CN104975017A - 能扩增多种食品微生物的引物对及其应用 - Google Patents

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杜红丽
赵毅
王菊芳
张文璐
张燕宇
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Abstract

本发明公开一种能扩增多种食品微生物的引物对及其应用。提供的引物对共2对，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示；每对引物都能够在同样条件下扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌这些常见微生物的序列，序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:14所示。且同一对引物扩增出的序列物种间存在一定的差异性，能区分不同的菌种。引物对可应用于食品微生物或菌种鉴定的荧光定量PCR或其他方法的试剂盒开发，可大大降低成本及简化操作。

Description

能扩增多种食品微生物的引物对及其应用
技术领域
本发明涉及利用全基因组生物信息分析技术优势，并用PCR扩增及sanger测序验证引物对的方法开发出能用于多种食品微生物检测的引物对及其应用。
背景技术
近年来，国内各地检测出饮用水菌落总数超标、各类食品细菌超标、冷饮大肠杆菌超标等，这一系列事件显示食品微生物超标问题已成为人们日常饮食安全的一大隐患，时刻威胁着人们的健康。德国专家称大肠疫情流行菌株可人际传染。因此，如何快速准确地检测食品中微生物是否达标已成为亟须解决的问题。
我国卫生部颁布了《食品微生物学检验方法微生物学部分GB4789－2010》，食品微生物检验在标准化的发展轨道上越走越严格，更大程度地保障了人民的健康。这套标准规定检查的食品微生物检测项有菌落总数、大肠菌群计数、金黄色葡萄球菌检验等。目前我国质检部门主要检验的是菌落总数、大肠菌群及致病菌3个项目。
目前对于食品微生物检测技术通常有琼脂平板培养法、显微镜镜检法、生化鉴定法等。而生物检测技术是近年来飞速发展，且在食品微生物检测中备受关注。应用较广泛的方法有酶联免疫吸附技术、PCR技术、生物传感器技术以及生物芯片技术等，每种技术都有其优缺点，其中主要缺点检测成本较高，周期较长，需要新的方法来检测食品微生物。随着荧光定量PCR、金标和测序技术的发展，成本逐渐降低，应用荧光定量PCR、金标、测序技术的方法检测肉质食品将成为可能，这些技术具有特异、结果精确、灵敏、专一、微量和快速等优点。目前市面上检测食品微生物的荧光定量PCR技术，采用了多对引物分别扩增不同的物种，相对成本偏高和操作复杂。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种能扩增多种食品微生物的引物对。提供的引物对共2对；每对引物都能够在同样条件下扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌这些常见微生物的序列。且同一对引物扩增出的序列微生物物种间存在一定的差异性。引物对可应用到食品微生物检测和微生物鉴定上。
本发明的另一目的在于提供所述的引物对的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明首先对大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、沙门氏菌(Salmonellaenterica)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)这五个菌种的基因组做了比对，筛选出了同源性大于75％且小于100％、长度大于300bp的区域。为了设计引物，从这些区域中过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数大于2个的序区域。然后从这些同源区域中设计引物，要求一对引物能扩增出各个菌种，且各个菌种的序列有一定差异。用设计的2对引物PCR扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌五个菌种的基因组序列，琼脂糖凝胶电泳确定成功扩增出序列，然后sanger测序，得到DNA片段序列。分析各菌种扩增出的序列与原菌种基因组序列一致性，然后分析各菌种序列间同源性与差异性。确定扩增出的序列可以用来区分食品微生物的种类。
所述的引物对共2对，序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。
所述的DNA片段，序列如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：14所示。
本发明的引物对可应用并加速荧光定量PCR或高通量测序等食品检测试剂盒或方法的开发。本发明的创新在于目前还没查询到一对引物可以扩增以上五个菌种，并且保证物种之间的序列有差异。
所述的引物对在辅助进行食品微生物或菌种鉴定中的应用。
所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为辅助食品微生物或菌种鉴定。
所述的DNA片段在辅助进行食品微生物或菌种鉴定中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明采用生物信息技术优势开发出能扩增多种食品微生物的引物对，即1对引物可以扩增出5个菌种的目的片段，并且每个物种目的DNA片段有差异，能区分不同的菌种。简化的引物对可应用于食品微生物或菌种鉴定的荧光定量PCR或其他方法的试剂盒开发，可大大降低成本及简化操作。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、目标微生物DNA样本
大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
2、微生物基因组来源
5个微生物的基因组数据在Genebank上下载的该物种最新版本的基因组，基因组数据来源如表1。
表1 基因组数据来源
物种 基因组网址
大肠杆菌O157 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/167？genome_assembly_id＝161522
沙门氏菌 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/152
李斯特菌 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/159
金黄色葡萄球菌 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/154
阪崎肠杆菌 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/1170
3、微生物DNA样本来源：广东出入境检验检疫局。
4、目标序列筛选
本发明采用lastz作为比对软件来比对和分析基因组。
比对策略：以大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)的基因组作为参考基因组，分别和沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌的基因组作比对。
在linux上运行比对程序，比对参数设置如表2，以大肠杆菌O157和沙门氏菌的基因组比对为例。
