CN104603620B

CN104603620B - 使用间变性淋巴瘤激酶(alk)作为标志物鉴定治疗响应性非小细胞肺癌的方法

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Publication number: CN104603620B
Application number: CN201380046571.2A
Authority: CN
Inventors: T·格罗根; H·尼塔; M·巴尼斯; P·汤尼; S·辛格; J·F·克莱门茨; C·谢姆普; E·罗伯茨
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: ES2633864T3; JP2015534061A; DK2898329T3; US20230184772A1; WO2014046730A1; EP2898329B1; AU2013318618B2; US20200225237A1; US20150346206A1; US20170205416A1; US11499974B2; US10620207B2; US9651555B2; CA2881559C; CN104603620A; AU2013318618A1; CA2881559A1; JP6259828B2; EP2898329A1

Abstract

本文中公开了用于将受试者鉴定为具有预测为或可能响应ALK抑制剂(例如克唑替尼)治疗的NSCLC的方法。所述方法包括使用本文中公开的免疫组织化学(IHC)和评分方法将包含NSCLC肿瘤细胞的样品鉴定为ALK阳性或ALK阴性。若样品鉴定为ALK阳性，则将受试者鉴定为具有可能响应ALK抑制剂治疗的NSCLC，且若样品鉴定为ALK阴性，则将受试者鉴定为具有可能不响应ALK抑制剂治疗的NSCLC。依照所述方法的某些实施方案，然后可以用ALK抑制剂(诸如克唑替尼)治疗预测为响应ALK抑制剂的受试者。

Description

使用间变性淋巴瘤激酶(ALK)作为标志物鉴定治疗响应性非小细胞肺癌的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月24日提交的美国临时申请No.61/704,960的权益，通过提及将其完整收入本文。

发明领域

本申请涉及用于非小细胞肺癌预后的方法，特别是确定非小细胞肺癌是否预测为响应间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)抑制剂的方法的实施方案。

发明背景

间变性淋巴瘤激酶(ALK)蛋白是受体酪氨酸激酶胰岛素受体超家族的一个成员。ALK是一种通常仅在神经系统中表达的I型膜糖蛋白。在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系和存档的临床标本中发现了染色体2p内的倒位，其导致包含ALK基因和棘皮动物微管关联蛋白样4(EML4)基因的部分的融合基因产物的形成(Soda等,Nature 448:561-566,2007)。现在公认ALK为NSCLC中的重要参与者，并且虽然EML4是主要的融合配偶体，但是已经鉴定出其它融合配偶基因。ALK基因重排的发生率的范围表现为2-7％，转化成在美国的约6,000例ALK阳性患者/年和全世界的约40,000例患者/年。重要地，ALK基因重排很少与EGFR、HER2、或KRAS突变同时发生，证明了ALK阳性是一种独特的疾病亚型。

克唑替尼(crizotinib)(XALKORI,Pfizer)是一种抑制ALK的有力受体酪氨酸激酶抑制剂。在两项临床试验中，用克唑替尼治疗的ALK阳性局部晚期或转移性NSCLC患者分别展现出50％(N＝136；95％CI:42％,59％)和61％(N＝119；95％CI:52％,70％)的总体响应率。如此，测定NSCLC患者中的ALK状态对于指导患者护理是至关重要的。然而，仍然需要一种快速且精确鉴定最可能响应克唑替尼治疗的NSCLC患者的特异的、灵敏的且标准化的ALK状态测定法。

发明概述

本文中公开了用于将受试者鉴定为具有预测为响应ALK抑制剂(例如克唑替尼)治疗的NSCLC的方法的实施方案。所述实施方案包括使用本文中公开的免疫组织化学(IHC)和评分方法将包含NSCLC肿瘤细胞的样品鉴定为ALK阳性或ALK阴性。若样品鉴定为ALK阳性，则将受试者鉴定为具有可能响应ALK抑制剂治疗的NSCLC，且若样品鉴定为ALK阴性，则将受试者鉴定为具有可能不响应ALK抑制剂治疗的NSCLC。在一些例子中，将样品用抗ALK抗体标记，而且若样品中存在至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞，则将样品鉴定为ALK阳性。

所公开的方法的一些实施方案还包括选择具有ALK阳性NSCLC肿瘤的受试者用ALK抑制剂治疗。所公开的方法的别的实施方案还包括治疗鉴定为具有预测为响应治疗的NSCLC的受试者，诸如通过对具有ALK阳性NSCLC肿瘤的受试者单独或与其它已知或未来开发的治疗组合施用ALK抑制剂(诸如克唑替尼)。

公开内容的前述和其它特征从参考附图进行的以下详细描述看会变得更为显而易见。

附图简述

图1A和1B是两种例示性ALK阳性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色(右侧小图)上的同质ALK IHC表达。

图2A-C是三种例示性ALK阳性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色(右侧小图)上的异质ALK IHC表达。抗ALK染色样品中存在强细胞质染色，但是强度有所变化。

图3是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中的腺上皮细胞中的点状颗粒染色(左侧小图)。在匹配家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中看到不太明显的腺上皮细胞染色(右侧小图)。腺上皮染色存在于正常组织成分而非癌细胞中，并且在载玻片解读中排除。

图4A是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中明显的神经元组织成分的染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中染色的缺乏(右侧小图)。图4B是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中(左侧小图)及匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中(右侧小图)的神经组织的染色。在载玻片解读中排除染色，因为它存在于正常的组织成分或细胞中。

图5是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中的肺泡巨噬细胞中存在的颗粒点刻(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中染色的缺乏(右侧小图)。在载玻片解读中排除此染色，因为它存在正常细胞，而非肿瘤细胞中。

图6A是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中(左侧小图)及匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中(右侧小图)的粘蛋白染色。正常组织和肿瘤细胞中没有染色，因此此样品解读为ALK阴性。图6B是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中(左侧小图)及匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中(右侧小图)的粘蛋白染色。此样品解读为ALK阳性，因为正常组织是阴性，但是肿瘤细胞是染色的。

图7A和B是数字图像，其显示了用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品中一些淋巴细胞的染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片中不太明显的(图7A)或阴性(图7B)染色(右侧小图)。在载玻片解读中排除此染色，因为它存在于正常细胞中。

图8A和B是两种例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了在抗ALK(D5F3)染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色(右侧小图)上肿瘤细胞中ALK IHC表达缺乏。

图9A和B是例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色(右侧小图)两者上的弱颗粒细胞质染色。

图10A-D是例示性ALK阴性病例的数字图像，其显示了抗ALK(D5F3)染色上的细胞质染色(左侧小图)，其比在匹配的家兔单克隆阴性对照Ig染色(右侧小图)上更明显。该病例由于缺乏强细胞质染色而被解读为ALK阴性。

图11是用抗ALK(D5F3)抗体染色的样品(左侧小图)和匹配的家兔单克隆阴性对照Ig载玻片(右侧小图)中的膜/细胞质染色的数字图像。虽然染色在用抗ALK抗体比用阴性对照染色的载玻片上更普遍，但是由于其不是强颗粒细胞质染色，结果解读为ALK阴性。

发明详述

I.缩写

ALK 间变性淋巴瘤激酶

DAB 3,3’-二氨基联苯胺四氢氯化物

FISH 荧光原位杂交

H&E 苏木精和曙红

HQ 3-羟基喹喔啉-2-羧酸

HRP 辣根过氧化物酶

IHC 免疫组织化学

NSCLC 非小细胞肺癌

II.术语

提供术语和方法的以下解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”指一个/种或超过一个/种，除非上下文另有明确指示。例如，术语“包含抗体”包括单数或复数种抗体，并且认为等同于短语“包含至少一种抗体”。术语“或”指陈述的备选成分的单一成分或两种或更多种成分的组合，除非上下文另有明确指示。如本文中使用的，“包含”意指“包括”。如此，“包含A或B”意指“包括A、B、或A和B”，而不排除别的成分。本文中提及的GenBank登录号的日期是至少早在2012年9月24日可得到的序列。

