分が標的の抗体である場合、２ステップのプロセスは、ユーザーが「ユニバーサル」な酵素−抗体コンジュゲートを使用するのを可能にするので、より多用途となりうる。例えば、一次抗体がウサギモノクローナル抗体であれば、酵素−抗体コンジュゲートは任意のウサギモノクローナル抗体に結合する能力のある抗体、例えば二次抗体を含みうる。複数ステップのプロセスは、各標的に適した酵素−抗体コンジュゲートを生成する必要を排除しうる。

いくつかの実施態様では、第１部分は、標識されたオリゴヌクレオチドなどの標識されたプローブでありうる。プローブが試料にハイブリダイズされた後、標識を識別する一次抗体が導入され、標識されたプローブに結合する。一次抗体は酵素−抗体コンジュゲートでありうる。しかし、一次抗体が酵素に結合されない場合、酵素−抗体コンジュゲートは、コンジュゲートの抗体部分が一次抗体を識別し結合するところに導入される。

いくつかの実施態様では、酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ若しくはグルタチオンペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ又はオキシドレダクターゼである。従って、酵素が、例えば基質を標的分子の部位で組織試料に沈着された検出可能な部分に転換するなどの所望の機能を果たすことを可能にする、塩濃度やｐＨなどの適切な条件が選択される。反応は酵素に適した温度で行われる。例えば、酵素が西洋わさびペルオキシダーゼの場合、反応は約３５〜４０℃で行われる。

いくつかの例では、検出可能な部分は、色素原、フルオロフォア、ハプテン又はタンパク質である。特定の例では、検出可能な部分は、１,３-ジアミノベンジジン、３-アミノ-９-エチルカルバゾール又はテトラメチルベンジジン又はその反応産物である。開示の方法で使用される色素原の追加の例が、先のセクション（セクションＡ）に挙げられている。

他の例では、検出可能な部分は、フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン又はローダミンなどのフルオロフォアである。開示の方法で使用されるフルオロフォアの追加の例が、先のセクション（セクションＡ）に挙げられている。

他の例では、検出可能な部分は、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール又はベンゾジアゼピンなどのハプテンである。

特定の実施態様では、検出可能な部分は、例えば脂肪族又は鎖に約１から約３０の炭素をもつヘテロ脂肪族のリンカーを介してチラミンに結合される。特定の実施態様では、リンカーはエチレングリコールなどの酸化アルキレン又はそのポリマー、例えば１から約１５のエチレングリコールユニットのポリマーである。チラミンが開示の方法で用いられる場合、チラミドシグナルの増幅が、生成されたシグナルをさらに増幅するのに使用される。チラミドシグナルの増幅は、チラミン又はチラミン誘導体の残基を固相に共有結合するペルオキシダーゼ酵素の触媒作用を利用する。固相は、例えば顕微鏡のスライドガラスなどに固定化された細胞又は細胞構造のタンパク質成分でありうる。ペルオキシダーゼ酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）は、ペルオキシドの存在下でフェノール化合物の二量体形成を触媒しうる。従って、西洋わさびペルオキシダーゼ及びペルオキシド（水素ペルオキシド）の存在下でチラミンがタンパク質含有試料に加えられると、チラミンフェノール基はチロシンアミノ酸のフェノール基と二量体を形成しうる。

固定化された酵素に近接するチラミン分子のみが、固定化酵素の近傍の又は近位のチロシン残基と反応し二量体を形成する。このチロシン残基としては、酵素自体のチロシン残基、酵素が結合される抗体のチロシン残基及び／又は固定化酵素の約１００ｎｍ以内、約５０ｎｍ以内、約１０ｎｍ以内又は約５ｎｍ以内など、試料中で固定化酵素に近位のチロシン残基が挙げられる。例えば、チロシン残基は、固定化された酵素から約１０オングストロームから約１００ｎｍ、約１０オングストロームから約５０ｎｍ、約１０オングストロームから約１０ｎｍ又は約１０オングストロームから約５ｎｍの距離である。このような近位の結合により、ＩＨＣ及び／又はＩＳＨで使用される従来の染色法と少なくとも同程度の特異性で標的を検出できる。例えば、本開示の方法の実施態様は、例えば核膜対核領域、細胞膜対細胞質などの細胞内構造を区別可能にする。

酵素が試料に固定化されると、チラミドコンジュゲートが適切な条件下で導入され、酵素がチラミドと反応できるようになる。典型的には、酵素は西洋わさびペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼである。このような条件下、チラミドがペルオキシド及び酵素と反応し、典型的には、固定化された酵素の近位のチロシン残基（固定化された酵素自体のチロシン残基を含む）との結合により、チラミドは試料と共有結合する活性な形態に転換される。チラミドコンジュゲートが試料に結合した後、その存在は適切な手段、例えばチラミドと結合した検出可能な部分により検出される。

いくつかの実施態様では、試料はさらに、１または複数のヘテロアリール化合物、Ｉ族又はＩＩ族の金属を含む塩、ホウ素含有化合物、フェノール化合物などの少なくとも１の任意のエンハンサーと接触させられる。例示的な任意のエンハンサーが、先のセクション（セクションＡ）に記載されている。いくつかの実施態様では、試料はさらに、例えば水素ペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼなどのオキシダントと接触させられる。いくつかの実施態様では、試料はさらに、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ツイーン（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ及びトリトン^ＴＭなどの界面活性剤と接触させられる。いくつかの実施態様では、試料はさらに、スズ酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム及び重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤と接触させられる。

ここで開示される方法の実施態様は、手動で又は例えば自動組織プロセス装置などで自動的に実施されうる。自動システムは典型的には少なくとも部分的に、実質的に全部ではないとしてもコンピューター制御される。自動システムは典型的には少なくともコンピューター制御なので、本開示の特定の実施態様も、コンピューターに本方法の開示の実施態様を実施させる、コンピューターが実行可能な指令を保存する１または複数の有形のコンピューター読込可能媒体に関する。

Ｃ．試料及び標的
試料は、生物学的成分を含み、一般に、１または複数の目的とする標的分子を含むと考えられる。標的分子は、細胞表面にあってよく、細胞は懸濁液又は組織切片の中にあってよい。標的分子は細胞内でもよく、細胞溶解又はプローブでの細胞貫通の際に検出されうる。当業者であれば、試料中の標的分子を検出する方法は、用いられる試料とプローブのタイプにより異なることを理解されよう。試料を収集し調製する方法は当分野で知られている。

ここで開示される方法で及び組成物と共に使用される、組織又は他の生体試料などの試料は、当業者に知られる任意の方法で調製されうる。試料は、ルーチンのスクリーニングの対象から、又は遺伝的異常、感染又は腫瘍などの疾患を有すると考えられる対象から得られうる。開示の方法の記載された実施態様はまた、遺伝的異常、疾患、障害などをもたない「正常な」試料と呼ばれる試料にも適用される。このような正常な試料は、他の試料との比較用コントロールとして、とりわけ便利である。試料は様々な目的のために解析されうる。例えば、試料は、科学的研究若しくは疾病が疑われる場合の診断、又は治療の成功、生存などの予後診断的インジケーターとして使用されうる。

試料は、プローブやリポーター分子によって特異的に結合されうる複数の標的を含みうる。標的は、核酸配列又はタンパク質でありうる。本開示を通じて、標的タンパク質を参照する場合、そのタンパク質関連の核酸配列も標的として使用されうることが理解される。いくつかの例では、標的は、ウイルス、細菌又はウイルスのゲノムからの細胞内寄生体などの病原体のタンパク質又は核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患と関連のある（例えば相関のある、偶然示唆されるなど）標的核酸配列から産生されうる。

