CN116710131A - 使用表皮调节素和双调蛋白来预测对表皮生长因子受体定向疗法的反应 - Google Patents

Abstract

提供了允许预测对抗EGFR疗法的反应的方法，所述方法包括用于对双调蛋白(AREG)或表皮调节素(EREG)进行染色的组织化学或细胞化学染色方法。提供了评分算法，所述评分算法可包括但不限于确定针对EREG和AREG中的每一者的肿瘤细胞阳性率百分比以及将经确定的阳性率百分比与预定截止进行比较。所述预定截止可以为阳性截止(在这种情况下，如果所述百分比大于或等于所述截止，则以EGFR定向疗法来治疗患者)、阴性截止(在这种情况下，如果所述百分比小于所述截止，则不以所述EGFR定向疗法来治疗患者)或阳性截止和阴性截止两者。

Description

使用表皮调节素和双调蛋白来预测对表皮生长因子受体定向 疗法的反应

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年9月22日提交的美国临时专利申请第62/706,988号的提交日的权益，该美国临时专利申请的公开内容全文通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及用于预测对表皮生长因子受体(EGFR)定向疗法的反应的组织化学或细胞化学方法、系统和组合物。本公开还涉及分析组织学或细胞学样本以预测对EREG定向治疗剂的反应的方法。更特别地，本公开涉及用于基于对双调蛋白(amphiregulin)(AREG)呈阳性的肿瘤样品内的肿瘤细胞的百分比和对EREG呈阳性的肿瘤样品内的肿瘤细胞的百分比两者，来预测对EGFR定向治疗剂的反应的评分方法。

共同研究协议的引用

本申请由本塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems,Inc.)与利兹大学之间的共同研究协议的一方或多方提出或以该一方或多方的名义提出。

背景技术

约20％的患有结肠癌的患者存在转移性结直肠癌(mCRC)。这些患者中超过一半(50％至60％)最终会发展成无法治愈的晚期疾病，其5年存活率大约为12.5％。mCRC的两条信号传导通路一直是治疗药物开发的重点：血管内皮生长因子受体(VEGFR)通路和表皮生长因子受体(EGFR)通路。目前，大多数患有mCRC的患者接受与EGFR或VEGF靶向疗法组合的细胞毒化学疗法。EGFR在约70％的CRC病例中过度表达，其中该过度表达与预后不良相关联。2004年和2006年，FDA批准用单克隆抗体诸如西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)来靶向抑制EGFR以治疗患有mCRC的患者。这两种药物具有非常相似的功效，其中反应率为10％至15％。

一段时间以来，一直缺乏可靠的预测对EGFR定向疗法的反应性的阳性预测物。

临床研究已表明，EGFR抑制剂对缺乏RAS通路突变的患者最为有效。RAS信号传导通路成员诸如KRAS、NRAS和BRAF中的点突变导致下游RAS-MAPK信号传导的持续激活，无论EGFR是否在药理上失活。除了RAS和BRAF突变外，其他替代机制诸如cMET或EGFR扩增也在对西妥昔单抗或帕尼单抗的抗性中发挥作用。PI3K突变或PTEN丢失(其经常与RAS或BRAF突变一起发生)也可能与反应的缺乏相关联。事实上，RAS、BRAF和PI3K突变占对EGFR靶向单克隆抗体表现出原发性抗性的患有mCRC的患者的超过60％。在40％的患有KRAS、NRAS、BRAF和PI3K野生型肿瘤的患者(四重野生型患者)中，大约一半的这些患者(仅15％)从抗EGFR疗法获益，并且超过20％的患者是无反应者。参见Perkins等人。

包括配体表皮调节素(epiregulin)(EREG)和双调蛋白(AREG)在内的EGFR配体的过度表达已被建议为用于抗EGFR疗法的预测物。在一项对患有mCRC的患者的研究中，与单独的最佳支持性治疗相比，加入抗EGFR疗法使具有高EREG表达水平的患者的存活期从5.1个月增加到9.8个月。该结果表明EGFR配体表达可能成为临床上有用的生物标志物以筛选针对EGFR抑制剂疗法的患有mCRC的患者。然而，基于PCR的检测系统缺乏任何空间背景，诸如表达配体的细胞的分布和相对丰度。

EGFR配体的免疫组织化学分析的结果不一。例如，Khelwatty等人指出野生型EGFR及其至少一种配体的共同表达(以EGFR阳性肿瘤细胞>5％和配体染色强度2+为截止)与较短的无进展存活期显著相关，并因此与对EGFR定向治疗剂的较低反应率显著相关。然而，在他们的样品中，EGFR染色主要是细胞质的，这导致他们推断EGFR的内化使得EGFR疗法无法显示抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。他们进一步指出，研究中多达40％的患者以前可能已接受西妥昔单抗疗法，这可能促成了来自表面的EGFR的下调。因此，Khelwatty没有描述EGFR和EGFR配体的表达模式与对EGFR定向疗法的反应之间的明确相关性。另一方面，Yoshida等人(Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,March 2013，第139卷，第3期，pp 367–378)发现了7种配体中的4种(AREG、HB-EGF、TGFα和EREG)与对EGFR疗法的临床反应之间的良好相关性，并提出一种评分算法，其要求配体中的至少2种得分在高(HIGH)类别中。然而，Yoshida的方法存在遗漏可能仅过度表达EGFR配体中的一种但以高水平表达的患者的风险。

发明内容

本公开总体涉及用于基于对AREG呈阳性的肿瘤样品内的肿瘤细胞的百分比和对EREG呈阳性的肿瘤样品内的肿瘤细胞的百分比两者，来预测对EGFR定向治疗剂的反应的评分方法。

在一个实施例中，提供了一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：如果肿瘤为AREG高或EREG高，则向患者施用EGFR定向治疗剂，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG高。

在另一个实施例中，提供了一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：如果肿瘤既为AREG低又为EREG低，则向患者施用不包括EGFR定向治疗剂的治疗，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则肿瘤为AREG低，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG低。

在另一个实施例中，提供了一种选择患有肿瘤的患者来接受EGFR定向治疗剂的方法，该方法包括：(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定截止进行比较；(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定截止进行比较，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第一预定截止或者EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第二预定截止，则选择患者来接受EGFR定向治疗剂。

在另一个实施例中，提供了一种选择患有肿瘤的患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的疗法的方法，该方法包括：(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定截止进行比较；(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定截止进行比较，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比小于第一预定截止并且EREG+肿瘤细胞的百分比小于第二预定截止，则选择患者来接受EGFR定向治疗剂。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止在20％至50％的范围内，诸如为20％、25％、30％、约33.3％、40％和50％。

在一些实施例中，前述方法的第二预定截止在20％至50％的范围内，诸如为20％、25％、30％、约33.3％、40％和50％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为20％并且前述方法的第二预定截止为20％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为25％并且前述方法的第二预定截止为25％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为30％并且前述方法的第二预定截止为30％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为33.3％并且前述方法的第二预定截止为33.3％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为40％并且前述方法的第二预定截止为40％。

在一些实施例中，前述方法的第一预定截止为50％并且前述方法的第二预定截止为50％。

在一个实施例中，提供了一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：(a)如果肿瘤为AREG高或EREG高，则向患者施用EGFR定向治疗剂，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定阳性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定阳性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG高；以及(b)如果肿瘤既为AREG低又为EREG低，则对患者施用不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定阴性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG低，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定阴性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG低。

在一个实施例中，提供了一种为患有肿瘤的患者选择治疗的方法，该方法包括：(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定阳性截止和第一预定阴性截止进行比较；(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定阳性截止和第二预定阴性截止进行比较；(e)如果肿瘤为AREG高或EREG高，则选择患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第一预定阳性截止，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第二预定阳性截止，则将肿瘤视为EREG高；以及(f)如果肿瘤既为AREG低又为EREG低，则选择患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比小于第一预定阴性截止，则将肿瘤视为AREG低，并且其中如果EREG+肿瘤细胞的百分比小于第二预定阳性截止，则将肿瘤视为EREG低。

在一些实施例中，第一预定阳性截止在30％至50％的范围内，诸如为30％、约33.3％、40％和50％，并且第一预定阴性截止在20％至30％的范围内，诸如为20％、25％和30％。

在一具体实施例中，第一预定阳性截止为50％并且第一预定阴性截止为20％。

在一些实施例中，第二预定阳性截止在30％至50％的范围内，诸如为30％、约33.3％、40％和50％，并且第二预定阴性截止在20％至30％的范围内，诸如为20％、25％和30％。

在一具体实施例中，第二预定阳性截止为50％并且第二预定阴性截止为20％。

在一具体实施例中，第一预定阳性截止和第二预定阳性截止为50％并且第一预定阴性截止和第二预定阴性截止为20％。

在一些实施例中，前述方法的肿瘤为结直肠肿瘤。

在一些实施例中，前述方法的EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体，诸如西妥昔单抗(cetuximab)和/或帕尼单抗(panitumumab)。

在一些实施例中，前述方法的疗法进一步包括向患者施用化学疗法，诸如包括伊立替康(irinotecan)的化学疗法。

在一些实施例中，前述方法的不包括EGFR定向治疗剂的疗法包括向患者施用化学疗法，诸如包括伊立替康的化学疗法。

在一些实施例中，前述方法的肿瘤不包括可检测量的RAS蛋白，其具有赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的突变。

在一些实施例中，前述方法的肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

在一些实施例中，前述方法的结直肠肿瘤为左侧肿瘤

在一些实施例中，前述方法的结直肠肿瘤右侧肿瘤。

在前述方法的一些实施例中，样品源自结直肠肿瘤的切除物。

在前述方法的一些实施例中，样品为结直肠肿瘤的活检样品。

在一些实施例中，前述方法的肿瘤的样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

在前述方法的一些实施例中，表达EREG的细胞百分比和表达AREG的细胞百分比通过自动化方法进行定量。

通过引用并入序列表

本文通过引用并入以计算机可读格式随本文提交的序列表，该序列表具有文件名“P36405US_SEQ_LIST_ST25”，创建于2020年9月20日，其大小为14,484字节。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一个彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1：展示研究样品的分解的流程图。

