EP1523579A2 - Obligonukleotide zum nachweis von mikroorganismen - Google Patents

Obligonukleotide zum nachweis von mikroorganismen

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Publication number
EP1523579A2
EP1523579A2 EP03765004A EP03765004A EP1523579A2 EP 1523579 A2 EP1523579 A2 EP 1523579A2 EP 03765004 A EP03765004 A EP 03765004A EP 03765004 A EP03765004 A EP 03765004A EP 1523579 A2 EP1523579 A2 EP 1523579A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
oligonucleotide
under
iii
microorganisms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03765004A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andrea SÄTTLER
Claudia Jassoy
Regine Scholtyssek
Vera Maienschein
Silke Nieveler
Albrecht Weiss
Karl-Heinz Trebesius
Claudia Beimfohr
Wolfgang Ludwig
Richard Robert Bamberg
Karl-Heinz Schleifer
Stefan Müllner
Ingrid Bergmaier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Vermicon AG
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Vermicon AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2002132776 external-priority patent/DE10232776A1/de
Priority claimed from DE2003107732 external-priority patent/DE10307732A1/de
Application filed by Henkel AG and Co KGaA, Vermicon AG filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1523579A2 publication Critical patent/EP1523579A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to oligonucleotides for the detection of microorganisms, a method for the detection of the microorganisms and a kit for carrying out this method.
  • microorganisms The detection of microorganisms is still predominantly carried out serologically or microscopically.
  • the methods are not sensitive enough to directly detect small amounts of microorganisms. For this reason, a cultivation step in which the microorganisms were propagated has been carried out up to now.
  • a disadvantage of this method is that some of the microorganisms do not grow on the available nutrient media and therefore cannot be detected.
  • Studies on various environmental samples show that e.g. Currently only between 0.1 to 14% of all bacteria can be cultivated. Cultivation-dependent methods have proven to be unsuitable, in particular for analyzing the composition of a complex biocenosis.
  • hybridization means in particular the formation of a double helix from two single-stranded, complementary oligo- or polynucleotides. Hybridization can in particular arise between two DNA or two RNA molecules, but also between DNA and RNA molecules. The different molecules hybridize only if the target sequences are sufficiently complementary to one another.
  • the complementary target sequences for the detection can also be immobilized, as is often done on so-called DNA chips.
  • a carrier DNA chip
  • Oligonucleotides which are complementary to known reference sequences of certain bacteria or viruses which occur in the oral flora are immobilized on this support. Due to the complementarity, the oligonucleotides applied to this gene chip can hybridize with the corresponding reference sequences under certain conditions.
  • a disadvantage of this carrier is that the microorganisms either have to be propagated by cultivation or the genetic information from the samples present has to be amplified on the chip before hybridization. It is therefore also not possible to quantify the microorganisms originally present in a sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a characteristic piece of the respective microorganism quantity is amplified with specific primers. If the primer finds its destination, a piece of the genetic material multiplies millions of times.
  • a qualitative assessment can take place. In the simplest case, this leads to the statement that the target points for the used primers were present in the sample examined. No further statements are possible; these target sites can originate from a living bacterium as well as from a dead bacterium or from naked DNA. A differentiation is not possible here.
  • Various substances present in the examined sample can also inhibit the DNA-amplifying enzyme, the Taq polymerase.
  • PCR technique quantitative PCR, in which an attempt is made to establish a correlation between the amount of microorganisms present and the amount of amplified DNA.
  • the advantages of PCR are its high specificity and the short time it takes.
  • Significant disadvantages are their high susceptibility to contamination and the false positive results they cause, as well as the aforementioned lack of ability to differentiate between living and dead cells or naked DNA, and finally the risk of false negative results due to the presence of inhibitory substances.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • microorganism species, species or groups can be identified in the sample in a highly specific manner and, if necessary, visualized or quantified. This method is the only method that provides a distortion-free representation of the actual in situ conditions of the biocenosis. Even microorganisms that have not yet been cultivated and therefore not described can be identified.
  • FISH FISH, probes penetrate the cells in the sample under investigation. If a microorganism of the type, genus or group for which the probes were developed is present in the sample under investigation, the probes in the microorganism cell bind to their target sequence and the cells can be detected on the basis of the labeling of the probes.
  • probes can be used to detect numerous microorganisms that traditional cultivation does not detect. While only a maximum of 15% of the bacterial population of a sample can be made visible by cultivation, the FISH technique allows detection of up to 100% of the total bacterial population in many samples. Second, the detection of microorganisms using the FISH technique is much faster than using cultivation. If the identification of microorganisms by cultivation often takes several days, it only takes a few hours from sampling to microorganism identification even at the species level using the FISH technique. Thirdly, in contrast to a cultivation medium, the specificity of probes can be chosen almost arbitrarily. Individual species can be detected with a probe just as easily as entire genera or groups of microorganisms. Fourthly, microorganism types or entire microorganism populations can be precisely quantified directly in the sample. Fifthly, associations and associations of different microorganisms can be visualized in one sample.
  • the FISH In contrast to PCR, the FISH reliably detects only living microorganisms. False positive results due to bare DNA or dead microorganisms such as PCR are excluded with the FISH. Furthermore, false negative results due to the presence of inhibitory substances are excluded, as are false positive results due to contamination.
  • the FISH technique is therefore an outstanding tool for quickly and extremely specifically detecting microorganisms directly in a sample. In contrast to cultivation methods, it is a direct method and also allows the microorganisms contained in the sample to be quantified.
  • the human skin for example, with an area of approximately 2 m 2, is one of the largest human body organs inhabited by microorganisms. In the course of evolution, a close relationship has developed between the host and its microbial inhabitants. The nutrients made available by the skin through various body glands are metabolized by microorganisms. The resulting acidification of the skin surface prevents the settlement of pathogenic microorganisms.
  • the metabolic activity of microorganisms can also have undesirable consequences. So is the development of body odor, dandruff and the development of various skin diseases. attributed to the activity of microbes.
  • yeast Malassezia is suspected to be particularly involved in the formation of flakes on the skin, for example on the head. This organism is also considered to trigger the skin disease pityriasis versicolor.
  • Propionihacterium acnes An increased occurrence of Propionihacterium acnes can indicate the development of acne at an early stage.
  • Transient flora microorganisms that cannot multiply on the human skin or are found only irregularly and in small numbers / proportions during examinations. According to the theory, these microorganisms are free and do not adhere to skin components.
  • oligonucleotides suitable as nucleic acid probes for other, more widespread microorganisms which can open up new areas of use.
  • probes for the detection of such microorganisms that can come into contact with humans and / or animals, e.g. in food, waste water, environmental samples or from the skin surface.
  • oligonucleotides for the detection of microorganisms selected from a group consisting of: i) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 01 to 30 specified
  • oligonucleotides which differ from one of those mentioned under i) and ii)
  • oligonucleotides the sequence being deleted or extended by one or more nucleotides, and iv) oligonucleotides, which have a sequence which belongs to one of the
  • Oligonucleotides under i), ii) or iii) is complementary, under stringent
  • Hybridize conditions as well as a method for using these oligonucleotides and a kit for applying the method.
  • microorganism group is to be understood as meaning at least two types of microorganisms which either belong to the same genus or have a very similar rRNA.
  • a microorganism group according to the invention can also contain, for example, all species of a genus.
  • oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 01 to 30 specified sequences and those oligonucleotides which correspond to these at least in 80%, preferably in at least 84%, particularly preferably in at least 90%, very particularly preferably in 95% of the nucleotides also includes those oligonucleotides which differ from the derive said oligonucleotides, wherein they are extended or deleted by one or more nucleotides.
  • oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 19 to 30 specified sequences and those oligonucleotides which correspond to these at least in 77%, preferably in at least 83%, particularly preferably in at least 88%, very particularly preferably in 94% of the nucleotides also includes those oligonucleotides which differ from the named ones Derive oligonucleotides, wherein they are extended or deleted by one or more nucleotides.
  • 1 to 40 preferably 1 to 25, in particular 1 to 15 nucleotides to be appended to the 3 'and / or 5' end of the oligonucleotides mentioned.
  • oligonucleotides which can be derived from the oligonucleotides mentioned in particular by deleting the sequence by 1 to 7, preferably 1 to 5, in particular one to three, for example one or two, nucleotides.
  • the microorganisms to be detected are selected from the genera Staphylococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia and / or the Sporomusa taxon.
  • the microflora of the skin has so far only been investigated using the known cultivation methods. Due to the methodological deficiency already mentioned, only cultivable bacteria or fungi were detected. For example, the following species were found: Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. cohnii, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis, S. warn, S. sciuri, S. schleifen, S. intermedius, Veillonella spec, Propionibacterium acnes , Malassezia sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur, Corynebacterium minutissimum, C. amycolatum, C. striatum and C.
  • skin is understood to mean human and / or animal skin or mucous membrane and the appendages of the skin (hair, hair follicles, nails, glands).
  • the oligonucleotide carries a detectable marker, in particular a fluorescent marker, which is in particular covalently bound to the oligonucleotide.
  • a detectable marker in particular a fluorescent marker
  • the detectability of the hybridization of the oligonucleotide with the target sequence is a prerequisite for the identification and, if necessary, quantification of the microorganisms. In particular, this is often achieved by covalently binding a detectable marker to the oligonucleotide.
  • Fluorescent groups for example Cy-2, Cy-3 or Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), FITC (fluorescein isothiocyanate), CT (5, (6) - carboxytetramethylrhodamine-N.) Are frequently used as detectable markers -hydroxysuccinimide ester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (tetramethylrhodamine-5,6-isothiocyanate (Molecular Probes Inc., see above) or FLUOS (5, (6) -carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester (Boehringer Mannheim, Mannheim , Germany))
  • chemiluminescent groups or radioactive labels eg 35S, 32P, 33P, 125J, are used, but detection can also be provided by coupling the oligonucleotide with an enzymatically active molecule, for example alkaline phosphatase, acidic phosphatase,
  • Alkaline phosphatase and 4-methylumbelliferyl phosphate (*) acid phosphatase bis (4-methylumbelliferyl phosphate), (*) 3-O-methylfluorescein, flavone-3-disphosphate triammonium salt (*), p-nitrophenylphosphate disodium salt
  • Peroxidase tyramine hydrochloride (*), 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid (*), p-hydroxyphenethyl alcohol (*), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline sulfonic acid) (ABTS), ortho-phenylenediamine dihydrochloride, o-Dianisidine, 5-aminosalicylic acid, p-Ucresol (*), 3,3'-dimethyloxybenzidine, 3-methyl-2-benzothiazolinehydrazone, tetramethylbenzidine
  • oligonucleotides in such a way that a further nucleic acid sequence suitable for hybridization is present at their 5 'or 3' end.
  • This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15-50 nucleotides.
  • This second nucleic acid region can in turn be recognized by an oligonucleotide which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable oligonucleotides with a hapten, which can then be brought into contact with an antibody that recognizes the hapten.
  • Digoxigenin can be cited as an example of such a hapten. The skilled worker is also well known about the examples given.
  • the enzymatic marker is selected from a group consisting of peroxidase, preferably horseradish peroxidase, and phosphatase, preferably alkaline phosphatase.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide combination for the detection of microorganisms containing at least one, preferably two or more of the said oligonucleotides.
  • an oligonucleotide combination is understood to mean a composition which contains at least one or more oligonucleotides, for example in a solution (for example a buffer solution) or a mixture (for example in the lyophilized state).
  • a solution for example a buffer solution
  • a mixture for example in the lyophilized state.
  • the oligonucleotides can also be present separately from one another (e.g. in different vessels), next to one another (for example on a chip or in a kit).
  • the oligonucleotide combination i) contains at least one oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Staphylococcus selected from the group consisting of a) Oligonucleotides with the in SEQ ID NO.
  • Genus Peptostreptococcus selected from the group consisting of a) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 04 to 06 and 27 to 29 sequences indicated, and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 ii) and c) oligonucleotides which match the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 iii ) agree and d) oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions.
  • oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Corynebacterium selected from the group consisting of a) Oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 07 to 12 and No.
  • oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Veillonella selected from the group consisting of a) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 13 to 15 specified sequences, and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 ii) and c) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 iii) and d ) Oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions.
  • oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the species Propionibacterium acnes selected from the group consisting of a) Oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 16 and 17 specified sequences, and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 ii) and c) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 1 iii) and d ) Oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions.
  • Genus Malassezia selected from the group consisting of a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO. 18 specified sequence and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotide under a) in accordance with the statements of claim 1 ii) and c) oligonucleotides which correspond with the oligonucleotide under a) in accordance with the statements in claim 1 iii) and d) oligonucleotides, which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions.
  • At least one oligonucleotide for the specific detection of microorganisms from the sporomusa taxon selected from the group consisting of a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO.
  • the oligonucleotides according to the invention enable the specific detection of microorganisms of the genera Staphylococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia and the Sporomusa taxon.
  • oligonucleotides each from one of the groups i), ii), iii), iv), v), vi) or vii) is to be understood here.
  • oligonucleotides selected from four groups ie from group i) with ii), iii) and iv) are also to be used; i) with ii), iii) and v); i) with ii), iii) and vi), i) with ii), iii) and vii); i) with ii), iv) and v); i) with ii), iv) and vi); i) with ii), iv) and vi); i) with ii), v) and vi), i) with ii), v) and vii); i) with ii), vi) and vii); i) with iii), vi) and vii); i) with iii), vi) and vii); i) with iii), vi) and vii); i) with iii), vi) and vii); i) with iii), vi) and vii
  • the oligonucleotide combination according to the invention is therefore suitable for detecting a microorganism species or a group of microorganisms.
  • one or more oligonucleotides according to i) are selected, for example, for the detection of certain species of Staphylococcus.
  • the combination of the oligonucleotides (according to the abovementioned Possible combinations) the detection of species and / or groups of microorganisms of the various genera mentioned can be carried out simultaneously and / or next to one another.
  • the detection of microorganisms of the genus Staphylococcus can be carried out simultaneously and / or next to one another to detect microorganisms of the species Propionibacterium acnes (by selecting one or more oligonucleotides according to v)) occur.