標的核酸配列は、サイズがかなり異なりうる。限定ではなく、核酸配列は、様々な数の核酸残基を有しうる。例えば，標的核酸配列は、少なくとも約１０の核酸残基又は少なくとも約２０、３０、５０、１００、１５０、５００、１０００残基を有しうる。同様に、標的ポリペプチドは、サイズがかなり異なりうる。限定ではなく、標的ポリペプチドは、ペプチドに特異的な抗体又はその断片に結合する少なくとも１のエピトープを含む。いくつかの実施態様では、そのポリペプチドは、ペプチドに特異的な抗体又はその断片に結合する少なくとも２のエピトープを含みうる。

具体的な非限定的な例では、標的タンパク質は、腫瘍（例えば癌）関連の標的核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）により産生される。多くの染色体異常（転座及び他の再編成、増幅又は欠失）が新生物細胞、特にＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経癌などの癌細胞で同定されている。従って、いくつかの例では、少なくとも標的分子の一部分が、試料の少なくとも細胞サブセットで増幅又は欠失された核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）により産生される。

癌遺伝子はいくつかのヒト悪性新生物の原因として知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２のブレークポイントに位置するＳＹＴ遺伝子に関与する染色体の再編成は、滑膜肉腫軟組織腫瘍に共通する。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば異なる標識を有するプローブを用いて同定されうる：第１プローブはＳＹＴ遺伝子から遠位に伸長する標的核酸配列から生成されるＦＰＣ核酸分子を含み、第２プローブはＳＹＴ遺伝子の３’又は近位に伸長するＦＰＣ核酸から生成される標的核酸配列を含む。これらの標的核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）に対応するプローブがインサイツハイブリダイゼーション手順で使用される場合、ＳＹＴ遺伝子領域でｔ（１８ｑ１１．２）が欠失した正常細胞は、２つの融合（近接する２つの標識により生成される）シグナルを示し、インタクトな２つのＳＹＴ複製を反映する。ｔ（１８ｑ１１．２）を有する異常細胞は、１つの融合シグナルを示す。

他の例では、悪性細胞で欠失した（失われた）腫瘍抑制遺伝子である、核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）から産生された標的タンパク質が選択される。例えば染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）及びＤ９Ｓ１７５２）は特定の膀胱癌で欠失する。（例えばＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）第１染色体の短腕の遠位領域及び（例えばＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）第１９染色体の動原体周囲領域（例えば１９ｐ１３−１９ｑ１３）に関する染色体欠失は、中枢神経系の特定タイプの固形腫瘍の特徴的な分子特性である。

先述の例は単なる説明の目的であり、限定を意図するものではない。新生物の形質転換及び／又は増殖と関連のある他の多くの染色体異常が当業者に知られている。核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）により産生される、新生物の形質転換と関連があり、開示の方法に有益な標的タンパク質としては、ＥＧＦＲ遺伝子（7p12；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000007, ヌクレオチド55054219-55242525）、Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（8q24.21；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000008, ヌクレオチド128817498-128822856）、D5S271（5p15.2）、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（8p22；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000008, ヌクレオチド19841058-19869049）、ＲＢ１（13q14；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000013, ヌクレオチド47775912-47954023）、ｐ５３（17p13.1；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000017, 補体、ヌクレオチド7512464-7531642）、Ｎ−ＭＹＣ（2p24；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000002, 補体, ヌクレオチド151835231-151854620）、ＣＨＯＰ（12q13；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000012, 補体、ヌクレオチド56196638-56200567）、ＦＵＳ（16p11.2；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000016, ヌクレオチド 31098954-31110601）、ＦＫＨＲ（13p14；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000013, 補体、ヌクレオチド40027817-40138734）並びに例えば：ＡＬＫ（2p23；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000002, 補体、ヌクレオチド29269144-29997936）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（11q13；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000011, ヌクレオチド69165054..69178423）、ＢＣＬ２（18q21.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000018, 補体、ヌクレオチド58941559-59137593）、ＢＣＬ６（3q27；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000003, 補体、ヌクレオチド188921859-188946169）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（1p32-p31；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000001, 補体、ヌクレオチド59019051-59022373）、ＴＯＰ２Ａ（17q21-q22；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000017, 補体、ヌクレオチド35798321-35827695）、ＴＭＰＲＳＳ（21q22.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000021, 補体、ヌクレオチド41758351-41801948）、ＥＲＧ（21q22.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000021, 補体、ヌクレオチド38675671-38955488）；ＥＴＶ１（7p21.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000007, 補体、ヌクレオチド13897379-13995289）、ＥＷＳ（22q12.2；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000022, ヌクレオチド27994271-28026505）；ＦＬＩ１（11q24.1-q24.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000011, ヌクレオチド128069199-128187521）、ＰＡＸ３（2q35-q37；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000002, 補体、ヌクレオチド222772851-222871944）、ＰＡＸ７（1p36.2-p36.12；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000001, ヌクレオチド18830087-18935219）、ＰＴＥＮ（10q23.3；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000010, ヌクレオチド89613175-89716382）、ＡＫＴ２（19q13.1-q13.2；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000019, 補体、ヌクレオチド45431556-45483036）、ＭＹＣＬ１（1p34.2；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000001, 補体、ヌクレオチド40133685-40140274）、ＲＥＬ（2p13-p12；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000002, ヌクレオチド60962256-61003682）及びＣＳＦ１Ｒ（5q33-q35；例えばGENBANK^TM寄託番号NC_000005, 補体、ヌクレオチド149413051-149473128）が挙げられる。

他の例では、標的タンパク質は、疾患または状態と関連づけられるウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織試料中のウイルス又は微生物由来の標的核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）の検出は、その生物の存在を示唆する。例えば、標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は発癌性若しくは病原体ウイルス、細菌又は細胞内寄生体（熱帯熱マラリア原虫及び他のマラリア原虫種、リーシュマニア（sp.）、クリプトスポリジウム・パルバム、赤痢アメーバ及びランブル鞭毛虫並びにトキソプラズマ、エイメリア、タイレリア及びバベシア種など）のゲノムから選択されうる。