图2：针对30个PICCOLO验证FOV的算法评分与共识病理学家评分之间的一致性-AREG总肿瘤计数(A)；AREG阳性百分比(B)；EREG总肿瘤计数(C)；EREG阳性百分比(D)。

图3：AREG与EREG IHC阳性率百分比的散点图。基于50％截点的四个象限被标记为：(A)AREG低/EREG高；(B)AREG高/EREG高；(C)AREG低/EREG低；以及(D)AREG高/EREG低。高配体表达物(蓝点；象限A、B和D)定义为高于50％的AREG和/或EREG阳性率百分比；低配体表达物(红点；象限C)定义为均低于50％的AREG和EREG阳性率百分比。50％截点通过虚线示出。

图4：针对(A)低配体表达物群组和(B)高配体表达物群组中的RAS-wt患者的PFSKaplan-Meier曲线。

具体实施方式

本公开总体涉及用于结直肠肿瘤样品针对EGFR和EGFR配体表达的组织化学染色和评估的方法、系统和组合物。除了其他方面，所公开的方法、系统和组合物可用于根据结直肠癌患者的肿瘤对EGFR定向治疗剂有反应的可能性将他们分层。

I.术语

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与所公开的公开内容所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文另外清楚指出，复制单数术语“一个”、“一种”、“所述”包括复数指代。

下面描述用于实践和/或测试本公开的实施例的合适方法和材料。此类方法和材料仅是说明性的，而不旨在进行限制。可以使用与本文所述那些相似或相当的其他方法和材料。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均全文出于所有目的以引用方式并入。如有歧义，以本专利说明书(包括术语解释)为准。

为了便于审视本公开的各种实施例，提供了对特定术语的如下解释：

施用:为了通过任何有效途径向受试者提供或给予药剂，例如，组合物、药物等。示例性的施用途径包括但不限于口服、注射(诸如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉)、舌下、直肠、透皮(例如局部)、鼻内、阴道和吸入途径。

抗体：包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区并特异性结合抗原表位的肽(例如多肽)。除非上下文另有指出，否则术语“抗体”应解释为明确包括抗体片段。在一些实施例中，抗体包括两条轻链和两条重链，其中轻链和重链可以彼此偶联(例如，共价偶联)。

抗体片段：除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

生物标志物：如本文所用，术语“生物标志物”应指在样品中发现的可用于对样品或从其获得样品的受试者进行表征的任何分子或分子组。例如，生物标志物可以是分子或分子组，其存在、不存在或相对丰度是：特定疾病状态的特征；指示疾病的严重程度或疾病进展或消退的可能性；和/或预测病理状况将对特定治疗有反应。

生物标志物特异性试剂：能够与细胞样品或组织样品中的一种或多种生物标志物直接特异性结合的特异性结合剂。短语“[靶标]生物标志物特异性试剂”应指能够与所述靶标生物标志物特异性结合的生物标志物特异性试剂。

复染：用染料对组织切片进行染色，其允许看到组织切片的全部“景观”，并用作用于检测组织靶标的主要颜色的参考。这种染料可以染色细胞核、细胞膜或整个细胞。染料的示例包括与核DNA结合并发出强蓝光的DAPI；与核DNA结合并发出强蓝光的Hoechst蓝色染料；和与核DNA结合并发出强红光的碘化丙啶。可以使用与荧光染料共轭的鬼笔环肽复染细胞内细胞骨架网络。鬼笔环肽是与细胞的细胞质中的肌动蛋白丝紧密结合'则在显微镜下变得清晰可见的毒素。

可检测部分：可以产生可检测信号(诸如视觉、电或其他信号)的分子或材料，其指示沉积在样品上的可检测部分或标记的存在和/或浓度。可以通过任何已知的或尚待发现的机制生成可检测信号，所述机制包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射。示例性可检测部分包括(但不限于)显色的、荧光的、磷光的和发光的分子和材料，将一种物质转换为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如酶)(诸如通过将无色物质转换为有色物质，反之亦然，或通过产生沉淀或增加样品浊度)。在一些示例中，可检测部分是荧光团，其属于几种常见的化学类别，包括香豆素类、荧光素类(或荧光素衍生物和类似物)、若丹明类、试卤灵类、发光团类和花青类。荧光分子的其他示例可参见：Molecular Probes Handbook—A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR,TheroFisher Scientific，第11版。在其他实施例中，可检测部分是经由明场显微术可检测的分子，诸如染料，包括二氨基联苯胺(DAB)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCOVERY紫色)、N,N'-双羧基戊基-5,5'-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5)和若丹明110(若丹明)。

检测试剂：任何用于沉积细胞样品中在与生物标志物结合的生物标志物特异性试剂附近的可检测部分，从而对样品进行染色的试剂。非限制性示例包括二级检测试剂(诸如能够与一级抗体结合的二级抗体，特异性结合生物素或亲和素的任何试剂)、三级检测试剂(诸如能够与二级抗体结合的三级抗体)、与特异性结合剂直接或间接相关联的酶、与此类酶反应以影响荧光或显色染色剂的沉积的化学物质、在染色步骤之间使用的洗涤试剂等。

单克隆抗体：具有基本上同质的抗体群体的抗体制剂，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少数的量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与多克隆抗体相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

多克隆抗体：通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的抗体制剂。

样品：为诊断目的获自受试者，并且以与使用特异性结合剂测试材料中生物标志物的存在或不存在和/或量相容的方式处理的任何材料。诊断目的的示例包括：对受试者的疾病进行诊断或预后，和/或预测疾病对特定治疗方案的反应，和/或监测受试者对治疗方案的反应，和/或监测疾病的进展或复发。

(a)细胞样品：包含完整细胞的样品，诸如细胞培养物、含有细胞的血液或其他体液样品、细胞涂片(诸如巴氏涂片和宫颈单层)、细针抽吸物(FNA)、基于液体的细胞学样品，以及采集用于病理学、组织学或细胞学解释的手术样本。

(b)组织样品：保留细胞之间的横截面空间关系(如同细胞存在于样品所获自的受试者体内那样)的细胞样品。“组织样品”应包括原始组织样品(即受试者产生的细胞和组织)和异种移植物(即植入受试者的外来细胞样品)。

切片：用作名词时指适用于显微分析的组织样品的薄片，通常使用切片机切割而成。用作动词时指制作组织样品的切片，通常使用切片机。

连续切片：从组织样品上依次切割的一系列切片中的任一个。对于被认为是彼此的“连续切片”的两个切片，它们不一定需要是来自组织的连续切片，但它们通常应该在相同的横截面关系中含有相同的组织结构，使得这些结构可以在组织学染色后彼此匹配。

特异性结合：如本文所用，短语“特异性结合”、“与...特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与特异性结合剂之间的结合，在分子(包括生物学分子)的异质群体的存在下，其确定靶标的存在。例如，与靶标特异性结合的结合实体是与其结合其他靶标相比以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合该靶标的抗体。

特异性结合剂：任何能够特异性结合与细胞样品或组织样品相关的靶化学结构(诸如样品表达的生物标志物或与样品结合的生物标志物特异性试剂)的物质组成。示例包括但不限于：对特定核苷酸序列具有特异性的核酸探针；抗体及其抗原结合片段；以及工程化的特异性结合结构，包括ADNECTIN(基于第10FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-SquibbCo.)、AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的支架；Affibody AB,Solna,Sweden)、AVIMER(基于结构域A/LDL受体的支架；Amgen,Thousand Oaks,CA)、dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架；GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK)、DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架；Molecular Partners AG,Zürich,CH)、ANTICALIN(基于脂质运载蛋白的支架；Pieris AG,Freising,DE)、NANOBODY(基于VHH的支架(骆驼Ig)；Ablynx N/V,Ghent,BE)、TRANS-BODY(基于转铁蛋白的支架；Pfizer Inc.,New York,NY)、SMIP(EmergentBiosolutions,Inc.,Rockville,MD)以及TETRANECTIN(基于C型凝集素结构域的支架(CTLD)，四连接素；Borean Pharma A/S,Aarhus,DK)。Wurch等人的《开发新型蛋白质支架作为全抗体的替代物用于成像和治疗：发现研究和临床验证的现状(Development of NovelProtein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging andTherapy:Status on DISCOVERY Research and Clinical Validation)》，《当今药物生物技术(Current Pharmaceutical Biotechnology)》，第9卷，第502-509页(2008)综述了此类工程化的特异性结合结构的描述，该文献的内容以引用方式并入本文。

染色：当用作名词时，术语“染色剂(stain)”应指任何可用于使用于显微分析(包括明场显微术、荧光显微术、电子显微术等)的细胞样品中的特定分子或结构可视化的物质。当用作动词时，术语“染色(stain)”应指任何引起染色剂沉积在细胞样品上的过程。

受试者：从其获得或衍生样品的哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，受试者为人。

II.针对EGFR配体对样品进行组织化学或细胞化学标记

本方法基于针对人EREG蛋白和人AREG蛋白对肿瘤样品进行组织化学或细胞化学染色。

A.样品和样品制备

本方法对从肿瘤获得的组织样品或组织样品的细胞学制备物(包括例如肿瘤活检样品、切除样品、细胞涂片、细针抽吸物(FNA)、液基细胞学样品等)进行。

在一个实施例中，样品为固定组织样品。固定组织样品使细胞和组织成分尽可能地保持在接近类似生命的状态，并允许它们在不发生重大变化的情况下进行制备程序。阻止了细胞死亡后开始的自溶和细菌分解过程，并且稳定了样品的细胞和组织成分，使得它们禁得起后续的组织处理阶段。固定剂可以分类为交联剂(诸如醛类，例如，甲醛、聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和络合物，诸如四氧化二锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇和乙醇)、机理不明的固定剂(例如，氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如，Camoy固定剂、Methacam、Bouin液、B5固定剂、Rossman液和Gendre液)、微波以及其他固定剂(例如，排除体积固定和蒸汽固定)。固定剂中还可以包括添加剂，诸如缓冲剂、洗涤剂、单宁酸、酚、金属盐(诸如氯化锌、硫酸锌和锂盐)和镧。制备样品时最常用的固定剂是甲醛，一般呈福尔马林溶液的形式(甲醛的水溶液(并且通常是缓冲的甲醛水溶液))。在一个实施例中，本方法中使用的样品通过包括在基于福尔马林的固定剂中固定的方法固定。在一示例中，固定剂是10％的中性缓冲福尔马林。尽管有这些示例，但是组织可以通过使用与所使用的生物标志物特异性试剂和特异性检测试剂相容的任何固定介质的过程进行固定。

