CN101177705B - 探针、探针组、固定有探针的载体和基因检测方法 - Google Patents

探针、探针组、固定有探针的载体和基因检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于病原性细菌菌种分类的、能汇总性地检测相同菌种的菌株和将它们从其它细菌菌种中区别性地检测出来的核酸探针。使用SEQ ID NO.84到86所示的碱基序列、和其互补序列或其修饰的序列中的任意一个，或它们中的至少两个的组合来检测传染性疾病病原性细菌的基因。

Description

探针、探针组、固定有探针的载体和基因检测方法
发明背景
发明领域
本发明涉及用于检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)(Clostridium)的基因的探针和探针组，其用于检测和鉴定传染性疾病的致病性生物；固定有探针的载体，所述探针或探针组被固定在它上面；使用该固定有探针的载体的基因检测方法；和用于该方法的基因检测试剂盒。
相关背景技术
迄今，已提出在分析物中快速并准确地检测传染性疾病的致病性生物的试剂和方法。例如，日本专利申请特开平H08-089254中公开了具有特定的碱基序列的寡核苷酸(其能分别用作探针和引物以用于检测念珠菌病和曲霉病的病原性细菌)和使用此类寡核苷酸检测目标细菌的方法。另外，相同的专利文件还公开了用于通过PCR同时扩增多种目标细菌的引物组。换言之，这些引物被用于在分析物中对作为多种目标的来自真菌的核酸片段进行PCR扩增。可以使用特异于各个真菌的探针和经由各个引物扩增的核酸片段进行杂交分析以检测序列的特定部分的存在，从而鉴定分析物中的目标真菌种类。
另一方面，作为能同时检测多个具有不同碱基序列的寡核苷酸的方法，已知使用探针阵列的方法，其中将具有与各个碱基序列互补的序列的探针间隔地排列在固相支撑物上  (日本专利申请特开平2004-313181)。
发明概述
不过，设计特异性地检测样品中传染性疾病病原性细菌基因的探针不是一件容易的工作。因为，除了目标基因，样品可能进一步含有其它传染性疾病病原性细菌的基因。因此，设计特异性地检测传染性疾病病原性细菌的基因并同时禁止交叉污染的探针不是一件容易的工作，所述交叉污染是其它传染性疾病病原性细菌的基因的存在而造成的影响。在这种情况下，本发明人为获得如下所述的探针进行了研究，所述探针在维持低水平交叉污染的同时，甚至当使用其中存在不同细菌的基因的样品时，允许精确检测后面提到的传染性疾病病原性细菌的基因。结果，本发明的发明人最终发现了能精确检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)的基因的多个探针。
本发明的第一个目标是提供探针和探针组，它们能从其中同时存在多种细菌的分析物中精确鉴定目标细菌的基因。本发明的另一个目标是提供固定有探针的载体，它能被用于从其中同时存在多种细菌的分析物中精确地鉴定目标细菌。本发明的另一个目标是提供检测目标细菌的基因检测方法，它能从分析物中的多种细菌中(当它们存在其中时)快速并精确地检测目标细菌；和用于这种方法的试剂盒。
本发明的检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针具有下述碱基序列(1)到(4)中的任一个：
(1)ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG(SEQ ID NO.84)或它的互补序列；
(2)ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG(SEQ ID NO.85)或它的互补序列；
(3)ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC(SEQ ID NO.86)或它的互补序列；和
(4)修饰的序列，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.84-86的序列和它的互补序列中的任一个上在所述修饰的序列保持作为探针的功能的范围内发生碱基缺失、置换或添加而制备的。
此外，本发明的用于检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)  的基因的探针组包括选自下述(A)到(L)中的至少两个探针：
(A)具有ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG(SEQ ID NO.84)所示的碱基序列的探针；
(B)具有ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG(SEQ ID NO.85)所示的碱基序列的探针；
(C)具有ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC(SEQ ID NO.86)所示的碱基序列的探针；
(D)具有SEQ ID NO.84所示的碱基序列的互补序列的探针；
(E)具有SEQ ID NO.85所示的碱基序列的互补序列的探针；
(F)具有SEQ ID NO.86所示的碱基序列的互补序列的探针；
(G)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.84所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(H)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.85所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(I)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.86所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(J)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.84所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(K)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.85所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；和
(L)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.86所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的。
本发明的固定有探针的载体的特征性特点是，上述探针(A)到(L)中的至少一个被固定在固相载体上，并且当使用多个探针时，各个探针被间隔排列。
通过使用本发明的固定有探针的载体在分析物中检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)的基因的方法，包括步骤：
(i)让分析物和具有上述构成的固定有探针的载体反应；和
(ii)检测固定有探针的载体上的探针和分析物中的核酸之间的反应是否存在，或检测固定有探针的载体上的探针和分析物中的核酸之间的杂交反应的强度。
本发明的检测传染性疾病病原性细菌-梭状芽孢杆菌(属)的试剂盒的特征性特点是，包括上述探针(A)到(L)中的至少一个，和检测探针与目标核酸之间的反应的试剂。
根据本发明，当分析物被上述致病性细菌感染时，细菌能被更快速并精确地从分析物中鉴定出，即使该分析物同时并且复杂地被上述细菌之外的其它细菌感染。特别地，可以检测出梭状芽孢杆菌(属)，同时精确区分它和可能引起交叉污染的大肠埃希氏杆菌。
参照下述例示性实施方案的描述和附图，本发明的进一步特点将变得显而易见。
附图简述
图1是阐述第一PCR(1st PCR)操作流程的图。
图2是阐述第二PCR(2nd PCR)操作流程的图。
发明详述
本发明的发明人已经从各个保藏机构获得了到目前为止几乎所有的被认为是败血病病原性细菌的细菌(由下述(1)到(80)表示)，并鉴定了所有这些细菌的16S rRNA的基因序列。
随后，在比较所有鉴定的序列时，详细研究了梭状芽孢杆菌(属)的探针序列，并且最终找出本发明的能够鉴定梭状芽孢杆菌(属)的探针。
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)              (ATCC12600)
(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)           (ATCC14990)
(3)大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)                   (ATCC11775)
(4)肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)            (ATCC13883)
(5)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)               (ATCC10145)
(6)粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)                  (ATCC13380)
(7)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)               (ATCC33400)
(8)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)               (ATCC33391)
(9)阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)                   (ATCC13047)
(10)粪肠球菌(Enterococcus faecalis)                   (ATCC19433)
(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)         (ATCC29970)
(12)人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)                (ATCC27844)
(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcuss aprophyticus)        (ATCC15305)