いくつかの例では、標的タンパク質は、ウイルスゲノムの核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）より産生される。例示的ウイルスと対応するゲノム配列（GENBANK^TM RefSeq受託番号を括弧内に示す）としては、ヒトアデノウイルスＡ (NC_001460)、ヒトアデノウイルスＢ (NC_004001)、ヒトアデノウイルスＣ (NC_001405)、ヒトアデノウイルスＤ (NC_002067)、ヒトアデノウイルスＥ (NC_003266)、ヒトアデノウイルスＦ (NC_001454)、ヒトアストロウイルス (NC_001943)、ヒトＢＫポリオーマウイルス (V01109; GI:60851) ヒトボカウイルス (NC_007455)、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ (NC_002645)、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１ (NC_006577)、ヒトコロナウイルスＮＬ６３ (NC_005831)、ヒトコロナウイルスＯＣ４３ (NC_005147)、ヒトエンテロウイルスＡ (NC_001612)、ヒトエンテロウイルスＢ (NC_001472)、ヒトエンテロウイルスＣ (NC_001428)、ヒトエンテロウイルスＤ (NC_001430)、ヒトエリスロウイルスＶ９ (NC_004295)、ヒト泡沫状ウイルス (NC_001736)、ヒトヘルペスウイルス１ (単純ヘルペスウイルス１型) (NC_001806)、ヒトヘルペスウイルス２ (単純ヘルペスウイルス２型) (NC_001798)、ヒトヘルペスウイルス３ (水痘帯状疱疹ウイルス) (NC_001348)、ヒトヘルペスウイルス４１型 (エプスタインバーウイルス１型) (NC_007605)、ヒトヘルペスウイルス４２型 (エプスタインバーウイルス２型) (NC_009334)、ヒトヘルペスウイルス５株ＡＤ１６９ (NC_001347)、ヒトヘルペスウイルス５株マーリン株 (NC_006273)、ヒトヘルペスウイルス６Ａ (NC_001664)、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ (NC_000898)、ヒトヘルペスウイルス７ (NC_001716)、ヒトヘルペスウイルス８型Ｍ (NC_003409)、ヒトヘルペスウイルス８型Ｐ (NC_009333)、ヒト免疫不全ウイルス１ (NC_001802)、ヒト免疫不全ウイルス２ (NC_001722)、ヒトメタニューモウイルス (NC_004148)、ヒトパピローマウイルス−１ (NC_001356)、ヒトパピローマウイルス−１８ (NC_001357)、ヒトパピローマウイルス−２ (NC_001352)、ヒトパピローマウイルス−５４ (NC_001676)、ヒトパピローマウイルス−６１ (NC_001694)、ヒトパピローマウイルス−ｃａｎｄ９０ (NC_004104)、ヒトパピローマウイルスＲＴＲＸ７ (NC_004761)、ヒトパピローマウイルス１０型 (NC_001576)、ヒトパピローマウイルス１０１型 (NC_008189)、ヒトパピローマウイルス１０３型 (NC_008188)、ヒトパピローマウイルス１０７型 (NC_009239)、ヒトパピローマウイルス１６型 (NC_001526)、ヒトパピローマウイルス２４型 (NC_001683)、ヒトパピローマウイル２６型 (NC_001583)、ヒトパピローマウイルス３２型 (NC_001586)、ヒトパピローマウイルス３４型 (NC_001587)、ヒトパピローマウイルス４型 (NC_001457)、ヒトパピローマウイルス４１型 (NC_001354)、ヒトパピローマウイルス４８型 (NC_001690)、ヒトパピローマウイルス４９型 (NC_001591)、ヒトパピローマウイルス５型 (NC_001531)、ヒトパピローマウイルス５０型 (NC_001691)、ヒトパピローマウイルス５３型 (NC_001593)、ヒトパピローマウイルス６０型 (NC_001693)、ヒトパピローマウイルス６３型 (NC_001458)、ヒトパピローマウイルス６型ｂ (NC_001355)、ヒトパピローマウイルス７型 (NC_001595)、ヒトパピローマウイルス７１型 (NC_002644)、ヒトパピローマウイルス９型 (NC_001596)、ヒトパピローマウイルス９２型 (NC_004500)、ヒトパピローマウイルス９６型 (NC_005134)、ヒトパラインフルエンザウイルス１ (NC_003461)、ヒトパラインフルエンザウイルス２ (NC_003443)、ヒトパラインフルエンザウイルス３ (NC_001796)、ヒトパレコウイルス (NC_001897)、ヒトパルボウイルス４ (NC_007018)、ヒトパルボウイルスＢ１９ (NC_000883)、ヒト呼吸器多核体ウイルス (NC_001781)、ヒトライノウイルスＡ (NC_001617)、ヒトライノウイルスＢ (NC_001490)、ヒトスプマレトロウイルス (NC_001795)、ヒトリンパ球向性ウイルス１ (NC_001436)、ヒトリンパ球向性ウイルス２ (NC_001488) が挙げられる。

特定の例では、標的タンパク質は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）などの腫瘍ウイルスの核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）から産生される。他の例では、核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）から産生された標的タンパク質は、ヒト呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの病原体ウイルス由来である。

Ｄ．試料の調製
本発明に記載の組織試料は、当分野で既知の又は今後開発される任意の方法で調製されうる。一般に、組織試料は、組織を培地に固定し包理することにより調製される。

いくつかの例では、包理培地が使用される。包理培地とは、組織及び／又は細胞が埋め込まれ、これらを将来の分析のため保存するのに役立つ不活性物質である。包理はまた、組織試料をスライスし薄片にするのを可能にする。包理培地としては、限定ではなく、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ^ＴＭ化合物、寒天、プラスチック又はアクリルが挙げられる。

包理培地の多くは疎水性なので、主として親水性試薬を使用する組織又は細胞の解析に先立ち不活性物質を除去する必要がありうる。脱パラフィン化又は脱脂という用語は、ここで広義に使用され、生体試料から任意の種類の包理培地を部分的又は完全に除去することを意味する。例えば、パラフィン包理組織切片は、トルエン、キシレン、リモネンなどの有機溶媒又は他の適切な溶媒を通すことで脱脂される。

試料の固定プロセスは様々でありうる。組織試料を固定すると、細胞及び組織の成分がなるべく生きている状態に近い状態で保存され、大きな変化なく調製用の手順に供することができる。固定により、細胞死後に開始する自己融解と細菌による分解が停止され、細胞及び組織の成分が安定するので、次いでＩＨＣやＩＳＨなどの組織プロセス段階に耐えられる。

組織は、灌流や固定液中の浸漬など任意適切なプロセスにより固定されうる。固定液は、架橋剤（ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドなどのアルデヒド並びに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば四酸化オスミウム及びクロム酸などの金属イオン及び錯体）、タンパク質変性剤（例えば酢酸、メタノール及びエタノール）、未知の機構の固定液（例えば昇汞、アセトン及びピクリン酸）、併用剤（例えばカルノア固定液、メタカン、ブアン液、Ｂ５固定液、ロスマン液及びGendre液）、電子レンジ及び種々の固定液（例えば除体積固定及び蒸気固定）に分類される。バッファー、洗剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（塩化亜鉛、硫酸亜鉛及びリチウム塩など）及びランタンなどの添加物も固定液に含まれる。

ＩＨＣ用の試料調製で最も一般的に使用される固定液は、ホルムアルデヒドであり、通常ホルマリン液の形態をとる（緩衝液中４％のホルムアルデヒド、１０％緩衝ホルマリンと呼ばれる）。一例では、固定液は１０％中性緩衝ホルマリンである。

Ｅ．対比染色
対比染色とは、試料を１または複数の標的を検出するために薬剤で既に染色しその構造が顕微鏡下でより容易に視認できるようにした後の後処理法である。例えば、対比染料をカバーガラスをかける前に任意で用いて免疫組織化学的染色をより明瞭にする。対比染料は、一次染料とは異なる色である。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄなどの多くの対比染料が公知である。

いくつかの例では、１以上の染料を混ぜて対比染料を生成しうる。これは染料選択の柔軟性と能力を提供する。例えば、第１染料が特定の特定を有する混合物用に選択されうるが、別の所望の特性は持たない。第２染料が、所望の特性を欠いている混合物に添加されうる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ及びポンタミンスカイブルーが混合され対比染料を形成しうる。

Ｆ．画像法
開示の実施態様の特定の又は全ての態様は、自動化され、コンピューター解析及び／又は画像解析システムにより容易にされうる。いくつかの用途では、精密な色比率が測定される。いくつかの実施態様では、画像解析に光学顕微鏡を使用する。開示の特定の実施態様ではデジタル画像を取得する。これはデジタルカメラを顕微鏡に接続して行われうる。染色試料のデジタル画像は画像解析ソフトウェアを用いて解析される。色は複数の異なる方法で測定されうる。例えば、色は、赤、青及び緑の値、色相、彩度及び強度で、及び／又はスペクトル画像カメラを用いて特定の波長又は波長域を測定することにより、測定されうる。

