CN100374577C - 用于检测b族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测b族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测细菌的方法，尤其涉及一种为检测B族链球菌特有序列而设计的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法。本发明的目的在于提供一种有效、快速检测B族链球菌的方法，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找B族链球菌可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。本发明用于检测B族链球菌的基因诊断试剂盒具有使用简便、快捷、灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景。

Description

用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测细菌的装置和方法，尤其涉及一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒及方法。
背景技术
B族链球菌(GBS)学名为无乳链球菌(S.agalactiae)，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害畜牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血病、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。鉴于该细菌引起的感染不只限于乳房炎，其细菌壁中多糖物质又属于抗原构造分类中的B族，故目前一般采用B族链球菌来代替学名无乳链球菌。
B族链球菌通常寄居于阴道和直肠，带菌率可高达30％左右。在健康人的鼻咽部也可分离到B族链球菌。新生儿感染与母体带菌有着密切关系，当分娩时胎儿经过带菌产道时可能受感染，也可能由医护人员呼吸道所携带病菌而引起感染。
B族链球菌感染也称作乙型链球菌感染，是新生儿败血症和脑膜炎、以及母亲感染的重要原因。健康妇女中15-35％带有生殖道和消化道B族链球菌菌落。一般健康良好的并不致病，但孕妇可感染，表现为菌血症、泌尿系感染、胎膜感染、宫内膜感染、以及创伤感染。大约25％妊娠妇女可检测出B族链球菌，其中约有一半会带给新生儿，有1-2％新生儿会发病。在美国统计发病率是1-4‰，澳大利亚、英国、和芬兰也有相似的数据报道。这种母婴传播发生在临产，由于新生儿暴露于有B族链球菌产道，可吞进和吸入细菌，也可能宫内感染，其结果不仅可发病和致死，也可遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍、以及脑瘫痪等后遗症。
新生儿B族链球菌感染表现为菌血症、脑膜炎、和皮肤感染，新生儿B族链球菌感染有两种类型：①早期发病的爆发性败血症：常见于1周内的婴儿，并且第一周内发病者的80％发生在第一天。具有败血症的一般表现，伴有呼吸窘迫，约1/3患儿有脑膜炎，也称新生儿呼吸窘迫症或新生儿休克综合症。病情凶险，1-2天死亡，死亡率高达50％-70％。此类感染主要来自带菌的产妇，B族链球菌血清型可以分为I、II、或III型。②晚期发病的化脓性脑膜炎：发病的年龄在1周-3月之间，平均为4周，呼吸道症状不多见，多伴随有败血症。病死率约15％，存活者可有痴呆、脑积水等后遗症。此类感染一般是医院内感染，B族链球菌血清型主要是III型。
1990年以来，美国由于分娩前采取预防性筛查，使早发的B族链球菌感染降低了70％。根据分娩前得到筛查结果，患者可在住院后立即得到静脉注射抗生素治疗。目前，通常采用标准细菌培养方法来检测B族链球菌的存在，该方法从阴道和肛门取材，由于需要进行细菌培养，需要在35-37周孕期取材，大约需要18-48小时得到检测结果。如果检测结果为阳性，需要给孕妇使用抗生素以预防她将细菌传染给婴儿。
B族链球菌感染是导致新生儿疾病和死亡的主要病因，通常采用标准的细菌培养的检测方法进行检测，要得到结果需要18-48小时。因而采用这种方法比较费时，不能够有效、快速地检测出B族链球菌的存在。
发明内容
因此，针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒及方法，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。
为了实现上述目的，针对B族链球菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对所选择的特定靶序列设计特异性的引物，特异性地扩增出目的DNA片段。因此，根据待测基因两端的DNA顺序的引物设定也是本发明的要点。
本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且该靶序列选定在537-656之间。
