DE10106370B4

DE10106370B4 - Oligonukleotidsonden zur Detektion von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung

Info

Publication number: DE10106370B4
Application number: DE10106370A
Authority: DE
Inventors: Karlheinz Dr. Trebesius; Jiri Dr. Snaidr
Original assignee: Vermicon AG
Current assignee: Vermicon AG
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2021-02-13
Also published as: WO2002064824A2; JP2004525626A; CA2438121A1; EP1409724A2; US20040143109A1; WO2002064824A3; DE10106370A1

Abstract

Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans durch in situ-Hybridisierung, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Actinobacillus actinomycetemcomitans sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:
a) der DNA-Sequenz 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3;
b) der DNA-Sequenz 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3;
c) einer DNA-Sequenz, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem zu der Nukleinsäuresequenz von a) oder b) komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung, Oligonukleotidsonden-Zusammensetzungen zum Nachweis derartiger parodontopathogener Bakterien, Verfahren zum sicheren Nachweis von parodontopathogenen Bakterien in humanen Proben aus dem Mundbereich sowie Kits zur Durchführung derartiger Verfahren.

Trotz Verbesserungen bei der Mundhygiene und neuer therapeutischer Verfahren ist die Parodontitis, auch Parodontose genannt, nach wie vor eine weitverbreitete Krankheit. Nach der Deutschen Mundgesundheitsstudie 1999 lassen sich bei 14,1 % der Altersgruppe 35–44 Jahre schwere Parodontopathien nachweisen. Unter den 65–74 jährigen weist sogar jeder 4. eine schwere Parodontitis auf.

Ursache für den fortschreitenden Abbau des Zahnhalteapparates, der bei Nichtbehandlung unweigerlich mit dem Verlust der befallenen Zähne endet, sind bakterielle Beläge, sog. Plaque, im Zahn und Wurzelbereich. Während früher davon ausgegangen wurde, daß die Zunahme an bakterieller Plaque allgemein für die Entstehung der Parodontitis verantwortlich ist (unspezifische Plaque-Hypothese), ist mittlerweile aus einer Reihe von fundierten Untersuchungen bekannt, daß nur wenige der weit über 500 bakteriellen Spezies im Mundraum mit der Entstehung von Parodontitis assoziiert sind. Besonders stark in die Entstehung dieser Krankheit involviert sind Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia und Bacteroides forsythus (Slots, J., M. Ting, Periodontol. 2000, 20: 82–121; Socransky, S. S., A. D. Haffajee, L. A. Ximenez-Fyvie, M. Feres, D. Mager, Periodontol. 2000, 20: 341–62; Carlos, J. P., M. D. Wolfe, J. J. Zambon, A. Kingman, J. Dent. Res. 1988, 67: 1510–4; Lai, C. H., M. A. Listgarten, M. Shirakawa, J. Slots, Oral Microbiol. Immunol. 1987, 2: 152–7; Gmur, R., J. R. Strub, B. Guggenheim, J. Periodontal. Res. 1989, 24: 113–20). Ein wesentlicher parodontopathoger Keim ist ferner Actinobacillus actinomycetemcomitans, der vor allem bei aggressiven Verlaufsformen der Parodontitis zu finden ist (Slots, J., M. Ting, Periodontol. 2000, 20: 82–121).

Während diese Bakterien auch bei Gesunden in geringen Zahlen vorkommen, kommt es beim Überschreiten eines bestimmten Schwellenwertes zur Auslösung des Krankheitsgeschehens. D.h. erst wenn der Anteil parodontopathogener Bakterien einen definierten Anteil an der Gesamtflora ausmacht, kommt es bei entsprechender Prädisposition des Wirtes zu einer Parodontitis.

Zum Nachweis relevanter Mikroorganismen stehen mittlerweile eine Reihe von Möglichkeiten zur Verfügung. Als Standardmethode gilt der kulturelle Nachweis dieser Bakterien mittels künstlicher Nährmedien. Diese Methode erlaubt sowohl die Quantifizierung als auch eine Bestimmung des Anteils der relevanten Bakterien an der kultivierbaren Mikroflora der parodontalen Probe. Da es sich allerdings bei den parodontopathogenen Bakterien um anaerobe und mikroaerophile Organismen handelt, die hinsichtlich ihrer Anzuchtbedingungen sehr spezielle Ansprüche stellen, müssen für die Probenahme, die Verarbeitung des Materials und die Anzüchtung dieser Organismen spezielle Verfahren und Geräte, insbesondere die Anaerobiertechnik verwendet werden. Ein derartiger Nachweis dieser parodontalen Leitkeime durch Kultivierung ist nicht nur personal- und arbeitsintensiv, sondern dauert mit durchschnittlich 10 bis 14 Tage auch vergleichsweise lange.

Die Verwendung von immunologischen Methoden ist für die Detektion von parodontopathogenen Bakterien ebenfalls prinzipiell geeignet (Bonta, Y., J. J. Zambon, R. J. Genco, M. E. Neiders, J Dent Res. 1985, 64: 793–8). Das Auftreten von Kreuzreaktivitäten führt bei dieser Methode allerdings häufig zu falsch positiven Ergebnissen.

