AT503401A1 - Microarray zur erkennung von pathogenen - Google Patents

Description

1

Die vorliegende Erfindung betrifft das mikrobiologische Gebiet der auf Nukleotiden basierenden Detektion und Identifikation von Mikroorganismen.

Mikroarrays sind genomische Werkzeuge, die ursprünglich zur Überwachung der Genexpression entwickelt wurden, auch zur Detektion von spezifischen Mutationen in DNA-Sequenzen angewendet wurden und in jüngster Zeit bei der Paralleldetektion und -Identifikation von Mikroorganismen in Umwelt- oder klinischen Proben eingesetzt werden. Auch wenn in letzter Zeit vermehrt mikrobielle Diagnose-Arrays (MDMs) verwendet werden (Loy et al., 2002; Bodrossy et al., 2003; Lee & Chao, 2005; Hashsham et al., 2004; Tiquia et al., 2004; DeSantis et al., 2005; Schadt et al., 2005; Bae et al., 2005; Wang et al., 2005; Lehner et al., 2005; Leinberger et al., 2005; Neufeld et al., 2006), bringt die umwelttechnische Anwendung weiterhin große Herausforderungen hinsichtlich Spezifität, Sensitivität und Quantifizierung mit sich (Zhou, 2003). Die MDM-Sensitivität kann auf verschiedene Weise definiert werden. Die für eine erfolgreiche Detektion nötige Menge an Nukleinsäure; das Verhältnis von mikrobieller Nukleinsäure zu Hintergrund-, Wirts-Nukleinsäure; und das Verhältnis von Target- zu Non-Target-mikrobieller Nukleinsäure. Meist wirkt sich die dritte Art der Sensitivitätsschwelle, die in direktem Zusammenhang mit der relativen Häufigkeit der Zielmikrobe (n) innerhalb der Mikrobengemeinschaft steht, einschränkend auf die Anwendbarkeit von MDMs aus. Die derzeit berichtete Sensitivitätsschwelle von MDMs liegt bei 1 bis 5 % relativer Häufigkeit (Bodrossy et al., 2003; Denef et al., 2003; Tiquia et al., 2004). MDMs für Analysen der Mikrobengemeinschaft müssen in der Lage sein, Mikroben aus einem weiten phylogenetischen Bereich nachzuweisen. Ihre Anwendung kann wiederum eine relativ niedrige Sensitivität hinsichtlich der relativen Häufigkeit tolerieren. Andererseits sind eine hohe Spezifität und Sensitivität Hauptanforderungen an MDMs, die zum Nachweis von Pathogenen verwendet werden. Solche MDMs, die in der klinischen Mikrobiologie, in der Veterinär- und Nahrungsmittelmikrobiologie sowie in der allgemeingesundheitlichen Mikrobiologie verwendet werden, stützen sich typischerweise auf art- oder gattungsspezifische PCR-Ampli-fikationen zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität einer Detektion (Sergeev et al., 2004; Lee & Chao, 2005; Maynard et al., 2005). Der Nachteil dabei ist, dass sie dann auf einen engen

I NACHGEREICHT 2

Bereich von Pathogenen beschränkt sind. Um einen Bereich von verschiedenen Pathogenen abzudecken, erfordert dieser Ansatz die Durchführung von Mehrfach-PCR- oder Multiplex-PCR-Reaktionen (PCR mit mehreren Primerpaaren auf einmal). Epidemiologische und allgemeingesundheitliche Erhebungen sowie die Durchmusterung von veterinären, Nahrungsmittel- und Wasserproben auf Pathogene erfordern einen unterschiedlichen Ansatz, der eine breite Abdeckung mit hoher Spezifität und gesteigerter Sensitivität kombiniert.

Die CN 1396270 beschreibt einen DNA-Mikroarray zum Nachweis von in Wasser häufig anzutreffenden pathogenen Bakterien wie Escherichia-Bakterien, Salmonella, Staphylococcus etc., bei welchem das 16s-rRNA-Gen, zwei in der Konservierungsregion des 16s-rRNA-Gens designte Primer und eine Sonde für die variable Region des 16s-rRNA-Gens verwendet werden.

Die DE 199 45 916 beschreibt mehrere Oligonukleotidsequenzen für bakterielle 23S/5S-rRNA-Sonden, die in Assays zur Unterscheidung von Bakterien unterschiedlicher Kategorien verwendet werden können.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Oligonukleotidsonden zum sensitiven und spezifischen Nachweis eines weiten Bereichs von Mikroorganismen aus Proben, die komplexe Mikrobengemeinschaften enthalten.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Set von Oligonukleoti-den zur Verfügung, die spezifisch für das gyrB-Gen eines Mikroorganismus sind, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid eine Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71, oder ein Fragment einer Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71 mit 14 bis 30 Nukleotiden, mit gegebenenfalls 1 oder 2 Punktmutation(en), aufweist. Dabei sind die vollständigen Nukleotide der angegebenen Sequenzen, aber auch Fragmente mit einer Länge von mindestens 8, 10 , 12, 14, 16, 20, 24, 28 oder 30 nt möglich. Die Sequenzen können gegebenenfalls auch weitere nt-Sequenzen umfassen. Die Mutationen gestatten den Nachweis von anderen nahe verwandten Mikroorganismen, die zu Nichtübereinstimmungen bei Hybridisierungsversuchen mit genetischem Probenmaterial oder amplifiziertem Material eines oder mehrerer Mikroorganismen führen. Bei einer Punktmutation ist ein Nukleotidaustausch, aber auch eine Deletion oder Insertion möglich. Besonders bevorzugt sind die Mutationen am 3'-Ende der Oligonukleotidsequenzen. Bevorzugt werden jedoch die in SEQ ID NOs 1 bis 71 angeführen Sequenzen. Γ 1 -.

[NACHGEREICHT 3

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set von Oligonukleotiden zur Verfügung, die spezifisch für das gyrB-Gen von mindestens zwei Mikroorganismen unterschiedlicher Gattungen sind, welches für das hierin beschriebene Verfahren verwendet werden kann.

Bevorzugt umfassen die Oligonukleotide Sequenzen ausgewählt aus mindestens zwei, bevorzugter mindestens 10, am meisten bevorzugt mindestens 30, verschiedenen Sequenzen SEQ ID NOs 1 bis 71. Die Sequenzen dieses Sets sind spezifisch für das gyrB-Gen von unterschiedlichen Arten oder Gattungen ausgewählter Mikroorganismen und können zu deren Detektion oder Identifikation verwendet werden. Je nach den verschiedenen Verfahren, z.B. Hybridisierungsverfahren, Verfahren auf PCR-Basis oder Mikroarray-Verfahren, bei denen unterschiedliche Stringenzbedingungen angewendet werden, kann jedes Oligonukleotid nur einen Mikroorganismus oder einen nahe verwandten Mikroorganismus (z.B. über eine geringere Stringenz) nachweisen.

Vorzugsweise umfasst das Set Oligonukleotide, worin jedes Oligonukleotid spezifisch für das gyrB-Gen eines Mikroorganismus ist und das Set Oligonukleotide umfasst, die spezifisch für mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 24 oder 32 Mikroorganismen unterschiedlicher Gattungen sind, wodurch ein breites Spektrum von nachweisbaren Mikroorganismen möglich ist.

Vorzugsweise umfasst das Set Oligonukleotide, worin verschiedene Oligonukleotide Sequenzen ausgewählt aus mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 24, 30 oder 32 verschiedenen Sequenzen SEQ ID NOs 1 bis 71 aufweisen.

Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Set von Oligonukleotiden zur Verfügung gestellt, das Oligonukleotide umfasst, die komplementär revers zu den Oligonukleotiden einer Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71 sind. Solche Oligonukleotide, deren Sequenz komplementär revers zu Template-Oligonukleotiden ist, können somit an diese Template-Oligonukleotide hybridisieren. Komplementär reverse Oligonukleotide sind auch spezifisch für den Gegensinnstrang eines genetischen (oder amplifizierten) DNA-Strangs. Dieses Sets können auch weitere Oligonukleotide, insbesondere für Mikroorganismen spezifische Oligonukleotide, z.B. direkt ausgewählt aus SEQ ID NOs 1 bis 71, umfassen und so Mischungen in der Spezifität für den gyrB-Strang in der Sinn- und Gegensinnrichtung bilden.

Vorzugsweise sind die Oligonukleotide des Sets markiert. 1 nachgereicht | 4

Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen festen Träger zur Verfügung, worin die Oligonukleotide des Sets oder Oligonukleotide, die zu den Oligonukleotiden des Sets komplementär revers sind (und somit die Oligonukleotide des Sets hybridisieren können), auf dem festen Träger immobilisiert sind.

Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen festen Träger mit mindestens zwei Sonden zur Verfügung, die spezifisch für das gyrB-Gen von mindestens zwei Mikroorganismen unterschiedlicher Gattungen sind, die auf dem festen Träger immobilisiert sind.

Weiters bevorzugt umfassen die Sonden auf dem Träger Sequenzen, die ausgewählt sind aus mindestens zwei, bevorzugter mindestens 10, am meisten bevorzugt mindestens 30 verschiedenen Sequenzen, die komplementär revers zu SEQ ID NOs 1 bis 71 sind (und daher diese Sequenzen hybridisieren können).

Vorteilhaft sind diese Oligonukleotidmoleküle an verschiedenen Spots auf der Oberfläche immobilisiert. Durch Vorsehen von Spots werden spezifisch definierte Regionen mit den immobilisierten Oligonukleotidmolekülen erzeugt. Ist ein Spot spezifisch für bestimmte Mikroorganismen, dann kann der in der untersuchten Probe vorhandene Mikroorganismus genau definiert werden. Weiters ist es möglich, ein Referenz-Oligonukleotidmolekül in den Spots vorzusehen, welches nicht nur eine positive Kontrolle darstellt, sondern auch als Referenz für die Quantifizierung herangezogen werden kann.

Vorzugsweise bildet der feste Träger einen Mikroarray. DNA-Mikroarrays sind ein wirksames Werkzeug zur leistungsstarken Pa-ralleldetektion und Quantifizierung vieler Gene. Ursprünglich für Genexpressionsanalysen ganzer Genome entwickelt, haben DNA-Mikroarrays ein sehr starkes Anwendungspotential auf vielen Gebieten der Mikrobiologie. Bei Verfügbarkeit entsprechender Sondensets ermöglichen sie den Nachweis von bis zu mehreren Tausend Mikrobenstämmen, Arten oder Artengruppen (je nach Sondendesign) in einem einzigen Assay. Für die klinische Mikrobiologie, die Veterinär- und Pflanzenmikrobiologie sowie die Nahrungsmittelund Wasser-Qualitätskontrolle bedeutet das, dass ein einziger Test entwickelt werden kann, um sämtliche pathogenen/nützlichen/ kontaminierenden Bakterien nachzuweisen, die in der untersuchten Probe anwesend sein könnten. Das Potential für die Umweltmikrobiologie ist noch höher. Durch die Anwendung von verschachtelten

NACHGEREICHT - 5 - ··

Oligonukleotidsondensets, die Zielgene anvisieren, welche die Phylogenie des Trägerorganismus widerspiegeln, wird es möglich, die ganze Prokaryonten-Diversität einer Umwelt grob zu bestimmen.