表2 lastz比对参数
基因组比对总共得到4个比对结果文件，分别为大肠杆菌O157与沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌的比对结果。由于4个菌种都是以大肠杆菌O157的基因组做为参考序列来进行的比对，所以可以得到每个菌种和大肠杆菌O157基因组的同源区域。根据这4个物种和大肠杆菌O157同源区域的重叠，进而筛选出沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌和大肠杆菌O157这五个菌种同源的区域以及基因组序列。部分结果如表3所示。表3为一组同源区域的详细信息，列出了五个菌种同源区域的染色体位置和同源序列长度和同源碱基序列。
表3 菌种同源序列信息
物种 同源位置 序列长(bp) 正负链 染色体长度 序列
大肠杆菌O157 227579 343 + 5498450 TTGACGTT***
沙门氏菌 289656 343 + 589473 TTGACGTT***
李斯特菌 237954 343 + 2944528 TTGACGTT***
金黄色葡萄球菌 449304 343 + 2821361 TTGACGTT***
阪崎肠杆菌 25382 343 + 4368373 TTGACGTT***
总共筛选出五个物种共有的同源性大于75％且同源区域长度大于200bp的序列19组。设计引物需要连续相同的序列超过18bp，因此，进一步过滤掉了这19组序列中至少包含两个连续相同区域长度小于23的序列，得到了可以用来设计引物的13组同源序列。
为了保证序列可以区分出物种的差异，选取物种间差异度较大的序列来设计PCR引物。
5、引物设计
目标片段筛选完成后，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。选取能够完全涵盖目标片段的引物，引物长度为18bp，退火温度55℃。共设计2对引物：3431号和3432，引物序列如表4，序列表中序列编号为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4。所有引物设计完成后委托北京华大基因公司合成。
表4 引物序列信息
6、目标片段PCR扩增
用设计的两对引物扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌的基因序列。
基因组DNA提取参照生工生物工程有限公司生产制造的微生物基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作。引物由上海生物工程有限公司合成。合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
以每个菌种样本的基因组DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应体系(20μL)如表5。
表5 PCR反应体系
名称 浓度 体积
基因组DNA 10ng/μL 5μL
上游引物 10μM 0.8μL
下游引物 10μM 0.8μL
PCR kit(2×) 10μL
ddH2O 3.4μL
混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
上述PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
称取0.5g琼脂糖加到50mL TAE反应液中加热溶解，待温度降至60℃时，加入溴化乙锭类似物3μL混匀，倒入插有2mm梳子的电泳槽内，等待凝固后使用。每孔加5μL PCR产物，采用121V恒压，电泳15min后在紫外线透射仪下观察结果，目标条带全部单一明亮。
所有扩增成功的PCR产物以4℃保存，直接进行DNA测序，全部测序工作由北京华大基因公司测序部完成。
7、测序序列分析
7.1测序序列拼接
由于Sanger测序的序列起始端测序质量较低，准确性相对较差，采用正向引物和反向引物分别进行测序，根据测序峰图，序列相互补充，拼接成完整的测序序列。详细序列信息见序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:14所示。
7.2PCR序列鉴定
把测序得到的序列与原基因组上序列比对，通过与原始序列的Identity(同源性)来确定用该引物PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果见表6、7。
表6和表7分别是两对引物PCR产物测序结果与原始基因组序列的比对结果，表中序列全部很好的比对回对应的基因组序列。表明设计的引物确实可以准确的在目标区域扩增出这五类菌种的基因组序列。
表6 3431号引物PCR序列与原始序列同源性(％)
物种 大肠杆菌O157 沙门氏菌 李斯特菌 金黄色葡萄球菌 阪崎肠杆菌
同源性(％) 100 100 100 100 100
表7 3432号引物PCR序列与原始序列同源性(％)
物种 大肠杆菌O157 沙门氏菌 李斯特菌 金黄色葡萄球菌 阪崎肠杆菌
同源性(％) 100 100 100 100 100
7.3PCR序列的物种间差异比较
下面，分析比较了两对引物扩增的5个物种的序列间的差异性，结果如表8、表9所示。
表中上三角内数值表示对应两个物种间碱基同源性，用百分比来表示。下三角内数值表示差异碱基的差异度，也用百分比表示。
当同源性不高于95％时，从同源性可以鉴别扩增序列所属物种。当同源性较高时，通过具体比较碱基序列的同源性与差异度，可鉴别扩增序列所属物种。
表8 3431号引物PCR序列Sanger测序同源性与差异度(％)
表9 3432号引物PCR序列Sanger测序同源性与差异度(％)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.能扩增多种食品微生物的引物对，其特征在于包括引物对3431F/R和引物对3432F/R中的至少一对；
引物3431F：AGCAGCCGCGGTAATACG；
引物3431R：ATCGTTTACGGCGTGGAC；
引物3432F：CCAGCAGCCGCGGTAATA；
引物3432R：CGTTTACGGCGTGGACTA；
所述的多种食品微生物，是指大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
2.利用权利要求1所述的引物对扩增得到的DNA序列，其特征在于：
利用权利要求1所述的引物对3431F/R扩增得到的DNA序列如SEQ IDNO:5～SEQ ID NO:9所示。
3.利用权利要求1所述的引物对扩增得到的DNA序列，其特征在于：
利用权利要求1所述的引物对3432F/R扩增得到的DNA序列如SEQ IDNO:10～SEQ ID NO:14所示。
4.权利要求1所述的引物对在辅助进行食品微生物鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的引物对在辅助进行菌种鉴定中的应用。
6.权利要求1所述的引物对在制备试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒的用途为辅助食品微生物或菌种鉴定。
7.权利要求1所述的引物对在检测方法中的应用，其特征在于：所述的检测方法的用途为辅助食品微生物或菌种鉴定。
8.权利要求2或3所述的DNA序列在辅助进行食品微生物鉴定中的应用。
9.权利要求2或3所述的DNA序列在辅助进行菌种鉴定中的应用。
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