ES2593464T3 - Deposición potenciada de cromógenos utilizando análogos de pirimidina - Google Patents

Deposición potenciada de cromógenos utilizando análogos de pirimidina Download PDF

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Abstract

Un método para detectar una diana en una muestra por deposición proximal de un marcador, que comprende: poner en contacto la muestra con una solución de reconocimiento, incluyendo la solución de reconocimiento un resto de unión específica que es específico para la diana; marcar el resto de unión específica con una enzima; poner en contacto la muestra con una solución de detección, comprendiendo la solución de detección un sustrato enzimático de modo que el marcador se deposite de forma proximal a la diana en presencia de un potenciador de deposición que tiene una fórmula**Fórmula** en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de grupo alifático, arilo, halógeno, un resto que contiene heteroátomo e hidrógeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromático condensado; A se selecciona de un átomo de carbono, un heteroátomo diferente de azufre y cualquier combinación de los mismos; y detectar el marcador.

Description

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DESCRIPCION
Deposicion potenciada de cromogenos utilizando analogos de pirimidina Campo
Esta descripcion se refiere a novedosas composiciones que contienen analogos de pirimidina para su uso en el aumento de la deposicion de restos detectables sobre moleculas diana en un tejido.
Antecedentes
Los metodos de tincion celular, incluyendo inmunohistoqmmica (IHC) y analisis de hibridacion in situ (ISH), son herramientas utiles en diagnostico histologico y el estudio de la morfologfa tisular. IHC emplea agentes o restos de union espedfica, tales como anticuerpos, para detectar un antigeno de interes que puede estar presente en una muestra tisular. IHC se usa ampliamente en aplicaciones clmicas y de diagnostico, tales como para diagnosticar patologfas o afecciones particulares. Por ejemplo, pueden diagnosticarse tipos particulares de cancer basandose en la presencia de una molecula marcadora particular en una muestra obtenida de un sujeto. IHC se usa tambien ampliamente en investigacion basica para comprender la distribucion y localizacion de biomarcadores en diferentes tejidos. Las muestras biologicas tambien pueden examinarse usando tecnicas de hibridacion in situ, tales como hibridacion in situ con plata (SISH), hibridacion in situ cromogenica (CISH) e hibridacion in situ de fluorescencia (FISH), colectivamente mencionadas como ISH. ISH es distinta de IHC, en que ISH detecta acidos nucleicos en tejido mientras que IHC detecta protemas.
Para ensayos in situ tales como ensayos IHC y ensayos ISH de muestras tisulares y citologicas, especialmente ensayos combinados de dichas muestras, es muy deseable identificar y desarrollar metodos que proporcionen resultados deseables sin interferencia del fondo. Uno de dichos metodos implica el uso de amplificacion de senal de tiramida (TSA), que se basa en la deposicion de indicador catalizado (CARD), patentada. La patente de Estados Unidos n.° 6.593.100, titulada " Enhanced catalyzed reporter deposition" describe la potenciacion de la catalisis de una enzima en un metodo CARD o TSA haciendo reaccionar un conjugado de fenol marcado con una enzima, donde la reaccion se realiza en presencia de un reactivo potenciador.
Aunque se han empleado metodos, tales como los descritos anteriormente, para aumentar las senales obtenidas desde los ensayos, los resultados de estos metodos indican que la amplificacion de la senal se altera por la amplificacion correspondiente de la senal de fondo. Por tanto, existe la necesidad continuada de amplificacion de senales que pueda producir resultados optimos sin un aumento correspondiente en las senales de fondo.
Sumario
La presente descripcion se refiere a un metodo para detectar una diana en una muestra depositando de forma proximal un marcador, que comprende: poner en contacto la muestra con una solucion de reconocimiento, incluyendo la solucion de reconocimiento un resto de union espedfica que es espedfico para la diana; marcar el resto de union espedfica con una enzima; poner en contacto la muestra con una solucion de deteccion, comprendiendo la solucion de deteccion un sustrato enzimatico de modo que el marcador se deposite de forma proximal a la diana en presencia de un potenciador de deposicion que tiene una formula
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R2
'R3
en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado; A se selecciona de un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre y cualquier combinacion de los mismos. Con referencia a este metodo, el contacto de la muestra con una solucion de deteccion puede incluir oxidar enzimaticamente el sustrato enzimatico usando un agente oxidante para formar el marcador. En realizaciones descritas particulares, la oxidacion enzimatica del sustrato enzimatico usando un agente oxidante comprende reducir la solubilidad o estabilidad del sustrato enzimatico de modo que el sustrato enzimatico quede depositado como el marcador.
En realizaciones descritas particulares, el sustrato enzimatico se selecciona del grupo que consiste en un cromogeno y un conjugado con tiramida y el potenciador de deposicion puede tener una formula,
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a-n'-a
R2
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en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan de hidrogeno e hidroxilo y cada A es un atomo de carbono. En ciertas realizaciones descritas R1, R3 y R4 son hidrogeno y R2 es hidroxilo.
Otros ejemplos del potenciador de deposicion incluyen aquellos que tienen una formula,
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N
II
R
,A
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R2
'R3
en la que R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de alquilo, alqueno, alquino, hidrogeno, yodo, bromo, cloro, fluor y combinaciones de los mismos.
Realizaciones descritas particulares se refieren al uso de una enzima que puede ser una oxidorreductasa o una peroxidasa. Adicionalmente, la enzima puede seleccionarse de peroxidasa de rabano rusticano, glutation peroxidasa y microoxidasa. El resto de union espedfica descrito tfpicamente comprende un anticuerpo o un acido nucleico.
Con referencia al metodo descrito, la deposicion del marcador de forma proximal a la diana en presencia del potenciador de deposicion incluye el potenciador de deposicion a una concentracion que vana de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM.
En realizaciones descritas particulares, el sustrato enzimatico puede seleccionarse de 1,3-diaminobencidina, 3- amino-9-etilcarbazol, tetrametilbencidina, una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un colorante BODIPY, una resorufina, una rodamina, o un derivado de los mismos. Mas tfpicamente, el sustrato enzimatico es un derivado de tiramina.
Cuando la muestra se pone en contacto con una solucion de deteccion, tfpicamente se expone al sustrato enzimatico a una concentracion que vana de mas de 0 mM a aproximadamente 8 mM. Ademas, la solucion de deteccion puede comprender adicionalmente un acelerador seleccionado de un grupo heteroarilo, un acido boronico, un compuesto fenolico o una combinacion de los mismos. El compuesto heteroarilo puede seleccionarse de imidazol, L-histidina, N-oxido de piridina, N-oxido de pirimidina, oxido de N-metilmorfolina y 2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxilo. Ademas, la solucion de deteccion puede comprender adicionalmente un tensioactivo no ionico seleccionado de un lauril eter de polioxietileno que tiene una formula (C2H4O)23C12H25OH; monoalquilato de polioxietileno (20) sorbitan, el monoalquilato que comprende entre 8 y 14 carbonos; un polioxietileno de alcohol secundario lineal que tiene una formula C12-14H25-29O(CH2CH2O]x, en la que x es igual a un numero entero entre 2 y 12; y octil fenil eter de polioxietileno. En realizaciones descritas particulares, la solucion de deteccion puede comprender adicionalmente un antioxidante seleccionado de bisulfato de sodio, estannato de sodio, metabisulfato de sodio y combinaciones de los mismos, y/o una sal que contiene un metal de Grupo I o Grupo II que tiene una formula MX2 o MX donde M es un metal del Grupo I o Grupo II seleccionado de litio, sodio, potasio, cesio, calcio, magnesio, estroncio y bario; y X se selecciona de fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, carbonato, hidroxido y fosfato.
Tambien se contempla en la presente descripcion una composicion para detectar una diana en una muestra por deposicion proximal de un marcador, que comprende un potenciador de deposicion que tiene una formula,
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R2
'R3
en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de un resto alifatico, arilo, halogeno, uno que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 puede estar unido a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado;
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A se selecciona de un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre y cualquier combinacion de los mismos; y un sustrato enzimatico.
En ciertas realizaciones descritas, el potenciador de deposicion tiene la formula
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n'A^a-
II I A-N'-A
R2
R3
en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan de un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado; A se selecciona de heteroatomo, diferente de azufre, un atomo de carbono y combinaciones de los mismos. Tfpicamente, el potenciador de deposicion puede tener una concentracion que vana de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM y el sustrato enzimatico tiene una concentracion que vana de mas de 0 mM a aproximadamente 8 mM, seleccionandose el sustrato enzimatico de 1,3-diaminobencidina, 3-amino-9-etilcarbazol, tetrametilbencidina, una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un colorante BODIPY, una resorufina, una rodamina, una tiramida o un derivado de los mismos.
En realizaciones descritas particulares, la composicion puede comprender adicionalmente un acelerador seleccionado de un compuesto heteroarilo, un acido boronico, un compuesto fenolico o una combinacion de los mismos; un tensioactivo no ionico seleccionado de Brij® 35, TWEEN®, Tergitol™, y Triton™; y un antioxidante seleccionado de bisulfato de sodio, estannato de sodio, metabisulfato de sodio y combinaciones de los mismos.
Tambien se describio un kit, que comprende una solucion de deteccion, que comprende un potenciador de deposicion y un sustrato enzimatico, teniendo el potenciador de deposicion una formula,
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R1
n'Sy
II I
R2
'R3
en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado; A se selecciona de un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre y cualquier combinacion de los mismos.
En realizaciones particulares, el compuesto de heteroarilo tiene una formula de acuerdo con
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...R10
R11
y/o una formula de acuerdo con
R1x
R16"
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R13
R12
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y/o una formula de acuerdo con
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en la que R8 - R22 son independientemente un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo, hidrogeno o cualquier combinacion de los mismos; R23 es [O] u [O]"; A es un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre o cualquier combinacion de los mismos; B es oxfgeno, carbono o nitrogeno; y m es 0-2. El halogeno puede seleccionarse de yodo, bromo, cloro y fluor, y el resto que contiene heteroatomo puede seleccionarse de hidroxilo, eter, eter sililico, ester, acido carbox^lico, sililo, fosfonato, fosfina, amida, NR6R7 donde R6 y R7 con independientemente hidrogeno, grupo alifatico arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones particulares, R17 y R21 comprenden cada uno un grupo metilo y m es 2. Compuestos heteroarilo ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, imidazol, L-histidina, N-oxido de piridina, N-oxido de pirimidina, oxido de N-metilmorfolina y 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo.
En realizaciones particulares, el potenciador opcional es un compuesto que contiene boro, tal como un acido boronico organico. Acidos boronicos organicos ejemplares incluyen, aunque sin limitacion acido borico.
En realizaciones particulares, el potenciador opcional es un compuesto fenolico que tiene una formula
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07 Ofi OQ 0(1 o-d
en la que R , R , R , R y R pueden seleccionarse independientemente de hidrogeno, alifatico, arilo, un resto que contiene heteroatomo o cualquier combinacion de los mismos. El resto que contiene heteroatomo es hidroxilo, eter, eter sililico, ester, acido carboxflico, sililo, fosfonato, fosfina, amida y NR5R6 donde R5 y R6 son independientemente hidrogeno, grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo y cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones particulares, dos grupos adyacentes cualesquiera seleccionados de R27, R28, R29, R30 y R31 pueden estar unidos para formar un sistema de anillo aromatico o no aromatico condensado. Compuestos fenolicos ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, pirocatecol.
En realizaciones particulares, el presente metodo puede comprender adicionalmente: inmovilizar el conjugado de resto de union espedfica-enzima sobre la diana en la muestra; poner en contacto la muestra con una solucion que comprende un conjugado de tiramida-hapteno; poner en contacto la muestra con la solucion potenciadora; poner en contacto la muestra con el oxidante; y localizar la diana en la muestra detectando el conjugado de tiramida-hapteno. En realizaciones particulares, la deteccion del conjugado de tiramida-hapteno comprende adicionalmente: poner en contacto la muestra con un anticuerpo antihapteno capaz de reconocer y unirse al conjugado de tiramida-hapteno y un resto detectable capaz de detectarse usando tecnicas de deposicion o fluorescentes; y detectar el resto detectable. En realizaciones particulares, el conjugado de tiramida-hapteno comprende un hapteno conjugado directamente a tiramida o mediante un enlazador. Tfpicamente, el enlazador es alifatico o heteroalifatico.
Lo anterior y las caractensticas y ventajas de esa descripcion llegaran a ser mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que prosigue con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es una imagen digital que muestra la tincion IHC de bcl2 sobre tejido de amfgdala usando un kit de deteccion convencional ultraView™.
La FIG. 2 es una imagen digital que muestra el uso de imidazol 10 nM como tampon basico en la solucion de tincion con diaminobencidina (DAB) para tincion IHC de bcl2 en tejido de amfgdala.
La FIG. 3 es un grafico que muestra la influencia de acido 4-acetilamidofenil boronico sobre la Vmax aparente para DAB oxidada por HRP cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 4 es un grafico que muestra la influencia de imidazol sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con
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peroxidasa de rabano rusticano (HRP-) cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 5 es un grafico que muestra la influencia de L-histidina sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm. La FIG. 6 es un grafico que muestra la influencia de acido borico sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm. La FIG. 7 es un grafico que muestra la influencia de pirimidina sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm. La FIG. 8 es un grafico que muestra la influencia de 2-hidroxipirimidina sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se anade al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 9 es un grafico que muestra la influencia de potenciadores potenciales sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se anade secuencialmente al kit de deteccion ultraView™. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 10 es una imagen digital de tincion con DAB ultraView™ de tejido bcl2 (airngdala) usando una solucion cromogenica de DAB basada en imidazol 10 mM.
La FIG. 11 es una imagen digital de tincion DAB ultraView™ de tejido bcl2 usando una solucion cromogenica de DAB basada en L-histidina 10 mM.
La FIG. 12 es una imagen digital de tincion DAB ultraView™ de tejido bcl2 usando una solucion cromogenica de DAB basada en N-oxido de pirimidina 10 nM en L-histidina 10 mM.
La FIG. 13 es una imagen digital de tincion DAB ultraView™ de tejido bcl2 usando una solucion cromogenica de DAB basada en 2-hidroxipirimidina 10 mM en L-histidina 10 mM.
Las FIG. 14-17 son imagenes digitales de tincion IHC de bcl2 en tejido de airngdala usando un kit de deteccion convencional VMSI ultraView™ o sin "soluciones potenciadoras" de DAB. Soluciones potenciadoras de DAB: FIG. 14: sin potenciacion; FIG. 15: imidazol 100 mM, acido borico 50 mM; FIG. 16: L-histidina 50 mM, pirimidina 10 mM; FIG. 17: L-histidina 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM. La valoracion patologica para la senal/fondo fue: FIG. 14, 3,75/0,5; FIG. 15, 4,0/0,75; FIG. 16, 4+/0,5; FIG. 17, 4/0,5. La FIG. 18 es un grafico que muestra la influencia de soluciones cromogenicas de DAB de imidazol y L-histidina sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se combina con pirimidina 10 mM. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 19 es un grafico que muestra la influencia de soluciones cromogenicas de DAB de imidazol y L-histidina sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se combina 2-hidroxipirimidina 10 mM, acido borico 10 mM y cloruro calcico 10 mM. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 20 es un grafico que muestra la influencia de potenciadores sobre la Vmax aparente para DAB oxidada con HRP cuando se combina con imidazol 50 mM, cloruro calcico 10 mM y acido borico 10 mM. La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm.
La FIG. 21 es una imagen digital de tincion ISH de DAB de la sonda HER-2 sobre xenoinjertos de raton 3 en 1 HER-2 de lmeas celulares de carcinoma CaLu3 HER-2 positivas con el sistema de deteccion ultraView™.
La FIG. 22 es una imagen digital de tincion ISD de DAB de la sonda HER-2 sobre xenoinjertos de raton 3 en 1 HER-2 de lmeas celulares de carcinoma CaLu3 HER-2 positivas con una solucion cromogenica de DAB y potenciacion con L-histidina 10 mM.
Las FIG. 23-26 son imagenes digitales de la tincion IHC de bcl2 sobre tejido de airngdala usando el sistema de amplificacion de tiramida con y sin potenciacion de oxidacion con HRP para la deposicion tanto de tiramida como de DAB. FIG. 23: sin potenciacion para deposicion de tiramida o DAB; FIG. 24: sin potenciacion de deposicion de tiramida, deposicion potenciada de DAB; FIG. 25: potenciador de deposicion de tiramida, sin deposicion potenciada de DAB; FIG. 26: potenciacion de la deposicion de tiramida y dAb.
Las FIG. 27-28 son imagenes digitales de tincion IHC de bcl2 sobre tejido de airngdala usando el sistema de amplificacion de tiramida para deposicion de tiramida con 2-hidroxipirimidina 10 mM (FIG. 27) y sin potenciacion de oxidacion con HRP (FIG. 28).
La FIG. 29 es una imagen digital de tincion ISH del ribosoma 18s sobre tejidos de xenoinjerto CaLu3 con ribosonda 18s y una DAB potenciada tanto con 2-hidroxipiridina 10mM como con L-histidina 10 mM.
La FIG. 30 es una imagen digital de tincion ISH de ribosoma 18s sobre tejidos de xenoinjerto CaLu3 con ribosonda 18s y sin potenciacion.
La FIG. 31 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto CaSki con sonda HPV haptenilada y una DAB potenciada tanto con 2-hidroxipiridina 10mM como con L-histidina 10 mM.
La FIG. 32 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto CaSki con sonda HPV haptenilada y sin potenciacion.
La FIG. 33 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto HeLa con sonda HPV haptenilada y una DAB potenciada tanto con 2-hidroxipiridina 10mM como con L-histidina 10 mM.
La FIG. 34 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto HeLa con sonda HPV haptenilada y sin potenciacion.
La FIG. 35 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto C33 con sonda HPV haptenilada y una DAB potenciada tanto con 2-hidroxipiridina 10mM como con L-histidina 10 mM.
La FIG. 36 es una imagen digital de tincion IHC de HPV sobre tejidos de xenoinjerto C33 con sonda HPV haptenilada y sin potenciacion.
La FIG. 37 es una imagen digital de tincion IHC de CD20 sobre tejidos de airngdala con sonda anti-CD20 y DAB
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potenciada tanto con 2-hidroxipiridina 10mM como con L-histidina 10 mM.
La FIG. 38 es una imagen digital de tincion IHC de CD20 sobre tejidos de amygdala con sonda anti-CD20 y sin potenciacion.
La FIG. 39 es una imagen digital de tincion IHC de CD20 sobre tejidos de amygdala con sonda anti-CD20 y deposicion de AEC potenciada con L-histidina 50 mM y 2-hidroxipiridina 10 mM.
La FIG. 40 es una imagen digital de tincion IHC de CD20 sobre tejidos de amygdala con sonda anti-CD20 y sin potenciacion.
La FIG. 41 es una imagen digital de tincion IHC de Ki67 sobre tejidos de amygdala con sonda anti-Ki67 y deposicion de AEC potenciada con L-histidina 50 mM y 2-hidroxipiridina 10 mM.
La FIG. 42 es una imagen digital de tincion IHC de Ki67 sobre tejidos de amygdala con sonda anti-Ki67 y sin potenciacion.
Las FIG. 43-46 son imagenes digitales de la tincion IHC de bcl2 sobre tejido de amygdala usando sistema de amplificacion de tiramida con y sin potenciacion de oxidacion con HRP para la deposicion tanto de tiramida como de DAB. FIG. 43: sin potenciacion para deposicion de tiramida o DAB; FIG. 44: sin potenciacion de la deposicion de tiramida, deposicion de DAB potenciada; FIG. 45: potenciacion de la deposicion de tiramida, sin deposicion de DAB potenciada; FIG. 46: potenciacion de la deposicion de tiramida y DAB.
Descripcion detallada
I. Introduccion
Las enfermedades, tales como el cancer, pueden diagnosticarse por varios metodos diferentes. Un metodo es identificar la presencia de un biomarcador, tal como un biomarcador de cancer, en tejido o celulas, estando correlacionado el biomarcador, o creyendose que esta correlacionado, con un tipo de cancer particular. A veces se usa inmunohistoqmmica para abordar biomarcadores proteicos que estan asociados con un tipo particular de cancer, mientras que a veces se emplean tecnicas de hibridacion in situ para abordar secuencias de acido nucleico que estan asociadas con un tipo particular de cancer.
