WO2002064824A2 - Oligonukleotidsonden zur detektion von parodontopathogenen bakterien mittels in situ-hybridisierung - Google Patents

Oligonukleotidsonden zur detektion von parodontopathogenen bakterien mittels in situ-hybridisierung Download PDF

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WO2002064824A2
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Karlheinz Trebesius
Jiri Snaidr
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Vermicon Ag
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • Oligonucleotide probes for the detection of periodontopathogenic bacteria using in situ hybridization are provided.
  • the invention relates to oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria by means of in situ hybridization, oligonucleotide probe compositions for the detection of such periodontopathogenic bacteria, methods for the reliable detection of periodontopathogenic bacteria in human samples from the mouth area and kits for carrying out such methods.
  • periodontitis also called periodontitis
  • Periodontitis is still a widespread disease.
  • 14.1% of the age group 35-44 years can be found to have severe periodontal disease.
  • 65-74 year olds every fourth even has severe periodontitis.
  • Periodontitis only occurs when the proportion of periodontopathogenic bacteria makes up a defined proportion of the total flora, if the host is predisposed accordingly.
  • the standard method is the cultural detection of these bacteria using artificial nutrient media. This method allows both the quantification and the determination of the proportion of the relevant bacteria in the cultivable microflora of the periodontal sample.
  • special methods and devices in particular the anaerobic technique, must be used for sampling, processing the material and growing these organisms .
  • Such detection of these periodontal leading germs by cultivation is not only labor and labor intensive, but also takes a comparatively long time, with an average of 10 to 14 days.
  • Bacteria can be detected in a highly sensitive and specific manner using amplification techniques.
  • these methods which are all based on enzyme-dependent amplification, have a number of disadvantages which hinder their routine implementation: a) Inhibitor substances present in the sample, e.g. the heme group of hemoglobin can inhibit or even prevent amplification.
  • the personnel and equipment expenditure is considerable.
  • As a rule only qualitative and no quantitative statements are possible with amplification techniques.
  • Free, non-cell associated DNA is also detected, i.e. there is also positive evidence if the organisms to be detected are dead.
  • Direct hybridization techniques seem to be more routine-capable, since they combine a robust and simple application with specific and sensitive detection.
  • the big problem associated with hybridization techniques periodontopathogenic bacteria, however, is that reliable quantification of the bacteria is difficult.
  • the detection of the in situ hybridization by fluorescence via the brightness of the signal allows a statement about the physiological activity of the bacteria and thus serves to differentiate the inactive bacteria, such as potential contaminants from other mouth areas, from the physiologically active subgingival flora.
  • Another advantage of this technique is that the bacteria can be detected in situ. In this way, important insights into the pathogenesis of periodontitis are gained through the spatial association of the bacteria with one another or through co-localization with immune cells.
  • the probe systems disclosed in the prior art are incomplete for in situ hybridization.
  • the important periodontopathogenic microorganisms A. actinomycetemcomitans and P. intermedia are not specifically recorded.
  • Already known specific probes for A. actinomycetemcomitans and P. intermedia, which could be used due to their primary structure, are partly. not suitable for the in situ hybridization method, since binding of the probes to the native ribosomal RNA is prevented by ribosomal proteins which block binding sites or by blocking secondary structures in the rRNA.
  • the known systems based on only one hybridization probe have a relatively low sensitivity. Periodontopathogenic leading germs with low ribosome numbers can therefore not or only with difficulty be detected with the oligonucleotide probes described in the prior art.
  • the presence of strain-strain sequence variability when using systems based solely on a hybridization probe can lead to mismatches in the highly variable probe target regions. This creates false negative results.
  • a further disadvantage of the in situ hybridization for the detection of periodontopathogenic bacteria according to the prior art is that, due to the low sensitivity, the evaluation can only be carried out with an expensive fluorescence microscope. It is therefore an object of the present invention to provide oligonucleotide probes which are suitable for in situ detection of bacteria relevant for the development of periodontitis with both high specificity and high sensitivity, while overcoming the disadvantages of the prior art. It is also an object of the present invention to provide a fast and inexpensive method with which periodontal lead germs can be reliably detected in human samples from the mouth area.
  • oligonucleotide probes are provided which are suitable for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the species Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus and Prevotella intermedia.
  • the sequences of the oligonucleotides according to the invention are in the attached sequence listing with the sequences SEQ ID No. 1-17 compiled. In it corresponds
  • oligonucleotide probes are used for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the Actinobacillus species actinomycetemcomitans provided by in situ hybridization, wherein the oligonucleotide probes are complementary to the rRNA of Actinobacillus actinomycetemcomitans and are selected from the group consisting of: a) DNA sequence comprising 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC- C-3 '5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' or parts thereof; b) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which hybridizes with a complementary strand of the nucleic acid sequence of a), or parts of this nucleic acid sequence; c) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which is degenerate to a nucleic acid sequence of b) or parts of this nucleic acid sequence.
  • oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the type Porphyromonas gingivalis are provided by in situ hybridization, the oligonucleotide probes being complementary to the rRNA of Porphyromonas gingivalis and being selected from the group consisting of: a) DNA sequence comprising 5 ' -CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3 'S'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-S 1 5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3 * or parts thereof; b) DNA sequence which is a nucleic acid sequence which hybridizes with a complementary strand of the nucleic acid sequence of a), or parts thereof
  • nucleic acid sequence Comprises nucleic acid sequence; c) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which is degenerate to a nucleic acid sequence of b) or parts of this nucleic acid sequence. Furthermore, according to the invention, oligonucleotide probes become species-specific
  • the oligonucleotide probes being complementary to the rRNA of Bacteroides forsythus and being selected from the group consisting of: a) comprising a DNA sequence
  • nucleic acid sequence Comprises nucleic acid sequence; c) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which is degenerate to a nucleic acid sequence of b) or parts of this nucleic acid sequence.
  • oligonucleotide probes become species-specific
  • the oligonucleotide probes being complementary to the rRNA of Prevotella intermedia and being selected from the group consisting of: a) comprising a DNA sequence
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the FISH technique is based on the fact that there are certain molecules in bacterial cells that, due to their vital function, have undergone only little mutation in the course of evolution: the 16S and the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA). Both are components of the ribosomes, the sites of protein biosynthesis, and due to their ubiquitous distribution, their size, and their structural and functional constancy, they can serve as specific markers (Woese, CR, 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, p. 221 -271). Based on a comparative sequence analysis, phylogenetic relationships can be established based solely on this data. For this, this sequence data must be in a Alignment can be brought. In the alignment, which is based on knowledge of the secondary structure and tertiary structure of these macromolecules, the homologous positions of the ribosomal nucleic acids are reconciled.
  • rRNA ribosomal ribonucleic acid
  • phylogenetic calculations can be carried out.
  • the use of the latest computer technology makes it possible to carry out large-scale calculations quickly and effectively, and to create large databases that contain the alignment sequences of the 16S rRNA and 23S rRNA. By quickly accessing this data material, newly obtained sequences can be analyzed phylogenetically in a short time.
  • These rRNA databases can be used to construct species- and genus-specific gene probes. Here, all available rRNA sequences are compared with each other and probes designed for specific sequence sites that specifically record a bacterial species, genus or group.
  • these gene probes which are complementary to a specific region on the ribosomal target sequence, are introduced into the cell.
  • the gene probes are usually small, 16-28 base long, single-stranded deoxyribonucleic acid pieces and are directed against a target region, which is typical for a type or group of bacteria. If the fluorescence-labeled gene probe finds its target sequence in a bacterial cell, it binds to it and the cells can be detected in the fluorescence microscope due to their fluorescence.
  • the FISH analysis is always carried out on a slide, since the bacteria are evaluated by irradiation with high-energy light visualized, i.e. made visible.
  • the analysis can also be carried out on a microtiter plate.
  • the implementation of the methods for the specific detection of parontopathogenic bacteria described in the present application generally comprises the following steps:
  • the nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is advantageous to choose a nucleic acid probe that is complementary to an area that is present in the number of copies of more than 1 in the microorganism to be detected.
  • the sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times.
  • the rRNA is preferably used as the target site, since the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis are present thousands of times in each active cell.
  • the oligonucleotide probes according to the invention are particularly preferably directed against the 16S rRNA of the parontopathogenic bacteria to be detected.
  • the nucleic acid probe in the sense of the invention can be a DNA or RNA probe, which will generally comprise between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200 and between 12 and 100, particularly preferably between 12 and 50 and between 14 and 40 and between 15 and 30, and most preferably between 17 and 25 nucleotides.
  • the nucleic acid probes are selected on the basis of whether a complementary sequence is present in the microorganism to be detected. Those regions are selected as the target region for complementary nucleic acid probes which occur in the target group, for example in all strains of one species, but not in other microorganisms. Complementarity should exist for a probe of 15 nucleotides over 100% of the sequence. In the case of oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one or more mismatching sites are permitted.
  • the invention also relates to modifications of the above oligonucleotide sequences which, despite the deviations in the sequence and / or length, show a specific hybridization with target nucleic acid sequences of the respective bacterium and are therefore suitable for use in a method according to the invention.
  • This includes in particular a) nucleic acid molecules which (i) with one of the above oligonucleotide sequences (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No.
  • sequence region of the nucleic acid molecule in at least 60%, 65%, preferably in at least 70%, 75%, more preferably in at least 80 %, 84%, 87% and particularly preferably in at least 90%, 94%, 96%, of the bases match (whereby the sequence region of the nucleic acid molecule is to be considered which corresponds to the sequence region of one of the oligonucleotides indicated above (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 17) corresponds to, and not approximately the entire sequence of a nucleic acid molecule which may be compared to the oligonucleotides given above (SEQ ID No. 1 to
  • SEQ ID No. 17 is extended by one to numerous bases) or (ii) differ from the above oligonucleotide sequences (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 17) by one or more deletions and / or additions and which enable a specific hybridization with nucleic acid sequences of bacteria of the species Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus and Prevotella intermedia.
  • Specific hybridization means that under the hybridization conditions described here or known to the person skilled in the art in connection with in situ hybridization techniques, only the ribosomal RNA of the target organisms, but not the rRNA of non-target organisms, binds to the oligonucleotide.
  • SEQ ID NO. 17 is complementary, hybridize under stringent conditions.
  • Nucleic acid molecules that have an oligonucleotide sequence of SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 17 or the sequence of a nucleic acid molecule according to a) or b) and in addition to the said sequences or their
  • Modifications according to a) or b) have at least one further nucleotide and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of target organisms.