(14)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)              (ATCC13813)
(15)变异链球菌(Streptococcus mutans)                  (ATCC25175)
(16)化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)                (ATCC12344)
(17)血链球菌(Streptococcus sanguis)                   (ATCC10556)
(18)鸟肠球菌(Enterococcus avium)                      (JCM8722)
(19)屎肠球菌(Enterococcus faecium)                    (ATCC19434)
(20)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluore scens)            (ATCC13525)
(21)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)                  (ATCC12633)
(22)洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)          (JCM5964)
(23)嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)  (ATCC13637)
(24)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)             (ATCC19606)
(25)乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)       (ATCC23055)
(26)木糖氧化产碱菌(Achromobacter xylosoxidans)        (ATCC27061)
(27)创伤弧菌(Vibrio vulnificus)                       (ATCC27562)
(28)猪霍乱沙门(氏)菌(Salmonella choleraesuis)         (JCM1651)
(29)弗劳地氏柠檬杆菌(Cit robacter freundii)           (ATCC8090)
(30)产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)                (ATCC13182)
(31)产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)                (ATCC13048)
(32)蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)                        (ATCC13337)
(33)液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)               (ATCC27592)
(34)奇异变形菌(Proteus mirabilis)                     (ATCC29906)
(35)普通变形菌(Proteus vulgaris)                      (ATCC33420)
(36)摩氏摩根(氏)菌(Morganella morganii)               (ATCC25830)
(37)雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)            (JCM1675)
(38)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)                (JCM1027)
(39)温和气单胞菌(Aeromonas sobria)                    (ATCC43979)
(40)阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)             (ATCC14018)
(41)白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)         (ATCC2701)
(42)侵肺军团菌(Legionella pneumophila)                (ATCC33152)
(43)蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)                     (ATCC14579)
(44)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)                   (ATCC6051)
(45)堪萨斯氏分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)          (ATCC12478)
(46)胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)        (ATCC13950)
(47)龟分支杆菌(Mycobacterium chelonae)                (ATCC35752)
(48)星状诺卡氏菌(Nocardiaas teroides)                 (ATCC19247)
(49)脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)                  (JCM11019)
(50)多形类杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)          (JCM5827)
(51)难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)           (ATCC51695)
(52)产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostididium perfringens)    (JCM1290)
(53)迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)                   (JCM10763)
(54)坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)             (JCM3718)
(55)核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)               (ATCC25586)
(56)嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophllus)         (ATCC4356)
(57)普氏厌氧球菌(Anaerococcus prevotii)               (JCM6490)
(58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)      (JCM8143)
(59)不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)   (JCM6326)
(60)牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)          (JCM8525)
(61)栖牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)              (ATCC38184)
(62)痤疮丙酸杆菌(Propionibacter ium acnes)            (JCM6473)
(63)约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)             (ATCC17909)
(64)琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)                 (ATCC17908)
(65)舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)                (ATCC43700)
(66)维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)                 (ATCC35624)
(67)吉氏类杆菌(Bacteroides distasonis)                (ATCC8503)
(68)普通类杆菌(Bacteroides vulgatus)                  (ATCC8482)
(69)大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)                  (ATCC33559)
(70)豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)       (ATCC35217)
(71)空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)                  (ATCC33560)
(72)水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)                 (ATCC11947)
(73)水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)                 (ATCC33299)
(74)黑色消化球菌(Peptococcus niger)                     (ATCC27731)