Los metodos de inmunohistoqmmica e hibridacion in situ para la identificacion dirigida cada vez van siendo mas importantes en aplicaciones de investigacion y para los medicos, por ejemplo, con fines de diagnostico y/o pronostico. Sin embargo, estas tecnicas pueden estar limitadas por la senal detectable emitida por un resto de deteccion que interacciona o se deposita sobre la molecula diana presente o que se cree que esta presente en una muestra tisular, tal como una molecula diana proteica y/o de acido nucleico. Teoricamente, un modo para aumentar la senal obtenida es aumentar la deposicion de un resto detectable sobre la molecula diana, por ejemplo, aumentando la tasa de deposicion, de modo que pudiera obtenerse una mayor senal en una cantidad mas corta de tiempo.
Como se describe en este documento, una novedosa formulacion de un cromogeno DAB actua de forma sinergica para proporcionar deposicion maximizada de DAB durante tincion tisular IHC o ISH. La novedosa formulacion del cromogeno DAB utiliza un potenciador organico como sal tamponante en combinacion con una diversidad de potenciadores organicos/inorganicos y tensioactivo para maximizar de forma sinergica la deposicion de DAB y, por lo tanto, la senal. Tambien se describen en este documento metodos de uso de las formulaciones descritas para potenciar la tincion tisular IHC y/o ISH.
Los metodos descritos en este documento encuentran utilidad para diagnostico, donde los resultados proporcionados por los metodos descritos se usan no solamente para el diagnostico, sino tambien para determinar el tratamiento optimo y rastrear la progresion y exito de dicho tratamiento, en un entorno clinico.
II. Terminos
Salvo que se aprecie de otro modo, los terminos tecnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de terminos comunes en biologfa molecular en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995; y George P. Redei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2a Edicion, 2003.
Las formas singulares "uno", "una" y "el", "la", se refiere a uno o mas de uno, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresion "que comprende una celula" incluye una unica celula o multiples celulas y se considera equivalente a la expresion "que comprende al menos una celula". El termino "o" se refiere a un unico elemento de elementos alternativos indicados o una combinacion de dos o mas elementos, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Una linea ondulada C se usa para indicar una desconexion de enlace y una lrnea discontinua ("—") se usa para ilustrar que puede formarse un enlace en una posicion particular.
Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento para poner en practica o ensayar la tecnologfa descrita, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Los
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materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos y metodos para describir mejor la presente descripcion y guiar a los expertos en la materia en la practica de la presente descripcion.
Alifatico: Restos que incluyen grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo halogenado y cicloalquilo. Un grupo "alifatico inferior" es un grupo alifatico ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 10 atomos de carbono. Este termino abarca compuestos alifaticos sustituidos, compuestos alifaticos saturados y compuestos alifaticos insaturados.
Alquilo: Un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 24 atomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, f-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares. Un grupo "alquilo inferior" es un hidrocarburo ramificado o no ramificado saturado que tiene de 1 a 10 atomos de carbono. Las expresiones "alquilo halogenado" o "grupo haloalquilo" se refieren a un grupo alquilo definido anteriormente con uno o mas atomos de hidrogeno presentes en estos grupos sustituidos con un halogeno (F, Cl, Br, I). El termino "cicloalquilo" se refiere a un anillo basado en carbono no aromatico compuesto de al menos tres atomos de carbono. Ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, aunque sin limitacion, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.
La expresion "grupo heterocicloalquilo" es un grupo cicloalquilo donde al menos uno de los atomos de carbono del anillo esta sustituido con un heteroatomo tal como, aunque sin limitacion, nitrogeno, oxfgeno, azufre o fosforo. Grupos opcionalmente sustituidos, tales como "alquilo sustituido", describe grupos, tales como un grupo alquilo, que tiene 1-5 sustituyentes, normalmente 1-3 sustituyentes, seleccionados de alcoxi, alcoxi opcionalmente sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, aminoacilo, aminoaciloxi, arilo, carboxialquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, hidroxi, tiol y tioalcoxi.
Amplificacion: Amplificacion se refiere al acto o resultado de hacer mas fuerte una senal. La amplificacion puede ser un aumento en la magnitud de la senal y/o un aumento en la senal relativa al fondo, por ejemplo, relacion aumentada de senal a ruido.
Anticuerpo: Se refiere colectivamente a inmunoglobulinas o moleculas tipo inmunoglobulina (incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitacion, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y combinaciones de las mismas, y moleculas similares producidas durante una respuesta inmunitaria en cualquier vertebrado, por ejemplo, en mairnferos tales como seres humanos, cabras, conejos y ratones) y fragmentos de anticuerpo que se unen espedficamente a una molecula de interes (o un grupo de moleculas de interes muy similares) a la exclusion sustancial de union a otras moleculas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que tienen una constante de union por la molecula de interes que es al menos 1o3 M-1 mayor, al menos 104 M-1 mayor, o al menos 105 M-1 mayor que una constante de union por otras moleculas en una muestra biologica).
Mas particularmente, "anticuerpo" se refiere a un ligando polipeptfdico que comprende al menos una region variable de inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada que reconoce espedficamente y se une a un epttopo de un antfgeno. Los anticuerpos pueden estar compuestos de una cadena pesada y una cadena ligera, cada una de las cuales tiene una region variable, llamada la region pesada variable (Vh) y la region ligera variable (Vl). En conjunto, la region Vh y la region Vl son responsables de la union al antfgeno reconocido por el anticuerpo.
Anticuerpos incluye inmunoglobulinas intactas y las variantes y partes de las mismas bien conocidas en la tecnica. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos proteolfticos de anticuerpo [tales como fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab'2, fragmentos Fab'-SH y fragmentos Fab que son conocidos en la tecnica], fragmentos recombinantes de anticuerpo (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespedficos, fragmentos dsFv biespedficos, fragmentos F(ab)'2, protemas Fv de cadena sencilla ("scFv"), protemas Fv estabilizadas por disulfuro ("dsFv"), diacuerpos y triacuerpos (que son conocidos en la tecnica), y anticuerpos de camelido (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.015.695; 6.005.079; 5.874.541; 5.840.526; 5.800.988; y 5.759.808). Una protema scFv es una protema de fusion en que una region variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una region variable de cadena pesada de una inmunoglobulina se unen mediante un enlazador, mientras que en dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociacion de las cadenas. El termino tambien incluye formas modificadas por ingeniena genetica tales como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespedficos). Vease tambien, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Normalmente, una inmunoglobulina de origen natural tiene cadenas pesadas y cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda y kappa. Hay cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
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Cada cadena pesada y ligera contiene una region constante y una region variable; las regiones tambien son conocidas como "dominios". En combinacion, las regiones variables de cadena pesada y ligera se unen espedficamente al antigeno. Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una region "flanqueante" interrumpida por tres regiones hipervariables, tambien llamadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La extension de la region flanqueante y las CDR se han definido (vease, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). La base de datos de Kabat ahora se mantiene en lrnea. Las secuencias de las regiones flanqueantes de diferentes cadenas ligeras o pesadas estan relativamente conservadas dentro de una especie. La region flanqueante de un anticuerpo, es decir, las regiones flanqueantes combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son principalmente responsables de la union a un epftopo de un antigeno. Las CDR de cada cadena normalmente se mencionan como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el extremo N-terminal, y tambien se identifican normalmente por la cadena en que esta localizada la CDR particular. Por tanto, una CDR3 de Vh esta localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en que se encuentra, mientras que una CDR1 de Vl es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en que se encuentra.
Antfgeno: Una molecula que estimula una respuesta inmunitaria. Los antfgenos son habitualmente protemas o polisacaridos. Un epftopo es un determinante antigenico compuesto de grupos qmmicos o secuencias peptfdicas en una molecula que provoca una respuesta inmunitaria espedfica. Un anticuerpo se une a un antfgeno o epftopo particular. La union de un anticuerpo a un antfgeno o epftopo de un antfgeno particular puede usarse para localizar la posicion del antfgeno, por ejemplo, en o sobre una muestra biologica, o para determinar si el antfgeno particular esta presente en una muestra biologica. Un antfgeno de interes es un antfgeno para detectar en un ensayo IHC disenado en una muestra de ensayo. Por ejemplo, para detectar un antfgeno de interes, el anticuerpo primario usado en el ensayo IHC se une espedficamente al antfgeno de interes.
Un epftopo es un sitio sobre una molecula diana (por ejemplo, un antfgeno, tal como una protema o molecula de acido nucleico) al que se une una molecula de union a antfgeno (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, protema estructural que contiene regiones de union a anticuerpo, o aptamero). Los epftopos pueden formarse a partir de restos contiguos o no contiguos yuxtapuestos (por ejemplo, aminoacidos o nucleotidos) de la molecula diana (por ejemplo, una superficie de contacto protema-protema). Los epftopos formados a partir de restos contiguos (por ejemplo, aminoacidos o nucleotidos) tfpicamente se retienen al exponerlos a disolventes desnaturalizantes mientras que los epftopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo normalmente incluye al menos 3 y mas habitualmente al menos 5 u 8, 10 restos (por ejemplo, aminoacidos o nucleotidos). Normalmente, un epftopo tambien es de menos de 20 restos (por ejemplo, aminoacidos o nucleotidos) de longitud, tal como menos de 15 restos o menos de 12 restos.
Aromatico: Un termino que describe anillos conjugados que tienen enlaces insaturados, pares solitarios u orbitales vados, que muestran una estabilizacion mas fuerte de lo que se esperana por la estabilizacion de la conjugacion en solitario. Tambien puede considerarse una manifestacion de deslocalizacion dclica o de resonancia.
Arilo: Un compuesto aromatico sustancialmente basado en hidrocarburo, o un radical del mismo (por ejemplo, C6H5) como un sustituyente unido a otro grupo, particularmente otros grupos organicos, que tiene una estructura de anillo ejemplificada por benceno, naftaleno, fenantreno, antraceno, etc. Este termino tambien abarca compuestos arilo sustituidos.
Aril alquilo: Un compuesto, o un radical del mismo (C7H7 para tolueno) como un sustituyente unido a otro grupo, particularmente otros grupos organicos, que contiene estructuras tanto alifaticas como aromaticas.
Union o union estable: Una asociacion entre dos sustancias o moleculas, tal como la asociacion de un agente o resto de union espedfica (por ejemplo, anticuerpo) con un antfgeno.
Afinidad de union: La tendencia de una molecula a unirse (normalmente de forma no covalente) con otra molecula, tal como la tendencia de un miembro de un par de union espedfica por otro miembro de un par de union espedfica. Una afinidad de union puede medirse como una constante de union, cuya afinidad de union por un par de union espedfica (tal como un par anticuerpo/antfgeno o par sonda de acido nucleico/secuencia de acido nucleico) puede ser de al menos 1 x 105 M"1, tal como al menos 1 x 106 M"1, al menos 1 x 107 M"1 o al menos 1 x 108 M"1. En una realizacion, la afinidad de union se calcula mediante una modificacion del metodo de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. En otra realizacion, la afinidad de union se mide por una tasa de disociacion de antfgeno/anticuerpo. En otra realizacion mas, una alta afinidad de union se mide por un radioinmunoensayo de competicion. En varios ejemplos, una alta afinidad de union por un par de anticuerpo/antfgeno es de al menos aproximadamente 1 x 108 M"1. En otras realizaciones, una alta afinidad de union es de al menos aproximadamente
* q a R 1 n 1
1,5 x 10 M' , al menos aproximadamente 2,0 x 10 M' , al menos aproximadamente 2,5 x 10 M' , al menos aproximadamente 3,0 x 108 M"1, al menos aproximadamente 3,5 x 108 M"1, al menos aproximadamente 4,0 x 108 M"1, al menos aproximadamente 4,5 x 108 M"1, o de al menos aproximadamente 5,0 x 108 M"1.
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Cromogeno: Una sustancia capaz de convertirse en un producto coloreado, tal como un pigmento o colorante. Ciertos cromogenos son donantes de electrones que, cuando se oxidan, se convierten en un producto coloreado. La produccion de un producto coloreado y la propiedad de volverse insoluble tras conversion qmmica, tal como por oxidacion, hace que los cromogenos sean utiles para IHC. Ejemplos particulares de compuestos cromogenicos, sin limitacion, incluyen diaminobencidina (DAB), tetrametilbencidina (TMB), 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3- etilbenzotiazolina] (ABTS), yodonitrotetrazolio (INT), azul de tetrazolio y violeta de tetrazolio.
DAB es un cromogeno que produce un producto final marron que es muy insoluble en alcohol y otros disolventes organicos. En algunos ejemplos, DAB es el sustrato de una enzima, tal como HRP.
Condiciones suficientes para deteccion: Cualquier entorno que permita la actividad deseada, por ejemplo, que permita que una sonda se una a una diana y se detecte la interaccion. Por ejemplo, dichas condiciones incluyen temperaturas apropiadas, soluciones tamponantes y medios de deteccion tales como microscopios y equipos de imagenes digitales.
Contacto: Colocacion que permite la asociacion entre dos o mas restos, particularmente asociacion ffsica directa, por ejemplo, en forma solida y/o en forma lfquida (por ejemplo, la colocacion de una muestra biologica, tal como una muestra biologica fijada a un portaobjetos, en contacto con una composicion, tal como una solucion que contiene las composiciones descritas en este documento).
Control: Una muestra o procedimiento realizado para evaluar la validez del ensayo. En un ejemplo, un control es un control de calidad, tal como un control positivo. Por ejemplo, un control positivo es un procedimiento o muestra, tal como un tejido o celula, que es similar a la muestra de ensayo real, pero que se sabe por la experiencia previa que da un resultado positivo. Un control positivo confirma que las condiciones basicas del ensayo producen un resultado positivo, incluso si ninguna de las muestras de ensayo reales produce dicho resultado. En un ejemplo particular, un control positivo es una muestra que se sabe por los ensayos previos que contiene el antfgeno sospechoso.
En otros ejemplos, un control es un control negativo. Un control negativo es un procedimiento o muestra de ensayo que se sabe por la experiencia previa que da un resultado negativo. El control negativo demuestra el resultado basal obtenido cuando un ensayo no produce un resultado positivo medible; a menudo el valor del control negativo se trata como valor "de fondo" a sustraerse de los resultados de la muestra de ensayo. En un ejemplo particular, un control negativo es un reactivo que no incluye el anticuerpo primario espedfico. Otros ejemplos incluyen controles de calibracion, que son muestras que contienen una cantidad conocida de un antfgeno de control. Dichos controles de calibracion tienen una intensidad de senal esperada y, por lo tanto, pueden usarse para corregir la variabilidad de tincion entre ejecuciones o dentro de la ejecucion.
Conjugado: Una molecula que comprende dos moleculas independientes, que se ha unido a traves de un enlace (normalmente un enlace covalente o ionico). En algunos ejemplos, se conjuga un agente o resto de union espedfica a una enzima que actua sobre un sustrato para producir un resto o marcador detectable.
Conjugacion, union, adhesion o enlace: Union de una molecula a otra molecula para hacer una molecula mas grande. Por ejemplo, hacer dos polipeptidos en una molecula polipeptfdica contigua, o fijar covalentemente un hapteno u otra molecula a un polipeptido, tal como un anticuerpo scFv. El enlace puede ser por medio qrnmicos o recombinantes. "Medios qrnmicos" se refiere a una reaccion entre el resto de anticuerpo y la molecula efectora de modo que se forme un enlace covalente entre las dos moleculas para formar una molecula.
Acoplado: El termino "acoplado" significa unido junto, directa o indirectamente. Un primer atomo o molecula puede acoplarse directamente o acoplarse indirectamente a un segundo atomo o molecula. Un anticuerpo secundario proporciona un ejemplo de acoplamiento indirecto. Un ejemplo espedfico de acoplamiento indirecto es un anticuerpo primario de conejo anti-hapteno que se une por un anticuerpo de raton anti-IgG de conejo, que a su vez se une por un anticuerpo de cabra anti-IgG de raton que esta ligado covalentemente a un marcador detectable.
Derivado: En qmmica, un derivado es un compuesto que se obtiene de un compuesto similar o un compuesto que puede imaginarse surgiendo de otro compuesto, por ejemplo, si un atomo se remplaza con otro atomo o grupo de atomos. La ultima definicion es habitual en qmmica organica. En bioqmmica, la palabra se usa para compuestos que pueden formarse al menos teoricamente a partir del compuesto precursor.
Marcado detectable: Una molecula o material que puede producir una senal detectable (tal como visualmente, electronicamente o de otro modo) que indica la presencia y/o concentracion de una diana, tal como una molecula diana, en una muestra, tal como una muestra tisular. Cuando se conjuga a una molecula de union espedfica, el marcador detectable puede usarse para localizar y/o cuantificar la diana a la que esta dirigida la molecula de union espedfica. De ese modo, la presencia y/o concentracion de la diana en una muestra puede detectarse detectando la senal producida por el marcador detectable. Un marcador detectable puede detectarse directa o indirectamente, y pueden usarse varios marcadores detectables diferentes conjugados a diferentes moleculas de union espedfica en combinacion para detectar una o mas dianas. Por ejemplo, un primer marcador detectable, tal como un hapteno conjugado a un anticuerpo espedfico para una diana, puede detectarse indirectamente usando un segundo
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marcador detectable que esta conjugado a una molecula que se une espedficamente al primer marcador detectable. Pueden conjugarse multiples marcadores detectables que pueden detectarse por separado a diferentes moleculas de union espedfica que se unen espedficamente a diferentes dianas para proporcionar un ensayo combinado que puede proporcionar deteccion de las multiples dianas en una muestra.
Los marcadores detectables incluyen moleculas y materiales coloreados, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia para proporcionar una diferencia detectable (tal como convirtiendo una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o produciendo un precipitado o aumentando la turbidez de la muestra), haptenos que pueden detectarse a traves de interacciones de union anticuerpo-hapteno usando conjugados de anticuerpo marcados de forma detectable y moleculas o materiales paramagneticos y magneticos. Ejemplos particulares de marcadores detectables incluyen: enzimas, tales como peroxidasa de rabano rusticano, glucosa oxidasa, p-galactosidasa o p-glucuronidasa; fluoroforos (pueden encontrarse muchos ejemplos adicionales de moleculas fluorescentes en The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR); nanopartfculas, tales como puntos cuanticos (por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 6.815.064, 6.682.596 y 6.649.138); quelatos de metales, tales como quelatos DotA y DPTA de iones de metales radiactivos o paramagneticos como Gd3+; cromogenos; y liposomas, por ejemplo, liposomas que contienen moleculas fluorescentes atrapadas.
Cuando el marcador detectable incluye una enzima, se usa una sustancia detectable tal como un cromogeno, un compuesto fluorogenico o un compuesto luminogenico en combinacion con la enzima para generar una senal detectable (una amplia diversidad de dichos compuestos esta disponible en el mercado, por ejemplo, de Life Technologies, Carlsbad, CA).
Como alternativa, puede usarse una enzima en un esquema de deteccion metalografica. Los metodos de deteccion metalografica incluyen el uso de una enzima en combinacion con un ion metalico soluble en agua y un sustrato redox-inactivo de la enzima. El sustrato se convierte en un agente redox-activo por la enzima, y el agente redox- activo reduce el ion metalico, causando que forme un precipitado detectable. (Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos en tramite junto con la presente con numero de serie 11/015.646, presentada el 20 de diciembre de 2004, la publicacion de PCT n.° 2005/003777 y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2004/0265922). Los metodos de deteccion metalografica incluyen el uso de una enzima oxidorreductasa (tal como peroxidasa de rabano rusticano (HRP)) junto con un ion metalico soluble en agua, un agente oxidante y un agente reductor, de nuevo para formar un precipitado detectable (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.670.113).
Detergente o tensioactivo: Una sustancia que reduce la tension superficial del agua. Espedficamente, un detergente o tensioactivo es un agente activo en superficie, o tensioactivo, que se concentra en superficies de contacto aceite- agua y ejerce una accion emulsionante. Los detergentes se clasifican como anionicos, cationicos o no ionicos, dependiendo de su modo de accion qmmica. Los detergentes no ionicos funcionan mediante un mecanismo de union a hidrogeno. Ademas, los tensioactivos o detergentes reducen la tension interfacial entre dos lfquidos. Una molecula de tensioactivo normalmente tiene una "cabeza" polar o ionica y una "cola" de hidrocarburo no polar. Tras la disolucion en agua, las moleculas de tensioactivo se agregan y forman micelas, en que las colas no polares estan orientadas hacia dentro y las cabezas polares o ionicas estan orientadas hacia afuera hacia el entorno acuoso. Las colas no polares crean un "bolsillo" no polar dentro de la micela. Los compuestos no polares en la solucion se secuestran en los bolsillos formados por las moleculas tensioactivas, permitiendo de ese modo que los compuestos no polares permanezcan mezclados dentro de la solucion acuosa.