  • the degree of sequence identity of a nucleic acid molecule with the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 17 can be determined using conventional algorithms.
  • the program for determining the sequence identity is suitable here, which is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (on this page e.g. the link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]").
  • nucleic acid probe molecules according to the invention can be used with various hybridization solutions as part of the detection method. Depending on whether stringent or moderate hybridization conditions are selected, the nucleic acid probe is bound to a 100% complementary target site or to a target site with one or more mismatches.
  • Moderate conditions in the sense of the invention are e.g. 0% formamide in a hybridization buffer as described in Example 1.
  • Stringent conditions in the sense of the invention are, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer.
  • parts or derivatives of the nucleic acid sequence are understood to mean oligonucleotide probes which can differ from the above-mentioned DNA sequences according to the invention by deletion and / or addition and / or mutation or which have only partial regions of these DNA sequences, the ability this probe is maintained to hybridize with rRNA specific for the bacteria mentioned above.
  • an oligonucleotide probe composition for the detection of periodontopathogenic bacteria comprising: i) at least one, preferably two or more oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the species Actinobacillus actinomycetemcomitans, selected from the group consisting of a) DNA sequence comprising
  • Porphyromonas gingivalis selected from the group consisting of a) DNA sequence comprising
  • nucleic acid sequence comprising nucleic acid sequence; c) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which is degenerate to a nucleic acid sequence of b) or parts of this nucleic acid sequence, and / or iii) at least one, preferably two or more oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the type Bacteroides forsythus, selected from the group consisting of a) DNA sequence comprising 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3 '
  • nucleic acid sequence comprising nucleic acid sequence; c) DNA sequence which comprises a nucleic acid sequence which is degenerate to a nucleic acid sequence of b) or parts of this nucleic acid sequence, and / or iv) at least one, preferably two or more oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the Prevotella intermedia species, selected from the group consisting of a) DNA sequence comprising 5 * -TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3 '5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'
  • the oligonucleotide probe composition comprises for the detection of periodontopathogenic bacteria i) all oligonucleotide probes for the species-specific detection of periodontopathogenic bacteria of the species Actinobacillus actinomycetemcomitans from the group consisting of a) DNA sequence, comprising 5'-CAT-CAG-CGT-C AG-TAC-ATC-C-3 '
  • the oligonucleotide probe composition according to the invention for the specific detection of parontopathogenic bacteria comprises all of the aforementioned oligonucleotide probes SEQ ID No. 1-17.
  • periodontal lead nuclei can be detected with high sensitivity, even if they harbor only a few ribosomes. This ensures that the corresponding pathogens can be detected in periodontal samples even if they are in a low active state.
  • periodontopathogenic bacteria can thus be detected quantitatively in a subgingival sample for the first time, even if the number of ribosomes in the bacteria is below the threshold that can be detected with a single fluorescence-labeled probe.
  • the use of the probes described above for example in combination with a bacteria-coloring dye, enables the proportion of a certain disease-relevant bacterium in the total microbial flora to be determined quickly. This is of great diagnostic importance because exceeding a critical value leads to the triggering of the disease.
  • a certain disease-relevant bacterium in the total microbial flora is of great diagnostic importance because exceeding a critical value leads to the triggering of the disease.
  • Detection with the oligonucleotide probe composition according to the invention is also successful even if strain varieties are present which differ from the type strains in individual highly variable rRNA sections. The detection with the probes according to the invention is not only quick, but is also robust and highly specific.
  • Another object of the present invention is a method for the detection of periodontopathogenic bacteria by in situ hybridization, comprising the following steps: a) fixing the bacteria contained in the sample; b) incubating the fixed bacteria with at least one oligonucleotide probe according to the invention described above, preferably with an oligonucleotide probe composition according to the invention described above; c) detecting and, if necessary, quantifying the hybridized bacterial cells.
  • the bacteria are preferably immobilized on a slide after being fixed, particularly preferably by drying or by filtration.
  • the fixation is preferably carried out by denaturing reagents, for example selected from the group consisting of ethanol, acetone and ethanol
  • Acetic acid mixtures, and / or by crosslinking reagents for example selected from the group consisting of formaldehyde, paraformaldehyde and glutaraldehyde.
  • the fixation is carried out by heat.
  • fixation of the bacteria is generally understood to mean a treatment with which the bacterial envelope is made permeable to nucleic acid probes. Ethanol is usually used for fixation. If the cell wall cannot be removed from the nucleic acid with these measures, are penetrated, the person skilled in the art is sufficiently aware of further measures which lead to the same result. These include, for example, methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution, enzymatic treatments or the like.
  • the oligonucleotide probes are covalently linked to a detectable marker.
  • the detectable marker is preferably selected from the group consisting of: a) fluorescent marker; b) chemiluminescent markers; c) radioactive marker; d) enzymatically active group; e) hapten; f) nucleic acid detectable by hybridization.
  • the enzymatic marker is selected in particular from the group consisting of peroxidase, preferably horseradish peroxidase, and phosphatase, preferably alkaline phosphatase.
  • peroxidase preferably horseradish peroxidase
  • phosphatase preferably alkaline phosphatase.
  • a detection system based on an enzyme reaction enables light microscopic detection of bacteria, which considerably reduces the initial costs for an analysis device.
  • the informative value of this detection system can be verified through its use suitable counterstaining agent significantly increase.
  • Carrying out a normal hematoxylin-eosin staining following an in situ hybridization with peroxidase-labeled oligonucleotides allows the number and proportion of specific bacteria to be determined, but also the number of relevant immune cells and possible spatial associations with certain bacterial groups.
  • there are significantly improved automation possibilities with regard to the detection system so that detection independent of a microscope is possible.
  • Such a detection system could, for example, be carried out in microtitre plates with a commercially available chromogenic peroxidase substrate.
  • the described technique will not only make microbial diagnostics significantly easier in special examination laboratories and at the local dentists, but will also provide new insights into the research of this infectious disease.
  • the fixed cells may also be advantageous for the fixed cells to be permeabilized before the incubation.
  • the cell envelope is perforated, but, unlike lysis, is not destroyed.
  • the cell's physiological integrity is preserved. Macromolecules such as DNA, RNA and ribosomes remain in the cell. Permeabilization may be necessary in order to ensure, for example, an effective penetration of probes, which are labeled with enzyme molecules that are large compared to fluorescent dyes, into the cell and thus the subsequent binding to ribosomes.
  • the permeabilization can preferably take place by partial degradation by means of cell wall lytic enzymes, in particular selected from the group consisting of proteinase K, pronase, lysozyme and mutanolysin.
  • the present invention further provides a kit for carrying out the method according to the invention described above, comprising at least one hybridization buffer and at least one oligonucleotide probe according to the invention, preferably an oligonucleotide probe composition according to the invention.
  • the method according to the invention described above is an in situ hybridization method which is based on the detection of ribosomal RNA.
  • the following steps are performed:
  • the bacteria removed using the various methods are then introduced into a suitable fixation medium in order to kill the bacteria and to prevent degradation of ribosomal RNA.
  • a suitable fixation medium in order to kill the bacteria and to prevent degradation of ribosomal RNA.
  • denaturing reagents such as ethanol, acetone or ethanol-acetic acid mixtures
  • crosslinking reagents such as formaldehyde, paraformaldehyde or glutaraldehyde
  • Mixtures of the two groups of fixatives e.g. ethanol together with formaldehyde
  • fixatives e.g. ethanol together with formaldehyde
  • the removed bacteria can also be eluted directly into a drop of water on a slide.
  • the bacteria are then heat-fixed over an open flame, e.g. a Bunsen burner, or in a temperature-controlled incubation cabinet, e.g. at 80 ° C, fixed and simultaneously immobilized on a slide. Fixed samples can be stored and possibly transported without further special devices until they are examined.
  • the fixed samples are then immobilized by drying on a slide unless heat fixation has been carried out.
  • filtration processes can also be used for immobilization.
  • a membrane filter larger amounts of sample volume are applied to a filter.
  • Polycarbonate membranes are preferably used for this purpose are then hybridized analogously to the samples immobilized on slides.
  • EtOH series (e.g. 50%, 80% and 96% ethanol for every 3 minutes) follows the immobilization.
  • the enzymes ProteinaseK and Lysozyme in the form shown in Example 3 are particularly suitable for permeabilization of the cell walls.
  • various chemical reagents e.g. 1N HC1 or detergents
  • 1N HC1 or detergents can also be used to permeabilize individual bacterial cells.
  • another ascending ethanol series is carried out.
  • the nucleic acid probe is incubated with the microorganism fixed in the abovementioned sense, in order to enable the nucleic acid probe molecules to penetrate into the microorganism and the hybridization of nucleic acid probe molecules with the nucleic acids of the microorganism.
  • the non-hybridized nucleic acid probe molecules are then removed by conventional washing steps.
  • the specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells.
  • the prerequisite for this is that the nucleic acid probe molecule can be detected, for example by the nucleic acid probe molecule being linked to a marker by covalent binding.
  • detectable markers are, for example, fluorescent groups such as CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (also available from Amersham Life Sciences), CY5 (also available from Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (available from Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), TRITC (available from Molecular Probes Inc.
  • chromogens are known for each of these enzymes, which can be converted instead of the natural substrate and can be converted into either colored or fluorescent products. Examples of such chromogens are given in the table below:
  • nucleic acid probe molecules so that at their 5 'or 3' end there is another nucleic acid suitable for hybridization. sequence is present.
  • This nucleic acid sequence again comprises approximately 15 to 1000, preferably 15-50 nucleotides.
  • This second nucleic acid region can again be recognized by an oligonucleotide probe which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable nucleic acid probe molecules with a hapten. After detachment of the nucleic acid probe molecules from the target nucleic acid, the nucleic acid probe molecules now isolated can be brought into contact with antibodies that recognize the hapten. Digoxygenin or its derivatives can be cited as an example of such a hapten. In addition to the examples given, those skilled in the art are also well known.
  • the hybridization is carried out as standard on slides, on filters, on a microtitre plate or in a reaction vessel.
  • the evaluation depends on the type of marking of the probe used and can be carried out with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer, flow cytometer and the like.
