CN1311085C - 分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用 - Google Patents

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CN1311085C CNB2004100838250A CN200410083825A CN1311085C CN 1311085 C CN1311085 C CN 1311085C CN B2004100838250 A CNB2004100838250 A CN B2004100838250A CN 200410083825 A CN200410083825 A CN 200410083825A CN 1311085 C CN1311085 C CN 1311085C
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梁建琴
张俊仙
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Abstract

本发明涉及一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒及其制备方法，可以根据不同种分枝杆菌16S rRNA基因序列，设计、合成相应的寡核苷酸探针，通过点样法将寡核苷酸探针按一定的顺序点在经预处理的硝酸纤维膜上，制成检测鉴定膜片，与带生物素标记的PCR扩增产物杂交。利用本发明的鉴定试剂盒，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱用肉眼判读结果，可同时快速、准确地检测分枝杆菌，鉴别分枝杆菌与非分枝杆菌及结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，鉴定分枝杆菌菌种，24小时内即可报告结果，从而辅助临床诊断、指导临床开展早期有效的化疗。

Description

分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用
技术领域
本发明涉及分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用，它属于医学分子生物学诊断技术领域，具体是关于分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其在结核病诊断中的应用。
背景技术
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。
目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万。1993年世界卫生组织(WHO)史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申遏制结核病的行动刻不容缓。
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位；分离出的分枝杆菌中，结核分枝杆菌占86.4％，牛分枝杆菌占2.5％，非结核分枝杆菌占11.1％，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。
究其原因是非结核分枝杆菌病人对大多数一线抗结核药物具有天然抗药性，采用目前标准的化疗方案治疗无效。目前，非结核分枝杆菌病通常依据传统的分枝杆菌菌种鉴定来确诊，然而，传统的分枝杆菌菌种鉴定烦琐、费时，需1～2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌病人通常被作为结核病按常规治疗，病人经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治病人，细菌在局部播散。因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定对结核病和非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
传统的分枝杆菌菌种鉴定方法需在改良罗氏培养基、对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鉴别培养基上初步鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌后，再观察细菌培养生长情况(包括菌落形态、生长速度、生长温度和色素产生)，做一系列生化试验(包括耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、吐温-80水解试验、尿素酶试验、芳香硫酸酯酶试验、烟酸试验、铁离子吸收试验和亚碲酸还原试验)进行系统的鉴定，操作烦琐、费时，需4～8周时间，影响因素多，重复性差，现临床实验室不常规开展。
BACTAC TB460 1977年问世，其特点是简便、快速，可初步鉴别结核分枝杆菌复合物和非结核分枝杆菌，在国内外已成为结核病诊断的标准参照系统之一。1977年问世、90年代初引进我国的BACTAC TB460分枝杆菌快速培养仪，利用放射性14C棕榈酸为基底物的7H 12B液体培养基培养结核分枝杆菌时，由于标本中含菌量不同，分枝杆菌生长产生的放射性CO2量也不同，达到仪器的检测值所需时间也不同，一般需4-25天。此外，由于P-硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮(P-Nitro-α-Acetylamino-β-hydroxypropi-phenone，简称NAP)对结核分枝杆菌复合群生长有抑制作用，而对非结核分枝杆菌生长无抑制作用，在BACTACTB460内加入NAP继续培养2-6天后，根据生长指数可初步鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。但BACTAC TB460只能进行初步的菌种鉴别，而且与传统鉴定法相比，其特异性只有95％左右，区分出来的非结核分枝杆菌尚需进一步的菌种鉴定，此外，BACTAC TB460仪器价格昂贵，需专门进口厂家(美国BectonDickinson公司)的专利液体培养基，费用较高，有放射性，而难以在普通实验室广泛开展。
PCR菌种鉴定法是用各种分枝杆菌特异性引物对标本DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩增产物所产生的特异性片段进行鉴定，或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌种特异的内部引物进行巢氏扩增鉴定，该法灵敏、快速，但目前PCR所能够鉴定的分枝杆菌菌种尚不多，主要有结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，而且鉴定未知的感染菌，需采用一系列种特异性引物进行扩增；PCR-直接测序鉴定法是用分枝杆菌属特异的引物对标本的16S rRNA或16S-23S rRNA间隔区序列或65kD或32kD抗原基因进行PCR扩增，然后直接测定扩增产物的核苷酸序列，比较其核苷酸的差异来鉴定菌种，该法虽灵敏、快速，已成为分枝杆菌分子菌种鉴定的“金标准”，但技术要求高，需专门的技术人员，所需的测序仪器昂贵，成本高，而难以推广；PCR-限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，简称RFLP)菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对标本中分枝杆菌65KD蛋白编码基因、16S rDNA或16S-23S rDNA进行扩增，然后用不同的限制性内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种，目前只能鉴定部分菌种，重复性还不够理想；PCR-基因芯片鉴定法是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法，目前国内外某些实验室利用分枝杆菌16S rRNA或rpoB基因序列某些位置上的分枝杆菌属或种特异的核苷酸变化，研究应用基因芯片技术进行杂交测序，鉴定分枝杆菌菌种，但该技术要求高，所需的点样系统和荧光分析系统昂贵，而难以推广应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种快速、敏感、高效、价廉的分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒；
本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案达到的：
一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒，含有分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和分枝杆菌PCR扩增试剂，其特征在于：所述分枝杆菌分子菌种鉴定膜片是在硝酸纤维膜上固定有一系列针对分枝杆菌属和各种分枝杆菌16S核糖体核糖核酸(简称rRNA)而设计的寡聚核苷酸探针，所述的寡聚核苷酸探针在3’末端加有50-110个脱氧核糖核酸(简称dT)；所述的分枝杆菌PCR扩增试剂包括针对分枝杆菌属16S rRNA进行扩增所需的5-10倍PCR缓冲液(包括50mM KCl、pH8.3的10mMTris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明胶)，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述分枝杆菌PCR扩增试剂各组分的终浓度如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物的终浓度各为0.2-1.0umol/L，Taq DNA聚合酶2-5U/100μl。
一种优选技术方案，其特征在于：所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为16-18个碱基。
一种优选技术方案，其特征在于：所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
  探针名称   探针序列
  M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’
  a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’
  b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’
  c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’
  d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’
  h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’
i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’
j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’
  k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’
  l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’
  m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’
  n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’
  o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’
  p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’