Deteccion: Para determinar si un agente (tal como una senal o antfgeno particular, protema o acido nucleico) esta presente o ausente, por ejemplo, en una muestra. En algunos ejemplos, esto puede incluir adicionalmente cuantificacion y/o localizacion, por ejemplo, localizacion dentro de una celula o compartimento celular particular. "Deteccion" se refiere a cualquier metodo de determinacion de si existe algo, o no existe, tal como determinar si una molecula diana esta presente en una muestra biologica. Por ejemplo, "deteccion" puede incluir el uso de un dispositivo visual o mecanico para determinar si una muestra presenta una caractenstica espedfica. En ciertos ejemplos, deteccion se refiere a observar visualmente una sonda unida a una diana, u observar que una sonda no se une a una diana. Por ejemplo, habitualmente se usa microscopfa optica y otros medios microscopicos para detectar precipitados cromogenicos para metodos descritos en este documento.
Radiacion electromagnetica: Una serie de ondas electromagneticas que se propagan por variaciones periodicas simultaneas de la intensidad del campo electrico y magnetico, y que incluye ondas de radio, infrarrojos, luz visible, luz ultravioleta, rayos X y rayos gamma. En ejemplos particulares, se emite radiacion electromagnetica por un laser, que puede poseer propiedades de monocromaticidad, direccionalidad, coherencia, polarizacion e intensidad.
Emision o senal de emision: La luz de una longitud de onda particular generada desde una fuente. En ejemplos particulares, se emite una senal de emision desde un fluoroforo despues de que el fluoroforo absorba luz en su longitud o longitudes de onda de excitacion.
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Potenciacion: Un potenciador o reactivo de potenciacion es cualquier compuesto o cualquier combinacion de compuestos suficiente para aumentar la actividad catalttica de una enzima, en comparacion con la actividad enzimatica sin dicho compuesto o compuestos. El potenciador o potenciadores o reactivo o reactivos de potenciacion tambien pueden definirse como un compuesto o combinacion de compuestos que aumentan o aceleran la tasa de union de un conjugado activado a un sitio receptor. La potenciacion es un proceso por el cual la actividad catalftica de una enzima se aumenta por un potenciador, en comparacion con un proceso que no incluye dicho potenciador. La potenciacion tambien puede definirse como el aumento o aceleracion de la tasa de union de un conjugado activado a un sitio receptor. La potenciacion puede medirse visualmente, tal como valorandola por un patologo. En realizaciones particulares, los valores vanan de mas de 0 a mas de 4, indicando el numero superior una mejor deteccion visual. Mas normalmente, los valores vanan de mas de 0 a aproximadamente 4++, tal como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 3,75, 4, 4+, y 4++. Ademas, la potenciacion puede medirse determinando la Vmax. aparente de una enzima. En realizaciones particulares, el termino abarca valores de Vmax. aparente (medidos como densidad optica/minuto) que vanan de mas de 0 mDO/min a aproximadamente 400 mDO/min, tal como de aproximadamente 15 mDO/min, 18 mDO/min, a aproximadamente 20 mDO/min, a aproximadamente 40 mDO/min, a aproximadamente 60 mDO/min, a aproximadamente 80 mDO/min, a aproximadamente 100 mDO/min, a aproximadamente 120 mDO/min, a aproximadamente 140 mDO/min, a aproximadamente 160 mDO/min, a aproximadamente 200
mDO/min, a aproximadamente 250 mDO/min, a aproximadamente 300 mDO/min, a aproximadamente 350
mDO/min, y a aproximadamente 400 mDO/min. Mas normalmente, la Vmax. vana de mas de 0 mDO/min a aproximadamente 160 mDO/min, tal como de aproximadamente 20 mDO/min, a aproximadamente 40 mDO/min, a aproximadamente 60 mDO/min, a aproximadamente 80 mDO/min, a aproximadamente 100 mDO/min, a
aproximadamente 120 mDO/min, a aproximadamente 140 mDO/min, y a aproximadamente 160 mDO/min. Ademas, la potenciacion puede suceder usando cualquier concentracion de un potenciador mayor de 0 mM. Normalmente, la potenciacion sucede a concentraciones de potenciador que vanan de mas de 0 mM a aproximadamente 100 mM. Incluso mas normalmente de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM, a aproximadamente 0,02 mM, a aproximadamente 0,05 mM, a aproximadamente 0,10 mM, a aproximadamente 0,20 mM, a aproximadamente 0,50 mM, a aproximadamente 1,0 mM, a aproximadamente
2.0 mM, a aproximadamente 3,0 mM, a aproximadamente 5,0 mM, a aproximadamente 10,0 mM, a
aproximadamente 20,0 mM, a aproximadamente 30,0 mM, a aproximadamente 40,0 mM, a aproximadamente 50,0 mM, a aproximadamente 75,0 mM, o a aproximadamente 100,0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,10 mM, a aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 0,50 mM, a aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1,0 mM, a aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,0 mM, a aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 10,0 mM, a aproximadamente 5,0 mM a aproximadamente 50,0 mM, y a aproximadamente
20.0 mM a aproximadamente 100,0 mM.
Excitacion o senal de excitacion: La luz de una longitud de onda particular necesaria y/o suficiente para excitar una transicion electronica a un nivel energetico mayor. En ejemplos particulares, una excitacion es la luz de una longitud de onda particular necesaria y/o suficiente para excitar un fluoroforo a un estado de modo que el fluoroforo emita una longitud de onda diferente (tal como mas larga) de luz que la longitud de onda de luz de la senal de excitacion.
Fijacion: Un proceso que conserva las celulas y constituyentes tisulares en un estado lo mas cercano posible a la vida y les permite experimentar procedimientos preparativos sin cambios. La fijacion detiene los procesos de autolisis y descomposicion bacteriana que empiezan tras la muerte celular, y estabiliza los constituyentes celulares y tisulares de modo que resisten las fases posteriores de procesamiento tisular, tal como para IHC.
Los tejidos pueden fijarse por perfusion con o inmersion en un fijador, tal como un aldehndo (tal como formaldehndo, paraformaldehndo, giutaraldetndo y similares). Otros fijadores incluyen agentes oxidantes (por ejemplo, iones y complejos metalicos, tales como tetroxido de osmio y acido cromico), agentes desnaturalizantes de protema (por ejemplo, acido acetico, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro mercurico, acetona y acido pfcrico), reactivos de combinacion (por ejemplo, fijador de Carnoy, methacarn, fluido de Bouin, fijador B5, fluido de Rossman y fluido de Gendre), microondas y diversos (por ejemplo, fijacion por volumen excluido y fijacion por vapor). Tambien pueden incluirse aditivos en el fijador, tales como tamponantes, detergentes, acido tanico, fenol, sales metalicas (por ejemplo, cloruro de zinc, sulfato de zinc y sales de litio) y lantano.
El fijador mas habitualmente usado en la preparacion de muestras para IHC es formaldetndo, generalmente en forma de una solucion en formalina (formaldehndo al 4 % en una solucion tamponante, mencionada como formalina tamponada al 10 %).
Fluorescencia: Un tipo de luminiscencia en que un atomo o molecula absorbe energfa y despues emite luz visible segun sufre una transicion desde un estado electronico superior a uno inferior. El termino "fluorescencia" esta restringido a fenomenos en que el intervalo de tiempo entre la absorcion y emision de energfa es extremadamente corto.
Hibridacion in situ de fluorescencia (FISH): FISH es una tecnica usada para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias espedficas de ADN y/o ARN en cromosomas. FISH usa sondas marcadas de forma fluorescente que se unen solamente a aquellas partes del cromosoma con que muestran un alto de grado de similitud de secuencia en condiciones definidas de reaccion. FISH tambien puede usarse para detectar secuencias
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particulares de ARNm dentro de muestras tisulares.
Fluoroforo: Un compuesto qmmico, que cuando se excita por exposicion a un estfmulo particular tal como una longitud de onda definida de luz, emite luz (emite fluorescencia), por ejemplo, a una longitud de onda diferente (tal como una longitud de onda mas larga de luz).
Los fluoroforos son parte de la clase mas grandes de compuestos luminiscentes. Los compuestos luminiscentes incluyen moleculas quimioluminiscentes, que no requieren una longitud de onda particular de luz para emitir luminiscencia, pero en su lugar usan una fuente qmmica de energfa. Por lo tanto, el uso de moleculas quimioluminiscentes (tales como aequorina) elimina la necesidad de una fuente de externa de radiacion electromagnetica, tal como un laser.
Ejemplos de fluoroforos particulares que pueden usarse en las sondas descritas en este documento se proporcionan en la patente de Estados Unidos n.° 5.866.366 de Nazarenko et al., tales como acido 4-acetamido-4'- isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfonico, acridina y derivados tales como acridina e isotiocianato de acridina, acido 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS), 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (amarillo Lucifer VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, amarillo Brilliant, cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151); cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5''-dibromopirogalol-sulfoneftalema (rojo de Bromopirogalol); 7- dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; acido 4,4'- diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfonico; acido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfonico; cloruro de 5- [dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescema y derivados tales como 5-carboxifluorescema (FAM), 5-(4,6- diclorotriazin-2-il)aminofluorescema (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato verde de Malaquita; 4-metilumbeliferona; orto cresolftalema; nitrotirosina; pararrosanilina; rojo Fenol; B-ficoeritrina; o- ftaldialdehndo; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinimidil 1-pireno; Rojo 4 reactivo (CIBACRON™ rojo Brilliant 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6- carboxirrodamina (R6G), sulfonil cloruro de lisamina rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo sulforrodamina 101 (rojo Texas); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; acido rosolico y derivados de quelato de terbio; rojo LightCycler 640; Cy5.5; y Cy5.
Hapteno: Una molecula, normalmente una molecula pequena, que puede combinarse espedficamente con un anticuerpo, pero normalmente es sustancialmente incapaz de ser inmunogenica excepto en combinacion con una molecula de vehmulo. Ejemplos de haptenos incluyen, aunque sin limitacion, fluorescema, biotina, nitroarilos incluyendo, aunque sin limitacion, dinitrofenol (DNP), digoxigenina, oxazol, pirazol, tiazol, benzofurazano, triperpeno, urea, tiourea, rotenoide, cumarina y ciclolignano.
Heterobifuncional: Agentes de reticulacion que contienen al menos dos grupos reactivos diferentes en cada extremo, que son reactivos hacia numerosos grupos, incluyendo, aunque sin limitacion, sulfhidrilos y aminas, y crean enlaces covalentes qrnmicos entre dos o mas moleculas, por ejemplo, entre un agente o resto de union espedfica (tal como un anticuerpo) y una enzima (tal como HRP).
Hibridacion: Para formar pares de bases entre regiones complementarias de dos hebras de ADN, ARN o entre ADN y ARN, formando de ese modo una molecula duplex. Las condiciones de hibridacion que provocan grados particulares de rigurosidad variaran dependiendo de la naturaleza del metodo de hibridacion y la composicion y longitud de las secuencias de acido nucleico hibridantes. En lmeas generales, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica (tal como la concentracion de Na+) del tampon de hibridacion determinara la rigurosidad de la hibridacion. Los calculos respecto a las condiciones de hibridacion para obtener grados particulares de rigurosidad se analizan en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (capttulos 9 y 11).
Inmunohistoqmmica (IHC): Un metodo de determinacion de la presencia o distribucion de un antfgeno en una muestra detectando la interaccion del antfgeno con un agente o resto de union espedfica, tal como un anticuerpo. Una muestra que incluye un antfgeno (tal como un antfgeno diana) se incuba con un anticuerpo en condiciones que permiten la union a anticuerpo-antfgeno. La union de anticuerpo-antfgeno puede detectarse mediante un marcador detectable conjugado al anticuerpo (deteccion directa) o mediante un marcador detectable conjugado a un anticuerpo secundario, que se genera contra el anticuerpo primario (por ejemplo, deteccion indirecta). Los marcadores detectables incluyen, aunque sin limitacion, isotopos radiactivos, fluorocromos (tales como fluorescema, isotiocianato de fluorescema y rodamina), enzimas y moleculas cromogenicas.
Hibridacion in situ (ISH): Un tipo de hibridacion que usa una hebra de ADN o ARN complementaria marcada (es decir, sonda) para localizar una secuencia espedfica de ADN o ARN en una parte o seccion de tejido (in situ) o, si el tejido es suficientemente pequeno (por ejemplo, semillas de plantas, embriones de Drosophila), en el tejido completo
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(ISH de montaje completo). Esto es distinto de la inmunohistoqmmica, que localiza protemas en secciones tisulares. Puede usarse ISH de ADN para determinar la estructura de los cromosomas, tal como para su uso en diagnostico medico para evaluar la integridad cromosomica. Se usa ISH de ARN (histoqmmica de hibridacion) para medir y localizar ARNm u otros transcritos dentro de secciones tisulares o montajes completos.
Para histoqmmica de hibridacion, habitualmente se tratan celulas y tejidos de muestra para fijar los transcritos diana en su lugar y para aumentar el acceso de la sonda a la molecula diana. Como se ha indicado anteriormente, la sonda es un ADN complementario o un ARN complementario marcado (Ribosonda). La sonda hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada, y despues se retira por lavado el exceso de sonda (despues de la hidrolisis previa usando RNasa en el caso de sonda de ARN en exceso no hibridada). Los parametros de solucion, tales como temperatura, concentracion salina y/o detergente, pueden manipularse para retirar cualquier interaccion no identica (es decir, solamente las coincidencias exactas de secuencias permaneceran unidas). Despues, la sonda marcada que se ha marcado de forma eficaz, tal como con bases radiomarcadas, marcadas con fluorescencia o marcadas con antigeno (por ejemplo, digoxigenina), se localiza y cuantifica potencialmente en el tejido usando autorradiograffa, microscopia de fluorescencia o inmunohistoqmmica, respectivamente.
Enlazador: Como se usa en este documento, un enlazador es una molecula o grupo de atomos posicionado entre dos restos. Normalmente, los enlazadores son bifuncionales, es decir, el enlazador incluye un grupo funcional en cada extremo, donde los grupos funcionales se usan para acoplar el enlazador a los dos restos. Los dos grupos funcionales pueden ser iguales, es decir, un enlazador homobifuncional, o diferentes, es decir, un enlazador heterobifuncional.
Peptido enlazador: Un peptido dentro de un fragmento de union a anticuerpo (tal como un fragmento Fv) que sirve para unir indirectamente la cadena pesada variable a la cadena ligera variable. "Enlazador" tambien puede hacer referencia a un peptido que sirve para unir un resto de direccionamiento, tal como un scFv, a una molecula efectora, tal como una citotoxina o un marcador detectable.
Molecula de interes o molecula diana: Una molecula para la cual tiene que determinarse la presencia, localizacion y/o concentracion. Ejemplos de moleculas de interes incluyen protemas y secuencias de acido nucleico presentes en muestras tisulares.
Combinacion: Realizaciones de la presente descripcion permiten detectar multiples dianas en una muestra de forma sustancialmente simultanea, o secuencialmente, segun se desee, usando multiples conjugados diferentes. La combinacion puede incluir identificar y/o cuantificar acidos nucleicos, generalmente ADN, aRn, peptidos, protemas, de forma tanto individual como en todas y cada una de las combinaciones. La combinacion tambien puede incluir detectar dos o mas de un gen, un mensajero y una protema en una celula en su contexto anatomico.
Neoplasia y tumor: El proceso de crecimiento celular anormal e incontrolado. La neoplasia es un ejemplo de un trastorno proliferativo.
El producto de la neoplasia es un neoplasma (un tumor), que es un crecimiento anormal de tejidos que resulta de una division celular excesiva. Un tumor que no metastatiza se menciona como "benigno". Un tumor que invade el tejido adyacente y/o puede metastatizar se menciona como "maligno". Ejemplos de tumores hematologicos incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, leucemia mielogenica aguda y leucemia mieloblastica, promielocftica, mielomonocftica, monocftica y eritroleucemia), leucemias cronicas (tales como leucemia mielocftica (granulocftica) cronica, leucemia mielogenica cronica y leucemia linfocftica cronica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolente y de alto grado), mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, smdrome mielodisplasico, leucemia de celulas ciliadas y mielodisplasia.
Ejemplos de tumores solidos tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia linfoide, cancer pancreatico, cancer de mama, canceres pulmonares, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudonparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores del SNC (tales como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, menangiona, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).
Oligonucleotido: Una pluralidad de nucleotidos unidos que estan unidos por enlaces fosfodiester nativos, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 300 nucleotidos de longitud. Un analogo oligonucleotfdico se refiere a restos que funcionan de forma similar a los oligonucleotidos pero que tienen partes de origen no natural. Por ejemplo, los analogos oligonucleotfdicos pueden contener partes de origen no natural, tales como restos de azucar
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alterados o enlaces entre azucares, tales como un oligodesoxinucleotido fosforotioato. Los analogos funcionales de polinucleotidos de origen natural pueden unirse a ARN o ADN, e incluyen moleculas de acido peptidonucleico.
Oligonucleotidos y analogos oligonucleotidicos particulares pueden incluir secuencias lineales de hasta aproximadamente 200 nucleotidos de longitud, por ejemplo, una secuencia (tal como ADN o ARN) que es de al menos 6 bases, por ejemplo, de al menos 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100 o incluso 200 bases de longitud, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 50 bases, por ejemplo, de aproximadamente 10-25 bases, tal como de 12, 15, o 20 bases.
Sonda: Un acido nucleico aislado, un oligonucleotido sintetico aislado, unido a un marcador detectable o molecula indicadora. Los marcadores tfpicos incluyen isotopos radiactivos, sustratos enzimaticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzima. Los metodos para marcar y las directrices en la eleccion de los marcadores apropiados para diversos propositos se analizan, por ejemplo, en Sambrook et al. (En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1989) y Ausubel et al. (En Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. y Wiley-Intersciences, 1992).
Un experto en la materia apreciara que la especificidad de una sonda particular aumenta con su longitud. Por tanto, puede seleccionarse sondas para proporcionar una especificidad deseada, y pueden comprender al menos 17, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas nucleotidos consecutivos de la secuencia deseada de nucleotidos. En ejemplos particulares, las sondas pueden ser de al menos 100, 250, 500, 600 o 1000 acidos nucleicos consecutivo de una secuencia deseada de nucleotidos.
Polipeptido: Un polfmero en que los monomeros son restos de aminoacido que estan unidos juntos a traves de enlaces amida. Cuando los aminoacidos son alfa-aminoacidos, puede usarse el isomero optico L o el isomero optico D. Los terminos "polipeptido" o "protema", como se usan en este documento, pretenden abarcar cualquier secuencia de aminoacidos e incluyen secuencias modificadas tales como glucoprotemas. El termino "polipeptido" pretende cubrir espedficamente protemas de origen natural, asf como aquellas que se producen de forma recombinante o sintetica.
El termino "resto" o "resto de aminoacido" incluye referencias a un aminoacido que se incorpora en una protema, polipeptido o peptido.
Muestra: El termino "muestra" se refiere a cualquier sustancia (o material) lfquida, semisolida o solida en o sobre la cual puede estar presente una diana. En particular, una muestra puede ser una muestra biologica o una muestra obtenida de un material biologico. Ejemplos de muestras biologicas incluyen muestras tisulares y muestras de citologfa. En algunos ejemplos, la muestra biologica se obtiene de un sujeto animal, tal como un sujeto humano. Una muestra biologica es cualquier muestra solida o fluida obtenida de, excretada o secretada por cualquier organismo vivo, incluyendo sin limitacion organismos unicelulares, tales como bacterias, levaduras, protozoos y amebas entre otros, organismos multicelulares (tales como plantas o animales, incluyendo muestras de un sujeto humano sano o aparentemente sano o un paciente humano afectado por una afeccion o enfermedad a diagnosticar o investigar, tal como cancer). Por ejemplo, una muestra biologica puede ser un fluido biologico obtenido de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, bilis, fluido asdtico, saliva, fluido cefalorraqrndeo, humor acuoso o vftreo, o cualquier secrecion corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, fluido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infeccion o inflamacion), o fluido obtenido de una articulacion (por ejemplo, una articulacion normal o una articulacion afectada por una enfermedad). Una muestra biologica tambien puede ser una muestra obtenida de cualquier organo o tejido (incluyendo una muestra de biopsia o autopsia, tal como una biopsia de tumor) o puede incluir una celula (sea una celula primaria o celula cultivada) o medio condicionado por cualquier celula, tejido u organo. En algunos ejemplos, una muestra biologica es un extracto nuclear. En algunos ejemplos, una muestra biologica es citoplasma bacteriano. En otros ejemplos, una muestra es una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo es una celula, un tejido o seccion de sedimento celular preparado a partir de una muestra biologica obtenida de un sujeto. En un ejemplo, el sujeto es uno que esta en riesgo o ha adquirido una afeccion o enfermedad particular.