  • the kit according to the invention particularly preferably contains the following specific probes for the detection of periodontopathogens:
  • AACT1 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3 'AACT2: 5 , -AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' Probes that detect strains of the Porphyromonas gingivalis species
  • PGBSfl 5 * -CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3 * PGIN2: 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3 'PGIN3: 5'- CGG-TTA-CGC -CCT-TCA-GGT-3 '
  • BFOR1 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3 'BFOR2: 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
  • BFOR3 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3 'BFOR4: 5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3' BFOR5: 5'-TGA -CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3 'BFOR6: 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3'
  • PINT1 S'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-S 'P ⁇ NT2: 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'
  • PINT3 5 * -TGT-ATC-CTG-CGT -CTG-CAA-TT-3
  • PINT4 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3
  • PINT5 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3 * PINT ⁇ ⁇ ' TCC CCA TCC TCC ACC GAT GA-S '
  • the probe molecules according to the invention can be used with various hybridization solutions as part of the detection method.
  • Various organic solvents can be used in concentrations from 0% to 80%.
  • formamide is preferably used in a Concentration of 20% to 60%, particularly preferably used in a concentration of 20% in the hybridization buffer.
  • a salt preferably sodium chloride, is in a concentration of 0.1 mol / 1 to 1.5 mol / 1, preferably 0.5 mol / 1 to 1.0 mol 1 and more preferably 0.7 mol / 1 to 0.9 mol / 1 and most preferably 0.9 mol / 1 contained in the hybridization buffer.
  • Tris / HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES buffer can be used to buffer the hybridization buffer, which range from 0.01 mol / 1 to 0.1 mol / 1, preferably from 0.01 mol / 1 up to 0.08 mol / 1 and particularly preferably from 0.02 mol / 1.
  • the pH is generally in the range from 6.0 to 9.0, preferably from 7.0 to 8.0.
  • the hybridization buffer preferably has 0.02 mol / l
  • detergents such as Triton X or sodium dodecyl sulphate (SDS) are usually present in a concentration of 0.001% to 0.2%, preferably 0.005% to 0.1%.
  • a particularly preferred hybridization buffer contains 0.01% SDS.
  • additives can be used for various problems, such as unlabeled nucleic acid fragments (e.g. fragmented salmon sperm DNA, unlabeled oligonucleotides, etc.) or molecules that accelerate the reaction due to a narrowing of the reaction space
  • unlabeled nucleic acid fragments e.g. fragmented salmon sperm DNA, unlabeled oligonucleotides, etc.
  • Hybridization reaction can lead (polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, dextran sulfate, etc.).
  • Such additives are added to the hybridization buffer by the person skilled in the art in the known and customary concentrations.
  • nucleic acid molecule enables specific detection of nucleic acid sequences from target organisms and can therefore be used reliably in the context of the invention.
  • the person skilled in the art is able, by changing the parameters of the hybridization buffer, to increase or decrease the stringency if necessary or depending on the probe or target organism.
  • the concentration of the nucleic acid probe in the hybridization buffer depends on the type of its labeling and the number of target structures. To enable fast and efficient hybridization, the number of nucleic acid probe molecules should exceed the number of target structures by several orders of magnitude. However, with fluorescence in situ hybridization (FISH) care must be taken to ensure that an excessive amount of fluorescence-labeled nucleic acid probe molecules leads to increased background fluorescence.
  • the concentration of the nucleic acid probe molecules should therefore be in a range between 0.5-500 ng / ⁇ l, preferably between 1.0-100 ng / ⁇ l and particularly preferably between 1.0-50 ng / ⁇ l.
  • the preferred concentration in the context of the method according to the invention is 1-10 ng of each nucleic acid probe molecule used per ⁇ l hybridization solution.
  • the volume of the hybridization solution used should be between 8 ⁇ l and 100 ml, in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention it is 30 ⁇ l.
  • the duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours.
  • the hybridization temperature is preferably between 44 ° C. and 48 ° C., particularly preferably 46 ° C., the parameter of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and detergents in the hybridization solution, depending on the nucleic acid probes, in particular their lengths and the degree of complementarity can be optimized for the target sequence in the cell to be detected.
  • the person skilled in the art is familiar with the relevant calculations here.
  • this washing solution can contain 0.001-0.1% of a detergent such as SDS, preferably 0.005-0.05%, particularly preferably 0.01%, and Tris / HCl in a concentration of 0.001-0.1 mol / 1. preferably 0.01 - 0.05 mol / 1, particularly preferably 0.02 mol 1, the pH of Tris / HCl in the range from 6.0 to 9.0, preferably from 7.0 to 8.0 , is particularly preferably 8.0.
  • a detergent may be included, but is not essential.
  • the washing solution usually also contains NaCl, the concentration depending on the stringency required being from 0.003 mol / 1 to 0.9 mol / 1, preferably from 0.01 mol / 1 to 0.9 mol / 1.
  • An NaCl concentration of about 0.215 mol / l is particularly preferred.
  • the washing solution can contain EDTA, the concentration preferably being 0-0.005 mol / 1.
  • the washing solution may also contain suitable amounts of preservatives familiar to those skilled in the art.
  • buffer solutions are used in the washing step, which in principle can look very similar to hybridization buffers (buffered sodium chloride solution), only that the washing step is usually carried out in a buffer with a lower salt concentration or at a higher temperature.
  • hybridization buffers buffered sodium chloride solution
  • Td dissociation temperature in ° C
  • the formamide content (which should be as low as possible due to the toxicity of the formamide) of the wash buffer can be replaced by a correspondingly lower sodium chloride content.
  • the “washing off” of the unbound nucleic acid probe molecules usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C. to 52 ° C., preferably from 44 ° C. to 50 ° C. and particularly preferably at 46 ° C. for a period of 10-40 minutes, preferably for 15 minutes.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are used in the so-called Fast-FISH method for the specific detection of the specified target organisms.
  • the Fast FISH method is known to the person skilled in the art and e.g. described in patent applications DE 199 36 875 and WO 99/18234. Reference is hereby expressly made to these documents with regard to their disclosure for carrying out the verification process described there.
  • kits for carrying out the corresponding methods are also provided.
  • the hybridization arrangement included in these kits is e.g. described in German patent application 100 61 655.0. Reference is hereby expressly made to the disclosure contained in this document with respect to the in situ hybridization arrangement.
  • kits comprise, as the most important component, the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected (so-called VIT solution).
  • VIT solution the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected
  • the corresponding hybridization buffer which corresponds to the hybridization solution without probe molecules
  • a concentrate of the corresponding washing solution are also contained in each case.
  • fixing solutions 50% ethanol, absolute ethanol
  • an embedding solution finishingers are commercially available, among other things they prevent the rapid fading of fluorescent probes under the fluorescence microscope. If necessary, solutions for parallel execution of a positive control (positive control) and a negative control (negative control) are included.
  • Example 1 Specific detection of A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, B. forsythus and P. intermedia
  • the supernatant was discarded and the pellet was washed in the 1 x PBS (starting volume). After another centrifugation step (conditions as above), the cells were taken up in a 1: 1 mixture of EtOH / PBS and stored at -20 ° C. until use.
  • hybridization took place in a moist chamber, which was equilibrated with hybridization buffer. The hybridization time was at least 90 minutes. To remove the unbound probe, the hybridized slide was placed in a 50 ml tube with washing buffer (0.215 mol / 1 NaCl, 0.02 mol / 1 Tris / HCl pH 8.0, 0.01% SDS) and 15 minutes at 48 ° C incubated.
  • washing buffer 0.15 mol / 1 NaCl, 0.02 mol / 1 Tris / HCl pH 8.0, 0.01% SDS
  • the fully hybridized slides were covered with a suitable embedding medium and then analyzed by fluorescence microscopy.
  • Table 2 shows the reference strains used and the results obtained with the probes according to the invention.
  • the periodontal samples were taken either with a sealer or with a sterile paper tip provided for this purpose. If a sealer was used, the sealer was stirred in the fixative solution (4% formaldehyde solution in 1 x PBS) after removing bacterial plaque from the gum pocket until the bacterial deposits adhering to it were completely suspended in 200 ⁇ l fixative solution. Sampling was done with sterile
  • Paper tips were to be aseptically removed from the packaging and, after appropriate preparation by the patient (drying of the appropriate area, removal of supragingival plaque), introduced into the periodontal pocket to be sampled. The paper tip remained there for 10-20 seconds, was then removed and transferred to a test tube with 200 ⁇ l of fixing solution. In this state, the paper tip was sent to the investigation laboratory. There the fixative solution was mixed with 1/10 volume of a 1% TritonX-100 solution and shaken well for 2 x 30 seconds in order to elute the bacteria from the paper tip.
  • the mixture was then centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, the pellet was washed as described in Example 1 and the bacteria were finally transferred to 60 ⁇ l of a 1: 1 mixture of ethanol and PBS.
  • the bacteria in the sample can be stored in this solution at - 20 ° C for at least 3 months.
  • the samples could then be examined in a suitable embedding medium (Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London, UK; Vectashild, Vector laboratories, Burlingame, USA) using a fluorescence microscope.
  • a suitable embedding medium (Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London, UK; Vectashild, Vector laboratories, Burlingame, USA) using a fluorescence microscope.
  • Example 3 Detection of periodontopathogenic bacteria with oligonucleotide probes which are labeled with horseradish peroxidase
  • the periodontal samples were taken, fixed and immobilized on the slides as described in Example 2.
  • the cells present in the sample were then permeabilized by incubation for 15 minutes in a 10 ⁇ g / ml ProteinaseK solution or in a 250 ⁇ g / ml lysozyme solution.
  • the enzyme reaction was stopped by an ascending ethanol series (50%, 80%, 100%, 3 min each).
  • the hybridization was carried out as described in Example 1, but in a buffer which contains 40% formamide instead of 20% formamide. In addition, the hybridization was carried out at 35 ° C. After 90 minutes, the slide was removed from the moist chamber and placed in a wash buffer POD (0.056 mol / 1 NaCl; 0.05 mol / 1 EDTA, 0.02 mol / 1 Tris / HCl pH 8.0; 0.01% SDS) for 15 minutes at 37 ° C. The hybridized sample was then covered with a diaminobenzidine-containing substrate solution for 10 minutes.
  • a tablet containing diaminobenzidine and a tablet containing H 2 O 2 from the SIGMA FAST DAB tablet sets were dissolved in 1 ml of substrate buffer (0.15 mol / 1 NaCl; 0.1 mol / 1 Tris / HCl pH 8.0). After the tablets had completely dissolved in the substrate buffer, 10 ⁇ l of this finished substrate solution were added to the hybridized samples and incubated for 10 minutes at RT. The sample was then rinsed with 1 ⁇ PBS and microscoped either immediately or after a suitable counter-staining.