除非另有解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本公开内容的实践或测试中使用，但是下文描述了合适的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性的而并不意图为限制性的。

为了促进公开内容的各个实施方案的审阅，提供了具体术语的以下解释：

间变性淋巴瘤激酶(ALK)：受体酪氨酸激酶的胰岛素受体超家族的成员。ALK包含胞外域、单次跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。在几种肿瘤类型，包括间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、和非小细胞肺癌中找到导致ALK融合基因的染色体重排。ALK/EML4是最常见的ALK基因融合；别的ALK融合包括ALK/RANBP2、ALK/ATIC、ALK/TFG、ALK/NPM1、ALK/SQSTM1、ALK/KIF5B、ALK/CLTC、ALK/TPM4、和ALK/MSN。

ALK序列公开可获自例如序列数据库(例如登录号NP_004295(蛋白质)，和NM_004304(核酸))。本领域普通技术人员可以鉴定别的ALK核酸和蛋白质序列，包括ALK变体和/或ALK基因融合。

ALK抑制剂是一种抑制或降低ALK活性，诸如ALK酪氨酸激酶活性的分子。在一些例子中，ALK抑制剂可以是小分子、蛋白质(诸如抗体)、或核酸(诸如反义分子)。ALK抑制剂可以抑制或降低配体(诸如多效蛋白)对ALK的结合，并且如此降低ALK酪氨酸激酶活性。ALK抑制剂也可以直接抑制或降低ALK酪氨酸激酶活性，例如ATP竞争性抑制剂(诸如克唑替尼)。降低或抑制ALK表达的分子，诸如反义分子也是ALK抑制剂。在一些例子中，ALK抑制剂抑制或降低经遗传改变的ALK，诸如ALK基因融合(包括但不限于ALK/EML4基因融合)的活性。ALK抑制剂可以特异性抑制ALK酪氨酸激酶活性或者在抑制ALK酪氨酸激酶活性外可以抑制其它受体酪氨酸激酶活性(诸如c-Met/HGFR活性)。

抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，也就是说，含有特异性结合抗原(诸如ALK)(与其起免疫反应)的抗原结合位点的分子。例示性的抗体包括单克隆、多克隆、和人源化抗体。

天然存在的抗体(诸如IgG、IgM、IgD)包括四条多肽链，即通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。如本文中使用的，术语抗体还包括通过在细胞中表达编码一条或多条抗体链的核酸生成的重组抗体(例如参见美国专利No.4,745,055；美国专利No.4,444,487；WO 88/03565；EP 256,654；EP 120,694；EP 125,023；Faoulkner等,Nature 298:286,1982；Morrison,J.Immunol.123:793,1979；Morrison等,Ann Rev.Immunol.2:239,1984)。

术语抗体还包括天然存在的或重组的抗体的抗原结合片段。术语抗体内涵盖的结合片段的具体非限制性例子包括Fab、(Fab’)₂、Fv、和单链Fv(scFv)。Fab是含有通过用酶木瓜蛋白酶消化全抗体以生成完整的轻链和一条重链的部分或等同地通过遗传工程生成的抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab’是通过用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原以生成完整的轻链和重链的一部分获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab’片段。(Fab’)₂是通过在没有随后还原的情况下用酶胃蛋白酶处理全抗体或等同地通过遗传工程获得的抗体的片段。F(Ab’)₂是通过二硫键保持在一起的两个FAb’片段的二聚体。Fv是含有以两条链表达的轻链可变区和重链可变区的遗传工程化片段。单链抗体(“SCA”)是作为遗传融合单链分子的含有通过合适的多肽接头连接的轻链可变区、重链可变区的遗传工程化分子。生成这些片段的方法是本领域中常规的。

色原体：能够转化成有色产物，诸如色素或染料的物质。某些色原体是电子供体，其在氧化时变为有色产物。有色产物的生成，和在化学转化(诸如氧化)时变为不溶性的特性使色原体可用于IHC。生色化合物的具体例子包括但不限于3,3’-二氨基联苯胺(DAB),4-硝基磷酸苯(4-nitrophenylphospate,pNPP)、坚牢红(Fast Red)、坚牢蓝(Fast Blue)、溴氯吲哚基磷酸(bromochloroindolyl phosphate，BCIP)、硝基蓝四唑(nitro bluetetrazolium,NBT)、BCIP/NBT、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2’-联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸](2,2’-azino-di-[3-ethylbenzothiazoline sulphonate],ABTS),邻联茴香胺(o-dianisidine)、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD),5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷(X-Gal)、甲基伞形基-β-D-半乳吡喃糖苷(methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside,MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、新品红(New Fuchsin)、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫。

接触：使一种媒介物与另一种媒介物极其接近，由此容许媒介物相互作用。例如，可以对含有生物样品的显微镜载玻片或其它表面应用抗体，由此容许检测样品中被抗体特异性识别的蛋白质。

克唑替尼：一种有力抑制ALK的受体酪氨酸激酶抑制剂。克唑替尼(又称为PF-02341066或XALKORI,Pfizer)是ALK和c-Met/HGFR酪氨酸激酶及其致癌性变体的一种口服选择性ATP竞争性小分子抑制剂。见例如美国专利No.7,230,098；7,825,137；7,858,643；及8,217,057；通过提及将每篇完整收入本文。克唑替尼可以用于治疗具有ALK阳性NSCLC的患者。

检测：测定媒介物是存在还是缺乏。在一些例子中，这可以进一步包括量化。例如，使用对特定蛋白质(例如ALK)特异性的抗体容许检测样品(诸如含有NSCLC组织的样品)中的蛋白质。在具体的例子中，检测来自可检测标记物的发射信号(诸如若靶物是存在的，则为信号的升高)。检测可以为大批的，从而同时观察到宏观数目的分子。检测还可以包括使用显微术和诸如降低背景噪音的全内反射等技术鉴定来自单一分子的信号。

标记物：能够例如通过分光光度法、流式细胞术、或显微术(诸如光学显微术)检测的药剂。例如，可以将一种或多种标记物附着于抗体，由此容许检测靶蛋白。例示性的标记物包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、半抗原、酶和其组合。

非小细胞肺癌(NSCLC)：与小细胞肺癌不同的任何类型的肺癌。NSCLC包括鳞状细胞癌(SQCC)、腺癌(ADC)、和大细胞癌。ADC和大细胞癌两者分类为非鳞状细胞类型癌。ADC可以分组成亚类，包括腺泡癌、乳头状癌、支气管肺泡癌(BAC)、实体瘤、和混合亚型(2004World Health Organization classification of lung tumors,Beasley等,Semin.Roentgenol.40:90-97,2004)。ADC占所有肺癌的约40％，并且是从未吸烟的个体间最常见的肺癌形式。ADC分类为NSCLC的非鳞状细胞类型。在组织学上，ADC显示腺形成、乳头状结构、或具有粘蛋白生成的固体生长。大细胞癌包括亚类巨细胞肿瘤、透明细胞癌、腺鳞状癌、和未分化的癌。

正常的细胞或组织：非肿瘤、非恶性细胞和组织。

样品：自受试者获得的含有基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物标本。例子包括含有至少一种NSCLC细胞的标本(“NSCLC样品”)，例如组织或肿瘤活组织检查、细针抽吸物、支气管肺泡灌洗、胸膜液、痰、手术标本、淋巴结、NSCLC转移、外周血、或尸检材料。在其它例子中，样品包括对照样品，诸如非NSCLC细胞或组织样品。

灵敏性和特异性：二元分类测试性能的统计学测量。灵敏性测量正确鉴定的真阳性的比例(例如鉴定为是ALK阳性的NSCLC肿瘤的百分比，所述NSCLC肿瘤通过另一种方法诸如FISH鉴定为ALK阳性)。特异性测量正确鉴定的阴性的比例(例如鉴定为ALK阴性的NSCLC肿瘤的百分比，所述NSCLC肿瘤通过另一种方法诸如FISH鉴定为ALK阴性)。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，即包括人和非人哺乳动物，诸如兽医受试者的分类。在一个具体的例子中，受试者是具有或怀疑具有肺癌诸如NSCLC的受试者。