開示の一実施態様は、発色性色素を用いる明視野画像法の使用を伴う。可視スペクトルの白色光が色素により透過される。色素は特定の波長の光を吸収し、他の波長を透過させる。こうして、透過される光の特定の波長により、光は白色から有色に変化する。

試料はまた、質的及び半定量的に評価されうる。質的評価としては、染色強度の評価、陽性染色細胞及び染色された細胞内区画の同定、及び全体的な試料又はスライドの質の評価が挙げられる。試験試料に対し別々の評価が実施され、この解析は、試料が異常状態を示しているかを決定するのに既知の平均値との比較を含みうる。

Ｇ．キット
開示の実施態様は、本発明の方法の様々な実施態様を実施するキットを一部提供する。このようなキットの例としては、コレステロール分析に有益なキット、妊娠判定キット、癌診断キットなどが挙げられる。いくつかの実施態様では、キットは、セクションＡに記載のとおりの処方のピリミジンアナログ及び／又はピリジンアナログを含む。

いくつかの実施態様では、キットは、西洋わさびペルオキシダーゼ又はグルタチオンペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素又はペルオキシダーゼなどの酵素を含む。いくつかの例では、キットは、標的分子に特異的に結合する抗体又は核酸などの特異的結合部分を含む。いくつかの例では、特異的結合部分と酵素は互いに結合する。

いくつかの実施態様では、キットは、沈着又は蛍光法を使用して検出されることができる検出可能な部分、又は酵素と反応後検出可能な部分を産生する酵素基質を含む。いくつかの例では、検出可能な部分はフルオロフォア（フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン又はローダミンなど）、ハプテン（オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ニトロアリール、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンなど）、タンパク質又は色素原（１,３-ジアミノベンジジン、３-アミノ-９-エチルカルバゾール又はテトラメチルベンジジンなど）である。キットは、任意で少なくとも１つの、例えばセクションＡに記載したような、ヘテロアリール化合物、Ｉ族又はＩＩ族の金属を含む塩、ホウ素含有化合物及びフェノール化合物などの任意のエンハンサーを含みうる。

いくつかの実施態様では、キットは、例えば水素ペルオキシドなどのペルオキシドなどの酸化剤を含む。

いくつかの実施態様では、キットは、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ツイーン（登録商標）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ及びトリトン^ＴＭなどの界面活性剤を含む。

いくつかの実施態様では、キットは、スズ酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム及び重硫酸ナトリウムから選択される抗酸化剤を含む。

いくつかの実施態様では、キットは、銅媒染剤を含む。キットは、抗体、ハプテンで標識されたプローブ及び色素原検出によりＩＨＣ及び／又はＩＳＨを実施するのに必要な他の試薬を含む、追加の成分を含みうる。このようなキットは、例えば、特定の患者の適切な治療を選択する補助として又は診断目的で臨床医又は医師が使用する場合がある。

特定の実施態様は、３％ Ｈ_２Ｏ_２；ＨＲＰが結合されたヤギ抗マウス／ウサギなどのユニバーサルマルチマーＨＲＰ；０．０３％ Ｈ_２Ｏ_２などのペルオキシド；ＤＡＢなどの色素原；及び銅媒染剤などの阻害剤を含むキットの使用に関する。このキットはｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭと呼ばれ、開示のエンハンサーと併用で使用されうる。

Ｈ．自動化された実施態様
当業者であれば、ここに開示された２つ以上の分子の発色検出法の実施態様が自動化されうることを理解されよう。ベンタナメディカルシステムズ社（Ventana Medical Systems, Inc.）は、自動解析のシステム及び方法を開示する米国特許第５，６５０，３２７号、５，６５４，２００号、６，２９６，８０９号、６，３５２，８６１号、６，８２７，９０１号及び６，９４３，０２９号、及び米国特許出願第２００３０２１１６３０号及び２００４００５２６８５号を含む数々の米国特許の譲受人である。手順の特定の実施態様は様々な自動化プロセスを用いて実施された。

ＶＩ．裏付けのある実施例
以下の実施例は、裏付けのある実施態様の特定の具体的な特性を説明するために提供される。本発明の精神は以下の実施例に例示される特性に限定されない。

実施例１
イミダゾールを用いるＩＨＣ組織染色
扁桃腺のｂｃｌ２のＩＨＣ染色がイミダゾールで増強されたｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＤＡＢ色素原を用いて実施された。イミダゾール（１０ｍＭ〜１００ｍＭ）はＤＡＢ染色強度を有意に増加させた（図１及び２参照）。しかし、所望のＤＡＢシグナルは増加したが観察されたバックグラウンドシグナルも増加した。イミダゾールの濃度を上げることは、再製剤化されたＤＡＢ色素原液からＤＡＢが析出する原因となり、両立しえない。

実施例２
エンハンサーの動的スクリーニング
実施例１で示したように、潜在的な化合物を独立してスクリーンし、観察される増強ＤＡＢ沈着をよりよく理解するために、プレートアッセイを行った。添加剤を、１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（VMSI 950-300）及び０．１％の魚類ゼラチン中ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットの必要な試薬（VMSI 760-500: 253-4290, 253-4292及び253-4293）を含むウェルに直接加えた。魚類ゼラチンは、酸化ＤＡＢを分散させ溶液からの析出を防ぐのに役立てるため使用した。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットを希釈し、ＵＶ−ＶＩＳにより４５５ｎｍで酸化ＤＡＢの形成を測定した。添加剤は、所定の濃度で試験しＤＡＢ酸化反応の増強を決定した。データをグラフ化し、見かけ最大速度（Ｖ_ｍａｘ）を各添加物濃度レベルで計算した。

４-アセチルアミドフェニルボロン酸及びイミダゾールの初回試験では、いずれかの添加剤の濃度が増加すると、ＨＲＰの反応速度が増加することが示された（それぞれ図３と図４を参照）。ＨＲＰ酸化ＤＡＢの見かけＶ_ｍａｘは、増強なしで１８．５ｍＯＤ／分であった。１０ｍＭのイミダゾールの添加により、見かけＶ_ｍａｘは５６％増加し、１０ｍＭの４-アセチルアミドフェニルボロン酸の添加により見かけＶ_ｍａｘは７７％増加した。（見かけＶ_ｍａｘ増加パーセント＝ [(増強Ｖ_ｍａｘ−ｕＶｉｅｗＶ_ｍａｘ）／ｕＶｉｅｗＶ_ｍａｘ]×１００％）。

以上の結果に鼓舞され、潜在的なエンハンサーとして使用されうる他のバッファーを検証した。イミダゾールアナログの概念的使用に加え、Ｌ-ヒスチジンに助長されるペルオキシド媒介酸化反応を検証した。５０ｍＭのＬ−ヒスチジンがＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘを１３８％増加させた（図５参照）。イミダゾールの高濃度と同様、５０ｍＭのＬ-ヒスチジンも再製剤化されたＤＡＢ色素原液からのＤＡＢ析出をもたらした。１０ｍＭのＬ-ヒスチジン濃度をＤＡＢ再製剤で使用した。ＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘは１０ｍＭのＬ-ヒスチジンで１８％増加した。ホウ酸塩バッファーも試験した。ホウ酸の緩衝能は、ホウ酸の有効ｐＨバッファー範囲が約８．５から約１０．２なので、ＤＡＢ製剤の所望のｐＨ範囲（可変ｐＨ範囲は約１から約７．９、最終ｐＨは約２から約３の範囲）ではない。１０ｍＭのホウ酸添加ではＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘは２６５％増加したが、５０ｍＭでは、ホウ酸はＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘを５９２％と大きく増強した（図６参照）。

