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Die Erfindung betrifft Oligonukleotide
zum Nachweis von Mikroorganismen, ein Verfahren zum Nachweis der
Mikroorganismen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
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Der Nachweis von Mikroorganismen
wird bis heute in überwiegendem
Maße serologisch
oder mikroskopisch durchgeführt.
Dabei sind die Methoden nicht empfindlich genug, um geringe Mengen
an Mikroorganismen direkt nachzuweisen. Daher wurde dem Nachweis
bisher ein Kultivierungsschritt vorgeschaltet, bei dem die Mikroorganismen
vermehrt wurden. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass
einige der Mikroorganismen gar nicht auf den zur Verfügung stehenden
Nährböden anwachsen,
und somit auch nicht nachgewiesen werden können. Untersuchungen an verschiedensten
Umweltproben belegen, dass z. Z. nur zwischen 0,1 bis 14% aller
Bakterien kultivierbar sind. Insbesondere zur Analyse der Zusammensetzung
einer komplexen Biozönose
haben sich kultivierungsabhängige
Verfahren als ungeeignet erwiesen. Abhängig von den gewählten Kultivierungsbedingungen
wird nämlich
die Vermehrung derjenigen Mikroorganismen begünstigt, welche an diese Kultivierungsbedingungen
besonders gut angepasst sind, wodurch es zu einer starken Verzerrung
der in der Ausgangsprobe herrschenden Populationsverhältnisse
kommt. Eine quantitative Analyse der Mikroorganismen ist aufgrund
dieser Populationsverschiebungen gar nicht möglich. Ein weiterer Nachteil
dieses Verfahren besteht darin, dass die heute bekannten Kultivierungsverfahren
teilweise sehr langwierig sind und nicht selten in ihrem Ergebnis
nicht eindeutig sind. Auf diese Weise kommt es sowohl zu falsch
positiven als auch zu falsch negativen Analyseergebnissen.
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Aufgrund der beschriebenen Nachteile
der Kultivierung haben moderne Methoden der Mikroorganismenbestimmung
alle ein gemeinsames Ziel: Sie versuchen die Nachteile der Kultivierung
zu umgehen, indem sie keine Kultivierung mehr benötigen.
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Beispiele moderner Verfahren zum
Nachweis von Mikroorganismen sind DNA(Desoxyribonukleinsäure) bzw.
RNA- (Ribonukleinsäure)
basierte Hybridisierungsoder Amplifikationsmethoden. Unter dem Begriff Hybridisierung
ist insbesondere die Bildung einer Doppelhelix aus zwei einzelsträngigen,
komplementären
Oligooder Polynukleotiden zu verstehen. Eine Hybridisierung kann
dabei insbesondere sowohl zwischen zwei DNA oder zwei RNA-Molekülen, aber
auch zwischen DNAund RNA-Molekülen
entstehen. Die verschiedenen Moleküle hybridisieren nur dann,
wenn die Zielsequenzen in einem ausreichenden Maße komplementär zueinander
sind.
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Die komplementären Zielsequenzen für den Nachweis
können
auch immobilisiert sein, wie dies auf sogenannten DNA-Chips häufig getan
wird. In der Gebrauchsmusterschrift
DE
201 10 013 wird ein solcher Träger (DNA-Chip) zur Diagnose
und Therapie oraler Erkrankungen, insbesondere Parodontitis, beansprucht.
Auf diesem Träger
sind Oligonukleotide immobilisiert, die komplementär zu bekannten
Referenzsequenzen bestimmter Bakterien oder Viren sind, welche in
der Mundflora vorkommen. Aufgrund der Komplementarität können die
auf diesem Genchip aufgebrachten Oligonukleotide mit den entsprechenden
Referenzsequenzen unter bestimmten Bedingungen hybridisieren. Nachteilig
bei diesem Träger
ist, dass die Mikroorganismen entweder durch Kultivierung vermehrt
werden müssen
oder die genetische Information aus den vorhandenen Proben vor der
Hybridisierung auf dem Chip amplifiziert werden muss. Eine Quantifizierung
der ursprünglich
in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen ist daher ebenfalls nicht
möglich.
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Eine bekannte Amplifikationsmethode
ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Bei der PCR wird mit spezifischen
Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Mikroorganismengenoms
amplifiziert. Findet der Primen seine Zielstelle, so kommt es zu
einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der
anschließenden
Analyse, z.B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann
eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies
zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in
der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht
möglich; diese
Zielstellen können
sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium
oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht
möglich.
Auch können
diverse in der untersuchten Probe vorhandene Stoffe eine Inhibierung
des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies
ist eine häufige
Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der
PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird,
eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Mikroorganismen und
der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen
in ihrer hohen Spezifität
und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe
Anfälligkeit
für Kontaminationen
und dadurch verursachte falsch positive Ergebnisse sowie die bereits
erwähnte
fehlende Möglichkeit
zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden
und schließlich
die Gefahr falsch negativer Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer
Substanzen.
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Zu Beginn der 90er Jahre wurde ein
Verfahren zur in situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden
entwickelt, das in vielen Umweltproben erfolgreich zum Einsatz gekommen
ist (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 762). Das Verfahren
wurde "FISH" (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)
genannt und macht sich den Umstand zunutze, dass die in jeder Zelle
vorkommenden ribosomalen Ribonukleinsäuren (RNAs) sowohl hochkonservierte
als auch variable, d.h. gattungs- oder sogar artspezifische Sequenzen
aufweisen. Gegen diese Sequenzbereiche können komplementäre Oligonukleotide
hergestellt werden, die zusätzlich
mit einem detektierbaren Marken versehen werden können. Mittels
dieser sogenannten Nukleinsäuresonden
können
Mikroorganismenarten, – gattungen
oder -gruppen hochspezifisch direkt in der Probe identifiziert und
bei Bedarf auch visualisiert oder quantifiziert werden. Diese Methode
ist das einzige Verfahren, das eine verzerrungsfreie Darstellung
der tatsächlichen
in situ-Verhältnisse
der Biozönose
darstellt. Sogar bisher nicht-kultivierte und demnach nicht beschriebene
Mikroorganismen können
identifiziert werden.
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Bei der FISH dringen Sonden in die
in der untersuchten Probe vorhandenen Zellen ein. Sofern ein Mikroorganismus
der Art, Gattung oder Gruppe, für
welche die Sonden entwickelt wurden, in der untersuchten Probe vorhanden
ist, binden die Sonden in der Mikroorganismenzelle an ihre Zielsequenz,
und die Zellen können
aufgrund der Markierung der Sonden detektiert werden.
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Die Vorteile der FISH-Technik gegenüber den
weiter oben beschriebenen Methoden zur Mikroorganismenidentifizierung
(Kultivierung, PCR) sind vielfältig.