治疗有效量：足以阻止行进，延迟进展，或引起疾病消退，或者能够降低由疾病诸如癌症，例如肺癌(诸如NSCLC)引起的症状的剂量。

在足以…的条件下：用于描述容许期望的活性的任何环境的短语。例子包括使抗体与NSCLC样品接触，足以容许检测样品中的一种或多种靶分子(例如ALK)。

III.将受试者鉴定为具有可能响应ALK抑制剂的肿瘤的方法

本文中公开了用于将受试者鉴定为具有预测为响应用ALK抑制剂，例如克唑替尼治疗的NSCLC的方法的实施方案。实施方案包括使用免疫组织化学(IHC)和本文中公开的评分方法将NSCLC肿瘤鉴定为ALK阳性或ALK阴性。若将NSCLC肿瘤鉴定为呈ALK阳性，则将受试者鉴定为具有可能或预测为响应ALK抑制剂治疗的NSCLC，并且若将NSCLC肿瘤鉴定为ALK阴性，则将受试者鉴定为具有可能不响应ALK抑制剂治疗或预测为不响应ALK抑制剂治疗的NSCLC肿瘤。

目前用于选择具有NSCLC的受试者以ALK抑制剂治疗的方法基于利用荧光原位杂交(FISH)测定法测定受试者的肿瘤是否呈ALK阳性。然而，与本文中公开的方法相比，FISH呈现几种缺点。FISH测定法比IHC方法，诸如本文中公开的那些方法更费时，更昂贵，且在解读结果方面需要实际上更专门的费用。另外，本文中公开的方法提供了“二元”评分方法，其以高灵敏性和特异性将NSCLC肿瘤鉴定为ALK阳性或ALK阴性。

ALK阳性NSCLC(例如在肿瘤中具有ALK基因重排和/或表达ALK)的快速且精确的鉴定对于指导患者护理是至关重要的。用ALK抑制剂(克唑替尼)治疗的具有ALK阳性NSCLC的受试者展现出大于50％的总体响应率(例如Kwak等,N.Engl.J.Med.363:1693-1703,2010；Shaw等,Lancet Oncol.12:1004-1012,2011)。估计NSCLC中的ALK基因重排具有约2-7％的流行。因此，需要ALK阳性NSCLC的精确鉴定以选择最可能受益于ALK抑制剂疗法的受试者。然而，目前使用的FISH“分开”测定法呈现样品解读的重大考验。例如，染色体内基因重排可以产生微妙的、难以检测的信号分离，这导致潜在的假阴性结果。另外，FISH测定法需要计算50个核的信号样式。若50个中小于5个细胞呈阳性，则认为样品呈ALK阴性；若50个中的超过25个细胞呈阳性，则认为样品呈ALK阳性。然而，若存在5-25个阳性细胞，则样品是可疑的，并且需要第二个阅读者；然后若平均百分比阳性细胞是≥15％，则认为样品呈ALK阳性。如此，FISH测定法可以产生大量的“可疑”结果，需要费时且昂贵的额外测试。此外，若样品不满足至少50个细胞的最少肿瘤含量要求，则它们不能通过FISH测试；因此在许多病例中，从未通过FISH测试标本诸如细针抽吸物或FFPE细胞学样品。最后，FISH具有约10-30％的失败率，这意味着许多标本会从未具有ALK结果，并且ALK阳性受试者可能被错过，并且没有获得最佳治疗。

比较而言，公开的实施方案利用ALK的IHC检测。IHC方法是快速的，解剖病理学实验室中常规的，利用光学显微术(与FISH相比，其需要专门的暗视野荧光显微术)，与FISH相比不太昂贵，并且不需要专门的解读费用。另外，公开的实施方案可以是自动化的，其提供了标准化的染色，并且进一步改善了测定法的灵敏性和特异性。公开的IHC方法的另一种优点是没有预先规定的肿瘤细胞含量要求(而FISH测定法需要至少50个肿瘤细胞)。另外，公开的IHC方法使病理学家或阅读者能够评估整个组织样品(与FISH方法形成对比)。对于FISH，仅使鉴定为含有肿瘤的样品部分与FISH试剂接触。因此，若ALK存在于组织上的不同肿瘤区中，则它不会被鉴定。比较而言，公开的方法使阅读者能够在整个组织样品的背景中看到载玻片上的整个肿瘤。最后，本文中公开的评分方法是“二元”(阳性或阴性)，并且因此提供了明确的结果。甚至先前用于检测ALK阳性NSCLC肿瘤的IHC方法产生常见的可疑结果，其需要额外的测试(例如Yi等,J.Thorac.Oncol.6:459-465,2011)，或者利用染色强度的半定量评级和免疫反应性肿瘤细胞百分比的评估(例如Mino-Kenudson等,Clin.CancerRes.16:1561-1571,2010)。然而，公开的IHC和评分方法提供了NSCLC肿瘤为ALK阳性的灵敏且特异的鉴定，即使仅几个肿瘤细胞(或甚至仅1个肿瘤细胞)展现出用ALK抗体的强颗粒细胞质染色。

A.ALK的检测

在具体的例子中，分析自受试者获得的样品以测定它是否含有ALK蛋白，诸如一个或多个肿瘤细胞中ALK蛋白的可检测水平。如此，可以分析样品以检测或测量样品中ALK蛋白的存在，例如定性或半定量测量。在具体的例子中，公开的方法利用样品中的肿瘤细胞中ALK蛋白存在的定性测量。

公开的实施方案利用IHC检测来自受试者的样品中的ALK蛋白。IHC是一种测定样品(诸如NSCLC样品，例如包含NSCLC肿瘤细胞或组织的组织部分或切片)中抗原(诸如蛋白质)的存在或分布的方法，其通过检测抗原与特异性结合剂，诸如抗体的相互作用进行。在容许抗体-抗原结合的条件下使包含抗原(诸如靶抗原)的样品与抗体一起温育。可以依靠与抗体缀合的可检测标记物(直接检测)或依靠与二抗(其针对一抗生成)缀合的可检测标记物(例如间接检测)检测抗体-抗原结合。在间接检测的其它例子中，可以依靠与能够结合二抗的三抗(例如其针对二抗生成或针对与二抗缀合的分子诸如半抗原生成)缀合的可检测标记物检测抗体-抗原结合。可以用于IHC的例示性可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光染料(诸如荧光素、异硫氰酸荧光素、和罗丹明)、半抗原、酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、和色原体(诸如3,3’-二氨基联苯胺(DAB)或坚牢红)。在一些例子中，抗原-抗体结合的检测还包括信号放大(诸如酪酰胺信号放大或相关方法)。信号放大方法可以包括记载于美国专利公开文本No.2012/0171668(通过提及将其完整收入本文)的方法。

在一些例子中，特异性结合剂是抗体，诸如多克隆或单克隆抗体，或其片段。在一些例子中，抗体是人源化抗体。在一些例子中，抗体是嵌合抗体。若想要的话，抗体可以包含可检测标记物以容许检测并且在一些情况中量化靶蛋白/抗体复合物。在其它例子中，用合适的经标记的二抗检测抗体。在别的例子中，用合适的经标记的三抗检测抗体。

在一些例子中，针对ALK的抗体获自Ventana Medical Systems,Inc.(Tucson,AZ)。在具体的例子中，抗体是抗ALK D5F3家兔单克隆抗体(Ventana,产品目录编号790-4794)。然而，本领域普通技术人员会领会可以在本文中提供的方法中使用的其它抗体可购自其它来源，包括但不限于抗ALK 5A4抗体(Abcam,Cambridge,MA；Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)、抗ALK ALK1抗体(Dako,Carpinteria,CA)和抗ALK D9E抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)。本领域普通技术人员可以选择可以在公开的方法中使用的别的抗ALK抗体，包括那些现在可用或未来开发的。