(75)亲合丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)              (ATCC25577)
(76)佛罗伊登氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)(ATCC6207)
(77)颗粒丙酸杆菌(Pro pionibacterium granulosum)         (ATCC25564)
(78)丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)             (ATCC13949)
(79)Flavobacterium hydatis                              (NBRC14958)
(80)约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)               (NBRC14942)
所获得的细菌菌种的保藏号示于上述右侧的各个括号中。具有以“ATCC”、“JCM”和“NBRC”开头的保藏号的细菌菌种分别得自于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，RIKENBioResource Center)和美国呼吸治疗协会(National Board forRespiratory Care)。
本发明提供了鉴定传染性疾病病原性细菌的寡核苷酸探针(在下文中，简称为探针)和包括两种或更多种探针的组合的探针组。使用这种探针或探针组能检测通过感染来引起炎症的下述细菌。
[细菌名称]
梭状芽孢杆菌(属)
就是说，本发明的探针能检测上述细菌的基因中的16S rRNA基因序列，包含下述的序列：
(A)具有ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG(SEQ ID NO.84)所示的碱基序列的探针；
(B)具有ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG(SEQ ID NO.85)所示的碱基序列的探针；
(C)具有ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC(SEQ ID NO.86)所示的碱基序列的探针；
(D)具有SEQ ID NO.84所示的碱基序列的互补序列的探针；
(E)具有SEQ ID NO.85所示的碱基序列的互补序列的探针；
(F)具有SEQ ID NO.8 6所示的碱基序列的互补序列的探针；
(G)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.84所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(H)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.85所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(I)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.86所示的碱基序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(J)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.84所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；
(K)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.85所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的；和
(L)具有修饰的序列的探针，所述修饰的序列是在SEQ ID NO.86所示的碱基序列的互补序列上在使它保持用于检测梭状芽孢杆菌(属)的基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加而获得的。
探针组可以使用这些探针中的至少两种来形成。
这些探针的功能显著依赖每个探针序列对感兴趣的目标核酸序列的特异性。探针序列的特异性可以通过目标核酸序列和探针序列的碱基一致性程度来评估。进一步地，当多种探针组成探针组时，探针间解链温度的变化可以影响探针组的性能。
为了设计探针序列，选择不管菌株的任何差异而对感兴趣的特定细菌菌种显示高特异性的区域。该区域含有3个或更多个和其它任意细菌菌种序列中的对应碱基不一致的碱基。设计该探针序列，使在该探针序列和感兴趣的特定细菌菌种对应序列间的解链温度与在该探针序列和任意其它细菌菌种对应序列间的解链温度相差10℃或更多。进一步地，可以缺失或增加一个或多个碱基，使固定在单个载体上的各个探针可以具有预定范围内的解链温度。
本发明的发明人通过实验发现，如果80％或更多的碱基序列连续保守，探针的杂交强度将不会显著降低。因此根据该发现可以得出结论，如果探针80％或更多的碱基序列连续保守，从公开在说明书中的探针序列修饰而得的任意序列将具有足够的探针功能。
上述修饰的序列可以包括任意变体，只要它不损害探针功能；或任何变体，只要它和作为检测目标的感兴趣的核酸序列杂交。尤其是，希望包括任何变体，只要它能在严格条件下和作为检测目标的感兴趣的核酸序列杂交。优选的界定所述变体的杂交条件包括下述实施例中的那些。此处使用的术语“检测目标”可以是包括在样品中的、将被用于杂交的序列，其可以是传染性疾病病原性细菌独有的碱基序列、或可以是独有序列的互补序列。进一步地，变体可以是在使它保持作为探针的功能的范围内通过缺失、置换或添加至少一个碱基所获得的修饰的序列。
这些探针序列仅特异性于编码上述细菌16S rRNA的DNA序列，因此即使是在严格条件下也能期望获得对该序列的足够的杂交灵敏度。此外，即使探针序列被固定在设计成产生优良结果的载体上时，这些探针序列中的任一个通过和目标分析物的杂交反应形成稳定的杂交产物。
进一步地，通过在载体上的预定位置供给探针并将探针固定其上，能够获得上面具有本发明的检测传染性疾病病原性细菌的探针的固定有探针的载体(例如DNA芯片)。可以使用多种方法来供给探针到载体上。其中，例如，一种能被适当使用的方法是保持表面状态能让探针通过化学结合(例如共价结合)固定在载体上，并且随后通过喷墨方法在预定位置上提供含有探针的液体。这种方法让探针难以从载体上脱离，并具有增强灵敏度的附加效果。换句话说，当使用常规使用的并被称为Stanford方法的压印方法制备DNA芯片时，产生的DNA芯片具有所施用的DNA趋于脱落的缺点。另一个形成DNA芯片的方法是通过在载体表面上合成DNA来进行探针排列(例如来自于Affymetrix公司的DNA芯片)。在这种在载体上合成探针的方法中，难以为每个探针序列制备相等数量的合成DNA。因此，对应于每个探针来说每个固定区域(点)的固定的探针数量趋于很大的变化。这种各个固定的探针数量的变化会引起对于采用那些探针的检测结果的错误评价。基于这一事实，优选使用上述喷墨方法来制备本发明的探针载体。上述喷墨方法具有一个优点，即探针能被稳定地固定在载体上并难以脱离载体，从而有效地提供能高灵敏度和高准确度地进行检测的探针载体。
此外，探针组可以包括选自于一组序列中的至少两个，所述一组序列含有上述SEQ ID NO.84-86、它们的互补序列和通过在这些序列上在使之保持检测梭状芽孢杆菌(属)基因的探针功能的范围内进行碱基缺失、置换或添加所获得的序列。这样，检测梭状芽孢杆菌(属)基因的准确度能进一步提高。
在下文中，详细描述本发明的优选实施例。
待使用探针载体(例如DNA芯片)进行检测的测试对象包括源自人和动物(例如家畜)的那些，在所述探针载体中本发明的探针被固定在载体上。例如，测试对象是可能含有细菌的那些中的任何一个，包括：任意体液，例如血液、脑脊液、咳出液、胃液、阴道分泌物和口腔粘膜液；和排泄物，例如尿和粪。也可以使用DNA芯片对能被细菌污染的所有介质进行检测。此类介质包括：食物、饮用水和天然环境中的水，例如温泉水，其能通过污染引起食物中毒；空气清洁器等的滤膜等。进/出口中应该检疫的动物和植物也可用作感兴趣的分析物。
当上述样品能被直接用于和DNA芯片反应时，它被用作和DNA芯反应的分析物并且随后分析反应的结果。可选择地，当样品不能直接和DNA芯片反应时，如果需要，可对样品进行抽提、纯化和其它处理来获得目标物质，并随后提供作为分析物来和DNA芯片进行反应。例如，当样品含有目标核酸时，从样品中制备提取物(所述提取物假定含有这种目标核酸)，并随后清洗、稀释或等等来获得分析物溶液，随后和DNA芯片进行反应。进一步，当目标核酸包括在通过进行多种扩增操作(例如PCR扩增)获得的分析物中时，该目标核酸可以被扩增并随后和DNA芯片反应。扩增的核酸的此类分析物包括如下：
(a)通过使用设计用于检测16S rRNA基因的PCR反应引物制备的扩增的分析物。
(b)通过额外的PCR反应等从PCR扩增产物中制备的扩增的分析物。
(c)通过PCR之外的扩增方法制备的分析物。
(d)通过各种不同标记方法中的任一种方法进行标记以便可视化的分析物。
进一步，用于制备固定有探针的载体(例如DNA芯片)的载体可以是满足进行感兴趣的固相/液相反应的特性的那些载体中的任意一个。载体的例子包括：平坦基板例如玻璃基板、塑料基板和硅片；具有不规则表面的三维结构；和球形体例如珠，和竿、带和丝状结构。载体的表面可以被处理，这样探针能固定在它上面。特别地，从重复性的观点上看，通过在其表面引入官能团使其能发生化学反应而制备的载体具有较好的形式，因为在杂交反应过程中探针被稳定地结合。
可以使用多种方法固定探针。此类方法的一个例子是使用马来酰亚胺基团和巯基(-SH)基团的组合。在这个方法中，巯基(-SH)基团结合到探针末端，并且事先进行加工以使载体(固体)表面具有马来酰亚胺基团。由此，供给到载体表面上的探针的巯基和载体表面上的马来酰亚胺基团反应，形成共价键，由此探针被固定。
能利用如下过程引入马来酰亚胺基团：首先让玻璃基板和氨基硅烷偶联剂发生反应，并随后通过氨基基团和EMCS试剂(N-(6-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺，购自Dojindo公司)反应将马来酰亚胺基团引入到玻璃基板上。能在通过自动DNA合成仪合成DNA时使用5′-巯基-修饰物C6(购自Glen Research公司)将巯基引入到DNA上。
代替巯基和马来酰亚胺基团的上述组合，还可以使用，例如环氧基(在固相上)和氨基(核酸探针末端)的组合作为官能团的组合用于固定。使用不同种类的硅烷偶联试剂进行表面处理也是有效的。使用其中引入了能和通过硅烷偶联试剂引入的官能团反应的官能团的探针。还可以使用施用带有官能团的树脂的方法。