本发明还提供了一种为了检测该特定靶序列而设计的探针。首先选定用于识别和检测B族链球菌的靶序列，将该靶基因片段选定在573-597之间。将该短柄圆环探针序列设计成两部分，该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，为5’CAG GGT TGGCAC GCA ATG AAG TCT 3’，一个为短柄序列，由位于该短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基构成。优选地，该圆环序列与选定的靶基因片段互补。优选地，所述短柄圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。优选地，位于所述短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基分别为：与所述圆环序列的5’端C相连的3’GCCGCC 5’，与所述圆环序列的3’端T相连的5’CGGCGG 3’。优选地，所述短柄圆环探针用于荧光检测。
此外，本发明还提供了一种用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤：a)采集生物样品，并且进行预处理；b)制备DNA模板；c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。
另外，本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒每人份包括：0.5-1ml拭子洗脱液，含有Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTGTTA AGG C 3’的引物、dNTP、包括上述短柄圆环探针的B族链球菌探针、以及内参照引物和探针；0.05-0.1ml溶解液；以及0.02-0.05ml自备试剂。
本发明用于识别B族链球菌的基因检测方法与现有培养技术相比，具有以下特点和优点：
1.根据本发明的方法，可以方便、安全地采集生物样本，适于批量处理，样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点；
2.根据本发明用于检测B族链球菌的试剂盒，具有灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景；以及
3.根据本发明用于检测B族链球菌的方法及试剂盒，可以供实验室和临床研究使用，并应用于普查和预防工作。
附图说明
图1是根据本发明的B族链球菌检测的设计流程图；
图2是短柄圆环探针进行靶序列检测的作用原理图；以及
图3示意性说明了本发明的短柄圆环探针构象。
具体实施方式
如图1所示，本发明用于检测生物样本中B族链球菌的方法包括以下步骤：
1.本发明根据国际上报道的B族链球菌序列来选择靶点；
2.针对选定靶点设计引物和探针序列；
3.提取患者的DNA样本；以及
4.进行核酸扩增和杂交检测DNA样本中是否存在B族链球菌。
通过以下对上述各个步骤的详细描述，本领域技术人员可以进一步了解本发明的目的和优点。
步骤1：选择靶点
以下为国际上报道的B族链球菌序列，结合于此作为参考，该序列是本发明选择靶点的依据。
CTTTCAACTCAAGAAATTGGCATGCTCTAATAGATCTTCCCCCTCGTTGACAAACAAGATAATATCCTTATTTTATCTAACTGTTCAAACTTATGACTGAGTTGACTCAAAGGAAGATTTATCGCACCTGAAATATGCCCCCCACGATACTCATGCTCTTCACGAACGTCTATCAAATGGATATTATTATGCTGGGCAATCAATGTTTCTAATGCTACAACAGTTATCTTTTTAGTCATAATCTTTATTTCCTTTGATACTTGGCAAATTTAGTCAAATGACTAATCACTTTATTATTTAAAATGGTGACATCGTTCTACTATTATGACTATTATCGTAAACCTTTTAATCATAAAAACCATGGTAGTACAAAATCACGAAGTCGACAGCATCACACGAAAAATACAAATATTATTTTAATGCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATGTTACAATCTCTTGATCAACTTGTTGTACCGTAACATTTGGATTCAACTGAACTCCAACAGCATGTGTGATTGCTTTATTTAAAGTATTGTAAACTTTAAATTCTTTGACGTTAAGTACTTTTTTATCTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATCAAGTTTTTGATTTTGTATAGATTGTAGCTCTATCAGTTGGTTTTAAATCAGGATAAGTTAAAACCTTTTGTTCTAATGCCTTTACATCGTTAACTTGAGCTTTAATTGAATCAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAATAACCAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATATTTGCTTGACTAACCTTATTTGCTAAATGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTTCAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACACGACTACCAATAGAATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTTAATTTTTCAACACTAGTAATAGCCTCATTAACCGTTTTTTCATAATCTGTTCCCTGAACATTATCTTTGATATTTCTCAACTGAATGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAGCCATTTGCTGGGCTTGATTATTACTGTTTACATGATTTACCACTTGTGGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGGTGAAAATAACAATGCACCAGCCACTAGAGTTCCAGATAGATACATCATATGTTTAACGTTCATAATGAATTTCCTCCTTTAAACTAAAATCACTTTTACTGCAGTATTTTTAATTTACAGGGCCCATGTTTGTATCTTACTACTTGTCCAAAAGGTCGTCAAGCGCTTTCTTTTCCCCTATATTTTACATTATTACAAATAAACTGCATTTTTTTCATAAAACTAATATTATCATTTTGCTATAATATACTTGCGCCTATCCTTTTGTTAATTTCTGATAATTTAATTTATATTTTCATGTAAAAAACCATAACGATAATTTACCACCTTATATAAATCTAAATATTTTAGAAAATTTCTACTTATCACTATTTTTATCAAATAGATTAGCCTAATGTTTTTCTTAAAAAATAAATTTAATAAGAAGCGTACTATTTTAGATAAAATCGTTCCATTATGCCCAAAAACCATACTAAAACTCATTATTTTTACTTTCTGTTTAGAAATTCATACTAGACCAAGTATTTTAGACACTTAAAAAGCCTTAAACATAATAAGTTCAAGACTTTTTTACTTAGTATTTTAAACTGTGAGTTTGTTTGGCAGTTCCCTCCGATGATTTTTACCCCAATTTTTTGAACCAAAAGTTAACAATATCGTCAGCCATAGTATTGATATCTAGATTACATTTACTGGTAACTATGTTACCATGTGTATGGATAACTTATATCAAAAATATATAATCTAAAAAAGTGAATAACCCTTATAAAATAAGTAAATCCTAAGTACAGCATTAACTTCAAGTAAACAATTTAACGGAGGTAGTATATGAAAATAGCAATAATCGGATATAGTGGGTCGGGTAAGTCCACTTTAGCAAGAAAATTGGGAAATTACTATAATTGCAATGTATTACATCTTGATAGTATTCACTTCGCCCCAAATTGGGAAGAGAGAAAATATGATGACATGATTGACG
靶点选择是本发明的引物设计的基础，要求所选的靶点稳定，没有突变区，长度在120-180bp之间。由于临床采样中细菌数量少，需要针对选定的靶序列进行扩增(即扩增靶序列的拷贝数量)，从而提高检测方法的灵敏度。
根据本发明所选择的靶点与迄今收集到的国际报道已知序列比较，其稳定、无突变、且适合应用于基因检测。
步骤2：针对选定靶点设计引物和探针序列
一般而言，基因检测要求靶分子数量足够高，而多数临床样本中靶分子量远低于此限，其采样量不能很大。因此，单独应用基因检测技术存在灵敏度低的问题。
目前聚合酶链式反应(以下简称“PCR”)技术的建立使基因诊断进入了一个崭新的阶段，其是一种基因扩增技术，在现代分子生物学研究中是很有价值的工具，可应用于不同领域。PCR技术于1983年由美国Centus公司人类遗传室的科学家Kary Mullis发明。以PCR技术为主的体外核酸扩增技术的发展，使低拷贝临床样本的检测成为可能。PCR能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增，将检测阈值降至1-10拷贝数，大大提高了杂交检测的灵敏度。
然而，评价PCR扩增是否成功，关键在于针对靶序列的引物设计，并且靶序列的选择更是PCR扩增成功的关键。本发明通过精确地计算和设计以及实验和筛选，确定了理想的靶序列及引物，以获得理想的靶序列扩增结果，从而为应用各种分子检测技术进行靶序列检测提供了基础。
杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)。杂交方法有很多种，最常见的可以采用DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针可用放射性或非放射性标记。如图2所示，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。
最近发展起来的短柄圆环探针技术，也称分子信标技术，也是一种杂交检测的方法，其具有快速灵敏的特点。在探针5’和3’端之间可形成一个具有20个碱基左右的圆环结构，当溶液中有模板序列时，探针的圆环序列与模板杂交，探针的发夹结构被破坏而线性展开；此时，荧光分子与淬灭分子分开并发出荧光，通过荧光的强度就可检测靶序列。现有技术已有将其应用于结核杆菌的耐药基因检测等。
对于应用核酸杂交检测，核酸杂交是提高基因诊断特异性的关键。短柄圆环探针体系特别值得推荐，这是因为其具有高特异性结合的特点。当采用DNA结合染料(如SYBR Green)进行的荧光即时检测系统时，需要知道SYBR Green与所有双链DNA结合的情况才能够进行检测。然而，短柄圆环探针的特殊性就在于仅与互补靶基因片段结合，只报告互补的靶序列或扩增产物。短柄圆环探针系统与其它线形探针比较，还具有可检测出单碱基对错配的功能。短柄圆环探针遇到有错配的单碱基对时，会很不稳定且不牢固，在这点上与一般线形探针有所不同，可应用于发现位点突变。与线形溶解探针比较，标记在短柄圆环探针上的荧光素与淬灭剂相邻，直接能量转换易于淬灭。因此，淬灭剂和荧光素的选择比较容易。