Ein Mikroarray umfasst eine große Anzahl von immobilisierten Oligonukleotidmolekülen in hoher Dichte auf dem festen Träger. Ein Mikroarray ist ein hochwirksames Werkzeug zum Nachweis von Hunderten bis Millionen von Zielmolekülen in einem einzigen Detektionsschritt. Solche Mikroarrays werden oft als Slides oder Platten, insbesondere Mikrotiterplatten, vorgesehen. Im Stand der Technik wird ein Mikroarray entweder als Miniaturanordnung von Bindungsstellen (d.h. Material, Träger) oder als Träger mit Miniatur-Bindungsstellen (d.h. Array) definiert. Beide Definitionen können auf die Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Für die erste Definition ist die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Miniaturanordnung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide in einem Mikroarray. Die Oligonukleotidmoleküle werden vorzugsweise mit Hilfe einer Druckeinrichtung auf dem Mikroarray immobilisiert, die die Immobilisierung in hoher Dichte auf dem festen Träger gewährleistet. Dieser Mikroarray ist besonders bei der Analyse einer großen Anzahl von Proben nützlich.

Besonders bevorzugt weist der feste Träger eine Aldehyd-Oberfläche auf. Eine Aldehyd-Oberfläche kann zur Immobilisierung von Oligonukleotidsonden, insbesondere mit einer NH2-Gruppe an einem Ende, die vorzugsweise im Linker enthalten ist, verwendet werden. Der Linker ist vorzugsweise ein Cx- bis Ci0-, vorzugsweise ein C2— bis C6-Linker, der an ein kurzes, z.B. 4,5,6 nt langes T-Stretch gebunden ist.

Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus zur Verfügung, umfassend das i) Vorsehen von DNA des gyrB-Gens des Mikroorganismus, ii) Hybridisieren der gyrB-DNA mit dem erfindungsgemäßen Oligo-nukleotidset oder dem festen Träger, worin die Oligonukleotide unter stringenten Bedingungen immobilisierte Sonden bilden, iii) gegebenenfalls Markieren von hybridisierten Oligonukleoti-den, iv) Sichtbarmachen von hybridisierten Oligonukleotiden.

Durch die spezifische Hybridisierung mit dem erfindungsge-

NACHGEREICHT 6 6 ♦ ♦ • · • · • ♦·· mäßen Set kann eine Vielzahl von Mikroorganismen über das gyrB-Gen nachgewiesen und identifiziert werden. Die Spezifität von MDMs definiert sich in erster Linie über den Grad der Konservierung des Markergens und die Länge der Oligonukleotidsonde (Loy & Bodrossy, 2006). Das gyrB-Gen, das für die Untereinheit B der Bakteriengyrase codiert, erfüllt sämtliche Voraussetzungen für ein phylogenetisch nützliches Protein-codierendes Gen: es ist in den meisten Bakterienarten zu finden und wird scheinbar nicht häufig horizontal übertragen. Weiters ist die Rate der gyr-B-Evolution nicht nur schneller als die der ribosomalen Gene, sondern scheint auch schnell gegenüber anderen Protein-codierenden Housekeeping-Genen zu sein (http://seasquirt.mbio.co.jp) (Yama-moto & Harayama, 1995). Kurze Oligonukleotidsonden ermöglichen die Differenzierung der Unterschiede einzelner Oligonukleotide.

In Kombination mit einem hochauflösenden phylogenetischen Marker kann eine optimale Leistung hinsichtlich MDM-Spezifität erzielt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren eignet sich zur sensitiven und spezifischen Detektion eines weiten Bereichs von Mikroorganismen aus Proben, die komplexe Mikrobengemeinschaften enthalten.

Bevorzugte stringente Bedingungen sind 60°C Annealing-Tempe-ratur zur Markierung und 55°C zur Hybridisierung mit den Sonden des festen Trägers, mit 6xSSC, lxDenhardt-Reagens (Sigma, St. Louis, Mikroorganismus, USA), 0,1% SDS, insbesondere dann, wenn die reaktiven Oligonukleotide für eine Schmelztemperatur Tm von 60°C'ausgelegt sind (z.B. +/-2°C, jedoch kann auch ein signifikanter Anteil von Oligos mit niedrigerer Tm nach wie vor funktionieren) , u.zw. zur Hybridisierung der reaktiven Oligonukleotide (RC-Oligos) an die Probe (z.B. das PCR-Produkt) und/oder der Sonden an den Träger. Oligonukleotide mit unterschiedlichen Gesamtschmelztemperaturen können jedoch ebenfalls gebildet werden, z.B. 55°C durch Auswählen von gyrB-Stretches mit unterschiedlichem GC-Gehalt, wodurch die bevorzugte Stringenztemperatur auf die Schmelztemperatur abgesenkt'wird. In besonders bevorzugten Fällen wird die Stringenz durch Erhöhung der konzipierten Schmelztemperatur um 5°C über die durchschnittliche Schmelztemperatur der Oligonukleotide erhöht.

In einer weiteren Ausführungsform ist ein Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus vorgesehen, umfassend das a) Vorsehen des erfindungsgemäßen Sets von für das gyrB-Gen

• · · · · · • · · · · · ·· • »•ft · · • · · # · · · ·· ·· · ·· - 7 - des Mikroorganismus spezifischen Oligonukleotiden, b) Vorsehen eines Trägers mit immobilisierten Sonden, welche Sonden unter stringenten Bedingungen an die Oligonukleotide hybridisieren können, c) Vorsehen einer Probe von Mikroorganismus-DNA oder -RNA, die vorzugsweise mittels PCR, am meisten bevorzugt mittels für das gyrB-Gen spezifischer PCR, amplifiziert wird, d) Hybridisieren der Oligonukleotide mit der Probe unter stringenten Bedingungen, e) Markieren von hybridisierten Oligonukleotiden, f) Hybridisieren der Oligonukleotide gegen die Sonden auf dem Träger unter stringenten Bedingungen, g) Sichtbarmachen der an die Sonden gebundenen markierten Oligonukleotide .

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Sonden die revers komplementären Sequenzen der Oligonukleotide (zur Ermöglichung der Hybridisierung an die Oligonukleotide) und vorzugsweise einen Linker zum Binden an den Träger.

Vorzugsweise bilden der vorzugsweise feste Träger und die immobilisierten Sonden einen Mikroarray.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sonden Oligo-nukleotidsonden, insbesondere DNA oder RNA mit Längen zwischen 10 und 30 nt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Markierung durch Zugabe von mindestens einem markierten ddNTP. Die Zugabe von ddNTPs verhindert eine weitere Markierung und Signalveränderung. Vorzugsweise ist die Markierung eine fluoreszierende Markierung oder eine radioaktive Markierung, z.B. 32P. Vorzugsweise sind die markierten Nukleotide ddCTP.

Vorzugsweise sind während einer Hybridisierung kompetitive Oligonukleotide anwesend, die sich von den Oligonukleotiden des Sets durch mindestens eine Nichtübereinstimmung, vorzugsweise 1 bis 6 Nichtübereinstimmungen, am meisten bevorzugt 1 bis 3 Nichtübereinstimmungen, unterscheiden. Diese kompetitiven Oligonukleotide (CO-Oligos) können mit geringerer Spezifität an die Probe binden als ein entsprechendes RC-Oligo und dabei helfen, falschpositive Signale zu verringern oder zu verhindern.

In einer besonderen Ausführungsform können die kompetitiven Oligonukleotide eine Markierung nicht binden und haben vorzugsweise eine 3'-Phosphatmodifikation, die mit einer Nukleotid-Ad- - 8 - ·· ·· ·· ·· ditionsreaktion unvereinbar ist (z.B. sequenzspezifische Endmarkierung) - somit können die kompetitiven Oligonukleotide eine Markierung nicht binden.

In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die kompetitiven Oligonukleotide mindesten eine, vorzugsweise mindestens drei, am meisten bevorzugt mindestens sechs verschiedene Sequenzen ausgewählt aus SEQ ID NOs 72 bis 82 gemäß der nachstehenden Tabelle 3.

Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Pathogen, insbesondere ausgewählt aus E. coli, Shigella spp, Salmonella spp, A. hydrophila, V. cholerae, M. avium, M. tuberculosis, H. pylori, P. mirabilis, Y. enterocolitica und C. jejuni.

Besonders bevorzugt werden die Schritte (z.B. die Schritte i) bis iv) oder a) bis g) der obigen Verfahren) einer ersten Analyse in mindestens einer zweiten Analyse mit einem Set von Oligonukleotiden ohne Oligonukleotide für Mikroorganismen, die in einer früheren Analyse verwendet wurden, wiederholt. Besonders bei Umweltproben verbessert sich dadurch der Nachweis und die Identifikation von weniger häufigen Mikroben in einer komplexen Mikrobengemeinschaft.

Vorzugsweise werden mindestens 4, 9, 10, 12, 16, 18, 20, 24 oder 26, vorzugsweise mindestens 30, 36 oder 40, am meisten bevorzugt mindestens 50, 60 oder 70, verschiedene Sonden auf dem Träger immobilisiert.

Ebenfalls bevorzugt umfassen die Oligonukleotide (eine) Sequenz (en) ausgewählt aus mindestens 1, bevorzugter mindestens 4, 9, 10, 12, 16, 18, 20, 24 oder 26, vorzugsweise mindestens 30, 36 oder 40, am meisten bevorzugt mindestens 50, 60 oder 70, verschiedenen Sequenzen SEQ ID NOs 1 bis 71, wie nachstehend in Tabelle 1 angeführt.

In einer anderen Ausführungsform umfassen die Sonden auf dem Träger (eine) Sequenz(en) ausgewählt aus mindestens 4, 9, 10, 12, 16, 18, 20, 24 oder 26, vorzugsweise mindestens 30, 36 oder 40, am meisten bevorzugt mindestens 50, 60 oder 70, verschiedenen Sequenzen SEQ ID NOs 1 bis 71, wie nachstehend in Tabelle 1 angeführt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.

Figuren:

Fig. 1: Sondenset-Validierung

Vorhergesagte (gewichtete Nichtübereinstimmungswerte, berechnet

J NACHGEREICHT • ♦ · • ··

9 mit CalcOligo 2.03) und experimentell nachgewiesene Sondenspezifität

Fig. 2: Detektionssensitivität

Mikroarray-Bilder, die die Hybridisierungsergebnisse aus einer Boden-DNA-Probe (A) und aus derselben Boden-DNA, versetzt mit 0,1% Vibrio cholerae (B), zeigen. Jeder Array enthält die gleichen Sonden dreifach. Die Bilder wurden mit 100 % Laserkraft, 750 V PMT, gescannt und sind in Regenbogenfarben dargestellt.

Die Helligkeitseinstellung betrug 78% in beiden Fällen; für Kontrast 78 bzw. 81%. Die normalisierten Signalwerte für Vch_1776 und Vch_1839 betrugen 4,6 bzw. 7,2, entsprechend etwa 3% des hierfür mit reinen Kulturen erhaltenen maximalen Signals (während der Validierung). 1: Interne Kontrolle Msi_294. 2; Vch_1776 3: Vch_1839.