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Erstens können mit Sonden zahlreiche
Mikroorganismen detektiert werden, die mittels traditioneller Kultivierung
gar nicht erfasst werden. Während
durch die Kultivierung maximal nur 15% der Bakterienpopulation einer
Probe sichtbar gemacht werden können,
erlaubt die FISH-Technik in vielen Proben eine Detektion bis zu
100% der Bakteriengesamtpopulation. Zweitens ist die Detektion von
Mikroorganismen mittels der FISH-Technik sehr viel schneller als
mittels Kultivierung. Benötigt
die Identifizierung von Mikroorganismen mittels Kultivierung oft
mehrere Tage, so vergehen von der Probennahme bis zur Mikroorganismenidentifizierung sogar
auf Artebene mittels der FISH-Technik nur wenige Stunden. Drittens
können
im Gegensatz zu einem Kultivienangsmedium Sonden in ihrer Spezifität fast beliebig
frei gewählt
werden. Einzelne Arten können
genauso gut mit einer Sonde erfasst werden, wie ganze Gattungen
oder Mikroorganismengruppen. Viertens können Mikroorganismenarten oder
ganze Mikroorganismenpopulationen direkt in der Probe exakt quantifiziert
werden. Fünftens
können
Assoziationen und Vergesellschaftungen verschiedener Mikroorganismen
in einer Probe visualisiert werden.
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Im Gegensatz zur PCR weist die FISH
zuverlässig
nur lebende Mikroorganismen nach. Falsch positive Ergebnisse durch
nackte DNA oder tote Mikroorganismen wie bei der PCR sind bei der
FISH ausgeschlossen. Des weiteren sind falsch negative Ergebnisse
infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen ebenso ausgeschlossen
wie falsch positive Ergebnisse infolge von Kontaminationen.
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Die FISH-Technik ist demnach ein überragendes
Werkzeug, um Mikroorganismen schnell und äußerst spezifisch direkt in
einer Probe nachzuweisen. Sie ist im Gegensatz zu Kultivierungsverfahren
eine direkte Methode und erlaubt darüber hinaus auch eine Quantifizierung
der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen.
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Die menschliche Haut beispielsweise
ist mit ca. 2 m2 Fläche eines der größten von
Mikroorganismen bewohnten menschlichen Körperorgane. Im Laufe der Evolution
hat sich eine enge Beziehung zwischen dem Wirt und seinen mikrobiellen
Bewohnern entwickelt. Die von der Haut über verschiedene Körperdrüsen zur Verfügung gestellten
Nährstoffe
werden von Mikroorganismen verstoffwechselt. Die dadurch verursachte
Ansäuerung
der Hautoberfläche
verhindert die Ansiedelung von pathogenen Mikroorganismen.
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Die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen
kann aber auch unerwünschte
Folgen haben. So ist die Entstehung von Körpergeruch, Schuppenbildung
und die Entwicklung verschiedener Hautkrankheiten auf die Aktivität von Mikroben
zurückzuführen.
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So steht beispielsweise der Hefepilz
Malassezia im Verdacht, insbesondere an der Schuppenbildung der
Haut, beispielsweise auf dem Kopf, beteiligt zu sein. Außerdem wird
dieser Organismus als Auslöser
der Hautkrankheit Pityriasis versicolor betrachtet.
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Ein vermehrtes Auftreten von Propionibacterium
acnes kann bereits im frühen
Stadium Hinweise auf die Entstehung von Akne geben.
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Prinzipiell sind alle Mikroorganismen
zur Hautflora zu rechnen, die von der Haut isoliert werden können. Dabei
können
nach Prise (Prise P.B. The bacteriology of the normal skin: A new
quantitative test applied to a study of the bacterial flora and
the disinfectant action of mechanical cleansing. J Infect Dis. 63:
301-318. 1938.) zwei unterschiedliche Gruppen unterschieden werden.
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a) Residente Flora: Mikroorganismen,
die sich auf der menschlichen Haut vermehren können oder bei der Untersuchung
von Hautproben in hoher Anzahl oder mit einem hohen Anteil regelmäßig gefunden
werden. Es wird postuliert, dass die oben genannten Eigenschaften
durch die feste Verankerung dieser residenten Mikroorganismen mit
der Haut zustande kommen (Anheftung).
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b) Transiente Flora: Mikroorganismen,
die sich auf der menschlichen Haut nicht vermehren können bzw.
bei Untersuchungen nur unregelmäßig und
in geringen Anzahlen/Anteilen gefunden werden. Diese Mikroorganismen
liegen der Theorie nach frei, nicht an. Hautbestandteile adhäriert, vor.
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Ein genauerer Kenntnisstand vor allem
der residenten Flora der Haut ist insbesondere im Hinblick auf die
Suche nach neuen medizinischen oder kosmetischen Wirkstoffen wichtig.
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroorganismen können darüber hinaus
ein breiteres Verständnis
der Zusammenhänge
zwischen gesunder Haut und ihren Erkrankungen eröffnen und die Entwicklung von
besseren Wirkstoffen, Therapien oder Arzneimitteln ermöglichen.
Auch die gezielte Beeinflussung relevanter Hautmikroorganismen durch Kosmetikprodukte,
wie Deodorants, Cremes u.a., setzt die genaue Kenntnis von Struktur
und Funktion des Mikro-Ökosystems
Haut voraus.
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Es besteht daher ein Bedarf an als
Nukleinsäuresonden
für weitere,
eher verbreitetere Mikroorganismen geeigneten Oligonukleotiden,
die so neue Einsatzgebiete erschließen können. Insbesondere besteht
ein Bedarf für
Sonden zum Nachweis solcher Mikroorganismen, die mit Menschen und/oder
Tieren in Kontakt kommen können,
z.B. in Lebensmitteln, Abwässern,
Umweltproben oder von der Hautoberfläche.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen oder
Mikroorganismengruppen bereitzustellen, die eine schnelle sowie
ggf. quantitative Bestimmung dieser Mikroorganismen in einer Probe
gewährleisten
und darüber
hinaus in der Lage sind, einzelne oder Gruppen von Spezies von Mikroorganismen
auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von anderen Mikroorganismen
sicher zu detektieren.
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Dies wird gelöst durch die Bereitstellung
von Oligonukleotiden zum Nachweis von Mikroorganismen ausgewählt aus
einer Gruppe bestehend aus:
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- i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01
bis 18 angegebenen Sequenzen, und
- ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter
i) zumindest in 80 %, bevorzugt in mindestens 84%, besonders bevorzugt
in mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt in 95% der Nukleotide übereinstimmen,
und
- iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und
ii) genannten Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein
oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und
- iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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sowie durch ein Verfahren zur Verwendung
dieser Oligonukleotide und ein Kit zur Anwendung des Verfahrens.
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Im erfindungsgemäßen Zusammenhang sind unter
dem Begriff "Mikroorganismengruppe" mindestens zwei
Arten der gleichen Gattung von Mikroorganismen zu verstehen. Eine
erfindungsgemäße Mikroorganismengruppe
kann auch alle Spezies einer Gattung enthalten.