  • the possible combinations can thus be individually adapted to the respective requirements.
  • a suitable complementary sequence is present in the microorganism to be detected.
  • a sequence is suitable if, on the one hand, it is specific for the microorganism to be detected and, on the other hand, it is accessible at all to the penetrating oligonucleotide, that is, it is not masked by ribosomal proteins or rRNA secondary structures.
  • Fuchs and coworkers BM Fuchs, G. Wallner, W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann.
  • oligonucleotide with good binding behavior is by no means derived from the primary sequence of the rRNA and consequently cannot be found using consensus sequence search programs.
  • a type of microorganism, a type of microorganism or a group of microorganisms can be detected.
  • Complementarity should exist for an oligonucleotide of 15 nucleotides over 100% of the sequence. For oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one or more mismatching sites are allowed.
  • oligonucleotides are provided for the specific detection of microorganisms of the genus Staphylococcus, the oligonucleotides being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 01 to 03 specified sequences.
  • Each of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genus Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S. saccharolyticus, S. caprae, S. capitis, S. warn, S. pasteuri, S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S. succinus, S. kloosii, S. saprophyticus, S. equorum, S. xylosus, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. chromogenes, S. auricularis, S. schleifen, S. sciuri, S.
  • microorganisms with a similar rRNA sequence are not covered by these oligonucleotides: Paenibacillus polymyxa, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Proteus vulgaris, Burkholderiausocococides, and Bokholderia cepacis.
  • Paenibacillus polymyxa Bacillus lentus
  • Bacillus cereus Bacillus subtilis
  • Bacillus mycoides Proteus vulgaris
  • Burkholderiausocococides Burkholderiausocococides
  • Bokholderia cepacis Bokholderia cepacis
  • the oligonucleotide according to SEQ ID NO. 02 is for the detection of microorganisms of the genus Staphylococcus, in particular of S. intermedius, S. delphini, S. muscae, S. condimenti, S. piscifermentans, S. carnosus, S. grind, S. felis and S. simulans, preferred by S. intermedius and S. grind suitable.
  • a combination of the oligonucleotides with those under SEQ ID NO is particularly preferred. 01 to 02 specified sequences. This combination detects at least the following species of the genus Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S. caprae, S. capitis, S. warn, S. pasteuri, S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S. succinus , S. kloosii, S. saprophyticus, S. equorum, S. xylosus, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. chromogenes, S. auricularis, S.
  • oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the genus Peptostreptococcus are also provided, the oligonucleotides being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 04 to 06 and 27 to 29 specified sequences.
  • the bacteria known under the generic name "Peptostreptococcus” can be assigned to various subgroups, in particular the genera Anaerococcus, Peptoniphilus or Finegoldia, according to the latest findings.
  • Each of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genera Anaerococcus, Peptoniphilus or Finegoldia belonging to the generic term "Peptostreptococcus”: P. assaccharolyticus, P. lacrimalis, P. hareii, F. magnus, A. tetradius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, and A. vaginalis.
  • oligonucleotides with the under SEQ ID NO. 04 to 06 specified sequences. These oligonucleotides each detect at least the following peptostreptococcal species, in particular those of the genus Anaerococcus: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii, Anaerococcus tetradius and A. vaginalis.
  • the species of the genus Peptostreptococcus mentioned below and other microorganisms with a similar rRNA sequence, but which do not belong to the genus Peptostreptococcus, in particular Anaerococcus, are not covered: Peptoniphilus lacrimalis, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magniotus, and Ruminididoccus product, and Ruminidocibus product, as well as Ruminidococcus Clostridium hastiform.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 04 specified sequence detects at least the following species of the microorganisms falling under the generic term "Peptostreptococcus”: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii and A. vaginalis.
  • oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the genus Peptostreptococcus are also provided, the oligonucleotides being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 27 to 29 sequences indicated.
  • the species of the genus Peptostreptococcus mentioned below and other microorganisms with a similar rRNA sequence, but which do not belong to the peptostreptococci, are not recorded; Micromonas micros, Helcococcus kunzii, Helcococcus ovis.
  • the oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 27 and 28 specified sequences detect at least the following species of the genus Peptoniphilus: Peptoniphilus assaccharolyticus, P. hareii, P. indolicus (in particular the ATCC 29427 strain and those strains which are closely related to it, ie have a very similar rRNA) and P. lacrimalis.
  • Pseudomonas saccharophila Variovorax paradoxus
  • Finegoldia magna Staphylococcus epidermidis
  • Propionibacterium acnes Micromonas micros, Gallicola baranese, Atopobium parvulum, Veilonella dispar and Cseudiesococcus putida, as well as Pseudomonocacterium putida and Pseudomonocacterium putida.
  • the oligonucleotide with the under SEQ ID No. 28 specified sequence detects in particular microorganisms of the species Peptoniphilus lacrimalis.
  • the oligonucleotide with that under SEQ ID NO. 29 specified sequence.
  • This oligonucleotide detects at least the species Finegoldia magna from the microorganisms falling under the generic term "peptostreptococci" and those microorganisms which are very similar in their rRNA sequence, while the following microorganisms cannot be detected at the same time: Anaerococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus anaerhilus, Pepton lacrimalis, Staphylococcus epidermidis, Halocella cellulosilytica, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Veillonella dispar, Pseudomonas putida and other species of the genera Anaerococcus, Corynebacterium and Peptoniphilus.
  • oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the genus Corynebacterium are also provided, the oligonucleotides being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 07 to 12 specified sequences.
  • Each of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genus Corynebacterium: C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. macginleyi, C. accolens, C. fastidiosum, C. segmentosum, C. ammoniagenes, C. minutissimum, C. flavescens, C. coyleiae, C. afermentans, C. pseudogenitalium, C. genitalium, C. mucofaciens, C. auris, C. mycetoides, C. cystitidis, C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C.
  • ulcerans C. diphteriae, C. vitarumen, C. carriages, C. genitalium, C. argentoratens, C. callunae, C. bovis, C. variabilis, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum", C. xerosis, C. matruchotii, C. jeikeium, C. efficiens, C. thomsenii, C. nigricans, C. auriscanis, C. mooreparkense, C. casei, C. camporealensis, C. sundsvallense, C. mastidis, C. imitans, C. riegelii, C. asperum, C. freneyi, C. striatum, C. coyleiae and C. simulans.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 10 specified sequence used for the detection of Corynebacteria of the species C. striatum and / or C. xerosis.
  • oligonucleotide with the under SEQ ID NO. 11 specified sequence used for the detection of Corynebacteria of the species C. jeikeium.
  • a combination of the oligonucleotides with those under SEQ ID NO is particularly preferred. 07, 08, 10 and 11 specified sequences. This combination detects at least the following species of the genus Corynebacterium: C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. macginleyi, C. accolens, C. fastidiosum, C. segmentosum, C. ammoniagenes, C. minutissimum, C. flavescens , C. coyleiae, C. afermentans, C. pseudogenitalium, C. "genitalium", C. mucofaciens, C. auris, C. mycetoides, C.
  • cystitidis C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, C. diphteriae , C. camporealensis, C. vitarumen, C. kutscheri, C. argentoratens, C. callunae, C. bovis, C. renale, C. riegelii, CC variabilis, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum", C. xerosis, C. matruchotii, C. jeikeium.
  • oligonucleotides are provided for the specific detection of microorganisms of the genus Corynebacterium, the oligonucleotides being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with those under SEQ ID NO. 19 to 26 specified sequences.
  • Each of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genus Corynebacterium: C. coyleiae, C. afermentans, C. "genitalium”, C. mucifaciens, C. amycolatum, C. “tuberculostearicum” and C. riegelii. These oligonucleotides are suitable for specifically detecting a group from one or more, very closely related species of the genus Corynebacterium.
  • microorganisms with a similar rRNA sequence are advantageously not detected by these oligonucleotides:. Clostridium acetobutylicum, Eubacterium yurii and Fusobacterium nucleatum. The following bacteria belonging to the skin microflora are also not recorded: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus and Streptococcus pyogenes. This is a particular advantage and shows the high specificity of the probes.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 19 specified sequence for the detection of a group of microorganisms from the genus Corynebacterium used by C. "tuberculostearicum" (in particular ATCC 35692) or the group around the strain with the designation CDC G5840 (Acc. No. X80498) and such microorganisms is formed, which have a very similar rRNA.
  • microorganisms which are very closely related to the microorganism or whose rRNA has a high degree of identity and / or in particular in the section hybridizing with the oligonucleotide mentioned with the rRNA of the said microorganisms completely or almost completely (ie with a deviation of one or more, preferably one to three nucleotides) agree.
  • This probe advantageously detects C. "tuberculostearicum” and the species of the genus Corynebacterium that have a very similar rRNA without detecting the following, more closely related species of the genus Corynebacterium: C. minutissimum, C. diphteriae, C. striatum, C. xerosis, C. "fastidiosum", C. camporealensis, C. accolens and C. "pseudogenitalium” as well as C. afermentans, C. jeikeium, C. durum, C. mucifaciens, C. renale, C. riegelii, C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.
  • C. amycolatum and species closely related to this species is the probe with the probe under SEQ ID NO. 20 specified sequence used.
  • This probe advantageously detects C. amycolatum, and those species of the genus Corynebacterium which have a very similar rRNA and which, in particular in the portion of the rRNA hybridizing with said oligonucleotide, has only a few, preferably no mismatches, without the following, more distant related species of the To detect genus Corynebacterium; C. "asperum", C. jeikeium, C. bovis, C. freneyi, C. afermentans, C. durum, C. matruchotii, C.
  • mucifaciens C. renale, C. glutamicum, and C. xerosis and C. lipophiloflavum , C. glucuronolyticum, C. minutissimum, C. ammoniagenes, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. riegelii, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 21 specified sequence for the detection of certain species of microorganisms, in particular the genus Corynebacterium, which with the partial sequence of 16 S rRNA indicated under Seq ID No 31 is used in at least 60%, preferably in at least 70%, particularly preferably in at least 80% and entirely particularly preferably in at least 90%, for example at least 95% of the nucleotides match.
  • This probe advantageously detects the specified species of the genus Corynebacterium without detecting the following, more closely related species of the genus Corynebacterium; C. "genitalium", C. mucifaciens, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 23 specified sequence used for the detection of Corynebacteria of the species C. afermentans.
  • This probe advantageously detects C. afermentans and those species of the genus Corynebacterium which have a rRNA very similar to these species without detecting the following, more distant, related species of the genus Corynebacterium; C. "genitalium", C. mucifaciens, C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. riegelii, C. thomssenii. C. pseudogenitalium and C. lipophiloflavum as well as C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C.
  • the oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 25 specified sequence used for the detection of Corynebacteria of the species C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae and / or "C. genitalium"
  • This probe advantageously detects C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae and "C. genitalium” as well as those species of the genus Corynebacterium which have an rRNA very similar to these species without detecting the following, more closely related species of the genus Corynebacterium; C. xerosis, C. jeikeium, C. urealyticum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. striatum, C. accolens, C. renale, C. ammoniagenes and C. kutscheri and C. glucuronolyticum, C. camporealensis, C. pseudotuberculosis, C. durum, C. minutissimum, C. lipophiloflavum, C. callunae and C. thomssenii.
  • This oligonucleotide also does not detect the following microorganisms, which do not belong to the genus Corynebacterium, but have a similar rRNA: Nanomurea fastidiosa, Micromonospora echinospora, Abiotropha elegans and Arcanobacterium pyogenes.
  • oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the genus Veillonella are furthermore provided according to the invention, the probes being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with the SEQ ID NO. 13 to 15 specified sequences.
  • Each of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genus Veillonella: V. dispar, V. parvula and V. atypica. Since the genus Veillonella is largely isolated in the phylogenetic family tree, advantageously no detection of non-target organisms is found.
  • a combination of the oligonucleotides with those under SEQ ID NO is particularly preferred. 13 to 14 specified sequences. This combination detects at least the following species of the genus Veillonella: V. dispar, V. parvula and V. atypica.
  • oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the species Propionibacterium acnes are also provided, the probes being complementary to the rRNA and being selected from a group consisting of oligonucleotides with the SEQ ID NO. 16 to 17 specified sequences. Each of the specified oligonucleotides specifically detects the Propionibacterium acnes species.
  • microorganisms with a similar rRNA sequence are not recorded: P. propionicus, P. granulosum, P. avidum, P. freudenreichii, P. thoeni, P. lymphophilus, C. minutissimum, Saccharomonospora viridis, Nocardiodes spec, Propioniferax innocua, Gordonia sputi and Arcanobacterium.
  • an oligonucleotide for the specific detection of microorganisms of the genus Malassezia is further provided according to the invention, the oligonucleotide being complementary to the rRNA and that under SEQ ID NO. Has 18 specified sequence.
  • the specified oligonucleotide detects at least one of the following species of the genus Malassezia: M. sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur.
  • the specified oligonucleotide detects at least the species Acidaminococcus fermentans, Phascolarctobacterium faecium and with them closely related microorganisms with very similar rRNA, but not the following microorganisms: Veillonella spec. Halobacillus halophilus, Sporomusa paucivorans, Macrococcus caseolyticus, Anaeromusa acidaminophila, Halocella cellulosilytica, Peptostreptococcus anaerobius, Succiniclasticum ruminis and Succinispira mobilis.
  • unlabeled oligonucleotides can also be used together with labeled oligonucleotides.
  • the incubation of samples with unlabelled and labeled oligonucleotides preferably serves to increase the specificity of the probes. For example, it is possible to distinguish closely related species from microorganisms by using an oligonucleotide for an undetectable species that is closely related to a species to be detected, which under the selected conditions hybridizes better with the target sequence of the rRNA of the undetectable microorganism than that marked probe.
  • the unlabeled probe hybridizes better with the rRNA of the undetectable microorganism than the labeled probe, binding of the labeled probe to the rRNA of the undetectable microorganism and thus a false positive result is prevented by using the unlabeled oligonucleotide (competitor).