ＨＲＰの見かけ速度をさらに増加しうる新たなクラスのエンハンサーを発見するため、他のヘテロ環化合物を検証した。ピリミジンアナログが新規クラスのエンハンサーとなることが発見された。ＨＲＰ媒介ＤＡＢ酸化の全てのエンハンサーのアッセイ結果のサマリーが表１に示される。

酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。（Ｓａｔ）＝反応速度はＵＶ−ＶＩＳ解析の開始により飽和した。（Ｓｏｌ）＝溶解性の問題が室温で生じた。反応バッファー中添加物を溶解するのに加熱が必要であった。（１）添加物は室温では溶解しなかった。

１０ｍＭのピリミジンの添加でＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘは４６２％と大きく増加した。このＤＡＢ酸化の見かけ速度の増加は、他のヘテロ環エンハンサー（イミダゾール、チアゾール及びオキサゾールのコア構造）で観察されたより大きかった。ピリミジン濃度を５０ｍＭに増加すると、ＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘは、１０ｍＭに対し、緩やかに増加した（５７０％）（図７参照）。ＤＡＢ色素原とピリミジンの再製剤は、高蒸気圧による潜在的な問題を呈する（ｂｐ≒１２４℃）。従って、揮発性の問題のない適切な代替物を探すため他のピリミジンアナログを検証した。

ピリミジンヌクレオチド塩基（チミン、ウラシル及びシトシン）はＨＲＰの見かけ速度を増加させたが、水性バッファー中で可溶性の問題がある。２-ヒドロキシピリミジン（図８参照）とピリミジン-Ｎ-オキシドはいずれもピリミジンと類似の速度又はより早い見かけ速度を提供し、可溶性や揮発性の問題がないことが見いだされた。５または６員ヘテロ環Ｎ-オキシドは、少糖及び多糖両方のＨＲＰベースの酸化、すなわちセルロースの酸化の見かけ速度を増加させることが先に示されている。ＤＡＢとピリミジン-Ｎ-オキシドの再製剤は、時間の経過と共に機能性を失い、染色を中止した。しかし、ピリミジン-Ｎ-オキシドは、組織のＨＲＰ媒介酸化反応に添加される場合は、増強液中でなお役に立つ。ピリミジンに加えて、１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンは、ＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘを増加させた（１５７％）。ベンズイミダゾール、メチレンブルー、フェノチアジ及び４-ジメチルアミノピリジンでは増強されなかった。

実施例３
エンハンサーに対する相乗効果と拮抗効果
実施例２のプレートアッセイを用いて、各添加剤がＨＲＰ媒介ＤＡＢ酸化の見かけ速度に及ぼす潜在的な相乗効果と拮抗効果を検証した。各トライアルでは、同じ濃度のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットの試薬（VMSI 760-500: 253-4290, 253- 4292 及び 253-4293）が０．１％の魚類ゼラチンを含む１×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ^ＴＭ中使用された。各トライアルでは、エンハンサーは１つずつ添加された。結果を図９と表２に要約する。

酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。（ＮＭＯ＝４-メチル-モルホリンＮ-オキシド）。

表１で先に示したように、１０ｍＭのホウ酸は、ＨＲＰの見かけ速度を２６５％増加させた。塩化カルシウムをＨＲＰアッセイに添加するとＨＲＰの安定性と見かけ速度が増加することが示された。１０ｍＭの塩化カルシウムと１０ｍＭのホウ酸の両方を１０ｍＭのイミダゾールを含むアッセイに添加すると、相乗的にＨＲＰの見かけ速度が増加した。

モルホリン-Ｎ-オキシドはＨＲＰ反応の見かけ速度を増加させたが（表１参照）、アッセイ混合物４に添加すると（表２、エントリー５参照）拮抗効果が観察された。５０ｍＭのＬ-ヒスチジン又は１０ｍＭのピリミジンのいずれかを反応混合物５に添加すると（表２、エントリー６及び７）ＨＲＰの見かけ速度は増加した。これらのデータは、増強液中のＮ-オキシドの使用のスクリーニングを支持する。ピリミジンＮ-オキシドはＬ-ヒスチジンとの併用でＩＨＣ組織染色におけるＤＡＢ沈着を増大させうる（図１１参照）。

実施例４
エンハンサーを用いてのＩＨＣ組織染色
増強されたＤＡＢ色素原液を用いて扁桃組織のｂｃｌ２にＩＨＣ染色を行い、ＤＡＢ沈着に及ぼすエンハンサーの相乗効果を検証した。ＩＨＣ染色の病理学的スコアリングサマリーを表３に示す。リーダー１は同期間内に全ての病理学的評価を行った。リーダー２はスライドが最初に産生されたときバッチで評価を行い、スコアリングに多少の変動性をもたらしている。

新規の塩基バッファーの全組成物は、５．５ｍＭの３,３-ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ・４ＨＣＩ）及び０．０５％ｗｔのＢｒｉｊ（登録商標）３５（ペルオキシダーゼなし）を含有する。[塩基１：５０ｍＭのＬ-ヒスチジン（ｐＨ＝６．５）；塩基２：１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ＝６．５）；塩基３：２．４３ｍＭのクエン酸、５．１３ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝５．３）；塩基４：１０ｍＭのＬ-ヒスチジン（ｐＨ＝６．５）；塩基４ａ：１０ｍＭのＬ-ヒスチジン（ｐＨ＝６．５）、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸]

２つの一般的観察が注目された。第１に、ＤＡＢのＨＲＰ沈着の見かけ速度の最大の増強が２〜３のエンハンサー成分の組合せを通じて得られた。追加のエンハンサーは組織の最強のＤＡＢ染色のシグナル強度を増加しなかったが、最高のシグナル強度で染色された細胞の百分率は組織全体で増加した。この観察は、主として、組織のＨＲＰ−ＤＡＢ酸化反応により観察された代謝回転の限定的な数に起因した。第２に、プレートアッセイでのＨＲＰ媒介ＤＡＢ酸化を増加させたエンハンサーは、組織上でＤＡＢをよりはっきりと沈着させた。ＤＡＢ沈着は一般にあまり拡散しない。

１０ｍＭのイミダゾール又は１０ｍＭのＬ-ヒスチジンのいずれかと０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５で製剤した５．５ｍＭのＤＡＢ液を使用してのｂｃｌ２（扁桃腺）のＩＨＣ染色を図１０と１１に示す。１０ｍＭのＬ-ヒスチジンを用いてのＤＡＢ染色の病理学的評価では、１０ｍＭのイミダゾールで得られるのと同様の強度が認められた。

１０ｍＭのＬ-ヒスチジン中１０ｍＭのピリミジン-Ｎ-オキシド又は１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンのいずれかと０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５で製剤した５．５ｍＭのＤＡＢ液を使用しての組織染色を図１２と１３に示す。両エンハンサー液を用いてのＤＡＢ染色の病理学的評価では、ピリミジン-Ｎ-オキシドが２つのエンハンサーで最高のＤＡＢシグナル対バックグラウンドノイズ比を提供した。

扁桃組織のｂｃｌ２のＩＨＣ染色を、標準的なｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットに「増強液」を追加したものを使用して評価した。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ検出キットの試薬の濃度は、増強液の希釈を補償するのに補正しなかった（図１４〜１７参照）。５０ｍＭのＬ−ヒスチジン及び１０ｍＭのピリミジン（図１６）を、表３に示すとおり好ましいＤＡＢ染色として病理学的リーダー１で選んだ。１００ｍＭのイミダゾール及び５０ｍＭのホウ酸はＤＡＢ沈着を増加させたが、ＤＡＢシグナルのダイナミックレンジを低減させ、血清バックグラウンドを増加させた。低濃度のエンハンサーはＤＡＢシグナルのダイナミックレンジを増加させよう。１０ｍＭのＬ-ヒスチジン、１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸の溶液は、ＤＡＢ液を再製剤化する際低いＤＡＢシグナルを示した（表３の最終行）。１０ｍＭのピリミジン-Ｎ-オキシドは増強液の筆頭候補である。