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Erfindungsgemäß sind neben den Oligonukleotiden
mit den in SEQ ID NO. 01 bis 18 angegebenen Sequenzen sowie solchen
Oligonukleotiden, die mit diesen zumindest in 80%, bevorzugt in
mindestens 84%, besonders bevorzugt in mindestens 90%, ganz besonders
bevorzugt in 95% der Nukleotide übereinstimmen, auch
solche Oligonukleotide umfasst, die sich von den genannten Oligonukleotiden
ableiten, wobei sie um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder
deletiert sind.
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Es ist insbesondere auch möglich, dass
am 3' und/oder am
5' Ende der genannten
Oligonukleotide 1 bis 40, vorzugsweise 1 bis 25, insbesondere 1
bis 15 Nukleotide angehängt
sind.
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Ebenfalls ist es weiterhin erfindungsgemäß möglich, Oligonukleotide
einzusetzen, die sich von den genannten Oligonukleotide insbesondere
dadurch ableiten lassen, dass die Sequenz um 1 bis 7, vorzugsweise 1
bis 5, insbesondere ein bis drei, beispielsweise ein oder zwei Nukleotide
deletiert ist.
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Gemäß einer besonderen Ausführungsform
sind die nachzuweisenden Mikroorganismen ausgewählt sind aus den Gattungen
Staphylococcus, Pepfostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium,
Veillonella und/oder Malassezia.
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Die Mikroflora der Haut ist bisher
nur durch die bekannten Kultivierungsmethoden untersucht worden. Dabei
wurden durch den bereits erwähnten
methodischen Mangel nur kultivierbare Bakterien oder Pilze nachgewiesen.
Beispielsweise wurden folgende Spezies gefunden: Staphylococcus
aureus, S. epidermidis, S. cohnii, S. haemolyticus, S. hominis,
S. capitis, S. warnen, S. sciuri, S. schleiferi, S. intermedius,
Veillonella dispar, V. parvula, V. atypica, Propionibacterium aches,
Malassezia sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur, Corynebacterium
minutissimum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. callunae, C. Iipophiloflavum,
C. pseudotuberculosis, C. glucuronolyticum, C. striatum, C. xerosis,
C. jekeium, Peptosfreptococcus hydrogenialis, P. lactolyticus, P,
octavius, P. prevotii und P. vaginalis.
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Diese und weitere Spezies der genannten
Gattungen können
vorteilhafterweise mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden nicht
nur qualitativ, sondern darüber hinaus
auch noch quantitativ nachgewiesen werden. Diese quantitativen Informationen
können
vor allem für
Tests von Wirkstoffen oder die Frühdiagnose von Hauterkrankungen
von Nutzen sein. Die genannten Mikroorganismengattungen können des
weiteren auch in anderen Proben vorkommen, so beispielsweise in
Lebensmitteln, klinischem Untersuchungsmaterial oder Umweltproben.
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Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter „Haut" die menschliche
und/oder tierische Haut oder Schleimhaut sowie die Anhangsgebilde
der Haut (Haare, Haarfollikel, Nägel,
Drüsen)
zu verstehen.
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Nach einer besonderen Ausführungsform
trägt das
Oligonukleotid einen detektierbaren Marken, insbesondere einen Fluoreszenzmarker,
der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Die Nachweisbarkeit
der erfolgten Hybridisierung des Oligonukleotids mit der Zielsequenz
ist eine Voraussetzung für
die Identifizierung und ggf. Quantifizierung der Mikroorganismen.
Insbesondere wird dies häufig
durch eine kovalente Bindung eines detektierbaren Markers an das
Oligonukleotid erreicht. Als detektierbare Marker werden häufig fluoreszierende
Gruppen, z.B. Cy-2, Cy-3 oder Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc.,
Arlington Heights, USA), FITC (Fluoresceinisothiocyanat), CT (5,(6)-Carboxytetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester
(Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (Tetramethylrhodamin-5,6-isothiocyanat
(Molecular Probes Inc., s.o.) oder FLUOS (5,(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)). Alternativ werden
chemolumineszierende Gruppen oder radioaktive Markierungen, z.B.
35S, 32P, 33P, 125J, verwendet. Nachweisbarkeit kann aber auch gegeben
sein durch Kopplung des Oligonukleotids mit einem enzymatisch aktiven
Molekül,
beispielsweise alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Peroxidase,
Meerettichperoxidase, β-D-Galaktosidase
oder Glukoseoxidase. Für
jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die
anstelle des natürlichen
Substrats umgesetzt werden können,
und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt
werden können.
Beispiele für solche
Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
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Schließlich ist es möglich, die
Oligonukleotide so zu gestalten, dass an ihrem 5'oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung
geeignete Nukleinsäuresequenz
vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz
umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 – 50 Nukleotide. Dieser zweite
Nukleinsäurebereich
kann wiederum von einem Oligonukleotid erkannt werden, welches durch
eines der oben erwähnten
Mittel nachweisbar ist.
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Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung
der nachweisbaren Oligonukleotide mit einem Hapten, das anschließend mit
einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden
kann. Als Beispiel für
solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die
angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.
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Insbesondere wird der enzymatische
Marken aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise
Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer
Phosphatase, ausgewählt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist eine Oligonukleotidkombination zum Nachweis von Mikroorganismen
enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehrere der genannten
Oligonukleotide.
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Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter
einer Oligonukleotidkombination eine Zusammensetzung zu verstehen,
die mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide, beispielsweise
in einer Lösung
(z.B. einer Pufferlösung)
oder Mischung (z.B. im lyophilisierten Zustand), enthält. Darüber hinaus
können
die Oligonukleotide auch von einander getrennt (z.B. in unterschiedlichen
Gefäßen), nebeneinander
(beispielsweise auf einem Chip oder in einem Kit) vorliegen.
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Gemäß einer besonderen Ausführungsform
enthält
die Oligonukleotidkombination
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- i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen
Nachweis von Bakterien der Gattung Staphylococcus ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 03 angegebenen
Sequenzen, und
- b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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und/oder
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- ii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen
Nachweis von Bakterien der Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Oligonukleotiden mit den in SEQ 1D NO. 04 bis 06 angegebenen
Sequenzen, und
- b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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und/oder
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- iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen
Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 07 bis 12 angegebenen
Sequenzen, und
- b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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und/oder
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- iv) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen
Nachweis von Bakterien der Gattung Veillonella ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 13 bis 15 angegebenen
Sequenzen, und
- b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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und/oder
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- v) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen
Nachweis von Bakterien der Spezies Propionibacterium acnes ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 16 und 17 angegebenen
Sequenzen, und
- b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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und/oder
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- vi) mindestens ein Oligonukleotid, zum spezifischen
Nachweis von Pilzen der Gattung Malassezia ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 18 angegebenen
Sequenz und
- b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und
- c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a)
entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und
- d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem
der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide ermöglichen
den spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Genera Staphylococcus,
Peptostreptococcus, Propionibakterium, Corynebacterium, Veillonella
und Malassezia.