在一些示例中，在包埋介质中包埋固定的组织样品。包埋介质为惰性材料，其中包埋组织和/或细胞以帮助保存它们供将来分析。包埋还能使组织样品被切成薄切片。包埋介质包括石蜡、火棉、OCT^TM化合物、琼脂、塑料或丙烯酸树脂。在一个实施例中，样品被固定在福尔马林中并包埋在石蜡中以形成福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)块。在典型的包埋过程(诸如用于FFPE块)中，固定样品后使其经受一系列的醇浸泡(通常使用在约70％至约100％范围内的渐增醇浓度)以使样品脱水。醇通常是烷醇，特别是甲醇和/或乙醇。特定的工作实施例对于这些系列脱水步骤使用70％、95％和100％的乙醇。在最后一个醇处理步骤之后，就将样品浸入另一种有机溶剂中，该溶剂通常被称为洗涤液。洗涤液(1)去除残留的醇，并(2)使样品更加疏水以供后续打蜡步骤。洗涤溶剂通常为芳香族有机溶剂，诸如二甲苯。通过将包埋材料应用于已洗涤的样品形成块，可以从该块切割(诸如通过使用切片机)组织切片。

尽管有这些示例，但是本公开不需要具体的处理步骤，只要获得的组织样品或细胞学样品与目标生物标志物的样品的组织染色和用于该染色以及后续显微镜评价或数字成像以对表达EREG或AREG的细胞数量进行定量的试剂相容即可。

B.样品选择

Bl.肿瘤分期

在一个实施例中，在针对EGFR蛋白和/或AREG蛋白对肿瘤进行染色之前，对样品所源自的肿瘤进行分期。0期结直肠癌是生长没有超出结肠内衬的癌症。I期结直肠癌是没有扩散到结肠壁本身以外或扩散入附近淋巴结的癌症。II期结直肠癌是已经穿过结肠壁生长，并可能生长入附近组织，但尚未扩散到淋巴结的癌症。III期结直肠癌是已经扩散到附近淋巴结，但尚未扩散到身体其他部位的癌症。IV期结直肠癌是已经自结肠扩散到远处器官和组织的癌症。在一个实施例中，如果样品是III期或IV期结直肠癌，则选择该样品进行染色。在另一个实施例中，如果样品是IV期结直肠癌，则选择该样品进行染色。

B2.EGFR抗性突变

可以针对赋予对EGFR定向治疗剂的抗性的突变的存在，筛选肿瘤。此类突变的示例包括RAS致癌基因(参见，例如，Prior、Waring、Vale、Kaprapetis、Douillard和VanCutsem)以及BRAF基因(参见，例如，Bokemeyer)中的激活突变。在一些实施例中，在进行针对EGFR配体的染色之前，样品或受试者已被确定为RAS野生型。如本文所用，“野生型RAS”应指在RAS突变筛选测定中，对于至少NRAS和KRAS内赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的突变(无论是目前已知的还是后来发现的)，样品或受试者被测试为阴性。在一个实施例中，RAS突变筛选测定包括确定至少NRAS的12和13号密码子以及KRAS的12和13号密码子中是否存在激活突变，其中如果样品或受试者没有在NRAS的12和13号密码子以及KRAS的12和13号密码子中的每一个中的激活突变，则认为该样品是“RAS野生型”。在另一个实施例中，RAS突变筛选测定包括确定至少NRAS的12、13、59、61、117和146号密码子以及KRAS的12、13、59、61、117和146号密码子中是否存在激活突变，其中如果样品或受试者没有在NRAS的12、13、59、61、117和146号密码子中的每一个中的激活突变并且KRAS的12、13、59、61、117和146号密码子被确定为具有野生型RAS状态，则认为该样品是“RAS野生型”。Ras突变状态的筛选可以在来自受试者的各种不同类型的样品上进行，包括源自肿瘤的组织样品和来自获得组织样品的相同受试者的血液样品。已知许多不同的Ras突变状态筛选方法，包括基于测序、焦磷酸测序、实时PCR、等位基因特异性实时PCR、带有测序的限制性片段长度多态性(RFLP)分析、扩增难治性突变系统(ARMS)或带有测序的COLD-PCR(低变性温度共扩增PCR)的方法。筛选Ras突变的其他具体示例性方法包括但不限于：依靠循环肿瘤DNA(ctDNA)的基于血液的筛选方法(参见例如，Schmiegel等人,Mol.Oncol.,Vol.11,第2期,pp.208–19(Feb.2017)(通过将用于KRAS和NRAS的2、3和4号外显子的基于乳液数字PCR的测定应用于循环无细胞DNA测定来筛选突变))和基于组织的方法，诸如使用Sanger测序、大规模平行测序(包括基于焦磷酸测序、循环可逆终止、半导体测序或荧光标记在核苷酸焦磷酸链上技术的测序方法)或基于PCR的测定(包括定量PCR和数字PCR)筛选肿瘤组织样品中KRAS和NRAS 2、3和4号外显子的突变。本公开不限于任何特定的筛选Ras突变状态的方法。

B3.侧性

在一些实施例中，结直肠肿瘤的侧性在染色之前确定。结直肠肿瘤可划分为右侧肿瘤(从盲肠到脾曲出现的肿瘤)和左侧肿瘤(从脾曲到直肠出现的肿瘤)。如示例所示，本评分方法可用于左侧肿瘤和右侧肿瘤两者。应注意，肿瘤的右侧性通常是用于对EGFR定向治疗剂的反应的阴性预测物(参见，例如Tejpar)。然而，如本发明示例中所示，本评分方法可用于预测左侧肿瘤和右侧肿瘤两者中的反应。

B4.EGFR状态

在一些实施例中，确定肿瘤的EGFR状态。可以使用确定EGFR状态的任何方法(无论是当前已知的还是后来开发的)。在具体示例中，EGFR状态通过免疫组织化学法(IHC)或免疫细胞化学法(ICC)确定。全长人EGFR的规范氨基酸序列以SEQ ID NO:1示出。正如本领域普通技术人员所理解的，准确的氨基酸序列可能因受试者不同而不同。在一个实施例中，IHC或ICC测定利用能够与包含SEQ ID NO:1的多肽特异性结合的抗体进行。表1列出了EGFR特异性单克隆抗体的非限制性示例。

表1

在一个实施例中，EGFR生物标志物特异性试剂是针对EGFR的细胞内结构域的单克隆抗体。在另一个实施例中，EGFR生物标志物特异性试剂是针对EGFR细胞外结构域的单克隆抗体。在另一个实施例中，EGFR生物标志物特异性试剂是识别全长EGFR和EGFRvIII突变型的单克隆抗体。

C.AREG和EREG组织化学和细胞化学染色

标记EREG和AREG可以通过在促进靶标生物标志物和生物标志物特异性试剂之间特异性结合的条件下使组织切片或细胞学制备物与生物标志物特异性试剂接触来完成。然后将样品与一组检测试剂接触，该一组检测试剂与生物标志物特异性试剂相互作用以促进可检测部分在样品上靶标生物标志物附近的沉积，从而产生定位于靶标生物标志物的可检测信号。经生物标志物染色的样品可以任选地另外用造影剂(诸如苏木精染色剂)染色以显现大分子结构。

本文公开的组织化学和细胞化学染色方法包括：在支持生物标志物特异性试剂与由样品表达的生物标志物之间的特异性结合的条件下，使结直肠肿瘤的组织切片或细胞学制备物与一种或多种针对人EGFR蛋白和人AREG蛋白的生物标志物特异性试剂接触。EREG和AREG首先以前肽的形式表达，该前肽在细胞表面处被切割以释放活性信号传导结构域。表2列出了人EREG和AREG(及其前肽)的经典氨基酸序列。正如本领域普通技术人员所理解的，准确的氨基酸序列可能因受试者不同而不同。

表2

在一个实施例中，人EREG蛋白的生物标志物特异性试剂是能够与包含SEQ ID NO:2的多肽特异性结合的生物标志物特异性试剂。在一个实施例中，人AREG蛋白的生物标志物特异性试剂是能够与包含SEQ ID NO:3的多肽特异性结合的生物标志物特异性试剂。

在一个实施例中，EREG生物标志物特异性试剂为抗体。表3列出了EREG特异性抗体的非限制性示例：

表3

在一个实施例中，EREG生物标志物特异性试剂是选自表3的单克隆抗体。

在一个实施例中，AREG生物标志物特异性试剂为抗体。表4列出了AREG特异性抗体的非限制性示例：

表4

在一个实施例中，AREG生物标志物特异性试剂选自表4。

在与样品结合之后，使用一组检测试剂使生物标志物特异性试剂可视化。在一些实施例中，检测试剂使与显微术(例如明场显微术)相容的染色剂(或可检测部分)沉积。

在一些实施例中，发色团或可检测部分的共价沉积是使用酪酰胺信号放大(TSA)完成的，该方法也称为催化报告沉积(CARD)。美国专利第5,583,001号(其公开内容据此通过引用整体并入本文)公开了一种使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，该系统依赖催化报告沉积来放大可检测标记物信号。通过使带标记的苯酚分子与酶反应来增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加了从IHC和ISH测定中获得的信号，同时不产生显著的背景信号放大(参见例如美国申请公开第2012/0171668号，其有关与酪酰胺扩增试剂的公开内容据此通过引用全文并入本文)。用于这些扩增方法的试剂正被应用于临床上重要的靶标，以提供先前无法实现的稳定的诊断能力(VENTANA OptiView扩增试剂盒，Ventana Medical Systems，Tucson AZ，目录号760-099)。