  • the specific detection of certain microorganism species or groups of microorganisms is thereby made possible, especially in the presence of closely related species with a very similar rRNA sequence.
  • the oligonucleotide according to SEQ ID No. 21 it is suitable according to the invention, together with the oligonucleotide according to SEQ ID No. 21 the oligonucleotide according to SEQ ID No. 22 to use.
  • the oligonucleotide according to SEQ ID No. 21 marked and the oligonucleotide according to SEQ ID No. 22 used unmarked.
  • the microorganism species, the 16 S rRNA sequence of which is shown under SEQ ID No. 31 specified sequence includes, can be detected easily, without that C. afermentans is detected at the same time (compare analysis result in the example). It can also be suitable according to the invention to use oligonucleotides of SEQ ID No. Use 23 and 24 together.
  • oligonucleotide with SEQ ID No. 23 marked as a probe is used to detect C. afermentans, masks the oligonucleotide according to SEQ ID No. 24 the very similar target sequence of the microorganism species, the 16 S rRNA sequence of which is shown under SEQ ID No. 31 specified sequence includes.
  • oligonucleotide according to SEQ ID No. 26 as an unlabeled competitor together with the oligonucleotide according to SEQ ID No. 25 are used.
  • the oligonucleotide combination of one or more oligonucleotides according to SEQ ID No. 19 to 30 contains one or more further oligonucleotides for the detection of species of the genera Staphylococcus, Veillonella, Malassezia and / or Propionibacterium. Different skin-relevant microorganisms can then advantageously be detected simultaneously or in parallel in a sample, in particular in a single process or method.
  • oligonucleotides disclosed herein are particularly suitable, in particular those according to SEQ ID No. 1 to 18.
  • the implementation of the method according to the invention comprises the following steps: a) taking a sample b) fixation of the microorganisms contained in the sample taken c) incubation of the fixed microorganisms with at least one oligonucleotide to bring about hybridization d) removal of non-hybridized oligonucleotides and e) detection and, if necessary, quantification of the microorganisms hybridized with the oligonucleotides.
  • fixing the microorganisms is understood to mean a treatment with which the microorganism shell is made permeable to oligonucleotides. Ethanol is usually used for fixation. If the cell wall cannot be penetrated by the oligonucleotides using these measures, the person skilled in the art is sufficiently aware of further measures which lead to the same result. These include, for example, methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution or the like.
  • the fixed cells are incubated with, in particular, fluorescence-labeled oligonucleotides for the “hybridization”. After penetration of the cell envelope, these may bind to the target sequence corresponding to the oligonucleotide.
  • the bond is to be understood as the formation of hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid.
  • oligonucleotides are used in the process according to the invention with a suitable hybridization solution.
  • Such a hybridization solution contains, for example, formamide in a concentration between 0% and 80%, preferably from 0-45%, particularly preferably from 20% to 40% and has, for example, a salt concentration (the salt is preferably NaCl) between 0, 1 mol / l and 1.5 mol / l, preferably between 0.5 and 1.0 mol / l, particularly preferably 0.9 mol / l. Furthermore, it generally contains a detergent (usually SDS) in a concentration between 0.001% and 0.2%, preferably 0.005% to 0.1%, particularly preferably of 0.01%.
  • a detergent usually SDS
  • the solution contains a suitable buffer substance (eg Tris-HCl, Na citrate, HEPES, PIPES or the like), usually in a concentration between 0.01 mol / l and 0.1 mol / l, preferably in a concentration of 0.01 Mol / I to 0.05 mol / I, particularly preferably from 0.02 mol / I.
  • a suitable buffer substance eg Tris-HCl, Na citrate, HEPES, PIPES or the like
  • the pH of the hybridization solution is generally between 6.0 and 9.0, preferably between 7.0 and 8.0, particularly preferably around 8.0.
  • additives can be used, e.g. fragmented salmon sperm DNA or blocking reagents to prevent nonspecific binding in the hybridization reaction or polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone or dextran sulfate to accelerate the hybridization reaction.
  • substances can also be added which stain the DNA of all living and / or organisms contained in the sample (e.g. DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride).
  • DAPI fragmented salmon sperm DNA
  • 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride e.g. DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride.
  • the concentration of the oligonucleotide in the hybridization solution depends on the type of its labeling and the number of target structures. In order to enable fast and efficient hybridization, the number of oligonucleotides should exceed the number of target structures by several orders of magnitude. However, it should be borne in mind that an excessive amount of fluorescence-labeled oligonucleotides leads to increased background fluorescence.
  • the concentration of the oligonucleotides should therefore be in a range between 0.5 - 500 ng / ⁇ l.
  • the preferred concentration in the context of the method according to the invention is 1-10 ng of each oligonucleotide used per ⁇ l hybridization solution.
  • the volume of the hybridization solution used should be between 8 ⁇ l and 100 ml, in a preferred embodiment of the method according to the invention it is between 10 ⁇ l and 1000 ⁇ l, particularly preferably it is between 20 ⁇ j and 40 ⁇ l.
  • the duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours.
  • the Hybridization temperature is preferably between 44 ° C and 48 ° C, particularly preferably 46 ° C, the parameter of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and detergents in the hybridization solution depending on the oligonucleotides, in particular their lengths and the degree of complementarity Target sequence can be optimized in the cell to be detected.
  • the person skilled in the art is familiar with the relevant calculations here.
  • this washing solution can contain 0.001-0.1% of a detergent such as SDS, with a concentration of 0.01% being preferred, as well as Tris-HCl or another suitable buffer substance in a concentration of 0.001-0.1 mol / l , preferably 0.02 mol / I, the pH being in the range from 6.0 to 9.0, preferably around 8.0.
  • the detergent may be included but is not essential.
  • the washing solution usually also contains NaCl, the concentration depending on the stringency required being from 0.003 mol / l to 0.9 mol / l, preferably from 0.01 mol / l to 0.9 mol / l.
  • a NaCl concentration of 0.07 mol / l is particularly preferred.
  • NaCl concentrations of 0.05-0.22 mol / l are particularly suitable.
  • the washing solution can also contain EDTA, the concentration preferably being 0.005 mol / l.
  • the washing solution can also contain suitable amounts of preservatives known to the person skilled in the art.
  • the "washing off" of the unbound oligonucleotides is usually carried out at a temperature in the range from 44 ° C. to 52 ° C., preferably from 44 ° C. to 50 ° C. and particularly preferably at 44 ° C. to 48 ° C. for a period of 10- 40 minutes, preferably 15 minutes.
  • the final evaluation is possible with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer and others
  • the speed of this detection method is a particular advantage. While traditional cultivation takes up to seven days for detection, the result is available within three hours after using the method according to the invention. This enables for the first time an accompanying diagnostic control of the effects and undesirable effects of an applied treatment. It is also advantageous here that the method provided according to the invention makes it possible to detect all of the microorganisms mentioned at the same time, which means a further time advantage, since all steps from sampling to evaluation need only be carried out once.
  • Another advantage is the possibility to quantify the detected microorganisms.
  • a further advantage is the fact that the oligonucleotides provided according to the invention can now also be used for the first time to detect such microorganisms, for example of the skin microflora, which have not previously been recorded by the traditional detection methods.
  • oligonucleotide or the oligonucleotides used a wide variety of groups of microorganisms can be detected.
  • Another advantage is the high specificity of the oligonucleotides. Specifically determined genera or groups of microorganisms can be detected as well as highly specific individual species of a genus.
  • the sample is obtained in step a) of the method i) from the skin surface, ii) from food, iii) from the environment, in particular from water, soil or air, iv) from waste water or from a biofilm , v) from medical examination material, or vi) from a pharmaceutical or cosmetic product.
  • the sample is obtained from the skin surface by detaching microorganisms of the skin flora by means of a detergent solution from the area to be examined.
  • a major advantage is, for example, that it is now possible for the first time to simultaneously detect these medically and cosmetically relevant microorganisms of the skin microflora.
  • By using different markers for the oligonucleotides all, several or individual groups or species of microorganisms can be detected in parallel and clearly differentiated from one another, as required. It also allows the population relationships of these microorganism groups or species and the interactions between them to be analyzed for the first time. This opens up for the first time the possibility of a clear diagnosis and targeted treatment of medically and / or cosmetically relevant skin problems. It is now possible for the first time to record the effects of medical therapy or cosmetic treatment on the overall microflora of the skin. Possible effects as well as undesirable effects of a treatment can be recognized early and can be strengthened or prevented in the further treatment.
  • Another advantage is the possibility to quantify the detected microorganisms. For the first time, insights into the absolute and relative quantitative relationships of the microorganisms mentioned in the skin microflora can be obtained. This enables the success and all effects of this treatment to be checked before, during and after medical or cosmetic treatment. In this context, it is also advantageous that the method according to the invention only detects living microorganisms.
  • a detergent solution which is intended to facilitate the detachment of the microorganisms from the skin surface.
  • Physiologically acceptable detergents such as. B. Tween or Triton, used in concentrations of about 0.01-1 wt .-%.
  • the skin surface is rubbed off with the help of a scraping instrument.
  • a scraping instrument There are bars of different thicknesses, for. B. with a diameter of 0.05 to 1.5 cm, made of different materials such as glass, metal or plastic. Spatulas made of the materials mentioned with a rounded surface are also suitable. Glass rods between 0.4 and 0.8 cm in diameter or plastic spatulas are preferred. Mouthpieces from glass pipettes, e.g. B. a 5 ml glass pipette. It has proven to be particularly suitable to rub rougher surfaces over the skin in order to increase the detachment.
  • Plastic spatulas with a rough surface are particularly suitable, for example a sampling spatula made of glass fiber reinforced polyamide from Merck (Art. No. 231J2412, double spatula, length 180 mm). Also suitable according to the invention are rubbing with swabs and the sampling by clapping with more viscous media or skin tears with adhesive films (for example commercial household adhesive strips). In these methods, the microorganisms can be obtained from these objects, for example, by washing with an appropriate buffer solution. The further procedure can also be carried out directly on the adhesive strip.
  • the method according to the invention is preferably also used for the control of foods.
  • the food samples are taken from milk or milk products (yogurt, cheese, quark, butter, buttermilk), drinking water, drinks (lemonades, beer, juices), baked goods or meat products.
  • environmental samples can be examined for the presence of microorganisms using the method according to the invention.
  • these samples can be taken from air, water or from the ground.
  • the method according to the invention can also be used to examine medical samples. It is for the examination of tissue samples, e.g. Biopsy material from the lungs, tumor or inflammatory tissue, from secretions such as sweat, saliva, sperm and discharge from the nose, urethra or vagina as well as for urine or stool samples.
  • tissue samples e.g. Biopsy material from the lungs, tumor or inflammatory tissue, from secretions such as sweat, saliva, sperm and discharge from the nose, urethra or vagina as well as for urine or stool samples.
  • Another area of application for the present method is the investigation of waste water, eg activated sludge, digested sludge or anaerobic sludge.
  • waste water eg activated sludge, digested sludge or anaerobic sludge.
  • it is suitable to analyze biofilms in industrial plants, as well as to examine naturally forming biofilms or biofilms that form during wastewater treatment.
  • the method according to the invention can also be used to examine pharmaceutical and cosmetic products, for example ointments, creams, tinctures, juices etc., for example for contamination with microorganisms.
  • fixation is carried out by i) denaturing reagents, preferably selected from a group consisting of ethanol, acetone and ethanol-acetic acid mixtures, ii) crosslinking reagents, preferably selected from a group consisting of formaldehyde, paraformaldehyde and glutaraldehyde, or iii) as heat fixation
  • the microorganisms can be immobilized on a support after being fixed.
  • the fixed cells of the microorganisms are permeabilized before step c) of the method according to the invention.
  • permeabilization means an enzymatic treatment of the cells. This treatment makes the cell wall of fungi and gram-positive bacteria permeable to the oligonucleotides. Enzymes suitable for this, their suitable concentrations and solvents suitable for these are known to the person skilled in the art. It goes without saying that the method according to the invention is also suitable for analyzing gram-negative bacteria; the enzymatic treatment for permeabilization is then adapted accordingly, and this can then be dispensed with entirely.
  • Permeabilization of the cells prior to hybridization has the advantage that the oligonucleotides can penetrate the cells, but the ribosomes and thus the rRNA cannot escape from the cells.
  • the great advantage of this whole cell hybridization technique is that the morphology of the bacteria is intact remains and you can detect these intact bacteria in situ, i.e. in their natural environment. As a result, the bacteria can not only be quantified, but also possible associations between different bacterial groups can be demonstrated.
  • the permeabilization can very particularly preferably take place by partial degradation by means of cell wall lytic enzymes, preferably selected from a group consisting of lysozyme, lysostaphin, proteinase K, pronase and mutanolysin.
  • cell wall lytic enzymes preferably selected from a group consisting of lysozyme, lysostaphin, proteinase K, pronase and mutanolysin.
  • an oligonucleotide suitable as a positive control is also provided.
  • Such an oligonucleotide is characterized in that it detects as many, optimally all, of the bacteria or eurkaryotes contained in the analyzed sample.
  • the oligonucleotide EUB338 (bacteria) or the oligonucleotide EUK (eukaryotes) described by Amann et al. (1990) is suitable.
  • Such a positive control can be used to check that the procedure used has been carried out correctly. Above all, however, it allows the determination of a percentage of the specifically detected microorganisms compared to the
  • kits for using the method according to the invention are also provided.
  • the most important components of this kit are the respective hybridization solutions with the above-described oligonucleotides that are specific to the microorganisms to be detected. It can also contain a corresponding hybridization solution without oligonucleotides and the corresponding washing solution or a concentrate of the corresponding washing solution. It may also contain enzyme solutions, fixing solutions and, if necessary, an embedding solution. If appropriate, hybridization solutions for carrying out a positive control and a negative control in parallel (for example without or with non-hybridizing oligonucleotides) are included. According to a special embodiment, the kit is used for the detection of microorganisms of the skin microflora.