Fig. 3: Anwendung von kompetitiven Oligonukleotiden

Mikroarray-Bilder, die die Hybridisierungsergebnisse von Enterobacter cloacea, markiert ohne (A) und mit (B) kompetitiven Oligonukleotiden, zeigen. Jeder Array enthält die gleichen Sonden dreifach. Die Bilder wurden mit 100 % Laserkraft, 750 V PMT, gescannt und sind in Regenbogenfarben dargestellt. 1: Interne Kontrolle Msi_294. 2: Eco_1402 und 3 - Eco_1404 falschpositive Signale, die durch Zugabe des kompetitiven Oligonukleotids CO_2 erfolgreich geräuschgedämpft werden konnten. 3: Yer_1740 falschpositive Signale, die durch Zugabe des kompetitiven Oligonukleotids CO_7 erfolgreich geräuschgedämpft werden konnten.

Fig. 4: Sequenzspezifisches Endmarkieren von Oligonukleotiden (SSELO) Prinzip

Beispiele:

Detektions- und Identifikationsverfahren für Pathogene müssen in vielen Fällen weniger häufige Mikroben innerhalb einer komplexen Mikrobengemeinschaft nachweisen. Darüber hinaus wird eine hohe Spezifität verlangt, die eine haltbare, verlässliche Identifikation liefert, zumindest was die Arten betrifft. Es wurde ein Ansatz zur Mikrobendiagnose mittels Mikroarray entwickelt, bei dem ein eindeutiges Markierverfahren, gyrB als Markergen und die Anwendung von kompetitiven Oligosonden kombiniert wurden, wodurch der sensitive und spezifische Nachweis eines weiten Bereichs von pathogenen Bakterien aus Proben, die komplexe Mikrobengemeinschaften enthielten, möglich wurde. Der Ansatz wurde

·· ·· ·· 10 erstmals mit einem Set von 35 Oligosonden getestet, die auf E. coli, Shigella spp, Salmonella spp, A. hydrophila, V. cholerae, M. avium, M.tuberculosis, H. pylori, P. mirabilis, Y. enteroco-litica and C. jejuni abzielten. Die Einbringung von kompetitiven Oligonukleotiden in die Markierungsreaktion unterdrückte erfolgreich eine Kreuzhybridisierung durch nah verwandte Sequenzen.

Die umwelttechnische Anwendbarkeit wurde mittels Umwelt- und Veterinärproben getestet. Es, wurde eine Detektionssensitivität im Bereich von 0,1% nachgewiesen.

Beispiel 1: Materialien und Verfahren Sondenkonstruktion und Mikroarray-Herstellung

Die gyrB-Sequenz-Datenbank wurde durch Herunterladen von Sequenzen von der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und durch Sequenzieren der für die Mikroarray-Validierung verwendeten Stämme erstellt. Die Ausrichtung und der Nachbar-verknüpfende phylogenetische Baum der gyrB-Sequenzen wurden unter Verwendung des ARB-Softwarepakets (Ludwig et al., 2004) konstruiert, welches anschließend auch für die Konstruktion der Sonde verwendet wurde. Der entscheidende Punkt bei der Sondenkonstruktion war die Platzierung der diagnostischen Nichtübereinstimmung (en) so nahe wie möglich am 3'-Ende. Dieses Merkmal ist von äußerster Wichtigkeit für die sequenzspezifische Endmarkierung der Oligonukleotide.

Die Sonden werden derart konstruiert, dass: • sie zu 100% mit dem Zielorganismus übereinstimmen • Nichtübereinstimmungen von nicht anvisierten, aber verwandten Sequenzen (jenen mit ein, zwei oder drei Nichtübereinstimmungen gegenüber der Sonde) vorzugsweise zum 3'-Ende der Sonde hin liegen.

Im nächsten Sequenzbeispiel ist das Oligonukleotid unterstrichen (es ist in einer 5'- -► 3' -Richtung dargestellt). Darunter sind die entsprechenden Sequenzen vom Target (Salmonella) und von einigen Non-Targets, aber verwandten Bakterien angeführt. Jeder Non-Target-Organismus weist eine Nichtübereinstimmung an der 3'-Position auf (durch Schrägstellung hervorgehoben). Manche Sonden haben Nichtübereinstimmungen weiter weg vom 3'-Ende. Eher wie jene, die in Fettdruck hervorgehoben sind - auch wenn die 3'-Nichtübereinstimmungen bereits genügen, um Spezifität zu gewährleisten. ···· ·· » · • · · # · ··· · · ····' ·#· · • · · · · · · · ·· ·· ·· · ·* · ·· - 11 - RC-Oligo: Sal_1451

Name Vollständ. Name mis N_mis wmis pos ecoli rev 'AGGCACCCCUGGCCGUC1

*Syhim gy00019:S.typhimurium 0 0 0,0 1451 1451 0 GCGÜGCCGC- —========---===-ACUGGCGAU *Etrbc Enterobacter_cloacae 2 0 1,7 1451 1451 0 GCGUGCCGC- ======G=======u-ACCGGCGAU *Klbsl Klebsiella_pneumoniae 2 0 2,2 1451 1451 0 GUGUGCCGC- *EslYyy23 Escherichia_coli 3 0 2,8 1451 1451 0 GUGUACCGC- =======G=====G== u-ACCGGCGAG *Esrchl34 Escherichia_coli 4 0 3,9 1451 1451 0 GUGUACCGC- ♦Shgll.l Shigella sonnei 4 0 3,4 1451 1451 0 GUGUACCGC- =======Gu=““=G== u-ACCGGCGAG *Erbct_5 Enterobacter_cloacae 2 0 1,7 1451 1451 0 GCGUGCCGC- ======G======== U-ACUGGCGAA ♦SnsMar Serratia_marcescens 4 0 3,9 1451 1451 0 GCGAGCCGC- ====g==G===A====G-UGGGCGAA

Weiters wurden sämtliche Sonden mit einem 3'-terminalen Cytosinrest konstruiert, der über terminales Markieren der Oligo-nukleotide (in Anwesenheit eines entsprechenden Templates) hinzugefügt wurde. Andere Faktoren, die bei der Konstruktion der Sonde berücksichtigt wurden, waren eine ähnliche Schmelztemperatur Tm (Ziel: 60°C) und eine Länge zwischen 17 und 28 Nukleotiden. Die Ergebnisse der Sonden-Übereinstimmungsfunktion wurden in CalcOligo 2.03 (Stralis-Pavese et al., 2004) importiert. Cal-cOligo wurde zur Erstellung einer Excel-Tabelle verwendet, die die vorhergesagten Schmelztemperaturen (auf Basis des Modells des nächstkommenden Nachbars und von SantaLucia-Parametern (San-taLucia, Jr. et al., 1996)), die Länge und den GC-Gehalt der Sonden und die Anzahl von gewichteten Nichtübereinstimmungen zwischen jedem Sonde-Target-Paar anzeigte. Die Tm-Werte des nächstkommenden Nachbars wurden mit Konzentrationseinstellungen von 250 nmol für das Oligonukleotid und 50 mmol für Na+ berechnet. Die Faktoren zur Gewichtung von Nichtübereinstimmungen in CalcOligo waren wie folgt. Positionen: 5' 1. 0,3; 5' 2. 0,6; 5' 3. 0,8; 3' 1. 4,0; 3' 2. 2,0; 3' 3. 1,2; alle anderen Positionen 1,0. Basenpaare dArC 1,2; dTrC 1,2; dGrü 0,7; dTrG 0,4; alle anderen nicht übereinstimmenden Basenpaare 1,0 (worin sich "d" auf die Sonde auf dem Array und "r" auf die Zielsequenz bezieht).

Von Sonde-Target-Paaren mit gewichteten Nichtübereinstimmungswerten von bis zu 0,5 wurde erwartet, dass sie eine positive Hybridisierung unter den angewendeten Bedingungen liefern. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Oligonukleo-tide ist in Tabelle 1 zu finden. Das Kontroll-Oligonukleotid (Msi 294), welches das pmoA-Gen von Methylosinus- trichosporium

I NACHGEREICHT • · • · • · ♦ # t · • ··· • · ·· • ·· · Μ - 12 - OB3b anvisiert, wurde dem Diagnose-Mikroarray für methanotrophe Bakterien (Bodrossy et al., 2003) entnommen .

Tabelle 1: Oligonukleotid-Sondenset. Die angeführten Sequenzen sind jene der RC-Oligosonden, die bei der Markierungsreaktion verwendet wurden. Alle Sequenzen sind ohne 3'-terminalem C-Rest angeführt. Die angegebenen Tm- und G+C-%-Werte wurden unter Verwendung von CalcOligo 2.03 berechnet. Die SEQ-ID-Nummern sind für PCR-Reaktions-Oligonukleotide ("RC-Oligos”) des Sets angegeben. Die Sequenzen der auf dem Träger immobilisierten Einfang-Oligonukleotide sind komplementär und revers (um eine Hybridisierung mit den RC-Oligos zu gestatten) und enthalten einen Oli-go-T-Tail-Linker zur Immobilisierung.