在其他实施例中，使用醌甲基化物化学进行发色团或可检测部分的共价沉积。于2019年1月1日授权的名称为"Quinone Methide Analog Signal Amplification"的美国专利第10,168,336号描述了一种与TSA一样可用于增加信号放大而不显著增加背景信号的技术("QMSA")。特别地，美国专利第10,168,336号(其公开内容据此通过引用整体并入本文)描述了新颖的醌甲基化物类似物前体以及使用这些醌甲基化物类似物前体检测生物学样品中的一个或多个靶标的方法。在特定实施例中，检测方法包括使样品与检测抗体或探针接触，然后使样品与包含碱性磷酸酶(AP)和结合部分的标记缀合物接触，其中该结合部分识别抗体或探针(例如，通过与半抗原或物种特异性抗体表位或其组合结合)。标记缀合物的碱性磷酸酶与包含可检测部分的醌甲基化物类似物前体相互作用，从而形成反应性醌甲基化物类似物，该反应性醌甲基化物类似物与生物学样品近端或直接在靶标上共价结合。然后检测(诸如目视或通过成像技术)可检测标记物。

另一种用于沉积可检测部分的技术采用“点击”化学来形成样品中可检测部分与形态学标志物或生物标志物之间的共价键。“点击化学”是一种化学原理，其由Sharpless和Meldal的研究组独立地定义，描述了经定制以通过将小单元连接在一起而快速且可靠地生成物质的化学过程。“点击化学”已应用于一组可靠并且自主的有机反应(Kolb,H.C.；Finn,M.G.；Sharpless,K.B.Angew.Chem.Int.Ed.2001,40,2004-2021)。在将可检测标记物共价沉积到生物学样品上的背景下，US2019/0204330中描述了一种点击化学技术，该专利通过引用整体并入本文。在该技术中，利用如上所述的酪酰胺沉积或同样如上所述的醌甲基化物沉积将能够参与点击化学反应的第一反应性基团共价锚定至生物学样品。该检测系统的第二组分具有对应的能够参与点击化学反应的第二反应性基团，其然后与第一反应基团反应以将使该第二组分与生物学样品共价结合。在特定实施例中，所述技术包括使生物学样品与特定于第一靶标的第一检测探针接触。第一检测探针可以为一抗探针或核酸探针。随后，使样品与第一标记缀合物接触，该第一标记缀合物包含第一酶。在一些实施例中，第一标记缀合物为二抗，该二抗特定于一抗(诸如由其获得抗体的物种)或缀合至核酸探针的标记物(诸如半抗原)。接下来，使生物学样品与点击缀合物对的第一成员接触。第一酶切割具有酪酰胺或醌甲基化物前体的点击缀合物对的第一成员，从而将该第一成员转化为反应性中间体，该反应性中间体与生物学样品近端或直接在第一靶标上共价结合。接下来，使点击缀合物对的第二成员与生物学样品接触，该对点击缀合物的第二成员包括第一报告部分(例如，发色团)和第二反应性官能团，其中第点击缀合物对的第二成员的第二反应性官能团能够与该对点击缀合物的第一成员的第一反应性官能团反应。最后，检测来自第一报告部分的信号。

市售的检测试剂或包含可用于本发明方法的检测试剂的试剂盒的非限制性示例包括：VENTANA ultraView检测系统(与酶(包括HRP和AP)缀合的二级抗体)；VENTANA iVIEW检测系统(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲和素缀合的酶)；OptiView检测系统(与半抗原缀合的抗物种二级抗体和与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体)；VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二级抗体，其可以与任何前述VENTANA检测系统一起使用，以扩增在一级抗体结合位点处沉积的酶的数目)；VENTANA OptiView扩增系统(与半抗原缀合的抗物种二级抗体，与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体，以及与相同半抗原缀合的酪酰胺)；VENTANADISCOVERY(例如，DISCOVERY黄色试剂盒、DISCOVERY紫色试剂盒、DISCOVERY银色试剂盒、DISCOVERY红色试剂盒、DISCOVERY若丹明试剂盒等)DISCOVERY OmniMap、DISCOVERYUltraMap抗半抗原抗体、二级抗体、色原、荧光团和染料试剂盒，其各自可以从VentanaMedical Systems,Inc.(Tucson,Arizona)获得；PowerVision和PowerVision+IHC检测系统(直接与HRP或AP聚合成带有高比例酶/抗体的紧凑聚合物的二级抗体)；以及DAKOEnVision^TM+系统(与二级抗体缀合的酶标记的聚合物)。

组织化学或细胞化学方法可以在自动化染色机(或其他载玻片处理机)上进行，手动进行，或者以自动化步骤和手动步骤相结合为特征。在一个实施例中，在自动化IHC染色装置上进行本文所述的组织化学或细胞化学染色方法。自动化IHC染色装置的具体示例包括：intelliPATH(Biocare Medical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS和DAKOAUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK XT(Ventana MedicalSystems,Inc.)、BENCHMARK Special Stains(Ventana Medical Systems,Inc.)、BENCHMARK ULTRA(Ventana Medical Systems,Inc.)、BENCHMARK GX(Ventana MedicalSystems,Inc.)、DISCOVERY XT(Ventana Medical Systems,Inc.)、DISCOVERY ULTRA(Ventana Medical Systems,Inc.)、Leica BOND和Lab Vision Autostainer(ThermoScientific)。自动化IHC染色装置也由Prichard,Overview of AutomatedImmunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med.,Vol.138,pp.1578–1582(2014)描述，其全文以引用方式并入本文。此外，Ventana Medical Systems,Inc.是公开用于执行自动分析的系统和方法的多项美国专利的受让人，包括美国专利号：5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开专利申请号：20030211630和20040052685，它们中各自的全文以引用方式并入本文。本公开的方法可以适应在任何适当的自动化IHC染色装置上进行。

本公开不限于使用自动化系统。在一些实施例中，手动应用本文所述的组织化学标记方法。或者，特定步骤可以手动进行，而其他步骤则在自动化系统中进行。

如果需要，可以对生物标志物经染色的载玻片进行复染，以帮助识别形态学相关区域和/或识别目标区域(ROI)。复染剂的示例包括：显色核复染剂，诸如苏木精(染色从蓝色到紫色)、亚甲蓝(染色为蓝色)、甲苯胺蓝(染色为细胞核深蓝色和多糖粉红色到红色)、核固红(也称为Kernechtrot染料，染色为红色)以及甲基绿(染色为绿色)；非核显色染色剂，诸如伊红(染色为粉红色)；荧光核染色剂，包括4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，染色为蓝色)、碘化丙啶(染色为红色)、Hoechst染色剂(染色为蓝色)、核绿DCS1(染色为绿色)、核黄(Hoechst S769121，在中性pH下染色为黄色，而在酸性pH下染色为蓝色)、DRAQ5(染色为红色)、DRAQ7(染色为红色)；荧光非核染色剂，诸如荧光团标记的鬼笔环肽(染色丝状肌动蛋白，颜色取决于缀合荧光团)；Van Gieson(van Gieson染色剂为用来突出胶原蛋白与其他结缔组织诸如肌肉组织之间的差异的染色剂)；阿尔新蓝(阿尔新蓝为酞菁染料，其提供对于糖胺聚糖和酸性粘蛋白等物质的特异性(阿尔新蓝8G在水中的吸光度最大为615nm)并致使酸性粘蛋白和粘液物质呈蓝色，并在使用复染中性红色时致使细胞核呈微红的粉色)；Weigert间苯二酚品红(Weigert Elastic)(这种类型的染料用于给弹性纤维上色。该染料致使这些纤维染成蓝黑色，致使细胞核变成浅蓝黑色，致使胶原蛋白变成粉色或红色，并致使其他组织变成黄色)。

在一些实施例中，复染剂选自：酸性品红(C.I.42685；最大吸光度546nm)、阿尔新蓝8GX(C.I.74240；最大吸光度615nm)、茜素红S(C.I.58005；最大吸光度556和596nm)、金胺O(C.I.41000；最大吸光度370和432nm)、偶氮胭脂红B(C.I.50090；最大吸光度516nm)、偶氮胭脂红G(C.I.50085；最大吸光度511nm)、天青A(C.I.52005；吸光度与天青B相似)、天青B(C.I.52010；最大吸光度639nm)、碱性品红(C.I.42510；最大吸光度547至552nm)、俾斯麦棕Y(C.I.21000；最大吸光度643nm)、亮甲酚蓝(C.I.51010；最大吸光度622nm)、胭脂红(C.I.75470；质子化最大吸光度490至495，在碱中以及与金属盐结合时增大)、氯唑黑E(C.I.30235；最大吸光度500至504nm以及574至602nm)、刚果红(C.I.22120；最大吸光度497nm)、甲酚紫(最大吸光度596至601nm)、结晶紫(C.I.42555；最大吸光度590nm)、达罗红(最大吸光度502nm)、乙基绿(C.I.42590；最大吸光度635nm、420nm)、固绿F C F(C.I.42053；最大吸光度624nm，取决于pH)、Giemsa染色剂(不纯的天青B、亚甲蓝和伊红Y的混合物)、靛蓝胭脂红(C.I.73015；最大吸光度608nm)、Janus绿B(C.I.11050：最大吸光度630nm)、Jenner染色剂1899、浅绿SF(C.I.42095；最大吸光度422和630nm)、孔雀石绿(C.I.42000；最大吸光度614和425nm)、马休黄(C.I.10315；最大吸光度420至432nm)、甲基橙(C.I.13025；最大吸光度507nm)，甲基紫2B(C.I.42535；最大吸光度583至587nm)、亚甲蓝(C.I.52015；最大吸光度656至661nm)、亚甲紫(Bernthsen)、(C.I.52041；最大吸光度580至601nm)、中性红(C.I.50040；最大吸光度454、529、541nm，取决于pH和溶剂)、苯胺黑(C.I.50420；最大吸光度570至580nm)、尼罗蓝A(C.I.51180；最大吸光度633至660nm)、核固红(C.I.60760；最大吸光度535和505nm)、油红O(C.I.26125；最大吸光度518和359nm)、橙色G(C.I.16230；最大吸光度475nm)、橙色II(C.I.15510；最大吸光度483nm)、地衣红(最大吸光度575至590，取决于pH)、副品红(C.I.42500；最大吸光度545nm)、根皮红B(C.I.45410；最大吸光度548和510nm)、派若宁B(C.I.45010；与派若宁Y密切相关)、派若宁Y(C.I.45005；最大吸光度546至549nm)、刃天青(水中最大吸光度598nm，甲醇中最大吸光度478)、玫瑰红(C.I.45435；最大吸光度546nm)、番红O(C.I.50240；最大吸光度530nm)、苏丹黑B(C.I.26150；最大吸光度598和415nm)、苏丹III(C.I.26100；最大吸光度503至507和503nm)、苏丹IV(C.I.26105；最大吸光度520nm)、四色染色剂(MacNeal)、硫堇(C.I.52000；最大吸光度598至602nm)、甲苯胺蓝(C.I.52040；最大吸光度626至630nm)、Weigert间苯二酚品红(最大吸光度508nm)、Wright染色剂及其任意组合。在这些示例中的每一个中，“C.I.”指Color Index^TM。Color Index^TM通过其公认的使用类别、其色调和序列号(其简单地反映相关着色剂类型已在Color Index中注册的时间顺序)描述商业产品。该定义使特定产品能够与其基本着色剂具有相同的化学组成并且其中该基本着色剂来自单一化学反应或一系列反应的其他产品一起分类。