应用短柄圆环探针体系检测B族链球菌，关键在于确定合适的靶序列，需要其具有特异性和稳定性。进一步地，所选靶序列应当符合探针序列的设计要求，要考虑能够保持圆环结构而不发生自身序列的杂交，以及特异性杂交产生的力能够克服短柄序列之间的结合力等等，这些都是解决检测问题的要点。
目前，通常采用PCR产物电泳的方法检测PCR扩增是否成功，而采用这种方法会增加额外时间，增加实验室设备和试剂的污染危险。在检测操作中，必须将所有试管打开进行取样。另外，同样的引物-模板系统重复进行检测，前一次实验的扩增产物可作为随后实验导致污染的模板，从而产生假阳性。而应用短柄圆环探针可以减少电泳步骤，因而减少污染机会，反应和结果分析在密封的一个试管中进行，从而提高了检测的准确性。
本发明采用了核酸扩增技术，而扩增能否成功的关键是针对选定靶点的引物设计，该引物的设计是本发明所解决关键技术。选择每个引物的长度在18-25bp之间，同时设计引物要求避免其自身杂交，因而还要进一步考虑其TM值等设计参数。
本发明是根据世界上各研究机构公开发表的B族链球菌序列基础上，分析确定B族链球菌的特异性、稳定的序列。为利用PCR技术，经过计算、设计、及筛选，提供了一对优选的针对B族链球菌设计的特异性引物。
此外，本发明还设计了短柄圆环探针，能够检测实验室及临床的生物样本，通过以下对实施例的详细描述，本领域技术人员可以进一步了解本发明的目的和优点。
本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且该靶序列选定在537-656之间。
本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的短柄圆环探针，将该短柄圆环探序列设计成5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAGTCT 3’，其中短柄是由该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸，圆环序列与选定的靶基因片段互补。短柄圆环探针的5’端标记荧光素，3’端标记DABCYL淬灭剂，可以应用荧光检测技术检测杂交，报告靶基因序列。
优选地，将PCR技术与短柄圆环探针体系结合，用于检测B族链球菌的存在。
步骤3：提取DNA样本
提取DNA样本，即制备DNA模板，包括以下步骤：(1)将拭子样本放置在TE液中，静置5-20分钟，震荡15-40秒；(2)将40-80μl拭子上清液加入裂解液管，高速震荡5-10分钟；(3)瞬时离心2-5秒；(4)在95℃下孵育2-10分钟，立即冰浴；以及(5)瞬时离心2-5秒。
步骤4：核酸扩增和杂交检测DNA样本
根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤：a)采集生物样品，并且进行预处理；b)制备DNA模板；c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。
根据本发明的基因诊断方法，优选地，对扩增的靶序列检测采用短柄圆环探针荧光检测，本领域技术人员也可以采用其它杂交技术来检测该扩增靶序列。
此外，根据本发明的用于检测B族链球菌的基因诊断试剂盒，该试剂盒每人份包括：0.5-1ml拭子洗脱液，含有Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CATCTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族链球菌探针、以及内参照探针；0.05-0.1ml溶解液，优选地，该溶解液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl；以及0.02-0.05ml自备试剂，优选地，该自备试剂为石蜡油。
根据本发明提供的试剂盒及基因诊断方法，通过包括对患者的病变部位的分泌物和组织、血样、以及尿样的检查作为B族链球菌早期诊断参考依据，同时也可以实现更大范围采样检测，以检测和发现B族链球菌。目前，已从临床送检病变部位的分泌物和组织、以及血样中，检测出B族链球菌的特有基因序列。
下面结合实施例，对本发明进行进一步阐述，并且不会因此限制本发明的保护范围。
实施例1
用于PCR引物的制备
根据本发明的一对引物序列为5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，该序列可以有效地避免自身杂交，退火温度在50-60℃之间。仪器规格为ABI 391DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料为ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G。
短柄圆环探针的制备
如图3所示，根据本发明的短柄圆环探针序列为5’CAG GGTTGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，其中短柄是该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸。采用ABI 391 DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料为ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G，其中5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。
短柄圆环探针荧光检测B族链球菌
短柄圆环探针体系与核酸扩增在同一试管中进行，无需开盖，可以有效地避免污染，从而提高检测准确率。