NACHGEREICHT « β « t · · • · · · ··· ·· • ·· · « · ·· ····· ··· ·· ·♦ · ·· · - 13 -

Name* Sequenz - Ad-Aiigos, L Im GC« Sequenz - Eintang-uiigos- beabsichtigte Spezifität| 1 Mav_1653 CGACATCTTCGAGACCACCGAGTA 24 61,9 56,0 UH2-C6-tttttGTACTCGGTGGTCTCGAAGATGICG lArcobacterium group Hb 2 Mav 1657 ÄTCTTCGAGACCACCGAGTACGA 23 61,3 54,2 UH2-C6- tttttGTCGTACTCGGTGGTCTCGAAGAT Mycobacterium flFOUD K) 2 Mav 1659 CTTCGAGACCACCGAGTACGACTT 24 61,8 56,0 9H2-C6-tttttGAAGTCGTACTCGGTGGTCTCGAAG Mycobacterium group ID Mb 2112 GAACAAGTACGCCAAGGACCG 21 61,8 59,1 »H2-C6-tttttGCGGTCCTTGGCGTACTTGTTC UycobacteriumgFOuplc i WL«» GATGAAAGCGTGATGGAAGT 20 55,0 47,6 8H2-C6-tttttGACTTCCATCACGCTTTCATC hteRcobacter pylori e TW 1647 TTTCTATGAAGACGGCTTGAÄACAATT 27 w 35,7 DH2-C6-tttttGAATTGTTTCAAGCCGTCTTCATAGAAA HeScobader pylori 7 Hw 1960 GTGAGCTTGAAAATGAGCGAGC 22 60,3 52,2 HH2-C6-tttttGGCTCGCTC4TTTTCAAGCTCAC hteRcobacter pylori i Mpy 2242 GAGAGTGAAATCTTTTTAGTGGAGGG 26 59,3 44,4 SH2-C6-tttttGCCCTCCACTAAAAAGATTTCACTCTC hteRcobacter pylori Vt 1662 AACTATATGGATAAAGAAGG 20 "sp" 33,3 HH2-C6-tttttGCCTTCTTTATCCAIATAGTT Yoteii8,SDD 1( f>rt 2152 GCGCGTAAAGCACGTGAGATGA 22 62,1 56,5 NH2-C6-tttttGTCATCTCACGTGCTTTACGCGC Proteus spp 1- Sa) 1451 AGGCACCCCTGGCCGT 16 §S,5 76,5 NH2-C6-tttttGACGGCCAGGGGTGCCT Salmonella sdd i; Salj'457 CCCTGGCCGTCACTGG 16 61,6 76,5 NH2-C6-tttttGCCAGTGACGGCCAGGG Salmonella spp 1i SÜT950 AGGTCTGATTGCGGTGGTTTC 21 61,1 10 KH2-C6-tttttGGAAACCAliCGCAATCAGACCT Salmonella sdd 1' Eco 1402 CAGCGCGAGGGTAAAATTCAC 21 m 54,5 SH2-C6-tttttGGTGÄATTTTACCCTCGCGCTG ischerichia spp and Shigella spp 1! ECO 1404 GCGCGAGGGTAAAATTCACCGT 22 10 56,5 WH2-C6-tttttGACGGTGAATTTTACCCTCGCGC Escherichia sdd and Shtaella sdd 1f feco_1472 GCGAGACTGAAAAAACCGG 16 5έ|ι 55,0 NH2-C6-tttttGCCGGTTTTTTCAGTCTCGC Escherichia spp and Shigella spp 15 Eco 1521 AACCTTCACCAATGTGACCGAGTT 24 10 46,0 NH2*C6-tttttGAACTCGGTCACAITGGTGAAGGTT Escherichia spp and Shigella spp 1f Aer 1195 TTCTGGCCGAGCCCGAC 17 w 72,2 NH2-C6-tttttGGTCGGGCTCGGCCAGAA Aeromonas spp 1i AerJ374 GAACCAGAACAAGACCCCGATC 22 60,9 56,5 NH2-C6-tttttGGATCGGGGTCTTGTTCTGGTTC Aeromonas spp 2( Aer 1585 GAGGATTACAGCAAGAAGGCCAAGT 25 61,2 50,0 NH2-C6-tttttGACTTGGCCTTCTTGCTGTAATCCTC Aeromonas sdd 2' Aer 1984 GCCAAGCAGGGTCGCAA 17 60,3 66,7 HH2-C6-tttttGTTGCGACCCTGCTTGGC Aeromonas spp Ϊ Cam 1556 TTTTGGCTAAAAGATTTCGTGAACTTG 27 59.1 35,7 KH2-C6-tttttGCAAGTTCACGAAATCTTTTAGCCAAAA Samovlobacter sdd 2; Cam_2027 CTTATGTGCGTCCTATAGTTTCAAAAG 27 58,1 39,3 NH2-C6-tttttGCTTTTGAAACTATAGGACGCACATAAG Campylobader spp 2‘ Com 2221 GCTGATTGTCAAAGTAAAGATC 22 53,4 10 HH2-C6-tttttGGATCTTTACTTTGACAATCAGC Sarovtobadersoo 21 Cje_2000 GACAAACCAAAGGAAAACTTGGTTCAA 27 59,5 39,3 NH2-C6-tttttGTT®ACCAAGTTTTCCTTTGGTTTGTC Campylobacterjejunj 2f Cie 2016 ACTTGGTTCAACTTATGTGCGTC 23 10 45.8 NH2-C6-tttttGGACGCACATAAGTTGAACCAAGT SamovtobacterWuni 2i Yer_1740 AGATGATATCGGTGTGGAAGTGG 23 60,3 50,0 NH2-C6-tttttGCCACTTCCACACCGATATCATCT Yersinia spp 21 Yen 1512 GAGCTTCGAGACGTTCACCAATAATA 26 59,2 44,4 HH2-C6-tttttGTATTATTGGTGAACGTCTGGAAGCTC Yersinia enterocolitica 2) Yen_1425 GCAGACTTACAAGATGGGTGTGC 23 61,6 54,2 KH2-C6-tttttGGCACACCCATCTTGTAAGTCTGC Yersinia enterocolilica 3( Yer 1407 rGAAGGTAAAGTTCACGAGCAGACTTA 27 60,3 iör $H2-C6-tttttpTAAGTCTGCTCGTGAACTTTACCTTCA Yersinia spp 3' Ver"1704 (ÄTCCACCCGAAAGTGTTCTATTTCT 26 59,1 44.4 ffl2-C«-tttttGAGAAATAGAACACTTTCGGGTGGATC Yersinia spp 32 «Λ 1776 GGTTGAGTCAGCCAT^AATGÄGAAG 25 6l,6 56,0 9H2-C6-tttttGCTICTCArTCATGGCIGACTCAACC Vbrio cholerae, Vibrio rrimicus, V.fluvi 3: Ych 1795 3AGAAGCTGGCGGATTTCCTAG 22 61,1 56,5 ffi2-C6-tttttGCTAGGAAATCCGCCAGCTTCTC Wbrio cholerae, V,fhiviaRs 3- Wh 1839 AAACGTTTGTTCGAAGATTATTGATG 26 57,0 30 9H2-C€-tttttGCATCAATAATCTTCGAÄCAAACGTTT Wbrio cholerae, Wbrio mimicus, V.Auvia 3! Wb 1627 AAAGAAGGCTTCTCGAAGAAAG # 57,1 43,5 982-fc6-tttttGCTTTCTTCGAGAAGCCTTCm Wbrio sdd 3( Bfrafl_1609 AAUGCCGGÜCÜGCGCAÖCU 19 61,6 60,0 ttH2-C6-tttttGAÜATGCGCAGACCGGCATT Bacteroioidesfragilis 3' äfraa2478 GGAAGAAGACAGCAAAGCUGC 21 60,0 50 8H2-C6-tttttGGC»GCTT7GC7Gkr7TärKC“· lacleroioides fraais 31 Citro 1031 CCCUDGAGAAAUOCGAGGC 19 56,7 55,0 SH2-C6-tttttGGCCTCGAAWTCTCAAGGG Citrobacter spp 3! Citro 1145 GCAAAGDGCAOCAGCAAACUOA 22 57,ö 10 ÜH2-C6-tttttGTAAG1"rTGCTGATGCACTTTGC Citrobacter spp 4( CpeiT_1222 GAUGACGGAAGAGGUAUGC 19 55,8 55,0 SH2-C6-tttttGGCATACCTCTTCCGTCATC Clostridium perfrlngens 4’ Cperf_2431 gcaaüüggagcogguaüaggac 22 w 10 SH2-C6-tttttGGTCCTATACCAGCTCCAATTGC Clostridium perfringens 4) Efaec_1711 GACGÜUAÜÜÜOCCCAGAGC 19 54,4 50,0 ffl2-C6-tttttGGCTCTGGGAAAATAACGTC Enterococcus faecalis 4! Efaec 2426 CAGCUADGGGAACAGGCÜÜCGG 22 63,6 60,9 (JH2-C6-tttttGCCGAAGCCTGTTCCCATAGCTG Enterococcus faecalls 4' KterrJ468 ACCGGCGACACOGAQGCDA 19 60,6 60,0 SH2-C6-tttttGTAGCATCAGTGTCGCCGGT Klebsiella terrigena 4! <ierr_2097 AGACGCCAAGAOCGUGGUAGG 21 62,5 59,1 ÜH2-C6-tttt tGCCTACCACGArCTTGGCGTCT Klebsiella terrigena 41 .pneumo_194 ÜCAGCAGOAGAADCCUGUGUUG 22 59,4 52,2 dH2-C6-tttttGCÄACACAGGATTCTACTGCTGG .eglonella pneumophila 4; Lpneumo_200 7UGCAGCAAAADCCADCGUAG 21 58,1 50,0 NH2-C6-tttttGCTACGATGGATTTTGCTGCAG .eglonella pneumophila 41 Mtuber_1831 GAACGCGCAGCCGAAUCCA 19 62,6 65,0 MH2-C6-tttttGTGGATTCGGCTGCGCGTTC Mycobacterium group Ic 4! Paero_l207 CCGGAGACCOTJCAGCAA 17 56,0 61,1 »H2-C6-tttttGTTGCTGAAGGTCTCCGG Pseudomonas aeruginosa 5C Paero_1397 GCCUGACCAUCCGUCGCCA 19 10 701" SH2-C6-tttttGTGGCGACGGATGGTCAGGC ’aeudomonas aeruginosa 5' PTL15Ö5 OCUGGCCAAGUCUUGAUAC 19 55,2 50,0 HH2-C6-tttttGGTATCAAGACTTGGCCAGA ’roteusspp 5; Pshlfl_1623 GCGUAACGACAAGCAGGADCA 21 59,6 54,5 ÄH2-C6-tttttGTGATCCTGCTTGTCGTTACGC Pleslomonas shlgelloldes 53 Pshia 2061 CGAGCGOCDGCAAGAGUAC 19 58,5 60,0 8H2-C6-tttttGGTACTCTTGCAGACGCTCG 4eslomonas shloelloldes 54 Rhodoc_1554 CCGCUACACACAGACCUACGA 21 60,2 59,1 8H2-C6-tttttGTCGTAGGTCTGTGTGTAGCGG Phodococcus spp 5i Rhodoc 1635 AACAAGCCGAGGUCGCUUC 19 61,2 60,0 SH2-C6-tttttGGAAGCGACCTCGGCTTGTT Rhodococcus sdd 5 Sagal_2072 GCGAAGCÜUUCAAOCGAÜÜC 20 55,8 47,6 SH2-C6-tttttGGAATCGATTGAAAGCTTCGC Streptococcus agalacüae 57 Saaal 2143 GCAOCDAAAGCCCGOAUUG 19 55,1 10 (JH2-C6-tttttGCAATACGGGCTTTAGATGC Streptococcus aoalactlae 5£ Saut_2106 UCCACAAGUCGCACGUA 17 55,4 55,6 SH2-C6-tttttGTACGTGCGACTTGTGGA Staphylococcus aureus 5! Saur 2320 CGUGACOCUAGAACGCAGä 19 56,5 10 iHi-CG-tttttGCfrnÜGTTCTAGAGTCACG stschvlococcus aureus 6C Wnbri_715 GDGGUGGCAAGAÜÜCACACC 20 59,8 57,1 8H2-C6-tttttGGGTGTGAATCTTGCCACCAC Wbrio mimicus 61 Wnimi 1684 GGCUUAACAGCAGDDGOGU 19 55,1 10 NH2-C6-tttttGACACAACTGCTGTTAAGCC Wbrio mimicus 62 Ypara 1352 XGAAGCGGACAAGCAAGAÜCA 22 123 56,5 9H2-C6-tttttGTGATCTTGCTTGTCCGCTTCGC Wbrio parahaemolytlcus 63 Vpara_1769 AAUCAGCGGUOGAAÖCGG 16 w 52,6 9H2-C6-tttttGCCGATTCAACCGCTGATT Wbrio parahaemolytlcus Lmono 1561 ACGCTTCGTACGCGTACACG 20 60 61,9 HH2-C6-tttttGCGTGTACGCGIACGAAGCGT Jsteria monocvtooenes 6! Lmono 2041 AAGCCCGTTCAATCACGGATAAG 23 59,7 50,0 SH2-C6-tttttGCTTATCCGTGATTGAACGGGCTT Jsteria monocytogenes 6C Lmono~2129 GAAGGGCGTTGTGGCTICT 19 50 60, Ö dH2-C6-tttttGAGAAGCCACAACGCCCTTC Listeria monocvtooenes 6- 06uv_1694 CAGTGGTTTCGGTGAGAGTG 2o 58,3 57,1 HH2-C6-tttttGCACTCTCACCGAAACCACTG V, fluviaSs 6 Blono 993 AAAGGCGAGCCGATCTCCGA 26 W 10 SH2-C6-tttttGTCGGAGATCGGCTCGCCTTT iiddobacterlumlonaum 6t BkmflLl483 AACAATCCGGCCGCGTG 17 62,3 66,7 DH2-C6-tttttGCACGCGGCCGGATTGTT Südobacteriumlongum 7( RC mtrof 173 XAGAAGTCCCAGTCNC 17 SH2-C6-tttttGGNGACTGGGACTTCTGG Josi#ve control 7 RC Msi 294 GCGAAGGTCGCGCCGAA 17 NH2-C6-tttttGTTCGGCGCGACCTTCGC Positive control a b