  • kits according to the invention can be used to examine samples of both human and animal skin efficiently and also against a high background of other microorganisms.
  • a kit which contains several oligonucleotides or oligonucleotide combinations is particularly suitable.
  • those oligonucleotides or oligonucleotide combinations which can detect a larger group of the microorganisms to be detected in a kit with one or more oligonucleotides which can only detect one or a few species from this group.
  • Oligonucleotides which can also be used especially in combination for the detection of many different species of the genus Corynebacterium, preferably for the detection of skin-relevant species of the genus Corynebacterium, is such an oligonucleotide with a nucleotide sequence according to one of the SEQ. ID No. 7 to 12, in particular 7, 8, 10 and 11, or their combination, in particular the oligonucleotide combination, all of which are SEQ oligonucleotides. ID No. 7, 8, 10 and 11 contains.
  • SEQ ID No. 19 to 26 can be added to the kit.
  • the plastic cylinder which is open on both sides, is pressed with the undamaged side onto the skin surface to be examined and with 1.5 ml of the detergent solution (a physiological Tween buffer solution, pH 8.0 with 0.523 KH 2 PO 4 g / liter, 16.73 K 2 HP0 4 g / liter, 8.50 NaCI g / liter, 10.00 tween 80 g / liter and 1.00 trypton g / liter).
  • the detergent solution a physiological Tween buffer solution, pH 8.0 with 0.523 KH 2 PO 4 g / liter, 16.73 K 2 HP0 4 g / liter, 8.50 NaCI g / liter, 10.00 tween 80 g / liter and 1.00 trypton g / liter.
  • the two liquids are combined. Part of the sample from the two combined liquids is used for the subsequent detection using oligonucleotides, another part is used for the control, which is carried out in parallel, by culturing the microorganisms contained in the sample.
  • Sterile water e.g. Millipore water
  • Millipore water Sterile water
  • a volume of absolute ethanol is then added to the sample taken and centrifuged (room temperature, 8,000 rpm, 5 minutes). The supernatant is discarded and the pellet washed in a volume of 1 x PBS solution. Finally, the pellet is resuspended in 1/10 volume of fixative (50% ethanol) and stored at -20 ° C until further use.
  • a suitable volume of a suitable enzyme solution is then applied and the sample incubated (room temperature, 15 min). This step may be repeated with another suitable enzyme solution.
  • the permeabilization solution is removed with distilled water and the sample is completely dried again (incubation at 46 ° C. to completely dry).
  • the cells are then completely dehydrated again by applying the fixing solution (absolute ethanol) and dried again (46 ° C., 3 min or until completely dry).
  • hybridization solution with the oligonucleotides specific for the microorganisms to be detected in each case is then applied to the fixed, fully digested and dehydrated cells.
  • the slide is then placed in a chamber moistened with hybridization solution (without oligonucleotides) (46 ° C, 90 min).
  • the slide is then immersed in a chamber filled with washing solution and incubated (46 ° C., 15 min).
  • the slide is then briefly immersed in a chamber filled with distilled water and then air-dried in the lateral position (46 ° C, 30 min or until completely dry).
  • the slide is then embedded in a suitable embedding medium. Finally, the sample is analyzed using a fluorescence microscope.
  • Microorganism samples were taken from the forehead of a female test subject with combination skin (typified by a beautician and confirmed by sebometer measurements) using the sampling method described above.
  • propionibacteria A very high proportion of propionibacteria was found by counting the fluorescence signals and comparing them with the total number of cells (> 90%). A small proportion of staphylococci was found ( ⁇ 10%). No corynebacteria were found.
  • a microorganism sample was taken from the skin of another female subject using the sampling method described above.
  • the 16 S rRNA gene of a microorganism was isolated from part of the sample. The subsequent sequence determination showed that it is a new sequence, but the microorganism can be assigned to the genus Corynebacterium. This sequence, on the basis of which a corresponding probe (according to SEQ ID No. 21) was developed, which can detect this microorganism, is under SEQ ID No. 31 specified in the sequence listing.
  • Another part of the sample was hybridized with the previously described bacteria-specific probe EUB and with a probe mixture (SEQ ID No. 07 to 11) for the detection of the skin-relevant Corynebacteria.
  • a high proportion of corynebacteria was determined by counting the fluorescence signals and comparing them with the total number of cells that had been recorded by the bacteria-specific probe (approx. 73%).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen, ein Verfahren zum Nachweis der Mikroorganismen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen, ein Verfahren zum Nachweis der Mikroorganismen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Der Nachweis von Mikroorganismen wird bis heute in überwiegendem Maße serologisch oder mikroskopisch durchgeführt. Dabei sind die Methoden nicht empfindlich genug, um geringe Mengen an Mikroorganismen direkt nachzuweisen. Daher wurde dem Nachweis bisher ein Kultivierungsschritt vorgeschaltet, bei dem die Mikroorganismen vermehrt wurden. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass einige der Mikroorganismen gar nicht auf den zur Verfügung stehenden Nährböden anwachsen, und somit auch nicht nachgewiesen werden können. Untersuchungen an verschiedensten Umweltproben belegen, dass z. Z. nur zwischen 0,1 bis 14 % aller Bakterien kultivierbar sind. Insbesondere zur Analyse der Zusammensetzung einer komplexen Biozönose haben sich kultivierungsabhängige Verfahren als ungeeignet erwiesen. Abhängig von den gewählten Kultivierungsbedingungen wird nämlich die Vermehrung derjenigen Mikroorganismen begünstigt, welche an diese Kultivierungsbedingungen besonders gut angepasst sind, wodurch es zu einer starken Verzerrung der in der Ausgangsprobe herrschenden Populationsverhältnisse kommt. Eine quantitative Analyse der Mikroorganismen ist aufgrund dieser Populationsverschiebungen gar nicht möglich. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahren besteht darin, dass die heute bekannten Kultivierungsverfahren teilweise sehr langwierig sind und nicht selten in ihrem Ergebnis nicht eindeutig sind. Auf diese Weise kommt es sowohl zu falsch positiven als auch zu falsch negativen Analyseergebnissen.
Aufgrund der beschriebenen Nachteile der Kultivierung haben moderne Methoden der Mikroorganismenbestimmung alle ein gemeinsames Ziel: Sie versuchen die Nachteile der Kultivierung zu umgehen, indem sie keine Kultivierung mehr benötigen. Beispiele moderner Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen sind DNA- (Desoxyribonukleinsäure) bzw. RNA- (Ribonukleinsäure) basierte Hybridisierungs- oder Amplifikationsmethoden. Unter dem Begriff Hybridisierung ist insbesondere die Bildung einer Doppelhelix aus zwei einzelsträngigen, komplementären Oligo- oder Polynukleotiden zu verstehen. Eine Hybridisierung kann dabei insbesondere sowohl zwischen zwei DNA oder zwei RNA-Molekülen, aber auch zwischen DNA- und RNA-Molekülen entstehen. Die verschiedenen Moleküle hybridisieren nur dann, wenn die Zielsequenzen in einem ausreichenden Maße komplementär zueinander sind.
Die komplementären Zielsequenzen für den Nachweis können auch immobilisiert sein, wie dies auf sogenannten DNA-Chips häufig getan wird. In der Gebrauchsmusterschrift DE 201 10 013 wird ein solcher Träger (DNA-Chip) zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen, insbesondere Parodontitis, beansprucht. Auf diesem Träger sind Oligonukleotide immobilisiert, die komplementär zu bekannten Referenzsequenzen bestimmter Bakterien oder Viren sind, welche in der Mundflora vorkommen. Aufgrund der Komplementarität können die auf diesem Genchip aufgebrachten Oligonukleotide mit den entsprechenden Referenzsequenzen unter bestimmten Bedingungen hybridisieren. Nachteilig bei diesem Träger ist, dass die Mikroorganismen entweder durch Kultivierung vermehrt werden müssen oder die genetische Information aus den vorhandenen Proben vor der Hybridisierung auf dem Chip amplifiziert werden muss. Eine Quantifizierung der ursprünglich in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen ist daher ebenfalls nicht möglich.
Eine bekannte Amplifikationsmethode ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Bei der PCR wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Mikroorganismengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Auch können diverse in der untersuchten Probe vorhandene Stoffe eine Inhibierung des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies ist eine häufige Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Mikroorganismen und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und dadurch verursachte falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden und schließlich die Gefahr falsch negativer Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen.
Zu Beginn der 90er Jahre wurde ein Verfahren zur in situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden entwickelt, das in vielen Umweltproben erfolgreich zum Einsatz gekommen ist (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 762). Das Verfahren wurde "FISH" (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) genannt und macht sich den Umstand zunutze, dass die in jeder Zelle vorkommenden ribosomalen Ribonukleinsäuren (RNAs) sowohl hochkonservierte als auch variable, d.h. gattungs- oder sogar artspezifische Sequenzen aufweisen. Gegen diese Sequenzbereiche können komplementäre Oligonukleotide hergestellt werden, die zusätzlich mit einem detektierbaren Marker versehen werden können. Mittels dieser sogenannten Nukleinsäuresonden können Mikroorganismenarten, - gattungen oder -gruppen hochspezifisch direkt in der Probe identifiziert und bei Bedarf auch visualisiert oder quantifiziert werden. Diese Methode ist das einzige Verfahren, das eine verzerrungsfreie Darstellung der tatsächlichen in situ- Verhältnisse der Biozönose darstellt. Sogar bisher nicht-kultivierte und demnach nicht beschriebene Mikroorganismen können identifiziert werden. Bei der FISH dringen Sonden in die in der untersuchten Probe vorhandenen Zellen ein. Sofern ein Mikroorganismus der Art, Gattung oder Gruppe, für welche die Sonden entwickelt wurden, in der untersuchten Probe vorhanden ist, binden die Sonden in der Mikroorganismenzelle an ihre Zielsequenz, und die Zellen können aufgrund der Markierung der Sonden detektiert werden.
Die Vorteile der FISH-Technik gegenüber den weiter oben beschriebenen Methoden zur Mikroorganismenidentifizierung (Kultivierung, PCR) sind vielfältig.
Erstens können mit Sonden zahlreiche Mikroorganismen detektiert werden, die mittels traditioneller Kultivierung gar nicht erfasst werden. Während durch die Kultivierung maximal nur 15 % der Bakterienpopulation einer Probe sichtbar gemacht werden können, erlaubt die FISH-Technik in vielen Proben eine Detektion bis zu 100 % der Bakteriengesamtpopulation. Zweitens ist die Detektion von Mikroorganismen mittels der FISH-Technik sehr viel schneller als mittels Kultivierung. Benötigt die Identifizierung von Mikroorganismen mittels Kultivierung oft mehrere Tage, so vergehen von der Probennahme bis zur Mikroorganismenidentifizierung sogar auf Artebene mittels der FISH-Technik nur wenige Stunden. Drittens können im Gegensatz zu einem Kultivierungsmedium Sonden in ihrer Spezifität fast beliebig frei gewählt werden. Einzelne Arten können genauso gut mit einer Sonde erfasst werden, wie ganze Gattungen oder Mikroorganismengruppen. Viertens können Mikroorganismenarten oder ganze Mikroorganismenpopulationen direkt in der Probe exakt quantifiziert werden. Fünftens können Assoziationen und Vergesellschaftungen verschiedener Mikroorganismen in einer Probe visualisiert werden.
Im Gegensatz zur PCR weist die FISH zuverlässig nur lebende Mikroorganismen nach. Falsch positive Ergebnisse durch nackte DNA oder tote Mikroorganismen wie bei der PCR sind bei der FISH ausgeschlossen. Des weiteren sind falsch negative Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen ebenso ausgeschlossen wie falsch positive Ergebnisse infolge von Kontaminationen. Die FISH-Technik ist demnach ein überragendes Werkzeug, um Mikroorganismen schnell und äußerst spezifisch direkt in einer Probe nachzuweisen. Sie ist im Gegensatz zu Kultivierungsverfahren eine direkte Methode und erlaubt darüber hinaus auch eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen.
Die menschliche Haut beispielsweise ist mit ca. 2 m2 Fläche eines der größten von Mikroorganismen bewohnten menschlichen Körperorgane. Im Laufe der Evolution hat sich eine enge Beziehung zwischen dem Wirt und seinen mikrobiellen Bewohnern entwickelt. Die von der Haut über verschiedene Körperdrüsen zur Verfügung gestellten Nährstoffe werden von Mikroorganismen verstoffwechselt. Die dadurch verursachte Ansäuerung der Hautoberfläche verhindert die Ansiedelung von pathogenen Mikroorganismen.
Die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen kann aber auch unerwünschte Folgen haben. So ist die Entstehung von Körpergeruch, Schuppenbildung und die Entwicklung verschiedener Hautkrankheiten auf . die Aktivität von Mikroben zurückzuführen.
So steht beispielsweise der Hefepilz Malassezia im Verdacht, insbesondere an der Schuppenbildung der Haut, beispielsweise auf dem Kopf, beteiligt zu sein. Außerdem wird dieser Organismus als Auslöser der Hautkrankheit Pityriasis versicolor betrachtet.
Ein vermehrtes Auftreten von Propionihacterium acnes kann bereits im frühen Stadium Hinweise auf die Entstehung von Akne geben.
Prinzipiell sind alle Mikroorganismen zur Hautflora zu rechnen, die von der Haut isoliert werden können. Dabei können nach Price (Price P.B. The bacteriology of the normal skin: A new quantitative test applied to a study of the bacterial flora and the disinfectant action of mechanical cleansing. J Infect Dis. 63:301-318. 1938.) zwei unterschiedliche Gruppen unterschieden werden. a) Residente Flora: Mikroorganismen, die sich auf der menschlichen Haut vermehren können oder bei der Untersuchung von Hautproben in hoher Anzahl oder mit einem hohen Anteil regelmäßig gefunden werden. Es wird postuliert, dass die oben genannten Eigenschaften durch die feste Verankerung dieser residenten Mikroorganismen mit der Haut zustande kommen (Anheftung).
b) Transiente Flora: Mikroorganismen, die sich auf der menschlichen Haut nicht vermehren können bzw. bei Untersuchungen nur unregelmäßig und in geringen Anzahlen/Anteilen gefunden werden. Diese Mikroorganismen liegen der Theorie nach frei, nicht an Hautbestandteile adhäriert, vor.