実施例５
ミカエリスメンテン速度式
ＨＲＰ酸化ＤＡＢの増加した見かけＶ_ｍａｘにおける相乗効果をさらに調査するため、表３の最大増強ＤＡＢ色素原混合物のミカエリスメンテン速度式を計算した。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＨＲＰマルチマーの１：３２希釈液をＨＲＰの見かけ速度を飽和させるため水素ペルオキシドの可変濃度（０．０１５μＭ〜０．５１４μＭ）と反応させた。当初、イミダゾール及びＬ-ヒスチジンの両方を１０ｍＭのピリミジン（図１８参照）及び１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジン（図１９参照）を用いて検証した。１／２Ｖ_ｍａｘで類似のＫ_ｍ値が計算されたが、イミダゾールでＬ-ヒスチジンより高い見かけＶ_ｍａｘが得られた（表４参照）。酵素基質の濃度が飽和レベルである場合、Ｖ_ｍａｘの定義＝ｋ_ｃａｔ・[Ｅ]_トータルである。酵素の濃度が一定である場合、見かけＶ_ｍａｘはｋ_ｃａｔに比例した（ＨＲＰの見かけ代謝回転又は一次速度定数）。イミダゾールはＨＲＰの見かけ代謝回転をＬ-ヒスチジンよりも増加させた。

Ｋ_ｍは１／２Ｖ_ｍａｘで決定した。

エンハンサーを有するイミダゾールＤＡＢ色素原液のＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘに及ぼす影響をスクリーンした（図２０及び表４参照）。５０ｍＭのイミダゾールを使用しＤＡＢ酸化をより増大させた。ＨＲＰの見かけ代謝回転に及ぼす増強効果は、１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン＞１０ｍＭのピリミジン-Ｎ-オキシド＞５０ｍＭのピリミジン＞１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンであった。これらの結果は表３で述べた観察された染色強度と一致した。

表４のＤＡＢ色素原液を使用し、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＨＲＰマルチマー（0.27 pg - 68.8 pg）の可変濃度を使用してプレートアッセイを実施した。見かけＶ_ｍａｘをモニターし、増強なしの反応に対する見かけＶ_ｍａｘの増加又は減少のパーセントとしてデータが報告された（表５参照）。ＨＲＰの濃度が低下するとＨＲＰの見かけＶ_ｍａｘの増加が観察された。変化の大きさはＨＲＰの低濃度で増加した。これらのデータは、イミダゾールでＬ-ヒスチジンより大きい見かけＶ_ｍａｘが得られた表４の結果を裏付けた。

酸化ＤＡＢの光学密度は４５５ｎｍでモニターした。[エンハンサー：（Ａ）＝１０ｍＭのピリミジン；（Ｂ）＝１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジン、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸；（Ｃ）＝１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸；（Ｄ）＝１０ｍＭのピリミジン-Ｎ-オキシド、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭのホウ酸]

実施例６
エンハンサーを用いてのＩＳＨ組織染色
増強ＤＡＢ液を用いてＩＳＨ組織染色を検証した。ＨＥＲ-２陽性含細胞株ＣａＬｕ３、ＺＲ−７５−１及びＭＣＦ７のＨＥＲ-２ スリーインワンマウス異種移植片をＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ（VMSI 480-4495）で処理し、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ色素原液又は１０ｍＭのＬ-ヒスチジン含有の増強ＤＡＢ色素原液で染色した（図２１〜２２参照）。１０ｍＭのＬ-ヒスチジンは、ＨＥＲ２を過剰発現しているＣａＬｕ３癌細胞のＩＳＨ染色でＤＡＢ沈着を増加させた。ＤＡＢ沈着増加は最強のＩＳＨシグナルではわずかであるが、弱いＤＡＢシグナルのシグナル強度は組織全体で上昇した。同様の観察がＩＨＣの増強ＤＡＢ沈着でなされた。

実施例７
エンハンサーを用いてのＴＳＡ組織染色
扁桃組織のｂｃｌ２のＴＳＡ−ＩＨＣ組織染色の増強ＤＡＢ沈着を評価した。ｂｃｌ２抗原を、ｂｃｌ２一次抗体を１６分間のインキュベート後４分間のＴＡ−ＨＱ沈着を用いてＴＳＡで染色した。チラミド沈着を１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンを用いて又は用いないで実施した。ＤＡＢ沈着をｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢ色素原液又は１０ｍＭのＬ-ヒスチジン含有の増強ＤＡＢ色素原液を用いて実施した（図２３〜２６参照）。１０ｍＭのＬ-ヒスチジンは組織上のＤＡＢ沈着を増加させた。

同時研究では、ｂｃｌ２抗原を、ｂｃｌ２一次抗体を８分間のインキュベート後４分間のＴＡ−ＨＱ沈着を用いてＴＳＡで染色した（図２７及び２８参照）。１０ｍＭの２-ヒドロキシピリミジンはチラミド沈着を増加させ、従ってＤＡＢ沈着が増加した。ＤＡＢで染色された細胞パーセントは、ｂｃｌ２抗原の低発現の部位で増加した。

実施例８
１８ｓリボプローブ染色
ホルマリン固定パラフィン包理ＣａＬｕ−３異種移植片組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）スライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＲｉｂｏＣｌｅａｒ^ＴＭ変性剤（RiboMap（登録商標）キットのコンポーネント、Ventana（登録商標）p/n 760-102）を１２分間のインキュベーションに、ＣＣ２試薬（Ventana（登録商標）p/n 950-123）、及びプロテアーゼ３を８分間のインキュベーション（Ventana（登録商標）p/n 760-2020）に用いて抗原を回収した。回収に次いでＮＰハプテン化アンチセンス又はセンス鎖１８ｓプローブを２滴スライドに分注し、８０℃で８分間変性させ、６５℃で６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、スライドを０．１×ＳＳＣを用いて７５℃で８分間３回洗浄し、各ＮＰハプテン化プローブを５μｇのマウス抗ＨＰ ＨＲＰコンジュゲート、次いで１００μＬの各５５μＬのチラミド−ＨＱコンジュゲートとＨ_２Ｏ_２（ultraView^TMDABキットVentana（登録商標） p/n 760-500のコンポーネント）を用いて検出し、１２分間インキュベートした。沈着したチラミド−ＨＱを０．５μｇのマウス抗ＨＱ ＨＲＰコンジュゲート、次いで１滴のＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；１０ｍＭのＬ-ヒスチジン；１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン）とＨ_２Ｏ_２を用いてスライド上で８分間インキュベートして検出した。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した。エンハンサー処理した試料とｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ試料の比較を図２９と３０に示す。