Se une espedficamente: Una expresion que se refiere a la union de un agente que se une preferentemente a una diana definida (tal como un anticuerpo a un antfgeno espedfico o una sonda de acido nucleico a una secuencia espedfica de acido nucleico). Con respecto a un antfgeno, "se une espedficamente" se refiere a la asociacion preferente de un anticuerpo u otro ligando, en su totalidad o en parte, con un polipeptido espedfico. Con respecto a una secuencia de acido nucleico, "se une espedficamente" se refiere a la asociacion preferente de una sonda de acido nucleico, en su totalidad o en parte, con una secuencia espedfica de acido nucleico.
Un agente o resto de union espedfica se une sustancialmente solo a una diana definida. Se reconoce que un grado minoritario de interaccion no espedfica puede aparecer entre una molecula, tal como un agente o resto de union espedfica, y un polipeptido no diana o secuencia de acido nucleico no diana. Aunque un anticuerpo selectivamente reactivo se une a un antfgeno, puede hacerlo con baja afinidad. La union espedfica de un anticuerpo a un antfgeno tfpicamente provoca un aumento de mas de 2 veces, tal como de mas de 5 veces, mas de 10 veces o mas de 100 veces en la cantidad del anticuerpo unido u otro ligando (por unidad de tiempo) a un polipeptido diana, en comparacion con un polipeptido no diana. Una diversidad de formatos de inmunoensayo son apropiados para
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seleccionar anticuerpos espedficamente inmunorreactivos con una protema particular. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria inmunoensayos ELISA en fase solida para seleccionar anticuerpos monoclonales espedficamente inmunorreactivos con una protema. Vease Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripcion de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden usarse para determinar inmunorreactividad espedfica.
La union espedfica de secuencia de la sonda de acido nucleico al acido nucleico normalmente provoca un aumento de mas de 2 veces, tal como de mas de 5 veces, mas de 10 veces o mas de 100 veces en la cantidad de sonda de acido nucleico unida a una secuencia de acido nucleico diana, en comparacion con un acido nucleico no diana. Una diversidad de condiciones de ISH, son apropiadas para seleccionar sondas de acido nucleico que se unen espedficamente con una secuencia particular de acido nucleico.
Resto de union espedfica o agente de union espedfica: Un miembro de un par de union espedfica. Los pares de union espedfica son pares de moleculas que se caracterizan porque se unen entre sf para la exclusion sustancial de union a otras moleculas (por ejemplo, los pares de union espedfica pueden tener una constante de union que es de al menos 103 M-1 mayor, 104 M-1 mayor o 105 M-1 mayor que una constante de union por cualquiera de los dos miembros del par de union con otras moleculas en una muestra biologica). Ejemplos particulares de restos de union espedfica incluyen protemas de union espedfica (por ejemplo, anticuerpos, lectinas, avidinas tales como estreptavidinas y protema A), secuencias de acido nucleico y acidos nucleicos de protema. Los restos de union espedfica tambien pueden incluir las moleculas (o partes de las mismas) que se unen espedficamente por dichas protemas de union espedfica.
Sustrato: Una molecula sobre la que actua un catalizador, tal como una enzima. En un ejemplo, un sustrato es 4- cloro-1-naftol (4-CN) o diaminobencidina (DAB).
Tejido: Una coleccion de celulas interconectadas que realizan una funcion similar dentro de un organismo.
Tiramina: Un compuesto que tiene la formula CgH^NO, tambien conocida como 4-(2-aminoetil)fenol.
Tiramida: Un derivado de tiramina, donde el grupo funcional amina de una molecula de tiramina ha formado un enlace amida con un grupo funcional que contiene carbonilo.
III. Vision global de varias realizaciones
A. Composiciones
Aspectos de esta descripcion se refieren a composiciones que potencian la deposicion de restos detectables sobre muestras tisulares, por ejemplo, secciones tisulares tales como las que se ensayan para la presencia de marcadores, tales como marcadores para enfermedades. Por tanto, se describen en este documento composiciones para potenciar la deposicion de restos detectables sobre muestras tisulares, por ejemplo, secciones tisulares. La deposicion potenciada proporciona una capacidad mejorada para detectar facilmente e identificar dianas en una muestra tisular, por ejemplo, mejorando la calidad, cantidad y/o relacion de senal a ruido de los restos detectables en muestras tisulares. En ciertas realizaciones, las composiciones y metodos descritos proporcionados en este documento aumentan y/o mejoran el recambio enzimatico aumentando las tasas de oxidacion enzimatica aparente, y de ese modo potencian la capacidad de la enzima para reaccionar con componentes de la composicion y aumentar la deposicion de restos detectables en el sitio diana espedfico, tal como el sitio de una molecula diana en una muestra. En dichas realizaciones, los productos enzimaticos son restos detectables que se depositan sobre muestras tisulares. Los componentes ejemplares de la composicion se detallan adicionalmente en las siguientes secciones.
1. Potenciadores
Las realizaciones descritas utilizan potenciadores o soluciones de potenciacion para mejorar la actividad enzimatica hacia la deposicion de restos detectables, por ejemplo, en el caso de HRP aumentando la cinetica de reaccion aparente de la enzima y aumentando de ese modo la tasa de deposicion del sustrato enzimatico, tal como el producto de reaccion cromogenica de DAB y HRP. Los potenciadores descritos pueden usarse en soluciones que comprenden otros componentes de la composicion, o pueden comprender una solucion diferente, donde la solucion se anade por separado a otros componentes de la composicion. La solucion puede ser una solucion acuosa, una solucion organica miscible en agua o cualquier combinacion de las mismas. Las soluciones organicas ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, glicoles, tales como propilenglicol, dimetilsulfoxido, tetrahidrofurano, dimetilformamida y cualquier combinacion de los mismos.
i. Analogos de pirimidina
Realizaciones particulares de las composiciones descritas incluyen como potenciadores analogos de pirimidina que tienen las siguientes formulas generales (Formula 1):
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Con referencia a la Formula 1, R1, R2, R3, y R4 pueden ser independientemente un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno. En algunos ejemplos, el halogeno es yodo, bromo, cloro o fluor. En algunos ejemplos, el resto que contiene heteroatomo es hidroxilo, eter, eter siKlico, ester, acido carbox^lico, sililo, fosfonato, fosfina, amida o Nr6R7 donde R6 y R7 son independientemente hidrogeno, grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, R1 y/o R3 estan unidos a R2 para formar un sistema de anillo condensado. Con referencia a la Formula 1, en algunos ejemplos, "A" es un heteroatomo (diferente de azufre), un atomo de carbono o cualquier combinacion de los mismos. Con referencia a la Formula 2, n es de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 1-3, 2-4, 3-5, 1-4, 2-5, o 1-5. En ejemplos espedficos, A es un atomo de carbono y n es 1. Analogos ejemplares de pirimidina para su inclusion en las composiciones descritas son pirimidina y 2-hidroxipirimidina.
En algunos ejemplos, los potenciadores estan presentes en una solucion, por ejemplo, para facilitar la distribucion desde maquinas automatizadas. En algunos ejemplos, los potenciadores estan presentes en la solucion a una concentracion de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,10 mM, aproximadamente 0,20 mM, aproximadamente 0,50 mM, aproximadamente 1,0 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 3,0 mM, aproximadamente 5,0 mM, aproximadamente 10,0 mM, aproximadamente 20,0 mM, aproximadamente 30,0 mM, aproximadamente 40,0 mM, aproximadamente 50,0 mM, aproximadamente 75,0 mM, o aproximadamente 100,0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,10 mM, aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 0,50 mM, aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1,0 mM, aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 10,0 mM, aproximadamente 5,0 mM a aproximadamente 50,0 mM, y de aproximadamente 20,0 mM a aproximadamente 100,0 mM.
ii. Potenciadores opcionales
En realizaciones particulares, los potenciadores de analogos de pirimidina se usan junto con potenciadores opcionales adicionales. En algunas realizaciones, los potenciadores opcionales se incluyen en la misma solucion que los potenciadores de analogo de pirimidina, y por tanto pueden ponerse en contacto con una muestra tisular como una unica composicion, tal como una unica solucion. En algunos casos podna ser deseable incluir los potenciadores opcionales en una solucion diferente, por ejemplo, para evitar la reactividad y/o solubilidad reducida. Por tanto, en algunas realizaciones, los potenciadores opcionales se incluyen en una solucion diferente de los potenciadores de analogo de pirimidina, y por tanto pueden ponerse en contacto con una muestra tisular desde una solucion diferente, por ejemplo, un suministro por etapas o suministro simultaneo.
Realizaciones particulares de las composiciones descritas contienen potenciadores opcionales que pueden usarse o no en combinacion con el analogo de pirimidina, dependiendo de factores tales como la aplicacion particular o restos detectables o enzimas, entre otros. En realizaciones particulares, una composicion descrita contiene, como potenciadores opcionales, potenciadores de heteroarilo que tienen la siguiente formula general (Formula 2):
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Pi Q 4 f) 4 4
Con referencia a la Formula 2, R , R , R y R son independientemente un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo, hidrogeno o cualquier combinacion de los mismos. En ciertos ejemplos, el halogeno es yodo, bromo, cloro o fluor. En ciertos ejemplos el resto que contiene heteroatomo es hidroxilo, eter, eter sililico, ester, acido carboxflico, sililo, fosfonato, fosfina, amida o NR6R7 donde R6 y R7 son independientemente hidrogeno, grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. Con referencia a la Formula 2 "A" es un heteroatomo (diferente de azufre), un atomo de carbono o cualquier combinacion de los mismos. Con referencia a la Formula 3 "B" es oxfgeno, carbono o nitrogeno. En ejemplos espedficos, A es un atomo de carbono y B es un atomo de nitrogeno. En ciertas realizaciones, los potenciadores de heteroarilo para su uso en las composiciones descritas se seleccionan de imidazol, L-histidina, tiazol, oxazol o cualquier combinacion de los
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mismos. En algunos ejemplos, los potenciadores estan presentes en una solucion, por ejemplo, para facilitar la distribucion desde maquinas automatizadas.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas contienen, como potenciadores opcionales, potenciadores de heteroarilo que tienen las siguientes formulas generales (Formula 3 y Formula 4):
R14
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R13
R12
Formula 3
R23.
R21'
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r1 8
•R17
Formula 4
Con referencia a las Formulas 3 y 4, R12-R23 son independientemente un grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo, hidrogeno o cualquier combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, el resto halogeno es yodo, bromo, cloro o fluor. En algunos ejemplos, el resto que contiene heteroatomo es hidroxilo, eter, eter silflico, ester, acido carboxflico, sililo, fosfonato, fosfina, amida o NR6R7 donde R6 y R7 son independientemente hidrogeno, grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones, R22 es una especie radical, tal como [O]\ o una especie cargada negativamente, tal como [O]". Con referencia a la Formula 4, en realizaciones particulares, R21 y R17 comprenden un grupo dimetilo geminal. Con referencia a la Formula 4 y/o 5 "A" es un heteroatomo (diferente de azufre), un atomo de carbono o cualquier combinacion de los mismos. En ejemplos espedficos, A es un atomo de nitrogeno, un atomo de oxfgeno, un atomo de carbono o cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones espedficas, los potenciadores de heteroarilo incluyen, aunque sin limitacion, N-oxido de pirimidina, N-oxido de piridina, N-metil morfolina (NMO), y 2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxilo (TEMPO).
En algunas realizaciones, las composiciones descritas contienen, como potenciadores opcionales, acidos boronicos organicos e inorganicos. En algunas realizaciones, los acidos boronicos organicos tienen la siguiente formula general (Formula 5):
R26
I
r24^b'r25
Formula 5
Con referencia a la Formula 5, R24, R25 y R26 son independientemente un grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. En ejemplos espedficos, dos o mas, tal como 2 o 3, de R24, R25 y R26 son hidroxilo, siendo los restantes R24, R25 o R26 un grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico o heteroarilo. En realizaciones particulares, R24, R25 y R26 son independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo y fenilo. En ciertas realizaciones de la composicion descrita, los acidos boronicos organicos son acido borico, acido fenilboronico, acido
4-AcHN-fenilboronico o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas incluyen compuestos fenolicos como potenciadores opcionales. En algunas realizaciones, los compuestos fenolicos tienen la siguiente formula general (Formula 6):
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Con referencia a la Formula 6, R27, R28, R29, un resto que contiene heteroatomo, halogeno o cualquier combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, el resto halogeno es yodo, bromo, cloro o fluor. En algunos ejemplos, el resto que contiene heteroatomo es hidroxilo, eter, eter sil^lico, ester, acido carboxflico, sililo, fosfonato, fosfina, amida o NR6R7 donde R6 y R7 son independientemente hidrogeno, grupo alifatico, arilo, grupo heteroalifatico, heteroarilo o cualquier combinacion de los mismos. En
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realizaciones particulares, dos grupos adyacentes cualesquiera seleccionados de R , R , R , R y R pueden estar unidos para formar un sistema de anillo aromatico o no aromatico condensado. En realizaciones particulares
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adicionales, al menos uno de R , R , R , R y R se selecciona de hidroxilo. Realizaciones de trabajo particulares se refieren a compuestos fenolicos como potenciadores opcionales, tales como pirocatecol.
2. Restos detectables
Las composiciones descritas permiten una deteccion aumentada de restos detectables. Estos restos detectables pueden seleccionarse de cualquier resto que sea capaz de usarse con muestras tisulares. Realizaciones particulares emplean restos detectables seleccionados de cromogenos, fluoroforos, conjugados de tiramida, que se forman entre tiramina y haptenos, nanopartfculas, fluoroforos y protemas, o cualquier combinacion de los mismos.
Realizaciones particulares utilizan cromogenos como restos detectables. Los cromogenos pueden seleccionarse de cualquier compuesto capaz de producir un cambio de color detectable tras la deposicion sobre el tejido, por ejemplo, una muestra tisular tal como una seccion tisular tfpicamente empleada para examen patologico. En algunos ejemplos, el resto detectable se deposita en el tejido de muestra despues de que haya actuado una enzima sobre el mismo. A modo de ejemplo, la enzima se dirige a una molecula diana en una muestra tisular, la enzima actua sobre el resto detectable, que a su vez se deposita sobre la muestra en la proximidad inmediata de la enzima, posibilitando de ese modo la deteccion, cuantificacion y/o localizacion de la molecula diana en una muestra tisular. Los restos detectables pueden usarse en soluciones que comprenden otros componentes de la composicion, o pueden comprender una solucion diferente, donde la solucion se anade por separado a otros componentes de la composicion.
Pueden disenarse restos de union espedfica para conjugarse directamente a un marcador. Usado de este modo, el complejo de union espedfica/marcador (es decir, la sonda) se pone en contacto con la muestra y se detecta la diana.
Tambien pueden asociarse indirectamente restos de union espedfica con un marcador. En algunos ejemplos, un primer resto de union espedfica se pone en contacto con una muestra. Los restos de union espedfica pueden estar basados en acido nucleico o basados en protema. El resto de union espedfica puede conjugarse a otro resto que despues se une, por ejemplo, por un anticuerpo secundario o un resto de union no basado en peptido, tal como biotina. El anticuerpo secundario o par de union no peptfdico puede unirse despues a un marcado, tal como una enzima. En otro ejemplo, puede asociarse indirectamente un resto de union espedfica con un marcador conjugando un resto de union espedfica, directa o indirectamente, a un peptido que tiene actividad enzimatica. La actividad enzimatica se elige de modo que, tras la adicion de un sustrato o sustratos, el sustrato o sustratos se conviertan en un resto detectable, o se convierta en un marcador mas activo.
Ejemplos no limitantes ejemplares de pares de enzima/sustrato incluyen los siguientes: HRP/DAB con un sustrato cromogenico o sustrato fluorogenico. Se conocen otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato por los expertos en la materia. Para una revision general de estos, veanse las patentes de Estados Unidos n.° 4.275.149, y 4.318.980. Cuando una sonda se prepara a partir de la asociacion indirecta de una o mas moleculas adicionales, las moleculas adicionales pueden mencionarse como componentes de la sonda.
En algunos ejemplos, el marcador se conjuga indirectamente con un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede conjugarse a biotina donde la biotina se une selectivamente a avidina para posterior deteccion. Como alternativa, un anticuerpo se conjuga con un pequeno hapteno y un marcador se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno. Por tanto, puede conseguirse la conjugacion indirecta del marcador con el resto de direccionamiento.
Cuando la sonda incluye una enzima que reacciona con un sustrato para generar el marcador de deteccion, el sustrato puede ser un compuesto cromogenico. Existen numerosos ejemplos de dichos sustratos. Por ejemplo, muchos de dichos compuestos pueden adquirirse de Invitrogen, Eugene OR. Ejemplos ni limitantes particulares de compuestos cromogenicos incluyen nitrofenil-p-D-galactopiranosido (ONPG), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-
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galactopiranosido (X-Gal), metilumbeliferil-p-D-galactopiranosido (MU-Gal), p-nitrofenil-a-D-galactopiranosido (PNP),
5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronido (X-Gluc), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP), diamino (DAB), tetrametilbencidina (tMb), 2,2'-azino-di-[sulfonato de 3-etilbenzotiazolina] (ABTS), o- dianisidina, 4- cloronaftol (4-CN) (usado junto con DMPDA/DEPDA/MBTH/ADET, de acuerdo con Kidwell, et al. Anal. Bio- chem., (1991), 192, 207), y o-fenilendiamina (OPD).
Realizaciones particulares utilizan fluoroforos como restos detectables. Los fluoroforos pueden seleccionarse de compuestos que muestran fluorescencia incluyendo, aunque sin limitacion, fluorescemas, luminoforos, cumarinas, colorantes BODIPY, resorufinas y rodaminas. Ejemplos de fluoroforos particulares que pueden usarse en las sondas descritas en este documento se proporcionan en la patente de Estados Unidos n.° 5.866.366 de Nazarenko et al., tales como acido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfonico, acridina y derivados tales como acridina e isotiocianato de acridina, acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS), 4-amino-N-[3- vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (amarillo Lucifer VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, amarillo Brilliant, cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7- amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151); cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5"- dibromopirogalol-sulfoneftalema (rojo de Bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; acido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfonico; acido 4,4'- diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfonico; cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescema y derivados tales como
5- carboxifluorescema (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluorescema (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-
carboxifluorescema (JOE), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato verde de Malaquita; 4-metilumbeliferona; orto cresolftalema; nitrotirosina;
pararrosanilina; rojo Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdetudo; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinimidil 1-pireno; Rojo 4 reactivo (CIBACROn™ rojo Brilliant 3B-A); rodamina y derivados tales como
6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), sulfonil cloruro de lisamina rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforrodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo sulforrodamina 101 (rojo Texas); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; acido rosolico y derivados de quelato de terbio; rojo LightCycler 640; Cy5.5; y Cy5 (pueden encontrarse muchos ejemplos adicionales de moleculas fluorescentes en in The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR).
En otras realizaciones, el resto detectable puede comprender un conjugado de tiramida que comprende un compuesto de tiramina conjugado con un resto detectable seleccionado de nanopartmulas, fluoroforos y protemas. Ciertas realizaciones usan conjugados de tiramida que comprenden tiramina y un hapteno donde el hapteno se selecciona de oxazol, pirazol, tiazol, benzofurazano, triterpeno, urea, tiourea, nitroarilo, rotenoide, cumarina, ciclolignano, heterobiarilo, azoarilo, benzodiazepina, o combinaciones de los mismos.
Otras realizaciones contempladas por la presente descripcion incluyen conjugados de tiramida que incluyen un compuesto de tiramina unido a una nanopartmula, tal como un punto cuantico. Otras realizaciones particulares incluyen un compuesto de tiramina unido a un fluoroforo, que puede seleccionarse de fluorescemas, luminoforos, cumarinas, colorantes BODIPY, resorufinas y rodaminas. Otras realizaciones particulares mas se refieren a un compuesto de tiramina unido a una protema, que puede seleccionarse de una enzima, tal como peroxidasa de rabano rusticano, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucuronidasa o p-lactamasa.