Ein genauerer Kenntnisstand vor allem der residenten Flora der Haut ist insbesondere im Hinblick auf die Suche nach neuen medizinischen oder kosmetischen Wirkstoffen wichtig. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroorganismen können darüber hinaus ein breiteres Verständnis der Zusammenhänge zwischen gesunder Haut und ihren Erkrankungen eröffnen und die Entwicklung von besseren Wirkstoffen, Therapien oder Arzneimitteln ermöglichen. Auch die gezielte Beeinflussung relevanter Hautmikroorganismen durch Kosmetikprodukte, wie Deodorants, Cremes u.a., setzt die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion des Mikro-Ökosystems Haut voraus.
Es besteht daher ein Bedarf an als Nukleinsäuresonden für weitere, eher verbreitetere Mikroorganismen geeigneten Oligonukleotiden, die so neue Einsatzgebiete erschließen können. Insbesondere besteht ein Bedarf für Sonden zum Nachweis solcher Mikroorganismen, die mit Menschen und/oder Tieren in Kontakt kommen können, z.B. in Lebensmitteln, Abwässern, Umweltproben oder von der Hautoberfläche.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen oder Mikroorganismengruppen bereitzustellen, die eine schnelle sowie ggf. quantitative Bestimmung dieser Mikroorganismen in einer Probe gewährleisten und darüber hinaus in der Lage sind, einzelne oder Gruppen von Spezies von Mikroorganismen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von anderen Mikroorganismen sicher zu detektieren.
Dies wird gelöst durch die Bereitstellung von Oligonukleotiden zum Nachweis von Mikroorganismen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus: i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 30 angegebenen
Sequenzen, und ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) zumindest in 80
%, bevorzugt in mindestens 84 %, besonders bevorzugt in mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt in 95 % der Nukleotide übereinstimmen, und iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ii) genannten
Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der
Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten
Bedingungen hybridisieren, sowie durch ein Verfahren zur Verwendung dieser Oligonukleotide und ein Kit zur Anwendung des Verfahrens.
Im erfindungsgemäßen Zusammenhang sind unter dem Begriff "Mikroorganismengruppe" mindestens zwei Arten von Mikroorganismen zu verstehen, die entweder der gleichen Gattung angehören oder eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Eine erfindungsgemäße Mikroorganismengruppe kann beispielsweise auch alle Spezies einer Gattung enthalten.
Erfindungsgemäß sind neben den Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 30 angegebenen Sequenzen sowie solchen Oligonukleotiden, die mit diesen zumindest in 80 %, bevorzugt in mindestens 84 %, besonders bevorzugt in mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt in 95% der Nukleotide übereinstimmen, auch solche Oligonukleotide umfasst, die sich von den genannten Oligonukleotiden ableiten, wobei sie um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.
Erfindungsgemäß sind neben den Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 19 bis 30 angegebenen Sequenzen sowie solchen Oligonukleotiden, die mit diesen zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94% der Nukleotide übereinstimmen, auch solche Oligonukleotide umfasst, die sich von den genannten Oligonukleotiden ableiten, wobei sie um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.
Es ist insbesondere auch möglich, dass am 3' und/oder am 5' Ende der genannten Oligonukleotide 1 bis 40, vorzugsweise 1 bis 25, insbesondere 1 bis 15 Nukleotide angehängt sind.
Ebenfalls ist es weiterhin erfindungsgemäß möglich, Oligonukleotide einzusetzen, die sich von den genannten Oligonukleotide insbesondere dadurch ableiten lassen, dass die Sequenz um 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere ein bis drei, beispielsweise ein oder zwei Nukleotide deletiert ist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die nachzuweisenden Mikroorganismen ausgewählt aus den Gattungen Staphylococcus, Peptostreptococcυs, Propionibacteriυm, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia und/oder des Sporomusa-Taxons.
Die Mikroflora der Haut ist bisher nur durch die bekannten Kultivierungsmethoden untersucht worden. Dabei wurden durch den bereits erwähnten methodischen Mangel nur kultivierbare Bakterien oder Pilze nachgewiesen. Beispielsweise wurden folgende Spezies gefunden: Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. cohnii, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis, S. warnen, S. sciuri, S. schleifen, S. intermedius, Veillonella spec, Propionibacterium acnes, Malassezia sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur, Corynebacterium minutissimum, C. amycolatum, C. striatum und C. xerosis. Diese und weitere Spezies der genannten Gattungen können vorteilhafterweise mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden nicht nur qualitativ, sondern darüber hinaus auch noch quantitativ nachgewiesen werden. Diese quantitativen Informationen können vor allem für Tests von Wirkstoffen oder die Frühdiagnose von Hauterkrankungen von Nutzen sein. Die genannten Mikroorganismengattungen können des weiteren auch in anderen Proben vorkommen, so beispielsweise in Lebensmitteln, klinischem Untersuchungsmaterial oder Umweltproben.
Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter "Haut" die menschliche und/oder tierische Haut oder Schleimhaut sowie die Anhangsgebilde der Haut (Haare, Haarfollikel, Nägel, Drüsen) zu verstehen.
Nach einer besonderen Ausführungsform trägt das Oligonukleotid einen detektierbaren Marker, insbesondere einen Fluoreszenzmarker, der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Die Nachweisbarkeit der erfolgten Hybridisierung des Oligonukleotids mit der Zielsequenz ist eine Voraussetzung für die Identifizierung und ggf. Quantifizierung der Mikroorganismen. Insbesondere wird dies häufig durch eine kovalente Bindung eines detektierbaren Markers an das Oligonukleotid erreicht. Als detektierbare Marker werden häufig fluoreszierende Gruppen, z.B. Cy-2, Cy-3 oder Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), FITC (Fluoresceinisothiocyanat), CT (5,(6)- Carboxytetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (Tetramethylrhodamin-5,6-isothiocyanat (Molecular Probes Inc., s.o.) oder FLUOS (5,(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)). Alternativ werden chemolumineszierende Gruppen oder radioaktive Markierungen, z.B. 35S, 32P, 33P, 125J, verwendet. Nachweisbarkeit kann aber auch gegeben sein durch Kopplung des Oligonukleotids mit einem enzymatisch aktiven Molekül, beispielsweise alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Peroxidase, Meerettichperoxidase, ß-D-Galaktosidase oder Glukoseoxidase. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrats umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Enzyme Chromogene
Alkalische Phosphatase und 4-Methylumbelliferylphosphat (*) saure Phosphatase Bis(4-Methylumbelliferylphosphat), (*) 3-O-Methylfluorescein, Flavon-3- Disphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (*), p-Hydroxyphenethylalkohol (*), 2,2'- Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin- Sulfonsäure) (ABTS), ortho- Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (*), 3,3'-Dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
Meerrettichperoxidase H2O2 + Diammoniumbenzidin H2O2 + Tetramethylbenzidin
ß-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktosid
Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau * Fluoreszenz
Schließlich ist es möglich, die Oligonukleotide so zu gestalten, dass an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Oligonukleotid erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Oligonukleotide mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.
Insbesondere wird der enzymatische Marker aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Oligonukleotidkombination zum Nachweis von Mikroorganismen enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehrere der genannten Oligonukleotide.
Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter einer Oligonukleotidkombination eine Zusammensetzung zu verstehen, die mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide, beispielsweise in einer Lösung (z.B. einer Pufferlösung) oder Mischung (z.B. im lyophilisierten Zustand), enthält. Darüber hinaus können die Oligonukleotide auch von einander getrennt (z.B. in unterschiedlichen Gefäßen), nebeneinander (beispielsweise auf einem Chip oder in einem Kit) vorliegen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält die Oligonukleotidkombination i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Staphylococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 03 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder ii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der
Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 04 bis 06 sowie 27 bis 29 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 07 bis 12 sowie No. 19 bis 26 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iv) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Veillonella ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 13 bis 15 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder v) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies Propionibacterium acnes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 16 und 17 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder vi) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Pilzen der
Gattung Malassezia ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Sequenz und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder vii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide ermöglichen den spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Genera Staphylococcus, Peptostreptococcus, Propionibakterium, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia sowie des Sporomusa-Taxons.
Folgende Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus den
Gruppen i) bis vii) ergeben sich erfindungsgemäß:
Beispielsweise ist die Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden jeweils aus einer der Gruppen i), ii), iii), iv), v), vi) oder vii) darunter zu verstehen.
Die Kombinationen von ein oder mehreren Oligonukleotiden aus der Gruppe i) mit ein oder mehreren Oligonukleotiden aus der Gruppe ii), analog dazu auch solche aus der Gruppe i) mit iii), i) mit iv), i) mit v), i) mit vi) sowie i) mit vii), ii) mit iii), ii) mit iv), ii) mit v), ii) mit vi) sowie ii) mit vii), iii) mit iv), iii) mit v), iii) mit vi) sowie iii) mit vii), iv) mit v), iv) mit vi), iv) mit vii), v) mit vi), v) mit vii) sowie vi) mit vii) sind erfindungsgemäß mit umfasst.
Ebenso sind die Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus den jeweiligen Gruppen i), ii) und iii); analog ebenso i) mit ii) und iv); i) mit ii) und v); i) mit ii) und vi); i) mit ii) und vii), i) mit iii) und iv); i) mit iii) und v); i) mit iii) und vi), i) mit iii) und vii); i) mit iv) und v); i) mit iv) und vi); i) mit iv) und vii), i) mit v) und vi), i) mit v) und vii); ii) mit iii) und iv); ii) mit iii) und v); ii) mit iii) und vi), ii) mit iii) und vii); ii) mit iv) und v); ii) mit iv) und vi), ii) mit iv) und vii); ii) mit v) und vi), ii) mit v) und vii); iii) mit iv) und v); iii) mit iv) und vi), iii) mit iv) und vii); iii) mit v) und vi), iii) mit v) und vii) sowie iv) mit v) und vi), iv) mit v) und vii), iv) mit vi) und vii), v) mit vi) und vii) erfindungsgemäß möglich.
Einzusetzen sind ebenfalls die Kombinationen von ein oder mehreren Oligonukleotiden ausgewählt aus je vier Gruppen, also aus Gruppe i) mit ii), iii) und iv); i) mit ii), iii) und v); i) mit ii), iii) und vi), i) mit ii), iii) und vii); i) mit ii), iv) und v); i) mit ii), iv) und vi); i) mit ii), iv) und vii), i) mit ii), v) und vi), i) mit ii), v) und vii); i) mit ii), vi) und vii); i) mit iii), iv) und v), i) mit iii), iv) und vi);, i) mit iii), iv) und vii),; i) mit iii), v) und vi), ; i) mit iii), v) und vii),; i) mit iv), v) und vi), i) mit iv), v) und vii); i) mit iv), vi) und vii); ii) mit iii), iv) und v); ii) mit iii), iv) und vi), ii) mit iii), iv) und vii); ii) mit iii), v) und vi), ii) mit iii), v) und vii) oder iii) mit iv), v) und vi), iii) mit iv), v) und vii), iii) mit iv), vi) und vii).
Die Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus fünf Gruppen, also i) mit ii), iii), iv) und v), i) mit ii), iii), iv) und vi), i) mit ii), iii), iv) und vii), i) mit ii), iii), v) und vi), i) mit ii), iii), v) und vii), i) mit iii), iv), v) und vi), i) mit iii), iv), v) und vii), i) mit ii), iv), v) und vi), i) mit ii), iv), v) und vii), i) mit ii), iv), vi) und vii), ii) mit iii), iv), v) und vi), ii) mit iii), iv), v) und vii).
Die Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus sechs Gruppen, also i) mit ii), iii), iv), v) und vi), i) mit ii), iii), iv), v) und vii), i) mit iii), iv), v), vi) und vii); ii) mit iii), iv), v), vi) und vii) sowie die Kombination von jeweils ein oder mehren Oligonukleotiden aus allen sieben Gruppen sind ebenfalls erfindungsgemäß umfasst.
Die erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination ist daher geeignet, eine Mikroorganismenspezies oder eine Mikroorganismengruppe nachzuweisen. Dazu werden beispielsweise zum Nachweis von bestimmten Spezies von Staphylococcus ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß i) ausgewählt.
Darüber hinaus kann aber vorteilhafterweise durch die geeignete Zusammenstellung der Oligonukleotidkombination (gemäß den o.g. Kombinationsmöglichkeiten) der Nachweis von Spezies und/oder Gruppen von Mikroorganismen der verschiedenen genannten Gattungen gleichzeitig und/oder nebeneinander durchgeführt werden.
Beispielsweise kann mit einer geeigneten Oligonukleotidkombination der Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß i)) gleichzeitig und/oder nebeneinander zum Nachweis von Mikroorganismen der Spezies Propionibacterium acnes (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß v)) stattfinden. Die möglichen Kombinationen können dadurch individuell an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden.
Wichtig für die Auswahl der Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen ist insbesondere, daß eine geeignete komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Geeignet ist eine Sequenz dann, wenn sie einerseits spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist und andererseits überhaupt zugänglich ist für das eindringende Oligonukleotid, also nicht etwa durch ribosomale Proteine oder rRNA-Sekundärstrukturen maskiert wird. Bereits Fuchs und Mitarbeiter (B. M. Fuchs, G. Wallner, W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64 (12):4973 -4982.) konnten zeigen, dass eine Vielzahl von Oligonukleotiden, die aufgrund von Primärsequenzdaten entwickelt wurden, in einem in situ Hybridisierungsansatz nicht oder nur eingeschränkt verwendet werden können. Die Abdeckung von potentiellen Oligonukleotidbindungsstellen durch rRNA-Sekundärstrukturmotive beziehungsweise ribosomale Proteine wird als Begründung für das unbefriedigende Bindungsverhalten der genannten Oligonukleotide aufgeführt. Solche unzugänglichen Bereiche sind für jeden Organismus unterschiedlich und müssen für jeden Mikroorganismus neu erforscht werden. Daher erschließt sich die Sequenz für ein Oligonukleotid mit gutem Bindungsverhalten, auch für einen Fachmann, keineswegs aus der Primärsequenz der rRNA und kann folglich auch nicht über Consensus-Sequenz-Suchprogramme erschlossen werden. Durch die erfinderische Auswahl einer definierten Sequenz kann eine Mikroorganismenart, eine Mikroorganismengattung oder eine Mikroorganismengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einem Oligonukleotid von 15 Nukleotiden über 100 % der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.
Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 01 bis 03 angegebenen Sequenzen.
Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S. saccharolyticus, S. caprae, S. capitis, S. warnen, S. pasteuri, S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S. succinus, S. kloosii, S. saprophyticus, S. equorum, S. xylosus, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. chromogenes, S. auricularis, S. schleifen, S. sciuri, S. lentus, S. vitulus, S. pulveri, S. felis, S. hyicus, S. piscifermentans, S. carnosus, S. simulans, S. intermedius, S. delphini, , S. muscae und S. condimenti.
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Staphylococcus gehören, nicht von diesen Oligonukleotiden erfasst: Paenibacillus polymyxa, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Proteus vulgaris, Burkholderia cepacia, Bacteroides uniformis und Pediococcus damnosus. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.
Das Oligonukleotid gemäß der SEQ ID NO. 02 ist zum Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus, insbesondere von S. intermedius, S. delphini, S. muscae, S. condimenti, S. piscifermentans, S. carnosus, S. schleifen, S. felis und S. simulans, bevorzugt von S. intermedius und S. schleifen geeignet.
Besonders bevorzugt ist eine Kombination der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 01 bis 02 angegebenen Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden Spezies der Gattung Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S. caprae, S. capitis, S. warnen, S. pasteuri, S. arlettae, S. gallinarum, S. cohnii, S. succinus, S. kloosii, S. saprophyticus, S. equorum, S. xylosus, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. chromogenes, S. auricularis, S. schleifen, S. sciuri, S. lentus, S. vitulus, S. pulveri, S. intermedius, S. delphini, S. felis, S. muscae, S. condimenti, S. piscifermentans, S. carnosus und S. simulans.
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptostreptococcus bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 04 bis 06 sowie 27 bis 29 angegebenen Sequenzen.
Die unter dem Gattungsnamen "Peptostreptococcus" bekannten Bakterien können nach neuesten Erkenntnissen verschiedenen Untergruppen, insbesondere den Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia, zugeordnet werden.
Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der zu dem Oberbegriff "Peptostreptococcus" gehörenden Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia: P. assaccharolyticus, P. lacrimalis, P. hareii, F. magnus, A. tetradius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, und A. vaginalis.
Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit der unter SEQ ID NO. 04 bis 06 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren jeweils mindestens die folgenden Spezies der Peptostreptokokken, insbesondere solche der Gattung Anaerococcus: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii, Anaerococcus tetradius und A. vaginalis.
Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Peptostreptococcus, insbesondere Anaerococcus gehören, nicht erfasst: Peptoniphilus lacrimalis, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magnus sowie Ruminococcus productus, Brevibacterium epidermidis, Abiotropha elegans und Clostridium hastiforme.
Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 04 angegebenen Sequenz. Dieses Oligonukleotid detektiert mindestens die folgenden Spezies der unter den Gattungsbegriff "Peptostreptococcus" fallenden Mikroorganismen: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii und A. vaginalis.
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptostreptococcus bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 27 bis 29 angegebenen Sequenzen.
Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zu den Peptostreptokokken gehören, nicht erfasst; Micromonas micros, Helcococcus kunzii, Helcococcus ovis.
Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 27 und 28 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren mindestens die folgenden Spezies der Gattung Peptoniphilus: Peptoniphilus assaccharolyticus, P. hareii, P. indolicus (insbesondere den Stamm ATCC 29427 sowie solche Stämme, die mit diesem nahe verwandt sind, d.h. eine sehr ähnliche rRNA aufweisen) sowie P. lacrimalis. Dabei werden folgende Spezies mit ähnlicher rRNA von diesen Oligonukleotiden nicht nachgewiesen: Pseudomonas saccharophila, Variovorax paradoxus, Finegoldia magna, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Gallicola baranese, Atopobium parvulum, Veilonella dispar, Pseudomonas putida sowie Spezies der Gattungen Anaerococcus und Corynebacterium.
Das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID No. 28 angegebenen Sequenz detektiert insbesondere Mikroorganismen der Spezies Peptoniphilus lacrimalis.
Besonders bevorzugt ist weiterhin das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 29 angegebenen Sequenz. Dieses Oligonukleotid detektiert aus den unter den Gattungsbegriff "Peptostreptokokken" fallenden Mikroorganismen, mindestens die Spezies Finegoldia magna sowie solche Mikroorganismen, die in ihrer rRNA- Sequenz dazu sehr ähnlich sind, während folgende Mikroorganismen gleichzeitig nicht nachgewiesen werden können: Anaerococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus lacrimalis, Staphylococcus epidermidis, Halocella cellulosilytica, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Veillonella dispar, Pseudomonas putida sowie andere Spezies der Gattungen Anaerococcus, Corynebacterium sowie Peptoniphilus.
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 07 bis 12 angegebenen Sequenzen.
Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. macginleyi, C. accolens, C. fastidiosum, C. segmentosum, C. ammoniagenes, C. minutissimum, C. flavescens, C. coyleiae, C. afermentans, C. pseudogenitalium, C. genitalium, C. mucofaciens, C. auris, C. mycetoides, C. cystitidis, C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, C. diphteriae, C. vitarumen, C. kutschen, C. genitalium, C. argentoratens, C. callunae, C. bovis, C. variabilis, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum", C. xerosis, C. matruchotii, C. jeikeium, C. efficiens, C. thomsenii, C. nigricans, C. auriscanis, C. mooreparkense, C. casei, C. camporealensis, C. sundsvallense, C. mastidis, C. imitans, C. riegelii, C. asperum, C. freneyi, C. striatum, C. coyleiae und C. simulans.
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Corynebacterium gehören, von diesen Oligonukleotiden nicht erfasst: Clostridium acetobutylicum, Eubacterium moniliforme und Fusobacterium nucleatum. Ebenfalls nicht erfasst werden die folgenden Bakterien, welche zur Hautmikroflora gehören: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus und Streptococcus pyogenes. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 10 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. striatum und/oder C. xerosis eingesetzt.
Weiterhin wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 11 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. jeikeium eingesetzt.
Besonders bevorzugt ist eine Kombination der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 07, 08, 10 und 11 angegebenen Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. macginleyi, C. accolens, C. fastidiosum, C. segmentosum, C. ammoniagenes, C. minutissimum, C. flavescens, C. coyleiae, C. afermentans, C. pseudogenitalium, C. "genitalium", C. mucofaciens, C. auris, C. mycetoides, C. cystitidis, C. pilosum, C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, C. diphteriae, C. camporealensis, C. vitarumen, C. kutscheri, C. argentoratens, C. callunae, C. bovis, C. renale, C. riegelii, C. C. variabilis, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum", C. xerosis, C. matruchotii, C. jeikeium. Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 19 bis 26 angegebenen Sequenzen.
Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. coyleiae, C. afermentans, C. "genitalium", C. mucifaciens, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum" und C. riegelii. Diese Oligonukleotide sind geeignet, eine Gruppe aus ein oder mehreren, sehr eng verwandten Spezies der Gattung Corynebacterium spezifisch nachzuweisen.
Vorteilhafterweise werden folgende Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz von diesen Oligonukleotiden nicht erfasst: . Clostridium acetobutylicum, Eubacterium yurii und Fusobacterium nucleatum. Ebenfalls nicht erfasst werden die folgenden Bakterien, welche zur Hautmikroflora gehören: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus und Streptococcus pyogenes. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 19 angegebenen Sequenz zum Nachwies von einer Gruppe von Mikroorganismen aus der Gattung Corynebacterium eingesetzt, die von C. "tuberculostearicum" (insbesondere ATCC 35692) bzw. der Gruppe um den Stamm mit der Bezeichnung CDC G5840 (Acc-Nr. X80498) und solchen Mikroorganismen gebildet wird, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Darunter sind solche Mikroorganismen zu verstehen, die sehr eng mit dem Mikroorganismus verwandt sind bzw. deren rRNA ein hohes Maß an Identität aufweist und/oder insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt mit der rRNA der genannten Mikroorganismen vollständig oder nahezu vollständig (d.h. mit einer Abweichung von ein oder mehreren, bevorzugt ein bis drei Nukleotiden) übereinstimmen.
Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. "tuberculostearicum" und die Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. minutissimum, C. diphteriae, C. striatum, C. xerosis, C. "fastidiosum", C. camporealensis, C. accolens und C. "pseudogenitalium" sowie C. afermentans, C. jeikeium, C. durum, C. mucifaciens, C. renale, C. riegelii, C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.
Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. amycolatum und mit dieser Art eng verwandte Spezies die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 20 angegebenen Sequenz eingesetzt. Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. amycolatum, und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, und die insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt der rRNA nur wenige, bevorzugt keine Fehlpaarungen aufweist, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen; C. "asperum", C. jeikeium, C. bovis, C. freneyi, C. afermentans, C. durum, C. matruchotii, C. mucifaciens, C. renale, C. glutamicum, und C. xerosis sowie C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. minutissimum, C. ammoniagenes, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. riegelii, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 21 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Spezies von Mikroorganismen, insbesondere der Gattung Corynebacterium eingesetzt, welche mit der unter Seq ID No 31 angegebenen Teilsequenz der 16 S rRNA zumindest in 60 %, bevorzugt in mindestens 70 %, besonders bevorzugt in mindestens 80 % und ganz besonders bevorzugt in mindestens 90%, beispielsweise mindestens 95 % der Nukleotide übereinstimmen. Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise die angegebenen Spezies der Gattung Corynebacterium, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen; C. "genitalium", C. mucifaciens, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. afermentans, C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 23 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans eingesetzt.
Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. afermentans und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen; C. "genitalium", C. mucifaciens, C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. riegelii, C. thomssenii. C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 25 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und/oder "C. genitalium" eingesetzt
Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und "C. genitalium" sowie solcher Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen; C. xerosis, C. jeikeium, C. urealyticum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. striatum, C. accolens, C. renale, C. ammoniagenes und C. kutscheri sowie C. glucuronolyticum, C. camporealensis, C. pseudotuberculosis, C. durum, C. minutissimum, C. lipophiloflavum, C. callunae und C. thomssenii.
Dieses Oligonukleotid detektiert darüber hinaus ebenfalls folgende Mikroorganismen nicht, die zwar nicht zur Gattung Corynebacterium gehören, aber eine ähnliche rRNA aufweisen: Nanomurea fastidiosa, Micromonospora echinospora, Abiotropha elegans und Arcanobacterium pyogenes.
Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. riegelii die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 26 angegebenen Sequenz eingesetzt.
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Veillonella bereitgestellt, wobei die Sonden komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 13 bis 15 angegebenen Sequenzen.
Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Veillonella: V. dispar, V. parvula und V. atypica. Da die Gattung Veillonella weitgehend isoliert im phylogenetischen Stammbaum steht, wird vorteilhafterweise keine Erfassung von Nichtzielorganismen festgestellt.
Besonders bevorzugt ist eine Kombination der Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 13 bis 14 angegebenen Sequenzen. Diese Kombination detektiert mindestens die folgenden Spezies der Gattung Veillonella: V. dispar, V. parvula und V. atypica.
Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Spezies Propionibacterium acnes bereitgestellt, wobei die Sonden komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 16 bis 17 angegebenen Sequenzen. Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert spezifisch die Spezies Propionibacterium acnes.
Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 16 angegebenen Sequenz.
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Spezies Propionibacterium acnes gehören, nicht erfasst: P. propionicus, P. granulosum, P. avidum, P. freudenreichii, P. thoeni, P. lymphophilus, C. minutissimum, Saccharomonospora viridis, Nocardiodes spec, Propioniferax innocua, Gordonia sputi und Arcanobacterium.
Insbesondere wird weiterhin erfindungsgemäß ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Malassezia bereitgestellt, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zur rRNA und die unter SEQ ID NO. 18 angegebene Sequenz besitzt.
Das angegebene Oligonukleotid detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Malassezia: M. sloffiae, M. pachydermatis, M. furfur.
Vorteilhafterweise werden Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Malassezia gehören, nicht erfasst: Candida albicans und Candida krucei.
Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 30 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Mikroorganismen des Sporomusa-Taxons, bevorzugt die eine Untergruppe des Sporomusa-Taxons bildenden Mikroorganismen der Gattungen Phascolarctobacterium und Acidaminococcus sowie solchen Mikroorganismen, die eine sehr ähnliche rRNA wie die genannten Mikroorganismen aufweisen, eingesetzt.
Das angegebene Oligonukleotid detektiert mindestens die Spezies Acidaminococcus fermentans, Phascolarctobacterium faecium sowie mit diesen eng verwandte Mikroorganismen mit sehr ähnlicher rRNA, aber nicht die folgenden Mikroorganismen: Veillonella spec. Halobacillus halophilus, Sporomusa paucivorans, Macrococcus caseolyticus, Anaeromusa acidaminophila, Halocella cellulosilytica, Peptostreptococcus anaerobius, Succiniclasticum ruminis und Succinispira mobilis.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform können zusammen mit markierten Oligonukleotiden auch unmarkierte Oligonukleotide eingesetzt werden. Bevorzugt dient die Inkubation von Proben mit unmarkierten neben markierten Oligonukleotiden der Erhöhung der Spezifität der Sonden. Es ist beispielsweise möglich, nah verwandte Spezies von Mikroorganismen dadurch zu unterscheiden, dass für eine nicht nachzuweisende, mit einer nachzuweisenden Spezies nahe verwandte Mikroorganismenart ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das unter den gewählten Bedingungen besser mit der Zielsequenz der rRNA des nicht nachzuweisenden Mikroorganismus hybridisiert als die markierte Sonde. Da die unmarkierte Sonde besser mit der rRNA des nicht nachzuweisenden Mikroorganismus hybridisiert, als die markierte Sonde, wird eine Bindung der markierten Sonde an die rRNA des nicht nachzuweisenden Mikroorganismus und somit ein falsch-positives Ergebnis durch den Einsatz des unmarkierten Oligonukleotids (Kompetitors) verhindert. Der spezifische Nachweis von bestimmten Mikroorganismenspezies oder Mikroorganismengruppen wird dadurch vor allem auch in Gegenwart eng verwandter Spezies mit einer sehr ähnlichen rRNA-Sequenz ermöglicht.