在某些实施例中，可以对经生物标志物染色的切片的连续切片(或生物标志物染色的切片本身)进行形态学染色。基本的形态学染色技术通常依赖于用第一种染料染色核结构并且用第二种染色剂染色细胞质结构。许多形态学染色剂是已知的，包括但不限于苏木精和伊红(H&E)染色剂以及李氏染色剂(亚甲蓝和碱性品红)。市售的H&E染色器的示例包括：来自罗氏公司的VENTANA SYMPHONY(个体载玻片染色器)和VENTANA HE 600(个体载玻片染色器)H&E染色器；来自Agilent Technologies的Dako CoverStainer(批量染色器)；来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小型线性染色器(批量染色器)、Leica ST5020多级染色器(批量染色器)和Leica ST5010自动染色器XL系列(批量染色器)H&E染色器。

III.细胞定量

本评分算法基于对经EREG染色的细胞(EREG+肿瘤细胞)和经AREG染色的细胞(AREG+肿瘤细胞)两者的百分比进行定量。可以手动或通过自动化方法确定阳性染色细胞的百分比。

在手动方法中，有技术的使用者(诸如病理学家)观察经染色的样品的放大图像并估计视野内对相应标志物呈阳性染色的细胞的百分比。当样品为组织切片时，有技术的读者可以识别视野(FOV)内的目标区域(ROI)以进行分析(诸如识别肿瘤边缘并仅评估肿瘤边缘内的细胞)，或者可以简单地评估FOV内的所有细胞。

在一个实施例中，在数字病理学系统上进行自动化定量。数字病理学系统存在两个基础部件：(1)用于生成经染色的样品的数字图像的扫描系统；(2)用于对图像内的特定特征进行识别和定量的图像分析系统。在本方法的示例性数字病理学工作流程中，在染色平台上将经染色的样品数字化，并然后由图像分析系统对其分析，以对图像内与细胞总数和经生物标志物染色的细胞的总数相对应的特征进行识别和定量。随后可以从这两个值得出对相应标志物呈阳性染色的细胞的百分比。这可以采取多种不同的形式。例如，系统可以识别图像内对应于“细胞”的对象，并随后识别这些细胞中有多少包含指示阳性生物标志物染色的适当染色模式。替代性地，系统可以计算图像的区域以及与阳性生物标志物染色相关的该区域的百分比。在又一个实施例中，系统可以识别图像对应于细胞膜的所有区域并计算对应于阳性生物标志物染色的该区域的百分比。可以设想或使用许多其他布置。手动方法和自动化方法两者的输出将为EREG+肿瘤细胞的百分比和AREG+肿瘤细胞的百分比。

用于数字病理学应用的各种扫描仪(荧光和明场两种)的详细概述可见于Farahani等人，Whole slide imaging in pathology:advantages,limitations,andemerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int'l,Vol.7,p.23–33(June 2015)，该文献的内容以引用的方式整体并入。市售载玻片扫描仪的示例包括：3DHistech PANNORAMIC SCAN II；DigiPath PATHSCOPE；Hamamatsu NANOZOOMER RS、HT和XR；Huron TISSUESCOPE 4000、4000XT和HS；Leica SCANSCOPE AT、AT2、CS、FL和SCN400；Mikroscan D2；Olympus VS120-SL；Omnyx VL4和VL120；PerkinElmer LAMINA；PhilipsULTRA-FAST SCANNER；Sakura Finetek VISIONTEK；Unic PRECICE 500和PRECICE 600x；VENTANA ISCAN COREO和ISCAN HT；以及Zeiss AXIO SCAN.Z1。其他示例性系统和特征可见于例如WO2011-049608或于2011年9月9日提交的题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,ANDMETHODS OF USING THE SAME”美国专利申请号61/533,114，上述文献的内容全文以引用方式并入本文。

可用于实现本文公开的自动化方法的示例性商购图像分析软件包包括：VENTANAVIRTUOSO软件套件(Ventana Medical Systems,Inc.)；TISSUE STUDIO、DEVELOPER XD和IMAGE MINER软件套件(Definiens)；BIOTOPIX、ONCOTOPIX和STEREOTOPIX软件套件(Visiopharm)；和HALO平台(Indica Labs,Inc.)。

IV.治疗选择

通过将经EREG染色的细胞(EREG+肿瘤细胞)和经AREG染色的细胞(AREG+肿瘤细胞)的百分比与预定截止进行比较来选择治疗方案。

所使用的预定截止可指示以下：患者将对EGFR定向疗法具有阳性反应的可能性；或者指示患者将对EGFR定向疗法具有阴性反应的可能性的截止。如本文所用，“对EGFR定向疗法的阳性反应”意指截止与用EGFR定向疗法进行治疗之后的总存活期和无进展存活期中的至少一者的改善相关联。如本文所用，“对EGFR定向疗法的阴性反应”意指截止与用EGFR定向疗法进行治疗之后的总存活期和无进展存活期中的至少一者的劣化相关联。

在一个实施例中，使用与对EGFR定向治疗剂的阳性反应相关联的截止。针对EREG和AREG开发独立截止，并将EREG+肿瘤细胞的百分比与EREG特异性截止进行比较，并将AREG+肿瘤细胞的百分比与AREG特异性截止进行比较。如果EREG+肿瘤细胞的百分比超过针对EREG的预定截止或者AREG+肿瘤细胞的百分比超过针对AREG的预定截止，则选择患者来接受EGFR定向疗法。

在一个实施例中，使用与对EGFR定向治疗剂的阴性反应相关联的截止。针对EREG和AREG开发独立截止，并将EREG+肿瘤细胞的百分比与EREG特异性截止进行比较，并将AREG+肿瘤细胞的百分比与AREG特异性截止进行比较。如果EREG+肿瘤细胞的百分比超过针对EREG的预定截止或者AREG+肿瘤细胞的百分比超过针对AREG的预定截止，则选择患者来接受EGFR定向疗法。如果EREG+肿瘤细胞的百分比以及AREG+肿瘤细胞的百分比两者均低于其相应的预定截止，则为患者选择不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程。

在另一个实施例中，针对每个标志物使用两个截止：(a)与对EGFR定向治疗剂的阳性反应相关联的截止(“阳性截止”)；和(b)与对EGFR定向治疗剂的阴性反应相关联的截止(“阴性截止”)。针对EREG和AREG开发独立截止，将EREG+肿瘤细胞的百分比与阳性EREG特异性截止和阴性EREG特异性截止两者进行比较，并将AREG+肿瘤细胞的百分比与阳性AREG特异性截止和阴性AREG特异性截止两则进行比较。治疗选择如表5中所示：

表5

示例性其他因素包括针对错配修复缺陷肿瘤的免疫疗法的可用性和功效、用于患有右侧原发肿瘤的患者的血管生成抑制剂、以及针对BRAF突变型肿瘤的BRAF和MEK抑制剂。

在一个实施例中，抗EGFR治疗剂为EGFR抗体。这些疗法通常依赖于与EGFR的细胞外结构域结合的抗体或抗体片段。在一个实施例中，基于EGFR抗体的疗法包括西妥昔单抗和/或帕尼单抗。

在一个实施例中，EGFR定向治疗剂被纳入患有III期结直肠肿瘤的RAS野生型受试者的治疗方案中。在这个阶段，通常会进行手术切除肿瘤或部分结肠切除术(包括切除附近的淋巴结)，然后进行辅助化学疗法和/或放射疗法，尽管对于某些患者可以使用化学疗法(任选地与放射疗法组合)而不进行手术。在这个阶段使用的非限制性联合疗法包括FOLFOX(5-FU、亚叶酸和奥沙利铂(oxaliplatin))或CapeOx(卡培他滨(capecitabine)和奥沙利铂)。在一具体非限制性实施例中，治疗III期结直肠癌的方法可以包括：

·对于被选择来接受EGFR定向治疗剂的患者：施用基于EGFR抗体的疗法，任选地联合基于氟嘧啶的化学疗法或基于氟嘧啶的联合化学疗法(诸如FOLFOX或CapeOx)；或者

·对于被选择不接受EGFR定向治疗剂的患者：施用不包括基于EGFR抗体的治疗过程。

在另一个实施例中，EGFR定向治疗剂被纳入患有IV期结直肠肿瘤的RAS野生型受试者的治疗方案中。IV期结直肠肿瘤的治疗方案通常包括手术切除肿瘤或部分结肠切除术(包括切除附近的淋巴结)和转移(如果可能的话)以及辅助或新辅助化学疗法和/或放射疗法。手术切除肿瘤或部分结肠切除术(包括切除附近的淋巴结)和转移(如果可能的话)以及化学疗法和/或放射疗法通常在这个阶段进行。常见的化学疗法包括基于氟嘧啶的化学疗法，该疗法任选地与亚叶酸和/或其他化学疗法和/或靶向疗法组合。在这个阶段使用的非限制性联合疗法包括：