En realizaciones particulares, el marcador detectable o hapteno se une al compuesto de tiramina mediante un enlazador, tal como un enlazador alifatico, un enlazador heteroalifatico o cualquier otro resto de union flexible con reactividades comparables. Por ejemplo, un compuesto de tiramina puede modificarse covalentemente con un marcador detectable mediante un enlazador heterobifuncional de polialquileneglicol tal como un enlazador heterobifuncional de polietilenglicol (PEG).
Una clase de enlazadores adecuada para formar conjugados descritos de tiramina-resto detectable y conjugados de tiramida-haptenos son compuestos alifaticos, tales como cadenas de hidrocarburo alifatico que tienen uno o mas sitios de insaturacion o cadenas alquilo. La cadena alifatica tambien incluye normalmente grupos funcionales terminales, incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitacion, un grupo carbonilo reactivo, un grupo amina reactivo, un grupo tiol reactivo o un grupo foto-reactivo, que facilita el acoplamiento a restos detectables y a otros compuestos deseados. La longitud de la cadena puede variar, pero normalmente tiene un lfmite practico superior de aproximadamente 30 atomos. Enlaces de cadena mayores de aproximadamente 30 atomos de carbono han demostrado ser menos eficaces que compuestos que tienen enlaces de cadena mas pequena. Por tanto, los enlazadores de cadena alifatica normalmente tienen una longitud de cadena de aproximadamente 1 atomo de carbono a aproximadamente 30 atomos de carbono. Sin embargo, un experto en la materia apreciara que, si un enlazador particular tiene mas de 30 atomos, y aun funciona de forma eficaz uniendo el resto detectable a un compuesto de tiramina, y el conjugado aun funciona segun lo deseado, entonces dichos enlaces de cadena aun estan dentro del alcance de la presente invencion. Las concentraciones tfpicas para conjugados de tiramida-hapteno que comprenden los enlazadores descritos vanan de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 100 pM. Incluso concentraciones mas tfpicas vanan de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 55 pM.
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Otra clase de enlazadores utiles son oxidos de alquileno. Los oxidos de alquileno estan representados en este documento por referencia a glicoles, tales como etilenglicoles. Un experto en la materia apreciara que, segun aumenta la cantidad de atomos de ox^geno, puede aumentar tambien la hidrofilicidad del compuesto. Por tanto, los enlazadores de la presente descripcion normalmente tienen una formula de (-OCH2CH2O-)n donde n es de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, pero mas particularmente es de aproximadamente 2 a aproximadamente 8. En algunos ejemplos, los restos detectables estan presentes en la solucion a una concentracion de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 10,0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM, de aproximadamente 0,02 mM, de aproximadamente 0,05 mM, de aproximadamente 0,10 mM, de aproximadamente 0,20 mM, de aproximadamente 0,50 mM, de aproximadamente 1,0 mM, de aproximadamente 2,0 mM, de aproximadamente 3,0 mM, de aproximadamente 5,0 mM, o de aproximadamente 10,0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,10 mM, de aproximadamente 0,05 mM de aproximadamente 0,50 mM, de aproximadamente 0,4 mM de aproximadamente 1,0 mM, de aproximadamente 0,5 mM de aproximadamente
2.0 mM, y de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 10,0 mM.
3. Conjugados de resto de union espedfica
Realizaciones particulares se refieren al uso de conjugados que comprenden un resto de union espedfica y una enzima, donde el resto de union espedfica es capaz de reconocer y unirse a una diana particular en una muestra. Los restos de union espedfica pueden seleccionarse de oligonucleotidos, acidos nucleicos, protemas y peptidos. Realizaciones particulares se refieren al uso de protemas, tales como anticuerpos, como restos de union espedfica.
En realizaciones particulares, el resto de union espedfica se une a una enzima. Ejemplos de enzimas contempladas del metodo pueden incluir oxidorreductasas, tales como peroxidasas. Realizaciones particulares se refieren al uso de peroxidasa de rabano rusticano, glutation peroxidasa y cualquier otra peroxidasa que contenga un resto hemo.
En ciertas realizaciones, pueden usarse conjugados que comprenden un resto de union espedfica y un hapteno junto con un segundo conjugado que comprende un anticuerpo anti-hapteno y una enzima. En estas realizaciones particulares, el resto de union espedfica, normalmente un anticuerpo, puede reconocer una diana en una muestra y unirse a la misma. El resto de union espedfica se une a un hapteno, que se reconocera por el segundo conjugado que comprende el anticuerpo anti-hapteno y una enzima. Este segundo conjugado de anticuerpo se unira con el primer conjugado, uniendo de ese modo la enzima a la diana. El hapteno puede seleccionarse de oxazol, pirazol, tiazol, benzofurazano, triterpeno, urea, tiourea, nitroarilo, rotenoide, cumarina, ciclolignano, heterobiarilo, azoarilo, benzodiazepina, o combinaciones de los mismos. Anticuerpos ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, IgG de conejo, IgG de raton, IgM de raton, e IgG de cabra. Enzimas ejemplares son las descritas previamente. En algunos ejemplos, los conjugados del resto de union espedfica y una enzima estan presentes en la solucion a una concentracion de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 10,0 mM, tal como aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,10 mM, aproximadamente 0,20 mM, aproximadamente 0,50 mM, aproximadamente 1,0 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 3,0 mM, aproximadamente 5,0 mM, o aproximadamente 10,0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,10, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,50, de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,0, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0, y de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0.
4. Otros componentes
Realizaciones particulares se refieren a composiciones que comprenden adicionalmente sales que contienen metales del Grupo I o del Grupo II que tienen una formula MXn o MX, donde M es un metal del Grupo I o del Grupo II, y X se selecciona de haluro, tal como fluoruro, bromuro, cloruro y yoduro; iones que contienen oxfgeno, tales como carbonato, hidroxido y fosfato. Realizaciones particulares se refieren al uso de un metal del Grupo I seleccionado de sodio, litio, cesio y potasio. Otras realizaciones particulares se refieren al uso de metales del Grupo II seleccionados de magnesio, calcio, estroncio y bario. Realizaciones particulares utilizan potenciadores de sal de calcio y/o magnesio seleccionados de cloruro de calcio, cloruro de magnesio y carbonato de calcio. En algunos ejemplos, los potenciadores opcionales estan presentes en la soluciona una concentracion de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, tal como aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,10 mM, aproximadamente 0,20 mM, aproximadamente 0,50 mM,
aproximadamente 1,0 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 3,0 mM, aproximadamente 5,0 mM,
aproximadamente 10,0 mM, aproximadamente 20,0 mM, aproximadamente 30,0 mM, aproximadamente 40,0 mM,
aproximadamente 50,0 mM, aproximadamente 75,0 mM, o aproximadamente 100,0 mM, tal como de
aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,10 mM, de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 0,50 mM, de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1,0 mM, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente
2.0 mM, de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 10,0 mM, de aproximadamente 5,0 mM a aproximadamente 50,0 mM, y de aproximadamente 20,0 mM a aproximadamente 100,0 mM.
Realizaciones particulares se refieren a composiciones que comprenden adicionalmente oxidantes, inhibidores y tensioactivos como componentes que pueden usarse en cualquier combinacion con cualquiera de los componentes descritos previamente. Los oxidantes pueden incluir cualquier compuesto capaz de activar de forma eficaz la enzima. Realizaciones particulares se refieren al uso de peroxidos, tales como peroxido de hidrogeno, como
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oxidantes usados para activar la enzima. Normalmente, el oxidante es peroxido de hidrogeno al 0,03 %.
Puede seleccionarse un inhibidor de cualquier compuesto capaz de inhibir de forma eficaz la enzima despues de haber reaccionado suficientemente de un modo que provoque la deposicion del resto detectable. Realizaciones particulares se refieren a inhibidores seleccionados de peroxidasas. Normalmente, se usa peroxido de hidrogeno como inhibidor. Ciertas realizaciones se refieren al uso de peroxido de hidrogeno al 3 % como inhibidor. En realizaciones particulares, el inhibidor se anade a la muestra posterior a la adicion de los otros componentes de la composicion.
Realizaciones particulares de esta descripcion se refieren a composiciones para su uso en la deteccion de una molecula diana en una muestra, tal como una muestra tisular. En algunas realizaciones, las composiciones comercialmente viables comprenden un analogo de pirimidina, un potenciador opcional, un resto detectable, un conjugado de resto de union espedfica, una enzima, un oxidante y un tensioactivo. Estos componentes de la composicion pueden anadirse en cualquier orden y cualquier combinacion que provoque la deposicion eficaz del resto detectable en la diana en la muestra. Las composiciones pueden usarse junto con un segundo anticuerpo, que se conjuga a una enzima, un oxidante y un colorante.
En realizaciones de trabajo particulares, el analogo de pirimidina es 2-hidroxipirimidina. En realizaciones de trabajo particulares, el conjugado de resto de union espedfica es un conjugado de anticuerpo IgG con hapteno y el segundo anticuerpo comprende un conjugado multimerico de HRP anti-hapteno.
Realizaciones descritas particulares se refieren al uso de un tensioactivo. Los tensioactivos se clasifican como anionicos, cationicos o no ionicos, dependiendo de su modo de accion qmmica. Los tensioactivos no ionicos funcionan mediante un mecanismo de union de hidrogeno. Ademas, los tensioactivos reducen la tension interfacial entre dos lfquidos. Una molecula de tensioactivo normalmente tiene una "cabeza" polar o ionica y una "cola" de hidrocarburo no polar. Tras su disolucion en agua, las moleculas de tensioactivo se agregan y forman micelas, en que las colas no polares estan orientadas hacia adentro y las cabezas polares o ionicas estan orientadas hacia afuera hacia el entorno acuoso. Las colas no polares crean un "bolsillo" no polar dentro de la micela. Los compuestos no polares en la solucion se secuestran en los bolsillos formados por las moleculas de tensioactivo, permitiendo por tanto que los compuestos no polares permanezcan mezclados con la solucion acuosa. En realizaciones descritas particulares, el tensioactivo puede usarse para producir propagacion uniforme de reactivos a traves de una seccion tisular, asf como disminucion de la tincion de fondo.
Ejemplos de tensioactivos incluyen, aunque sin limitacion, alquil eter de polioxietileno, donde el alquilo es (CH2)m y el oxietileno es (C2H40)n, donde M un numero entero de 5 a 16, de 8 a 14, o de 10 a 12 y N es un numero entero de 10 a 40, de 15 a 30, o de 20 a 28. En una realizacion, el tensioactivo es lauril eter de polioxietileno que tiene la formula (C2H40)23C-i2H250H. En otra realizacion, el tensioactivo es un monoalquilato de polioxietilen (20) sorbitan, comprendiendo el monoalquilato entre 8 y 14 carbonos. En otra realizacion, el tensioactivo es un polioxietileno de alcohol secundario lineal que tiene una formula C-i2_i4H25_2gO(CH2CH2O]x, donde x es igual a un numero entero entre 2 y 12. En otra realizacion mas, el tensioactivo es un octil fenil eter de polioxietileno. Se venden tensioactivos ejemplares con los nombres: Brij® 35, TWEEN®, Tergitol™, Triton™, Ecosurf™, Dowfax™, polisorbato 80™, BigCHAP, Deoxy BigCHAP, IGEpAL®, Saponina, Thesit®, Nonidet®, Pluronic F-68, digitonina, desoxicolato, y similares. Realizaciones particulares de trabajo descritas se refieren al uso de tensioactivos seleccionados de Brij® 35, TWEEN®, Tergitol™, Triton™.
B. Metodo de deteccion de una molecula diana
Las composiciones descritas son particularmente utiles para la deteccion de moleculas diana en muestras porque actuan de forma sinergica para proporcionar deposicion maximizada durante tincion tisular IHC o ISH. Por tanto, la presente descripcion proporciona un metodo de deteccion de una molecula diana en una muestra, tal como una muestra tisular. En algunas realizaciones, el metodo incluye poner en contacto una muestra con una solucion de potenciacion que incluye un analogo de pirimidina como se describe en la seccion precedente (Seccion A), poner en contacto la muestra con una enzima y poner en contacto la muestra con un resto detectable capaz de detectarse usando tecnicas de deposicion o fluorescentes. En algunos ejemplos, la enzima actua sobre un sustrato para catalizar la produccion del resto detectable, que se deposita sobre la muestra en la localizacion de la molecula diana, posibilitando de ese modo la deteccion de la molecula diana. El resto detectable se detecta detectando de ese modo la molecula diana en una muestra. En algunos ejemplos, se mide la intensidad y/o la localizacion de una senal producida por el resto detectable, por ejemplo, para determinar la cantidad y/o la localizacion de la molecula diana en la muestra tisular. La diana puede ser cualquier molecula de interes para la que tiene que determinarse la presencia, la localizacion y/o la concentracion. Ejemplos de moleculas de interes incluyen protemas y secuencias de acido nucleico. En algunas realizaciones, el analogo de pirimidina es pirimidina y/o 2-hidroxipirimidina.
En algunas realizaciones, la enzima se inmoviliza sobre la diana incubando la muestra con un conjugado enzimatico que se une a la diana. La enzima puede conjugarse a cualquier resto capaz de unirse a la diana, por ejemplo, puede conjugarse un anticuerpo o acido nucleico que reconozca espedficamente la molecula diana. Los restos adecuados incluyen, aunque sin limitacion, anticuerpos, nucleotidos, oligonucleotidos, protemas, peptidos o aminoacidos.
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En otras realizaciones, la inmovilizacion de la enzima es un proceso de multiples etapas. Por ejemplo, la muestra puede incubarse con un primer resto (por ejemplo, un anticuerpo, un nucleotido, un oligonucleotido, una protema, un oligopeptido, un peptido o un aminoacido) que se une a la diana. La muestra despues puede incubarse con un conjugado enzimatico que comprende un resto que es capaz de unirse al primer resto. En algunas realizaciones, cuando el primer resto es un anticuerpo contra la diana, el proceso de dos etapas puede ser mas versatil porque permite al usuario emplear un conjugado "universal" de enzima-anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo, el conjugado de enzima-anticuerpo puede incluir un anticuerpo que es capaz de unirse a cualquier anticuerpo monoclonal de conejo, por ejemplo, un anticuerpo secundario. El proceso de multiples etapas puede eliminar la necesidad de generar un conjugado de enzima-anticuerpo que sea adecuado para cada diana.
En algunas realizaciones, el primer resto puede ser una sonda marcada, tal como un oligonucleotido marcado. Despues de que la sonda haya hibridado con la muestra, se introduce un primer anticuerpo que reconoce el marcador y se une a la sonda marcad. El primer anticuerpo puede ser un conjugado de enzima-anticuerpo. Sin embargo, si el primer anticuerpo no esta conjugado a una enzima, se introduce un conjugado de enzima-anticuerpo donde el resto de anticuerpo del conjugado reconoce y se une al primer anticuerpo.
En algunas realizaciones, la enzima es una peroxidasa tal como peroxidasa de rabano rusticano o glutation peroxidasa o una oxidorreductasa. Por tanto, se seleccionan condiciones adecuadas para la reaccion enzimatica tal como una concentracion salina y pH que posibiliten que la enzima realice su funcion deseada, por ejemplo, para convertir el sustrato en un resto detectable que se deposite sobre la muestra tisular en el sitio de la molecula diana. La reaccion se realiza a una temperatura que es adecuada para la enzima. Por ejemplo, si la enzima es peroxidasa de rabano rusticano, la reaccion puede realizarse a aproximadamente 35-40 °C.
En algunos ejemplos, un resto detectable es un cromogeno, un fluoroforo, un hapteno o una protema. En ejemplos espedficos, el resto detectable es 1,3-diaminobencidina, 3-amino-9-etilcarbazol o tetrametilbencidina o un producto de reaccion de los mismos. Ejemplos adicionales de cromogenos para su uso en los metodos descritos se dan en la seccion precedente (Seccion A).
En otros ejemplos, un resto detectable es un fluoroforo, tal como una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un colorante BODIPY, una resorufina o una rodamina. Ejemplos adicionales de fluoroforos para su uso en las realizaciones del metodo descrito se dan en la seccion precedente (Seccion A).
En otros ejemplos, un resto detectable es un hapteno, tal como un oxazol, pirazol, un tiazol, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un nitroarilo, un rotenoide, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo, o benzodiazepina.
En realizaciones espedficas, el resto detectable se conjuga a tiramina, por ejemplo, mediante un enlazador, tal como un enlazador alifatico o heteroalifatico de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 atomos de carbono en una cadena. En realizaciones espedficas, el enlazador es un oxido de alquileno, tal como etilenglicol o un polfmero del mismo, por ejemplo, un poifmero con 1 a aproximadamente 15 unidades de etilenglicol. Cuando se usan tiraminas con los metodos descritos, puede usarse amplificacion de la senal de tiramida para amplificar adicionalmente la senal generada. La amplificacion de senal de tiramida utiliza la actividad catalftica de una enzima peroxidasa para unir covalentemente un resto de tiramina o un derivado de tiramina a una fase solida. La fase solida puede ser, por ejemplo, componentes proteicos de celulas o estructuras celulares que se inmovilizan sobre un sustrato tal como un portaobjetos de microscopio. Algunas enzimas peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rabano rusticano), en presencia de un peroxido, pueden catalizar la dimerizacion de compuestos fenolicos. Por tanto, si se anade tiramina a una muestra que contiene protemas en presencia de peroxidasa de rabano rusticano y peroxido (por ejemplo, peroxido de hidrogeno), el grupo fenol de tiramina puede formar un dfmero con el grupo fenol de un aminoacido tirosina.
Solamente las moleculas de tiramina en cercana proximidad a la enzima inmovilizada reaccionaran y formaran dfmeros con restos de tirosina en las cercamas de, o proximales a, la enzima inmovilizada, incluyendo restos de tirosina en la propia enzima, restos de tirosina en el anticuerpo con el que esta conjugada la enzima y/o restos de tirosina en la muestra que estan proximales a la enzima inmovilizada, tal como dentro de aproximadamente 100 nm, dentro de aproximadamente 50 nm, dentro de aproximadamente 10 nm o dentro de aproximadamente 5 nm de la enzima inmovilizada. Por ejemplo, el resto de tirosina puede estar dentro de una distancia de aproximadamente 10 angstrom a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 10 angstrom a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 10 angstrom a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 10 angstrom a aproximadamente 5 nm desde la enzima inmovilizada. Dicha union proximal permite que la diana se detecte con al menos algun grado de especificidad como los metodos convencionales de tincion usados con IHS y/o ISH. Por ejemplo, realizaciones del metodo descrito permiten distinguir estructuras subcelulares, por ejemplo, membrana nuclear frente a la region nuclear, membrana celular frente a la region citoplasmatica, etc.
Una vez la enzima esta inmovilizada sobre la muestra, se introduce el conjugado de tiramida en condiciones adecuadas para posibilitar que la enzima reaccione con la tiramida. Normalmente, la enzima es una peroxidasa, tal
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como peroxidasa de rabano rusticano. En dichas condiciones, la tiramida reacciona con el peroxido y la enzima, convirtiendo la tiramida en una forma activa que se une covalentemente a la muestra, normalmente por union a un resto de tirosina proximal a la enzima inmovilizada, incluyendo restos de tirosina dentro de la propia enzima inmovilizada. Despues de que el conjugado de tiramida se haya unido a la muestra, su presencia se detecta por medios adecuados, por ejemplo, en virtud de un resto detectable unido a la tiramida.
En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto adicionalmente con al menos un potenciador opcional, tal como uno o mas de un grupo heteroarilo, una sal que contiene metal del Grupo I o del Grupo II, un compuesto que contiene boro, un compuesto de fenol. Potenciadores opcionales ejemplares se describen en la seccion precedente (Seccion A). En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto adicionalmente con un oxidante, tal como una peroxidasa, por ejemplo, hidrogeno peroxidasa. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto adicionalmente con un tensioactivo, tal como Brij® 35, TWEEN®, Tergitol™, y Triton™. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto adicionalmente con un antioxidante, tal como estannato de sodio, metabisulfato de sodio y bisulfato de sodio.
Las realizaciones del metodo descrito en este documento pueden realizarse de forma manual o automatica, por ejemplo, en un instrumento automatizado de procesamiento de tejidos. Los sistemas automatizados normalmente estan al menos parcialmente, sino de forma sustancialmente completa, bajo el control de un ordenador. Como los sistemas automatizados normalmente estan al menos parcialmente controlados por ordenador, ciertas realizaciones de la presente descripcion tambien se refieren a uno o mas medios tangibles legibles en ordenador que almacenan instrucciones ejecutables por ordenador para hacer que un ordenador realice realizaciones descritas del metodo.