Bei der Verwendung von molekularbiologischen Methoden gibt es prinzipiell zwei verschiedene Möglichkeiten, nämlich zum einen Hybridisierungstechniken, die direkt die Nukleinsäure von parodontopathogenen Bakterien detektieren und zum anderen Amplifikationstechniken (z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Transcription-Mediated-Amplification-Techniken (TMA)), die bestimmte Erbsubstanzabschnitte von parodontalen Leitkeimen spezifisch vervielfältigen (Chen, C., J. Slots, Periodontol. 2000, 20: 53–64).

Mit Amplifikationstechniken lassen sich hochsensitiv und spezifisch Bakterien nachweisen. Allerdings sind diese Methoden, die alle auf einer enzymabhängigen Vervielfältigung beruhen, mit einer Reihe von Nachteilen behaftet, die ihre Umsetzung in der Routine behindern:

a) In der Probe vorhandene Inhibitorsubstanzen wie z.B. die Häm-Gruppe des Hämoglobins können eine Amplifikation be- oder sogar verhindern.
b) Aufgrund der millionenfachen Vervielfältigung von Erbsubstanz ist die Gefahr von Kreuzkontaminationen hoch. Um dies zu vermeiden, sind aufwendige Schutzmaßnahmen erforderlich.
c) Der personelle und apparative Aufwand ist beträchtlich.
d) In der Regel sind mit Amplifikationstechniken nur qualitative und keine quantitativen Aussagen möglich.
e) Freie, nicht zellassoziierte DNA wird ebenfalls nachgewiesen, d.h. es erfolgt auch dann ein positiver Nachweis, wenn die nachzuweisenden Organismen tot sind.

Slots et al. (1995) Clin. Infect. Dis. 20 (Suppl. 2): 304–307 beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch PCR-Amplifikation von Bereichen der 16S ribosomalen Gene. Ein artspezifischer, quantitativer Nachweis von parodontopathogenen Bakterien ist mit diesem Verfahren jedoch nicht möglich.

Routinefähiger scheinen hier direkte Hybridisierungstechniken zu sein, da sie eine robuste und einfache Anwendung mit spezifischer und sensitiver Detektion verbinden. Das große Problem der Hybridisierungstechniken im Zusammenhang mit parodontopathogenen Bakterien ist allerdings, dass eine verlässliche Quantifizierung der Bakterien nur schwer möglich ist.

US 6,007,994 beschreibt den Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch Hybridisierung mit markierten Fragmenten der genomischen DNA dieser Bakterien. Diese markierten genomischen DNA-Fragmente eignen sich jedoch nicht zum quantitativen Nachweis einzelner parodontopathogener Bakterienarten in Proben von Patienten, da das Problem der Kreuzhybridisierung nicht ausgeschlossen werden kann.

Eine Ausnahme stellt diesbezüglich die rRNA-gerichtete in situ-Hybridisierung dar. Mit dieser Technik lassen sich durch den gezielten Einsatz von verschiedenen Sonden nicht nur die Anzahl spezieller Mikroorganismen bestimmen, sondern auch kulturunabhängig deren Anteil an der Gesamtflora. Dies ist aufgrund des erforderlichen Schwellenwertes zur Auslösung von Parodontitis essentiell für eine aussagekräftige mikrobielle Diagnostik.

Zudem erlaubt beispielsweise die Detektion der in situ-Hybridisierung durch Fluoreszenz über die Helligkeit des Signals eine Aussage über die physiologische Aktivität der Bakterien und dient so zur Unterscheidung der inaktiven Bakterien, wie beispielsweise potentiellen Kontaminanten von anderen Mundbereichen, von der physiologisch aktiven Subgingivalflora.

Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass die Bakterien in situ nachgewiesen werden können. So werden über die räumliche Assoziation der Bakterien miteinander oder durch Colokalisation mit Immunzellen wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese der Parodontitis gewonnen.

Die einfache und schnelle Durchführbarkeit prädestiniert diese Methode für einen Routineeinsatz in einem Diagnostiklabor oder in der Zahnarztpraxis selbst. Erste Erfahrungen mit dem Verfahren der in situ-Hybridisierung zur Diagnostik von parodontopathogenen Mikroorganismen sind bekannt. So konnten Gersdorf et al. (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993, 6: 109–14) bereits P. gingivalis und B. forsythus mit fluoreszenzmarkierten Sonden nachweisen. Durch Moter et al. (J. Clin. Microbiol. 1998, 36: 1399–403) wurden schwer und nicht kultivierbare Spirochäten mit dieser Technik nachgewiesen. Die bekannten Sonden zum spezifischen Nachweis von P. gingivalis und B. forsythus mittels in situ-Hybridisierung weisen allerdings eine relativ geringe Sensitivität auf.