Beispielsweise ist es erfindungsgemäß geeignet, zusammen mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 21 das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 22 einzusetzen. Dabei wird bevorzugterweise das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 21 markiert und das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 22 unmarkiert eingesetzt. Somit kann die Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 31 angegebene Sequenz beinhaltet, problemlos nachgewiesen werden, ohne, dass C. afermentans gleichzeitig detektiert wird (vergleiche Analyseergebnis im Beispiel). Ebenfalls kann es erfindungsgemäß geeignet sein, Oligonukleotide der SEQ ID No. 23 und 24 gemeinsam einzusetzen. Während das Oligonukleotid mit der SEQ ID No. 23 markiert als Sonde eingesetzt wird, um C. afermentans zu detektieren, maskiert das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 24 die sehr ähnliche Zielsequenz der Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 31 angegebene Sequenz beinhaltet.
Weiterhin kann das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 26 als unmarkierter Kompetitor gemeinsam mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 25 eingesetzt werden. Damit gelingt der Nachweis der folgenden, sich im phylogenetischen Stammbaum nahestehenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. afermentans, C. genitalium, C. mucifaciens, C. coyleiae, ohne, dass gleichzeitig die Corynebacterium-Spezies C. riegelii, die eine sehr ähnliche rRNA aufweist, nachgewiesen wird.
Es ist bevorzugt, dass die Oligonukleotidkombination aus einem oder mehreren Oligonukleotiden gemäß SEQ ID No. 19 bis 30 ein oder mehrere, weitere Oligonukleotide zum Nachweis von Spezies der Gattungen Staphylococcus, Veillonella, Malassezia und/oder Propionibacterium enthält. Vorteilhafterweise können dann verschiedene hautrelevanten Mikroorganismen gleichzeitig bzw. parallel in einer Probe, insbesondere in einem einzigen Prozeß bzw. Verfahren, nachgewiesen werden. Geeignet sind wiederum insbesondere hierin offenbarte Oligonukleotide, insbesondere solche gemäß SEQ ID No. 1 bis 18.
In der folgenden Tabelle 2 sind die Sequenzen des Sequenzprotokolls zusammengefasst:
Tabelle 2
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte: a) Entnahme einer Probe b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem Oligonukleotid, um eine Hybridisierung herbeizuführen d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide und e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden hybridisierten Mikroorganismen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Fixieren" der Mikroorganismen eine Behandlung verstanden, mit der die Mikroorganismenhülle für Oligonukleotide durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Oligonukleotiden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung oder ähnliches.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die "Hybridisierung" die fixierten Zellen mit insbesondere fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden inkubiert. Diese können ggf. nach Penetration der Zellhülle sich an die dem Oligonukleotid entsprechende Zielsequenz binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.
Die Oligonukleotide werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer geeigneten Hybridisierungslösung eingesetzt. Geeignete
Zusammensetzungen dieser Lösung sind dem Fachmann wohlbekannt. Eine solche Hybridisierungslösung enthält beispielsweise Formamid in einer Konzentration zwischen 0 % und 80 %, bevorzugt von 0 - 45 %, besonders bevorzugt von 20 % bis 40 % und hat z.B. eine Salzkonzentration (bei dem Salz handelt es sich bevorzugt um NaCI) zwischen 0,1 Mol/I und 1 ,5 Mol/I, bevorzugt zwischen 0,5 und 1 ,0 Mol/I, besonders bevorzugt 0,9 Mol/I. Weiterhin ist enthalten i.a. ein Detergens (i.d.R. SDS) in einer Konzentration zwischen 0,001 % und 0,2 %, bevorzugt 0,005 % bis 0,1 %, besonders bevorzugt von 0,01 %. Zum Puffern der Lösung ist eine geeignete Puffersubstanz (z.B. Tris-HCI, Na-Citrat, HEPES, PIPES o.a.) enthalten, üblicherweise in einer Konzentration zwischen 0,01 Mol/I und 0,1 Mol/I, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Mol/I bis 0,05 Mol/I, besonders bevorzugt von 0,02 Mol/I. Der pH-Wert der Hybridisierungslösung liegt in der Regel zwischen 6,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 7,0 und 8,0, besonders bevorzugt um 8,0.
Weitere Zusatzstoffe können zum Einsatz kommen, z.B. fragmentierte Lachsspermien-DNA oder Blocking-Reagenzien zur Verhinderung von unspezifischen Bindungen bei der Hybridisierungsreaktion oder auch Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon oder Dextransulfat zur Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion. Des weiteren können auch Substanzen zugegeben werden, welche die DNA aller in der Probe enthaltenen lebenden und/oder Organismen anfärben (z.B. DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid). Solche Zusätze sind dem Fachmann sämtlich wohlbekannt und können in den bekannten und üblichen Konzentrationen zugegeben werden.
Die Konzentration des Oligonukleotids in der Hybridisierungslösung ist abhängig von der Art ihrer Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Oligonukleotide die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist zu bedenken, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Oligonukleotide sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 - 500 ng/μl liegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1 - 10 ng jedes verwendeten Oligonukleotids pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt es zwischen 10 μl und 1000 μl, besonders bevorzugt beträgt es zwischen 20 μj und 40 μl.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Oligonukleotiden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.
Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Oligonukleotide entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1 % eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01 % bevorzugt wird, sowie Tris-HCI oder eine andere geeignete Puffersubstanz in einer Konzentration von 0,001-0,1 Mol/I, bevorzugt 0,02 Mol/I, enthalten, wobei der pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise um 8,0 liegt. Das Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCI, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 Mol/I bis 0,9 Mol/I, bevorzugt von 0,01 Mol/I bis 0,9 Mol/I, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCI-Konzentration von 0,07 Mol/I. Für Hybridisierungen, in denen spezifische Nachweise mit den Oligonukleotiden gemäß SEQ ID No. 19 bis 30 durchgeführt werden sollen, sind insbesondere NaCI-Konzentrationen von 0,05-0,22 mol/l geeignet. Des weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 Mol/I beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
Das "Abwaschen" der nicht gebundenen Oligonukleotide erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 44 °C bis 48 °C für eine Dauer von 10 - 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten. Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung des verwendeten Oligonukleotids möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vielfältig.
Ein besonderer Vorteil ist die Geschwindigkeit dieses Nachweisverfahrens. Während die traditionelle Kultivierung bis zu sieben Tage für den Nachweis benötigt, liegt das Ergebnis nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb von drei Stunden vor. Dies ermöglicht erstmals eine begleitende diagnostische Kontrolle der Wirkungen und unerwünschten Wirkungen einer angewandten Behandlung. Hier ist weiterhin vorteilhaft, dass das erfinderisch bereitgestellte Verfahren es ermöglicht, alle genannten Mikroorganismen gleichzeitig nachzuweisen, was einen weiteren Zeitvorteil bedeutet, da alle Schritte von der Probenahme bis zur Auswertung nur einmal durchgeführt werden müssen.
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen.
Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache, dass durch die erfinderisch bereitgestellten Oligonukleotide nunmehr erstmals auch solche Mikroorganismen beispielsweise der Hautmikroflora nachgewiesen werden können, die von den traditionellen Nachweisverfahren bislang nicht erfasst wurden.
Dabei können je nach Spezifität des Oligonukleotids bzw. der verwendeten Oligonukleotide unterschiedlichste Gruppen von Mikroorganismen detektiert werden. Es ist einerseits möglich große Gruppen von Mikroorganismen, aber auch kleinere Untergruppen, die eine enge Verwandtschaft aufweisen, und sogar einzelne Spezies spezifisch, neben anderen, auch nahe verwandten Mikroorganismenspezies nachzuweisen. Weiterhin ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, im Falle des positiven Signals, über die Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, eine Einordnung von unbekannten Mikroorganismenspezies in den phylogenetischen Stammbaum vorzunehmen oder solche Zuordnungen, die aufgrund von biochemischen Nachweisen vorgenommen wurde, zu bestätigen.
Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität der Oligonukleotide. Es können sowohl spezifisch bestimmte Gattungen oder Gruppen von Mikroorganismen nachgewiesen werden als auch hochspezifisch einzelne Spezies einer Gattung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe in Schritt a) des Verfahrens gewonnen i) von der Hautoberfläche, ii) aus Lebensmitteln, iii) aus der Umwelt, insbesondere aus Wasser, Boden oder Luft, iv) aus Abwasser oder aus einem Biofilm, v) aus medizinischem Untersuchungsmaterial, oder vi) aus einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt.
Im Rahmen dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe von der Hautoberfläche durch die Ablösung von Mikroorganismen der Hautflora mittels einer Detergenslösung vom zu untersuchenden Areal gewonnen.
Ein wesentlicher Vorteil besteht beispielsweise darin, dass nun erstmals der gleichzeitige Nachweis dieser medizinisch und kosmetisch relevanten Mikroorganismen der Hautmikroflora möglich ist. So können durch Verwendung unterschiedlicher Marker für die Oligonukleotide ganz nach Bedarf alle, mehrere oder einzelne Mikroorganismengruppen oder -spezies parallel nachgewiesen und dabei klar voneinander unterschieden werden. Auch können so erstmals die Populationsverhältnisse dieser Mikroorganismengruppen oder -Spezies und die zwischen ihnen bestehenden Wechselwirkungen analysiert werden. Dies eröffnet erstmals die Möglichkeit zur eindeutigen Diagnose und gezielten Behandlung von medizinisch und/oder kosmetisch relevanten Hautproblemen. Es ist nun erstmals möglich, die Auswirkungen einer medizinischen Therapie oder kosmetischen Behandlung auf die Gesamtmikroflora der Haut zu erfassen. Mögliche Wirkungen ebenso wie unerwünschte Wirkungen einer Behandlung können so früh erkannt und in der weiteren Behandlung verstärkt bzw. unterbunden werden.
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen. Erstmalig können somit Erkenntnisse bezüglich der absoluten und relativen quantitativen Verhältnisse der genannten Mikroorganismen der Hautmikroflora gewonnen werden. Dies ermöglicht vor, während und nach einer medizinischen oder kosmetischen Behandlung die Überprüfung des Erfolgs sowie aller Auswirkungen dieser Behandlung. In diesem Zusammenhang ist weiterhin von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausschließlich lebende Mikroorganismen erfasst.
Bei der Probennahme von der Haut des Probanden wird die Haut in Kontakt mit einer Detergenslösung gebracht, die die Ablösung der Mikroorganismen von der Hautoberfläche erleichtern soll. Bevorzugt werden physiologisch unbedenkliche Detergenzien, wie z. B. Tween oder Triton, in Konzentrationen von etwa 0,01-1 Gew.-% eingesetzt. Ein pH-Wert zwischen 5 und 10, insbesondere zwischen 7 und 9, z. B. 8, hat sich als günstig erwiesen.
Um eine bessere Ablösung der Mikroorganismen zu erreichen, wird die Hautoberfläche mit Hilfe eines Schabeinstrumentes abgerieben. Es eignen sich dabei Stäbe unterschiedlicher Dicke, z. B. mit einem Durchmesser von 0,05 bis 1 ,5 cm, aus unterschiedlichen Materialien wie beispielsweise Glas, Metall oder Plastik. Ebenso sind Spatel aus den genannten Materialien mit einer abgerundeten Fläche geeignet. Bevorzugt finden Glasstäbe zwischen 0,4 und 0,8 cm Durchmesser oder Plastikspatel Verwendung. Ebenfalls günstig eingesetzt werden können beispielsweise Mundstücke von Glaspipetten, z. B. einer 5 ml Glaspipette. Als besonders geeignet hat es sich erwiesen, rauere Oberflächen über die Haut zu reiben, um die Ablösung zu erhöhen. Insbesondere geeignet sind Plastikspatel mit rauer Oberfläche, beispielsweise ein Probenahmespatel aus Polyamid glasfaserverstärkt der Fa. Merck (Art. Nr. 231J2412, Doppelspatel, Länge 180 mm). Ebenfalls erfindungsgemäß geeignet sind Abreibungen mit Tupfern sowie die Probengewinnung durch Abklatschen mit viskoseren Medien oder auch Hautabrisse mit Klebefilmen (beispielsweise handelsübliche Haushaltsklebestreifen). Die Mikroorganismen können bei diesen Methoden beispielsweise durch Abwaschen mit einer entsprechenden Pufferlösung von diesen Gegenständen gewonnen werden. Das weitere Verfahren kann auch direkt auf dem Klebestreifen durchgeführt werden.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren auch bei der Kontrolle von Lebensmitteln angewendet. Insbesondere werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen.
Des weiteren können beispielsweise Umweltproben mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersucht werden. Diese Proben können hierzu aus Luft, Wasser oder aus dem Boden entnommen sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist für die Untersuchung von Gewebeproben, z.B. Biopsiematerial aus der Lunge, Tumor- oder entzündliches Gewebe, aus Sekreten wie Schweiß, Speichel, Sperma und Ausfluss aus der Nase, Harnröhre oder Vagina sowie für Urin- oder Stuhlproben geeignet.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende Verfahren ist die Untersuchung von Abwässern, z.B. Belebtschlamm, Faulschlamm oder anaeroben Schlamm. Darüber hinaus ist es geeignet, Biofilme in industriellen Anlagen zu analysieren, sowie auch sich natürlicherweise bildende Biofilme oder bei der Abwasserreinigung bildende Biofilme zu untersuchen. Auch die Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte etc. z.B. auf Kontamination mit Mikroorganismen ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Fixierung durch i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen, ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, oder iii) als Hitzefixierung
Insbesondere können die Mikroorganismen nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die fixierten Zellen der Mikroorganismen vor Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens permeabilisiert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Permeabilisierung" eine enzymatische Behandlung der Zellen verstanden. Durch diese Behandlung wird die Zellwand von Pilzen und gram-positiven Bakterien für die Oligonukleotide durchlässig gemacht. Hierfür geeignete Enzyme, deren geeignete Konzentrationen und für diese geeignete Lösungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Es versteht sich von selbst, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Analyse gram-negativer Bakterien geeignet ist; die enzymatische Behandlung zur Permeabilisierung wird dann entsprechend adaptiert, es kann auf diese dann auch ganz verzichtet werden.
