CN1396270A - 一种检测水中常见致病菌的dna微振列 - Google Patents

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李君文
靳连群
晁福寰
郑金来
王新为
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Abstract

本发明公开了一种DNA微振列检测水中常见致病菌的技术。该技术利用16s rRNA基因检测与鉴定水中常见致病菌，两条引物分别设计在16srRNA基因的保守区，探针在16s rRNA基因的可变区。该DNA微阵列技术可检测埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属、军团杆菌、结核分枝杆菌、耶尔森氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌，可用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查。

Description

一种检测水中常见致病菌的DNA微振列
本技术属于微生物检测技术、尤其是水中致病菌的检测技术范畴。
由致病菌污染水或食品等而引起的疾病每年导致成千上万的人发病或死亡和无法估量的经济损失，因此，致病菌的快速、准确检测与鉴定是控制细菌性疾病发生的重要手段。传统的致病菌检测一般采用培养法和生化反应及血清型鉴定技术，操作复杂、检测时间长，PCR技术检测致病菌一次实验只能检测一种细菌，对分离到的未知细菌或样品中存在的多种检测十分困难。该芯片可以对水中存在的所用常见致病菌进行快速、系统的检测。为达到上述目的，本发明是通过以下方案来实现的：
1、利用细菌的16s rRNA基因设计引物，两条PCR引物分别设计在16s rRNA基因的保守区，引物序列是：上游引物：5’AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3’下游引物：5’AGG AGG TGA TCC AAC CGC A 3’，其中一条引物经过5’端荧光素标记。利用这一对引物可以扩增出细菌的约370bp长的片段(针对不同细菌，产物片段长度有所不同)，该技术利用一对引物可以扩增样品中所有的细菌的核酸，扩增产物与DNA微阵列上探针杂交后可以检测出样品中致病细菌的种类。
2、探针的序列设计在16s rRNA基因的可变区，探针分为五类：A.所有真细菌共有探针；B.区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的探针；C.科特异性探针；D.属/种特异性探针；E.阳性对照探针和阴性对照探针。探针为寡核苷酸探针，探针的3’端或者5’端经过了氨基化修饰。
3、探针固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上，形成n*n的阵列，每一阵列的第一行第一列、第一行最后一列、最后一行第一列和最后一行最后一列这四个位置上的探针为阳性对照探针。可以有多个这样的阵列分布于同一个固相载体上。
4、将探针涂布到固相载体的途径是机械手打印、喷印或者手工点样，这样制备好的探针阵列就是DNA微阵列。
5、PCR扩增产物在一定的杂交反应条件下与DNA微阵列共保温20分钟至2小时，利用荧光扫描仪即可检测到荧光信号。根据信号出现的位置可以判断出细菌的种类。
这项DNA微阵列技术可以检测的细菌有埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属的细菌以及嗜肺军团杆菌、结核分枝杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核增生李斯特氏菌、绿脓假单胞菌、空肠弯曲菌等。这项DNA微阵列技术可以用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查等。

Claims (10)

1、一种利用16s rRNA基因检测与鉴定水中常见致病菌的DNA微阵列技术，该技术利用一对引物扩增样品中的细菌，扩增产物与DNA微阵列杂交后可以检测出样品中致病细菌的种类，其特征在于PCR引物、探针的序列、探针的排布、杂交检测过程和检测细菌的范围五个方面：
2、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，两条PCR引物分别设计在16s rRNA基因的保守区，利用这一对引物可以扩增出细菌的约370bp长的片段(针对不同细菌，产物片段长度有所不同)，作为下一步DNA微阵列检测的靶序列。
3、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，引物序列是：上游引物：5′AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3′，下游引物：5′AGG AGG TGA TCC AAC CGC A3′，其中一条引物经过5’端荧光素标记。
4、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，探针的序列设计在16srRNA基因的可变区，探针分为五类：A.所有真细菌共有探针；B.区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的探针；C.科特异性探针；D.属/种特异性探针E.阳性对照探针和阴性对照探针。
5、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，探针为寡核苷酸探针，探针的3’端或者5’端经过了氨基化修饰。
6、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，探针固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上，形成n*n的阵列，每一阵列的第一行第一列、第一行最后一列、最后一行第一列和最后一行最后一列这四个位置上的探针为阳性对照探针。可以有多个这样的阵列分布于同一个固相载体上。
7、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，将探针涂布到固相载体的途径是机械手打印、喷印或者手工点样，这样制备的探针阵列就是DNA微阵列
8、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，利用上述的引物进行PCR扩增，在一定的杂交反应条件下与DNA微阵列共保温20分钟至数小时，利用荧光扫描仪即可检测到荧光信号。根据信号出现的位置及强度可以判断出细菌的种类。
9、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，这项DNA微阵列技术可以检测的细菌有埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属的细菌以及嗜肺军团杆菌、结核分枝杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核增生李斯特氏菌、绿脓假单胞菌、空肠弯曲菌等。
10、根据专利要求1所述的DNA微阵列技术，其特征在于，这项DNA微阵列技术可以用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查。
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