能通过基因检测方法，使用本发明的固定有探针的载体对传染性疾病病原性细菌的基因进行检测，所述基因检测方法包括步骤：
(i)让分析物和上面固定有本发明的探针的固定有探针的载体反应；
(ii)检测分析物中的核酸和固定有探针的载体上的探针之间的反应存在与否，或检测分析物中的核酸和固定有探针的载体上的探针之间的杂交反应强度；和
(iii)当检测到探针和分析物中的核酸的反应时，指明已经和分析物中的核酸反应的探针，并且根据探针的核酸序列指明传染性疾病病原性细菌的基因。
固定在固定有探针的载体上的探针是上述(A)到(L)中的至少一个。在载体上，根据检测目的，用于检测除梭状芽孢杆菌(属)以外的其他细菌菌种的探针可以作为其它探针被固定。此时，其它探针可以是能检测梭状芽孢杆菌(属)以外的菌菌种而不引起交叉污染的那些探针，并且使用这样的探针能同时高准确性地检测多种细菌菌种。
进一步，如上所述，当通过PCR扩增分析物中的传染性疾病病原性细菌的16S rRNA基因序列，并且将其提供为和探针载体反应的样品时，可以使用用于检测所述传染性疾病病原性细菌的引物组。该引物组适当地包括选自下述(1)到(21)所示的寡核苷酸中的至少一个，和选自下述(22)到(28)所示的寡核苷酸中的至少一个，更合适地包括下述(1)到(28)所示的所有寡核苷酸：
(1)具有5’gcggcgtgcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：1)的碱基序列的寡核苷酸；
(2)具有5’gcggcaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：2)的碱基序列的寡核苷酸；
(3)具有5’gcggcaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：3)的碱基序列的寡核苷酸；
(4)具有5’gcggtaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：4)的碱基序列的寡核苷酸；
(5)具有5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：5)的碱基序列的寡核苷酸；
(6)具有5’gcgggatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：6)的碱基序列的寡核苷酸；
(7)具有5’gcggcatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：7)的碱基序列的寡核苷酸；
(8)具有5’gcggcatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：8)的碱基序列的寡核苷酸；
(9)具有5’gcggcgtgcttaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：9)的碱基序列的寡核苷酸；
(10)具有5’gcggcaggcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：10)的碱基序列的寡核苷酸；
(11)具有5’gcgggatgctttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：11)的碱基序列的寡核苷酸；
(12)具有5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：12)的碱基序列的寡核苷酸；
(13)具有5’gcggcgtgcataacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：13)的碱基序列的寡核苷酸；
(14)具有5’gcggcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：14)的碱基序列的寡核苷酸；
(15)具有5’gcggcgcgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：15)的碱基序列的寡核苷酸；
(16)具有5’gcggcgcgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：16)的碱基序列的寡核苷酸；
(17)具有5’gcgtcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：17)的碱基序列的寡核苷酸；
(18)具有5’gcgataggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：18)的碱基序列的寡核苷酸；
(19)具有5’gcgacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：19)的碱基序列的寡核苷酸；
(20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：20)的碱基序列的寡核苷酸；
(21)具有5’acagaatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：21)的碱基序列的寡核苷酸；
(22)具有5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO：22)的碱基序列的寡核苷酸；
(23)具有5’atccaaccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO：23)的碱基序列的寡核苷酸；
(24)具有5’atccagccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO：24)的碱基序列的寡核苷酸；
(25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO：25)的碱基序列的寡核苷酸；
(26)具有5’atccagcgccaggttcccctag 3’(SEQ ID NO：26)的碱基序列的寡核苷酸；
(27)具有5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO：27)的碱基序列的寡核苷酸；和
(28)具有5’atccagccgcacgttcccgtac 3’(SEQ ID NO：28)的碱基序列的寡核苷酸。
在它们中，设计用于使梭状芽孢杆菌(属)扩增的引物是下述引物组：
(5)具有5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：5)的碱基序列的寡核苷酸；
(12)具有5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：12)的碱基序列的寡核苷酸；
(22)具有5’atccagccgccccttccgatac 3’(SEQ ID NO：22)的碱基序列的寡核苷酸；和
(27)具有5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO：27)的碱基序列的寡核苷酸。
为了检测梭状芽孢杆菌(属)，至少可以包括这样的引物。
通过对SEQ ID NO.1到28的每个序列与包括丁酸梭状芽孢杆菌(ATCC 13949，SEQ ID NO.95)的16S rRNA编码区的DNA序列进行比较，能评价和验证各个引物(1)到(28)对于梭状芽孢杆菌(属)的扩增的效用。
使用至少一种如上所述的探针和用于检测该探针和分析物中的核酸的反应的试剂，可以构建用于检测传染性疾病病原性细菌的试剂盒。试剂盒中的探针可以优选地被提供为如上所述的固定有有探针的载体。进一步地，检测试剂可以含有标记物以检测反应或含有用于进行作为预处理的扩增的引物。
实施例
在下文中，通过使用用于检测传染性疾病病原性细菌的探针以检测梭状芽孢杆菌(属)的实施例对本发明进行更详细的描述。
(实施例1)
在这个实施例中，将描述使用两步PCR的微生物检测。
1.探针DNA的制备
示于表1的核酸序列被设计作为用于检测梭状芽孢杆菌(属)的探针。具体而言，下面的探针碱基序列选自于编码梭状芽孢杆菌(属)16s rRNA基因的基因组部分。这些探针碱基序列被设计为它们能具有对所述细菌的非常高的特异性，并且可以期望在探针碱基序列没有变化的情况下具有足够的杂交灵敏度。探针碱基序列不必总是与表1所示的那些完全匹配。除了具有表1所示碱基序列的探针以外，还可以使用包括表1所示碱基序列的具有20到30个碱基长度的探针。不过，应该确保在这样的探针中的除表1所示部分以外的其它碱基序列部分对检测准确性没有影响。
表1
微生物名称
梭状芽孢杆菌(属)
探针号 SEQ ID NO. 序列
108_G_CLO_01_01 84 5’ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG 3’
108_G_CLO_01_02 85 5’ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG 3’
108_G_CLO_01_03 86 5’ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC 3’
对于具有表1所示碱基序列的每种探针，在依照常规方法进行合成后在核酸的5′末端引入作为用于将探针固定在DNA芯片上的官能团的巯基。在引入官能团后，进行纯化和冻干。用作内标物的冻干的探针储存于-30℃冰箱。
2.PCR引物的制备
2-1.制备用于分析物扩增的PCR引物
作为用于病原性细菌检测的16S rRNA基因(目标基因)扩增PCR引物，设计了如下面的表2所示的核酸序列。具体地，设计了特异性扩增编码16S rRNA的基因组部分的引物组，即，位于碱基长度为1400到1700的16S rRNA编码区的两个末端部分的、特定解链温度尽可能相等的引物。为了同时扩增列于下述(1)到(80)的多个不同细菌菌种、突变体或基因组中的多个16S rRNA基因，设计了多种类型的引物。注意，引物组不局限于表2所示的引物组，只要该引物组能共同地扩增几乎全长的所述病原性细菌16S rRNA基因即可。
表2
引物号 SEQ ID NO. 序列
F01 1 5′gcggcgtgcctaatacatgcaag 3′
F02 2 5′gcggcaggcctaacacatgcaag 3′
F03 3 5′gcggcaggcttaacacatgcaag 3′
F04 4 5′gcggtaggcctaacacatgcaag 3′
F05 5 5′gcggcgtgcttaacacatgcaag 3′
F06 6 5′gcgggatgccttacacatgcaag 3′
F07 7 5′gcggcatgccttacacatgcaag 3′