  q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’
  r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’
  s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’
  t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’
  u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’
  w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’
  y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’
  z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’
  aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’
  ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’
一种优选技术方案，其特征在于：所述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G-3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.分枝杆菌分子菌种鉴定膜片的制备方法如下：
(1)根据现有技术合成上述寡核苷酸探针；
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为1.5-6pmol/μl；
(3)将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10-30min，晾干或42℃以下烘干；
(4)取0.6-1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，60-80℃烘烤1-2小时或紫外灯下照射10-20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；
2.分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成上述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5-12.5μmol/L；
(2)取5-10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
3.分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的装配：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片密封后和分枝杆菌PCR扩增试剂装入一容器。
一种优选技术方案，其特征在于：所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为16-18个碱基。
一种优选技术方案，其特征在于：所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
  探针名称   探针序列
  M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’
  a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’
  b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’
  c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’
  d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’
  h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’
i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’
j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’
  k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’
  l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’
  m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’
  n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’
  o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’
  p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’
  q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’
  r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’
  s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’
  t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’
  u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’
  w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’
  y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’
  z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’
  aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’
  ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’
一种优选技术方案，其特征在于：所述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G-3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
本发明的分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒及其制备方法，可以根据不同种分枝杆菌16S rRNA基因序列，设计、合成相应的寡核苷酸探针，通过点样法将寡核苷酸探针按一定的顺序点在经预处理的硝酸纤维膜上，制成检测鉴定膜片，与带生物素标记的PCR扩增产物杂交，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱用肉眼判读结果，可同时快速、准确地检测分枝杆菌，鉴别分枝杆菌与非分枝杆菌及结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，鉴定分枝杆菌菌种，24小时内即可报告结果，从而辅助临床诊断、指导临床开展早期有效的化疗。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1为应用本发明膜片鉴定结核分枝杆菌标准株H37Rv的结果；
图2为应用本发明膜片鉴定鸟分枝杆菌标准株的结果；
图3为直接测序法用生物分析软件BLAST显示的分枝杆菌临床分离株No.12027的结果；
图4为用本发明膜片鉴定分枝杆菌临床分离株No.12027的结果；
具体实施方式
实施例1
一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.分枝杆菌分子菌种鉴定膜片的制备方法如下：
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针：
  探针名称   探针序列   所鉴定的分枝杆菌菌种
  M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’   分枝杆菌属
  a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’   结核分枝杆菌
  b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’   鸟分枝杆菌
  c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’   胞内分枝杆菌
  d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’   堪萨斯、瘰疬、胃、猿分枝杆菌
  h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’   不产色分枝杆菌
  i   5’-CAGAACATGCATCCCA-3’   土分枝杆菌
  j   5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’   蟾分枝杆菌
  k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’   戈登分枝杆菌
  l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’   苏尔加分枝杆菌
  m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’   海分枝杆菌
  n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’   微黄分枝杆菌
  o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’   龟分枝杆菌龟亚种
  p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’   龟分枝杆菌脓肿亚种
  q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’   耻垢分枝杆菌
  r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’   偶然分枝杆菌
  s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’   草分枝杆菌
  t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’   浅黄分枝杆菌
  u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’   金色分枝杆菌
  w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’   次要分枝杆菌
  y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’   母牛分枝杆菌
  z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’   迪氏分枝杆菌
  aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’   抗热分枝杆菌
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’   楚布分枝杆菌
  ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’   爱知分枝杆菌
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有100个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为6pmol/μl；
(3)20×SSC溶液的配制：氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置37℃温箱烘干；
(4)取0.8μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，在紫外灯下照射10分钟，用水简单漂洗，晾干备用；
2.分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G-3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓中液稀释，使其浓度为3.75μmol/L；
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为3.75μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
3.分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的装配及保存：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片密封后和分枝杆菌PCR扩增试剂装入一容器。分枝杆菌分子菌种鉴定膜片室温干燥保存；分枝杆菌PCR扩增试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的应用：
(1)样品处理及DNA提取：将来自于中国药品生物制品检定所的结核分枝杆菌标准株H37Rv灭活后，提取DNA；
(2)PCR扩增：
①反应体系总体积25μl。
②在0.5ml塑料离心管中加入下列试剂：
  试剂   加样顺序   体积(μ1)
  水10×PCR缓冲液3.75μmol/L 5’端带生物素标记的上游引物3.75μmol/L不带标记的下游引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTPDNA样品   123456   12.52.52.02.02.02.0
  总计   23.0
若检测标本较多，可配制主悬液分装。不同DNA样品用量可能不同，通过调整反应体系中水的体积使总体积一样。
③混匀后，于95℃变性8min。
④稍冷却后，加Taq DNA聚合酶2μl(含2U)，混匀，加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
取5μl PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果可见一条280bp的片段。
(3)预杂交液配制：6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液            10ml
20×SSC溶液                 30ml
10％SDS溶液                 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA          1ml
加水定容至                  100ml
(4)预杂交：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和2ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(5)杂交：将带生物素标记的PCR扩增产物20μl置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(6)洗膜：用洗液I 2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；
(7)加酶：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；
(8)洗膜：用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；
(9)显色：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图1。
(10)结果判定：如图1所示，根据分枝杆菌探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和a探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为结核分枝杆菌。
实施例2
一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.分枝杆菌分子菌种鉴定膜片的制备方法如下：
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针：
  探针名称   探针序列   所鉴定的分枝杆菌菌种
  M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’在3’加102个dT   分枝杆菌属
  a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’在3’加102个dT   结核分枝杆菌
  b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’在3’加102个dT   鸟分枝杆菌
  c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’在3’加102个dT   胞内分枝杆菌
  d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’在3’加102个dT   堪萨斯、瘰疬、胃、猿分枝杆菌
  h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’在3’加104个dT   不产色分枝杆菌
i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’在3’加104个dT   土分枝杆菌
j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’在3’加102个dT   蟾分枝杆菌
  k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’在3’加102个dT   戈登分枝杆菌
  l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’在3’加102个dT   苏尔加分枝杆菌
  m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’在3’加104个dT   海分枝杆菌
  n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’在3’加102个dT   微黄分枝杆菌
  o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’在3’加104个dT   龟分枝杆菌龟亚种
  p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’在3’加102个dT   龟分枝杆菌脓肿亚种分枝杆菌
  q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’在3’加102个dT   耻垢分枝杆菌
  r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’在3’加102个dT   偶然分枝杆菌
  s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’在3’加102个dT   草分枝杆菌
  t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’在3’加103个dT   浅黄分枝杆菌
  u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’在3’加104个dT   金色分枝杆菌
  w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’在3’加104个dT   次要分枝杆菌
  y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’在3’加104个dT   母牛分枝杆菌
  z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’在3’加104个dT   迪氏分枝杆菌
  aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’在3’加104个dT   抗热分枝杆菌
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’在3’加104个dT   楚布分枝杆菌
  ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’在3’加104个dT   爱知分枝杆菌
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为4pmol/μl；
(3)20×SSC溶液的配制：氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置室温晾干；
(4)取0.6μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，置烤箱中于60℃烘烤1小时，用水简单漂洗，晾干备用；
2.分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度为12.5μmol/L；
(2)取5倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及5U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
3.分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的装配及保存：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和分枝杆菌PCR扩增试剂装入一纸盒。分枝杆菌分子菌种鉴定膜片室温干燥保存；分枝杆菌PCR扩增试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的应用：
(1)样品处理及DNA提取：将来自于中国药品生物制品检定所的鸟分枝杆菌标准株灭活后，提取DNA；
(2)PCR扩增：
①反应体系总体积50μl。
②在0.5ml塑料离心管中加入下列试剂：
  试剂   加样顺序   体积(μl)
  水5×PCR缓冲液12.5μmol/L 5’端带生物素标记的上游引物12.5μmol/L不带标记的下游引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTPDNA样品   123456   22.010.04.04.04.05.0
  总计   49.0
若检测标本较多，可配制主悬液分装。不同DNA样品用量可能不同，通过调整反应体系中水的体积使总体积一样。
③混匀后，于95℃变性8min。
④稍冷却后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混匀，加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心10秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