  • a suitable counterstain was a HE stain, which was prepared in the following way.
  • the moist, hybridized slides were immersed in a glass cuvette, which is filled with hemalum (Merk, Germany, Item No. 1.09249.0500).
  • the slides were rinsed briefly in distilled water and then exposed to cold tap water flowing for blue for 10 minutes. Then the slide was immersed in a cuvette with eosin for 3-5 minutes. Then the slides were briefly in 90% and then in absolute

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Abstract

Die Erfindung betrifft Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung, Oligonukleotidsonden-Zusammensetzungen zum Nachweis derartiger parodontopathogener Bakterien, Verfahren zum sicheren Nachweis von parodontopathogenen Bakterien in humanen Proben aus dem Mundbereich sowie Kits zur Durchführung derartiger Verfahren.

Description

Oligonukleotidsonden zur Detektion von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung
Die Erfindung betrifft Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung, Oligonukleotid- sonden-Zusammensetzungen zum Nachweis derartiger parodontopathogener Bakterien, Verfahren zum sicheren Nachweis von parodontopathogenen Bakterien in humanen Proben aus dem Mundbereich sowie Kits zur Durchführung derartiger Verfahren.
Trotz Verbesserungen bei der Mundhygiene und neuer therapeutischer Verfahren ist die Parodontitis, auch Parodontose genannt, nach wie vor eine weitverbreitete Krankheit. Nach der Deutschen Mundgesundheitsstudie 1999 lassen sich bei 14,1 % der Altersgruppe 35 - 44 Jahre schwere Parodontopathien nachweisen. Unter den 65 - 74-jährigen weist sogar jeder 4. eine schwere Parodontitis auf.
Ursache für den fortschreitenden Abbau des Zahnhalteapparates, der bei Nichtbehandlung unweigerlich mit dem Verlust der befallenen Zähne endet, sind bakterielle Beläge, sog. Plaque, im Zahn und Wurzelbereich. Während früher davon ausgegangen wurde, daß die Zunahme an bakterieller Plaque allgemein für die Entstehung der Parodontitis verantwortlich ist (unspezifische Plaque-Hypothese), ist mittlerweile aus einer Reihe von fundierten Untersuchungen bekannt, daß nur wenige der weit über 500 bakteriellen Spezies im Mundraum mit der Entstehung von Parodontitis assoziiert sind. Besonders stark in die Entstehung dieser Krankheit involviert sind Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia und Bacteroides forsythus (Slots, J., M. Ting, Periodontol. 2000, 20: 82-121; Socransky, S. S., A. D. Haffajee, L. A. Ximenez-Fyvie, M. Feres, D. Mager, Periodontol. 2000, 20: 341-62; Carlos, J. P., M. D. Wolfe, J. J. Zambon, A. Kingman, J. Dent. Res. 1988, 67: 1510- 4; Lai, C. H., M. A. Listgarten, M. Shirakawa, J. Slots, Oral Microbiol. Immunol.
1987, 2: 152-7; Gmur, R., J. R. Strub, B. Guggenheim, J. Periodontal. Res. 1989, 24: 113-20). Ein wesentlicher parodontopathoger Keim ist ferner Actinobacillus actinomycetemcomitans, der vor allem bei aggressiven Verlaufsformen der Parodontitis zu finden ist (Slots, J., M. Ting, Periodontol. 2000, 20: 82-121).
Während diese Bakterien auch bei Gesunden in geringen Zahlen vorkommen, kommt es beim Überschreiten eines bestimmten Schwellenwertes zur Auslösung des Krankheitsgeschehens. D.h. erst wenn der Anteil parodontopathogener Bakterien einen definierten Anteil an der Gesamtflora ausmacht, kommt es bei entsprechender Prädisposition des Wirtes zu einer Parodontitis.
Zum Nachweis relevanter Mikroorganismen stehen mittlerweile eine Reihe von Möglichkeiten zur Verfugung. Als Standardmethode gilt der kulturelle Nachweis dieser Bakterien mittels künstlicher Nährmedien. Diese Methode erlaubt sowohl die Quantifizierung als auch eine Bestimmung des Anteils der relevanten Bakterien an der kultivierbaren Mikroflora der parodontalen Probe. Da es sich allerdings bei den parodontopathogenen Bakterien um anaerobe und mikroaerophile Organismen handelt, die hinsichtlich ihrer Anzuchtbedingungen sehr spezielle Ansprüche stellen, müssen für die Probenahme, die Verarbeitung des Materials und die Anzüchtung dieser Organismen spezielle Verfahren und Geräte, insbesondere die Anaerobier- technik verwendet werden. Ein derartiger Nachweis dieser parodontalen Leitkeime durch Kultivierung ist nicht nur personal- und arbeitsintensiv, sondern dauert mit durchschnittlich 10 bis 14 Tage auch vergleichsweise lange.
Die Verwendung von immunologischen Methoden ist für die Detektion von parodontopathogenen Bakterien ebenfalls prinzipiell geeignet (Bonta, Y., J. J.
Zambon, R. J. Genco, M. E. Neiders, J Dent Res. 1985, 64: 793-8). Das Auftreten von Kreuzreaktivitäten führt bei dieser Methode allerdings häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Bei der Verwendung von molekularbiologischen Methoden gibt es prinzipiell zwei verschiedene Möglichkeiten, nämlich zum einen Hybridisierungstechniken, die direkt die Nukleinsäure von parodontopathogenen Bakterien detektieren und zum anderen Amplifikationstechniken (z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Transcription-Mediated-Amplification-Techniken (TMA)), die bestimmte Erbsubstanzabschnitte von parodontalen Leitkeimen spezifisch vervielfältigen (Chen, C, J. Slots, Periodontol. 2000, 20: 53-64).
Mit Amplifikationstechniken lassen sich hochsensitiv und spezifisch Bakterien nachweisen. Allerdings sind diese Methoden, die alle auf einer enzymabhängigen Vervielfältigung beruhen, mit einer Reihe von Nachteilen behaftet, die ihre Umsetzung in der Routine behindern: a) In der Probe vorhandene Inhibitorsubstanzen wie z.B. die Häm-Gruppe des Hämoglobins können eine Amplifikation be- oder sogar verhindern. b) Aufgrund der millionenfachen Vervielfältigung von Erbsubstanz ist die Gefahr von Kreuzkontaminationen hoch. Um dies zu vermeiden, sind aufwendige Schutzmaßnahmen erforderlich. c) Der personelle und apparative Aufwand ist beträchtlich. d) In der Regel sind mit Amplifikationstechniken nur qualitative und keine quantitativen Aussagen möglich. e) Freie, nicht zellassoziierte DNA wird ebenfalls nachgewiesen, d.h. es erfolgt auch dann ein positiver Nachweis, wenn die nachzuweisenden Organismen tot sind.
Routinefähiger scheinen hier direkte Hybridisierungstechniken zu sein, da sie eine robuste und einfache Anwendung mit spezifischer und sensitiver Detektion verbinden. Das große Problem der Hybridisierungstechniken im Zusammenhang mit parodontopathogenen Bakterien ist allerdings, daß eine verlässliche Quantifizierung der Bakterien nur schwer möglich ist.
Eine Ausnahme stellt diesbezüglich die rRNA-gerichtete in situ-Hybridisierung dar. Mit dieser Technik lassen sich durch den gezielten Einsatz von verschiedenen Sonden nicht nur die Anzahl spezieller Mikroorganismen bestimmen, sondern auch kulturunabhängig deren Anteil an der Gesamtflora. Dies ist aufgrund des erforderlichen Schwellenwertes zur Auslösung von Parodontitis essentiell für eine aussagekräftige mikrobielle Diagnostik.
Zudem erlaubt beispielsweise die Detektion der in situ-Hybridisierung durch Fluoreszenz über die Helligkeit des Signals eine Aussage über die physiologische Aktivität der Bakterien und dient so zur Unterscheidung der inaktiven Bakterien, wie beispielsweise potentiellen Kontaminanten von anderen Mundbereichen, von der physiologisch aktiven Subgingivalflora.
Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, daß die Bakterien in situ nachgewiesen werden können. So werden über die räumliche Assoziation der Bakterien miteinander oder durch Co-Lokalisation mit Immunzellen wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese der Parodontitis gewonnen.
Die einfache und schnelle Durchführbarkeit prädestiniert diese Methode für einen Routineeinsatz in einem Diagnostiklabor oder in der Zahnarztpraxis selbst. Erste Erfahrungen mit dem Verfahren der in situ-Hybridisierung zur Diagnostik von parodontopathogenen Mikroorganismen sind bekannt. So konnten Gersdorf et al. (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993, 6: 109-14) bereits P. gingivalis und B. forsythus mit fluoreszenzmarkierten Sonden nachweisen. Durch Moter et al. (J. Clin. Microbiol. 1998, 36: 1399-403) wurden schwer und nicht kultivierbare Spirochäten mit dieser Technik nachgewiesen. Die bekannten Sonden zum spezifischen Nachweis von P. gingivalis und B. forsythus mittels in situ-Hybridisierung weisen allerdings eine relativ geringe Sensitivität auf.
Ferner sind die im Stand der Technik offenbarten Sondensysteme für die in situ- Hybridisierung unvollständig. So werden die wichtigen parodontopathogenen Mikroorganismen A. actinomycetemcomitans und P. intermedia nicht spezifisch erfaßt. Bereits bekannte spezifische Sonden für A. actinomycetemcomitans und P. intermedia, die aufgrund ihrer Primärstruktur verwendet werden könnten, sind z.T. für das Verfahren der in situ-Hybridisierung nicht geeignet, da ein Binden der Sonden an die native, ribosomale RNA durch ribosomale Proteine, die Bindungsstellen blockieren, oder blockierende Sekundärstrukturen in der rRNA verhindert wird.
Ferner weisen die bekannten, auf nur einer Hybridisierungssonde beruhenden Systeme eine relativ geringe Sensitivität auf. Parodontopathogene Leitkeime mit geringen Ribosomenzahlen lassen sich deshalb mit den im Stand der Technik beschriebenen Oligonukleotidsonden nicht oder nur schwer detektieren. Zudem kann das Vorliegen von Stamm-Stamm-Sequenz- Variabilität bei Verwendung von Systemen, die lediglich auf einer Hybridisierungssonde beruhen, dazu führen, daß es in den hoch variablen Sondenzielregionen zu Fehlpaarungen kommt. Dadurch entstehen falsch negative Ergebnisse.