·FOLFOX：亚叶酸、5-FU和奥沙利铂(ELOXATIN)；

·FOLFIRI：亚叶酸、5-FU和伊立替康(CAMPTOSAR)；

·CapeOX：卡培他滨(XELODA)和奥沙利铂；

·FOLFOXIRI：亚叶酸、5-FU、奥沙利铂和伊立替康；

·上述组合之一加上靶向VEGF的药物(诸如贝伐珠单抗(bevacizumab)[AVASTIN]、阿柏西普(ziv-aflibercept)[ZALTRAP]或雷莫芦单抗(ramucirumab)[CYRAMZA])或靶向EGFR的药物(诸如西妥昔单抗[Erbitux]或帕尼单抗[VECTIBIX])；

·5-FU和亚叶酸，有或没有靶向药物；

·卡培他滨，有或没有靶向药物；

·伊立替康，有或没有靶向药物；

·仅西妥昔单抗；

·仅帕尼单抗；

·仅瑞戈非尼(STIVARGA)；和

·三氟尿苷和地匹福林(LONSURF)，

在一具体非限制性实施例中，治疗IV期结直肠癌的方法可以包括：

·对于被选择来接受EGFR定向治疗剂的受试者，施用基于EGFR抗体的疗法，任选地联合选自由以下所组成的群组的一种或多种附加疗法：FOLFOX、FOLFIRI、CapeOX、FOLFOXIRI、5-FU和亚叶酸钙、卡培他滨、伊立替康以及靶向VEGF的药物(诸如贝伐珠单抗、阿柏西普和雷莫芦单抗)；或者

·对于被选择不接受EGFR定向治疗剂的受试者，施用不包括EGFR定向治疗剂(诸如靶向VEGF的药物)、FOLFOX(任选地与靶向VEGF的药物组合)、FOLFIRI(任选与靶向VEGF的药物组合)、CapeOX(任选与靶向VEGF的药物组合)、FOLFOXIRI(任选与靶向VEGF的药物组合)、5-FU和亚叶酸(任选与靶向VEGF的药物组合)、卡培他滨(任选与靶向VEGF的药物组合)、伊立替康(任选与靶向VEGF的药物组合)、瑞戈非尼或三氟尿苷和地匹福林(任选与靶向VEGF的药物组合))的治疗过程。

V.实例

A.患者、材料和方法

将460个KRASc.12,13,59-61-wt患者事先随机分配到二线伊立替康(Ir)与(vs)伊立替康加帕尼单抗(IrPan)。参见Seymour等人以及Middleton等人。当前研究包括所有同意的患者，这些患者具有足够的经储存的病理学材料(460个患者中的326个[70.9％])(在试验开始时收集的组织)，其中针对AREG和EREG的IHC成功(n＝313)。存在13个其中IHC失败并且没有足够的肿瘤组织可用于重复分析的病例。事先对KRAS c.146、NRAS c.12,13,59-61、BRAF c.1799T>A进行附加的突变分析。在以下患者中进行初步分析：KRAS c.12,13,59-61、146以及NRAS c.12,13,59-61 wt(“RAS-wt”)。

将来自每个FFPE块的三个4μm厚组织切片切割到独立的Superfrost Plus载玻片(VWR,Lutterworth,UK)上。将一个切片用抗AREG(SP272)(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ,USA)染色，并使用VENTANA BenchMark ULTRA自动染色仪(VentanaMedical Systems,Inc.Tucson,AZ,USA)和经预编程的方案，将另一个切片用抗EREG(SP326)(Ventana Medical Systems,Inc.Tucson,AZ,USA)兔单克隆抗体染色。使用Mayer苏木精和Scott自来水替代品作为蓝染试剂，将第三切片用苏木精和伊红(H&E)染色。在放大200倍下使用VENTANA DP200扫描仪生成载玻片的数字图像。研究人员对患者的治疗分配、突变概况和临床结果不知情。

评估对AREG和EREG呈染色阳性的肿瘤细胞的百分比的AI算法由Ventana MedicalSystems,Inc.(Santa Clara,CA,USA；Tucson,AZ,USA)开发。为了验证算法，最初从使用针对AREG和EREG染色的结直肠癌样本的内部开发队列生成的30个数字载玻片图像随机选择肿瘤区域内的30个视野(FOV)。两个病理学家独立地将FOV内的所有肿瘤细胞注释为对AREG和EREG中的每一者呈阳性或阴性。观察四种染色模式：膜状、细胞质状、细胞膜状和点状。如果看到这些染色模式中的任一种，则将肿瘤细胞视为阳性。使用一致性相关系数(CCC)来评定病理学家间一致性以及算法生成结果与病理学家生成结果之间的一致性。为在用于分析全视野载玻片图像时验证算法，将AI算法IHC读数与来自PICCOLO队列的肿瘤区域内的qRT-PCR结果关联。

肿瘤区域由病理学家注释，并将开发的AI算法应用于全视野载玻片，且随后从肿瘤区域提取数据。AI算法确定针对AREG和EREG中每一者的IHC阳性肿瘤细胞的百分比。按IHC阳性率百分比将样品二分为高表达物(AREG高或EREG高)和低表达物(既AREG低又EREG低)。针对AREG和EREG IHC截点的所有可能组合(每个截点为1％至100％，因此1002＝10,000种组合)生成接受者操作特性(ROC)曲线，参考如由Seligmann等人报告的先前mRNA二分法，作为敏感性和特异性计算的基础。计算最大约登指数(Max_c[敏感性_c+特异性_c-1]，即其中当对每一者放置相等权重时，敏感性和特异性的总和处于其最大值)以确定与mRNA测定的IHC截点最匹配的这种截点。参见Youden。这被用来定义用于在初步分析中进行调查的IHC截点。

主要终点为无进展存活期(PFS)；次要终点为总存活期(OS)和实体瘤反应评估标准(RECIST)反应率(RR)。PFS和RR数据与初步PICCOLO试验分析没有变化，但在该分析中使用了更新的2年OS数据。

将Stata(Stata统计软件，第16版[2019]；StataCorp)用于所有统计分析。使用双尾t检验、Wilcoxon秩和检验(针对具有非正态分布频率分布的变量)和Pearsonχ²检验(针对分类变量)，在治疗组(IrPan与Ir)之间比较基线患者特性。使用相同的检验将患者特性与整个试验群体进行比较。使用箱形图和Wilcoxon秩和检验来比较BRAF-wt病例与突变型病例之间连续AREG和EREG IHC阳性率百分比的分布，比较左侧(脾曲到直肠)与右侧PTL，并最后比较腹膜转移的存在与不存在。

首先在Cox比例风险模型中，将配体表达(即IHC阳性率百分比)评定为单独用Ir治疗的所有患者中的预后标志物，即使用二分法分类器(高与低)和每个配体两者分别作为连续变量。在AREG和EREG被评定为连续变量的情况下，将配体阳性率百分比按比例缩小10倍，以提高风险比(HR)的可解释性。分析首先在未经调整的情况下进行，并随后针对世界卫生组织体力状态[WHO PS]、对既往疗法的反应以及既往化学疗法进行调整(是与否)。30个患者中对既往疗法的反应未知，并使用多重插补来估算针对这30个患者的值。基于20个经估算的数据集，使用“既往奥沙利铂疗法”和“既往化学疗法”作为既往反应的预测物，进行多元逻辑回归。

随后在按IHC配体状态(AREG高或EREG高与既AREG低又EREG低)分层以及评定治疗效果(IrPan与Ir)并使用似然比检验来检验配体-治疗相互作用的未经调整Cox比例风险模型中，将配体表达评定为针对帕尼单抗疗法对PFS和OS的益处的预测标志物。随后分别针对BRAF突变、PTL和腹膜转移的存在进行调整，重复这些模型，以确定在针对这些可能的混杂因素进行调整后配体-治疗相互作用是否持续存在。还将未经调整模型在RAS和BRAF-wt群组中重复，并还分别考虑二分AREG和二分EREG(50％截点)。绘制Kaplan-Meier(KM)曲线。使用Harrell C指数来评定一致性概率。

由按二分配体IHC分层的广义线性模型(具有对数链接)来估计针对IrPan与Ir对RR的影响的未经调整风险比。随后进行针对配体-治疗相互作用的似然比检验。

B.结果

该生物标志物研究中的患者队列与主要试验群体之间不存在显著的特性差异(数据未示出)。313个患者中共有274个(88％)为RAS-wt，其中49个(18％)患有BRAF突变(图1)。242个(88％)RAS-wt患者出现疾病进展事件，并且248个(91％)死亡。

B1.算法开发

两个独立病理学家在评定所分析的30个FOV中的每一个中的肿瘤细胞总计数以及AREG和EREG IHC阳性率百分比方面存在高度一致性。每个病理学家的评分也与AI算法的评定高度相关(图2)。

B2.配体表达

AREG和EREG IHC阳性率百分比高度相关(Spearman相关系数为0.77，P<0.0005)。在IHC数据和mRNA数据两者均对其可用的患者子集(313个患者中的186个[59％])中，这两个度量对于配体中的每一个呈阳性相关(Spearman相关系数：AREG 0.64，P<0.0001；EREG0.80，P<0.0001)。

对于初步分析，将AREG和EREG IHC阳性率百分比先验地评定为二分标志物(任一配体的高表达与两种配体的低表达)，以帮助实现到临床应用的途径。在IHC数据和mRNA数据两者均可用的情况下，最大约登指数为0.581，这确定“高”与“低”截点对于AREG具有IHC阳性率47％并且对于EREG具有IHC阳性率52％。与这些截点的敏感性和特异性分别为0.716和0.865。使用这些截点将研究样品(n＝313)划分为159(50.8％)个高病例和154(49.2％)个低病例。为便于在未来的临床实践中手动解释AREG和EREG，在下一步的分析中，针对两种标志物将最佳截点四舍五入至50％。EREG IHC阳性百分比与AREG IHC阳性率百分比的散点图如图3所示，其中虚线描绘50％截点。高配体群组和低配体群组在每个治疗群组中具有均匀的患者分布。低配体群组中患有右侧PTL、BRAF突变型状态和腹膜转移的患者显著多于高配体群组(表6)。

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*从检验排除的未知类别。用于年龄的Wilcoxon秩和检验和用于分类变量的Pearson卡方检验或Fisher精确检验