C. Muestras y dianas
Las muestras incluyen componentes biologicos y generalmente se sospecha que incluyen una o mas moleculas diana de interes. Las moleculas diana pueden estar sobre la superficie de celulas y las celulas pueden estar en una suspension o en una seccion tisular. Las moleculas diana tambien pueden ser intracelulares y detectarse tras lisis celular o penetracion de la celula por una sonda. Los expertos en la materia apreciaran que el metodo de deteccion de moleculas diana en una muestra variara dependiendo del tipo de muestra y sonda que se este usando. Los metodos de recogida y preparacion de muestras son conocidos en la tecnica.
Las muestras para su uso en las realizaciones del metodo y con la composicion descrita en este documento, tal como una muestra tisular u otra muestra biologica, pueden prepararse usando cualquier metodo conocido en la tecnica por los expertos en la materia. Las muestras pueden obtenerse de un sujeto para exploracion rutinaria o de un sujeto que se sospecha un trastorno, tal como una anormalidad genetica, infeccion o una neoplasia. Las realizaciones descritas del metodo descrito tambien pueden aplicarse a muestras que no tienen anormalidades geneticas, enfermedades, trastornos, etc., mencionadas como muestras "normales". Dichas muestras normales son utiles, entre otras cosas, como controles para comparacion con otras muestras. Las muestras pueden analizarse para muchos propositos diferentes. Por ejemplo, las muestras pueden usarse en un estudio cientffico o para el diagnostico de una enfermedad sospechosa, o como indicadores de pronostico para el exito del tratamiento, supervivencia, etc.
Las muestras pueden incluir multiples dianas que pueden unirse espedficamente a una sonda o molecula indicadora. Las dianas pueden ser secuencias de acido nucleico o protemas. Durante toda esta descripcion cuando se hace referencia a una protema diana se entiende que las secuencias de acido nucleico asociadas con esa protema tambien pueden usarse como diana. En algunos ejemplos, la diana es una protema o molecula de acido nucleico de un patogeno, tal como un virus, bacteria o parasito intracelular, tal como de un genoma vmco. Por ejemplo, una protema diana puede producirse a partir de una secuencia de acido nucleico diana asociada con (por ejemplo, correlacionada con, implicada de forma causal en, etc.) una enfermedad.
Una secuencia de acido nucleico diana puede variar sustancialmente en tamano. Sin limitacion, la secuencia de acido nucleico puede tener una cantidad variable de restos de acido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico diana puede tener al menos aproximadamente 10 restos de acido nucleico o al menos aproximadamente 20, 30, 50, 100, 150, 500, 1000 restos. Asimismo, un polipeptido diana puede variar sustancialmente en tamano. Sin limitacion, el polipeptido diana incluira al menos un epftopo que se une a un anticuerpo espedfico de peptido o fragmento del mismo. En algunas realizaciones ese polipeptido puede incluir al menos dos epftopos que se unen a un anticuerpo espedfico de peptido, o fragmento del mismo.
En ejemplos no limitantes espedficos, se produce una protema diana por una secuencia de acido nucleico diana (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) asociada con una neoplasia (por ejemplo, un cancer). Se han identificado numerosas anormalidades cromosomicas (incluyendo translocaciones y otros reordenamientos, amplificacion o delecion) en celulas neoplasicas, especialmente en celulas cancerosas, tales como leucemias de celulas B y celulas T, linfomas, cancer de mama, cancer de colon, canceres neurologicos y similares. Por lo tanto, en algunos ejemplos, al menos una parte de la molecula diana se produce por una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) amplificada o delecionada en al menos un subconjunto de celulas en una muestra.
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Se sabe que los oncogenes son responsables de varias neoplasias humanas. Por ejemplo, los reordenamientos cromosomicos que implican el gen SYT localizado en la region de rotura del cromosoma 18q11.2 son comunes entre tumores de tejido blando de sarcoma sinovial. La translocacion t(18q11.2) puede identificarse, por ejemplo, usando sondas con diferentes marcadores: la primera sonda incluye moleculas de acido nucleico FPC generadas a partir de una secuencia de acido nucleico diana que se extiende de forma distal desde el gen SYT, y la segunda sonda incluye el acido nucleico FPC generado a partir de una secuencia de acido nucleico diana que se extiende 3' o proximal al gen SYT. Cuando se usan sondas correspondientes a estas secuencias de acido nucleico diana (por ejemplo, secuencias genomicas de acidos nucleico diana) en un procedimiento de hibridacion in situ, las celulas normales, que carecen de un t(18q11.2) en la region genica SYT, muestran dos senales de fusion (generadas por los dos marcadores en cercana proximidad), lo que refleja las dos copias intactas de SYT. Celulas anormales con un t(18q11.2) muestran una unica senal de fusion.
En otros ejemplos, se selecciona una protema diana producida a partir de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) que es un gen supresor tumoral que esta delecionado (perdido) en celulas malignas. Por ejemplo, la region pl6 (que incluye D9S1749, D9S1747, p16(INK4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B), y D9S1752) localizada en el cromosoma 9p21 esta delecionada en ciertos canceres de vejiga. Deleciones cromosomicas que implican la region distal del brazo corto del cromosoma 1 (que abarca, por ejemplo, SHGC57243, TP73, EGfL3, ABL2, ANGPTL1, y SHGC-1322), y la region pericentromerica (por ejemplo, 19p13-19q13) del cromosoma 19 (que abarca, por ejemplo, MAN2B1, ZNF443, ZNF44, CRX, GlTsCr2, y GLTSCR1) son rasgos moleculares caractensticos de ciertos tipos de tumores solidos del sistema nervioso central.
Los ejemplos mencionados anteriormente se proporcionan unicamente con fines de ilustracion y no pretenden ser limitantes. Los expertos en la materia conocen otras numerosas anormalidades citogeneticas que se correlacionan con transformacion y/o crecimiento neoplasico. Las protemas diana que se producen por secuencias de acido nucleico (por ejemplo, secuencias genomicas de acido nucleico diana), que se han correlacionado con transformacion neoplasica y que son utiles en los metodos descrito, tambien incluyen el gen EGFR (7p12; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC 000007, nucleotidos 55054219-55242525), el gen C-MYC (8q24.21; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000008, nucleotidos 128817498-128822856), D5S271 (5p15.2), gen de lipoprotema lipasa (LPL) (8p22; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000008, nucleotidos 1984105819869049), RB1 (13q14; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ C_000013, nucleotidos 47775912-47954023), p53 (17p13.1; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleotidos 75124647531642)), N-MYC (2p24; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 151835231-151854620), CHOP (12q13; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000012, complemento, nucleotidos 56196638-56200567), FUS (16p11.2; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000016,
nucleotidos 31098954-31110601), FKHR (13p14; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000013,
complemento, nucleotidos 40027817-40138734), asf como, por ejemplo: ALK (2p23; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 29269144-29997936), cadena pesada de Ig, CCND1 (11q13; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000011, nucleotidos 69165054..69178423), BCL2 (18q21.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000018, complemento, nucleotidos 58941559-59137593), BCL6 (3q27; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000003, complemento, nucleotidos 188921859-188946169), MALF1, AP1 (1p32-p31; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleotidos 5901905159022373), TOP2A (17q21-q22; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleotidos 35798321-35827695), TMPRSS (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000021, complemento, nucleotidos 41758351-41801948), ERG (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000021,
complemento, nucleotidos 38675671-38955488); eTv1 (7p21.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™
NC_000007, complemento, nucleotidos 13897379-13995289), EWS (22q12.2; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000022, nucleotidos 27994271-28026505); FLI1 (11q24.1-q24.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ C_000011, nucleotidos 128069199-128187521), PAX3 (2q35-q37; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleotidos 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000001, nucleotidos 18830087-18935219), PTEN (10q23.3; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000010, nucleotidos 89613175-89716382), AKT2 (19q13.1-q13.2; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000019, complemento, nucleotidos 45431556-45483036), MYCL1 (1p34.2; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleotidos 40133685-40140274), REL (2p13-p12; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000002, nucleotidos 60962256-61003682) y CSF1R (5q33-q35; por ejemplo, n.° de acceso a GENBANK™ NC_000005, complemento, nucleotidos 149413051-149473128).
En otros ejemplos, una protema diana se selecciona de un virus u otro microorganismo asociado con una enfermedad o afeccion. La deteccion de la secuencia de acido nucleico diana derivada del virus o microorganismo (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) en una muestra celular o tisular es indicativa de la presencia del organismo. Por ejemplo, el peptido, polipeptido o protema diana puede seleccionarse del genoma de un virus oncogenico o patogenico, una bacteria o un parasito intracelular (tal como Plasmodium falciparum y otras especies Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica, y Giardia lamblia, asf como especies Toxoplasma, Eimeria, Theileria, y Babesia).
En algunos ejemplos, la protema diana se produce a partir de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) de un genoma vmco. Virus ejemplares y las secuencias genomicas
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correspondientes (n.° de acceso de la secuencia de referencia de GENBANK™ en parentesis) incluyen adenovirus humano A (NC 001460), adenovirus humano B (NC_004001), adenovirus humano C (NC_001405), adenovirus humano D (NC_002067), adenovirus humano E (NC_003266), adenovirus humano F (NC_001454), astrovirus humano (NC_001943), poliomavirus BK humano (V01109; GI:60851) bocavirus humano (NC_007455), coronavirus 229E humano (NC_002645), coronavirus HKU1 humano (NC_006577), coronavirus Nl63 humano (NC_005831), coronavirus OC43 humano (NC_005147), enterovirus humano A (NC_001612), enterovirus humano B (NC_001472), enterovirus humano C (NC_001428), enterovirus humano D (NC_001430), eritrovirus humano V9 (NC_004295), virus espumoso humano (NC_001736), herpesvirus humano 1 (virus del Herpes simple tipo 1) (NC_001806), herpesvirus humano 2 (virus del Herpes simple tipo 2) (NC_001798), herpesvirus humano 3 (virus Varicela zoster) (NC_001348), herpesvirus humano 4 tipo 1 (virus de Epstein-Barr tipo 1) (NC_007605), herpesvirus humano 4 tipo 2 (virus de Epstein-Barr tipo 2) (NC_009334), herpesvirus humano 5 cepa Ad 169 (NC_001347), herpesvirus humano 5 cepa Merlin Strain (NC_006273), herpesvirus humano 6A (NC_001664), herpesvirus humano 6b (NC_000898), herpesvirus humano 7 (NC_001716), herpesvirus humano 8 tipo M (NC_003409), herpesvirus humano 8 tipo P (NC_009333), virus de la inmunodeficiencia humana 1 (NC_001802), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (NC_001722), metapneumovirus humano (NC_004148), papilomavirus humano 1 (NC_001356), papilomavirus humano 18 (NC_001357), papilomavirus humano 2 (NC_001352), papilomavirus humano 54 (nC_001676), papilomavirus humano 61 (NC_001694), papilomavirus humano-cand90 (NC_004104), papilomavirus humano RTRX7 (NC_004761), papilomavirus humano tipo 10 (NC_001576), papilomavirus humano tipo 101 (NC_008189), papilomavirus humano tipo 103 (NC_008188), papilomavirus humano tipo 107 (NC_009239), papilomavirus humano tipo 16 (NC_001526), papilomavirus humano tipo 24 (NC_001683), papilomavirus humano tipo 26 (C_001583), papilomavirus humano tipo 32 (C_001586), papilomavirus humano tipo 34 (NC_001587), papilomavirus humano tipo 4 (NC_001457), papilomavirus humano tipo 41 (NC_001354), papilomavirus humano tipo 48 (NC_001690), papilomavirus humano tipo 49 (NC_001591), papilomavirus humano tipo 5 (NC_001531), papilomavirus humano tipo 50 (NC_001691), papilomavirus humano tipo 53 (NC_001593), papilomavirus humano tipo 60 (NC_001693), papilomavirus humano tipo 63 (NC_001458), papilomavirus humano tipo 6b (NC_001355), papilomavirus humano tipo 7 (NC_001595), papilomavirus humano tipo 71 (NC_002644), papilomavirus humano tipo 9 (NC_001596), papilomavirus humano tipo 92 (NC_004500), papilomavirus humano tipo 96 (NC_005134), virus de la parainfluenza humana 1 (NC_003461), virus de la parainfluenza humana 2 (NC_003443), virus de la parainfluenza humana 3 (NC_001796), parechovirus humano (NC_001897), parvovirus humano 4 (Nc_007018), parvovirus humano B 19 (NC_000883), virus sincitial respiratorio humano (NC_001781), rinovirus A humano (Nc_001617), rinovirus B humano (NC_001490), retrovirus espuma humano (NC_001795), virus linfotropico-T humano 1 (NC_001436), virus linfotropico-T humano 2 (NC_001488).
En ciertos ejemplos, la protema diana se produce a partir de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) a partir de un virus oncogenico, tal como virus de Epstein-Barr (EBV) o un virus del papiloma humano (HPV, por ejemplo, HPV16, HPV18). En otros ejemplos, la protema diana producida a partir de una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, secuencia genomica de acido nucleico diana) es de un virus patogenico, tal como un virus sincitial respiratorio, un virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis C), un coronavirus (por ejemplo, virus SARS), un adenovirus, un poliomavirus, un citomegalovirus (CMV) o un virus del Herpes simple (HSV).
D. Preparacion de muestras
Las muestras tisulares descritas en este documento pueden prepararse usando cualquier metodo ahora conocido o a partir de ahora desarrollado en la tecnica. En lmeas generales, se preparan muestras tisulares fijando e incrustando el tejido en un medio.
En algunos ejemplos, se usa un medio de incrustacion. Un medio de incrustacion es un material inerte en que se incrustan tejidos y/o celulas para ayudar a conservarlos para futuro analisis. La incrustacion tambien posibilita que las muestras tisulares se corten en secciones delgadas. El medio de inscrustacion incluye, aunque sin limitacion, parafina, celoidina, compuesto OCT™, agar, plasticos o acnlicos.
Muchos medios de incrustacion son hidrofobos; por lo tanto, puede que se necesite retirar el material inerte antes del analisis histologico o citologico, que utiliza reactivos principalmente hidrofilos. El termino desparafinizacion o desparafinado se usa ampliamente en este documento para hacer referencia a la retirada parcial o completa de cualquier tipo de medio de incrustacion de una muestra biologica. Por ejemplo, las secciones tisulares incrustadas en parafina se desparafinan por pase a traves de disolventes organicos, tales como tolueno, xileno, limoneno u otros disolventes adecuados.
El proceso de fijacion de una muestra puede variar. La fijacion de una muestra tisular conserva las celulas y los constituyentes tisulares en un estado lo mas cercano posible al estado vivo y les permite experimentar procedimientos preparativos sin cambio significativo. La fijacion detiene los procesos de autolisis y descomposicion bacteriana que empiezan tras la muerte celular, y estabiliza los constituyentes celulares y tisulares de modo que resisten las fases posteriores de procesamiento tisular, tal como para IHC o ISH.
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Los tejidos pueden fijarse por cualquier proceso adecuado, incluyendo perfusion o por inmersion en un fijador. Los fijadores pueden clasificarse como agentes reticulantes (tales como aldelddos, por ejemplo, formaldelddo, paraformaldelddo y glutaraldelddo, as^ como agentes de reticulacion no de aldelddo) agentes oxidantes (por ejemplo iones y complejos metalicos, tales como tetroxido de osmio y acido cromico), agentes desnaturalizantes de protemas (por ejemplo, acido acetico, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro mercurico, acetona y acido pfcrico, reactivos de combinacion (por ejemplo, fijador de Carnoy, methacarn, fluido de Bouin, fijador B5, fluido de Rossman y fluido de Gendre), microondas y fijadores diversos (por ejemplo, fijacion de volumen excluido y fijacion por vapor). Tambien pueden incluirse aditivos en el fijador, tales como tampones, detergentes, acido tanico, fenol, sales metalicas (tales como cloruro de zinc, sulfato de zinc y sales de litio), y lantano.
El fijador mas habitualmente usado en la preparacion de muestras para IHC es formaldefndo, generalmente en forma de una solucion de formalina (formaldefndo al 4 % en una solucion tamponante, mencionada como formalina tamponada al 10 %). En un ejemplo, el fijador es formalina tamponada neutra al 10 %.
E. Tincion con contraste
La tincion con contraste es un metodo de tratamiento posterior de las muestras despues de que ya se hayan tenido con agentes para detectar una o mas dianas, de modo que sus estructuras puedan visualizarse mas facilmente al microscopio. Por ejemplo, se usa opcionalmente un tinte de contraste antes de tapar con el cubreobjetos para hacer que el tinte inmunohistoqmmico sea mas distinto. El tinte de contraste difiere en color de un tinte primario. Son bien conocidos numerosos tintes de contraste, tales como hematoxilina, eosina, verde metilo, azul metileno, Giemsa, azul Alcian y rojo Nuclear Fast.
En algunos ejemplos, pueden mezclarse, mas de un tinte juntos para producir el tinte de contraste. Esto proporciona flexibilidad y la capacidad de elegir tintes. Por ejemplo, un primer tinte, puede seleccionarse de la mezcla que tiene un atributo particular, pero aun no tiene un diferente atributo deseado. Puede anadirse un segundo tinte a la mezcla que presenta el atributo deseado perdido. Por ejemplo, puede mezclarse azul toluidina, DAPI y azul cielo pontamina juntos para formar un tinte de contraste.
F. Imagenes
Ciertos aspectos, o todos, de las realizaciones descritas pueden automatizarse y facilitarse por analisis informatico y/o sistema de analisis de imagenes. En algunas aplicaciones, se miden relaciones precisas de color. En algunas realizaciones, se utiliza microscopia optica para el analisis de imagenes, ciertas realizaciones descritas implican adquirir imagenes digitales. Esto puede hacerse acoplando una camara digital a un microscopio. Las imagenes digitales obtenidas de muestras tenidas se analizan usando un software de analisis de imagenes. El color puede medirse de varios modos diferentes. Por ejemplo, puede medirse el color como valores de rojo, azul y verde; valores de matiz, saturacion e intensidad; y/o midiendo una longitud de onda espedfica o intervalo de longitudes de onda usando una camara espectral de imagenes.
Una realizacion descrita implica el uso de imagenes de campo claro con colorantes cromogenicos. La luz blanca en el espectro visible se transmite a traves del colorante. El colorante absorbe luz de ciertas longitudes de onda y transmite otras longitudes de onda. Esto cambia la luz del blanco al color dependiendo de las longitudes de onda espedficas de luz transmitida.
Las muestras tambien pueden evaluarse cualitativamente y semicuantitativamente. La evaluacion cualitativa incluye evaluar la intensidad de tincion, identificar las celulas tenidas de forma positiva y los compartimentos intracelulares implicados en la tincion y evaluar la muestra global o calidad del portaobjetos. Se realizan evaluaciones diferentes sobre las muestras de ensayo y este analisis puede incluir una comparacion de valores promedio conocidos para determinar si las muestras representan un estado anormal.
G. Kits
Las realizaciones descritas proporcionan, en parte, kits para realizar diversas realizaciones del metodo de la invencion. Ejemplos de dichos kits incluyen aquellos utiles para analisis de colesterol, kits de embarazo, kits de diagnostico del cancer, etc. En algunas realizaciones, el kit incluye un analogo de pirimidina que tiene una formula descrita en la Seccion A.
En algunas realizaciones, el kit incluye una enzima, tal como una oxidorreductasa o una peroxidasa, tal como peroxidasa de rabano rusticana o glutation peroxidasa. En algunos ejemplos, el kit incluye un resto de union espedfica, tal como un anticuerpo o un acido nucleico que se une espedficamente a una molecula diana. En algunos ejemplos, el resto de union espedfica y la enzima se unen juntos.
En algunas realizaciones, el kit incluye un resto detectable capaz de detectarse usando tecnicas de deposicion o fluorescentes, o un sustrato enzimatico que produce el resto detectable despues de reaccion con la enzima. En algunos ejemplos, el resto detectable es un fluoroforo (tal como una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un
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colorante BODIPY, una resorufina, o una rodamina), un hapteno (tal como oxazol, pirazol, tiazol, benzofurazano, triterpeno, urea, tiourea, nitroarilo, rotenoide, cumarina, ciclolignano, heterobiarilo, azoarilo, benzodiazepina), una protema o un cromogeno (tal como 1,3-diaminobencidina, 3-amino-9-etilcarbazol o tetrametilbencidina). El kit puede incluir opcionalmente al menos un potenciador opcional, tal como un compuesto heteroarilo, una sal que contiene metal del Grupo I o Grupo II, un compuesto que contiene boro y un compuesto de fenol, por ejemplo, los descritos en la Seccion A,
En algunas realizaciones, el kit incluye un oxidante, tal como un peroxido, por ejemplo, peroxido de hidrogeno.