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Folgende Kombinationen von jeweils
ein oder mehreren Oligonukleotiden aus den Gruppen i) bis vi) ergeben
sich erfindungsgemäß: Beispielsweise
ist die Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden jeweils aus
einer der Gruppen i), ii), iii), iv), v) oder vi) darunter zu verstehen.
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Die Kombinationen von ein oder mehreren
Oligonukleotiden aus der Gruppe i) mit ein oder mehreren Oligonukleotiden
aus der Gruppe ii), analog dazu auch solche aus der Gruppe i) mit
iii), i) mit iv), i) mit v) sowie i) mit vi), ii) mit iii), ii)
mit iv), ii) mit v) sowie ii) mit vi), iii) mit iv), iii) mit v)
sowie iii) mit vi), iv) mit v), iv) mit vi) sowie v) mit vi) sind
erfindungsgemäß mit umfasst.
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Ebenso sind die Kombinationen von
jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus den jeweiligen Gruppen
i), ii) und iii); analog ebenso i) mit ii) und iv); i) mit ii) und
v); i) mit ii) und vi); i) mit iii) und iv); i) mit iii) und v);
i) mit iii) und vi); i) mit iv) und v); i) mit iv) und vi); i) mit
v) und vi); ii) mit iii) und iv); ii) mit iii) und v); ii) mit iii)
und vi); ii) mit iv) und v); ii) mit iv) und vi); ii) mit v) und
iv); iii) mit iv) und v); iii) mit iv) und vi); iii) mit v) und
vi) sowie iv) mit v) und vi) erfindungsgemäß möglich.
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Einzusetzen sind ebenfalls die Kombinationen
von ein oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus je vier Gruppen, also
aus Gruppe i) mit ii), iii) und iv); i) mit ii), iii) und v); i)
mit ii), iii) und vi); i) mit ii), iv) und v); i) mit ii), iv) und
iv); i) mit ii), v) und vi); i) mit iii), iv) und v); i) mit iii),
iv) und vi); i) mit iii), v) und vi); i) mit iv), v) und vi); ii)
mit iii), iv) und v); ii) mit iii), iv) und vi); ii) mit iii), v)
und vi) oder iii) mit iv), v) und vi).
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Die Kombinationen von jeweils ein
oder mehreren Oligonukleotiden aus fiinf Gruppen, also i) mit ii), iii),
iv) und v), i) mit ii), iii), iv) und vi), i) mit ii), iii), v)
und vi), i) mit iii), iv), v) und vi), i) mit ii), iv), v) und vi),
ii) mit iii), iv), v) und vi) sowie die Kombination von jeweils
ein oder mehren Oligonukleotiden aus allen sechs Gruppen sind ebenfalls
erfindungsgemäß umfasst.
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Die erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination
ist daher geeignet, eine Mikroorganismenspezies oder eine Mikroorganismengruppe
nachzuweisen. Dazu werden beispielsweise zum Nachweis von bestimmten
Spezies von Staphylococcus ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß i) ausgewählt.
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Darüber hinaus kann aber vorteilhafterweise
durch die geeignete Zusammenstellung der Oligonukleotidkombination
(gemäß den o.g.
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Kombinationsmöglichkeiten) der Nachweis von
Spezies und/oder Gruppen von Mikroorganismen der verschiedenen genannten
Gattungen gleichzeitig und/oder nebeneinander durchgefiihrt werden.
Beispielsweise kann mit einer geeigneten Oligonukleotidkombination
der Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus (durch
Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß i)) gleichzeitig
und/oder nebeneinander zum Nachweis von Mikroorganismen der Gattung
Veillonella (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden
gemäß iv)) stattfinden.
Die möglichen
Kombinationen können
dadurch individuell an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden.
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Wichtig fiir die Auswahl der Oligonukleotide
zum Nachweis von Mikroorganismen ist insbesondere, daß eine geeignete
komplementäre
Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Geeignet
ist eine Sequenz dann, wenn sie einerseits spezifisch fiir den nachzuweisenden
Mikroorganismus ist und andererseits überhaupt zugänglich ist
fiir das eindringende Oligonukleotid, also nicht etwa durch ribosomale
Proteine oder rRNA-Sekundärstrukturen
maskiert wird. Bereits Fuchs und Mitarbeiter (B. M. Fuchs, G. Wallner,
W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann. Flow cytometric
analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA
for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ.
Microbiol. 1998. 64 (12): 4973 -4982.) konnten zeigen, dass eine
Vielzahl von Oligonukleotiden, die aufgrund von Primärsequenzdaten entwickelt
wurden, in einem in situ Hybridisierungsansatz nicht oder nur eingeschränkt verwendet
werden können.
Die Abdeckung von potentiellen Oligonukleotidbindungsstellen durch
rRNA-Sekundärstrukturmotive
beziehungsweise ribosomale Proteine wird als Begriindung fiir das
unbefriedigende Bindungsverhalten der genannten Oligonukleotide
aufgefiihrt. Solche unzugänglichen
Bereiche sind für
jeden Organismus unterschiedlich und miissen für jeden Mikroorganismus neu
erforscht werden. Daher erschließt sich die Sequenz für ein Oligonukleotid
mit gutem Bindungsverhalten, auch für einen Fachmann, keineswegs
aus der Primärsequenz der
rRNA und kann folglich auch nicht über Consensus-Sequenz-Suchprogramme
erschlossen werden.
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Durch die erfinderische Auswahl einer
definierten Sequenz kann eine Mikroorganismenart, eine Mikroorganismengattung
oder eine Mikroorganismengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte
bei einem Oligonukleotid von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben
sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein
bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.
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Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotide
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus
bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur
rRNA und ausgewählt
sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter
SEQ ID NO. 01 bis 03 angegebenen Sequenzen.
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Jedes der angegebenen Oligonukleotide
detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Staphylococcus:
S. aureus, S. epidermidis, S. saccharolyticus, S. caprae, S. capitis,
S. warneri, S. pasteun, S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S.
succinus, S. kloosii, S. saprophyticus, S. equorum, S. xylosus,
S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. chromogenes, S.
auricularis, S. schleiferi, S. sciuri, S. lentus, S. vitulus, S.
pulveri, S. felis, S. hyicus, S. auriularis, S. condimenfi, S. piscifermentans,
S. carnosus, S. simulans, S. intermedius, S. delphini,, S. muscae
und S. condimenti.
-
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen
mit ähnlicher
rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, nicht
von diesen Oligonukleotiden erfasst: Paenibacillus polymyxa, Bacillus
lentus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Proteus
vulgaris, Burkholderia cepacia, Bacteroides uniformis und Pediococcus
damnosus. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.