取8μl PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果可见一条278bp的片段。
(3)预杂交液配制：6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5％十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液             10ml
20×SSC溶液                  30ml
10％SDS溶液                  5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA           1ml
加水定容至                   100ml
(4)预杂交：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和3ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(5)杂交：将带生物素标记的PCR扩增产物30μl置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(6)洗膜：用洗液I 2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；
(7)加酶：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；
(8)洗膜：用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；
(9)显色：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图2。
(10)结果判定：如图2所示，根据分枝杆菌探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和b探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为鸟分枝杆菌。
对比例
采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于中国人民解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.12027。
1.样品处理及DNA提取：将来自于中国人民解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.12027灭活后，提取DNA；
2.分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成下述上游引物和下游引物：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-CGA GTG GCG AAC GGG TGAG--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓中液稀释，使其浓度为3.75μmol/L；
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为3.75μmol/L的上游引物和下游引物以及5U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
3.分枝杆菌PCR扩增试剂的保存：将分枝杆菌PCR扩增试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
4.PCR扩增：
①反应体系总体积100μl。
②在0.5ml塑料离心管中加入下列试剂：
  试剂   加样顺序   体积(μl)
  水10×PCR缓冲液3.75μmol/L 5’端带生物素标记的上游引物3.75μmol/L不带标记的下游引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTPDNA样品   123456   57.010.08.08.08.08.0
总计 99.0
③混匀后，于95℃变性8min。
④稍冷却后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混匀，加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
取5μl PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果可见一条278bp的片段。
5.直接测序鉴定法：将剩余的95μl PCR扩增产物和20μl下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.结果判定：测序结果如图3所示，用生物分析软件BLAST分析显示与戈登分枝杆菌序列完全相同，说明该分离株为戈登分枝杆菌。
实施例3
采用本发明膜片鉴定来自于中国人民解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.12027。
一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.分枝杆菌分子菌种鉴定膜片的制备方法如下：
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针：
  探针名称   探针序列   所鉴定的分枝杆菌菌种
  M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’   分枝杆菌属
  a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’   结核分枝杆菌
  b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’   鸟分枝杆菌
  c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’   胞内分枝杆菌
  d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’   堪萨斯、瘰疬、胃、猿分枝杆菌
  h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’   不产色分枝杆菌
i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’ 土分枝杆菌
j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’ 蟾分枝杆菌
  k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’   戈登分枝杆菌
  l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’   苏尔加分枝杆菌
  m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’   海分枝杆菌
  n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’   微黄分枝杆菌
o 5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’ 龟分枝杆菌龟亚种
  p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’   龟分枝杆菌脓肿亚种分枝杆菌
  q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’   耻垢分枝杆菌
  r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’   偶然分枝杆菌
  s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’   草分枝杆菌
  t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’   浅黄分枝杆菌
  u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’   金色分枝杆菌
  w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’   次要分枝杆菌
  y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’   母牛分枝杆菌
  z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’   迪氏分枝杆菌
  aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’   抗热分枝杆菌
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’   楚布分枝杆菌
  ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’   爱知分枝杆菌
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有90个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为1.5pmol/μl；
(3)20×SSC溶液的配制：氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置37℃温箱烘干；
(4)取1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，在紫外灯下照射20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；
2.分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物：
  靶基因   引物序列(5’→3’)
16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度为2.5μmol/L；
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
3.分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的装配及保存：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和分枝杆菌PCR扩增试剂装入一纸盒。分枝杆菌分子菌种鉴定膜片室温干燥保存；分枝杆菌PCR扩增试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的应用：
(1)样品处理及DNA提取：将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.12027灭活后，提取DNA；
(2)PCR扩增：
①反应体系总体积100μl。
②在0.5ml塑料离心管中加入下列试剂：
  试剂   加样顺序   体积(μl)
  水10×PCR缓冲液3.75μmol/L 5’端带生物素标记的上游引物3.75μmol/L不带标记的下游引物2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTPDNA样品   123456   57.010.08.08.08.08.0
  总计   99.0
③混匀后，于95℃变性8min。
④稍冷却后，加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混匀，加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次，最后72℃延伸5分钟。