Die Zahlen am Ende der Sondennamen beziehen sich auf ihre relative Position auf dem E. coli gyrB-Gen M. avium, M. intracellulare, M. maloensei nachgereicht ·· - 14 ·* ·· • ·· c - M. tuberculosis, M. bovis, M. gastri

Oligonukleotide zur Immobilisierung wurden mit einem 5'-Ami-nolink, gefolgt von fünf Thymidinresten vor der Sondensequenz, eigens synthetisiert (VBC Genomics, Wien, Österreich). Eine flache Bodenplatte mit 384 Vertiefungen (Ritter GmbH, Schwabmünchen, Deutschland) wurde mit 30 μΐ 50 μΜ Oligonukleotidlösung in Arraylt-Spotting-Puffer (TeleChem Inc., Sunnyvale, CA, USA) hergestellt. Mikroarrays wurden mit einem OmniGrid-Spotter (1 TeleChem SMP3-Stift) bei 55 % relativer Luftfeuchtigkeit und 21°C auf Aldehyd-silylierte Südes (CEL Associates Inc., Pear-land, TX, USA) gespottet. Die Arrays wurde dreifach gespottet, um eine statistische Fehlerkorrektur zu gestatten. Die Verarbeitung der Südes erfolgte wie oben beschrieben (StraÜs-Pavese et al., 2004). Die verarbeiteten Südes wurden feuchtigkeitsfrei bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt. DNA-Templates

Die für die Mikroarray-Vaüdierung verwendeten Stämme sind in Tabelle 2 aufgelistet. Genomische DNA-Proben aus Reinkulturen wurden unter Verwendung des DNeasy-Extraktionskits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach Anweisungen des Herstellers gereinigt. Archivierte Veterinärproben, die zum Testen der Leistung des Verfahrens verwendet wurden, wurden freundlicherweise von Clyde Hutchinson (Institute of Zoology, London, UK) zur Verfügung gestellt. Diese DNA-Proben wurden unter Verwendung des DNeasy-Extraktionskits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) aus Tierarten hergestellt, von denen man wusste, dass sie mit einem oder mehr der bakteriellen Pathogene kontaminiert waren. Genomische DNA aus Bodenproben wurde unter Verwendung des UltraClean-Soil-DNA-Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) nach Anweisungen des Herstellers extrahiert.

Tabelle 2: Auflistung von zur Mikroarray-Vaüdierung verwendeten Bakterienarten. Die Stämme waren Umwelt- oder klinische Isolate aus der Kultursammlung der Universität Sassari, Fakultät für Biologie, mit Ausnahme von Pseudomonas putida, das von DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) stammte. fnachgereicht • · · · • · · · • · · » ·· ·♦ - 15 - # · • ··· « · • ·· • · • · • · · • ·· Name Bezeichnung gyrB Zugangsnummer Aeromonas hydrophila SSM 4131 DQ386876 Campylobacter jejuni SSM 4129 - Enterobacter cloacae SSM 2554 DQ386885 Escherichia coli SSM 1771 DQ386875 ETEC (E.coli enterotoxic) SSM 4135 DQ386871 EHEC slt-I (E.coli enterohaemorragic) SSM 4134 DQ386872 EHEC slt-II (E.coli enterohaemorragic) SSM 4140 DQ386873 EIEC (E.coli enteroinvasive) SSM 4137 DQ386888 EPEC (E.coli enteropathogenic) SSM 4136 DQ386874 Helicobacter pylori SSM 4138 DQ386880 Mycobacterium avium SSM 4139 DQ386879 Mycobacterium tuberculosis - - Proteus mirabilis SSM 2105 DQ386881 Pseudomonas spp SSM 2506 DQ386884 Salmonella spp SSM 1592 DQ386877 Serratia marcescens SSM 2560 DQ386886 Shigella spp SSM 2023 DQ386882 Staphylococcus aureus SSM CI-1 DQ386887 Vibrio cholerae SSM 2508 DQ386878 Yersinia enterocolitica SSM 4130 DQ386883 DNA-Amplifikation

Das gyrB-Gen wurde unter Verwendung der universellen Primer UPI (5 ' -GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3 ' ) und UP2r (3 ' -TACTGNCTRCGNCTRCANCTRCCGAGCGTGTAGGCATGGGACGA-5 ' ) amplif i-ziert. Für mehrere Stämme mussten die alternativen Primer UP1G (5 ' -GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGG-3 ' ) und UP2Ar (3 ' -TACYGNCTRCGNCTRCANCTRCCGAGCGTGTAGGCATGGGACGA- 5 ' ) verwendet werden. PCR-Reaktionen wurden in ΙΟΟ-μΙ-Aliquoten bestehend aus lx PCR-Puffer, 2 mM MgCl2, 4U Taq DNA-Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 50 μΜ für jedes der vier dNTPs, 150 nM für jeden Primer, mit 50 bis 100 ng DNA als Template durchgeführt. Für Boden-DNA und DNA-Mischungen erfolgte die Amplifikation mit allen vier Primern in einer "Multiplex"-Reaktion unter Verwendung von FailSafe PCR Premix E (Epicentre, Madison, WI, USA).

Die Amplifikationsbedingungen waren 5 min bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen von 1 min bei 95°C, 1 min bei 58°C, 2 min bei 72°C, ge- I nachgereicht • · · · · · · · ♦ · · · · ··· · · • · ♦ · - #· » • · · · · · · · · · ·· ·· · ·· · ·· - 16 - folgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt von 10 min bei 72°C (http://seasquirt.mbio.co.jp/icb/protocols/protocols.php) .

Die PCR-Produkte wurden anschließend unter Verwendung eines handelsüblichen PCR-Reinigungskits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach Anweisungen des Herstellers gereinigt und in 30 μΐ dH20 eluiert. Die DNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines NanoDrop-Spektrophotometers (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) gemessen und auf eine Endkonzentration von 50 ng/μΐ eingestellt.

Klonierung und Sequenzierung

Die gereinigten PCR-Produkte wurde unter Verwendung eines TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nach Anweisungen des Herstellers kloniert. 25 μΐ der chemisch kompetenten Zellen (die mit dem Klonierungskit geliefert wurden) wurden mit 6 μΐ des Ligationsansatzes transformiert. 100 μΐ des Transformationsansatzes wurden auf LB-Platten enthaltend 100 pg/ml Ampicillin aufgebracht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Template für die Kolonie-PCR wurde durch Resuspendie-ren einzelner Kolonien in 20 μΐ dH20 und Denaturieren der Zell Suspension 10 min lang bei 95°C in einem Thermozykler unter anschließender Abkühlung auf 4°C hergestellt. 1 μΐ dieser Suspension wurde als Template für 50 μΐ PCR-Reaktionen verwendet. M13-PCR-Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, aber unter Verwendung des M13-Forward-Primers (5' GTAAAACGACGGCCAG 3' ) und des M13-Reverse-Primers (3' GTCCTTTGTCGATACTG 5') und bei einer Annealing-Temperatur von 50°C. Die PCR-Produkte wurden anschließend unter Verwendung des PCR-Reinigungskits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach Anweisungen des Herstellers gereinigt und in 30 μΐ dH20 eluiert. Die DNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines NanoDrop-Spektrophotometers (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) gemessen. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung des BigDye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Die Sequenzierungsreaktion wurde in ΙΟ-μΙ-Ansatzaliquoten bestehend aus 4 μΐ gereinigtem PCR-Produkt, 2 μΐ Sequenzierungsmischung und 400 nM Primer (M13-Forward oder M13-Reverse). Die Sequenzierungsbedingungen waren 2 min bei 5°C, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 95°C, 25 s bei 50°C, 4 min bei 60°C ohne abschließendem Verlängerungsschritt. Die Sequenzierungsansätze wurden unter Verwendung von Sephadex-G-50-Säulen (Amersham Biosciences, Piscataway,

| NAOHGEREICHT • · • ··· • · · · • · • · · ·

• · · · · I • · · · · ··· ·· ·· ·· · ·· · ·· - 17 - NJ, USA) gereinigt und über den automatischen ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) laufen gelassen. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Sequencher v 4.5 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) analysiert und einer Nukleotid- Nukleotid-BLAST-Voranalyse innerhalb der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) unterzogen, u.zw. vor Importieren in die gyrB-Datenbank in ARB, wo die eigentliche phylogenetische Analyse stattfand. Die Zugangsnummern der gyrB-Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Stämme sind in Tabelle A angeführt. pmoA-PCR-Kontrollprodukt

Eine interne positive Kontrolle, ein pmoA-PCR-Produkt aus Methylosinus trichosporium 0B3b, wurde in jeden Markierungs- und Hybridisierungsversuch aufgenommen und anschließend zur Normalisierung der Ergebnisse verwendet. Die genomische DNA-Extraktion und PmoA-PCR-Amplifikation erfolgten wie zuvor beschrieben (Bodrossy et al., 2003). Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines PCR-Reinigungskits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) nach Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die DNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines NanoDrop-Spektrophotometers (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) gemessen und auf eine Endkonzentration von 50 ng/μΐ eingestellt. DNA-Markierung Für die sequenzspezifische Endmarkierung der Oligonukleotide wurde ein modifiziertes Protokoll von Rudi und Mitarbeitern (2003) angewendet. Nach der Reinigung wurden gyrB-PCR-Produkte mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (SAP) (Roche Diagnostics GmbH, Penzbeg, Deutschland) behandelt, um verbleibende Nukleotide zu dephosphorylieren. Proben bestehend aus 20 μΐ gereinigtem PCR-Produkt (50 ng/μΐ), 2 μΐ Thermo Sequenase Reaktionspuffer (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) und 4 μΐ SAP (1 E/ μΐ) wurden bei 37°C 30 min lang inkubiert, gefolgt von 10 min bei 95°C zur Inaktivierung der Enzymaktivität. Die SAP-behandel-ten gyrB-PCR-Produkte wurden dann für die zyklische Markierungsreaktion verwendet. Das pmoA-PCR-Kontrollprodukt wurde auf eine Endkonzentration von 5 ng/μΐ weiter verdünnt.