Ferner sind die im Stand der Technik offenbarten Sondensysteme für die in situ-Hybridisierung unvollständig. So werden die wichtigen parodontopathogenen Mikroorganismen A. actinomycetemcomitans und P. intermedia nicht spezifisch erfaßt. Bereits bekannte spezifische Sonden für A. actinomycetemcomitans und P. intermedia, die aufgrund ihrer Primärstruktur verwendet werden könnten, sind z.T. für das Verfahren der in situ-Hybridisierung nicht geeignet, da ein Binden der Sonden an die native, ribosomale RNA durch ribosomale Proteine, die Bindungsstellen blockieren, oder blockierende Sekundärstrukturen in der rRNA verhindert wird.

WO 89/06704 offenbart unter anderem Oligonukleotidsonden, die an die rRNA von B. gingivalis, A. actinomycetemcomitans und B. forsythus hybridisieren. Das ebenfalls in WO 89/06704 beschriebene und beanspruchte Verfahren, in dem diese Sonden verwendet werden, beinhaltet die Lyse der Bakterien. Die in WO 89/06704 angegebenen Oligonukleotidsonden sind von den erfindungsgemäßen Sequenzen verschieden.

Ferner weisen die bekannten, auf nur einer Hybridisierungssonde beruhenden Systeme eine relativ geringe Sensitivität auf. Parodontopathogene Leitkeime mit geringen Ribosomenzahlen lassen sich deshalb mit den im Stand der Technik beschriebenen Oligonukleotidsonden nicht oder nur schwer detektieren. Zudem kann das Vorliegen von Stamm-Stamm-Sequenz-Variabilität bei Verwendung von Systemen, die lediglich auf einer Hybridisierungssonde beruhen, dazu führen, daß es in den hoch variablen Sondenzielregionen zu Fehlpaarungen kommt. Dadurch entstehen falsch negative Ergebnisse.

Ein weiterer Nachteil der in situ-Hybridisierung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien gemäß dem Stand der Technik ist, daß die Auswertung aufgrund der geringen Sensitivität nur mit einem teuren Fluoreszenzmikroskop erfolgen kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, unter Überwindung der Nachteile des Standes der Technik, Oligonukleotidsonden bereitzustellen, die zum in situ-Nachweis von für die Entstehung von Parodontitis relevanten Bakterien mit sowohl hoher Spezifität als auch hoher Sensitivität geeignet sind. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles und kostengünstiges Verfahren bereitzustellen, mit dem parodontale Leitkeime in humanen Proben aus dem Mundbereich sicher nachgewiesen werden können.

Weitere Aufgaben ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.

Die oben genannten Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.

Erfindungsgemäß werden Oligonukleotidsonden bereitgestellt, die zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Arten Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingavalis, Bacteroides forsythus und Prevotella intermedia geeignet sind.

Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Actinobacillus actinomycetemcomitans sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3' oder Teile davon;
b) DNA-Sequenz, umfassend 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' oder Teile davon;
c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäwesequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäwesequenz von a) oder b) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäwesequenz umfaßt;
d) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäwesequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäwesequenz umfaßt.

Ferner werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Porphyromonas gingivalis sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3' oder Teile davon;
b) DNA-Sequenz, umfassend 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3' oder Teile davon;
c) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3' oder Teile davon;
d) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäwesequenz von a), b) oder c) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäwesequenz umfaßt;
e) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäwesequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von d) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäwesequenz umfaßt.

Des weiteren werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Bacteroides forsythus sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3' oder Teile davon;
b) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3' oder Teile davon;
c) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3' oder Teile davon;
d) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3' oder Teile davon;
e) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3' oder Teile davon;
f) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' oder Teile davon;
g) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a), b), c), d), e) oder f) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt;
h) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von g) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.

Schließlich werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Prevotella intermedia sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' oder Teile davon;
b) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' oder Teile davon;
c) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' oder Teile davon;
d) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' oder Teile davon;
e) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3' oder Teile davon;
f) DNA-Sequenz, umfassend 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3' oder Teile davon;
g) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a), b), c), d), e) oder f) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt;
h) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von g) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.

Bei einer erfindungsgemäß geeigneten Oligonukleotidsonde kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide bevorzugt zwischen 12 und 50 und besonders bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotiden umfaßt. Als Zielregion für komplementäre Nukleinsäuresonden werden solche Bereiche ausgewählt, die zwar bei der Zielgruppe, beispielsweise bei allen Stämmen einer Spezies, vorkommen, nicht aber bei anderen Mikroorganismen. Bei einer erfindungsgemäßen Sonde von 15 Basen beträgt die Komplementarität 100 %. Bei erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden von mehr als 15 Nukleotiden sind eine bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.

Je nachdem ob stringente oder moderate Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, erfolgt die Bindung der Nukleinsäuresonde an eine 100 % komplementäre Zielstelle oder an eine Zielstelle mit einer oder mehreren Fehlpaarungen.

Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0% Formamid in einem wie in Beispiel 1 beschriebenen Hybridisierungspuffer. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20–80% Formamid im Hybridisierungspuffer.

Unter Teilen oder Derivaten der Nukleinsäuresequenz werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Oligonukleotidsonden verstanden, die sich von den vorstehend genannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen durch Deletion und/oder Addition und/oder Mutation unterscheiden können oder die nur Teilbereiche dieser DNA-Sequenzen aufweisen, wobei die Fähigkeit dieser Sonden, mit für die vorstehend genannten Bakterien spezifischer rRNA zu hybridisieren, erhalten bleibt.

Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, umfassend:

a) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans;
b) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis;
c) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus; oder
d) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia.

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien bereitgestellt, umfassend:

a) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden nach Anspruch 1;
b) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere, besonders bevorzugt sämtliche Oligonukleotidsonden nach Anspruch 2;
c) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere, besonders bevorzugt sämtliche Oligonukleotidsonden nach Anspruch 3; oder
d) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehrere, besonders bevorzugt sämtliche Oligonukleotidsonden nach Anspruch 4.

Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die erfindungsgemäße Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung sämtliche vorstehend genannten erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden-Zusammensetzungen lassen sich parodontale Leitkeime mit hoher Sensitivität nachweisen, selbst wenn diese nur wenige Ribosomen beherbergen. Somit ist gewährleistet, daß die entsprechenden Pathogene in parodontalen Proben auch dann detektiert werden können, wenn sie in niedrig aktivem Zustand vorliegen. Damit lassen sich mit den erfindungsgemäßen Sonden-Zusammensetzungen erstmals parodontopathogene Bakterien quantitativ in einer subgingivalen Probe nachweisen, selbst wenn die Ribosomenzahl der Bakterien unterhalb der mit einer einfach fluoreszenzmarkierten Sonde nachweisbaren Zahl befindlichen Schwelle liegt.

Zudem lässt sich anders als bei allen aus dem Stand der Technik bekannten Sonden durch den Einsatz der vorstehend beschriebenen Sonden beispielsweise in Kombination mit einem bakterienfärbenden Farbstoff schnell der Anteil eines bestimmten krankheitsrelevanten Bakteriums an der mikrobiellen Gesamtflora bestimmen. Dies ist von großer diagnostischer Bedeutung, da das Überschreiten eines kritischen Wertes zur Auslösung der Krankheit führt. Anders als bei Kulturtechniken werden nicht nur kultivierbare Bakterien detektiert, sondern alle in einer Probe vorhandenen Bakterien. Die Detektion mit der erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung gelingt ferner auch dann, wenn Stammvarietäten vorliegen, die sich in einzelnen hochvariablen rRNA-Abschnitten von den Typstämmen unterscheiden. Der Nachweis mit den erfindungsgemäßen Sonden gelingt nicht nur schnell, sondern ist auch robust und hochspezifisch.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, umfassend die folgenden Schritte:

a) Fixieren der in der Probe enthaltenen Bakterien;
b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einer vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonde, vorzugsweise mit einer vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung;
c) Detektieren und ggf. Quantifizieren der hybridisierten bakteriellen Zellen.

Vorzugsweise werden die Bakterien nach dem Fixieren auf einem Objektträger immobilisiert, besonders bevorzugt durch Trocknung oder durch Filtration.

Die Fixierung erfolgt vorzugsweise durch denaturierende Reagenzien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen, und/oder durch quervernetzende Reagenzien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd. Alternativ erfolgt die Fixierung durch Hitze.

Ferner ist es bevorzugt, wenn die Oligonukleotidsonden kovalent mit einem detektierbaren Marker verbunden sind. Der detektierbare Marker wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Fluoreszenzmarker;
b) Chemolumineszenzmarker;
c) radioaktiver Marker;
d) enzymatisch aktive Gruppe;
e) Hapten;
f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.

Der enzymatische Marker wird insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phophatase, ausgewählt. Somit kann die Detektion und Quantifizierung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in dieser speziellen Ausführungsform auch mittels eines einfachen Lichtmikroskopes erfolgen. Dazu werden erstmals Peroxidase-markierte Oligonukleotidsonden zum in situ-Nachweis von parodontopathogenen Bakterien eingesetzt.

Diese Ausführungsform bietet gegenüber den herkömmlicherweise verwendeten Techniken eine Reihe von Vorteilen. Zum einen ist mit einem Nachweissystem, das auf einer Enzymreaktion beruht, eine lichtmikroskopische Detektion von Bakterien möglich, was die Anschaffungskosten für ein Analysegerät erheblich reduziert. Zudem lässt sich die Aussagekraft dieses Nachweissystems durch den Einsatz geeigneter Gegenfärbemittel noch deutlich steigern. Die Durchführung einer gewöhnlichen Hämatoxylin-Eosin-Färbung im Anschluß an eine in situ-Hybridisierung mit Peroxidase-markierten Oligonukleotiden erlaubt die Bestimmung von Anzahl und Anteil spezieller Bakterien, aber auch die Bestimmung der Anzahl von relevanten Immunzellen und eventuelle räumliche Assoziationen mit bestimmten bakteriellen Gruppen. Weiterhin ergeben sich bezüglich des Nachweissystems deutlich verbesserte Automatisierungsmöglichkeiten, so daß eine Mikroskop-unabhängige Detektion möglich ist. Eine solches Nachweissystem könnte beispielsweise in Mikrotiterplatten mit einem handelsüblichen chromogenen Peroxidasesubstrat durchgeführt werden.