**来自针对生存函数相等性的对数秩检验的p值

表6：低配体表达群组和高配体表达群组中RAS-wt患者的特性的描述性统计数据以及针对关联性的p值

B3.AREG/EREG表现作为组合型二分生物标志物

在单独利用Ir治疗的患者中或在经调整的分析中，不存在针对以下的证据：IHC配体状态(高与低)对PFS(未经调整的HR，1.22[95％CI，0.86-1.75]；P＝0.27)或OS(未经调整的HR，1.01[95％CI，0.71-1.43]；P＝0.98)的预后影响(表7)。

表7：单独利用Ir治疗的RAS-wt患者中二分分类器(50％IHC阳性率截点)对PFS和OS的影响的预后分析(未经调整和经调整的HR以及95％CI)

*针对WHO PS、既往反应和既往化疗进行调整(是与否)。

主要假设是高配体IHC评分可预测帕尼单抗在RAS-wt患者中的PFS益处。这一假设得到数据支持，如表8和图4所示。

表8：RAS-wt患者(随后RAS-wt和BRAF-wt患者)中治疗(IrPan与Ir)对PFS和OS的影响的估计粗HR，由二分分类器分层并且包括针对配体-治疗相互作用的似然比检验

在具有高配体IHC阳性率的RAS-wt患者中，利用IrPan的中位PFS为8.0个月，与其相比，单独利用Ir的中位PFS为3.2个月(HR，0.54[95％CI，0.37-0.79]；P＝0.001)。相反，在具有低配体IHC阳性率的患者中，不存在来自帕尼单抗疗法的益处(中位PFS IrPan与Ir：3.4个月与4.4个月；HR，1.05[95％CI，0.74-1.49]；p＝0.78)(表8，图4)。无论是未经调整(p＝0.02)还是经调整(p＝0.02)，配体-治疗相互作用均是显着的。OS的结果不太显著(相互作用p＝0.19)，这很可能是由于试验中总体上缺乏帕尼单抗的OS影响。在RAS-wt和BRAF-wt亚群体中，影响大小相似，但由于样品量较小而可能不太显著(PFS相互作用p＝0.21)(表8)。

在具有高配体IHC阳性率的RAS-wt患者中，通过向伊立替康加入帕尼单抗显著地改善了RR(IrPan与Ir：48％与6％；风险比，7.8[95％CI,2.90-20.69]；p<0.0001)，而在具有低配体IHC阳性率的患者中，在两个治疗群组之间RR没有显着差异(IrPan与Ir：25％与14％；风险比，1.8[95％CI,0.89-3.65]；p＝0.10)(表9)。

表9：RAS-wt患者中治疗组对完全或部分反应的风险的影响的估计粗风险比和95％CI，由配体二分分类器分层并且包括针对配体-治疗相互作用的似然比检验。

B4.AREG和EREG作为独立的生物标志物

作为次级分析，将AREG和EREG IHC阳性率百分比分别作为连续变量进行检查。如在组合型二分分类器的初步分析中，AREG和EREG均不作为连续变量来预测PFS或OS(表10)。EREG预测来自帕尼单抗的PFS益处(相互作用p＝0.01)。尽管对于AREG有相同发现的趋势，但配体-治疗相互作用未达到显著(相互作用p＝0.06)。AREG和EREG均不预测帕尼单抗疗法OS益处(表11)。

*针对WHO PS、既往化学疗法和对化学疗法的既往反应进行调整。

表10：单独利用Ir治疗的RAS-wt患者中AREG和EREG作为连续变量(按10倍缩放)对PFS和OS的影响的预后分析(未经调整和经调整的HR以及95％Cis)。

表11：RAS-wt(随后是RAS-wt和BRAF-wt)患者中连续AREG和EREG(缩放10倍)对PFS和OS的影响的估计粗HR和95％CI。针对所有患者，随后是Ir群组，最后是IrPan组示出HR。示出了针对配体-治疗相互作用的似然比检验。

B5.可能混杂因素的影响

鉴于BRAF突变、右侧PTL和腹膜转移的存在与低配体IHC阳性率相关联，研究了在RAS wt患者中针对PFS所见的按配体水平的差异治疗效果是否反而由这些因素驱动(表12)。在针对BRAF(相互作用P＝0.02)、PTL(相互作用P＝0.01)和腹膜转移(相互作用P＝0.01)进行调整后，二分分类器仍然为帕尼单抗疗法益处的重要预测物。当将每个配体分别作为连续变量进行检查时，发现相似的结果。因此，配体-治疗效果似乎与这些潜在的混杂因素无关。

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表12：RAS-wt患者中连续AREG、连续EREG和二分分类器(高与低)对PFS的影响的HR和95％CI，针对BRAF(突变型与wt)、PTL(右与左)和腹膜转移(存在与不存在)进行调整，按治疗组分层，并且包括针对配体治疗相互作用的似然比检验

源于右侧结肠(盲肠至脾曲)的腺癌更常与BRAF、PTEN和PIK3CA突变以及错配修复酶缺陷相关联。肿瘤侧性(作为此类分子特性的代表)与抗EGFR疗法之间的关系已得到广泛研究，其中对CRYSTAL(FOLFIRI+/-西妥昔单抗)和PRIME(FOLFOX+/-帕尼单抗)试验的回顾性分析证明在患有左侧而非右侧PTL的RAS-wt患者中OS受益于抗EGFR药剂。这些数据已用于为国家治疗指南提供信息，其中NCCN建议不应在一线环境中向右侧PTL患者提供抗EGFR药剂。此处，对于左侧PTL而非右侧PTL，AREG和EREG蛋白表达较高。然而，我们的二分分类器在针对该因素进行调整后仍然为帕尼单抗益处的重要预测物，表明其在识别可以在其治疗过程的早期适当地接受抗EGFR疗法的右侧PTL患者方面具有潜在的临床效用。

B6.AREG/EREG组合型模型的探询—替代性截点

选择50％IHC阳性率截点，因为其与在先前验证的基于mRNA表达的测定中开发的中间/上三分位截点紧密对齐。出于探索目的，使用不同的截点来研究帕尼单抗对PFS的益处(表13)。将截点降低至20％可识别具有低配体IHC阳性率百分比的患者，这些患者实际上由于添加帕尼单抗而具有显着较差的PFS(HR，1.73[95％CI，1.02-2.95]；p＝0.04)并且可能被这种治疗伤害。在高配体群组中，IrPan与Ir对PFS的HR显示出显着益处，其中对于20％到50％截点，HR为约0.55。配体-治疗相互作用在整个范围内仍然显著，表明在不同临床场景中可以使用不同的截点。另外，当截点降低到20％时，识别出具有非常低的配体表达物的群组，他们似乎因向化学治疗加入帕尼单抗而受到伤害。

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表13：RAS-wt患者中治疗组(IrPan与Ir)对PFS影响的估计粗HR和95％CI，按不同截点处的配体阳性率百分比分层并且包括针对配体治疗相互作用的似然比检验

B7.活检与切除的比较

在研究样品中，190个(61％)肿瘤样本取自切除，并且123个(39.3％)取自活检。为了确保我们的二分模型保持可靠，而不管所检查的肿瘤样本类型如何，我们还分别分析了这些亚群组(表14)。针对治疗(IrPan与Ir)对PFS的影响的HR有利于针对已经历切除的患者(HR，0.62[95％CI，0.44-0.86]；p＝0.005)，而非仅进行活检的那些(HR，1.06[95％CI，0.70-1.62]；p＝0.78)加入帕尼单抗，可能是因为这些患者更有可能出现广泛转移性疾病，而非在常规术后监测中检测到的疾病复发。即，在仅进行活检的患者中，仍存在趋势表明向伊立替康加入帕尼单抗可能有益于高配体表达物而非低配体表达物。对于两种样本类型，配体-治疗相互作用均未达到显著，这可能是由于该亚群组分析中的样品量较小。

表14：以切除或活检样本估计的RAS-wt患者中治疗(IrPan与Ir)对PFS的影响的粗HR，由二分分类器分层并且包括针对配体-治疗相互作用的似然比检验。

参考文献

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附加实施例

附加实施例1一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：如果肿瘤为AREG高或EREG高，则向患者施用包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG高。

附加实施例2一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：如果肿瘤既为AREG低又为EREG低，则向患者施用治疗，即不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则肿瘤为AREG低，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG低。

附加实施例3一种选择患有肿瘤的患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程的方法，该方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定截止进行比较；以及

(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定截止进行比较，

其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第一预定截止或者EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第二预定截止，则选择患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程。

附加实施例4提供了一种选择患有肿瘤的患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的疗法的方法，该方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定截止进行比较；以及

(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定截止进行比较，

其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比小于第一预定截止并且EREG+肿瘤细胞的百分比小于第二预定截止，则选择患者来接受EGFR定向治疗剂。

附加实施例5根据附加实施例1至4中任一者所述的方法，其中第一预定截止在20％至50％的范围内，并且第二预定截止在20％至50％的范围内。

附加实施例6根据附加实施例5所述的方法，其中：

第一预定截止为20％，并且第二预定截止为20％；或者

第一预定截止为25％，并且第二预定截止为25％；或者

第一预定截止为20％，并且第二预定截止为30％；或者

第一预定截止为25％，并且第二预定截止为33.3％；或者

第一预定截止为20％，并且第二预定截止为40％；或者

第一预定截止为25％，并且第二预定截止为50％。

附加实施例7一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：

(a)如果该肿瘤为AREG高或EREG高，则向患者施用EGFR定向治疗剂，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定阳性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定阳性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG高；以及

(b)如果该肿瘤既为AREG低又为EREG低，则向患者施用不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定阴性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为AREG低，并且其中如果肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定阴性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将肿瘤视为EREG低。

附加实施例8一种为患有肿瘤的患者选择治疗的方法，该方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对肿瘤的样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第一预定阳性截止和第一预定阴性截止进行比较；

(d)对肿瘤的样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将该百分比与第二预定阳性截止和第二预定阴性截止进行比较；