Zum Markieren wurde ein Set von revers komplementären Oligo-nukleotiden, denen der 3'-terminale Cytosinrest fehlte, eigens synthetisiert (VBC Genomics, Wien, Österreich) . Lyophilisierte Oligonukleotide wurden auf eine Endkonzentration von 100 pmol/μΐ

NACHGEREICHT • · · I · · · · • · · · · ··· · ·

#···· * ♦ · V ····· ··· · · ·· ·· · ·· · ·· - 18 - gelöst und bei -20°C aufbewahrt. Für die Markierungsreaktion wurde eine Oligonukleotidmischung ("RC-Mischung"), die jedes revers komplementäre Oligonukleotid in einer Endkonzentration von 1 pmol/μΐ enthielt, hergestellt. Kompetitive Oligonukleotide wurden, wenn überhaupt, in derselben Konzentration zur RC-Mischung zugegeben.

Das zyklische Markieren erfolgte in ΙΟ-μΙ-Aliquoten bestehend aus lx Thermo-Sequenase-Reaktionspuffer, 10 ng SAP-behan-deltem pmoA-PCR-Kontrollprodukt, 1 pmol von jedem revers komplementären Oligonukleotid, 10 pmol Tamra-ddCTP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA), je 10 pmol von ddATP, ddTTP, ddGTP (Roche Diagnostics GmbH, Penzbeg, Germany), 3 E Taq DNA-Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) oder 3,2 E Thermo Sequenase (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) und 100 ng SAP-behandeltem gyrB-PCR-Produkt. Die Reaktionsbedingungen waren 25 Zyklen zu 30 s bei 95°C, gefolgt von 75 s bei 60°C, ausgeführt in einem Thermozykler. Nach dem zyklischen Markieren wurden Proben direkt, ohne weitere Reinigung, für die Hybridisierung verwendet. Für die Versuche zur Untersuchung der Möglichkeit einer Verwendung von bis zu 1000 verschiedenen Sonden wurden RC-Oligos in einer Endkonzentration von 0,1 pmol/μΐ zugegeben. Die Markierungsversuche wurden ebenfalls unter Verwendung aller vier Nukleotide in Form von Tamra-markierten ddNTPs (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA) in einer Endkonzentration von 10 pmol und unter Weglassen sämtlicher geräuschdämpfender ddNTPs durchgeführt.

Enzym-Inaktivierung Sämtliche Versuche wurden unter Zugabe von Inaktivierungsmittel während des zyklischen Markierens (10 μΐ Reaktionsvolumen) und während der Hybridisierung (210 μΐ Volumen) durchgeführt. Die Reaktionsvolumen wurden durch Einstellen des zugesetzten dH20-Volumens konstant gehalten. Die Inaktivierung der Thermo Sequenase wurde mit 2 E alkalischer Shrimp-Phosphatase, 100 mg Proteinase K und 1 M Guanidinthiocyanat versucht. Weiters wurde die Reinigung des markierten Target unter Verwendung des Phenol/Chloroform-Verfahrens sowie von Microcon-YM-30-Röhrchen (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) untersucht.

Sensitivitätstests

Zur Ermittlung der Detektionssensitivität der Mikroarray-Analyse wurden Versuche mit sowohl künstlich gemischten Proben

NACHGEREICHT

• · · · · · • · · · · ··· • · · · · · · • · · · · · · ·· ·· · Μ - 19 - (die Target-Stämme in unterschiedlichen Verhältnissen enthielten) also auch mit Umweltproben, die mit 1% und 0,1% der anvisierten Stämme versetzt wurden, durchgeführt.

Mikroarray-Hybridisierung

Die Hybridisierung wurde durchgeführt wie oben beschrieben (Stralis-Pavese et al., 2004). Markierte Targets (10 μΐ) wurden mit 200 μΐ Hybridisierungspuffer (vorerhitzt auf 65°C) gemischt. Die Endkonzentration des Hybridisierungspuffers war 6xSSC, lx-Denhardt-Reagens (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,1% SDS. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 55°C. Nach der Hybridisierung wurden die Südes in einer Waschlösung mit 2xSSC und 0,1% SDS 5 Minuten lang gewaschen, gefolgt von zwei Waschzyklen in 0,2xSSC 5 Minuten lang und einer abschließenden Waschung in 0,lxSSC 5 Minuten lang, alle bei Raumtemperatur. Die Südes wurden mit einer ölfreien Druckluftpistole getrocknet und sofort gescannt.

Scanning und Datenanalyse

Die Mikroarrays wurden in drei Rastern zum Mittelwert (at three ünes to average) und mit einer Auflösung von 10 pm unter Verwendung eines Laserscanners GenePix 4000A (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) gescannt. Die PMT-Verstärkung wurde so eingestellt, dass die Spots unterhalb des Sättigungsniveaus gescannt wurden. Die gescannten Bilder wurden als Mehrschicht-TIFF-Bilder abgespeichert und mittels GenePix Pro 6.0 Software (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) analysiert. Microsoft Excel wurde für die statistische Analyse und Präsentation der Ergebnisse verwendet. Die Ergebnisse der Mikroarray-Hybridisierung wurde auf das vom internen Kontroll-Oligonukleotid (Msi_294) erhaltene Signal normalisiert und in Prozent ausgedrückt, wobei 100% dem Signal der Kontrollsonde entsprechen. Bei der Validierung wurden jene Sonden als positiv angesehen, deren normalisiertes Signal mindestens 10% (des Kontrollsignals Msi_294) betrug. Beispiel 2: Ergebnisse und Diskussion

Adaptation der Methodik

Die sequenzspezifische Endmarkierung von Oügonukleotiden (SSELO) (Rudi et al., 1998; Rudi et al., 2003; Rudi et al., 2002b), ursprünglich für Makroarrays auf Membranbasis entwickelt, stellt eine signifikante Verbesserung der Nachweisgrenze von MDMs dar, indem der Fokus der Markierung auf Regionen gelegt wird, die tatsächlich bei der Hybridisierung an den Mikroarray

NACHGEREICHT

• · · · · · • ·* · ···· • · · · · · · • · · · t · · ·· ·· I ·· - 20 - verwendet werden. Das Verfahrensprinzip ist in Fig. 4 gezeigt. Einfang-Oligonukleotide werden auf dem Mikroarray immobilisiert. Reverse Komplementäre der Einfang-Oligos (RC-Oligos) werden in einer linearen Amplifikationsreaktion nach Verfügbarkeit der entsprechenden Target-Sequenz endmarkiert. Die gesamte Mischung wird dann auf den Mikroarray hybridisiert, um die Sequenzen auszusortieren, die markiert worden sind. Auf diese Weise wird die Menge der markierten Nukleinsäuren, insbesondere jene ohne wirkliche Einfangsonde auf dem Mikroarray, drastisch verringert. Und damit der Grad an unspezifischer Hintergrund-Hybridisierung, der die Detektionssensitivität einschränkende Hauptfaktor. Das sequenzspezifische Endmarkieren von Oligonukleotiden (SSELO) wurde an Glas-Mikroarrays und zur Anwendung auf relativ komplexen Systemen adaptiert.

Unter Verwendung von Thermo Sequenase wie im ursprünglichen Protokoll wurden falschpositive Signale nachgewiesen, die offensichtlich nichts mit der für die Markierung verwendeten DNA-Pro-be zu tun hatten. Durch Substitution des Enzyms durch seinen Wildtyp-Ahnen, der Taq-Polymerase (Vander Horn et al., 1997) verschwanden alle diese falschpositiven Signale ohne Beeinträchtigung der Signalintensität. Interessanterweise versagten alle versuchten Enzym-Inaktivierungsverfahren beim Ausschalten dieser falschpositiven Signale. Schließlich wurde über eine Reihe von Ausschlussversuchen festgestellt, dass nur vier Faktoren (nämlich Thermo Sequenase, Tamra-ddCTP, RC-Oligos und Einfang-Oligos) für das Auftreten von falschpositiven Signalen wesentlich waren - nicht einmal der im Markierungsprotokoll verwendete thermische Kreisprozess oder irgendeine Template-DNA waren notwendig. Fehlte einer dieser vier Faktoren, verschwand das Hybridisierungssignal. Ohne eine umfassende Erklärung für dieses Phänomen finden zu wollen, sei gesagt, dass das Thermo-Sequenase-Protokoll auf Nylonmembranen und Amino-Mikroarray-Oberflachen entwickelt und erfolgreich verwendet wurde (Rudi et al., 2002a; Rudi et al., 2003). Beim vorliegenden Versuchsaufbau werden Al-dehyd-Mikroarray-Oberflächen verwendet, und es können die Unterschiede in den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Oberfläche, die räumliche Organisation der immobilisierten Oli-gos und anschließende sterische Faktoren für diesen beobachteten Effekt verantwortlich sein.

Es zeigte sich, dass die Spezifität des Assav in erster Li-

NACHGEREICHT 21 • · • · ♦ t • ♦ • · · · • · · • # I ·· 0 nie durch die Stringenz des Annealing-Schritts während der Markierung und nicht durch jene der anschließenden Hybridisierung bestimmt wurde. Als optimale Annealing-Temperatur unter den angewendeten Bedingungen erwiesen sich 60°C, darunter und darüber begannen zunehmend falschpositive und -negative Ergebnisse zu erscheinen. Andererseits brachte eine Erhöhung der Hybridisierungstemperatur vom Standard (55°C) auf 60°C bei der Verwendung von unter optimierten Bedingungen markierten Targets keine weitere Verbesserung der Spezifität. Insbesondere wurden auch nicht die wenigen falschpositiven Signale beeinflusst. Die einzige Auswirkung war eine globale Absenkung der Intensität sämtlicher Signale .

Einer der Mechanismen zur Verleihung von Spezifität im Markierungsschritt ist die Anwendung des markierten ddCTP in Kombination mit den anderen drei, unmarkierten ddNTPs (geräuschdämpfenden ddNTPs). Dadurch verringert sich die Chance einer unerwarteten Hybridisierung des RC-Oligos an ein PCR-Produkt, das ein markiertes Oligo liefert, um 75% (unter der Annahme einer Zufallschance, dass das nächste Nukleotid in der 3'-Richtung auf dem PCR-Produkt G ist, das als Template für die Zugabe des markierten ddCTP dient). Dieses System schränkt jedoch die Möglichkeiten des Sondendesigns ernsthaft ein. Dadurch ist es möglich, nur Sonden auszuwählen, wo das Nukleotid stromaufwärts des RC-Oligos ein Cytosin ist. Auch wenn das vorliegende Sondenset unter Berücksichtigung dieser Regel konzipiert wurde, wurde überprüft, ob eine Relaxation desselben die Spezifität beeinträchtigen würde. Eine Umweltprobe wurde unter Standardbedingungen sowie in einer modifizierten Reaktion, bei der alle vier dTNPs markiert wurden, markiert. Die Ergebnisse bei Verwendung aller vier Tamra-ddNTPs und keiner geräuschdämpfenden ddNTPs zeigten falschpositive Ergebnisse nur bei einer von 35 Sonden (nämlich Sal_1950).