每人份(25μl)核酸扩增体系设计如下：
体系组成         终浓度
缓冲液           1x
MgCl2            2.0mM
dNTP             0.08mM
Taq，酶          2.5单位
短柄圆环探针     0.5mM
引物             0.5mM
DNA模板          5μl
H2O              补充至25μl
即时PCR程序设置：
95℃    2分钟    1个循环
94℃    15秒
55℃    50秒     }40个循环
72℃    10秒
实施例2
根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤：
1.样本采集：对于被检测者阴道和直肠的样本需用涤纶拭子，首先擦去被检测者阴道内过多的分泌物，将拭子小心地插入被检测者的阴道，采取阴道低位1/3处粘膜分泌物样本，再将拭子小心地插入被检测者的肛门，在肛门括约肌以上约2-5厘米处轻轻旋转取得样本，按照医院样本输送程序送至实验室，注意防止运送中的过热温度(一般不超过30℃)；
2.样本检测：将步骤1采集到的样本在室温下保存，24小时内检测，原则上样本在5-25℃可保存6天。如果不能在24小时内处理，应该置于冰箱(4℃)保存，荧光PCR法检测目的是找到特有序列，检测结果应该在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的；
3.制备DNA模板，包括以下步骤：(1)将拭子样本放置在1xTE液中，静置10分钟，震荡25秒；(2)将拭子上清液60μl加入裂解液管，高速震荡10分钟；(3)瞬时离心5秒；(4)在95℃下孵育5分钟，立即冰浴；以及(5)瞬时离心4秒；
4.进行核酸扩增处理，包括以下步骤：(1)取DNA模板液2μl；(2)加入混合反应液23μl；(3)循环时间与温度设置：
95℃ 2分钟 1次循环；
94℃ 15秒
55℃ 50秒  }40次循环；以及
72℃ 10秒
5.检验结果报告：即时荧光法检测目的是找到特有序列，检测结果在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的。
实施例3
B族链球菌检测试剂盒及其使用方法
每人份用于检测B族链球菌的试剂盒包括：
0.8ml拭子洗脱液，包括1xTris、EDTA缓冲液，pH值为7.2；
裂解液管，内装0.08ml玻璃珠；
核酸扩增和杂交反应管，内装0.025ml的0.001％核酸扩增混和液、0.002％一对特异引物、0.05％dNTP、0.001％B族链球菌探针、0.001％内参照引物和探针，其中特异引物序列为5’CGG TTA ATGAGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；
0.07ml溶解液，为经处理的高纯水；
0.03ml石蜡油；以及
0.01ml阳性对照液，为B族链球菌特有序列。
采用根据本发明的试剂盒检测B族链球菌的方法，包括以下步骤：
1)吸取1ml拭子洗脱液放置于1.5ml离心管中；
2)将拭子放置于装有洗脱液的离心管中，使拭子浸湿，然后稍微向上提起，剪断高于离心管的拭子柄部分，盖好盖子，室温静置5分钟，高速震荡5分钟，稍离心以便甩去离心管盖子上的液体；
3)从洗脱液中吸取50μl液体放置在裂解液管中，高速震荡5-15分钟，其中震荡时间根据所用仪器的震荡强度而定；
4)在95℃孵育2分钟，取出并立即置于冰浴中；
5)向反应管中加入23μl溶解液，用吸头轻吹打溶解并将试剂混合均匀；以及
6)再向反应管中加入10μl的石蜡油，取1.5μl裂解液管中的模板加到反应管中石蜡油的液面下，在石蜡油液面下，用吸头轻吹打4次，将试剂与模板混合均匀，按下列程序设置进行核酸扩增和杂交(即时核酸扩增)：
95℃    2分钟   1个循环
94℃    15秒
55℃    50秒    }40个循环
72℃    10秒
比较例
美国FDA通过的IDI-Strep BTM检测B族链球菌的方法，与本发明的方法不同之处在于引物、探针序列选择、以及内参照的制定，其中IDI-Strep BTM为加拿大人研制在美国首次上市的用于检测B族链球菌的试剂盒，价格为每人份30美元。
分别采用根据本发明的B族链球菌方法(称之为“乙链即时检测法”)与现有技术的IDI-Strep BTM检测方法进行对比试验，将对比试验的结果列于表1，而将临床诊断检测结果列于表2。
表1对比试验结果
 日期   样本编号   培养方法   现有技术IDI结果   培养结果   本发明乙链即时检测法
 2004年1月29日   M67285   培养基   +   +   +
 2004年1月29日   M66445   培养基   -   -
 2004年1月29日   M67290   培养基   -   -
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 2004年2月27日   T29439   培养基   -   -   -
 2004年2月27日   T24046   培养基   -   -   -
 2004年2月27日   T29481   培养基   -   -   -
 2004年3月1日   T27201   培养基   +   +   +
 2004年3月1日   T27820   培养基   -   -   -
 2004年3月1日   T27189   培养基   -   -   -
 2004年3月1日   T29005   培养基   -   -   -