F08 8 5′gcggcatgcttaacacatgcaag 3′
F09 9 5′gcggcgtgcttaatacatgcaag 3′
F10 10 5′gcggcaggcctaatacatgcaag 3′
F11 11 5′gcgggatgctttacacatgcaag 3′
F12 12 5′gcggcgtgcctaacacatgcaag 3′
F13 13 5′gcggcgtgcataacacatgcaag 3′
F14 14 5′gcggcatgcctaacacatgcaag 3′
F15 15 5′gcggcgcgcctaacacatgcaag 3′
F16 16 5′gcggcgcgcttaacacatgcaag 3′
F17 17 5′gcgtcatgcctaacacatgcaag 3′
F18 18 5′gcgataggcttaacacatgcaag 3′
F19 19 5′gcgacaggcttaacacatgcaag 3′
F20 20 5′gctacaggcttaacacatgcaag 3′
F21 21 5′acagaatgcttaacacatgcaag 3′
R01 22 5′atccagccgcaccttccgatac 3′
R02 23 5′atccaaccgcaggttcccctac 3′
R03 24 5′atccagccgcaggttcccctac 3′
R04 25 5′atccagccgcaccttccggtac 3′
R05 26 5′atccagcgccaggttcccctag 3′
R06 27 5′atccagccgcaggttctcctac 3′
R07 28 5′atccagccgcacgttcccgtac 3′
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)
(3)大肠埃希氏杆菌(Escher ichia coli)
(4)肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)
(5)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
(6)粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)
(7)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
(8)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
(9)阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)
(10)粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)
(12)人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)
(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)
(14)无乳链球菌(Streptococcu sagalactiae)
(15)变异链球菌(Streptococcu smutans)
(16)化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
(17)血链球菌(Streptococcus sanguis)
(18)鸟肠球菌(Enterococcus avium)
(19)屎肠球菌(Enterococcus faecium)
(20)荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)
(21)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
(22)洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)
(23)嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)
(24)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
(25)乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)
(26)木糖氧化产碱菌(Achromobacter xylosoxidans)
(27)创伤弧菌(Vibrio vulnificus)
(28)猪霍乱沙门(氏)菌(Salmonella choleraesuis)
(29)弗劳地氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)
(30)产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)
(31)产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)
(32)蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)
(33)液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)
(34)奇异变形菌(Proteus mirabilis)
(35)普通变形菌(Proteus vulgaris)
(36)摩氏摩根(氏)菌(Morganella morganii)
(37)雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)
(38)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
(39)温和气单胞菌(Aeromonas sobria)
(40)阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)
(41)白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
(42)侵肺军团菌(Legionella pneumophila)
(43)蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
(44)枯草芽孢杆菌(Bacilluss ubtilis)
(45)堪萨斯氏分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)
(46)胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)
(47)龟分支杆菌(Mycobacterium chelonae)
(48)星状诺卡氏菌(Nocardiaa steroides)
(49)脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)
(50)多形类杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)
(51)难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)
(52)产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)
(53)迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)
(54)坏死梭杆菌(Fusobacterium nec rophorum)
(55)核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)
(56)嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophilus)
(57)普氏厌氧球菌(Anaerococcus prevotii)
(58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)
(59)不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasa saccharolytica)
(60)牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
(61)栖牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)
(62)痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)
(63)约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)
(64)琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)
(65)舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)
(66)维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)
(67)吉氏类杆菌(Bacteroides distasonis)
(68)普通类杆菌(Bacteroides vulgatus)
(69)大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)
(70)豚肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)
(71)空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
(72)水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)
(73)水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)
(74)黑色消化球菌(Peptococcus niger)
(75)亲合丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)
(76)佛罗伊登氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)
(77)颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)
(78)丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)