-
Besonders bevorzugt ist eine Kombination
der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 01 bis 02 angegebenen
Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden
Spezies der Gattung Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S.
saccharolyticus, S. caprae, S, capitis, S. warneri, S. pasteuri,
S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S. succinus, S. kloosii,
S. saprophyticus, S. equorum, S, xylosus, S. haemolyticus, S. hominis,
S. lugdunensis, S. chromogenes, S. auricularis, S. schleiferi, S.
sciuri, S. lentus, S, vitulus, S, pulveri, S. intermedius, S. delphini,,
S. felis, S. muscae, S. condimenti, S. piscifermentans, S. carnosus
und S. simulans Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptosfreptococcus
bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur
rRNA und ausgewählt
sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter
SEQ ID NO. 04 bis 06 angegebenen Sequenzen.
-
Jedes der angegebenen Oligonukleotide
detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Peptostreptococcus:
P. assaccharolyticus, P. hydrogenalis, P. lactolyticus, P. octavius,
P. prevotii und P. vaginalis.
-
Vorteilhafterweise werden die nachfolgend
genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen
mit ähnlicher
rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Peptostreptococcus gehören, nicht
erfasst: P. lacrimalis, P. anaerobius, P. magnus sowie Ruminococcus
productus, Brevibacterium epidermidis, Abiotropha elegans und Clostridium
hastiforme.
-
Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid
mit der unter SEQ ID NO. 04 angegebenen Sequenz. Dieses Oligonukleotid
detektiert mindestens die folgenden Spezies der Gattung Peptostreptococcus:
P. assaccharolyticus, P. hydrogenalis, P. lactolyticus, P. octavius,
P. prevotii und P. vaginalis.
-
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium
bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur
rRNA und ausgewählt
sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter
SEQ ID NO. 07 bis 12 angegebenen Sequenzen.
-
Jedes der angegebenen Oligonukleotide
detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Connebacterium:
C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. macginleyi,
C. accolens, C. fastidiosum, C. segmentosum, C. ammoniagenes, C.
minutissimum, C. ammoniagenes, C. flavescens, C. coyleiae, C. afermentans,
C. pseudogenitalium, C. genifalium, C. mucofaciens, C. auris, C.
mycetoides, C. cystitidis, C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C.
ulcerans, C. diphteriae, C. vitarumen, C. kutscheri, C. genitalium, C.
argentoratens, C. glutamicum, C. callunae, C. bovis, C. variabilis,
C. amycolatum, C. pseudogenitalium, C, tuberculostearicum, C. xerosis,
C, matruchotii und C. jeikeium
-
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen
mit ähnlicher
rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Corynebacterium gehören, von
diesen Oligonukleotiden nicht erfasst: Clostridium acetobutylicum,
Eubacterium moniliforme und Fusobacterium nucleatum. Ebenfalls nicht
erfasst werden die folgenden Bakterien, welche zur Hautmikroflora
gehören:
Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter
calcoaceticus und Streptococcus pyogenes. Dies ist ein besonderer
Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.
-
Besonders bevorzugt ist eine Kombination
der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 07, 08, 10 und 11 angegebenen
Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden
Spezies der Gattung Corynebactenum: C. glutamicum, C. lipophiloflavum,
C. glucuronolyticum, C. macginleyi, C. accolens, C. fastidiosum,
C. segmentosum, C. ammoniagenes, C. minutissimum, C. ammoniagenes,
C, flavescens, C. coyleiae, C. afermentans, C. pseudogenitalium,
C. genitalium, C. mucofaciens, C. auris, C. mycetoides, C. cystitidis,
C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, C. diphteriae, C.
vitarumen, C. kutscheri, C. genitalium, C. argentoratens, C. glutamicum,
C. callunae, C. bovis, C. variabilis, C. amycolatum, C. pseudogenitalium,
C. tuberculosteancum, C. xerosis, C. matruchotii und C. jeikeium
-
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Veillonella
bereitgestellt, wobei die Sonden komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind
aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ
ID NO. 13 bis 15 angegebenen Sequenzen.
-
Jedes der angegebenen Oligonukleotide
detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Veillonella:
V. dispar, V. parvula und V. atypica. Da die Gattung Veillonella
weitgehend isoliert im phylogenetischen Stammbaum steht, wird vorteilhafterweise
keine Erfassung von Nichtzielorganismen festgestellt.
-
Besonders bevorzugt ist eine Kombination
der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 13 bis 14 angegebenen
Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden
Spezies der Gattung Veillonella: V. dispar, V. parvula und V, atypica.
-
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Propionibacterium
acnes bereitgestellt, wobei die Sonden komplementär sind zur
rRNA und ausgewählt
sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter
SEQ ID NO. 16 bis 17 angegebenen Sequenzen.
-
Jedes der angegebenen Oligonukleotide
detektiert spezifisch die Spezies Propionibacterium acnes.
-
Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid
mit der unter SEQ ID NO. 16 angegebenen Sequenz.
-
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen
mit ähnlicher
rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Spezies Propionibacterium acnes
gehören,
nicht erfasst: P. propionicus, P. granulosum, P. avidum, P. freudenreichii,
P. thoeni, P. lymphophilus, C. minutissimum, Saccharomonospora viridis,
Nocardiodes spec., Propioniferax innocua, Gordonia sputi und Arcanobacterium.
-
Insbesondere wird weiterhin erfindungsgemäß ein Oligonukleotid
zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Malassezia
bereitgestellt, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zur
rRNA und die unter SEQ ID NO. 18 angegebene Sequenz besitzt.
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Das angegebene Oligonukleotid detektiert
mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Malassezia: M.
sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur.
-
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen
mit ähnlicher
rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Malassezia gehören, nicht
erfasst: Candida albicans und Candida krucei.
-
In der folgenden Tabelle 2 sind die
Sequenzen des Sequenzprotokolls zusammengefasst:
Tabelle
2
-
Die Durchfiihrung des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die folgenden Schritte:
-
- a) Entnahme einer Probe
- b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen
- c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem
Oligonukleotid, um eine Hybridisierung herbeizufiihren
- d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide und
- e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden
hybridisierten Mikroorganismen.
-
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
wird unter „Fixieren" der Mikroorganismen
eine Behandlung verstanden, mit der die Mikroorganismenhülle für Oligonukleotide
durchlässig
gemacht wird. Zur Fixierung wird iiblicherweise Ethanol verwendet.
Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen
nicht von den Oligonukleotiden penetriert werden, so sind dem Fachmann
ausreichend weitere Maßnahmen
bekannt, die zu demselben Ergebnis fiihren. Dazu zählen beispielsweise
Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder
eine verdiinnte Formaldehydlösung
oder ähnliches.
-
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
werden für
die „Hybridisierung" die fixierten Zellen
mit insbesondere fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden inkubiert.
Diese können
ggf. nach Penetration der Zellhülle sich
an die dem Oligonukleotid entsprechende Zielsequenz binden. Die
Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu
verstehen.