En algunas realizaciones, el kit incluye un tensioactivo, tal como Brij® 35, TWEEN®, Tergitol™, y Triton™.
En algunas realizaciones, el kit incluye un antioxidante seleccionado de estannato de sodio, metabisulfato de sodio y bisulfato de sodio.
En algunas realizaciones, el kit incluye mordiente de cobre. El kit puede incluir componentes adicionales, incluyendo anticuerpos, sondas marcadas con hapteno y otros reactivos necesarios para realizar IHC y/o ISH por deteccion cromogenica. Dichos kits pueden usarse, por ejemplo, por un clmico o medico como un auxiliar para seleccionar una terapia apropiada para un paciente particular o con fines de diagnostico.
Realizaciones particulares se refieren al uso de kits que comprenden un inhibidor, tal como H2O2 al 3 %; una HRP multimerica universal, tal como anticuerpo de cabra anti-raton/conejo conjugado con HRP; un peroxido, tal como H2O2 al 0,03 %; un cromogeno, tal como DAB; y un mordiente de cobre. Este kit se menciona como ultraView™ y puede usarse en combinacion con los potenciadores descritos.
H. Realizaciones automatizadas
Los expertos en la materia apreciaran que realizaciones del metodo descrito en este documento para deteccion cromogenica de dos o mas moleculas pueden automatizarse. Ventana Medical Systems, Inc. es el cesionario de varias patentes de Estados Unidos que describen sistemas y metodos para realizar analisis automatizados, incluyendo las patentes de Estados Unidos n.° 5.650.327, 5.654.200, 6.296.809, 6.352.861, 6.827.901 y 6.943.029, y las solicitudes publicadas de Estados Unidos n.° 20030211630 y 20040052685. Se realizaron realizaciones particulares de los procedimientos usando diversos procesos automatizados.
IV. Ejemplos de trabajo
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas caractensticas espedficas de realizaciones de trabajo. El alcance de la presente invencion no esta limitado a esas caractensticas ejemplificadas por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Tincion tisular IHC con imidazol
La tincion IHC de bcl2 sobre airngdalas se realizo usando el cromogeno DAB universal ultraView™ potenciado con imidazol. El imidazol (10 mM - 100 mM) aumentaba significativamente la intensidad de la tincion dAb (veanse las FIG. 1 y 2). Sin embargo, segun aumentaba la sena DAB deseada tambien lo hada la senal de fondo observada. Concentraciones mayores de imidazol demostraron ser compatibles causando que DAB precipitara de la solucion de cromogeno DAB reformulada.
Ejemplo 2
Deteccion cinetica de potenciadores
Se desarrollo un ensayo de placa para detectar independientemente compuestos potenciales y comprender mejor la deposicion potenciada observada de DAB como se demuestra en el Ejemplo 1. Los aditivos se anadieron directamente a un pocillo que contema los reactivos necesarios del kit de deteccion ultraView™ (VMSI 760-500: 2534290, 253-4292 y 253-4293) en tampon de reaccion 1X (VMSI 950-300) y gelatina de pescado al 0,1 %. La gelatina de pescado se uso para ayudar a dispersar la DAB oxidada e inhibir su precipitacion de la solucion. El kit de deteccion ultraView™ se diluyo para medir la formacion de DAB oxidada por UV-VIS a 455 nm. Los aditivos se ensayaron a concentraciones establecidas para determinar la potenciacion en la reaccion de oxidacion de DAB. Los datos se representaron en grafico y se calculo la velocidad maxima aparente (Vmax) a cada nivel de concentracion de aditivo.
El ensayo inicial de acido 4-acetilamidofenil boronico e imidazol demostro una velocidad de reaccion aumentada para HRP segun se aumentaba la concentracion de cada aditivo (veanse las FIG. 3 y 4, respectivamente). La (Vmax) aparente para DAB oxidada con HRP era 18,5 mDO/minuto sin potenciacion. La adicion de imidazol 10 mM aumento
la (Vmax) aparente en un 56 %, y 10 mM de acido 4-acetilamidofenil boronico aumento la (Vmax) aparente en un 77 %. (Porcentaje de aumento de Vmax = [(Vmax potenciada - Vmax de uView)/Vmax de uView] x 100%).
Estimulados por los resultados anteriores, se examinaron otros tampones que podfan usarse como potenciadores 5 potenciales. Ademas del uso conceptual de analogos de imidazol, se exploraron reacciones de oxidacion mediadas por peroxido facilitadas por L-histidina. 50 mM de L-histidina aumentaba la Vmax aparente de HRP en un 138 % (vease la FIG. 5). Como con concentraciones mayores de imidazol, L-histidina 50 mM tambien causaba la precipitacion de DAB de la solucion de cromogeno dAb reformulada. Se utilizo una concentracion de L-histidina 10 mM con reformulaciones de DAB. La Vmax aparente de HRP se aumento al 18 % con L-histidina 10 mM. Tambien se 10 ensayaron tampones borato. La capacidad tamponante del acido borico no esta en el intervalo de pH deseado (intervalo de pH variable de aproximadamente 1 a aproximadamente 7,9, variando del pH final de aproximadamente 2 a aproximadamente 3) para la formulacion de dAb porque el acido borico tiene un intervalo tamponante de pH eficaz de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10,2. La adicion de 10 mM de acido borico potenciaba la Vmax aparente de HRP en un 265 %, sin embargo, a 50 mM, el acido borico potenciaba enormemente la Vmax aparente de 15 HRP en un 592 % (vease la FIG. 6).
Se examinaron otros compuestos heterodclicos para encontrar una nueva clase de potenciadores que aumentara adicionalmente la velocidad aparente de HRP. Se descubrieron analogos de pirimidina como una novedosa clase de potenciadores. Puede encontrarse un sumario de los resultados de ensayo para todos los potenciadores de la 20 oxidacion de DAB mediada por HRP en la Tabla 1.
Tabla 1: Influencia de potenciadores sobre la Vmax aparente para DAB oxidada por HRP cuando se anaden al kit de
deteccion ultraView™.
Potenciador
Concentracion (mM) Vmax (mDO/min) Coef. reg
Sin potenciador
n/a 18,50 0,985
10 67,47 0,989
Acido borico
50 128,00 0,935
100 47,60 (sat) 0,999
5 43,50 0,984
Cloruro de calcio
10 52,50 0,999
20 57,00 0,998
5 21,20 0,971
4-AcHNPhB(OH)2
10 32,80 0,975
20 32,00 0,977
10 28,80 0,982
Imidazol
50 38,80 0,967
100 70,00 0,954
10 66,40 0,993
Tiazol
50 27,00 (sat) 0,989
100 27,05 (sat) 0,972
10 24,00 0,995
Oxazol
50 40,00 0,961
100 18,00 (sat) 0,998
Pirimidina
10 104,00 0,961
50 124,00 0,968
100 36,80 (sat) 0,983
L-Histidina
10 21,84 0,973
50
44,00 0,999
100
72,00 0,961
2-Hidroxipirimidina
10 144,00 2 pt.
50
156,00 2 pt.
100
148,00 2 pt.
Timina
10 82,00 0,984
50 (sol)
86,00 0,896
100 (sol)
74,00 0,990
Citosina
10 36,00 0,931
50 (sol)
66,00 0,857
100 (sol)
n/a (1) n/a (1)
Uracilo
10 52,00 0,942
50 (sol)
72,00 0,933
100 (sol)
n/a (1) n/a (1)
Acido 2-tiobarbiturico
10 54,00 0,964
50
56,00 0,911
100
76,00 0,920
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Potenciador
Concentracion (mM) Vmax (mDO/min) Coef. reg
N-oxido de pirimidina
10 104,00 2 pt.
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104,00 2 pt.
100
36,00 (sat) 2 pt.
TEMPO
0,13 % (8 mM) 18,00 0,993
0,25 % (16 mM)
24,80 0,914
0,50 % (32 mM)
21,20 0,959
NMO
0,13 % (10,7 mM) 33,60 0,933
0,25 % (21,3 mM)
43,60 0,988
0,50 % (42,7 mM)
51,60 0,971
L-Triptofano
10 30,00 0,994
50
52,00 0,825
100
64,00 2 pt.
2-Hidroxipiridina
10 47,67 2 pt.
50
18,19 (sat) 0,970
100
15,98 (sat) 0,985
La densidad optica total de DAB oxidada se controlo a 455 nm. (Sat) = La velocidad de la reaccion se saturaba por el inicio del analisis UV- VIS. (Sol) = Las cuestiones de solubilidad sucedfan a temperatura ambiente. Se requirio calor para disolver el aditivo en tampon de reaccion. (1) el aditivo no era soluble a temperatura ambiente.
La adicion de 10 mM de pirimidina aumentaba enormemente la Vmax aparente de HRP en un 462 %. Este aumento aparente de la tasa de la oxidacion de DAB era mayor que lo observado con otros potenciadores heterodclicos (imidazol, tiazol y estructuras de nucleo oxazol). El aumento de la concentracion de pirimidina hasta 50 mM proporcionaba un aumento moderado en la Vmax de HRP respecto a 10 mM (570 %) (vease la FIG. 7). Una reformulacion del cromogeno DAB con pirimidina posee un problema potencial debido a la alta presion de vapor (bp “ 124 °C). Por tanto, se investigaron otros analogos de pirimidina para descubrir una alternativa adecuada que no tuviera problemas de volatilidad.
Las bases de nucleotido pirimidina (timina, uracilo y citosina) aumentaban la velocidad aparente de HRP, sin embargo, teman problemas de solubilidad en tampones acuosos. Se descubrio que tanto 2-hidroxipirimidina (vease la FIG. 8) como N-oxido de pirimidina proporcionaban velocidades aparentes similares o aumentadas respecto a pirimidina y no teman problemas de solubilidad o volatilidad. Se ha demostrado previamente que N-oxidos heterodclicos de cinco y seis miembros aumentan la velocidad aparente de la oxidacion basada en HRP de oligosacaridos y tambien de polisacaridos, concretamente la oxidacion de celulosa. Las reformulaciones de DAB con N-oxido de pirimidina perdfan funcionalidad y deteman la tincion con el tiempo. Sin embargo, el N-oxido de pirimidina aun es de utilidad en una solucion de potenciacion si se anade a reacciones de oxidacion mediadas por HRP sobre el tejido. Ademas de la pirimidina, 2-hidroxipiridina 10 mM aumentaba la Vmax aparente de HRP (157 %). El bencimidazol, azul metileno, fenotiazina y 4-dimetilaminopiridina no proporcionaban potenciacion.
Ejemplo 3
Efectos sinergicos y antagonistas para los potenciadores
El ensayo de placa del Ejemplo 2 se uso para examinar los efectos sinergicos y antagonistas potenciales de cada aditivo sobre la velocidad aparente de la oxidacion de DAB mediado por HRP. Se uso la misma concentracion de reactivos del kit de deteccion ultraView™ (VMSI 760-500: 253-4290, 253- 4292 y 253-4293) en Reaction Buffer™ 1X que contema gelatina de pescado al 0,1 % para cada ensayo. En cada ensayo, los potenciadores se anadieron juntos de una vez. Los resultados se resumieron en la FIG. 9 y en la Tabla 2.
Tabla 2: Se evaluo la influencia de potenciadores sobre la Vmax aparente para DAB oxidada por HRP cuando se
anadfan secuencialmente al kit de deteccion ultraView™.
Entrada
Potenciador Vmax (mDO/min) Coef. Reg
1
Sin Potenciador 18,50 0,985
2
Imidazol 10 mM 34,00 0,904
3
(2) + Cloruro de Calcio 10 mM 96,00 0,982
4
(3) + Acido borico 10 mM 138,00 0,915
5
(4) + NMO 10,7 mM 84,00 2 pt
6
(5) + L-Histidina 50 mM 92,00 2 pt
7
(5) + Pirimidina 10 mM 140,00 ________2_pt________
La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 455 nm. (NMO = N-oxido de 4-metilmorfolina).
Como se ha demostrado previamente en la Tabla 1, el acido borico 10 mM aumentaba la velocidad aparente de HRP en un 265 %. La adicion de cloruro calcico a ensayos de HRP demostro aumentar la estabilidad y velocidad
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aparente de HRP. La adicion de cloruro calcico 10 Mm y tambien de acido borico 10 mM al ensayo que contema imidazol 10 mM aumentaba sinergicamente la velocidad aparente de HRP.
El A/-oxido de morfolina aumentaba la velocidad aparente de las reacciones de HRP (vease la Tabla 1); sin embargo, cuando se anadfa a la mezcla de ensayo 4 (vease la Tabla, Entrada 5), se observaba un efecto antagonista. La adicion de 50 mM de L-histidina o pirimidina 10 mM a la mezcla de reaccion 5 (Tabla 2, Entradas 6 y 7) aumentaba la velocidad aparente de HRP. Estos datos apoyan la deteccion del uso de N-oxidos en una solucion de potenciacion. El N-oxido de pirimidina puede usarse en combinacion con L-histidina para aumentar la deposicion de DAB en tincion tisular IHC (vease la FIG. 11)
Ejemplo 4
Tincion tisular IHC con potenciadores
La tincion IHC se realizo para bcl2 sobre tejido de amygdala usando soluciones potenciadas de cromogeno DAB para examinar adicionalmente los efectos sinergicos potenciadores sobra la deposicion de DAB. Se muestra un sumario de valoracion de patologfa para tincion IHC en la Tabla 3. El Lector 1 realizo todas las evaluaciones de patologfa durante el mismo periodo de tiempo. El Lector 2 realizo las evaluaciones en lotes cuando los portaobjetos se produdan inicialmente y justifica alguna variabilidad en la valoracion.
Tabla 3: Sumario de valoracion de la patologfa para tincion IHC de bcl2 sobre tejido de amygdala usando tincion DAB _______________________ultraView™ y soluciones potenciadas de cromogeno DAB______________________
Solucion ensayada
Lector 1 BG 1 Lector 2 BG 2
DAB ultraView
3,75 0,25 3 0,25
Base 1
3,75 0,5 4++ 0,5
Base 1 con pirimidina 10 mM
4 0,5 4++ 0
Base 1 con CaCl2 10 mM
4 0,5 3,5 0,5
Base 1 con fosfito 5 mM
3,75 0,25 4 0,5
Base 2
4 0,5 4 0,75
Base 2 con pirimidina 10 mM
4+ 0,5 3,5 0,5
Base 2 con CaCl210 mM
4 0,5 3,5 0,5
Base 2 con fosfito 5 mM
4+ 0,5 3,75 0,5
Base 3
4+ 0,75 3,5 0,5
Base 3 con CaCl2 10 mM
4+ 0,5 3,5 0,5
Base 3 con fosfito 5 mM
4+ 0,75 3,75 0,5
Base 4
4 0,5 4 0,25
Base 4 con acido borico 10 mM
4 0,5 3,5 0
Base 2 con acido borico 10 mM
4 0,5 4 0,25
Base 4 con timina 10 mM
4 0,5 4 0,25
Base 4 con 2-OH pirimidina 10 mM
3,75 0,5 4 0,5
Base 4 con L-triptofano 10 mM
4 0,5 4 0,25
Base 4 con N-oxido de pirimidina 10 mM
4+ 0,5 4 0,25
Base 4 con CaCl2 10 mM
4 0,75 3,5 0,25
Base 4a
4+ 0,75 3,5 0,5
Base 4a con pirimidina 10 mM
4+ 0,75 3,5 0,25
Base 4a con 2-OH piridina 10 mM
4+ 0,75 4++ 0
Todas las composiciones de los nuevos tampones basicos contienen 5 mM de tetraclorhidrato de 3,3- diaminobencidina (DAB-4 HCI) y Brij® 35 (sin peroxidasa) al 0,05 % en peso. [Base 1: L-histidina 50 mM (pH = 6,5); Base 2: imidazol 10 mM (pH = 6,5); Base 3: acido cftrico 2,43 mM, fosfato sodico 5,13 mM (pH = 5,3); Base 4: L- histidina 10 mM (pH =6,5); Base 4a: L-histidina 10 mM (pH =6,5), cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM.]
Se apreciaron dos observaciones generales. En primer lugar, se consegrna una potenciacion de tasa maxima aparente para la deposicion por HRP de DAB a traves de la combinacion de 2-3 componentes potenciadores. Los potenciadores adicionales no aumentaban la intensidad de la senal de la tincion mas fuerte de DAB sobre el tejido; sin embargo, el porcentaje de celulas tenidas con la intensidad de senal mas alta aumentaba en todo el tejido. Esta observacion se debfa en gran medida a la cantidad limitada de recambios observados por reacciones de oxidacion HRP-DAB sobre el tejido. En segundo lugar, los potenciadores que aumentaban la oxidacion de DAB mediada por HRP en el ensayo de placa proporcionaban una deposicion mas concreta de DAB sobre el tejido. La tincion de DAB era generalmente menos difusa.
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La tincion IHC de bcl2 (airngdala) usando solucion de DAB 5,5 mM formulada con imidazol 10 mM o L-histidina 10 mM y Brij® 35 al 0,05 % se muestra en las FIG. 10 y 11. La revision patologica de la tincion DAB con la L-histidina 10 mM mostro una intensidad similar a la producida con imidazol 10 mM.
La tincion tisular con soluciones de DAB 5,5 mM formuladas con N-oxido de pirimidina 10 mM o 2-hidroxipirimidina 10 mM en L-histidina 10 mM y Brij® 35 al 0,05 % se muestra en las FIG. 12 y 13. La revision patologica de la tincion DAB con ambas soluciones potenciadoras mostro que el N-oxido de pirimidina proporcionaba la mejor relacion de senal DAB a ruido de fondo para los dos potenciadores.
La tincion IHC de bcl2 sobre tejido de airngdalas se evaluo usando la adicion de una "solucion de potenciacion" a un kit de deteccion convencional ultraView™. No se hicieron correcciones a la concentracion de los reactivos ultraView™ para compensar la dilucion de la solucion de potenciacion (veanse las FIG. 14-17). Se selecciono L- histidina 50 mM y pirimidina 10 mM (FIG. 16) para el Lector 1 de patologfa como tincion DAB preferida como se muestra en la Tabla 3. Imidazol 10 mM y acido borico 50 mM aumentaban la deposicion de DAB, pero redudan el intervalo dinamico en la senal de DAB y aumentaban el fondo de suero. Una concentracion inferior de potenciadores aumentana el intervalo dinamico de la senal DAB. Una solucion de L-histidina 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM mostro una senal DAB inferior cuando se reformulaba una solucion de DAB (ultima fila de la Tabla 3). El N-oxido de pirimidina 10 mM es un candidato principal para una solucion de potenciacion.
Ejemplo 5
Cinetica de Michaelis-Menton
Para estudiar adicionalmente el efecto sinergico de la Vmax. aparente aumentada para DAB oxidada por HRP, se calculo la cinetica de Michaelis-Menton para las mejores mezclas potenciadas de cromogeno DAB en la Tabla 3. Una dilucion 1:32 del multimero HRP ultraView™ se hizo reaccionar con una concentracion variable de peroxido de hidrogeno (0,015 mM - 0,514 mM) para saturar la velocidad aparente de HRP. Inicialmente, se examino tanto imidazol como L-histidina con pirimidina 10 mM (vease la FIG. 18) y 2-hidroxipirimidina 10 mM (vease la FIG. 19). Se calcularon valores similares de Km a 1^Vmax., pero el imidazol produjo una Vmax. aparente mayor que L-histidina (vease la Tabla 4). La definicion de Vmax. = kcat • [E]total cuando la concentracion de sustrato enzimatico estaba a niveles de saturacion. Cuando la concentracion de enzimas se mantema constante, la Vmax. aparente es proporcional a kcat (el recambio aparente para HRP o la constante de velocidad de primer orden). El imidazol aumentaba el recambio aparente de HRP mayor que L-histidina.
Tabla 4: Influencia de potenciadores sobre la Vmax. aparente para DAB oxidada por HRP cuando se combinaban con _____________________imidazol 50 mM, cloruro calcico 10 mM y acido borico 10 mM._____________________
Potenciador
Vmax. (mDO/min) Km
Sin potenciador
228 0,073
Tampon con pirimidina 10 mM
Imidazol 10 mM
330 0,085
L-histidina 10 mM
0,088
Tam
pon con 2-hidroxipirimidina 10 mM
Imidazol 50 mM
320 0,081
L-histidina 50 mM
317 0,084
Potenciador en imidazol 50 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM
Pirimidina 50 mM
326 0.082
10 mM
320 0,081
2-hidroxipiridina 10 mM
383 1,001
N-Oxido de pirimidina
374 0,098
La Km se determino a ^Vmax.