⑥取5μl PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果可见一条278bp的片段。
(3)预杂交液配制：6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液              10ml
20×SSC溶液                   30ml
10％SDS溶液                   5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA            1ml
加水定容至                    100ml
(4)预杂交：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(5)杂交：将带生物素标记的PCR扩增产物40μl置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；
(6)洗膜：用洗液I 2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；
(7)加酶：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；
(8)洗膜：用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100MTris-HCl-150mM NaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；
(9)显色：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图4。
(10)结果判定：如图4所示，根据分枝杆菌探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和k探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为戈登分枝杆菌。

Claims (3)

1、一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒，含有分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和分枝杆菌PCR扩增试剂，其特征在于：所述分枝杆菌分子菌种鉴定膜片是在硝酸纤维膜上固定一系列针对分枝杆菌属和各种分枝杆菌16S核糖体核糖核酸而设计的寡聚核苷酸探针，所述的寡聚核苷酸探针在3’末端加有50-110个脱氧核糖核酸；所述的分枝杆菌PCR扩增试剂包括针对分枝杆菌属16S rRNA进行扩增所需的5-10倍PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述的寡聚核苷酸探针序列如下表所示：   探针名称   探针序列   M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’   a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’   b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’   c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’   d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’   h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’ i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’ j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’   k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’   l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’   m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’   n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’   o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’   p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’   q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’   r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’   s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’   t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’   u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’   w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’   y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’   z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’   aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’
  ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’   ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’
所述的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下表所示。   靶基因   引物序列(5’→3’) 16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGAG G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
2、根据权利要求1所述的鉴定试剂盒，其特征在于：所述的PCR缓冲液含有50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明胶。
3、一种如权利要求1-2中任一项所述的分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[1].分枝杆菌分子菌种鉴定膜片的制备方法如下：
(1)根据现有技术合成所述寡核苷酸探针；
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为1.5-6pmol/μl；
(3)将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10-30min，晾干或42℃以下烘干；
(4)取0.6-1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，60-80℃烘烤1-2小时或紫外灯下照射10-20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；
[2].分枝杆菌PCR扩增试剂的配制方法如下：
(1)根据现有技术合成所述5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5-12.5μmol/L；
(2)取5-10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；
[3].分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的装配：将分枝杆菌分子菌种鉴定膜片密封后和分枝杆菌PCR扩增试剂装入一容器；
所述的寡聚核苷酸探针序列如下表所示：
  探针名称   探针序列   M   5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’   a   5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’   b   5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’   c   5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’   d   5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’   h   5’-CACACCATGCAGCATG-3’ i   5’-CAGAACATGCATCCCA-3’ j   5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’   k   5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’   l   5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’   m   5’-AGGACATGAATCCCGT-3’   n   5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’   o   5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’   p   5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’   q   5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’   r   5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’   s   5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’   t   5’-CACACACCATGAAGCAT-3’   u   5’-GACATGCATCGCGTAG-3’   w   5’-CACCATGCGACATGTG-3’   y   5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’   z   5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’   aa   5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’   ab   5’-CACATGCATGCCGTGG-3’   ac   5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’
所述的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下表所示。   靶基因   引物序列(5’→3’) 16SrRNA   上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGGTGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CACTGC TG--3′
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