実施例９
ＨＰＶ染色
ホルマリン固定パラフィン包理Ｃ３３、ＨｅＬａ及びＣａＳｋｉ異種移植片組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ２試薬（Ventana（登録商標）p/n 950-123）及びプロテアーゼ３を８分間のインキュベーション（Ventana（登録商標）p/n 760-2020）に用いて抗原を回収した。回収に次いで、３滴（３００μＬ）のＳＩＳＨ Ｈｙｂバッファー（ultraView^TM SISH検出キットp/n 780-001のコンポーネント）及び３滴のＤＩＧハプテン化ＨＰＶプローブをスライドに分注し、７５℃で８分間インキュベートし、４４℃で６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、スライドを０．１×ＳＳＣを用いて６４℃で８分間３回洗浄した。ＤＩＧハプテン化プローブを３μｇのマウス抗ＤＩＧ ＨＲＰコンジュゲート、次いでＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；１０ｍＭのＬ-ヒスチジン；１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン）とＨ_２Ｏ_２（ultraView^TMDABキットVentana p/n 760-500のコンポーネント）を用いてスライド上で８分間インキュベートして検出した。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した。エンハンサー処理した試料とｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ試料の比較を図３１対図３２、図３３対図３４及び図３５対図３６にそれぞれ示す。

実施例１０
ＣＤ２０のＤＡＢ染色
ホルマリン固定パラフィン包理の扁桃組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ１バルク試薬（Ventana（登録商標） p/n 950-124）を用いて抗原を回収した。回収に次いで、１滴（１００μＬ）のＵＶ阻害剤（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）をスライドに分注し、８分間インキュベートした。阻害剤のインキュベーションに次いで、１滴のマウス抗ＣＤ２０（クローンL-26; Ventana（登録商標） p/n 760-2531）をスライド上に分注し、１６分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、ＣＤ２０抗体を１滴のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＨＲＰコンジュゲート（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）を用いて検出し、スライド上で８分間インキュベートした。１滴のＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；１０ｍＭのＬ-ヒスチジン；１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン）とＨ_２Ｏ_２をそれぞれスライドに加え、８分間インキュベートした。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した。エンハンサー処理した試料とｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ試料の比較を図３７と３８にそれぞれ示す。

実施例１１
ＣＤ２０及びＫｉ-６７のＡＥＣ染色
ホルマリン固定パラフィン包理の扁桃組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ１バルク試薬（Ventana（登録商標） p/n 950-124）を用いて抗原を回収した。回収に次いで、１滴（１００μＬ）の阻害剤（ＡＥＣキット Ventana（登録商標） p/n 760-020）をスライドに分注し、８分間インキュベートした。阻害剤のインキュベーションに次いで、１滴のマウス抗ＣＤ２０（クローンL-26; Ventana（登録商標） p/n 760-2531）又はウサギ抗Ｋｉ６７（クローン30-9; Ventana（登録商標） p/n 790-4286）をスライド上に分注し、１６分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、抗体を１滴のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＨＲＰコンジュゲート（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）を用いて検出し、スライド上で８分間インキュベートした。５０ｍＭのＬ-ヒスチジンｐＨ６．５及び１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンを含む増強液１滴を加え、ＡＥＣとＨ_２Ｏ_２各１滴ずつと共にインキュベートし、８分間インキュベートした。一切増強なしのＡＥＣ色素原で染色したスライドを参照として使用した。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを空気乾燥させ、水性マウント媒体を用いてカバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した。エンハンサー処理した試料とｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭ試料の比較を図３９対図４０及び図４１対図４２にそれぞれ示す。

実施例１２
Ｂｃｌ-２のＤＡＢ染色
ホルマリン固定パラフィン包理の扁桃組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ１バルク試薬（Ventana（登録商標） p/n 950-124）を用いて抗原を回収した。回収に次いで、１滴（１００μＬ）のＵＶ阻害剤（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）をスライドに分注し、８分間インキュベートした。阻害剤のインキュベーションに次いで、１滴のマウス抗ｂｃｌ２（クローン124; Ventana（登録商標） p/n 790-4464）をスライド上に分注し、１６分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、ｂｃｌ２抗体を１滴のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＨＲＰコンジュゲート（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）を用いて検出し、スライド上で８分間インキュベートした。１滴のＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；プラス表３で調査した任意のエンハンサーの組合せ）とＨ_２Ｏ_２をそれぞれスライドに加え、８分間インキュベートした。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した。

実施例１３
Ｂｃｌ-２−ＴＳＡ−ＨＱのＤＡＢ染色
ホルマリン固定パラフィン包理の扁桃組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ１バルク試薬（Ventana（登録商標） p/n 950-124）を用いて抗原を回収した。回収に次いで、１滴（１００μＬ）のＵＶ阻害剤（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）をスライドに分注し、８分間インキュベートした。阻害剤のインキュベーションに次いで、１滴のマウス抗ｂｃｌ２（クローン124; Ventana（登録商標） p/n 790-4464）をスライド上に分注し、１６分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、ｂｃｌ２抗体を１滴のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＨＲＰコンジュゲート（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）を用いて検出し、スライド上で８分間インキュベートした。１００μＬの各５５μＬの１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンを有する又は有さないチラミド−ＨＱコンジュゲートとＨ_２Ｏ_２（ultraView^TMDABキットVentana（登録商標） p/n 760-500のコンポーネント）を用いて検出し、１２分間インキュベートした。沈着したチラミド−ＨＱを、０．５μｇのマウス抗ＨＱ ＨＲＰコンジュゲート、次いで１滴のＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；１０ｍＭのＬ-ヒスチジン）とＨ_２Ｏ_２を用いて検出し、８分間インキュベートした。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した（図２３〜２６）。

実施例１４
Ｂｃｌ-２−ＴＳＡ−ＮＰのＤＡＢ染色
ホルマリン固定パラフィン包理の扁桃組織をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、脱パラフィン化し、ＣＣ１バルク試薬（Ventana（登録商標） p/n 950-124）を用いて抗原を回収した。回収に次いで、１滴（１００μＬ）のＵＶ阻害剤（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）をスライドに分注し、８分間インキュベートした。阻害剤のインキュベーションに次いで、１滴のマウス抗ｂｃｌ２（クローン124; Ventana（登録商標） p/n 790-4464）、１：３００希釈液をスライド上に分注し、１６分間インキュベートした。反応バッファーで２回すすいだ後、ｂｃｌ２抗体を１滴のｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭユニバーサルＨＲＰコンジュゲート（ultraView^TM DABキットのコンポーネント）を用いて検出し、スライド上で８分間インキュベートした。１００μＬの各５ｕＭの１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジンを有する又は有さないチラミド−ＮＰとＨ_２Ｏ_２（ultraView^TMDABキットVentana（登録商標） p/n 760-500のコンポーネント）及び１２分間インキュベートした。沈着したチラミド−ＨＱを、０．５μｇのマウス抗ＮＰ ＨＲＰコンジュゲート、次いで１滴のＤＡＢ（５．５ｍＭのＤＡＢ；０．０５％のＢｒｉｊ（登録商標）３５；１０ｍＭのＬ-ヒスチジン；１０ｍＭの２-ヒドロキシピリジン）とＨ_２Ｏ_２を用いて検出し、８分間インキュベートした。参照としてｕｌｔｒａＶｉｅｗ^ＴＭＤＡＢを使用した。スライドを反応バッファー中ですすいだ後、１００μＬの銅（ultraView^TMDABキットのコンポーネント）をスライドに４分間加えた。スライドをヘマトキシリンＩＩ（Ventana（登録商標） p/n 790-2208）とＢｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ventana（登録商標） p/n 760-2037）を用いて対比染色した。スライドを勾配アルコールを用いて脱水し、カバーガラスをかけ、明視野顕微鏡を使用して観察した（図４３〜４６）。

開示の発明の原理が適用されうる多くの可能な実施態様に鑑み、例示の実施態様は本発明の単なる好ましい例であって、本発明の範囲を限定するものととらえてはならないことを理解されたい。むしろ、本発明の範囲は以下の請求項により定義される。従って、我々は、これらの請求項の範囲と精神の及ぶ全てを我々の発明として請求する。