Se exploraron soluciones de cromogeno DAB con imidazol con potenciadores para la influencia sobre la Vmax. aparente de HRP (vease la FIG. 20 y la Tabla 4). Se uso imidazol 50 mM para una mayor potenciacion de la oxidacion de DAB. El efecto de potenciacion sobre el recambio aparente de hRp era 2-hidroxipiridina 10 mM > 10 mM N-oxido de pirimidina 10 mM > pirimidina 50 mM > 2-hidroxipirimidina 10 mM. Estos resultados equivalfan a las intensidades de tincion observadas analizadas en la Tabla 3.
Usando las soluciones de cromogeno de DAB en la Tabla 4, se realizo un ensayo de placa usando concentraciones variables del multfmero HRP ultraView™ (0,27 pg - 68,8 pg). La Vmax. aparente se controlo y los datos se presentaron como un porcentaje del aumento o disminucion en la Vmax. aparente en comparacion con reacciones no potenciadas (vease la Tabla 5). Se observo un aumento en la Vmax. aparente de HRP segun se disminma la concentracion de HRP. La magnitud del cambio aumentaba a concentraciones inferiores de HRP. Estos datos confirmaron los resultados de la Tabla 1 donde el imidazol proporciono una mayor Vmax. aparente respecto a L- histidina. Este efecto se observo para una mayona de concentraciones.
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Tabla 5: Influencia de sales tamponantes y potenciadores sobre la Vmax. aparente para DAB oxidada por HRP
cuando se anadfan al kit de deteccion ultraView™
Sale basica
Potenciador Concentracion de HRP (pg)
68,8
34,4 17,2 8,59 4,3 2,15 1,07 0,54 0,27
Histidina 10 mM
A -12 -9 -7 3 -3 -7 -6 27 9
Imidazol 10 mM
A -22 -15 2 19 22 11 12 43 145
Histidina 50 mM
B -3 -10 0 13 10 0 4 35 9
Imidazol 50 mM
B -3 14 16 30 28 18 34 71 32
Imidazol 50 mM
C -3 3 12 19 18 17 20 89 97
Imidazol 50 mM
D -2 11 10 20 31 30 62 58 45
La densidad optica de DAB oxidada se controlo a 450 nm. [Potenciadores: (A) = pirimidina 10 mM; (B) = 2- hidroxipirimidina 10 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM; (C) = 2-hidroxipiridina 10 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM; (D) = N-oxido de pirimidina 10 mM, cloruro calcico 10 mM, acido borico 10 mM].
Ejemplo 6
Tincion tisular ISH con potenciadores
Se examino la tincion tisular ISH usando soluciones potenciadas de DAB. Se trataron xenoinjertos de raton 3-en-1 HER-2 de lmeas celulares de carcinoma HER-2 positivas CaLu3, ZR-75-1 y MCF7 con son sonda de ADN de HER2 (VMSI 480-4495) y se tineron con la solucion de cromogeno DAB ultraView™ o una solucion potenciada de cromogeno DAB que contema L-histidina 10 mM (veanse las FIG. 21-22). La L-histidina 10 mM aumentaba la deposicion de DAB en la tincion ISH de celulas de carcinoma CaLu3 que teman una sobreexpresion de HER2. La deposicion aumentada de DAB era marginal para las senales ISH mas fuertes, pero la intensidad de la senal para las senales DAB mas debiles se elevaba en todo el tejido. Se hizo la misma observacion con deposicion potenciada de DAB en IHC.
Ejemplo 7
Tincion tisular TSA con potenciadores
Se evaluo la deposicion potenciada de DAB sobre tincion tisular TSA-IHC de bcl2 en tejido de airngdala. El antigeno bcl2 se tino con TSA usando deposicion TA-HQ durante 4 minutos despues de una incubacion de 16 minutos del anticuerpo primario contra bcl2. Se realizo deposicion de tiramida con y sin 2-hidroxipirimidina 10 mM. La deposicion de DAB se realizo con la solucion de cromogeno DAB ultraView™ o con una solucion de cromogeno DAB que contema L-histidina 10 mM (veanse las FIG. 23-26).
La L-histidina 10 mM aumentaba la deposicion de DAB sobre el tejido.
En un estudio paralelo, se tino el antigeno bcl2 con TSA usando deposicion TA-HQ durante 4 minutos despues de una incubacion de 8 minutos del Ab primario contra bcl2 (veanse las FIG. 27 y 28). La 2-hidroxipirimidina 10 mM aumentaba la deposicion de tiramida y por tanto aumentaba la deposicion de dAb. El porcentaje de celulas tenidas con DAB aumentaba en areas con baja expresion de antigeno bcl2.
Ejemplo 8
Tincion de ribosonda 18s
Se montaron tejidos de xenoinjerto CaLu-3 incrustados en parafina fijados en formalina sobre portaobjetos Superfrost®, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando desnaturalizante RiboClear™ (un componente del kit RiboMap®; Ventana® p/n 760-102) durante 12 minutos de incubacion, reactivo CC2 (Ventana® p/n 950-123), y proteasa 3 durante 8 minutos de incubacion (Ventana® p/n 760-2020). Despues de la recuperacion, se distribuyeron dos gotas (200 ml) de una sonda 18s de hebra antisentido o con sentido haptenilada NP sobre un portaobjetos, se desnaturalizaron a 80 °C durante 8 minutos, y se hibridaron a 65 °C durante 6 horas. Despues de la hibridacion, los portaobjetos se lavaron 3 veces usando SSC 0,1x a 75 °C durante 8 minutos; cada sonda haptenilada NP se detecto usando 5 mg de un conjugado de raton con HRP anti-NP seguido por 100 pl de cada uno 55 pl de conjugado de tiramida-HQ y H2O2 (componente del kit de DAB ultraView™ Ventana® p/n 760-500) y se incubaron durante 12 minutos. Se detecto tiramida-HQ depositada usando 0,5 pg de un conjugado de raton con HRP
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anti-HQ seguido por una gota de DAB (DAB 5,5 mM; Brij® 35 0,05 %; L- histidina 10 mM; 2-hidroxipiridina 10 mM) y H2O2 incubando el portaobjetos durante 8 minutos. Se uso DAB ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 pl de cobre (componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando un microscopio de campo claro. La comparacion de la muestra tratada con potenciador y la muestra ultraView™ se muestra en las FIG. 29 y 30, respectivamente.
Ejemplo 9
Tincion HPV
Se montaron tejidos de xenoinjerto C33, HeLa y CaSki incrustados en parafina fijados con formalina en portaobjetos Superfrost, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo CC2 (Ventana® p/n 950-123), y proteasa 3 durante 8 minutos de incubacion (Ventana® p/n 760-2020). Despues de la recuperacion, se distribuyeron 3 gotas (300 pl) de tampon SISH Hyb (un componente del kit de deteccion SISH ultraView™ p/n 780-001) y 3 gotas de sonda HPV haptenilada DIG sobre un portaobjetos, se desnaturalizaron a 75 °C durante 8 minutos y se hibridaron a 44 °C durante 6 horas. Despues de la hibridacion, los portaobjetos se lavaron 3 veces usando sSc 0,1x a 64 °C durante 8 minutos. La sonda haptenilada DIG se detecto usando 3 pg de un conjugado de raton con HRPAanti-DIG seguido por DAB (DAB 5,5 mM; Brij® 35 al 0,05 %; L-histidina 10 mM; 2-hidroxipiridina 10 mM) y H2O2 (componente del kit de DAB ultraView™ Ventana p/n 760-500) incubando el portaobjetos durante 8 minutos. Se uso DAB ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 pl de cobre (componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando microscopio de campo claro. La comparacion de la muestra tratada con potenciador y la muestra ultraView™ se muestra en las FIG. 31 frente a 32, 33 frente a 34 y 35 frente a 36, respectivamente.
Ejemplo 10
Tincion DAB de CD20
Se monto tejido de amfgdala incrustado en parafina fijado en formalina sobre portaobjetos Superfrost®, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo a granel CC1 (Ventana® p/n 950-124). Despues de la recuperacion, se distribuyo una gota (100 pl) de inhibidor UV (un componente del kit de DAB ultraView™) sobre un portaobjetos y se incubo durante 8 minutos. Despues de la incubacion del inhibidor, se distribuyo una gota del anticuerpo de raton anti-CD20 (clon L-26; Ventana® p/n 760-2531) sobre el portaobjetos y se incubo durante 16 minutos. Despues de 2 aclarados con tampon de reaccion, se detecto el anticuerpo contra CD20 usando una gota del conjugado HRP universal ultraView™ (un componente del kit de DAB ultraView™) y se incubo sobre el portaobjetos durante 8 minutos. Se anadio una gota de DAB (DAB 5,5 mM; Brij® 35 al 0,05 %; L-histidina 10 mM; 2- hidroxipiridina 10 mM) y H2O2 a los portaobjetos y se incubaron durante 8 minutos. Se uso DAB ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 pl de cobre (componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando microscopio de campo claro. La comparacion de la muestra tratada con potenciador y la muestra ultraView™ se muestra en las FIG. 37 y 38, respectivamente.
Ejemplo 11
Tincion AEC de CD20 y Ki-67
Se monto tejido de airngdala incrustado en parafina fijado con formalina sobre portaobjetos Superfrost, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo a granel CC1 (Ventana® p/n 950-124). Despues de la recuperacion, se distribuyo una gota (100 pl) de inhibidor (un componente del kit de AEC Ventana® p/n 760-020) sobre un portaobjetos y se incubo durante 8 minutos. Despues de la incubacion del inhibidor, se distribuyo una gota del anticuerpo de raton anti-CD20 (clon L-26; Ventana® p/n 760-2531) o anticuerpo de conejo anti-Ki67 (clon 30-9; Ventana® p/n 790-4286) sobre el portaobjetos y se incubo durante 16 minutos. Despues de 2 aclarados con tampon de reaccion, se detecto el anticuerpo usando una gota del conjugado HRP universal ultraView™ (un componente del kit de DAB ultraView™) y se incubaron sobre el portaobjetos durante 8 minutos. Se anadio una gota de una solucion de potenciacion que contema L-histidina 50 mM pH 6,5 y 2-hidroxipiridina 10 mM y se co-incubo con una gota de AEC y H2O2 y se incubaron durante 8 minutos. Se uso un portaobjetos tenido con cromogeno AEC sin ninguna potenciacion como referencia. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 7902208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se dejaron secar al aire; se cubrieron los portaobjetos con un medio de montaje acuoso y se visualizaron usando un microscopio de campo claro. La comparacion de la muestra tratada con potenciador y la muestra ultraView™ se muestra en las FIG. 39 frente a 40 y
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42 frente a 42, respectivamente.
Ejemplo 12 Tincion DAB de bcl-2
Se monto tejido de amygdala incrustado en parafina fijado con formalina sobre portaobjetos Superfrost, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo a granel CC1 (Ventana® p/n 950-124). Despues de la recuperacion, se distribuyo una gota (100 jl) de inhibidor UV (un componente del kit de DAB ultraView™) sobre un portaobjetos y se incubo durante 8 minutos. Despues de la incubacion del inhibidor, se distribuyo una gota del anticuerpo de raton anti-bcl2 (clon 124; Ventana® p/n 790-4464) sobre el portaobjetos y se incubo durante 16 minutos. Despues de 2 aclarados con tampon de reaccion, se detecto el anticuerpo contra bcl2 usando una gota del conjugado hRp universal ultraView™ (un componente del kit de DAB ultraView™) y se incubo sobre el portaobjetos durante 8 minutos. Se anadio una gota de dAb (DAB 5,5 mM; Brij® 35 al 0,05 %; mas cualquier combinacion de potenciadores investigada en la Tabla 3) y H2O2 a los portaobjetos y se incubaron durante 8 minutos. Se uso DAB ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 jl de cobre (componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando microscopio de campo claro.
Ejemplo 13
Tincion TSA-HQ DAB de bcl-2
Se monto tejido de amygdala incrustado en parafina fijado con formalina sobre portaobjetos Superfrost, se desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo a granel CC1 (Ventana® p/n 950-124). Despues de la recuperacion, se distribuyo una gota (100 jl) de inhibidor UV (un componente del kit de DAB ultraView™) sobre un portaobjetos y se incubo durante 8 minutos. Despues de la incubacion del inhibidor, se distribuyo una gota del anticuerpo de raton anti-bcl2 (clon 124; Ventana® p/n 790-4464) sobre el portaobjetos y se incubo durante 16 minutos. Despues de 2 aclarados con tampon de reaccion, se detecto el anticuerpo contra bcl2 usando una gota del conjugado hRp universal ultraView™ (un componente del kit de DAB ultraView™) y se incubo sobre el portaobjetos durante 8 minutos. Se anadieron 100 jl de tiramida-HQ 50 uM con y sin 2-hidroxipiridina 10 mM y H2O2 (componente del kit de DAB ultraView™ Ventana® p/n 760-500) y se incubaron durante 12 minutos. Se detecto tiramida-HQ depositada usando 0,5 jg del conjugado de raton con HRP anti-HQ seguido por una gota de DAB (DAB 5,5 mM; Brij® 35 al 0,05 %; L-histidina 10 mM) y H2O2 incubando el portaobjetos durante 8 minutos. Se uso dAb ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 jl de cobre
(componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con
contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando microscopio de campo claro (FIG. 23-26).
Ejemplo 14
Tincion TSA-NP DAB de bcl2
Se monto tejido de amygdala incrustado en parafina fijado con formalina sobre portaobjetos Superfrost, se
desparafinizaron y se recupero el anrtgeno usando reactivo a granel CC1 (Ventana® p/n 950-124). Despues de la
recuperacion, se distribuyo una gota (100 jl) de inhibidor UV (un componente del kit de DAB ultraView™) sobre un portaobjetos y se incubo durante 8 minutos. Despues de la incubacion del inhibidor, se distribuyo una gota del anticuerpo de raton anti-bcl2 (clon 124; Ventana® p/n 790-4464) dilucion 1:300, sobre el portaobjetos y se incubo durante 16 minutos. Despues de 2 aclarados con tampon de reaccion, se detecto el anticuerpo contra bcl2 usando una gota del conjugado HRP universal ultraView™ (un componente del kit de DAB ultraView™) y se incubo sobre el portaobjetos durante 8 minutos. Se anadieron 100 jl de tiramida-NP 5 uM con y sin 2-hidroxipiridina 10 mM y H2O2 (componente del kit de DAB ultraView™ Ventana® p/n 760-500) y se incubaron durante 12 minutos. Se detecto tiramida-HQ depositada usando 0,5 jg del conjugado de raton con HRP anti-NP seguido por una gota de DAB (DAB 5,5 mM; Brij® 35 al 0,05 %; L-histidina 10 mM; 2-hidroxipiridina 10 mM) y H2O2 incubando el portaobjetos durante 8 minutos. Se uso DAB ultraView™ como referencia. Despues de aclarar los portaobjetos en tampon de reaccion, se aplicaron 100 jl de cobre (componente del kit de DAB ultraView™) al portaobjetos durante 4 minutos. Los portaobjetos se tineron con contraste usando Hematoxilina II (Ventana® p/n 790-2208) y reactivo Bluing (Ventana® p/n 760-2037). Los portaobjetos se deshidrataron usando alcoholes en gradiente, se cubrieron los portaobjetos y se visualizaron usando microscopio de campo claro (FIG. 43-46).
En vista de las muchas posibles realizaciones a las que pueden aplicarse los principios de la invencion descrita, debe reconocerse que las realizaciones ilustradas son solamente ejemplos preferidos de la invencion y no deben tomarse como limitantes del alcance de la invencion. En su lugar, el alcance de la invencion se define por las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar una diana en una muestra por deposicion proximal de un marcador, que comprende:
    poner en contacto la muestra con una solucion de reconocimiento, incluyendo la solucion de reconocimiento un resto de union espedfica que es espedfico para la diana; marcar el resto de union espedfica con una enzima;
    poner en contacto la muestra con una solucion de deteccion, comprendiendo la solucion de deteccion un sustrato enzimatico de modo que el marcador se deposite de forma proximal a la diana en presencia de un potenciador de deposicion que tiene una formula
    imagen1
    R2
    'R3
    en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado; A se selecciona de un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre y cualquier combinacion de los mismos; y detectar el marcador.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el contacto de la muestra con una solucion de deteccion incluye oxidar enzimaticamente el sustrato enzimatico usando un agente oxidante para formar el marcador, en el que la oxidacion enzimatica del sustrato enzimatico usando un agente oxidante incluye reducir la solubilidad o estabilidad del sustrato enzimatico de modo que el sustrato enzimatico quede depositado como el marcador.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el sustrato enzimatico se selecciona del grupo que consiste en un cromogeno y un conjugado de tiramida.
  4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan de hidrogeno e hidroxilo y cada A es un atomo de carbono, opcionalmente en el que R1, R3 y R4 son hidrogeno y R2 es hidroxilo.
  5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de alquilo, alqueno, alquino, hidrogeno, yodo, bromo, cloro, fluor y combinaciones de los mismos.
  6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la enzima es una oxidorreductasa o una peroxidasa.
  7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el resto de union espedfica comprende un anticuerpo o un acido nucleico.
  8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el sustrato enzimatico se selecciona de 1,3- diaminobencidina, 3-amino-9-etilcarbazol, tetrametilbencidina, una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un colorante BODIPY, una resorufina, una rodamina, o un derivado de los mismos, o en el que el sustrato enzimatico es un derivado de tiramina.
  9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la solucion de deteccion comprende adicionalmente un acelerador seleccionado de un compuesto heteroarilo, un acido boronico, un compuesto fenolico o una combinacion de los mismos, opcionalmente en el que el compuesto heteroarilo se selecciona de imidazol, L- histidina, N-oxido de piridina, N-oxido de pirimidina, oxido de N-metil morfolina y 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la solucion de deteccion comprende adicionalmente un tensioactivo no ionico seleccionado de un lauril eter de polioxietileno que tiene una formula (C2H4O)23C12H25OH; monoalquilato de polioxietilen (20) sorbitan, el monoalquilato que comprende entre 8 y 14 carbonos; un polioxietileno de alcohol secundario lineal que tiene una formula C12-14H25-29O(CH2CH2O]x, en la que x es igual a un numero entero entre 2 y 12; y octil fenil eter de polioxietileno, o en el que la solucion de deteccion comprende adicionalmente un antioxidante seleccionado de bisulfato de sodio, estannato de sodio, metabisulfato de sodio y combinaciones de los mismos, o en el que la solucion de deteccion comprende adicionalmente una sal que contiene metal del Grupo I o del Grupo II que tiene una formula MX2 o MX donde M es un metal del Grupo I o del Grupo II seleccionado de litio, sodio, potasio, cesio, calcio, magnesio, estroncio y bario; y X se selecciona de fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, carbonato, hidroxido y fosfato.
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  11. 11. Uso de un kit en un metodo para detectar una diana, comprendiendo el kit
    una enzima;
    una solucion de deteccion que comprende un potenciador de deposicion y un sustrato enzimatico que produce un resto detectable despues de reaccion con la enzima, teniendo el potenciador de deposicion una formula,
    imagen2
    R2
    'R3
    en el que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de grupo alifatico, arilo, halogeno, un resto que contiene heteroatomo e hidrogeno; R1 y/o R3 pueden estar unidos a R2 para formar un sistema de anillo aromatico condensado; A se selecciona de un atomo de carbono, un heteroatomo diferente de azufre y cualquier combinacion de los mismos.
  12. 12. El uso de la reivindicacion 11, en el que el kit comprende adicionalmente un resto de union espedfica, opcionalmente en el que el resto de union espedfica es un anticuerpo o un acido nucleico que se une espedficamente a una molecula diana.
  13. 13. El uso de la reivindicacion 12, en el que el resto de union espedfica y la enzima estan unidos juntos.
  14. 14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la enzima es una oxidorreductasa o una peroxidasa, opcionalmente en el que la peroxidasa es peroxidasa de rabano rusticano o glutation peroxidasa.
  15. 15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el sustrato enzimatico se selecciona de 1,3- diaminobencidina, 3-amino-9-etilcarbazol, tetrametilbencidina, una fluorescema, un luminoforo, una cumarina, un colorante BODIPY, una resorufina, una rodamina, o un derivado de los mismos, o en el que el sustrato enzimatico es un derivado de tiramina.
  16. 16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que el potenciador de la deposicion tiene una concentracion que vana de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM y el sustrato enzimatico tiene una concentracion que vana de mas de 0 mM a aproximadamente 8 mM.
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