Die beschriebene Technik wird nicht nur zu einer deutlichen Erleichterung der mikrobiellen Diagnostik in speziellen Untersuchungslaboratorien und bei den niedergelassenen Zahnärzten führen, sondern auch für neue Erkenntnisse bei der Erforschung dieser Infektionskrankheit sorgen.

Ferner kann es vorteilhaft sein, daß die fixierten Zellen vor der Inkubation permeabilisiert werden. Bei einer Permeabilisierung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Zellhülle durchlöchert, aber im Unterschied zur Lyse nicht zerstört. Die morphologische Integrität der Zelle bleibt erhalten. Makromoleküle wie DNA, RNA und Ribosomen verbleiben in der Zelle. Die Permeabilisierung kann notwendig sein, um z.B. ein effektives Eindringen von Sonden, die mit im Vergleich zu Fluoreszenzfarbstoffen großen Enzymmoleküle markiert sind, in die Zelle und damit das anschließende Binden an Ribosomen zu gewährleisten. Die Permeabilisierung kann vorzugsweise durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinase K, Pronase, Lysozym und Mutanolysin, erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend mindestens einen Hybridsierungspuffer sowie mindestens eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde, vorzugsweise eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung.

Bei dem vorstehend beschriebene erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein in situ-Hybridisierungsverfahren, das auf dem Nachweis von ribosomaler RNA beruht. Bei einer im folgenden ausführlich dargestellten speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden folgende Schritte durchgeführt:

1) Probenahme;
2) Fixierung der Probe;
3) ggf. Transport;
4) ggf. Konzentrierung;
5) Immobilisierung der Probe auf einem Träger;
6) Permeabilisierung der in der Probe enthaltenen bakteriellen Zellen;
7) Hybridisierung der Probe;
8) Waschen der Probe;
9) Detektion der hybridisierten Sonden.

Bei der Auswahl der Patienten bzw. betroffenen Stellen im Gebiß ist die klinische Erfahrung des behandelnden Arztes ausschlaggebend. Als Orientierungshilfe kann hier die Stellungnahme der Gesellschaft für Parodontologie und der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde zur mikrobiologischen Diagnostik bei marginalen Parodontitiden von 1998 dienen. Es können entweder einzelne parodontale Taschen oder aber auch "Pool-Proben" von mehreren subgingivalen Stellen beprobt werden. Alternativ können mit der dargestellten Technik aber auch supragingivale Stellen oder andere Proben aus dem Mund-Rachenraum untersucht werden (z.B. Speichelproben). Zur Beprobung von subgingivalen Stellen werden entweder speziell dafür vorgesehene zahnärztliche Instrumente (z.B. Kürretten, Scaler u.ä.) oder spezielle Papierspitzen, vorzugsweise ISO45 der Firma Alfred Becht (Offenburg; Deutschland) oder anderer Hersteller verwendet.

Die mit den verschiedenen Verfahren entnommenen Bakterien werden anschließende in ein geeignetes Fixierungsmedium eingebracht, um die Bakterien abzutöten und einen Abbau ribosomaler RNA zu verhindern. Dazu können prinzipiell entweder denaturierende Reagenzien, wie Ethanol, Aceton oder Ethanol-Essigsäuremischungen, oder quervernetzende Reagenzien, wie Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd, verwendet werden. Auch Mischungen aus den beiden Fixierungsmittelgruppen (z.B. Ethanol zusammen mit Formaldehyd) sind einsetzbar.

Die entnommenen Bakterien können auch direkt in einen Wassertropfen eluiert werden, der sich auf einem Objektträger befindet. Die Bakterien werden dann mittels Hitzefixierung über einer offenen Flamme, z.B. einem Bunsenbrenner, oder in einem temperierbaren Inkubationsschrank, z.B. bei 80°C, fixiert und gleichzeitig auf einem Objektträger immobilisiert. Fixierte Proben lassen sich ohne weitere Spezialvorrichtungen bis zur Untersuchung lagern und eventuell transportieren.

Die fixierten Proben werden anschließend, sofern keine Hitzefixierung durchgeführt wurde, durch Trocknung auf einem Objektträger immobilisiert. Alternativ können zur Immobilisierung auch Filtrationsverfahren verwendet werden. Mit Hilfe eines Membranfilters werden dabei auch größere Mengen Probenvolumen auf einen Filter aufgebracht.

Vorzugsweise werden dazu Polycarbonatmembranen verwendet, die anschließend analog zu den auf Objektträgern immobilisierten Proben hybridisiert werden.

Optional schließt sich an die Immobilisierung eine aufsteigende EtOH-Reihe an (50, 80 und 96 % Ethanol für je 3 Minuten).