-
Die Oligonukleotide werden im Rahmen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit einer geeigneten Hybridisierungslösung eingesetzt. Geeignete Zusammensetzungen
dieser Lösung
sind dem Fachmann wohlbekannt. Eine solche Hybridisierungslösung enthält beispielsweise
Formamid in einer Konzentration zwischen 0% und 80%, bevorzugt von
0 – 35%,
besonders bevorzugt von 20% und hat z.B. eine Salzkonzentration
(bei dem Salz handelt es sich bevorzugt um NaCl) zwischen 0,1 Mol/l
und 1,5 Mol/l, bevorzugt zwischen 0,5 und 1,0 Mol/l, besonders bevorzugt
0,9 Mol/l. Weiterhin ist enthalten i.a. ein Detergens (i.d.R. SDS)
in einer Konzentration zwischen 0,001% und 0,2%, bevorzugt 0,005%
bis 0,1%, besonders bevorzugt von 0,01%. Zum Puffern der Lösung ist
eine geeignete Puffersubstanz (z.B. Tris-HCl, Na-Citrat, HEPES,
PIPES o.a.) enthalten, iiblicherweise in einer Konzentration zwischen
0,01 Mol/l und 0,1 Mol/l, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01
Mol/l bis 0,05 Mol/l, besonders bevorzugt von 0,02 Mol/l. Der pH-Wert
der Hybridisierungslösung
liegt in der Regel zwischen 6,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 7,0
und 8,0, besonders bevorzugt um 8,0.
-
Weitere Zusatzstoffe können zum
Einsatz kommen, z.B. fragmentierte Lachsspermien-DNA oder Blocking-Reagenzien
zur Verhinderung von Hintergrundrauschen der Hybridisierungsreaktion
oder auch Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon oder Dextransulfat
zur Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion. Des weiteren können auch
Substanzen zugegeben werden, welche die DNA aller in der Probe enthaltenen
lebenden und/oder Organismen anfärben
(z.B. DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid).
Solche Zusätze
sind dem Fachmann sämtlich
wohlbekannt und können
in den bekannten und üblichen
Konzentrationen zugegeben werden.
-
Die Konzentration des Oligonukleotids
in der Hybridisierungslösung
ist abhängig
von der Art ihrer Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen.
Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen,
sollte die Anzahl der Oligonukleotide die Anzahl der Zielstrukturen
um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings
ist zu bedenken, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten
Oligonukleotide zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz
führt.
Die Konzentration der Oligonukleotide sollte deshalb in einem Bereich
zwischen 0,5 – 500
ng/μl liegen.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
bevorzugte Konzentration beträgt 1 – 10 ng
jedes verwendeten Oligonukleotids pro μl Hybridisierungslösung. Das
verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100
ml liegen, bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
liegt es zwischen 10 μl
und 1000 μl,
besonders bevorzugt beträgt
es zwischen 20 μl
und 40 μl.
-
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise
zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung
für etwa
1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44°C und 48°C, besonders
bevorzugt 46 °C,
wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration
an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in
Abhängigkeit
von den Oligonukleotiden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz
in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann
ist mit hier einschlägigen
Berechnungen vertraut.
-
Nach erfolgter Hybridisierung sollten
die nicht hybridisierten und überschiissigen
Oligonukleotide entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise
mittels einer herkömmlichen
Waschlösung
erfolgt. Diese Waschlösung
kann, falls gewiinscht, 0,001-0,1% eines Detergens wie SDS, wobei
eine Konzentration von 0,01% bevorzugt wird, sowie Tris-HCl oder
eine andere geeignete Puffersubstanz in einer Konzentration von 0,001-0,1
Mol/l, bevorzugt 0,02 Mol/l, enthalten, wobei der pN-Wert im Bereich
von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise um 8,0 liegt. Das Detergens kann enthalten
sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise
NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003
Mol/l bis 0,9 Mol/l, bevorzugt von 0,01 Mol/l bis 0,9 Mol/l, beträgt. Besonders
bevorzugt ist eine NaCl-Konzentration von 0,07 Mol/l. Des weiteren
kann die Waschlösung
EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 Mol/l beträgt. Ferner
kann die Waschlösung
auch dem Fachmann geläufige
Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
-
Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Oligonukleotide
erfolgt üblicherweise
bei einer Temperatur im Bereich von 44°C bis 52°C, bevorzugt von 44°C bis 50°C und besonders
bevorzugt bei 44°C
bis 48°C
für eine Dauer
von 10 – 40
Minuten, vorzugsweise für
15 Minuten.
-
Die abschließende Auswertung ist abhängig von
der Art der Markierung des verwendeten Oligonukleotids möglich mit
einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer,
Fluorometer u.a.
-
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind vielfältig.
-
Ein besonderer Vorteil ist die Geschwindigkeit
dieses Nachweisverfahrens. Während
die traditionelle Kultivierung bis zu sieben Tage für den Nachweis
benötigt,
liegt das Ergebnis nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
innerhalb von drei Stunden vor. Dies ermöglicht erstmals eine begleitende
diagnostische Kontrolle der Wirkungen und unerwiinschten Wirkungen
einer angewandten Behandlung. Hier ist weiterhin vorteilhaft, dass
das erfinderisch bereitgestellte Verfahren es ermöglicht,
alle genannten Mikroorganismen gleichzeitig nachzuweisen, was einen
weiteren Zeitvorteil bedeutet, da alle Schritte von der Probenahme
bis zur Auswertung nur einmal durchgeführt werden miissen.
-
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit
zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen.
-
Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache,
dass durch die erfinderisch bereitgestellten Oligonukleotide nunmehr
erstmals auch solche Mikroorganismen beispielsweise der Hautmikroflora
nachgewiesen werden können,
die von den traditionellen Nachweisverfahren bislang nicht erfasst
wurden.
-
Ein weiterer Vorteil ist die hohe
Spezifität
der Oligonukleotide. Es können
sowohl spezifisch bestimmte Gattungen oder Gruppen von Mikroorganismen
nachgewiesen werden als auch hochspezifisch einzelne Spezies einer
Gattung.
-
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Probe in Schritt a) des Verfahrens gewonnen
-
- i) von der Hautoberfläche,
- ii) aus Lebensmitteln,
- iii) aus der Umwelt, insbesondere aus Wasser, Boden oder Luft,
- iv) aus Abwasser oder aus einem Biofilm,
- v) aus medizinischem Untersuchungsmaterial, oder
- vi) aus einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt.
-
Im Rahmen dieser bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Probe von der Hautoberfläche durch die Ablösung von
Mikroorganismen der Hautflora mittels einer Detergenslösung vom
zu untersuchenden Areal gewonnen.