在一些例子中，将肺癌样品(诸如包含NSCLC肿瘤组织的样品)获得，并加工用于IHC。例如，可以将样品固定并包埋，例如用福尔马林和石蜡。然后，可以将样品在支持物，诸如玻璃显微镜载玻片上封固。例如，可以将样品切成一系列薄的切片(例如使用切片刀)，并将切片封固至显微镜载玻片上。在一些例子中，单一载玻片包含来自相同肺癌样品的多个组织切片或者可以将来自相同肺癌样品的切片在不同载玻片上放置。然后，可以将肺癌(例如NSCLC肿瘤)样品的不同切片用不同抗体，例如抗ALK抗体和阴性对照抗体(例如不特异性结合样品中的内源抗原的抗体)个别标记。也就是说，可以将一个切片用抗ALK抗体标记，并可以将另一个切片用阴性对照抗体(诸如结合不在样品中内源存在的靶物的抗体)标记。在一些例子中，还将用抗ALK抗体(或阴性对照抗体)标记的载玻片用苏木精和曙红(H&E)(例如以提供形态学或组织学信息，诸如以区别样品中的细胞类型)染色。在其它例子中，用H&E标记来自同一受试者的不同载玻片(诸如来自相同NSCLC样品的连续切片)。在一些例子中，可以通过用别的抗体(例如抗EGFR抗体、抗RAS抗体、和/或抗HER2抗体)标记在相同或别的组织样品中检测别的感兴趣蛋白质。在一些例子中，可以使用自动化载玻片染色仪(诸如来自Ventana Medical Systems的BENCHMARK仪，例如BENCHMARK XT或BENCHMARK GX仪)染色并加工载玻片。

在一些例子中，检测样品中的ALK蛋白包括间接检测抗ALK抗体对样品的结合(例如抗ALK(一级)抗体不是可检测标记的)。例如，在足以使抗ALK抗体结合样品中的ALK蛋白的条件下使样品与抗ALK抗体(诸如抗ALK D5F3抗体)接触。然后，在足以使二抗结合抗ALK抗体的条件下使样品与能特异性结合抗ALK抗体的二抗(诸如若抗ALK抗体是家兔抗体，则为抗家兔抗体)接触。二抗可以是可检测标记的。可以将可检测标记物与二抗缀合。在一些例子中，可以直接检测与二抗缀合的可检测标记物(诸如荧光标记物，或酶，其可以在存在合适底物的情况中生成可检测反应产物)。在其它例子中，将二抗与一种或多种半抗原(诸如荧光素、二硝基苯基、生物素、或3-羟基喹喔啉-2-羧酸(HQ))缀合。然后，在足以使三抗结合半抗原的条件下使样品与能特异性结合缀合有半抗原的二抗的三抗(例如抗半抗原抗体，诸如抗HQ抗体)接触。在一些例子中，将三抗与可检测标记物，诸如酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))缀合。然后，使样品与一种或多种在存在酶的情况中生成可检测反应产物的试剂接触。在一些例子中，使样品与在存在HRP的情况中生成视觉可检测的产物的HRP底物(诸如过氧化氢)和色原体(诸如DAB)接触。在一些例子中，使用OPTIVIEWDAB IHC检测试剂盒(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ,Catalog No.760-700)实施检测样品中的ALK蛋白。

在别的例子中，检测样品中的ALK蛋白包括间接检测，包括信号放大。在一些例子中，信号放大容许明确检测在不放大信号的情况中仅能展现弱染色的ALK阳性标本。用于IHC的信号放大法是本领域普通技术人员已知的。在一些例子中，信号放大包括催化报告物沉积(CAtalyzed Reporter Deposition,CARD)，又称为酪酰胺信号放大(TSA^TM)。在此方法的一种变型中，缀合有酶的二抗(诸如缀合有HRP的二抗)结合一抗。接着，使用生物素化的酪酰胺的底物(酪胺是4-(2-氨乙基)酚)，推测其在与HRP酶相互作用时变为自由基。酚基然后与周围的材料快速起反应，如此沉积或固定附近的生物素。通过提供更多底物(生物素化的酪酰胺)并建立更为局部化的生物素重复此过程。最后，用附着于荧光分子的链霉亲合素检测“放大的”生物素沉积物。或者，可以用亲合素-过氧化物酶复合物检测放大的生物素沉积物，然后使亲合素-过氧化物酶复合物与DAB接触以产生褐色颜色。

在其它例子中，信号放大包括在足以在与样品结合的一抗的位置处或附近沉积HQ的条件下在使样品与缀合有HRP的三抗接触后使样品与过氧化氢和酪酰胺-HQ缀合物接触。然后，使样品与缀合有酶的特异性结合HQ的抗体(诸如缀合有HRP或AP的抗体)接触。在一些例子中，此缀合有酶的抗体与缀合有HRP的三抗相同。在其它例子中，缀合有酶的抗体是与缀合有HPR的三抗不同的抗体。然后，使样品与一种或多种在存在酶的情况中生成可检测反应产物的试剂接触。在一些例子中，使样品与在存在HRP的情况中生成视觉可检测产物的HRP底物(诸如过氧化氢)和色原体(诸如DAB)接触。在一些例子中，使用OPTIVIEW放大试剂盒(Ventana Medical Systems,Inc.,Tucson,AZ,Catalog No.760-099)实施信号放大。

B.将样品评分为ALK阳性或ALK阴性

为了将样品评分为ALK阳性或ALK阴性，使用具有可检测标记的ALK的NSCLC样品(例如一个或多个载玻片，诸如1、2、3、4或5个载玻片)。在一些例子中，可以用对ALK特异性的抗体和适当标记的二抗和/或三抗，例如如上文的部分A中描述的抗体标记NSCLC样品。在一个非限制性例子中，按照制造商的用法说明书(Ventana Medical Systems,Inc.,分别为产品目录编号760-700和760-099)使用OPTIVIEW DAB IHC检测试剂盒和OPTIVIEW放大试剂盒。

例如，经抗ALK标记的NSCLC样品(或其数字图像)由病理学家视觉检查(例如用或不用光学显微术)。在一些例子中，例如使用光学显微术，例如以约2倍-20倍放大视觉检查整个样品(诸如整个组织切片)。在其它例子中，视觉检查至少一个观察视场(诸如至少2、3、4、或5个不同观察视场)。观察视场是要通过显微术分析的样品区域(例如组织切片)，其小于整个切片或切片的整个数字图像。在一些例子中，观察视场是以2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、或60倍放大(诸如2倍-20倍放大)可见的样品区域。

可以使用公开的方法将肿瘤鉴定(例如评分)为ALK阳性或ALK阴性，例如以提供预后信息,诸如NSCLC对ALK抑制剂的可能响应性。对肿瘤(例如新生物)细胞评估可检测标记物(染色)的存在，这指示肿瘤细胞中ALK蛋白的表达。将具有肿瘤细胞(任何百分比的肿瘤细胞)中强颗粒细胞质染色的存在的样品鉴定或评分为呈ALK阳性。用抗ALK抗体标记的样品中至少1个肿瘤细胞(诸如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个肿瘤细胞)中的强颗粒细胞质染色评分为ALK阳性样品。例如，用抗ALK抗体标记的样品中约1-100,000个细胞(诸如10-100,000个细胞、1000-100,000个细胞、1000-50,000个细胞、10,000-50,000个细胞、10-50,000个细胞、500-50,000个细胞、或约1000-10,000个细胞)中的强颗粒染色评分为ALK阳性样品。在一些例子中，强颗粒细胞质染色遍及肿瘤的新生物部分同质分布。在其它例子中，强颗粒细胞质染色遍及肿瘤的新生物部分异质分布。在任一个例子中，将肿瘤的新生物部分中强颗粒细胞质染色的存在(例如在至少一个或多个肿瘤细胞)评分为ALK阳性。