 2004年3月1日   T29694   培养基   +   -   +
 2004年3月1日   T27817   培养基   -   -   -
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 2004年3月1日   T29444   培养基   -   -   -
 2004年3月1日   M15055R   BAP   -   -   -
 2004年3月1日   T28998R   BAP   -   -   -
 2004年3月1日   T28269R   BAP   +   -   +
表2临床诊断检测结果
  本发明方法的检测结果   临床诊断   合计
IDI方法检测出<u>的阳性病例</u>IDI(+) IDI方法检测出<u>的阴性病例</u>IDI(-)
  阳性GBS(+)   38   1<sup>**</sup>   39
  阴性GBS(-)   1<sup>*</sup>   72(-)   73
  合计   39   73   112
从表2数据可以得出：
灵敏性＝(PCR方法的阳性样本数/培养方法的阳性样本数)×100％＝(38/39)×100％＝97.4％
特异性＝(PCR方法的阴性样本数/培养方法的阴性样本数)×100％＝(72/73)×100％＝98.6％
符合率＝[(PCR方法的阳性样本数+PCR方法的阴性样本数)/总样本数]×100％＝[(38+72)/112]×100％＝98.2％
阳性预测值＝(PCR方法的阳性样本数/耐药培养的阳性样本总数)×100％＝[38/(38+1)]×100％＝97.4％
阴性预测值＝(PCR方法的阴性样本数/耐药培养的阴性样本总数)×100％＝[72/(1+72)]×100％＝98.6％
如果以培养结果为参考，其中一例GBS阴性样本*虽与IDI结果不同(IDI为阳性)，但与培养结果相同(阴性)，一例GBS阳性样本**，IDI结果为阴性，培养结果也是阴性。
其中阳性预测值表示某一检测方法其阳性结果被证明为阳性的概率，阴性预测值表示某一检测方法其阴性结果被证明为阴性的概率。
由此可以看出，与现有技术的IDI-StrepTM检测方法相比，本发明的乙链即时检测法在灵敏性、特异性、阳性预测值、和阴性预测值方面至少等同或优于IDI-StrepTM检测方法(如果以培养结果为参照标准)。IDI-StrepTM试剂盒价格是本发明试剂盒的5倍。
此外，本发明用于快速检测B族链球菌的试剂盒可批量生产、操作简单、简便快捷、特异性好、灵敏性高、并且符合率高，具有良好的市场应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，所述引物为以下的一对序列：
5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’；以及
5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C3’。
2.一种用于检测根据权利要求1所述的引物扩增的B族链球菌的短柄圆环探针，所述短柄圆环探针包括两个序列，一个为圆环序列，为5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，一个为短柄序列，由位于所述短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基构成。
3.根据权利要求2所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而所述圆环探针的3’端标记DABCYL淬灭剂。
4.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄序列为与所述圆环序列的5’端C相连的3’GCCGCC5’，与所述圆环序列的3’端T相连的5’CGGCGG 3’。
5.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄圆环探针用于荧光检测。
6.根据权利要求5所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述圆环序列与所述靶序列是完全互补的序列。
7.一种用于检测B族链球菌的试剂盒，包括：
0.5-1ml拭子洗脱液，包括Tris和EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；
裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；
核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、一对序列为5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、根据权利要求2～6所述的用于B族链球菌的短柄圆环探针、以及内参照引物和探针；
0.05-0.1ml溶解液；以及
0.02-0.05ml自备试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括阳性对照液。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述溶解液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述自备试剂为石蜡油。
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