-
Ein wesentlicher Vorteil besteht
beispielsweise darin, dass nun erstmals der gleichzeitige Nachweis dieser
medizinisch und kosmetisch relevanten Mikroorganismen der Hautmikroflora
möglich
ist. So können durch
Verwendung unterschiedlicher Marker für die Oligonukleotide ganz
nach Bedarf alle, mehrere oder einzelne Mikroorganismengruppen oder
-spezies parallel nachgewiesen und dabei klar voneinander unterschieden
werden. Auch können
so erstmals die Populationsverhältnisse
dieser Mikroorganismengruppen oder -spezies und die zwischen ihnen
bestehenden Wechselwirkungen analysiert werden. Dies eröffnet erstmals
die Möglichkeit
zur eindeutigen Diagnose und gezielten Behandlung von medizinisch
und/oder kosmetisch relevanten Hautproblemen. Es ist nun erstmals
möglich,
die Auswirkungen einer medizinischen Therapie oder kosmetischen
Behandlung auf die Gesamtmikroflora der Haut zu erfassen. Mögliche Wirkungen
ebenso wie unerwünschte
Wirkungen einer Behandlung können
so friih erkannt und in der weiteren Behandlung verstärkt bzw.
unterbunden werden.
-
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit
zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen. Erstmalig
können
somit Erkenntnisse beziiglich der absoluten und relativen quantitativen
Verhältnisse
der genannten Mikroorganismen der Hautmikroflora gewonnen werden.
Dies ermöglicht
vor, während
und nach einer medizinischen oder kosmetischen Behandlung die Überpriifung
des Erfolgs sowie aller Auswirkungen dieser Behandlung. In diesem
Zusammenhang ist weiterhin von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren
ausschließlich
lebende Mikroorganismen erfasst.
-
Bei der Probennahme von der Haut
des Probanden wird die Haut in Kontakt mit einer Detergenslösung gebracht,
die die Ablösung
der Mikroorganismen von der Hautoberfläche erleichtern soll. Bevorzugt
werden physiologisch unbedenkliche Detergenzien, wie z. B. Tween
oder Triton, in Konzentrationen von etwa 0,01-1 Gew.-% eingesetzt.
Ein pH-Wert zwischen 5 und 10, insbesondere zwischen 7 und 9, z.
B. 8, hat sich als günstig
erwiesen.
-
Um eine bessere Ablösung der
Mikroorganismen zu erreichen, wird die Hautoberfläche mit
Hilfe eines Schabeinstrumentes abgerieben. Es eignen sich dabei
Stäbe unterschiedlicher
Dicke, z. B. mit einem Durchmesser von 0,05 bis 1,5 cm, aus unterschiedlichen
Materialien wie beispielsweise Glas, Metall oder Plastik. Ebenso
sind Spatel aus den genannten Materialien mit einer abgerundeten
Fläche
geeignet. Bevorzugt finden Glasstäbe zwischen 0,4 und 0,8 cm
Durchmesser oder Plastikspatel Verwendung. Ebenfalls günstig eingesetzt werden
können
beispielsweise Mundstücke
von Glaspipetten, z. B. einer 5 ml Glaspipette. Als besonders geeignet
hat es sich erwiesen, rauere Oberflächen über die Haut zu reiben, um
die Ablösung
zu erhöhen.
-
Insbesondere geeignet sind Plastikspatel
mit rauer Oberfläche,
beispielsweise ein Probenahmespatel aus Polyamid glasfaserverstärkt der
Fa. Merck (Art. Nr. 231 J2412, Doppelspatel, Länge 180 mm). Ebenfalls erfindungsgemäß geeignet
sind Abreibungen mit Tupfern sowie die Probengewinnung durch Abklatschen
mit viskoseren Medien oder auch Hautabrisse mit Klebefilmen (beispielsweise
handelsübliche
Haushaltsklebestreifen). Die Mikroorganismen können bei diesen Methoden beispielsweise
durch Abwaschen mit einer entsprechenden Pufferlösung von diesen Gegenständen gewonnen
werden. Das weitere Verfahren kann auch direkt auf dem Klebestreifen
durchgeführt
werden.
-
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren
auch bei der Kontrolle von Lebensmitteln angewendet. Insbesondere
werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt,
Käse, Quark,
Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren
oder Fleischwaren entnommen.
-
Des weiteren können beispielsweise Umweltproben
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersucht werden. Diese
Proben können
hierzu aus Luft, Wasser oder aus dem Boden entnommen sein.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur
Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist für die Untersuchung
von Gewebeproben, z.B. Biopsiematerial aus der Lunge, Tumor- oder
entzündliches
Gewebe, aus Sekreten wie Schweiß,
Speichel, Sperma und Ausfluss aus der Nase, Harnröhre oder Vagina
sowie für
Urin- oder Stuhlproben geeignet.
-
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende
Verfahren ist die Untersuchung von Abwässern, z.B. Belebtschlamm,
Faulschlamm oder anaeroben Schlamm. Darüber hinaus ist es geeignet,
Biofilme in industriellen Anlagen zu analysieren, sowie auch sich
natiirlicherweise bildende Biofilme oder bei der Abwasserreinigung
bildende Biofilme zu untersuchen.
-
Auch die Untersuchung pharmazeutischer
und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte etc.
z.B. auf Kontamination mit Mikroorganismen ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
möglich.
-
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Fixierung durch
-
- i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise
ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen,
- ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus
einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd,
oder
- iii) als Hitzefixierung
-
Insbesondere können die Mikroorganismen nach
dem Fixieren auf einem Träger
immobilisiert werden.
-
Gemäß einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden die fixierten Zellen der Mikroorganismen vor Schritt c) des
erfindungsgemäßen Verfahrens
permeabilisiert.
-
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
wird unter „Permeabilisierung" eine enzymatische
Behandlung der Zellen verstanden. Durch diese Behandlung wird die
Zellwand von Pilzen und gram-positiven Bakterien für die Oligonukleotide
durchlässig
gemacht. Hierfür
geeignete Enzyme, deren geeignete Konzentrationen und für diese
geeignete Lösungsmittel
sind dem Fachmann bekannt. Es versteht sich von selbst, dass das
erfindungsgemäße Verfahren
auch zur Analyse gram-negativer Bakterien geeignet ist; die enzymatische
Behandlung zur Permeabilisierung wird dann entsprechend adaptiert,
es kann auf diese dann auch ganz verzichtet werden.
-
Die Permeabilisierung der Zellen
vor der Hybridisierung hat den Vorteil, dass die Oligonukleotide
zwar in die Zellen eindringen können,
die Ribosomen und somit die rRNA aber nicht aus den Zellen entweichen kann.
Der große
Vorteil dieser Technik der Ganzzellhybridisierung ist, dass die
Morphologie der Bakterien intakt bleibt und man diese intakten Bakterien
in situ, also in ihrem natiirlichen Umfeld detektieren kann. Folglich können die
Bakterien nicht nur quantifiziert werden, sondern auch eventuelle
Assoziationen zwischen verschiedenen bakteriellen Gruppen nachgewiesen
werden.
-
Ganz besonders bevorzugt kann die
Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer
Enzyme, bevorzugt ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase
K, Pronase und Mutanolysin erfolgen.