Ein entscheidender Faktor bei der Bestimmung der potentiellen Leistung des Verfahrens ist die maximale Anzahl von Sonden, die parallel verwendet werden könnten. Im Standardprotokoll werden 1 μΐ einer Mischung von RC-Oligonukleotiden mit 1 pmol/μΐ Endkonzentration pro Oligo verwendet. Oligonukleotid-Stocklösun-gen haben üblicherweise eine Konzentration von 100 pmol/μΐ, wobei ein weiterer Anstieg derselben rasch zu einer instabilen Lösung und schließlich zu Ausfällung, ungl 1/-Hmäft-i π^τη Mischen nachgereicht ···· · ♦ · · • · · · · ··· · · • · · · · φ I · · • · · · t · · · · · ·· ♦ · 9 ·♦ · ♦· - 22 -etc. führt. So ist die maximale Anzahl von Sonden bei der verwendeten Menge von RC-Oligos auf einen Bereich von 100 bis 200 beschränkt (beim vorliegenden Array und damit Markierungsverfahren werden 35 Oligonukleotidsonden pro Assay verwendet). Eine Verringerung der Menge von RC-Oligos von 1 auf 0,1 pmol brachte jedoch keinen signifikanten Abfall der Signalintensität der entsprechenden Spots, was zeigt, dass das Verfahren auf bis zu 1000-2000 verschiedene Oligonukleotide aufgestockt werden könnte, mit der einzigen Einschränkung der zunehmenden Anzahl von potentiellen Wechselwirkungen zwischen den Oligos.

Sondenset-Validierung

Das Sondenset wurde mit Reinkulturen von Referenzstämmen validiert (Fig. 1). Von den 35 validierten Sonden zeigte nur eine (nämlich Prt_1882) falschnegative Hybridisierungsergebnisse. Das lässt sich am ehesten durch die niedrige Tm (48,3°C) erklären, die mit der Markierungstemperatur von 60°C unvereinbar war. Mehrere Sonden zeigten falschpositive Signale bei Non-Target-Stäm-men, die eine signifikante Sequenz-Ähnlichkeit mit den entsprechenden Sonden aufwiesen (berechnete, gewichtete Nichtübereinstimmungen zwischen 1,0 und 2,7). Es wurde jedoch ein kompetitives Oligonukleotidsystem entwickelt, mit dem dieses Problem erfolgreich gelöst wurde. Eine Übersicht über die Validierungsdaten ist in Fig. 1 gegeben.

Kompetitive Oligonukleotide

Zur Unterdrückung von falschpositiven Signalen wurde eine Reihe von kompetitiven Oligonukleötiden ("CO-Oligos") konstruiert und getestet. Kompetitive Oligonukleotide wurden als Variation eines RC-Oligos konstruiert, das falschpositive Signale bei Non-Target-Stämmen zeigte. Die Sondensequenz wurde derart verändert, dass eine neue Sonde konstruiert wurde, die perfekt zu dem falschpositive Signale aufweisenden Stamm passte. Diese CO-Oligos sollten daher eine höhere Spezifität gegenüber der zu einem falschpositiven Signal führenden Sequenz aufweisen als die entsprechenden RC-Oligos. Zur Gewährleistung des geräuschdämpfenden Merkmals wurden CO-Oligos mit einer 3'-Phosphat-Modifikation (VBC Genomics, Wien, Österreich) synthetisiert. CO-Oligos wurden in derselben Konzentration wie die RC-Oligos in die Markierungsreaktion aufgenommen. Von den sieben kompetitiven Oligonukleoti-den, die entwickelt wurden (Tabelle 3), dämpften sechs das falschpositive Signal, gegen das sie gerichtet waren. Fig. 3

NACHGEREICHT zeigt die Hybridisierungsprofile von E. cloacae, die mit und ohne CO-Oligos erhalten wurden. Eines der kompetitiven Oligos (C0_1) versagte bei der vollständigen Dämpfung des falschpositiven Signals (d.h. unterhalb der Detektionsschwelle). Dennoch wurde eine signifikante Schwächung des Signals erreicht. Es sei bemerkt, dass dies das stärkste falschpositive Signal war, das erhalten wurde. Weiters war es jenes, das aus der stärksten Ähnlichkeit zwischen dem RC-Olio und der zum falschpositiven Signal führenden Sequenz resultierte (gewichteter Nichtübereinstimmungswert 0,7) - und daher den geringsten Unterschied in den Bindungsspezifitäten für die CO- und RC-Oligos zeigte. Die Anwendung der CO-Oligos hatte keine statistisch signifikante Auswirkung auf die spezifischen (d.h. erwarteten) Signale, die mit den anvisierten Stämmen erhalten wurden. Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse, dass die Anwendung von kompetitiven Oligonu-kleotiden während des Markierungsschritts die Spezifität signifikant erhöhen können, ohne die Sensitivität zu beeinträchtigen.

Tabelle 3: Set von kompetitiven Oligonukleotiden. Die Positionen von Nichtübereinstimmungen mit der ursprünglichen Sonde (RC-Oligo, siehe Sequenz in Tabelle 1) sind mit Großbuchstaben vermerkt.

Seq ID NO Name Sequenz - RC-Oligos L Für Sonde ... Gegen — 72 CO_1 gcgcgtaaagcGcgtgagatgac CO CM Prt_2152 Serratia marcescens 7S CO 2 cagcgcgaAggCaaaattcacc ^ΣΓ Eco_1402, Eco. 1404 Enterobacter cloacae 7-! CO_3 cagcgAgaTggCaaaattcacc 22 Eco_1402, Eco_1404 Salmonella sp 7Ϊ CO_4 gaacAagaacaaAaccccgatcc 23 Aer 1374 Serratia marcescens 76 CO_5 gccaagcagggGcgcaac 18 Aer_1984 Serratia marcescens 77 CO 6 agatgatatcggCgtggaagtggc 24 Yer 1740 Enterobacter cloacae, Serratia marcescer 76 o o —I agatgGtatcggCgtggaagtggc 24 Yer_1740 Enterobacter cloacae 7£ CO 8 CAGTGGTTTCGGTGAAAGTGC 21 VHuv 1694 Vibrio cholerae 8C C0_9 gcgcgtaaagcacgtgaAatgac 23 Prt_2152 Vibrio sp, Aeromonas sp, Acinetobacter s| 8' CO 10 gcgcgtaaagcCcgtgagatgac 23 Prt 2152 Pseudomonas so 82 CO_11 gcgcgtaaagcücgtgagatgac 23 Prt_2152 Vibrio sp

Sondensetentwicklung

Bei diesem Ansatz ist es nicht die Hybridisierung auf dem Array, die in erster Linie die Sondenspezifität bestimmt, da jede gespottete Sonde ihr perfektes revers komplementäres Gegenstück trifft (entweder fluoreszierend markiert oder nicht). Das bestätigte sich auch dadurch, dass praktisch die gleichen Hybridisierungsprofile bei einer Hybridisierungstemperatur von 55°C

| NACHGEREICHT - 24 - • · • · und von 60°C erhalten wurden (wie oben detailliert ausgeführt). Der Spezifität verleihende Schritt des Assays ist die zyklische Markierung, die Verlängerung der RC-Oligos durch ein einziges fluoreszierend markiertes Didesoxynukleotid. Daher ist die am meisten kritische Region das 3'-Ende des Oligos, gefolgt von der Mitte. Das zeigt sich in den Parameters zur Berechnung von gewichteten Nichtübereinstimmungen, die sich signifikant von den Parametern unterscheiden, die für einen Ansatz verwendet werden, bei dem die Hybridisierung auf dem Array den die Spezifität bestimmenden Schritt darstellt (Stralis-Pavese et al., 2004).

Daher liegt eine wesentliche Voraussetzung bei der Konstruktion einer Sonde in der Feineinstellung des Sondensets derart, dass ihr Verhalten kompatibel mit den Bedingungen der zyklischen Markierungsreaktion ist und die Sonden eine ausreichende Unterscheidungskraft aufweisen. Es wurden drei wesentliche Richtlinien für das Sondendesign definiert: i) eine Position der diagnostischen Nichtübereinstimmung(en) so nahe am 3'-Ende wie möglich, ii) eine ähnliche Schmelztemperatur (wenn möglich 60 + 2°C) und iii) eine ähnliche Sondenlänge (17-28 nt). Sonden, die eventuell Haarnadelstrukturen oder 3'-Selbstdimere ausbilden, welche sich zum Selbstprimen eignen könnten, wurden vermieden.

Von Sonden-Target-Paaren mit gewichteten Nichtübereinstimmungswerten (wMM) von bis zu 0,5 wurde erwartet, dass sie unter den angewendeten Bedingungen eine positive Hybridisierung liefern.

Da, wie zu sehen war, die meisten der entwickelten Sonden erwartete Hybridisierungsergebnisse lieferten, waren die für das Sondendesign festgelegten, ursprünglichen Richtlinien für diese Anwendung tatsächlich angebracht. Die einzige Sonde, die falschnegative Ergebnisse lieferte, war nämlich jene, die von diesen Anforderungen am stärksten abwich (Prt_1882, TM = 48,3°C).

In-silico-Vorhersagen zur Spezifität konnten jedoch nicht immer experimentell bestätigt werden. Mehrere Sonden mit wMM-Werten zwischen 0,7 und 2,7 zeigten unerwartete ("falsche") positive Signale. Parameter zur Gewichtung von Nichtübereinstimmungen können zweifelsohne durch Berücksichtigung dieser und weiterer Ergebnisse verfeinert werden. Daraus kann sich eine höhere Erfolgsrate von in-silico-Vorhersagen zur Spezifität ergeben.

Sensitivität

Die Sensitivität von MDMs wird üblicherweise als die geringste relative Häufigkeit der nachweisbaren Target-Gruppe (in- nachgereicht - 25 - 0 0 nerhalb der analysierten Gemeinschaft) definiert. Bei Berichten liegt sie bei etwa 5% (Loy et al., 2002; Bodrossy et al., 2003; Tiquia et al., 2004; Denef et al., 2003). Bei kurzen Oligosonden-Arrays beruht diese Einschränkung darauf, dass das Target aus (mehrere Hundert Nukleotide langen) markierten Nukleinsäurefragmenten besteht, die das gesamte amplifizierte Target-Gen überspannen und das Potential für die Akkumulation von Hintergrundsignalen aufgrund einer niedrigen Rate von unspezifischer Hybridisierung erhöhen. In der Praxis entwickelt jede Sonde bei Verwendung dieser "konventionellen" Ansätze ein schwaches Hintergrundsignal von etwa 1-5% gegenüber dem maximal erzielbaren Signal (Bodrossy & Sessitsch, 2004). Durch Schwerpunkt-Markieren nur der von den jeweiligen Sonden anvisierten Region wird beim SSELO-Ansatz dieses Hintergrundsignal minimiert.