Bei der Verwendung von großen Markierungsmolekülen (z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, u.a.) kann eine weitere Permeabilisierung der Bakterienzellwände vorteilhaft sein, um eine effektive Diffusion der markierten Sondenmoleküle in die bakterielle Zelle zu gewährleisten. Dazu können verschiedenen zellwandlytische Enzyme verwendet werden, z.B. ProteinaseK, Pronase, Lysozym, Mutanolysin und dergleichen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis der parodontopathogenen Bakterien A. actinomycetemcomitan, P. gingivalis, B. forsythus und P. intermedia sind vor allem die Enzyme ProteinaseK und Lysozym in der in Beispiel 3 gezeigten Form zur Permeabilisierung der Zellwände geeignet. Aber auch der Einsatz verschiedener chemischer Reagenzien (z.B. 1 N HCl oder Detergenzien) können zu einer Permeabilisierung von einzelnen bakteriellen Zellen verwendet werden. Zum Abstoppen der Enzymreaktion wird eine weitere aufsteigende Ethanolreihe durchgeführt.

Erfindungsgemäß wird die Nukleinsäuresonde mit dem im obengenannten Sinne fixierten Mikroorganismus inkubiert, um so ein Eindringen der Nukleinsäuresondenmoleküle in den Mikroorganismus und die Hybridisierung von Nukleinsäuresondenmolekülen mit den Nukleinsäuren des Mikroorganismus zu ermöglichen. Anschließend werden die nichthybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle durch übliche Waschschritte entfernt.

Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung ist, daß die Nukleinsäuresonde z.B. über eine kovalente Bindung mit einem Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden fluoreszierende Gruppen wie z.B. CY2, CY3, CY5, FITC, FLUOS, TRITC oder FLUOS-PRIME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können mit Vorteil verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1

Enzyme	Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase	4-Methylumbelliferylphosphat (), Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), () 3-O-Methylfluoreszein, Flavon-3-Diphosphattriammoniumsalz (), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase	Tyraminhydrochlorid (), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (), p-Hydroxyphenethylalkohol (), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase	H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H₂O₂ + Tetramethylbenzidin
4. β-D-Galaktosidase	o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid

5. Glukoseoxidase

ABTS, Glukose und Thiazolylblau

Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, daß an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfaßt wiederum ca. 15 bis 1000, bevorzugt 15–50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einer Oligonukleotidsonde erkannt werden, die durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten. Nach Ablösung der Nukleinsäuresondenmoleküle von der Zielnukleinsäure können die nunmehr isoliert vorliegenden Nukleinsäuresondenmoleküle mit Antikörpern, die das Hapten erkennen, in Kontakt gebracht werden. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxygenin oder dessen Derivate angeführt werden. Dem Fachmann sind neben den angegebenen Beispielen auch noch weitere wohlbekannt.

Die Durchführung der Hybridisierung geschieht standardmäßig auf Objektträgern, auf Filtern, auf einer Mikrotiterplatte oder in einem Reaktionsgefäß. Die Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde und kann mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer, Durchflußzytometer und dergleichen erfolgen.

Der erfindungsgemäße Kit enthält besonders bevorzugt folgende spezifische Sonden zum Nachweis von Parodontopathogenen:

a) Sonden, die Stämme der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans erfassen: AACT1: 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATGC-3' AACT2: 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3'
b) Sonden, die Stämme der Art Porphyromonas gingivalis nachweisen PGIN1: 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3' PGIN2: 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3' PGIN3: 5'-CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3'
c) Sonden, die Stämme der Art Bacteroides forsythus erfassen BFOR1: 5'-GCT-ACC-ATGGCT-GCC-CCT-3' BFOR2: 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3' BFOR3: 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3' BFOR4: 5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3' BFOR5: 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3' BFOR6: 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3'
d) Sonden, die Stämme der Art Prevotella intermedia erfassen PINT1: 5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' PINT2: 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' PINT3: 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' PINT4: 5'-CCC-GCT-TTA-CTGCCC-AAC-3' PINT5: 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3' PINT6: 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3'

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken:
Beispiel 1: Spezifischer Nachweis von A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, B. forsythus und P. intermedia
Um die Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden zu belegen, wurden eine Reihe von Referenzorganismen aus öffentlich zugänglichen Bakterienstammsammlungen bestellt und auf den von den Stammsammlungen empfohlenen Medien kultiviert. Sobald sichtbare Kolonien auf den Nährmedien zu sehen waren, wurde mit einer Impföse eine Kolonie von der Platte entfernt und in einer Fixierungslösung (4 % Formaldehyd in 1×PBS) suspendiert. Optimalerweise beträgt die optische Dichte der Bakteriensuspension 0,2, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Bakterien wurden 1 bis 24 h in der Fixierlösung belassen und dann für 5 min bei 8.000 U/min (Rotina 35, Rotortyp 1714, Hettich, Tuttlingen) sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in dem 1×PBS gewaschen (Ausgangsvolumen). Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (Bedingungen wie oben) wurden die Zellen in einer 1:1-Mischung aus EtOH/PBS aufgenommen und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert.
Aus dieser Suspension wurden 5 μl entnommen und auf den Aussparungen eines teflonbeschichteten Objektträgers aufgebracht, luftgetrocknet und einer aufsteigenden Ethanolreihe unterzogen (50 %, 80 % und 100 % je 3 Minuten). Anschließend wurden die immobilisierten Proben luftgetrocknet, und 10 μl des Hybridisierungspuffers (0,9 mol/l NaCl, 0,02 mol/l Tris/HCl pH 8,0, 0,01 % SDS, 20 % Formamid, je 5 ng Hybridisierungssonde AACT1 und 2, PGIN1–3, BFOR1–6, PINT1–3) wurden zugegeben. Um zu überprüfen, ob die entsprechenden Referenzzellen genügend rRNA enthalten, um mit dieser Methode nachgewiesen zu werden, wurde neben einer Cy3-markierten spezifischen Sonde noch eine FLUOS-markierte universelle Sonde in der Hybridisierung mitgeführt.
Die Hybridisierung erfolgte in einer feuchten Kammer, die mit Hybridisierungspuffer äquilibriert war. Die Hybridisierungszeit betrug mindestens 90 Minuten. Anschließend wurde zur Entfernung der ungebundenen Sonde der hybridisierte Objektträger in einem 50 ml Röhrchen mit Waschpuffer (0,225 mol/l NaCl, 0,02 mol/l Tris/HCl pH 8,0, 0,01 % SDS) plaziert und 15 Minuten bei 48°C inkubiert. Die fertig hybridisierten Objektträger wurden mit einem geeigneten Einbettmedium überschichtet und anschließend Fluoreszenz-mikroskopisch analysiert.
Tabelle 2 zeigt die verwendeten Referenzstämme und die mit den erfindungsgemäßen Sonden erzielten Ergebnisse. Tabelle 2 a) Spezifität der AACT-Sonden:

b) Spezifität der PGIN-Sonden:

c) Spezifität der BFOR-Sonden:

d) Spezifität der PINT-Sonden
Beispiel 2: Detektion von parodontopathogenen Bakterien in Proben von Patienten mit Parodontitis
Die Entnahme der parodontalen Proben erfolgte entweder mit einem Scaler oder mit einer dafür vorgesehenen sterilen Papierspitze. Im Falle der Verwendung eines Scalers wurde der Scaler nach der Entfernung bakterieller Plaque aus der Zahnfleischtasche solange in der Fixierungslösung (4 % Formaldehydlösung in 1×PBS) gerührt, bis die daran haftenden bakteriellen Beläge vollständig in 200 μl Fixierungslösung suspendiert waren. Erfolgte die Probenahme mit sterilen Papierspitzen, so waren diese aseptisch aus der Verpackung zu entnehmen und nach entsprechender Vorbereitung des Patienten (Trocknung der entsprechenden Stelle, Entfernung supragingivaler Plaque) in die zu beprobenden parodontale Tasche einzuführen. Dort verblieb die Papierspitze für 10–20 Sekunden, wurde dann entnommen und in ein Reagenzgefäß mit 200 μl Fixierlösung übergeführt. In diesem Zustand wurde die Papierspitze in das Untersuchungslaboratorium geschickt. Dort wurde die Fixierlösung mit 1/10-tel Volumen einer 1%-igen TritonX-100-Lösung versetzt und 2×30 Sekunden gut geschüttelt, um die Bakterien von der Papierspitze zu eluieren.
Anschließend wurde bei 8.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, das Pellet wie bei Beispiel 1 ausgeführt gewaschen und die Bakterien schließlich in 60 μl einer 1:1-Mischung von Ethanol und PBS übergeführt. In dieser Lösung sind die Bakterien in der Probe bei –20°C mindestens 3 Monate lagerbar.
5 μl dieser Suspension wurden auf einen Objektträger aufgebracht und wie in Beispiel 1 ausgeführt mit den erfindungsgemäßen Sonden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Proben mit dem unspezifisch an DNA bindenden Farbstoff DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid; Sigma; Deisenhofen; Deutschland) gefärbt. Dazu wurden die Proben mit einer PBS-Lösung überschichtet, die 1 μg/ml DAPI enthielt, und 5–15 Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit 1×PBS konnten die Proben dann in einem geeigneten Einbettmedium (Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London, UK; Vectashild, Vector laboratories, Burlingame, U.S.A) mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes untersucht werden.
Die quantitative Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Zählokulars nach Angaben des Mikroskopherstellers (Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Die quantitative Auswertung von drei verschiedenen Patientenproben ist in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3
Beispiel 3: Detektion von parodontopathogenen Bakterien mit Oligonukleotidsonden, die mit Meerettich-Peroxidase markiert sind
Die parodontalen Proben wurden entnommen, fixiert und auf den Objektträgern immobilisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Anschließend wurden die in der Probe vorhandenen Zellen mittels einer 15-minütigen Inkubation in einer 10 μg/ml ProteinaseK-Lösung oder in einer 250 μg/ml Lysozym-Lösung permeabilisiert. Das Abstoppen der Enzymreaktion erfolgte durch eine aufsteigende Ethanolreihe (50 %, 80 %, 100 %, je 3 min).
Die Hybridisierung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, allerdings in einem Puffer, der 40 % Formamid anstelle von 20 % Formamid enthält. Zudem wurde die Hybridisierung bei 35°C durchgeführt. Nach 90 Minuten wurde der Objektträger aus der feuchten Kammer entnommen und in einem Waschpuffer-POD (0,056 mol/l NaCl; 0,05 mol/l EDTA, 0,02 mol/l Tris/HCl pH 8,0; 0,01 % SDS) für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die hybridisierte Probe für 10 Minuten mit einer Diaminobenzidin-haltigen Substratlösung überschichtet. Zur Herstellung dieser Lösung wurde eine Diaminobenzidin-haltige Tablette und eine H₂O₂ enthaltende Tablette aus dem SIGMA FAST DAB Tablet Sets (D4168) in 1 ml Substratpuffer gelöst (0,15 mol/l NaCl; 0,1 mol/l Tris/HCl pH 8,0). Nachdem die Tabletten vollständig in dem Substratpuffer gelöst waren, wurden 10 μl dieser fertigen Substratlösung auf die hybridisierten Proben gegeben und 10 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit 1×PBS gespült und entweder sofort oder nach einer geeigneten Gegenfärbung mikroskopiert.
Eine geeignete Gegenfärbung war eine HE-Färbung, die auf folgende Weise erstellt wurde. Die feuchten, hybridisierten Objektträger wurden in eine Glasküvette getaucht, die mit Hämalaun (Merk, Deutschland, Art.-Nr. 1.09249.0500) gefüllt ist. Nach 3–5 Minuten wurden die Objektträger kurz in destilliertem Wasser gespült und dann 10 Minuten zum Bläuen fließendem kalten Leitungswasser ausgesetzt. Dann wurde der Objektträger für 3–5 Minuten in eine Küvette mit Eosin getaucht. Anschließend wurden die Objektträger kurz in 90%-igem und dann in absolutem Ethanol gespült. Abschließend wurde der Objektträger in drei verschiedene Xylol-Bäder getaucht, bis die Xylol-Lösung klar blieb. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans durch in situ-Hybridisierung, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Actinobacillus actinomycetemcomitans sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) der DNA-Sequenz 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3; b) der DNA-Sequenz 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3; c) einer DNA-Sequenz, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem zu der Nukleinsäuresequenz von a) oder b) komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis durch in situ-Hybridisierung, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Porphyromonas gingivalis sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) der DNA-Sequenz 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3; b) der DNA-Sequenz 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3'; c) der DNA-Sequenz 5'-CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3; d) einer DNA-Sequenz, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem zu der Nukleinsäuresequenz von a), b) oder c) komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus durch in situ-Hybridisierung, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Bacteroides forsythus sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) der DNA-Sequenz 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'; b) der DNA-Sequenz 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3; c) der DNA-Sequenz 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3; d) der DNA-Sequenz 5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3'; e) der DNA-Sequenz 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'; f) der DNA-Sequenz 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3; g) DNA-Sequenz, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem zu der Nukleinsäuresequenz von a), b), c), d), e) oder f) komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia durch in situ-Hybridisierung, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Prevotella intermedia sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) der DNA-Sequenz 5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3'; b) der DNA-Sequenz 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'; c) der DNA-Sequenz 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3; d) der DNA-Sequenz 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3; e) der DNA-Sequenz 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3; f) der DNA-Sequenz 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3'; g) DNA-Sequenz, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem zu der Nukleinsäuresequenz von a), b), c), d), e) oder f) komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, umfassend: a) mindestens eine Oligonukleotidsonde zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans nach Anspruch 1; b) mindestens eine Oligonukleotidsonde zum anspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis nach Anspruch 2; c) mindestens eine Oligonukleotidsonde zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus nach Anspruch 3; und/oder d) mindestens eine Oligonukleotidsonde zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia nach Anspruch 4.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, enthaltend:. a) zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum anspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans nach Anspruch 1; b) zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum anspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis nach Anspruch 2; c) zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum anspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus nach Anspruch 3; und/oder d) zwei oder mehrere Oligonukleotidsonden zum anspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia nach Anspruch 4.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, enthaltend sämtliche Oligonukleotidsonden nach den Ansprüchen 1 bis 4.
Verfahren zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, mit den Schritten: a) Fixieren der in der Probe enthaltenen Bakterien; b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einer Oligonukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4; c) Detektieren der hybridisierten bakteriellen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 8, mit dem Schritt c): c) Detektieren und Quantifizieren der hybridisierten bakteriellen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, mit dem Schritt b): b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit einer Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Bakterien nach dem Fixieren auf einem Objektträger immobilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Immobilisierung durch Trocknung oder durch Filtration erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Fixierung durch denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Fixierung durch quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Fixierung durch Hitzefixierung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 15, wobei die Oligonukleotidsonden kovalent mit einem detektierbaren Marker verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der detektierbare Marker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) Fluoreszenzmarker; b) Chemolumineszenzmarker; c) radioaktiver Marker; d) enzymatisch aktive Gruppe; e) Hapten; f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der enzymatische Marker aus der Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 18, wobei die fixierten Zellen vor der Inkubation permeabilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die zellwandlytischen Enzyme ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Proteinase K, Pronase, Lysozym und Mutanolysin.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 21, enthaltend: a) mindestens einen Hybridsierungspuffer; b) mindestens eine Oligonukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Kit nach Anspruch 22, enthaltend unter Punkt b): b) eine Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7.