若用抗ALK抗体标记的样品中的至少一个肿瘤细胞中不存在强颗粒细胞质染色，则将样品评分为ALK阴性样品。在一些例子中，将在肿瘤细胞中无细胞质染色(例如无高于背景或阴性对照水平的染色)，具有弱细胞质染色，和/或中等细胞质染色的NSCLC样品评分为ALK阴性样品，只要样品中无肿瘤细胞具有强颗粒细胞质染色。将在任何数目的肿瘤细胞中具有弱细胞质染色和/或中等细胞质染色的样品评分为ALK阴性，除非存在至少一个具有强颗粒细胞质染色的样品中的肿瘤细胞，在该情况中将样品评分为ALK阳性。

测定染色强度的方法(例如半定量IHC法)是本领域普通技术人员已知的。在一些例子中，强颗粒细胞质染色包括本领域普通技术人员会鉴定为“3+”染色强度的一个或多个肿瘤细胞中的染色(例如利用如下的量表：0，无高于背景的染色，1+弱强度染色，2+中等强度染色，和3+强强度染色)。因此，在一些例子中，认为至少一个具有细胞质染色强度3+(例如强染色)的细胞的存在是ALK阳性样品。在一些例子中，将样品中存在任何数目的肿瘤细胞中会被本领域普通技术人员鉴定为1+(例如弱染色)或2+(例如中等染色)强度的细胞质染色评分为ALK阴性样品，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色(例如3+染色强度)的肿瘤细胞。

本领域普通技术人员可以鉴定新生性的样品部分(例如肿瘤细胞)和正常组织或细胞的样品部分，例如基于形态学和/或组织学特征。在一些例子中，用H&E染色样品(例如用抗ALK抗体标记的相同样品或邻近的组织切片)以帮助鉴定组织和细胞形态学。

在公开方法的一些例子中，一个或多个新生性肿瘤区可以存在于经标记的样品中。认为用抗ALK抗体的新生性肿瘤区或新生性肿瘤细胞(例如具有核丧失和炎性浸润物且具有或没有保留的细胞轮廓的肿瘤区)染色不是肿瘤细胞的阳性染色，并且将其自对样品评估肿瘤细胞的强颗粒细胞质染色排除。认为具有新生性肿瘤细胞或区域的任何强度染色(包括强的强度染色)的样品是ALK阴性，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞。

在公开方法的其它例子中，认为非肿瘤细胞或正常细胞成分的染色，甚至强颗粒细胞质染色不是阳性染色，并且自样品的评估排除。例如，已知神经起源的细胞(诸如神经细胞和/或神经节细胞)表达ALK(例如Iwahara等,Oncogene 14:439-449,10997)。因此，样品的评估中不包括神经元或神经节(或其它神经起源细胞)的染色。认为具有神经起源细胞的任何强度染色的样品是ALK阴性，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞。

在别的例子中，认为正常粘膜或腺上皮细胞的抗ALK染色(甚至强颗粒细胞质染色)不是ALK阳性染色，并且自样品的评估排除。认为具有正常粘膜或腺上皮细胞的任何强度染色的样品是ALK阴性，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞。类似地，认为肺泡巨噬细胞(例如亮颗粒胞质点刻法(light granular cytoplasmicstippling))或浸润性淋巴细胞的抗ALK染色不是ALK阳性染色，并且将其自样品评估排除。认为具有肺泡巨噬细胞或浸润性淋巴细胞的任何强度染色的样品呈ALK阴性，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞。

在别的例子中，通过抗ALK抗体染色粘蛋白，并且认为其不是ALK阳性染色并自样品评估排除。认为具有粘蛋白的任何强度染色的样品呈ALK阴性，除非还有样品中存在的至少一个具有强颗粒细胞质染色的肿瘤细胞。

在一些例子中，评分方法还包括比较经抗ALK标记的NSCLC样品与一种或多种用抗ALK抗体标记的对照(例如，在与NSCLC样品相同的IHC运行中测定的对照)。在一些例子中，对照包括阳性对照，诸如包含已知为ALK阳性的细胞(例如H228细胞)的样品。在其它例子中，对照包含阴性对照，诸如包含已知为ALK阴性的细胞(例如Calu-3细胞)的样品。在一些例子中，阳性和/或阴性对照样品是系统水平对照以确保测定试剂和仪器的正确运行。在一个例子中，对照包括阳性和阴性对照两者(例如ALK 2in 1对照载玻片，Ventana MedicalSystems,Inc.，产品目录编号781-4796)。

在其它例子中，阴性对照包括用阴性对照抗体染色的NSCLC样品。在一些例子中，阴性对照抗体是特异性结合不内源存在于NSCLC样品中的靶抗原的抗体。在一些例子中，阴性对照抗体是免疫球蛋白，诸如单克隆抗体。用阴性对照抗体染色可以用于评估来自受试者的样品中背景染色的水平。在一些例子中，用阴性对照抗体染色的NSCLC样品是与用抗ALK抗体染色的样品来自相同受试者的NSCLC样品(诸如来自样品的相邻或连续切片)。在其它例子中，用阴性对照抗体染色的NSCLC样品与用抗ALK抗体染色的样品来自不同受试者。

C.样品

自受试者获得生物学样品的方法是本领域中已知的。例如，获得肺组织或肺细胞的方法是常规的。例如，可以通过手术切除整个或部分肿瘤，通过自肿瘤收集细针抽吸物，以及本领域中已知的其它方法获得来自含有细胞材料的肺肿瘤的样品。在一些例子中，自具有或怀疑具有NSCLC的受试者获得样品。在具体的例子中，自受试者获得的样品包含NSCLC肿瘤细胞，诸如NSCLC肿瘤的至少一部分。在一些例子中，自受试者获得的样品还包含正常的(例如非肿瘤)组织或细胞。

收集后通过固定加工样品，并且在一些例子中将其用蜡(例如石蜡)包埋。用于封固的细胞和组织制备物的固定剂是本领域中公知的，并且包括但不限于福尔马林固定剂、95％醇性布安(Bouin)氏固定剂；95％乙醇固定剂；B5固定剂，布安氏固定剂，Karnovsky氏固定剂(戊二醛)，哈特曼(Hartman)氏固定剂，奥朗德(Hollande)氏固定剂，Orth氏溶液(重铬酸盐固定剂)，和Zenker氏固定剂(见例如Carson,Histotechology:A SelfInstructional Text,Chicago:ASCP Press,1997)。如果使用特定的固定剂(诸如95％乙醇，AFA，B5，或Prefer)，那么ALK染色强度可以降低。如果没有将组织样品在收集的短时间内固定或没有固定足够的时间段，那么ALK染色也可以降低。在具体的例子中，将样品在中性缓冲福尔马林(诸如10％中性缓冲福尔马林)或锌福尔马林中固定。在一些例子中，将样品固定至少约6小时(例如约6-48小时，12-24小时或约6、12、16、18、24、36、或48小时)。在别的例子中，将样品在收集的约6小时内(例如在约15分钟、30分钟、1、2、3、4、5、或6小时内)在固定剂中放置。

在一些例子中，样品可以是固定的、经蜡包埋的肺组织样品，诸如固定的、经蜡包埋的包含NSCLC肿瘤的肺组织样品。在一些例子中，样品是用苏木精和曙红(H&E)染色的包含NSCLC肿瘤的肺组织切片。在一些例子中，样品是用对ALK特异性的一抗标记的包含NSCLC肿瘤的肺组织切片，所述一抗可以直接或间接(例如用经标记的二抗)标记，所述肺组织切片在一些例子中用H&E进一步染色。

在一些例子中，样品(或其部分)存在于固体支持物上。固体支持物携带生物学样品，并且容许样品中组分(例如蛋白质)的方便检测。例示性的支持物或基片包括显微镜载玻片(例如玻璃显微镜载玻片或塑料显微镜载玻片)、盖玻片(例如玻璃盖玻片或塑料盖玻片)、组织培养皿、多孔板、膜(例如硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF))或BIACORE^TM芯片。