(79)Flavobacterium hydatis
(80)约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)
在合成后通过高效液相色谱(HPLC)纯化表2所示引物。将21个正向引物和7个反向引物混合并溶于TE缓冲液，每个引物的终浓度为10pmol/μl。
2-2.标记式PCR引物的制备
采用和上述分析物扩增引物相似的方式，具有如下面表3所示的序列的寡核苷酸用作用于进行标记的引物。
表3
引物号 SEQ ID NO. 序列
Cy3R9-1 29 5′TACCTTGTTACGACTTCACCCCA 3′
Cy3R9-2 30 5′TACCTTGTTACGACTTCGTCCCA 3′
Cy3R9-3 31 5′TACCTTGTTACGACTTAGTCCCA 3′
Cy3R9-4 32 5′TACCTTGTTACGACTTAGCCCCA 3′
Cy3R9-5 33 5′TACCTTGTTACGACTTAGTCCTA 3′
Cy3R9-6 34 5′TACCTTGTTACGACTTAGCCCTA 3′
用荧光染料Cy3标记表3所示引物。合成后通过高效液相色谱(HPLC)纯化引物。将所述6个标记的引物混合并溶于TE缓冲液中，使每个引物的终浓度为10pmol/μl。
3.梭状芽孢杆菌(属)基因组DNA(模型分析物)的提取
3-1.微生物培养和基因组DNA提取
首先，按照常规方法培养梭状芽孢杆菌(属)的3种菌种：难辨梭状芽孢杆菌(ATCC 51695)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(JCM 1290)和丁酸梭状芽孢杆菌(ATCC 13949)。使用核酸纯化试剂盒(FastPrepFP100A FastDNA Kit，Funakoshi公司制造)对这种微生物培养基施行基因组DNA的提取和纯化。
3-2.收集的基因组DNA的检测
按照常规方法对收集的微生物梭状芽孢杆菌(属)的基因组DNA进行琼脂糖电泳和260/280nm吸收测定。因此，检测了质量(低分子核酸的混入量和分解程度)和收集量。在这个实施例中，大约收集了10μg的基因组DNA。没有观察到基因组DNA的降解或rRNA污染。收集的基因组DNA以50ng/μl的终浓度溶于TE缓冲液中，并用于下面的实验。
4.DNA芯片的制备
4-1.清洁玻璃基板
将合成石英制备的玻璃基板(尺寸：25mm×75mm×1mm，购自Iiyama Precision Glass公司)放在耐热和碱的架子中并浸泡在已经调节到具有预定浓度的清洁溶液中进行超声波清洗。玻璃基板在清洁溶液中持续浸泡一夜并用超声波清洗20分钟。取出基板，用纯水轻轻冲洗，并在高纯水中用超声波清洗20分钟。将该基板在加热到80℃的1N氢氧化钠水溶液中浸泡10分钟。再次用纯水清洗和用高纯水清洗。如此制备了DNA芯片的石英玻璃基板。
4-2.表面处理
硅烷偶联试剂KBM-603(购自Shin-Etsu Silicone公司)以1重量％(wt％)的浓度溶于纯水，并在室温下搅拌2小时。清洁的玻璃基板浸泡到硅烷偶联试剂水溶液中并在室温下持续放置20分钟。取出玻璃基板。用纯水轻轻冲洗其表面，并通过喷射氮气至基板的两个表面上来进行干燥。干燥的基板在烘箱中以120℃烘烤1小时来完成偶联试剂处理，由此氨基基团被引入到基板表面上。下一步，N-马来酰亚氨基己酰氧基琥珀酰亚胺(下文简写为EMCS)溶于二甲亚砜和乙醇的1∶1(体积比)溶剂混合物中，以获得0.3mg/ml的终浓度。结果，制备了EMCS溶液。此处，EMCS是N-(6-马来酰亚氨基己酰氧基)琥珀酰亚胺，购自Dojindo。
烘烤的玻璃基板保持静置并冷却，并在室温下浸泡到制备好的EMCS溶液中2小时。通过这个处理，通过硅烷偶联试剂引入到基板表面上的氨基基团和EMCS中的琥珀酰亚胺基团发生反应，将马来酰亚胺基团引入到玻璃基板表面上。使用上述溶有EMCS的溶剂混合物清洗从EMCS溶液中取出的玻璃基板。用乙醇进一步清洗玻璃基板并在氮气氛围中干燥。
4-3.探针DNA
将在实施例1的阶段1(探针DNA的制备)中制备的微生物检测探针溶于纯水。溶液配制为终浓度(溶解在墨水中时)为10μM。随后，溶液被冻干以去除水。
4-4.用BJ打印机吐出DNA并结合到基板上
制备含有7.5-wt％丙三醇、7.5-wt％硫二甘醇、7.5-wt％尿素和1.0-wt％Acetylenol EH(购自Kawaken Fine Chemicals公司)的水溶液。事先制备的三种探针(表1)中的每种探针按特定浓度溶于该溶剂混合物中。用所得到的DNA溶液充满喷墨打印机(商品名：BJF-850，购自Canon公司)的墨盒，并安装到打印头上。
此处所用的喷墨打印机事先已经被改良，能在平板上打印。当根据预定的文件创建方法输入打印模式时，可将大约5皮升DNA溶液以大约120μm的间距点样。
通过使用改良的喷墨打印机来对一片玻璃基板进行打印操作以制备阵列。在确证打印已经确实完成后，玻璃基板在潮湿的仓室中静置30分钟，让玻璃基板表面上的马来酰亚胺基团和核酸探针末端的巯基基团反应。
4-5.清洗
反应30分钟后，使用含有100mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)清洗表面残留的DNA溶液，由此获得DNA芯片，在该芯片中单链DNA被固定在玻璃基板的表面上。
5.分析物的扩增和标记
5-1.分析物的扩增：第一PCR
提供作为分析物的微生物基因的扩增反应(第一PCR)和标记反应(第二PCR)如下面表4所示。
表4
  AmpliTaq Gold LD (5.0U/μL)引物混合物<FR21x7>正向引物(x21[每种0.625μM])反向引物(x07[每种1.875μM])10x PCR缓冲液MgCl2(25mM)dNTP混合物(每种2.5mM)模板H2O     0.5μL(2.5单位/管)2.0μL(最终每种1.25pmol/管)(最终每种3.75pmol/管)5.0μL(最终1倍浓度)8.0μL(最终4.0mM)4.0μL(最终每种200μM)可变直到50μL
  总计     50μL
使用市售的热循环仪根据图1所示的操作流程进行具有上述的组成的反应溶液的扩增反应。反应结束后，使用纯化柱(QIAquick PCRPurification Kit，购自QIAGEN公司)纯化引物。随后进行扩增产物的定量测定。
5-2.标记反应：第二PCR
使用市售的热循环仪根据图2所示操作流程进行具有表5所示组成的反应溶液的扩增反应。
表5
Premix Taq (Ex Taq Version)Cy3-标记的反向引物混合物Cy3R9混合物(x06[每种10μM])模板H2O     25μL0.83μL(最终每种8.3 pmol/管)可变(最终30ng/管)直到50μL
总计     50μL
反应结束后，使用纯化柱(QIAquick PCR Purification Kit，购自QIAGEN)纯化引物来获得标记的分析物。
6.杂交
使用在阶段4(DNA芯片的制备)制备的DNA芯片和在阶段5(分析物的扩增和标记)制备的标记的分析物进行检测反应。
6-1.DNA芯片的封闭
牛血清白蛋白(BSA，Fraction V：购自Sigma公司)溶于100mMNaCl/10mM磷酸盐缓冲液中，获得1wt％的溶液。随后，在阶段4(DNA芯片的制备)制备的DNA芯片在室温下在所述溶液中浸泡2小时以进行封闭。封闭结束后，使用如下所述的清洗溶液清洗芯片，用纯水冲洗，并用旋转式干燥机脱水。
清洗溶液：含有0.1wt％十二烷基硫酸钠(SDS)的2×SSC溶液(NaCl 300mM，柠檬酸钠(柠檬酸三钠二水合物，C6H5Na3·2H2O)30mM，pH7.0)。
6-2.杂交
脱水的DNA芯片置于杂交仪(Hybridization Station，购自Genomic Solutions公司)。在杂交溶液中在下述条件下进行杂交反应。
6-3.杂交溶液
6×SSPE/10％甲酰胺/目标(所有第二PCR产物)/0.05wt％(6×SSPE：NaCl 900mM，NaH2PO4H2O 50mM，EDTA 6mM，pH，7.4)
6-4.杂交条件
65℃ 3分钟，55℃ 4小时，用2×SSC/0.1％SDS在50℃下清洗，用2×SSC/0.1％SDS在20℃下清洗(用H2O冲洗：手工)，并旋转甩干。
7.微生物基因组检测(荧光测定法)
杂交反应结束后用DNA芯片荧光检测器(GenePix 4000B，购自Axon公司)对DNA芯片进行荧光测定。结果，能够具有足够信号地、可高重复性地检测出梭状芽孢杆菌(属)。荧光测定结果显示于下面的表6。
表6
探针号 荧光强度
难辨梭状芽孢杆菌ATCC 51695 产气荚膜梭状芽孢杆菌JCM 1290 丁酸梭状芽孢杆菌ATCC 13949
108_G_CLO_01_01 52.2 3236.8 335.3
108_G_CLO_01_02 3905.0 55.3 60.3
108_G_CLO_01_03 76.5 2873.1 10040.1
8.和其它细菌菌种的杂交
为了证实表1所示探针组能特异性地只和梭状芽孢杆菌(属)杂交这一事实，和大肠埃希氏杆菌(JCM 1649)的杂交反应的结果显示于下面的表7。
表7
探针号 荧光强度
大肠埃希氏杆菌(JCM 1649)
108_G_CLO_01_01 50.0
108_G_CLO_01_02 50.0
108_G_CLO_01_03 50.0
9.结果
如从上面的描述可以看出的，制备了固定有能以特异性的方式只检测梭状芽孢杆菌(属)的探针组的DNA芯片。进一步地，使用这种DNA芯片能鉴定传染性疾病病原性细菌，因此来自于微生物的DNA探针的问题能被解决。换句话说，所述寡核苷酸探针能被大量地化学制备，同时它的纯化或浓缩能被控制。此外，对于微生物菌种的分类，能够提供探针组，所述探针组能汇总性地检测相同属的菌株，并能将它们从其它属细菌中区别性地检测出来。
进一步地，除了如上述的大肠埃希氏杆菌以外，对提取自上述(1)到(80)所示的细菌的每种核酸进行杂交反应。其结果证实，除了梭状芽孢杆菌(属)以外，对于那些细菌中的每种细菌，和大肠杆菌相似，没有观察到实质上的反应。
列于上述(1)到(80)的细菌是败血病病原性细菌，并且它们几乎覆盖了过去在人血液中检测到的所有的病原性细菌。因此，通过使用本实施方案的引物，血液中的传染性疾病病原性细菌的核酸能被提取出来并随后和本发明的探针进行杂交反应，由此能够以高准确性进行梭状芽孢杆菌(属)的鉴定。
进一步地，根据上述的实施例，通过完全地检测传染性疾病病原性细菌的16S rRNA基因，能够以高准确性且有效地确定传染性疾病病原性细菌的存在。
(实施例2)能同时确定多种细菌菌种的DNA芯片的制备
按照和实施例1的阶段1(探针DNA的制备)相似的方式，制备具有显示于下面表8的碱基序列的探针。
表8
感兴趣的细菌菌种(或属) 探针序列(5’→3’) SEQ ID NO.