Versuche mit Umwelt-DNA aus gewöhnlicher Gartenerde, die offensichtlich frei von den durch den vorliegenden Mikroarray anvisierten Bakterien war, zeigten fast kein nachweisbares Signal an den Sonden des Arrays. Eine sorgfältige Analyse ergab, dass das stärkste Signal, das an einer der Sonden nachgewiesen wurde, immer noch geringer als 0,1% des während der Validierung erhaltenen Signals (d.h. des maximalen Signals der Sonde) war. Bei Versetzen derselben Boden-DNA mit 0,1% Vibrio cholerae führte die DNA zu deutlich nachweisbaren Signalen bei zwei der vier V.-cholerae-Sonden (Fig. 2). Ähnliche Resultate wurden mit E. coli, in Boden-DNA hineingemischt, sowie mit künstlichen Mischungen von reinen genomischen DNAs erzielt. Während der Array-Validierung mit Reinkulturen wurden einige Stellen von detektierbarer Querhybridisierung nachgewiesen, von denen die meisten durch die Anwendung von kompetitiven Oligos angesprochen wurden. Dadurch erhöht sich jedoch die Möglichkeit, dass solche schwache Querhybridisierungen mit Signalen von wenig häufigen Bakterien verwechselt werden. Solche Signale zeigten sich jedoch nur während der Validierung und beim Versetzen von Umweltproben mit einem Pathogen in einem vernünftigen Verhältnis (nämlich >1%) - d.h. bei Anwesenheit einer anvisierten Sequenz mit hoher Häufigkeit. Die schwachen falschpositiven Signale in diesen Fällen gingen auf die für dieses Pathogen mit hoher Häufigkeit spezifische(n) Sonde(n) zurück, die auf spezifische Weise markiert war(en), aber eine leicht unspezifische Hybridisierung zeigte(n). Solche potentiellen Unsicherheiten können durch

NACHGEREICHT

- 26 - wiederholtes Markieren und Hybridisieren, aber Weglassen der für das bzw. die in starker Häufigkeit nachgewiesene(n) Pathogen(e) spezifischen RC-Oligos aus der Markierungsmischung behoben werden. Daher wird für Umweltanwendungen ein Ansatz in zwei Schritten vorgeschlagen, nämlich zuerst das Analysieren der gesamten Gemeinschafts-DNA mit einem vollständigen Sondenset und anschließend das neuerliche Analysieren der Probe mit einem Sondenset, das keine Sonden für häufig auftretende Arten enthält.

Die Sensitivität der Analyse wird auch durch die inhärenten systematischen Fehler bei der PCR-Amplifikation des gyrB-Gens beeinflusst .

Proof-of-Concept

Die Anwendbarkeit des Mikroarrays wurde auch durch Analysieren zweier archivierter Veterinärproben (mit freundlicher Genehmigung von Clyde Hutchinson, Institute of Zoology, London, UK) unter Beweis gestellt. Die beiden Proben waren pathologische Stuhlproben von einem Hafendelfin und einem Grünling, die beide pathologische Symptome einer Salmonelleninfektion zeigten. Der Mikroarray ließ bei beiden Proben die Anwesenheit von Salmonella sowie ein geringeres, aber deutliches Signal für Vibrio Cholera erkennen. Leider konnte der zweite Befund nicht durch Versuche auf Basis einer Kultivierung bestätigt werden, weil die Lagerung der Proben kein langes Überleben der Bakterien zuließ. Vibrio-Signale wurden jedoch bei keiner Hybridisierung mit Referenzstämmen und Kontrollhybridisierungen mit Umgebungs-DNA gefunden, was stark dafür spricht, dass bei beiden Proben tatsächlich eine Mischinfektion mit Salmonellen und Vibrio gegeben war. Sogar diese vorläufigen Ergebnisse zeigen das Potential von Parallel-Screening für multiple Pathogene auf, indem neue, wertvolle Informationen über verschiedene Aspekte der Ökologie, Diversität, Wechselwirkungen und Epidemiologie von bakteriellen Pathogenen geliefert werden.

Zusammenfassung

Verfahren zur Detektion und Identifikation von pathogenen Bakterien müssen in den meisten Fällen sehr spezifisch und hochsensitiv sein. Die Kombination eines einzigartigen Markierungsverfahrens (SSELO, sequenzspezifische Endmarkierung von Oligo-nukleotiden), eines Housekeeping-Gens mit einer robusten phylogenetischen Auflösung auf Artenniveau (gyrB), einer Mikroarray-Technologie und des Konzepts von kompetitiven Oligos während der

NACHGEREICHT

Markierung führte zu einem hochspezifischen Verfahren mit signifikant verbesserter Sensitivität (0,1% der gesamten analysierten Mikrobengemeinschaft), das sehr komplexe Mikrobengemeinschaften ansprechen kann.

NACHGEREICHT

Quellenangabe

Bae et al. 2005. Nucleic Acids Res. 33: ell3.

Bodrossy et al. 2004. Current Opinion in Microbiology 7: 245-254. Bodrossy et al. 2003. Environmental Microbiology 5: 566-582.

Denef et al. 2003. Environmental Microbiology 5: 933-943.

DeSantis et al. 2005. FEMS Microbiol Lett 245: 271-278.

Hashsham et al. 2004. Biosens.Bioelectron. 20: 668-683.

Lee et al. 2005. J.Microbiol.Methods 61: 87-94.

Lehner et al. 2005. FEMS Microbiology Letters 246: 133-142. Leinberger et al. 2005. Journal of Clinical Microbiology 43: 4943-4953.

Loy et al. 2006. Clinica Chimica Acta 363: 106-119.

Loy et al. 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 5064-5081.

Ludwig et al. 2004. Nucleic Acids Res. 32: 1363-1371.

Maynard et al. 2005. Applied and Environmental Microbiology 71: 8548-8557.

Neufeld et al. 2006. Environmental Microbiology 8: 126-140.

Rudi et al. 2002a. Applied and Environmental Microbiology 68: 1146-1156.

Rudi et al. 1998. Applied and Environmental Microbiology 64: 2639-2643.

Rudi et al. 2002b. Bio/Techniques 33: 496, 498, 500.

Rudi et al. 2003. ScientificWorldJournal. 3: 578-584.

SantaLucia et al. 1996. Biochemistry 35: 3555-3562.

Schadt et al. 2005. Methods In Microbiology 34: 332-368.

Sergeev et al. 2004. Biosens.Bioelectron. 20: 684-698. Stralis-Pavese et al. 2004. Environmental Microbiology 6: 347-363.

Tiquia et al. 2004. Bio/Techniques 36: 664-665.

Vander et al. 1997. Bio/Techniques 22: 758-5.

Wang et al. 2005. Journal of Clinical Microbiology 43: 4121-4128. Yamamoto et al. 1995. Appl.Environ Microbiol 61: 1104-1109.

Zhou 2003. Current Opinion in Microbiology 6: 288-294.

NACHGEREICHT

Claims (23)

1. • · • · • ···

   - 29 - Patentansprüche: 1. Set von Oligonukleotiden, die spezifisch für das gyrB-Gen eines Mikroorganismus sind, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid eine Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71, oder ein Fragment einer Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71 mit 14 bis 30 Nukleotiden, mit gegebenenfalls 1 oder 2 Punktmutation(en), aufweist.
2. 2. Set nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid eine vollständige Sequenz SEQ ID NOs 1 bis 71 aufweist.
3. 3. Set nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Oligonukleotid spezifisch für das gyrB-Gen eines Mikroorganismus ist und das Set Oligonukleotide umfasst, die spezifisch für mindestens zwei Mikroorganismen verschiedener Gattungen sind.
4. 4. Set nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide Sequenzen ausgewählt aus mindestens zwei, bevorzugter mindestens 10, am meisten bevorzugt mindestens 30, verschiedenen Sequenzen SEQ ID NOs 1 bis 71 umfassen.
5. 5. Set von Oligonukleotiden bestehend aus Oligonukleotiden, die komplementär revers zu den Oligonukleotiden des Sets nach einem der Ansprüche 1 bis 4 sind, und gegebenenfalls weiteren Oligonukleotiden.
6. 6. Set nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide markiert sind.
7. 7. Fester Träger, worin die Oligonukleotide des Sets nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Oligonukleotide, die komplementär revers zu den Oligonukleotiden des Sets nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sind, auf dem festen Träger immobilisiert sind.
8. 8. Fester Träger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Oligonukleotide jeweils an verschiedenen Spots auf dem festen Träger immobilisiert. —. NACHGEREICHT - 30 - ··
9. 9. Fester Träger nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Mikroarray bildet.
10. 10. Fester Träger nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger eine Aldehyd-Oberfläche aufweist.
11. 11. Verfahren zur Identifikation eines Mikroorganismus, umfassend das i) Vorsehen von DNA des gyrB-Gens des Mikroorganismus, ii) Hybridisieren der gyrB-DNA mit dem Set nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder dem festen Träger nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die Oligonukleotide unter stringenten Bedingungen immobilisierte Sonden bilden, iii) gegebenenfalls Markieren von hybridisierten Oligonukleoti-den, iv) Sichtbarmachen von hybridisierten Oligonukleotiden.
12. 12. Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus, umfassend das a) Vorsehen des Sets von für das gyrB-Gen des Mikroorganismus spezifischen Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 6, b) Vorsehen eines Trägers mit immobilisierten Sonden, welche Sonden unter stringenten Bedingungen an die Oligonukleotide hybridisieren können, c) Vorsehen einer Probe von Mikroorganismus-DNA oder -RNA, die vorzugsweise mittels PCR, am meisten bevorzugt mittels für das gyrB-Gen spezifischer PCR, amplifiziert wird, d) Hybridisieren der Oligonukleotide mit der Probe unter stringenten Bedingungen, e) Markieren von hybridisierten Oligonukleotiden, f) Hybridisieren der Oligonukleotide gegen die Sonden auf dem Träger unter stringenten Bedingungen, g) Sichtbarmachen der an die Sonden gebundenen, markierten Oligonukleotide .
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden die revers komplementären Sequenzen der Oligonukleotide und vorzugsweise einen Linker zum Binden an den Träger umfassen. NACHGEREICHT - 31 - • · I • · · • · • ···
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger und die immobilisierten Sonden einen Mikroarray bilden.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung durch Zugabe von mindestens einem markierten ddNTP, vorzugsweise ddCTP, erfolgt.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass während einer Hybridisierung kompetitive Oli-gonukleotide anwesend sind, die sich von den Oligonukleotiden des Sets durch mindestens eine Nichtübereinstimmung, vorzugsweise 1 bis 6 Nichtübereinstimmungen, am meisten bevorzugt 1 bis 3 Nichtübereinstimmungen, unterscheiden.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die kompetitiven Oligonukleotide eine Markierung nicht binden können und vorzugsweise eine 3'-Phosphatmodifikation haben, die mit der Nukleotid-Additionsreaktion unvereinbar ist.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die kompetitiven Oligonukleotide mindesten eine, vorzugsweise mindestens drei, am meisten bevorzugt mindestens sechs, verschiedene Sequenzen ausgewählt aus SEQ ID NOs 72 bis 82 aufweisen.
19. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Pathogen ist.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Pathogen ausgewählt ist aus E. coli, Shigella spp, Salmonella spp, A. hydrophila, V. cholerae, M. avium, M. tuberculosis, H. pylori, P. mirabilis, Y. enterocolitica und C. jejuni.
21. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte i) bis iv) oder a) bis g) einer ersten Analyse in mindestens einer zweiten Analyse mit einem Set von Oligonukleotiden ohne Oligonukleotide für Mikroorganismen, die in einer früheren Analyse verwendet wurden, wiederholt wer- NACHGEREICHT - 32 - • · · • · • ··· den.
22. 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 10, vorzugsweise mindestens 30, am meisten bevorzugt mindestens 70, verschiedene Sonden auf dem Träger immobilisiert werden.
23. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden auf dem Träger (eine) Sequenz(en) ausgewählt aus mindestens einer, bevorzugter mindestens 10, am meisten bevorzugt mindestens 30, verschiedenen Sequenzen aufweisen, die komplementär revers zu SEQ ID NOs 1 bis 71 sind. NACHGEREICHT