-
Nach einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein als Positivkontrolle
geeignetes Oligonukleotid bereit gestellt. Ein solches Oligonukleotid
ist dadurch gekennzeichnet, dass es möglichst viele, optimalerweise
alle in der analysierten Probe enthaltenen Bakterien bzw. Eurkaryonten
erfasst. Hierzu ist beispielsweise das von Amann et al., (1990)
beschriebene Oligonukleotid EUB338 (Bakterien) bzw. das Oligonukleotid
EUK (Eukaryonten) geeignet. Eine solche Positivkontrolle kann zur Überpriifung
der ordnungsgemäßen Durchführung des
angewendeten Verfahrens eingesetzt werden. Vor allem aber erlaubt
sie die Bestimmung eines prozentualen Anteils der spezifisch nachgewiesenen
Mikroorganismen gegenüber
der Bakteriengesamtpopulation.
-
Bereitgestellt wird weiterhin ein
Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dieser Kit enthält als wichtigste
Bestandteile die jeweiligen Hybridisierungslösungen mit den oben beschriebenen
jeweils für
die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotiden.
Weiterhin ist kann enthalten sein eine entsprechende Hybridisierungslösung ohne
Oligonukleotide sowie die entsprechende Waschlösung oder ein Konzentrat der
entsprechenden Waschlösung.
Weiterhin können
gegebenenfalls enthalten sein Enzymlösungen, Fixierungslösungen sowie
gegebenenfalls eine Einbettlösung.
Gegebenenfalls sind Hybridisierungslösungen zur parallelen Durchführung einer
Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle (beispielsweise ohne oder
mit nichthybridisierenden Oligonukleotiden) enthalten.
-
Gemäß einer besonderen Ausführungsform
wird das Kit zum Nachweis von Mikroorganismen der Hautmikroflora
verwendet. So ist die Verwendung des Kits bei der Wirkstoffsuche,
bei der Analyse der Mikroflora der Haut sowie bei der Testung der
Wirkung von wirkstoffhaltigen Kosmetika vorteilhaft. Die Untersuchung von
Proben sowohl von menschlicher als auch von tierischer Haut kann
mit den erfindungsgemäßen Kits
effizient und auch gegen einen hohen Hintergrund von anderen Mikroorganismen
erfolgen.
-
Das folgende Beispiel soll die Erfindung
beschreiben, ohne sie einzuschränken:
Nachweis
von Mikroorganismen der Hautmikroflora
-
Probenahme:
-
Die Probenahme erfolgt mittels der
Detergens-Waschmethode ((P. Williamson, A.M. Kligman. (1965) J.
Invest. Derm., Vol. 45, No. 6).
-
Durchführung:
-
- 1. Der beidseitig offene Kunststoffzylinder
wird mit der nicht beschädigten
Seite auf die zu untersuchende Hautoberfläche gedrückt und mit 1,5ml der Detergenslösung (eine
physiologische Tween-Pufferlösung,
pH 8,0 mit 0,523 KHP2O4 g/Liter,
16,73 KHP2O4 g/Liter,
8,50 NaCl g/Liter, 10,00 Tween 80 g/Liter und 1,00 Trypton g/Liter)
gefiillt.
- 2. Mit einem der o.g. Schabegeräte wird die zu behandelnde
Fläche
6x horizontal und 6x vertikal unter leichtem Druck abgerieben.
- 3. Die Prozedur wird nach Absaugen der Fliissigkeit wiederholt.
-
Die beiden Fliissigkeiten werden
vereinigt. Ein Teil der Probe aus den beiden vereinigten Fliissigkeiten wird
für den
anschließenden
Nachweis unter Verwendung von Oligonukleotiden verwendet, ein anderer
Teil wird für
den als Kontrolle dienenden, parallel durchgeführten Nachweis durch Kultivierung
der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verwendet.
-
Zum Ansetzen der Detergenslösung soll
keimfreies Wasser (z. B. Millipore-Wasser) eingesetzt werden.
-
Fixierung:
-
Die entnommene Probe wird sodann
mit einem Volumen absolutem Ethanol versetzt und zentrifugiert (Raumtemperatur,
8.000 U/min, 5 Minuten). Der Überstand
wird verworfen und das Pellet in einem Volumen 1 x PBS-Lösung gewaschen.
Abschließend
wird das Pellet in 1/10 Volumen Fixierungslösung (50 % Ethanol) resuspendiert
und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
-
Ein Aliquot der Zellsuspension wird
auf einen Objektträger
aufgebracht und getrocknet (46°C,
30 min oder bis vollständig
trocken). Anschließend
werden die Zellen vollständig
dehydratisiert durch Aufbringen einer weiteren Fixierungslösung (Ethanol
absolut) und erneut getrocknet (46°C, 3 min oder bis vollständig trocken).
-
Permeabilisierung:
-
Anschließend wird ein geeignetes Volumen
einer geeigneten Enzymlösung
aufgebracht und die Probe inkubiert (Raumtemperatur, 15 min). Dieser
Schritt wird ggf. mit einer weiteren geeigneten Enzymlösung wiederholt.
-
Die Permeabilisierungslösung wird
mit destilliertem Wasser entfernt und die Probe erneut vollständig getrocknet
(Inkubation bei 46°C
bis vollständig
trocken). Anschließend
werden die Zellen erneut vollständig
dehydratisiert durch Aufbringen der Fixierungslösung (Ethanol absolut) und
erneut getrocknet (46°C,
3 min oder bis vollständig
trocken).
-
Hybridisierung:
-
Anschließend wird auf die fixierten,
vollständig
aufgeschlossenen und dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung mit
den weiter oben beschriebenen für
die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotide
aufgebracht. Der Objektträger
wird anschließend
in einer mit Hybridisierungslösung
(ohne Oligonukleotide) befeuchteten Kammer (46°C, 90 min).
-
Waschen:
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Anschließend wird der Objektträger in eine
mit Waschlösung
befüllte
Kammer eingetaucht und inkubiert (46°C, 15 min).
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Anschließend wird der Objektträger in eine
mit destilliertem Wasser befüllte
Kammer kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung
luftgetrocknet (46°C,
30 min oder bis vollständig
trocken).
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Detektion:
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Anschließend wird der Objektträger in einem
geeigneten Einbettmedium eingebettet. Abschließend wird die Probe mit Hilfe
eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.
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Analysenergebnis Mischhaut:
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Von einer weiblichen Probandin mit
Mischhaut (typisiert durch eine Kosmetikerin und bestätigt durch Sebometer-Messungen)
wurden Mikroorganismen-Proben von der Stirn mittels der oben beschriebenen
Methode zur Probennahme genommen.
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Es wurde ein sehr hoher Anteil an
Propionibakterien durch Auszählung
der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der Gesamtzellzahl festgestellt
(> 90%). Es wurde
ein geringer Anteil von Staphylokokken festgestellt (< 10%). Es wurden
keine Corynebakterien gefunden.
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