普氏厌氧球菌(Anaerococcus prevotii) TCATCTTGAGGTATGGAAGGGAAAGTGG 35
GTGTTAGGTGTCTGGAATAATCTGGGTG 36
ACCAAGTCTTGACATATTACGGCGG 37
脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis) AAGGATTCCGGTAAAGGATGGGGATG 38
TGGAAACATGTCAGTGAGCAATCACC 39
多形类杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron) AAGAATTTCGGTTATCGATGGGGATGC 40
AAGTTTTCCACGTGTGGAATTTTGTATGT 41
AAGGCAGCTACCTGGTGACAGGAT 42
难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile) AATATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGGA 43
CCGTAGTAAGCTCTTGAAACTGGGAGAC 44
TCCCAATGACATCTCCTTAATCGGAGAG 45
产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens) AACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGAT 46
GAGCGTAGGCGGATGATTAAGTGGG 47
CCCTTGCATTACTCTTAATCGAGGAAATC 48
迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta) GGAAAGCCCAGACGGCAAGGGA 49
CCTCTCAAGCGGGATCTCTAATCCGA 50
TGCCCCATGTTGCCAGCATTAGG 51
坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum) TTTTCGCATGGAGGAATCATGAAAGCTA 52
AGATGCGCCGGTGCCCTTTCG 53
AGTCGGGAAGAAGTCAGTGACGGTAC 54
不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus) GAGTACGTGCGCAAGCATGAAACT 55
不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica) GAAGACTGCCCGCAAGGGTTGTAA 56
GTGTACTGGAGGTACGTGGAACGTG 57
GCATGAGGCTGAGAGGTCTCTTCC 58
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis) TTATAGCTGTAAGATAGGCATGCGTCCC 59
AACGGGCGATACGAGTATTGCATTGA 60
ATATACCGTCAAGCTTCCACAGCGA 61
鸟肠球菌(Enterococcus avium) TTTGAAAGGCGCTTTTGCGTCACTG 62
CAAGGATGAGAGTAGAACGTTCATCCCTTG 63
CAAGGATGAGAGTAGAATGTTCATCCCTTG 64
雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri) CCTGGGAATGGCATCTAAGACTGGTCA 65
GAGGAAGGCGTTGATGCTAATATCATCA 66
GAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTC 67
不动杆菌(属)(Acinetobacter) GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG 68
TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT 69
栖牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola) TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA 70
AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT 71
ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT 72
黄杆菌(属)(Flavobacterium) GGAAGTAACTAGAATATGTAGTGTAGCGGTG 73
GCCAGTGCAAACTGTGAGGAAGGT 74
GGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATC 75
气单胞菌(属)(Aeromonas) GAGTGCCTTCGGGAATCAGAACAC 76
CTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGA 77
类杆菌(属)(Bacteroides) CGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAA 78
TGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGT 79
TGTGGCTCAACCATAGAATTGCCGT 80
黑色消化球菌(Peptococcus niger) GTACCTGTAAGAAAGACGGCCTTCGT 81
CTGCCGAGTGATGTAATGTCACTTTTC 82
TCGGAGGTTTCAAGACCGTCGG 83
梭状芽孢杆菌(属)(Clostridium) ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG 84
ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG 85
ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC 86
痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes) GGGCTAATACCGGATAGGAGCTCCTG 87
AAGCGTGAGTGACGGTAATGGGTAAA 88
ATCGCGTCGGAAGTGTAATCTTGGG 89
弯曲杆菌(属)(Campylobacter) TGGAGCAAATCTATAAAATATGTCCCAGT 90
ACAGTGGAATCAGCGACTGGGG 91
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) GCCTAATACGTATCAACTGTGACGTTAC 92
GCCTAATACGTGTCAACTGTGACGTTAC 93
丙酸杆菌(属)(Propionibacterium) GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA 94
这些探针能特异性地检测列于表中左栏的特定细菌菌种(或属)，正如实施例1中的能特异性地针对梭状芽孢杆菌(属)的探针一样。
进一步地，这些探针被设计为它们具有和目标相同的Tm值、和非目标序列相同的反应性等，因此在相同的反应条件下，感兴趣的细菌菌种的核酸能被特异性地检测。
对于各个探针，按照和实施例1的阶段4-3相似的方式制备探针溶液。随后，使用在实施例1的阶段4-4中使用的喷墨打印机将每个探针溶液吐出到相同的基板上，形成具有以大约120μm的间隔排列的各个探针的点的多个DNA芯片。
按照和实施例1的阶段6相似的方式将所述DNA芯片之一用于和提取自梭状芽孢杆菌(属)的核酸杂交。结果，特异性检测梭状芽孢杆菌(属)的探针点显示出和实施例1几乎相等的荧光强度。相反，其它探针的点显示非常低的荧光强度。
进一步，使用其它制备的DNA芯片和表8所列的除梭状芽孢杆菌(属)以外的细菌杂交。结果，梭状芽孢杆菌(属)的点显示非常低的荧光强度，同时针对感兴趣的细菌菌种的探针的点显示非常高的荧光强度。因此，证实了本实施例制备的DNA芯片还能同时测定列于表8的除梭状芽孢杆菌(属)以外的16个细菌菌种和6个属。通过同时使用针对目标种和相应属(例如丙酸杆菌属和痤疮丙酸杆菌)的探针，能够高度准确地鉴定目标种或同时鉴定相同属的多个目标种。
(实施例3)
当分析物中存在多种细菌菌种时，尝试了使用实施例2所制备的DNA芯片进行检测。
制备其中培养有作为梭状芽孢杆菌(属)的痤疮丙酸杆菌和迟缓埃格特菌的培养基，并进行和实施例1相同的处理来和DNA芯片反应。
结果，只有具有SEQ ID NO.49、50、51、84、85和86的探针点显示高荧光强度，因此能同时证实这些细菌的共同存在。
本发明不局限于上述实施例，并且在本发明的精神和范围内可以进行多种改变和修饰。因此为了向公众通告本发明的范围，指定了下面的权利要求。
虽然已经用例示性实施方案描述了本发明，不过应该知道该发明不局限于公布的例示性实施方案。下面的权利要求的范围符合使之包括所有这些修改和相同的结构和功能的最广泛的解释。
序列表
<110>佳能株式会社
<120>探针、探针组、固定有探针的载体和基因检测方法
<130>10048393CN01
<150>JP2006-306008
<151>2006-11-10
<160>95
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>53
agatgcgccg gtgccctttc g                                                21
<210>54
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>54
agtcgggaag aagtcagtga cggtac                                           26
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>55
gagtacgtgc gcaagcatga aact                                             24
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>56
gaagactgcc cgcaagggtt gtaa                                             24
<210>57
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>57
gtgtactgga ggtacgtgga acgtg                                            25
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>58
gcatgaggct gagaggtctc ttcc                                             24
<210>59
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>59
ttatagctgt aagataggca tgcgtccc                                         28
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>60
aacgggcgat acgagtattg cattga                                           26
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>61
atataccgtc aagcttccac agcga                                            25
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>62
tttgaaaggc gcttttgcgt cactg                                            25
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>63
caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg                                       30
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>64
caaggatgag agtagaatgt tcatcccttg                                       30
<210>65
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>65
cctgggaatg gcatctaaga ctggtca                                          27
<210>66
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>66
gaggaaggcg ttgatgctaa tatcatca                                         28
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>67
gagcaaagca ggggaacttc ggtc                                             24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>68
gttggggcct ttgaggcttt agtg                                             24
<210>69
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>69
ggagaggatg gtagaattcc aggt                                             24
<210>70
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>70
tcgatgacgg catcagattc gaagca                                           26
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>71
aatgtaggcg cccaacgtct gact                                             24
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>72
atgttgaggt ccttcgggac tcct                                             24
<210>73
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>73
ggaagtaact agaatatgta gtgtagcggt g                                     31
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>74
gccagtgcaa actgtgagga aggt                                             24
<210>75
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>75
gggtaggggt cctgagaggg agatc                                            25
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>76
gagtgccttc gggaatcaga acac                                             24
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>77
ctgcaagcta gcgatagtga gcga                                             24
<210>78
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>78
cgatggatag gggttctgag aggaa                                            25
<210>79
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>79
tgcggctcaa ccgtaaaatt gcagt                                            25
<210>80
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>80