Ein weiterer Nachteil der in situ-Hybridisierung zum Nachweis von parodonto- pathogenen Bakterien gemäß dem Stand der Technik ist, daß die Auswertung aufgrund der geringen Sensitivität nur mit einem teuren Fluoreszenzmikroskop erfolgen kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, unter Überwindung der Nachteile des Standes der Technik Oligonukleotidsonden bereitzustellen, die zum in situ- Nachweis von für die Entstehung von Parodontitis relevanten Bakterien mit sowohl hoher Spezifität als auch hoher Sensitivität geeignet sind. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles und kostengünstiges Verfahren bereitzustellen, mit dem parodontale Leitkeime in humanen Proben aus dem Mundbereich sicher nachgewiesen werden können.
Weitere Aufgaben ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.
Die oben genannten Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.
Erfindungsgemäß werden Oligonukleotidsonden bereitgestellt, die zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Arten Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus und Prevotella intermedia geeignet sind. Die Sequenzen der erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind in dem beigefügten Sequenzprotokoll mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-17 zusammengestellt. Darin entspricht
SEQ ID No. 1, 2 = AACT1, AACT2 SEQ ID No. 3-SEQ ID No. 5 = PGIN1-PGIN3 SEQ ID NO. 6-SEQ ID No. 11 = BFOR1-BFOR6 SEQ ID NO. 12-SEQ ID No. 17 = PINT1-PINT6.
Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Actinobacillus actinomycetemcomitans sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3' 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.
Ferner werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Porphyromonas gingivalis sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3' S'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-S1 5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3* oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser
Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt. Des weiteren werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen
Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Bacteroides forsythus sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) DNA-Sequenz, umfassend
5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3* 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3'
5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'
5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären
Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser
Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.
Schließlich werden erfindungsgemäß Oligonukleotidsonden zum artspezifischen
Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia durch in situ-Hybridisierung bereitgestellt, wobei die Oligonukleotidsonden komplementär zur rRNA von Prevotella intermedia sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) DNA-Sequenz, umfassend
S'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-S"
5'-TGC-GTG-C AC-TCA-AGT-CCG-3 ' 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3' 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.
Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität der molekularbiologischen Methoden wie der PCR mit der Möglichkeit der Bakterienvisualisierung, wie sie die Antikörper- Methoden ermöglichen, zu verbinden, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ- Hybridisierung (FISH; Amann, R. I, W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995.
Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, - gattungen oder -gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert werden.
Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und funktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C. R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271). Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Im Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht.
Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszuführen, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen.
Bei der FISH (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i.d.R. kleine, 16-28 Basen lange, einzelsträngige Desoxyribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.
Die FISH- Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgeführt, da bei der Auswertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden. Die Analyse kann alternativ auch auf einer Mikrotiterplatte erfolgen.
Die Durchführung der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zum spezifischen Nachweis von parontopathogenen Bakterien umfasst allgemein die folgenden Schritte:
- Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien
- Inkubation der fixierten Bakterien mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen, - Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle und
- Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.
Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 - 100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000 - 50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden besonders bevorzugt gegen die 16S rRNA der nachzuweisenden parontopathogenen Bakterien gerichtet.
Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200 und zwischen 12 und 100, besonders bevorzugt zwischen 12 und 50 und zwischen 14 und 40 und zwischen 15 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Als Zielregion für komplementäre Nukleinsäuresonden werden solche Bereiche ausgewählt, die zwar bei der Zielgruppe, beispielsweise bei allen Stämmen einer Spezies, vorkommen, nicht aber bei anderen Mikroorganismen. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.
Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotid- sequenzen, die trotz der Abweichungen in der Sequenz und/oder Länge eine spezifische Hybridisierung mit Ziel-Nukleinsäuresequenzen des jeweiligen Bakteriums zeigen und somit für den Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Hierunter fallen insbesondere a) Nukleinsäuremoleküle, die (i) mit einer der obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 17) in mindestens 60%, 65%, bevorzugt in mindestens 70%, 75%, bevorzugter in mindestens 80 %, 84%, 87% und besonders bevorzugt in mindestens 90 %, 94%, 96%, der Basen übereinstimmen (wobei der Sequenzbereich des Nukleinsäuremoleküls zu betrachten ist, der dem Sequenzbereich eines der oben angegebenen Oligonukleotide (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 17) entspricht, und nicht etwa die gesamte Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das u.U. im Vergleich zu den oben angegebenen Oligonukleotiden (SEQ ID No. 1 bis
SEQ ID No. 17) um eine bis zahlreiche Basen verlängert ist) oder (ii) sich von obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 17) durch eine oder mehrere Deletionen und/oder Additionen unterscheiden und die eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Bakterien der Arten Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus und Prevotella intermedia ermöglichen. Dabei bedeutet „spezifische Hybridisierung", dass unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-Hybridisierungstechniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel-Organismen, nicht aber die rRNA von NichtZiel-Organismen an das Oligonukleotid bindet. b) Nukleinsäuremoleküle, die mit einer Sequenz, die zu einem der unter a) genannten Nukleinsäuremoleküle oder zu einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis
SEQ ID NO. 17 komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. c) Nukleinsäuremoleküle, die eine Oligonukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 17 oder die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach a) oder b) umfassen und zusätzlich zu den genannten Sequenzen bzw. deren
Abwandlungen nach a) oder b) mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen, und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Ziel- Organismen ermöglichen.
Der Grad der Sequenzidentität eines Nukleinsäuremoleküls mit den Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 17 kann mit üblichen Algorithmen bestimmt werden. Geeignet ist hier beispielsweise das Programm zur Bestimmung der Sequenzidentität, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (auf dieser Seite z.B. der Link „Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle können im Rahmen des Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Je nachdem ob stringente oder moderate Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, erfolgt die Bindung der Nukleinsäuresonde an eine 100 % komplementäre Zielstelle oder an eine Zielstelle mit einer oder mehreren Fehlpaarungen.
Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0 - 80%> eingesetzt werden. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0% Formamid in einem wie in Beispiel 1 beschriebenen Hybridisierungspuffer. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer.
Unter Teilen oder Derivaten der Nukleinsäuresequenz werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Oligonukleotidsonden verstanden, die sich von den vorstehend genannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen durch Deletion und/oder Addition und/oder Mutation unterscheiden können oder die nur Teilbereiche dieser DNA-Sequenzen aufweisen, wobei die Fähigkeit dieser Sonden, mit für die vorstehend genannten Bakterien spezifischer rRNA zu hybridisieren, erhalten bleibt.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Oligonukleotid- sonden-Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien bereitgestellt, umfassend: i) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend
5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3' 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfasst, und/oder ii) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art
Porphyromonas gingivalis, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend
S'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-S'
5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3'
5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären
Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser
Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfasst, und/oder iii) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-C AA-ACT-TTC- ACC-GCG-G-3 ' 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3' 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser
Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfasst, und/oder iv) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5*-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'
5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3'
5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3'
5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3'
5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; c) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz von b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Oligonukleotidsonden- Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien i) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CAT-CAG-CGT-C AG-TAC-ATC-C-3 '
5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' und/oder ii) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis aus der Gruppe bestehend aus
5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3'
5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3'
5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3' und/oder iii) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus aus der Gruppe, bestehend aus
5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3' 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3'
5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'
5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' und/oder iv) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia aus der Gruppe bestehend aus
5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3* 5--TCC-CC A-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3 '.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die erfindungsgemäße Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung zum spezifischen Nachweis von parontopathogenen Bakterien sämtliche vorstehend genannten erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 1-17.
Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden- Zusammensetzungen lassen sich parodontale Leitkeime mit hoher Sensitivität nachweisen, selbst wenn diese nur wenige Ribosomen beherbergen. Somit ist gewährleistet, daß die entsprechenden Pathogene in parodontalen Proben auch dann detektiert werden können, wenn sie in niedrig aktivem Zustand vorliegen. Damit lassen sich mit den erfindungsgemäßen Sonden-Zusammensetzungen erstmals parodontopathogene Bakterien quantitativ in einer subgingivalen Probe nachweisen, selbst wenn die Ribosomenzahl der Bakterien unterhalb der mit einer einfach fluoreszenzmarkierten Sonde nachweisbaren Zahl befindlichen Schwelle liegt.
Zudem lässt sich anders als bei allen aus dem Stand der Technik bekannten Sonden durch den Einsatz der vorstehend beschriebenen Sonden beispielsweise in Kombination mit einem bakterienfärbenden Farbstoff schnell der Anteil eines bestimmten krankheitsrelevanten Bakteriums an der mikrobiellen Gesamtflora bestimmen. Dies ist von großer diagnostischer Bedeutung, da das Überschreiten eines kritischen Wertes zur Auslösung der Krankheit führt. Anders als bei Kulturtechniken werden nicht nur kultivierbare Bakterien detektiert, sondern alle in einer Probe vorhandenen Bakterien. Die Detektion mit der erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung gelingt ferner auch dann, wenn Stammvarietäten vorliegen, die sich in einzelnen hochvariablen rRNA-Abschnitten von den Typstämmen unterscheiden. Der Nachweis mit den erfindungsgemäßen Sonden gelingt nicht nur schnell, sondern ist auch robust und hochspezifisch.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, umfassend die folgenden Schritte: a) Fixieren der in der Probe enthaltenen Bakterien; b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einer vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonde, vorzugsweise mit einer vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung; c) Detektieren und ggf. Quantifizieren der hybridisierten bakteriellen Zellen.
Vorzugsweise werden die Bakterien nach dem Fixieren auf einem Objektträger immobilisiert, besonders bevorzugt durch Trocknung oder durch Filtration.
Die Fixierung erfolgt vorzugsweise durch denaturierende Reagenzien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-
Essigsäuremischungen, und/oder durch quervernetzende Reagenzien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd. Alternativ erfolgt die Fixierung durch Hitze.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Bakterien allgemein eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäure- sonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niedeφrozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung, enzymatische Behandlungen oder ähnliches.
Femer ist es bevorzugt, wenn die Oligonukleotidsonden kovalent mit einem detektierbaren Marker verbunden sind. Der detektierbare Marker wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Fluoreszenzmarker; b) Chemolumineszenzmarker; c) radioaktiver Marker; d) enzymatisch aktive Gruppe; e) Hapten; f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.