D.治疗方法

公开的实施方案可以进一步包括例如若将来自受试者的样品评分为ALK阳性，则选择受试者以ALK抑制剂治疗。另外，公开的方法可以进一步包括若将来自受试者的样品评分为ALK阳性，则对受试者施用ALK抑制剂。

在一些例子中，ALK抑制剂是小分子抑制剂，诸如克唑替尼(Pfizer,New York,NY)、AP26113(Ariad Pharmaceuticals,Cambridge,MA)、CH5424802(ChugaiPharmaceutical,Tokyo,Japan)、LDK378(Novartis,Basel,Switzerland)、ASP3026(Astellas Pharma,Northbrook,IL)、X-396(Xcovery,West Palm Beach,FL)、或瑞螺旋霉素(retaspimycin)(Infinity Pharmaceuticals,Cambridge,MA)。别的ALK抑制剂包括3-39(Novartis),GSK1838705A(GlaxoSmithKline,Boston,MA)，和CEP-28122(Cephalon,Frazer,PA)。在另一个例子中，ALK抑制剂是抗ALK抗体，诸如人源化的抗ALK抗体。

在一些例子中，公开的方法包括对受试者(诸如具有ALK阳性NSCLC的受试者)提供治疗有效量的ALK抑制剂。此类药剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域普通技术人员已知的，并且例如可以由熟练临床医生确定。在一个非限制性例子中，对具有鉴定为ALK阳性的NSCLC肿瘤的受试者施用治疗有效量的克唑替尼。在一些例子中，克唑替尼的治疗有效量可以是每天一剂或两剂口服施用的约50-2000mg/天(诸如约50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000mg/天)。在一些例子中，方法包括若将来自受试者的样品评分为ALK阳性，则每天一次或两次对受试者口服施用200mg克唑替尼。在其它例子中，方法包括若将来自受试者的样品评分为ALK阳性，则每天一次或两次对受试者口服施用250mg克唑替尼。考虑别的因素，诸如肿瘤部位、肿瘤阶段、肿瘤等级、患者治疗史、患者行为和营养状态、伴随的健康问题、社会和后勤因素、先前的原发性肿瘤、和患者偏爱，熟练临床医师可以确定受试者的克唑替尼剂量和给药日程表。可以将克唑替尼按连续的给药日程表施用或者施用一个或多个周期(例如一个或多个21-28天的周期)。若以周期施用，则可以每21-28天重复治疗。

在一些例子中，还与ALK抑制剂组合对受试者施用一种或多种别的化疗剂。别的化疗剂包括但不限于烷化剂，诸如氮芥(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、甲川氯(chlormethine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、和美法仑(melphalan))，亚硝基脲类(nitrosoureas)(例如卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、和链佐星streptozocin))，铂化合物(例如卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、和BBR3464)，白消安(busulfan)，达卡巴嗪(dacarbazine)，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，丙卡巴肼(procarbazine)，替莫唑胺(temozolomide)，噻替派(thiotepa)，和乌拉莫司汀(uramustine)；抗代谢物，诸如叶酸(例如甲氨蝶呤、培美曲塞(pemetrexed)、和雷替曲塞(raltitrexed))，嘌呤(例如克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、和硫鸟嘌呤(tioguanine))，嘧啶(例如卡培他滨(capecitabine))，阿糖胞苷(cytarabine)，氟尿嘧啶(fluorouracil)，和吉西他滨(gemcitabine)；植物生物碱(plant alkaloids)，诸如鬼臼(podophyllum)(例如依托泊苷(etoposide)，和替尼泊苷(teniposide))，紫杉烷(taxane)(例如多西他赛(docetaxel)和帕利他赛(paclitaxel))，长春花(vinca)(例如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、和长春瑞滨(vinorelbine))；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，诸如蒽环类抗生素家族成员(例如柔红霉素(daunorubicin)，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，和戊柔比星(valrubicin))，博来霉素(bleomycin)，利福平(rifampicin)，羟基脲(hydroxyurea)，和丝裂霉素(mitomycin)；拓扑异构酶抑制剂，诸如托泊替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)；单克隆抗体，诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)，贝伐单抗(bevacizumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，吉妥珠单抗(gemtuzumab)，利妥昔单抗(rituximab)，帕木单抗(panitumumab)，培妥珠单抗(pertuzumab)，和曲妥珠单抗(trastuzumab)；光敏剂，诸如氨基酮戊酸，氨基酮戊酸甲酯(methyl aminolevulinate)，卟菲尔钠(porfimer sodium)，和维替泊芬(verteporfin)；和其它药剂，诸如阿利维A酸(alitretinoin)，六甲蜜胺(altretamine)，安吖啶(amsacrine)，阿那格雷(anagrelide)，三氧化二砷(arsenic trioxide)，天冬酰胺酶(asparaginase)，阿昔替尼(axitinib)，贝沙罗汀(bexarotene)，贝伐单抗(bevacizumab)，硼替佐米(bortezomib)，塞来昔布(celecoxib)，地尼白介素2(denileukin diftitox)，厄洛替尼(erlotinib)，雌莫司汀(estramustine)，吉非替尼(gefitinib)，羟基脲(hydroxycarbamide)，伊马替尼(imatinib)，拉帕替尼(lapatinib)，帕唑帕尼(pazopanib)，喷司他丁(pentostatin)，马索罗酚(masoprocol)，米托坦(mitotane)，培门冬酶(pegaspargase)，他莫昔芬(tamoxifen)，索拉非尼(sorafenib)，舒尼替尼(sunitinib)，威罗菲尼(vemurafinib)，凡他尼布(vandetanib)，和维A酸(tretinoin)。此类药剂的选择和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可以由熟练技术人员确定。

在其它例子中，公开的方法包括与ALK抑制剂组合(例如序贯，基本上同时，或同时)对受试者提供手术、放射疗法、和/或化疗剂。此类药剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可以由熟练技术人员确定。

本公开内容通过以下非限制性实施例例示。

实施例

实施例1：ALK免疫组织化学方案

本实施例描述了ALK IHC用于鉴定ALK阳性NSCLC样品的方法。

用抗ALK D5F3家兔单克隆抗体(Ventana Medical Systems，产品目录编号790-4794)染色经福尔马林固定的经石蜡包埋的NSCLC组织切片。用家兔单克隆阴性对照Ig(Ventana，产品目录编号790-4795)染色来自每个NSCLC样品的不同组织切片。还用苏木精和曙红(H&E)染色载玻片以区别形态学。使用ALK 2in 1对照载玻片(Ventana产品目录编号781-4796)作为系统水平阳性和阴性对照。使用Ventana BENCHMARK XT自动化载玻片染色仪和OPTIVIEW DAB IHC检测试剂盒(Ventana,产品目录编号760-700)和OPTIVIEW放大试剂盒(Ventana产品目录编号760-099)用表1中显示的染色方案染色载玻片。还使用VentanaBENCHMARK GX自动化载玻片染色仪测试相同的方案和试剂。

表1：用OPTIVEIW DAB IHC检测试剂盒和OPTIVIEW放大试剂盒进行的针对抗ALK(D5F3)和家兔单克隆阴性对照Ig的染色方案

实施例2：免疫组织化学结果的评估

本实施例描述了评估或评分ALK IHC结果以测定NSCLC样品在ALK方面呈阳性还是阴性的例示性方法。

用抗ALK D5F3抗体实施ALK IHC，如实施例1中描述的。对用ALK IHC测定法标记的新生性细胞评估DAB信号的存在或缺乏。使用匹配的阴性对照载玻片评估非特异性背景染色和已知由于特定的组织成分(肺泡巨噬细胞、神经细胞、腺上皮细胞、淋巴细胞性浸润物中的细胞)而发生的背景染色的程度。基于表2中的评分算法，将样品测定为在ALK方面呈阳性或阴性。