tgtggctcaa ccatagaatt gccgt                                            25
<210>81
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>81
gtacctgtaa gaaagacggc cttcgt                                           26
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>82
ctgccgagtg atgtaatgtc acttttc                                          27
<210>83
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>83
tcggaggttt caagaccgtc gg                                               22
<210>84
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>84
accaaaggag caatccgcta tgagatg                                          27
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>85
atcaaaggtg agccagtaca ggatgg                                           26
<210>86
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>86
attaaaggag taatccgcta tgagatggac c                                     31
<210>87
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>87
gggctaatac cggataggag ctcctg                                           26
<210>88
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>88
aagcgtgagt gacggtaatg ggtaaa                                           26
<210>89
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>89
atcgcgtcgg aagtgtaatc ttggg                                            25
<210>90
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>90
tggagcaaat ctataaaata tgtcccagt                                        29
<210>91
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>91
acagtggaat cagcgactgg gg                                               22
<210>92
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>92
gcctaatacg tatcaactgt gacgttac                                         28
<210>93
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>93
gcctaatacg tgtcaactgt gacgttac                                         28
<210>94
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>94
gctttcgata cgggttgact tgaggaa                                          27
<210>95
<211>1397
<212>DNA
<213>丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)
<400>95
ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgagcgatga agctccttcg     60
ggagtggatt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctca tagaggggaa    120
tagcctttcg aaaggaagat taataccgca taagattgta gtaccgcatg gtacagcaat    180
taaaggagta atccgctatg agatggaccc gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg    240
gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttgggactga    300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc    360
ctgatgcagc aacgccgcgt gagtgatgac ggtcttcgga ttgtaaagct ctgtctttag    420
ggacgataat gacggtacct aaggaggaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg    480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttactgggcg taaagggagc gtaggtggat    540
atttaagtgg gatgtgaaat acycgggctt aacctgggtg ctgcattcca aactggatat    600
ctagagtgca ggagaggaaa ggagaattcc tagtgtagcg gtgaaatgcg tagagattag    660
gaagaatacc agtggcgaag gcgcctttct ggactgtaac tgacactgag gctcgaaagc    720
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatactagg    780
tgtaggggtt gtcatgacct ctgtgccgcc gctaacgcat taagtattcc gcctggggag    840
tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat    900
gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctagac ttgacatctc ctgaattact    960
ctgtaatgga ggaagccact tcggtggcag gaagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc   1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt gttagttgct   1080
accatttagt tgagcactct agcgagactg cccgggttaa ccgggaggaa ggtggggatg   1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtctag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca   1200
atgagatgca acctcgcgag agtgagcaaa actataaaac cgatctcagt tcggattgta    1260
ggctgaaact cgcctacatg aagctggagt tgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg    1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt ggcaataccc    1380
aaagttcgtg agctaac                                                   1397

Claims (10)

1.用于检测传染性疾病病原性细菌梭状芽孢杆菌的基因的探针组，所述探针组包括用于特异性检测梭状芽孢杆菌的三个探针，所述三个探针分别由下述(1)到(3)中的碱基序列组成：
(1)ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG(SEQ ID NO.84)；
(2)ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG(SEQ ID NO.85)；
(3)ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC(SEQ ID NO.86)。
2.固定有探针的载体，其包含根据权利要求1的探针组的第一探针，其中所述探针互相间隔地排列在固相载体上。
3.根据权利要求2的固定有探针的载体，其中固定有探针的载体包含至少一个序列SEQ ID NO.35到94中任一个所示的、固定在与第一探针相分开的位置上的第二探针。
4.用于检测梭状芽孢杆菌的基因的试剂盒，包含：
根据权利要求1的探针组；和
用于检测探针组和目标核酸之间的反应的试剂。
5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述试剂含有用于扩增梭状芽孢杆菌的基因的引物，并且该引物包括：
(5)序列为5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：5)的寡核苷酸；
(12)序列为5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：12)的寡核苷酸；
(22)序列为5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO：22)的寡核苷酸；和
(27)序列为5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO：27)的寡核苷酸。
6.基因检测试剂盒，包含：
根据权利要求3的固定有探针的载体；和
用于检测探针和目标核酸之间的反应的试剂，
其中该试剂含有引物，所述引物包括选自下述(1)到(21)中的至少一个寡核苷酸和选自下述(22)到(28)中的至少一个寡核苷酸：
(1)序列为5’gcggcgtgcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：1)的寡核苷酸；
(2)序列为5’gcggcaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：2)的寡核苷酸；
(3)序列为5’gcggcaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：3)的寡核苷酸；
(4)序列为5’gcggtaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：4)的寡核苷酸；
(5)序列为5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：5)的寡核苷酸；
(6)序列为5’gcgggatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：6)的寡核苷酸；
(7)序列为5’gcggcatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：7)的寡核苷酸；
(8)序列为5’gcggcatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：8)的寡核苷酸；
(9)序列为5’gcggcgtgcttaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：9)的寡核苷酸；
(10)序列为5’gcggcaggcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO：10)的寡核苷酸；
(11)序列为5’gcgggatgctttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：11)的寡核苷酸；
(12)序列为5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：12)的寡核苷酸；
(13)序列为5’gcggcgtgcataacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：13)的寡核苷酸；
(14)序列为5’gcggcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：14)的寡核苷酸；
(15)序列为5’gcggcgcgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：15)的寡核苷酸；
(16)序列为5’gcggcgcgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：16)的寡核苷酸；
(17)序列为5’gcgtcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：17)的寡核苷酸；
(18)序列为5’gcgataggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：18)的寡核苷酸；
(19)序列为5’gcgacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：19)的寡核苷酸；
(20)序列为5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：20)的寡核苷酸；
(21)序列为5’acagaatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：21)的寡核苷酸；
(22)序列为5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO：22)的寡核苷酸；
(23)序列为5’atccaaccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO：23)的寡核苷酸；
(24)序列为5’atccagccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO：24)的寡核苷酸；
(25)序列为5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO：25)的寡核苷酸；
(26)序列为5’atccagcgccaggttcccctag 3’(SEQ ID NO：26)的寡核苷酸；
(27)序列为5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO：27)的寡核苷酸；和
(28)序列为5’atccagccgcacgttcccgtac 3’(SEQ ID NO：28)的寡核苷酸。
7.用于检测传染性疾病病原性细菌梭状芽孢杆菌的基因的探针组，由下述(A)到(C)的探针组成：
(A)由ACCAAAGGAGCAATCCGCTATGAGATG(SEQ ID NO.84)所示的碱基序列组成的探针；
(B)由ATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGG(SEQ ID NO.85)所示的碱基序列组成的探针；
(C)由ATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACC(SEQ ID NO.86)所示的碱基序列组成的探针。
8.固定有探针的载体，包含排列在固相载体上的权利要求7的探针组，其中构成探针组的探针彼此互相间隔地排列。
9.权利要求1的探针组在制备用于检测分析物中的梭状芽孢杆菌的基因的试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9的用途，其中所述试剂盒还进一步包括下述PCR引物：
(5)序列为5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：5)的碱基序列的寡核苷酸；
(12)序列为5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO：12)的寡核苷酸；
(22)序列为5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO：22)的寡核苷酸；和
(27)序列为5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO：27)的寡核苷酸。
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