(e)如果该肿瘤为AREG高或EREG高，则选择患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第一预定阳性截止，则将肿瘤视为AREG高，并且其中如果EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于第二预定阳性截止，则将肿瘤视为EREG高；以及

(f)如果该肿瘤既为AREG低又为EREG低，则选择患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果AREG+肿瘤细胞的百分比小于第一预定阴性截止，则将肿瘤视为AREG低，并且其中如果EREG+肿瘤细胞的百分比小于第二预定阴性截止，则将肿瘤视为EREG低。

附加实施例9根据附加实施例7或附加实施例8所述的方法，其中：

第一预定阳性截断在30％至50％的范围内，并且第一预定阴性截断在20％至30％的范围内；和/或

第二预定阳性截断在30％至50％的范围内，并且第二预定阴性截断在20％至30％的范围内。

附加实施例10根据附加实施例9所述的方法，其中

第一预定阳性截断为50％；

第一预定阴性截断为20％；

第二预定阳性截断为50％；并且

第二预定的阴性截止为20％。

附加实施例11根据附加实施例1至10中任一者所述的方法，其中肿瘤为结直肠肿瘤。

附加实施例12根据附加实施例11所述的方法，其中结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

附加实施例13根据附加实施例11所述的方法，其中结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

附加实施例14根据附加实施例11至13中任一者所述的方法，其中样品源于结肠直肠肿瘤的切除物。

附加实施例15根据附加实施例11至13中任一者所述的方法，其中样品为结直肠肿瘤的活检样品。

附加实施例16根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中前述方法的EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

附加实施例17根据附加实施例16所述的方法，其中抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

附加实施例18根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中治疗过程包括向患者施用化学疗法。

附加实施例19根据附加实施例18所述的方法，其中化学疗法包括伊立替康。

附加实施例20根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

附加实施例21根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

附加实施例22根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中肿瘤的样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

附加实施例23根据前述附加实施例中任一者所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

序列表

<110> 文塔纳医疗系统公司

利兹大学

<120> 使用表皮调节素和双调蛋白来预测对表皮生长因子受体定向疗法的反应

<130> I14269

<160> 3

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1210

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe

1010 1015 1020

Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu

1025 1030 1035

Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn

1040 1045 1050

Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg

1055 1060 1065

Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp

1070 1075 1080

Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro

1085 1090 1095

Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln

1100 1105 1110

Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro

1115 1120 1125

His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln

1130 1135 1140

Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala

1145 1150 1155

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1160 1165 1170

Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys

1175 1180 1185

Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln

1190 1195 1200

Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

1205 1210

<210> 2

<211> 169

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Thr Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser

20 25 30

Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys

35 40 45

Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser

50 55 60

Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln

65 70 75 80

Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val

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Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val His Gln

100 105 110

Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu

115 120 125

Phe Leu Ile Thr Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr

130 135 140

Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr

145 150 155 160

Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val

165

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Arg Ala Pro Leu Leu Pro Pro Ala Pro Val Val Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Ile Leu Gly Ser Gly His Tyr Ala Ala Gly Leu Asp Leu Asn Asp Thr

20 25 30

Tyr Ser Gly Lys Arg Glu Pro Phe Ser Gly Asp His Ser Ala Asp Gly

35 40 45

Phe Glu Val Thr Ser Arg Ser Glu Met Ser Ser Gly Ser Glu Ile Ser

50 55 60

Pro Val Ser Glu Met Pro Ser Ser Ser Glu Pro Ser Ser Gly Ala Asp

65 70 75 80

Tyr Asp Tyr Ser Glu Glu Tyr Asp Asn Glu Pro Gln Ile Pro Gly Tyr

85 90 95

Ile Val Asp Asp Ser Val Arg Val Glu Gln Val Val Lys Pro Pro Gln

100 105 110

Asn Lys Thr Glu Ser Glu Asn Thr Ser Asp Lys Pro Lys Arg Lys Lys

115 120 125

Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn

130 135 140

Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys

145 150 155 160

Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys Gln Gln Glu Tyr

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys Thr His Ser Met Ile

180 185 190

Asp Ser Ser Leu Ser Lys Ile Ala Leu Ala Ala Ile Ala Ala Phe Met

195 200 205

Ser Ala Val Ile Leu Thr Ala Val Ala Val Ile Thr Val Gln Leu Arg

210 215 220

Arg Gln Tyr Val Arg Lys Tyr Glu Gly Glu Ala Glu Glu Arg Lys Lys

225 230 235 240

Leu Arg Gln Glu Asn Gly Asn Val His Ala Ile Ala

245 250

Claims (84)

1.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，所述方法包括：如果所述肿瘤为AREG高或EREG高，则向所述患者施用包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为AREG高，并且其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为EREG高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一预定截止在20％至50％的范围内，并且所述第二预定截止在20％至50％的范围内。

3.根据权利要求2所述的方法，其中：所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为20％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为25％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为30％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为33.3％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为40％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为50％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

15.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，所述方法包括：如果所述肿瘤既为AREG低又为EREG低，则向所述患者施用治疗，即不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则所述肿瘤为AREG低，并且其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为EREG低。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一预定截止在20％至50％的范围内，并且所述第二预定截止在20％至50％的范围内。

17.根据权利要求16所述的方法，其中：所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为20％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为25％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为30％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为33.3％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为40％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为50％。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

21.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

23.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

25.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

26.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

27.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

28.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

29.一种选择患有肿瘤的患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程的方法，所述方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对所述肿瘤的所述样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第一预定截止进行比较；以及

(d)对所述肿瘤的所述样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第二预定截止进行比较，

其中如果所述AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于所述第一预定截止或者所述EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于所述第二预定截止，则选择所述患者来接受包括所述EGFR定向治疗剂的所述治疗过程。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一预定截止在20％至50％的范围内，并且所述第二预定截止在20％至50％的范围内。

31.根据权利要求30所述的方法，其中：所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为20％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为25％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为30％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为33.3％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为40％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为50％。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

35.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

37.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

39.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

40.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

41.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的所述样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

42.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

43.提供了一种选择患有肿瘤的患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的疗法的方法，所述方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对所述肿瘤的所述样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第一预定截止进行比较；以及

(d)对所述肿瘤的所述样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第二预定截止进行比较，

其中如果所述AREG+肿瘤细胞的百分比小于所述第一预定截止并且所述EREG+肿瘤细胞的百分比小于所述第二预定截止，则选择所述患者来接受所述EGFR定向治疗剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第一预定截止在20％至50％的范围内，并且所述第二预定截止在20％至50％的范围内。

45.根据权利要求44所述的方法，其中：所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为20％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为25％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为30％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为33.3％；或者所述第一预定截止为20％，并且所述第二预定截止为40％；或者所述第一预定截止为25％，并且所述第二预定截止为50％。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

49.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

51.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

53.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

54.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

55.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的所述样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

56.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

57.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，所述方法包括：

(a)如果所述肿瘤为AREG高或EREG高，则向所述患者施用EGFR定向治疗剂，其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第一预定阳性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为AREG高，并且其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有大于或等于第二预定阳性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为EREG高；以及

(b)如果所述肿瘤既为AREG低又为EREG低，则向所述患者施用不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第一预定阴性截止的AREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为AREG低，并且其中如果所述肿瘤已在组织化学或细胞化学上经确定具有小于第二预定阴性截止的EREG+肿瘤细胞的百分比，则将所述肿瘤视为EREG低。

58.根据权利要求57所述的方法，其中：所述第一预定阳性截止在30％至50％的范围内，并且所述第一预定阴性截止在20％至30％的范围内；和/或所述第二预定阳性截止在30％至50％的范围内，并且所述第二预定阴性截止在20％至30％的范围内。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第一预定阳性截止为50％；

所述第一预定阴性截止为20％；所述第二预定阳性截止为50％；并且所述第二预定阴性截止为20％。

60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

63.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

65.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

67.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

68.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

69.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

70.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。

71.一种为患有肿瘤的患者选择治疗的方法，所述方法包括：

(a)针对人AREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(b)针对人EREG蛋白，对所述肿瘤的样品进行组织化学或细胞化学染色；

(c)对所述肿瘤的所述样品中的AREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第一预定阳性截止和第一预定阴性截止进行比较；

(d)对所述肿瘤的所述样品中的EREG+肿瘤细胞的百分比进行定量，并将所述百分比与第二预定阳性截止和第二预定阴性截止进行比较；

(e)如果所述肿瘤为AREG高或EREG高，则选择所述患者来接受包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果所述AREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于所述第一预定阳性截止，则将所述肿瘤视为AREG高，并且其中如果所述EREG+肿瘤细胞的百分比大于或等于所述第二预定阳性截止，则将所述肿瘤视为EREG高；以及

(f)如果所述肿瘤既为AREG低又为EREG低，则选择所述患者来接受不包括EGFR定向治疗剂的治疗过程，其中如果所述AREG+肿瘤细胞的百分比小于所述第一预定阴性截止，则将所述肿瘤视为AREG低，并且其中如果所述EREG+肿瘤细胞的百分比小于所述第二预定阴性截止，则将所述肿瘤视为EREG低。

72.根据权利要求71所述的方法，其中：所述第一预定阳性截止在30％至50％的范围内，并且所述第一预定阴性截止在20％至30％的范围内；和/或所述第二预定阳性截止在30％至50％的范围内，并且所述第二预定阴性截止在20％至30％的范围内。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一预定阳性截止为50％；

所述第一预定阴性截止为20％；所述第二预定阳性截止为50％；并且所述第二预定阴性截止为20％。

74.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为结直肠肿瘤。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为左侧肿瘤。

76.根据权利要求74所述的方法，其中所述结直肠肿瘤为右侧肿瘤。

77.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述EGFR定向治疗剂为抗EGFR单克隆抗体。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述抗EGFR单克隆抗体为西妥昔单抗或帕尼单抗。

79.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述治疗过程包括向所述患者施用化学疗法。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述化学疗法包括伊立替康。

81.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤不包含赋予对EGFR单克隆抗体疗法的抗性的可检测量的突变。

82.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为RAS野生型(RAS-wt)。

83.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤的所述样品为福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

84.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中表达EREG的肿瘤细胞的百分比和表达AREG的肿瘤细胞的百分比通过自动化方法进行定量。