表2：用于测定NSCLC中的ALK状态的评分标准

在ALK方面呈阳性：用实施例1中描述的IHC测定法染色的阳性病例通常展现出强颗粒胞质信号。将在任何数目的肿瘤细胞中具有强胞质染色(诸如在常规的IHC评分中的3+染色)的任何样品评分为阳性。在大多数阳性病例中，信号同质分布，遍及肿瘤的新生性部分具有一致的强度水平。在一些阳性病例中，信号在染色强度上更为异质。图1A和B中显示了同质ALK IHC表达的例子。图2A-C中显示了异质ALK IHC表达的例子。

在NSCLC样品中的正常粘膜内，以及在坏死肿瘤区中观察到一些背景染色。没有将此染色评估为ALK阳性染色。另外，在神经细胞(包括神经或神经节细胞)、腺上皮细胞、肺泡巨噬细胞、和淋巴细胞性浸润或肺对淋巴结的转移中的细胞中记录染色。还在一些样品中记录粘蛋白的染色。在测定样品是否呈ALK阳性时排除所有这些。在图3(腺上皮细胞染色)、4A和B(神经细胞染色)、5(肺泡巨噬细胞染色)、6A和B(粘蛋白染色)、和7A和B(淋巴细胞染色)中显示这些排除的ALK染色类型的例子。

在ALK方面呈阴性：大多数ALK阴性病例展现出高于来自匹配阴性对照载玻片的背景染色的DAB信号的缺乏(图8A和B)。然而，大多数阴性病例展现出弱的弥散颗粒胞质样式，其高于对匹配阴性对照载玻片观察到的背景染色检出(图9A和B)。估计这些病例占ALK阴性病例的约1-2％，并且根据确认FISH分析呈阴性。

在几例病例中，用抗ALK(D5F3)抗体染色的载玻片上的胞质染色比在阴性对照载玻片上更明显。然而，这些病例没有展现出强的胞质染色，因此确定为呈ALK阴性(图10A-D)。在另一例病例中，在用抗ALK抗体染色的载玻片中观察到膜/胞质染色(图11)。此样品由于缺乏强颗粒细胞质染色而确定为呈ALK阴性。

实施例3：免疫组织化学结果与FISH的一致

本实施例证明了实施例2中描述的ALK IHC评分方法与用于测定NSCLC样品的ALK状态的ALK分离FISH的一致。

使用三个分组就ALK临床状态而言比较来自抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗的染色结果与ALK FISH。分组包括一批来自原发性和转移性肿瘤的人NSCLC组织样品，包括切除、针活组织检查、支气管活组织检查、和经福尔马林固定的、经石蜡包埋的(FFPE)来自细针抽吸物的细胞块。如实施例1中描述的那样实施IHC。使用实施例2中(表2中描述)的评分算法评分所有研究。使用VYSIS ALK分离FISH探针试剂盒(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)依照制造商的方案获得分离FISH数据。

一致研究1

在外部实验室进行比较抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗与回顾ALK分离FISH数据(克利夫兰临床基金会(Cleveland Clinic Foundation))的研究。该外部位置在BenchMark XT仪上使用抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗染色约100例NSCLC病例。抗ALK IHC测定法表明与关于此NSCLC样品分组的回顾ALK分离FISH数据的>98％总体百分比一致。表3和4中详述了结果。在100例病例中，86例具有可用的FISH数据和存在的对于与ALK IHC结果比较足够的肿瘤。没有就固定条件(收集后固定前时间，固定时间)而言证实用于此研究的组织标本的制备。

表3：与分离FISH比较的抗ALK D5F3IHC

表4：与分离FISH相比抗ALK D5F3IHC的百分比总体、阳性、和阴性一致率

比率	n/N	％	95％CI^a
				总体百分比一致	85/86	98.8	93.7,99.8
阳性百分比一致	10/11	90.9	62.3,98.4
				阴性百分比一致	75/75	100.0	95.1,100.01

a使用评分方法计算的两侧95％置信区间

一致研究2

在第二个外部实验室进行此研究，其比较抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗与关于73例NSCLC病例的ALK分离FISH数据(在染色1周内切割)。该外部位置在BenchMark XT仪上使用抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗染色病例，如实施例1中描述的。VENTANA ALK IHC测定法表明与关于此NSCLC样品分组的回顾ALK分离FISH数据的>93％总体百分比一致。结果详见表5和表6。

表5：与分离FISH比较的抗ALK D5F3IHC

表6：与分离FISH相比抗ALK D5F3IHC的百分比总体、阳性、和阴性一致率

比率	n/N	％	95％CI^a
				总体百分比一致	58/62	93.5	84.6-97.5
阳性百分比一致	2/2	100	34.2-100.0
				阴性百分比一致	56/60	93	84.1-97.4

a使用评分方法计算的两侧95％置信区间

在4例不一致的(FISH阴性，ALK IHC阳性)病例中，用另一种ALK IHC测定法(不同克隆和检测系统)测试额外的未染色的载玻片。4例病例中的3例就检测的ALK IHC染色而言与抗ALK(D5F3)IHC测定法一致。

还存在有未测定或没有实施FISH结果的10例病例。这些病例中的4例根据抗ALK(D5F3)IHC测定法和其它ALK克隆呈阳性，而6例根据ALK IHC呈阴性。存在有根据FISH呈阳性，但是没有足够的样品可用于用IHC染色的1例病例。

一致研究3

在此研究中，用抗ALK(D5F3)家兔单克隆抗体测定法染色来自用ALK分离FISH探针研究对登记的ALK阳性NSCLC患者的进行中的全局临床研究的约300例病例。在约300例病例中，一些分类为通过FISH“不提供信息”或“没有实施FISH测定法”，并且仅为了信息目的而染色并评估。自参与临床研究的中心实验室获得关于样品的FISH数据。

病例是FISH状态方面盲的，随机化的，并且提供给两个阅读者，其评估染色结果。将结果与自全局临床研究获得的FISH状态比较。表7中显示了ALK IHC与ALK分离FISH的比较结果。没有就固定条件(收集后固定前时间，固定时间)而言证实用于此研究的组织标本的制备。

表7：抗ALK D5F3IHC与ALK分离FISH的一致，如由两个病理学家评估的。

呈ALK IHC阳性，ALK FISH阴性的差异病例：

·至少一名阅读者将4例病例评估为呈ALK IHC阳性，FISH阴性。在一致审查后，确定它们应当评估为呈IHC阴性。这些病例具有聚焦的胞质/膜染色，并且认为呈阴性，如实施例2中描述的。

·存在有认为是真差异病例的9例ALK IHC阳性，ALK FISH阴性病例。

在9例差异病例中，7例具有未染色的载玻片，其可用于额外的ALK诊断测试(使用不同克隆和检测系统的分子测试和IHC测试)。这些额外的测试结果指示大多数差异病例在ALK FISH呈阴性时支持ALK状态的阳性IHC评估。在染色前超过3个月切割来自这些病例的载玻片，其可能降低IHC测定法的灵敏性。

呈ALK IHC阴性，ALK FISH阳性的差异病例：

·存在有根据FISH呈阳性，但是根据抗ALK IHC测定法呈阴性的11例病例。这些病例中的10例具有未染色的载玻片，其可用于用分子技术和IHC的额外ALK诊断测试。这些额外的测试结果指示大多数根据抗ALK D5F3IHC测定法呈阴性的病例根据另一种ALK IHC系统也呈阴性，但是根据一种或多种分子测定法呈阳性。在染色前超过3个月切割来自这些病例的载玻片，其可能降低IHC测定法的灵敏性。

·此分组中存在有根据FISH不提供信息(没有获得结果)的14例病例。在这些中，两名阅读者通过抗ALK IHC测定法将3例评估为呈阳性。另外，存在有不能实施基于H&E载玻片的FISH测定法(通常由于肿瘤含量不足所致)的19例病例。在这些中，两名阅读者在4例病例中将ALK IHC染色结果评估为呈阳性。因此，平均而言，21％的没有获得FISH结果的病例根据抗ALK(D5F3)IHC测定法具有阳性ALK状态。