Die Permeabilisierung der Zellen vor der Hybridisierung hat den Vorteil, dass die Oligonukleotide zwar in die Zellen eindringen können, die Ribosomen und somit die rRNA aber nicht aus den Zellen entweichen kann. Der große Vorteil dieser Technik der Ganzzellhybridisierung ist, dass die Morphologie der Bakterien intakt bleibt und man diese intakten Bakterien in situ, also in ihrem natürlichen Umfeld detektieren kann. Folglich können die Bakterien nicht nur quantifiziert werden, sondern auch eventuelle Assoziationen zwischen verschiedenen bakteriellen Gruppen nachgewiesen werden.
Ganz besonders bevorzugt kann die Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K, Pronase und Mutanolysin erfolgen.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein als Positivkontrolle geeignetes Oligonukleotid bereit gestellt. Ein solches Oligonukleotid ist dadurch gekennzeichnet, dass es möglichst viele, optimalerweise alle in der analysierten Probe enthaltenen Bakterien bzw. Eurkaryonten erfasst. Hierzu ist beispielsweise das von Amann et al., (1990) beschriebene Oligonukleotid EUB338 (Bakterien) bzw. das Oligonukleotid EUK (Eukaryonten) geeignet. Eine solche Positivkontrolle kann zur Überprüfung der ordnungsgemäßen Durchführung des angewendeten Verfahrens eingesetzt werden. Vor allem aber erlaubt sie die Bestimmung eines prozentualen Anteils der spezifisch nachgewiesenen Mikroorganismen gegenüber der
Bakteriengesamtpopulation.
Bereitgestellt wird weiterhin ein Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dieser Kit enthält als wichtigste Bestandteile die jeweiligen Hybridisierungslösungen mit den oben beschriebenen jeweils für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotiden. Weiterhin ist kann enthalten sein eine entsprechende Hybridisierungslösung ohne Oligonukleotide sowie die entsprechende Waschlösung oder ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung. Weiterhin können gegebenenfalls enthalten sein Enzymlösungen, Fixierungslösungen sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung. Gegebenenfalls sind Hybridisierungslösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle (beispielsweise ohne oder mit nicht- hybridisierenden Oligonukleotiden) enthalten. Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das Kit zum Nachweis von Mikroorganismen der Hautmikroflora verwendet. So ist die Verwendung des Kits bei der Wirkstoffsuche, bei der Analyse der Mikroflora der Haut sowie bei der Testung der Wirkung von wirkstoffhaltigen Kosmetika vorteilhaft. Die Untersuchung von Proben sowohl von menschlicher als auch von tierischer Haut kann mit den erfindungsgemäßen Kits effizient und auch gegen einen hohen Hintergrund von anderen Mikroorganismen erfolgen.
Besonders geeignet ist ein Kit, welches mehrere Oligonukleotide bzw. Oligonukleotidkombinationen enthält. Insbesondere ist es bevorzugt, solche Oligonukleotide bzw. Oligonukleotidkombinationen, die eine größere Gruppe der nachzuweisenden Mikroorganismen detektieren können, in einem Kit mit einem oder mehreren Oligonukleotiden, die nur eine oder wenige Spezies aus dieser Gruppe nachweisen können, einzusetzen. Beispielsweise kann es sinnvoll sein, zuerst solche Proben mit einer oder mehreren Sonden vorab zu identifizieren, die Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium enthalten, und anschließend die positiven Proben spezifisch auf einzelne Mikroorganismenspezies oder -gruppen innerhalb der Gattung Corynebacterium zu untersuchen. Oligonukleotide, die insbesondere auch in Kombination für den Nachweis von vielen verschiedenen Spezies der Gattung Corynebacterium, bevorzugt für den Nachweis der hautrelevanten Spezies der Gattung Corynebacterium, eingesetzt werden können, ist ein solches Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der unter SEQ. ID No. 7 bis 12, insbesondere 7, 8, 10 und 11, oder deren Kombination, insbesondere die Oligonukleotidkombination, die alle Oligonukleotde der SEQ. ID No. 7, 8, 10 und 11 enthält. Dazu kann dann je nach Art des interessierenden Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium eine oder mehrere der oben genannten Oligonukleotide gemäß SEQ ID No. 19 bis 26 zum Kit hinzugefügt werden.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung beschreiben, ohne sie einzuschränken: Nachweis von Mikroorganismen der Hautmikroflora
Probenahme:
Die Probenahme erfolgt mittels der Detergens-Waschmethode ((P. Williamson, A.M. Kligman. (1965) J. Invest. Derm., Vol. 45, No. 6).
Durchführung:
1. Der beidseitig offene Kunststoffzylinder wird mit der nicht beschädigten Seite auf die zu untersuchende Hautoberfläche gedrückt und mit 1 ,5ml der Detergenslösung (eine physiologische Tween-Pufferlösung, pH 8,0 mit 0,523 KH2P04g/Liter, 16,73 K2HP04 g/Liter, 8,50 NaCI g/Liter, 10,00 Tween 80 g/Liter und 1 ,00 Trypton g/Liter) gefüllt.
2. Mit einem der o.g. Schabegeräte wird die zu behandelnde Fläche 6x horizontal und 6x vertikal unter leichtem Druck abgerieben.
3. Die Prozedur wird nach Absaugen der Flüssigkeit wiederholt.
Die beiden Flüssigkeiten werden vereinigt. Ein Teil der Probe aus den beiden vereinigten Flüssigkeiten wird für den anschließenden Nachweis unter Verwendung von Oligonukleotiden verwendet, ein anderer Teil wird für den als Kontrolle dienenden, parallel durchgeführten Nachweis durch Kultivierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verwendet.
Zum Ansetzen der Detergenslösung soll keimfreies Wasser (z. B. Millipore- Wasser) eingesetzt werden.
Fixierung:
Die entnommene Probe wird sodann mit einem Volumen absolutem Ethanol versetzt und zentrifugiert (Raumtemperatur, 8.000 U/min, 5 Minuten). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem Volumen 1 x PBS-Lösung gewaschen. Abschließend wird das Pellet in 1/10 Volumen Fixierungslösung (50 % Ethanol) resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Ein Aliquot der Zellsuspension wird auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen vollständig dehydratisiert durch Aufbringen einer weiteren Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46 °C, 3 min oder bis vollständig trocken).
Permeabilisierung:
Anschließend wird ein geeignetes Volumen einer geeigneten Enzymiösung aufgebracht und die Probe inkubiert (Raumtemperatur, 15 min). Dieser Schritt wird ggf. mit einer weiteren geeigneten Enzymiösung wiederholt.
Die Permeabilisierungslösung wird mit destilliertem Wasser entfernt und die Probe erneut vollständig getrocknet (Inkubation bei 46 °C bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen erneut vollständig dehydratisiert durch Aufbringen der Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46 °C, 3 min oder bis vollständig trocken).
Hybridisierung:
Anschließend wird auf die fixierten, vollständig aufgeschlossenen und dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotide aufgebracht. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungslösung (ohne Oligonukleotide) befeuchteten Kammer (46 °C, 90 min).
Waschen:
Anschließend wird der Objektträger in eine mit Waschlösung befüllte Kammer eingetaucht und inkubiert (46 °C, 15 min).
Anschließend wird der Objektträger in eine mit destilliertem Wasser befüllte Kammer kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Detektion: Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Einbettmedium eingebettet. Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.
Analysenergebnisse
1.
Von einer weiblichen Probandin mit Mischhaut (typisiert durch eine Kosmetikerin und bestätigt durch Sebometer-Messungen) wurden Mikroorganismen-Proben von der Stirn mittels der oben beschriebenen Methode zur Probennahme genommen.
Es wurde ein sehr hoher Anteil an Propionibakterien durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der Gesamtzellzahl festgestellt (>90 %). Es wurde ein geringer Anteil von Staphylokokken festgestellt (<10 %). Es wurden keine Corynebakterien gefunden.
2.
Von einer anderen weiblichen Probandin wurde eine Mikroorganismen-Probe von der Haut mittels der oben beschriebenen Methode zur Probennahme genommen.
Aus einem Teil der Probe wurde das 16 S rRNA-Gen eines Mikroorganismus isoliert. Die anschließende Sequenzbestimmung ergab, dass es sich um eine neue Sequenz handelt, wobei sich der Mikroorganismus aber der Gattung Corynebacterium zuordnen lässt. Diese Sequenz, anhand derer eine entsprechende Sonde (gemäß SEQ ID No. 21) entwickelt wurde, die diesen Mikroorganismus nachweisen kann, ist unter SEQ ID No. 31 im Sequenzprotokoll angegeben.
Ein weiterer Teil der Probe wurde mit der früher beschriebenen bakterienspezifischen Sonde EUB und mit einem Sondengemisch (SEQ ID No. 07 bis 11) zum Nachweis der hautrelevanten Corynebakterien hybridisiert. Es wurde ein hoher Anteil an Corynebakterien durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der Gesamtzellzahl, die von der bakterienspezifischen Sonde erfasst worden war, festgestellt (ca. 73%).
Von den Corynebakterien dieser Probe hybridisierte ein kleiner Anteil von etwa 5% mit dem markierten Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 21, was durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der zuvor detektierten Corynebakterienzahl ermittelt werden konnte, wobei das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 22 gleichzeitig unmarkiert als Kompetitor mitzugesetzt wurde.

Claims

Patentansprüche:
1. Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 30 angegebenen
Sequenzen, und i) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) zumindest in 80
%, bevorzugt in mindestens 84 %, besonders bevorzugt in mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt in 95% der Nukleotide übereinstimmen, und iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ii) genannten
Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der
Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten
Bedingungen hybridisieren.
2. Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus den Gattungen Staphylococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia und/oder des Sporomusa-Taxons.
3. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Oligonukleotid einen detektierbaren Marker trägt, der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist.
4. Oligonukleotid nach Anspruch 3, wobei der detektierbare Marker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus a) Fluoreszenzmarker, b) Chemolumineszenzmarker, c) radioaktiver Marker, d) enzymatisch aktive Gruppe, e) Hapten, f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.
5. Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei der enzymatische Marker aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt wird.
6. Oligonukleotidkombination zum Nachweis von Mikroorganismen enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Staphylococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 03 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder ii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der
Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 04 bis 06 sowie 27 bis 29 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 07 bis 12 sowie No. 19 bis 26 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iv) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Veillonella ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 13 bis 15 angegebenen
Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruch 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruch 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder v) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies Propionibacterium acnes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 16 und 17 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder vi) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Pilzen der
Gattung Malassezia ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Sequenz und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren
und/oder vii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
8. Oligonukleotidkombination nach Anspruch 7, enthaltend i) mindestens ein, insbesondere mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Staphylococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 und 02 angegebenen
Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder ii) mindestens ein, insbesondere mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 04 sowie 27 bis 29 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iii) mindestens ein, insbesondere mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 7, 8, 10, 11 und 19 bis 26 angegebenen Sequenzen, b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder iv) mindestens ein, insbesondere mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Veillonella ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 13 und 14 angegebenen Sequenzen, b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder v) mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Spezies Propionibacterium acnes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 16 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
und/oder vi) mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Pilzen der Gattung Malassezia ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID No. 18 und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren
und/oder vii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
9. Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 6 bis 8, enthaltend ein, mehrere oder alle Oligonukleotide mit den in SEQ ID NO. 01 , 02, 04, 07, 08, 10, 11, 13, 14, 16, 18 sowie 19 bis 30 angegebenen Sequenzen.
10.Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen insbesondere der Gattungen Staphylococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Corynebacterium, Veillonella, Malassezia und/oder des Sporomusa-Taxons durch in-situ- Hybridisierung, umfassend die folgenden Schritte: a) Entnahme einer Probe b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem Oligonukleotid oder Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 9, um eine Hybridisierung herbeizuführen d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden hybridisierten Mikroorganismen.
11.Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Probe in a) gewonnen wird i) von der Hautoberfläche, ii) aus Lebensmitteln, iii) aus der Umwelt, insbesondere aus Wasser, Boden oder Luft, iv) aus Abwässern oder aus einem Biofilm, v) aus medizinischem Untersuchungsmaterial, oder vii) aus einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei die Fixierung durch i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen erfolgt, ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd erfolgt, iii) wobei die Fixierung als Hitzefixierung erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Mikroorganismen nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Mikroorganismen vor der Hybridisierung permeabilisiert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Permeabilisierung erfolgt durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K, Pronase und Mutanolysin.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig neben markierten Oligonukleotiden unmarkierte Oligonukleotide eingesetzt werden.
17. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 16, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, vorzugsweise eine Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
18. Kit nach Anspruch 17, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine Hybrisierungslösung ohne Oligonukleotide enthält.
19. Kit nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Waschlösung oder ein Konzentrat der Waschlösung enthält.
20. Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Permeabilisierungslösung enthält.
21. Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Fixierungslösung enthält.
22. Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Positivkontrolllösung enthält.
23. Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Negativkontrolllösung enthält.
24. Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei der Kit zusätzlich eine Einbettlösung enthalt.
25. Verwendung i) eines Oligonukleotids oder einer Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ii) eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 16 und/oder iii) eines Kits nach einem der Ansprüche 16 bis 24 zum Nachweis und/oder der Quantifizierung von Mikroorganismen.
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