Der enzymatische Marker wird insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meeπettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phophatase, ausgewählt. Somit kann die Detektion und Quantifizierung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in dieser speziellen Ausführungsform auch mittels eines einfachen Lichtmikroskopes erfolgen. Dazu werden erstmals Peroxidase-markierte Oligonukleotidsonden zum in situ-Nachweis von parodontopathogenen Bakterien eingesetzt.
Diese Ausfuhrungsform bietet gegenüber den herkömmlicherweise verwendeten Techniken eine Reihe von Vorteilen. Zum einen ist mit einem Nachweissystem, das auf einer Enzymreaktion beruht, eine lichtmikroskopische Detektion von Bakterien möglich, was die Anschaffungskosten für ein Analysegerät erheblich reduziert. Zudem lässt sich die Aussagekraft dieses Nachweissystems durch den Einsatz geeigneter Gegenfärbemittel noch deutlich steigern. Die Durchführung einer gewöhnlichen Hämatoxylin-Eosin-Färbung im Anschluß an eine in situ- Hybridisierung mit Peroxidase-markierten Oligonukleotiden erlaubt die Bestimmung von Anzahl und Anteil spezieller Bakterien, aber auch die Bestimmung der Anzahl von relevanten Immunzellen und eventuelle räumliche Assoziationen mit bestimmten bakteriellen Gruppen. Weiterhin ergeben sich bezüglich des Nachweissystems deutlich verbesserte Automatisierungsmöglichkeiten, so daß eine Mikroskopunabhängige Detektion möglich ist. Eine solches Nachweissystem könnte beispielsweise in Mikrotiteφlatten mit einem handelsüblichen chromogenen Peroxidasesubstrat durchgeführt werden.
Die beschriebene Technik wird nicht nur zu einer deutlichen Erleichterung der mikrobiellen Diagnostik in speziellen Untersuchungslaboratorien und bei den niedergelassenen Zahnärzten fuhren, sondern auch für neue Erkenntnisse bei der Erforschung dieser Infektionskrankheit sorgen.
Femer kann es vorteilhaft sein, daß die fixierten Zellen vor der Inkubation permeabilisiert werden. Bei einer Permeabilisierung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Zellhülle durchlöchert, aber im Unterschied zur Lyse nicht zerstört. Die moφhologische Integrität der Zelle bleibt erhalten. Makromoleküle wie DNA, RNA und Ribosomen verbleiben in der Zelle. Die Permeabilisierung kann notwendig sein, um z.B. ein effektives Eindringen von Sonden, die mit im Vergleich zu Fluoreszenzfarbstoffen großen Enzymmoleküle markiert sind, in die Zelle und damit das anschließende Binden an Ribosomen zu gewährleisten. Die Permeabilisierung kann vorzugsweise durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinase K, Pronase, Lysozym und Mutanolysin, erfolgen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend mindestens einen Hybridsierungspuffer sowie mindestens eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde, vorzugsweise eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonden- Zusammensetzung.
Bei dem vorstehend beschriebene erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein in situ-Hybridisierungsverfahren, das auf dem Nachweis von ribosomaler RNA be ht. Bei einer im folgenden ausführlich dargestellten speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden folgende Schritte durchgeführt:
1) Probenahme;
2) Fixierung der Probe;
3) ggf. Transport; 4) ggf. Konzentrierung;
5) Immobilisierung der Probe auf einem Träger;
6) Permeabilisierung der in der Probe enthaltenen bakteriellen Zellen;
7) Hybridisierung der Probe;
8) Waschen der Probe; 9) Detektion der hybridisierten Sonden.
Bei der Auswahl der Patienten bzw. betroffenen Stellen im Gebiß ist die klinische Erfahrung des behandelnden Arztes ausschlaggebend. Als Orientierungshilfe kann hier die Stellungnahme der Gesellschaft für Parodontologie und der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde zur mikrobiologischen
Diagnostik bei marginalen Parodontitiden von 1998 dienen. Es können entweder einzelne parodontale Taschen oder aber auch "Pool-Proben" von mehreren subgingivalen Stellen beprobt werden. Alternativ können mit der dargestellten Technik aber auch supragingivale Stellen oder andere Proben aus dem Mund- Rachenraum untersucht werden (z.B. Speichelproben). Zur Beprobung von subgingivalen Stellen werden entweder speziell dafür vorgesehene zahnärztliche Instrumente (z.B. Kürretten, Sealer u.a.) oder spezielle Papierspitzen, vorzugsweise ISO45 der Firma Alfred Becht (Offenburg; Deutschland) oder anderer Hersteller verwendet.
Die mit den verschiedenen Verfahren entnommenen Bakterien werden anschließend in ein geeignetes Fixierungsmedium eingebracht, um die Bakterien abzutöten und einen Abbau ribosomaler RNA zu verhindern. Dazu können prinzipiell entweder denaturierende Reagenzien, wie Ethanol, Aceton oder Ethanol-Essigsäure- mischungen, oder quervernetzende Reagenzien, wie Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd, verwendet werden. Auch Mischungen aus den beiden Fixierungsmittelgruppen (z.B. Ethanol zusammen mit Formaldehyd) sind einsetzbar.
Die entnommenen Bakterien können auch direkt in einen Wassertropfen eluiert werden, der sich auf einem Objektträger befindet. Die Bakterien werden dann mittels Hitzefixierung über einer offenen Flamme, z.B. einem Bunsenbrenner, oder in einem temperierbaren Inkubationsschrank, z.B. bei 80°C, fixiert und gleichzeitig auf einem Objektträger immobilisiert. Fixierte Proben lassen sich ohne weitere Spezialvor- richtungen bis zur Untersuchung lagern und eventuell transportieren.
Die fixierten Proben werden anschließend, sofern keine Hitzefixierung durchgeführt wurde, durch Trocknung auf einem Objektträger immobilisiert. Alternativ können zur Immobilisiemng auch Filtrationsverfahren verwendet werden. Mit Hilfe eines Membranfilters werden dabei auch größere Mengen Probenvolumen auf einen Filter aufgebracht. Vorzugsweise werden dazu Polycarbonatmembranen verwendet, die anschließend analog zu den auf Objektträgem immobilisierten Proben hybridisiert werden.
Optional schließt sich an die Immobilisiemng eine aufsteigende EtOH-Reihe an (z.B. 50%, 80% und 96% Ethanol für j e 3 Minuten) .
Bei der Verwendung von großen Markierungsmolekülen (z.B. Meerrettich- peroxidase, alkalische Phosphatase, u.a.) kann eine weitere Permeabilisierung der Bakterienzellwände vorteilhaft sein, um eine effektive Diffusion der markierten Sondenmoleküle in die bakterielle Zelle zu gewährleisten. Dazu können verschiedenen zellwandlytische Enzyme verwendet werden, z.B. ProteinaseK, Pronase, Lysozym, Mutanolysin und dergleichen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis der parodontopathogenen Bakterien A. actinomycetemcomitan, P. gingivalis, B. forsythus und P. intermedia sind vor allem die Enzyme ProteinaseK und Lysozym in der in Beispiel 3 gezeigten Form zur Permeabilisierung der Zellwände geeignet. Aber auch der Einsatz verschiedener chemischer Reagenzien (z.B. 1 N HC1 oder Detergenzien) können zu einer Permeabilisierung von einzelnen bakteriellen Zellen verwendet werden. Zum Abstoppen der Enzymreaktion wird eine weitere aufsteigende Ethanolreihe durchgeführt.
Erfindungsgemäß wird die Nukleinsäuresonde mit dem im obengenannten Sinne fixierten Mikroorganismus inkubiert, um so ein Eindringen der Nukleinsäuresonden- moleküle in den Mikroorganismus und die Hybridisierung von Nukleinsäuresonden- molekülen mit den Nukleinsäuren des Mikroorganismus zu ermöglichen.
Anschließend werden die nicht-hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle durch übliche Waschschritte entfernt. Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresondenmolekül nachweisbar ist, z.B. dadurch dass das Nukleinsäuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z.B. fluoreszierende Gmppen wie z.B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6-FAM oder FLUOS-PRIME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
Tabelle 1
Enzyme Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und 4-Methylumbelliferylphosphat (*), saure Phosphatase Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), (*) 3-O- Methylfluoreszein, Flavon-3- Diphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*), 3-(p-Hydroxyphenyl)- Propionsäure (*), p-Hydroxyphenethylalkohol(*), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (*), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothia- zolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase H2O2 + Diammoniumbenzidin H2O + Tetramethylbenzidin 4. ß-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau
* Fluoreszenz
Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, daß an ihrem 5 '- oder 3 '-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäure- sequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfaßt wiedemm ca. 15 bis 1000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiedemm von einer Oligonukleotidsonde erkannt werden, die durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten. Nach Ablösung der Nukleinsäuresondenmoleküle von der Zielnukleinsäure können die nunmehr isoliert vorliegenden Nukleinsäuresondenmoleküle mit Antiköφern, die das Hapten erkennen, in Kontakt gebracht werden. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxygenin oder dessen Derivate angeführt werden. Dem Fachmann sind neben den angegebenen Beispielen auch noch weitere wohlbekannt.
Die Durchführung der Hybridisierung geschieht standardmäßig auf Objektträgem, auf Filtern, auf einer Mikrotiteφlatte oder in einem Reaktionsgefäß. Die Auswertung ist abhängig von der Art der Markiemng der verwendeten Sonde und kann mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer, Durchflußzytometer und dergleichen erfolgen.