Claims (33)

1. 近位にマーカーを沈着させることにより試料中の標的を検出するための組成物であって、
   式
   

   

   ［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、Ｃ _１−１０ 脂肪族、ハロゲン、ヒドロキシル及び水素より独立して選択され；Ｒ^５はヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］であり；Ａは炭素、イオウを除くヘテロ原子又はそれらの任意の組合せであり；ｎは１〜５である］
   を有するピリミジン及び／又はピリジン沈着エンハンサー；
   第二の沈着エンハンサー；及び
   酵素基質、を含む組成物。
2. 第二の沈着エンハンサーが式
   

   

   ［Ａは炭素、イオウ以外のヘテロ原子又はそれらの任意の組み合わせであり；Ｂは酸素、炭素又は窒素であり；Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１は独立して、脂肪族、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、水素又はそれらの任意の組合せである］
   を有する、請求項１に記載の組成物。
3. Ａは炭素であり、Ｂは窒素である、請求項２に記載の組成物。
4. 第二の沈着エンハンサーが、イミダゾール、Ｌ-ヒスチジン、チアゾール、オキサゾール又はそれらの任意の組合せから選択される、請求項１に記載の組成物。
5. 第二の沈着エンハンサーが、式
   

   

   又は
   

   

   ［Ａは炭素、窒素、酸素又はそれらの任意の組み合わせであり；Ｒ^１２〜Ｒ^２３は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、水素又はそれらの任意の組合せである］
   を有する、請求項１に記載の組成物。
6. Ｒ^２２が、[Ｏ]^・又は[Ｏ]⁻である、請求項５に記載の組成物。
7. 第二の沈着エンハンサーが、ピリミジンＮ-オキシド、ピリジンＮ-オキシド、Ｎ-メチルモルホリン（ＮＭＯ）及び２,２,６,６-テトラメチルピペリジン-１-オキシル（ＴＥＭＰＯ）である、請求項５に記載の組成物。
8. 第二の沈着エンハンサーが、有機又は無機ボロン酸である、請求項１に記載の組成物。
9. 第二の沈着エンハンサーが、式
   

   

   ［Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６は独立して脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］
   を有する、請求項８に記載の組成物。
10. Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６の２以上はヒドロキシルであり、残りのＲ^２４、Ｒ^２５又はＲ^２６は脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族又はヘテロアリールである、請求項９に記載の組成物。
11. 有機ボロン酸がホウ酸、フェニルボロン酸、４-ＡｃＨＮ-フェニルボロン酸又はそれらの任意の組合せである、請求項８に記載の組成物。
12. 第二の沈着エンハンサーが、式
    

    

    ［Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１は独立して水素、脂肪族、アリール、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、ハロゲン又はそれらの任意の組合せである］
    を有するフェノール化合物である、請求項１に記載の組成物。
13. Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１から選択される２つの隣接基が、縮合した芳香又は非芳香環系を形成する、請求項１２に記載の組成物。
14. Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１の少なくとも１つがヒドロキシルである、請求項１２に記載の組成物。
15. フェノール化合物がピロカテコールである、請求項１２に記載の組成物。
16. 第二の沈着エンハンサーが、式
    

    

    ［Ａは炭素、イオウを除くヘテロ原子及びそれらの組合せであり；Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は脂肪族、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］及び水素より選択され；Ｒ^１及び／又はＲ^３はＲ^２と結合して縮合した芳香環系を形成してよい］
    を有する、請求項１に記載の組成物。
17. 酵素基質が、１,３-ジアミノベンジジン、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、テトラメチルベンジジン、フルオレセイン、ルミノフォア、クマリン、ボディパイ色素、レゾルフィン、ローダミン又はそれらの誘導体より選択される、請求項１に記載の組成物。
18. 沈着エンハンサーが、ピリジン、２-ヒドロキシピリジン、ピリミジン又は２-ヒドロキシピリミジンから選択される、請求項１に記載の組成物。
19. 近位にマーカーを沈着させることにより試料中の標的を検出するための方法であって、
    試料を標的に特異的な特異的結合部分を含む識別液と接触させることと；
    特異的結合部分を酵素で標識することと；
    式
    

    

    ［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は独立してＣ _１−１０ 脂肪族、ハロゲン、ヒドロキシル及び水素より選択され；Ｒ^５はヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］であり；Ａは炭素、イオウを除くヘテロ原子又はそれらの任意の組合せであり；ｎは１〜５である］
    を有する第一の沈着エンハンサーと、第二の沈着エンハンサーとの存在下で、標的の近位にマーカーが沈着するように、試料を酵素基質を含む検出液と接触させることと；
    マーカーを検出することと、を含む方法。
20. 第二の沈着エンハンサーが式
    

    

    ［Ａは炭素、イオウ以外のヘテロ原子又はそれらの任意の組み合わせであり；Ｂは酸素、炭素又は窒素であり；Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１は独立して、脂肪族、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、水素又はそれらの任意の組合せである］
    を有する、請求項１９に記載の方法。
21. Ａは炭素であり、Ｂは窒素である、請求項２０に記載の方法。
22. 第二の沈着エンハンサーが、イミダゾール、Ｌ-ヒスチジン、チアゾール、オキサゾール又はそれらの任意の組合せから選択される、請求項１９に記載の方法。
23. 第二の沈着エンハンサーが、式
    

    

    又は
    

    

    ［Ａは炭素、窒素、酸素又はそれらの任意の組み合わせであり；Ｒ^１２〜Ｒ^２３は独立して脂肪族、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、水素又はそれらの任意の組合せである］
    を有する、請求項１９に記載の方法。
24. Ｒ^２２が、[Ｏ]^・又は[Ｏ]⁻である、請求項２３に記載の方法。
25. 第二の沈着エンハンサーが、ピリミジンＮ-オキシド、ピリジンＮ-オキシド、Ｎ-メチルモルホリン（ＮＭＯ）及び２,２,６,６-テトラメチルピペリジン-１-オキシル（ＴＥＭＰＯ）である、請求項２３に記載の方法。
26. 第二の沈着エンハンサーが、有機又は無機ボロン酸である、請求項１９に記載の方法。
27. 第二の沈着エンハンサーが、式
    

    

    ［Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６は独立して脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］
    を有する、請求項２６に記載の方法。
28. Ｒ^２４、Ｒ^２５及びＲ^２６の２以上はヒドロキシルであり、残りのＲ^２４、Ｒ^２５又はＲ^２６は脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族又はヘテロアリールである、請求項２７に記載の方法。
29. 第二の沈着エンハンサーが、ホウ酸、フェニルボロン酸、４-ＡｃＨＮ-フェニルボロン酸又はそれらの任意の組合せである、請求項２６に記載の方法。
30. 第二の沈着エンハンサーが、式
    

    

    ［Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１は独立して水素、脂肪族、アリール、ヒドロキシル、エーテル、シリルエーテル、エステル、カルボン酸、シリル、ホスホン酸、ホスフィン、アミド又はＮＲ ^６ Ｒ ^７ ［Ｒ ^６ 及びＲ ^７ は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、ヘテロアリール又はそれらの任意の組合せである］、ハロゲン又はそれらの任意の組合せである］
    を有するフェノール化合物である、請求項１９に記載の方法。
31. ２つの隣接するＲ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１基が、縮合した芳香又は非芳香環系を形成する、請求項３０に記載の方法。
32. Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０及びＲ^３１の少なくとも１つがヒドロキシルである、請求項３０に記載の方法。
33. 第二の沈着エンハンサーがピロカテコールである、請求項３０に記載の方法。

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