测定如通过抗ALK IHC测定法获得的ALK状态的可再现性。比较每名阅读者对约300例病例获得的ALK状态。结果指示抗ALK IHC测定法和得分算法在阅读者间高度可再现，如表8中显示的。

表8：评分解读阅读者间精确性

结论

用抗ALK(D5F3)家兔单克隆一抗的IHC在其在BENCHMARK XT和BENCHMARK GX平台上的临床ALK状态的染色结果上可再现。二元评分算法在阅读者间高度可再现。测定法与用于ALK状态的ALK分离FISH法一致。

实施例4：组织加工条件对IHC测定法的影响

本实施例描述了不同组织加工条件对IHC测定法的影响。

使用H228(ALK阳性)细胞系在SCID小鼠中生成异种移植物肿瘤。将肿瘤收获，并用不同固定剂固定不同时间，并用抗ALK D5F3抗体染色，如实施例1中描述的。

用10％中性缓冲福尔马林固定至少6小时的组织产生最佳的ALK IHC染色结果。锌福尔马林固定至少6小时也产生可接受的ALK IHC染色。在中性缓冲福尔马林或锌福尔马林中小于6小时的固定时间导致显著降低的ALK染色强度。还测试了别的固定剂(AFA、B5、Prefer、和95％乙醇)，并且其在所有时间点时产生显著降低的ALK染色强度。

将异种移植物样品收获，并将未固定保持范围为30分钟至24小时的时间，然后在中性缓冲福尔马林中固定12小时。若将固定前时间延迟超过6小水，则ALK染色强度降低。

还对已经切出但是没有染色(持续多个时间段)的切片评估ALK IHC染色。ALK染色强度在已经在染色前超过3个月切出并且于室温贮存的切片中降低。尽管染色强度降低，ALK阳性病例无一将状态改变为ALK阴性。

基于这些数据，推荐在收集的约6小时内在10％中性缓冲福尔马林或锌福尔马林中将样品固定至少约6小时以实现最佳的ALK染色结果。另外，若将切片在切割的约3个月内染色(当于室温贮存时)，则染色是最佳的。

鉴于公开内容的原则可以适用的许多可能的实施方案，应当认可例示的实施方案仅仅是例子，而不应理解为限制本发明的范围。相反，本发明的范围以所附权利要求书限定。因此，我们要求保护均在这些权利要求的范围和精神内的我们的发明。

Claims

1.抗ALK抗体制备供一种将受试者鉴定为具有可能响应间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)抑制剂治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法使用的试剂或试剂盒的用途，其中所述方法包括：

使包含来自受试者的NSCLC肿瘤细胞的样品与抗ALK抗体接触；

检测所述样品中的ALK蛋白质表达；

将所述样品评分为在ALK方面呈阳性或阴性，包括：

若检测ALK蛋白质表达包括检测所述样品中一个或多个肿瘤细胞中的强颗粒细胞质染色，则将所述样品评分为在ALK方面呈阳性；或

若检测ALK蛋白质表达不包括检测所述样品中一个或多个肿瘤细胞中的强颗粒细胞质染色，则将所述样品评分为在ALK方面呈阴性；并

若所述样品评分为在ALK方面呈阳性，则将所述受试者鉴定为具有可能响应ALK抑制剂治疗的NSCLC，或若所述样品评分为在ALK方面呈阴性，则将所述受试者鉴定为具有可能不响应ALK抑制剂治疗的NSCLC。

2.权利要求1的用途，其中将所述样品评分为在ALK方面呈阳性或阴性进一步包括排除检测所述样品中的正常细胞或成分或坏死肿瘤区中的ALK蛋白质表达。

3.权利要求2的用途，其中所述样品中的正常细胞包括非肿瘤细胞、神经起源的细胞、肺泡巨噬细胞、腺上皮细胞、或淋巴细胞。

4.权利要求2的用途，其中所述正常成分包括粘蛋白。

5.权利要求1至4中任一项的用途，其中所述样品包括组织活组织检查、细针抽吸物、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、或痰。

6.权利要求5的用途，其中所述组织活组织检查包括组织切片。

7.权利要求5或权利要求6的用途，其中所述样品是固定的。

8.权利要求7的用途，其中所述样品在样品收集的6小时内在中性缓冲福尔马林或锌福尔马林中固定至少6小时。

9.权利要求1至8中任一项的用途，其中所述抗ALK抗体是家兔抗ALKD5F3抗体。

10.权利要求1至9中任一项的用途，其中检测所述样品中的ALK蛋白质表达包括直接或间接检测抗ALK抗体对所述样品的结合。

11.权利要求1至9中任一项的用途，其中所述方法进一步包括信号放大步骤。

12.权利要求1至11中任一项的用途，其中用自动化组织染色仪实施使所述样品与抗ALK抗体接触及检测所述样品中的ALK蛋白质表达。

13.权利要求1至12中任一项的用途，其中将所述样品评分为在ALK方面呈阳性或阴性包括视觉检查。

14.权利要求13的用途，其中利用光学显微术实施所述视觉检查。

15.权利要求13或权利要求14的用途，其中将所述样品检测评分为在ALK方面呈阳性或阴性包括至少一个视场的视觉检查。

16.权利要求1至15中任一项的用途，其中所述方法进一步包括若来自所述受试者的样品评分为在ALK方面呈阳性，则选择所述受试者用ALK抑制剂治疗。

17.权利要求16的用途，其中所述方法进一步包括对选择的受试者施用治疗有效量的ALK抑制剂。

18.权利要求1至17中任一项的用途，其中所述ALK抑制剂包括克唑替尼(crizotinib)。

19.家兔抗ALK D5F3抗体制备供一种将受试者鉴定为具有可能响应克唑替尼治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法使用的试剂或试剂盒的用途，其中所述方法包括：

(a)使包含来自受试者的NSCLC肿瘤细胞的样品与家兔抗ALK D5F3抗体接触；

(b)检测所述样品中的ALK蛋白质表达，包括：

(i)使所述样品与缀合有3-羟基喹喔啉-2-羧酸的结合所述抗ALK抗体的二抗接触；

(ii)使所述样品与缀合有辣根过氧化物酶的结合3-羟基喹喔啉-2-羧酸的三抗接触；

(iii)使所述样品与过氧化氢和3,3’-二氨基联苯胺四氢氯化物接触；并

(iv)利用光学显微术检测DAB沉淀物；

(c)将所述样品评分为在ALK方面呈阳性或阴性，包括：

(i)若强颗粒细胞质染色存在于所述样品中的一个或多个肿瘤细胞中，则将所述样品评分为在ALK方面呈阳性；或

(ii)若强颗粒细胞质染色不存在于所述样品中的一个或多个肿瘤细胞中，则将所述样品评分为在ALK方面呈阴性；并

(d)若所述样品评分为在ALK方面呈阳性，则将所述受试者鉴定为具有可能响应克唑替尼治疗的NSCLC，或若所述样品评分为在ALK方面呈阴性，则将所述受试者鉴定为具有可能不响应克唑替尼治疗的NSCLC。

20.权利要求19的用途，其中检测所述样品中的ALK蛋白质表达进一步包括在步骤(b)(ii)后：

在足以在ALK蛋白质处或附近沉积3-羟基喹喔啉-2-羧酸的条件下使所述样品与过氧化氢和缀合有酪酰胺的3-羟基喹喔啉-2-羧酸接触；并

使所述样品与结合3-羟基喹喔啉-2-羧酸的三抗接触。

21.权利要求19或权利要求20的用途，其中所述方法进一步包括若来自所述受试者的样品评分为在ALK方面呈阳性，则选择所述受试者用克唑替尼治疗。

22.权利要求21的用途，其中所述方法进一步包括对选择的受试者施用治疗有效量的克唑替尼。