Der erfindungsgemäße Kit enthält besonders bevorzugt folgende spezifische Sonden zum Nachweis von Parodontopathogenen:
Sonden, die Stämme der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans erfassen:
AACT1 : 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3' AACT2: 5,-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' Sonden, die Stämme der Art Porphyromonas gingivalis nachweisen
PGBSfl : 5*-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3* PGIN2: 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3' PGIN3: 5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3'
Sonden, die Stämme der Art Bacteroides forsythus erfassen
BFOR1 : 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3' BFOR2: 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
BFOR3 : 5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3' BFOR4: 5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3' BFOR5 : 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3' BFOR6: 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3'
Sonden, die Stämme der Art Prevotella intermedia erfassen
PINT1 : S'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-S' PΓNT2: 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' PINT3: 5*-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' PINT4: 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' PINT5 : 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3* PINTό^'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-S'
Die erfindungsgemäßen Sondenmoleküle können im Rahmen des Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisiemngslösungen eingesetzt werden. Verschiedene organische Lösungsmittel können in Konzentrationen von 0% bis 80% eingesetzt werden. Formamid wird beispielsweise vorzugsweise in einer Konzentration von 20 % bis 60 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 % im Hybridisiemngspuffer eingesetzt. Zudem ist ein Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, in einer Konzentration von 0,1 mol/1 bis 1,5 mol/1, bevorzugt von 0,5 mol/1 bis 1 ,0 mol 1 und bevorzugter von 0,7 mol/1 bis 0,9 mol/1 und am meisten bevorzugt von 0,9 mol/1 im Hybridisiemngspuffer enthalten. Zum Abpuffem des Hybridisierungspuffers können verschiedene Verbindungen wie Tris/HCl, Natrium- Citrat, PIPES oder HEPES-Puffer verwendet werden, die im Bereich von 0,01 mol/1 bis 0,1 mol/1, bevorzugt von 0,01 mol/1 bis 0,08 mol/1 und besonders bevorzugt von 0,02 mol/1 eingesetzt werden. Der pH- Wert liegt in der Regel im Bereich von 6,0 bis 9,0, bevorzugt von 7,0 bis 8,0. Bevorzugt weist der Hybridisiemngspuffer 0,02 mol/1
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Zudem sind meist Detergenzien, wie Triton X oder Natrium-Dodecylsulphat (SDS) in einer Konzentration von 0,001 % bis 0,2 %, bevorzugt von 0,005 % bis 0,1 % enthalten. Hier enthält ein besonders bevorzugter Hybridisiemngspuffer 0,01 % SDS.
Weitere Zusatzstoffe können bei verschiedenen Problemstellungen zum Einsatz kommen, wie unmarkierte Nukleinsäurefragmente (z.B. fragmentierte Lachsspermien-DNA, unmarkierte Oligonukleotide u.a.) oder Moleküle, die aufgrund einer Reaktionsraumverengung zu einer Beschleunigung der
Hybridisierungsreaktion führen können (Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Dextransulfat u.a.). Solche Zusätze werden vom Fachmann in den bekannten und üblichen Konzentrationen dem Hybridisiemngspuffer zuzugeben.
Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der
Bestandteile des Hybridisiemngspuffer derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausfiihrungsformen geben stringente bis besonders stringente Hybrisidierungs- bedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen artspezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von parontopathogenen Bakterien ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kann.
Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der Bestandteile des Hybridisiemngspuffers derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausführungsformen geben stringente bis besonders stringente Hybridisiemngs- bedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der
Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Ziel-Organismen ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kann. Der Fachmann ist in der Lage durch Verändemng der Parameter des Hybridisiemngspuffers die Stringenz im Bedarfsfall bzw. je nach Sonde oder Zielorganismus zu erhöhen oder zu erniedrigen.
Die Konzentration der Nukleinsäuresonde im Hybridisiemngspuffer ist abhängig von der Art ihrer Markiemng und der Anzahl der Zielstmkturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Nukleinsäuresondenmoleküle die Anzahl der Zielstmkturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresondenmolekülen zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Nukleinsäuresondenmoleküle sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 - 500 ng/μl, bevorzugt zwischen 1,0 - 100 ng/μl und besonders bevorzugt zwischen 1,0 - 50 ng/μl liegen. Die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte Konzentration beträgt 1 - 10 ng jedes verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküls pro μl Hybridisierungs- lösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren beträgt es 30 μl.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.
Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Nukleinsäuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1 % eines Detergens wie SDS, bevorzugt 0,005 - 0,05 %, besonders bevorzugt 0,01 %, sowie Tris/HCl in einer Konzentration von 0,001-0,1 mol/1, bevorzugt 0,01 - 0,05 mol/1, besonders bevorzugt 0,02 mol 1 enthalten, wobei der pH- Wert von Tris/HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 7,0 - 8,0, besonders bevorzugt bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 mol/1 bis 0,9 mol/1, bevorzugt von 0,01 mol/1 bis 0,9 mol/1, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von etwa 0,215 mol/1. Des Weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0 - 0,005 mol/1 beträgt. Femer kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
Allgemein kommen bei dem Waschschritt Pufferlösungen zum Einsatz, die prinzipiell sehr ähnlich aussehen können, wie Hybridisiemngspuffer (gepufferte Natriumchloridlösung), nur dass der Waschschritt in der Regel in einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration, bzw. bei höherer Temperatur durchgeführt wird. Zur theoretischen Abschätzung der Hybridisierungsbedingungen kann folgende Formel verwendet werden:
Td = 81,5 + 16,6 lg[Na+] + 0,4 x (% GC) - 820/n - 0,5 X (% FA)
Td = Dissoziationstemperatur in °C
[Na+] = Molarität der Natriumionen
% GC = Anteil der Guanin- und Cytosinnukleotide an der Anzahl der Basen n = Länge des Hybrids % FA= Formamidgehalt
Mit Hilfe dieser Formel kann z.B. der Formamidanteil (der wegen der Toxizität des Formamids möglichst gering sein sollte) des Waschpuffers ersetzt werden durch einen entsprechend niedrigeren Natriumchloridgehalt. Allerdings ist dem Fachmann aus der umfangreichen Literatur zu in situ-Hybridisiemngsmethoden bekannt, dass und aufweiche Weise die genannten Bestandteile variiert werden können. Bezüglich der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen gilt das oben im Zusammenhang mit dem Hybridisiemngspuffer Gesagte. Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 46 °C für eine Dauer von 10 - 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.
In einer alternativen Ausfühmngsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle im sog. Fast-FISH- Verfahren zum spezifischen Nachweis der angegebenen Ziel-Organismen eingesetzt. Das Fast- FISH-Verfahren ist dem Fachmann bekannt und z.B. in den Patentanmeldungen DE 199 36 875 und WO 99/18234 beschrieben. Auf diese Dokumente wird hinsichtlich deren Offenbarung zur Durchfühmng der dort beschriebenen Nachweis verfahren hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Erfindungsgemäß werden weiterhin Kits zur Durchfühmng der entsprechenden Verfahren zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene Hybridisierungs- anordnung ist z.B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ- Hybridisierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reaktor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die jeweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen (sog. VIT-Lösung). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisiemngspuffer (der der Hybridisierungslösung ohne Sondenmoleküle entspricht) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung. Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixiemngslösungen (50% Ethanol, Ethanol absolut) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u.a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchfühmng einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken:
Beispiel 1 : Spezifischer Nachweis von A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, B. forsythus und P. intermedia
Um die Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden zu belegen, wurden eine Reihe von Referenzorganismen aus öffentlich zugänglichen Bakterienstammsammlungen bestellt und auf den von den Stammsammlungen empfohlenen Medien kultiviert. Sobald sichtbare Kolonien auf den Nährmedien zu sehen waren, wurde mit einer Impföse eine Kolonie von der Platte entfernt und in einer Fixiemngslösung (4 % Formaldehyd in 1 x PBS) suspendiert. Optimalerweise beträgt die optische Dichte der Bakteriensuspension 0,2, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Bakterien wurden 1 bis 24 h in der Fixierlösung belassen und dann für 5 min bei 8.000 U/min (Rotina 35, Rotortyp 1714, Hettich, Tuttlingen) sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in dem 1 x PBS gewaschen (Ausgangsvolumen). Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (Bedingungen wie oben) wurden die Zellen in einer l:l-Mischung aus EtOH/PBS aufgenommen und bei -20°C bis zur Verwendung gelagert.
Aus dieser Suspension wurden 5 μl entnommen und auf den Ausspamngen eines teflonbeschichteten Objektträgers aufgebracht, luftgetrocknet und einer aufsteigenden Ethanolreihe unterzogen (50 %, 80 % und 100 % je 3 Minuten). Anschließend wurden die immobilisierten Proben luftgetrocknet, und 10 μl des Hybridisiemngspuffers (0,9 mol/1 NaCl, 0,02 mol 1 Tris/HCl pH 8,0, 0,01 % SDS, 20 % Formamid, je 5 ng Hybridisierungssonde AACT1 und AACT2, PGIN1-3, BFOR1-6, PINT1-6) wurden zugegeben. Um zu übeφriifen, ob die entsprechenden Referenzzellen genügend rRNA enthalten, um mit dieser Methode nachgewiesen zu werden, wurde neben einer Cy3 -markierten spezifischen Sonde noch eine FLUOS- markierte universelle Sonde in der Hybridisierung mitgeführt.
Die Hybridisierung erfolgte in einer feuchten Kammer, die mit Hybridisierungs- puffer äquilibriert war. Die Hybridisierungszeit betmg mindestens 90 Minuten. Anschließend wurde zur Entfernung der ungebundenen Sonde der hybridisierte Objektträger in einem 50 ml Röhrchen mit Waschpuffer (0,215 mol/1 NaCl, 0,02 mol/1 Tris/HCl pH 8,0, 0,01 % SDS) plaziert und 15 Minuten bei 48 °C inkubiert.
Die fertig hybridisierten Objektträger wurden mit einem geeigneten Einbettmedium überschichtet und anschließend Fluoreszenz-mikroskopisch analysiert.
Tabelle 2 zeigt die verwendeten Referenzstämme und die mit den erfindungsgemäßen Sonden erzielten Ergebnisse.
Tabelle 2
a) Spezifität der AACT-Sonden:
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
b) Spezifität der PGIN-Sonden:
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
c) Spezifität der BFOR-Sonden:
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
d) Spezifität der PINT-Sonden
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000040_0001
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
ATCC: American Type Culture CoUection
CCUG: Culture CoUection, Universität Göteborg
GF: Max von Pettenkofer-Institut, Stammsammlung Zweigstelle Großhadem Beispiel 2: Detektion von parodontopathogenen Bakterien in Proben von Patienten mit Parodontitis
Die Entnahme der parodontalen Proben erfolgte entweder mit einem Sealer oder mit einer dafür vorgesehenen sterilen Papierspitze. Im Falle der Verwendung eines Sealers wurde der Sealer nach der Entfernung bakterieller Plaque aus der Zahnfleischtasche solange in der Fixiemngslösung (4 % Formaldehydlösung in 1 x PBS) gerührt, bis die daran haftenden bakteriellen Beläge vollständig in 200 μl Fixiemngslösung suspendiert waren. Erfolgte die Probenahme mit sterilen
Papierspitzen, so waren diese aseptisch aus der Veφackung zu entnehmen und nach entsprechender Vorbereitung des Patienten (Trocknung der entsprechenden Stelle, Entfernung supragingivaler Plaque) in die zu beprobenden parodontale Tasche einzuführen. Dort verblieb die Papierspitze für 10 - 20 Sekunden, wurde dann entnommen und in ein Reagenzgefäß mit 200 μl Fixierlösung übergeführt. In diesem Zustand wurde die Papierspitze in das Untersuchungslaboratorium geschickt. Dort wurde die Fixierlösung mit 1/10-tel Volumen einer 1 %-igen TritonX-lOO-Lösung versetzt und 2 x 30 Sekunden gut geschüttelt, um die Bakterien von der Papierspitze zu eluieren.
Anschließend wurde bei 8.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, das Pellet wie bei Beispiel 1 ausgeführt gewaschen und die Bakterien schließlich in 60 μl einer 1:1- Mischung von Ethanol und PBS übergeführt. In dieser Lösung sind die Bakterien in der Probe bei - 20°C mindestens 3 Monate lagerbar.
5 μl dieser Suspension wurden auf einen Objektträger aufgebracht und wie in Beispiel 1 ausgeführt mit den erfindungsgemäßen Sonden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Proben mit dem unspezifisch an DNA bindenden Farbstoff D API (4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid; Sigma; Deisenhofen; Deutschland) gefärbt. Dazu wurden die Proben mit einer PBS-Lösung überschichtet, die 1 μg/ml DAPI enthielt, und 5 - 15 Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit 1 x PBS konnten die Proben dann in einem geeigneten Einbettmedium (Citifluor AF1 , Citifluor Ltd., London, UK; Vectashild, Vector laboratories, Burlingame, U.S.A) mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes untersucht werden.
Die quantitative Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Zählokulars nach Angaben des Mikroskopherstellers (Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Die quantitative Auswertung von drei verschiedenen Patientenproben ist in Tabelle 3 wiedergegeben.
Tabelle 3
Figure imgf000042_0001
n.d.: nicht detektiert
Beispiel 3: Detektion von parodontopathogenen Bakterien mit Oligonukleotidsonden, die mit Meerettich-Peroxidase markiert sind
Die parodontalen Proben wurden entnommen, fixiert und auf den Objektträgem immobilisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Anschließend wurden die in der Probe vorhandenen Zellen mittels einer 15-minütigen Inkubation in einer 10 μg/ml ProteinaseK-Lösung oder in einer 250 μg/ml Lysozym-Lösung permeabilisiert. Das Abstoppen der Enzymreaktion erfolgte durch eine aufsteigende Ethanolreihe (50 %, 80 %, 100 %, je 3 min).
Die Hybridisierung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben, allerdings in einem Puffer, der 40 % Formamid anstelle von 20 % Formamid enthält. Zudem wurde die Hybridisierung bei 35°C durchgeführt. Nach 90 Minuten wurde der Objektträger aus der feuchten Kammer entnommen und in einem Waschpuffer-POD (0,056 mol/1 NaCl; 0,05 mol/1 EDTA, 0,02 mol/1 Tris/HCl pH 8,0; 0,01 % SDS) für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die hybridisierte Probe für 10 Minuten mit einer Diaminobenzidin-haltigen Substratlösung überschichtet. Zur Herstellung dieser Lösung wurde eine Diaminobenzidin-haltige Tablette und eine H2O2 enthaltende Tablette aus dem SIGMA FAST DAB Tablet Sets (D4168) in 1 ml Substratpuffer gelöst (0,15 mol/1 NaCl; 0,1 mol/1 Tris/HCl pH 8,0). Nachdem die Tabletten vollständig in dem Substratpuffer gelöst waren, wurden 10 μl dieser fertigen Substratlösung auf die hybridisierten Proben gegeben und 10 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Probe mit 1 x PBS gespült und entweder sofort oder nach einer geeigneten Gegenfärbung mikroskopiert.
Eine geeignete Gegenfärbung war eine HE-Färbung, die auf folgende Weise erstellt wurde. Die feuchten, hybridisierten Objektträger wurden in eine Glasküvette getaucht, die mit Hämalaun (Merk, Deutschland, Art.-Nr. 1.09249.0500) gefüllt ist.
Nach 3 - 5 Minuten wurden die Objektträger kurz in destilliertem Wasser gespült und dann 10 Minuten zum Bläuen fließendem kalten Leitungswasser ausgesetzt. Dann wurde der Objektträger für 3 - 5 Minuten in eine Küvette mit Eosin getaucht. Anschließend wurden die Objektträger kurz in 90 %-igem und dann in absolutem
Ethanol gespült. Abschließend wurde der Objektträger in drei verschiedene Xylol-
Bäder getaucht, bis die Xylol-Lösung klar blieb.

Claims

P A T E N T A N S P R U C H E
1. Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus: i)
5'-C AT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3 '
5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3*
5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3* 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3'
5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3'
5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3' 5'-CGA-C AA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3 '
5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'
5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3'
5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3'
5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3'
5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3'
5*-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3'
5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3', ii) Oligonukleotiden, die mit einem der Oligonukleotide unter i) in mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 %, 92%, 94%, 96% der Basen übereinstimmen und eine spezifische Hybridisiemng mit Nukleinsäuresequenzen von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus und/oder Prevotella intermedia ermöglichen, iii) Oligonukleotiden, die sich von einem der Oligonukleotide unter i) und ii) dadurch unterscheiden, dass sie um mindestens ein Nukleotid verlängert sind, iv) Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter i), ii) und iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
2. Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien durch in situ-Hybridisierung, umfassend: i) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans, ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3' 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; und/oder ii) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art
Porphyromonas gingivalis, ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3'
5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3'
5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; und/oder iii) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus, ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend 5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3' 5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3'
5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'
5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfaßt; und/oder iv) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia, ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend
5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'
5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3'
5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3'
5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3* 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3' oder Teile davon; b) DNA-Sequenz, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz umfasst.
3. Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend i) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans aus der Gmppe bestehend aus a) DNA-Sequenz, umfassend
5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3'
5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3' und/oder ii) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis aus der Gmppe bestehend aus
5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3'
5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3' 5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3' und/oder iii) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Bacteroides forsythus aus der Gmppe, bestehend aus S'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-S1
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-CAA-ACT-TTC-ACC-GCG-G-3' 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3' 5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3' und/oder iv) sämtliche Oligonukleotidsonden zum artspezifischen Nachweis von parodontopathogenen Bakterien der Art Prevotella intermedia aus der Gmppe bestehend aus
5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3' 5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3' 5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3' 5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3' 5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3'.
4. Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach Anspmch 2 oder 3 umfassend sämtliche Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 1-17.
5. Verfahren zum Nachweis von parodontopathogenen Bakterien in einer Probe durch in situ-Hybridisierung, umfassend die folgenden Schritte: a) Fixieren der in der Probe enthaltenen parodontopathogenen Bakterien; b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einer Oligonukleotidsonde nach Anspmch 1, vorzugsweise mit einer Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2-4, um eine Hybridisiemng herbeizufuhren; c) Detektieren und ggf. Quantifizieren der parodontopathogenen Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotidsonden.
6. Verfahren nach Anspmch 5, wobei die Bakterien nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.
7. Verfahren nach Anspmch 6, wobei die Immobilisiemng durch Trocknung oder Filtration erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Fixiemng durch denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen, erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Fixiemng durch quervemetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Fixiemng durch Hitzefixierung erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die Oligonukleotidsonden kovalent mit einem detektierbaren Marker verbunden sind.
12. Verfahren nach Anspmch 11 , wobei der detektierbare Marker ausgewählt ist aus der Gmppe, bestehend aus: a) Fluoreszenzmarker; b) Chemolumineszenzmarker; c) radioaktiver Marker; d) enzymatisch aktive Gmppe; e) Hapten; f) durch Hybridisiemng nachweisbare Nukleinsäure.
13. Verfahren nach Anspmch 12, wobei der enzymatische Marker aus der Gmppe, bestehend aus, Peroxidase, vorzugsweise Meeπettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phophatase, ausgewählt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, wobei die fixierten Zellen vor der Inkubation permeabilisiert werden.
15. Verfahren nach Anspmch 14, wobei die Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme erfolgt.
16. Verfahren nach Anspmch 15, wobei die zellwandlytischen Enzyme ausgewählt werden aus der Gmppe, bestehend aus Proteinase K, Pronase, Lysozym und Mutanolysin.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, wobei es sich bei den parodontopathogen Bakterien um Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus und/oder Prevotella intermedia handelt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17 zum artspezifischen Nachweis von Bakterien der Art Actinobacillus actinomycetemcomitans, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus 5'-CAT-CAG-CGT-CAG-TAC-ATC-C-3* 5'-AGT-ACT-CCA-GAC-CCC-CAG-3\
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17 zum artspezifischen Nachweis von Bakterien der Art Porphyromonas gingivalis, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus 5'-CCT-CTG-TAA-GGC-AAG-TTG-C-3' 5'-GCG-CTC-AGG-TTT-CAC-CGC-3' 5'- CGG-TTA-CGC-CCT-TCA-GGT-3*.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17 zum artspezifischen Nachweis von Bakterien der Art Bacteroides forsythus, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus
5'-GCT-ACC-ATC-GCT-GCC-CCT-3'
5'-CCA-TGC-GGA-ACC-CCT-GTT-3'
5'-CCG-CGG-ACT-TAA-CAG-CCC-ACC-T-3'
5'-CGA-C AA- ACT-TTC-ACC-GCG-G-3 ' 5'-TGA-CAG-TCA-GGG-TTG-CGC-3'
5'-TCA-CAG-CTT-ACG-CCG-GC-3\
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17 zum artspezifischen Nachweis von Bakterien der Art Prevotella intermedia, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5'-TTG-GTC-CAC-GTC-AGA-TGC-3'
5'-TGC-GTG-CAC-TCA-AGT-CCG-3'
5'-TGT-ATC-CTG-CGT-CTG-CAA-TT-3'
5'-CCC-GCT-TTA-CTC-CCC-AAC-3' 5'-CAT-CCC-CAT-CCT-CCA-CCG-3'
5'-TCC-CCA-TCC-TCC-ACC-GAT-GA-3'.
22. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 21, enthaltend mindestens eine Oligonukleotidsonde nach Anspmch 1 , vorzugsweise eine Oligonukleotidsonden-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
23. Kit nach Anspmch 22, weiter enthaltend mindestens eine
Hybridsierungslösung, wobei die Oligonukleotidsonden in der Hybridisierungslösung enthalten sein können.
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