WO2002102824A2 - Verfahren zum spezifischen schnellnachweis von trinkwasser relevanten bakterien - Google Patents

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WO2002102824A2
WO2002102824A2 PCT/EP2002/006809 EP0206809W WO02102824A2 WO 2002102824 A2 WO2002102824 A2 WO 2002102824A2 EP 0206809 W EP0206809 W EP 0206809W WO 02102824 A2 WO02102824 A2 WO 02102824A2
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Claudia Beimfohr
Jiri Snaidr
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Vermicon Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of bacteria in drinking and surface water, in particular a method for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species Legionella pneumophila by in situ hybridization and a method for the specific detection of faecal streptococci by means of in situ hybridization as well as a method for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli as well as corresponding oligonucleotide probes and kits with which the methods according to the invention can be carried out.
  • Legionella are gram-negative, non-spore-forming rod-shaped bacteria with a length of 0.5 - 20 ⁇ M and a diameter of 0.3 - 0.9 ⁇ m. They are motile due to their polar flagellation with one to three flagella. Legionella are ubiquitous residents of moist soils and all non-marine aquatic habitats. Ideal conditions for their propagation exist at temperatures between 25 ° C and 55 ° C. As a result, they can also be found in appropriate human-made habitats, such as Hot and cold water systems, cooling towers of air conditioning systems and water evaporators. As intracellular parasites of amoebas and ciliates, they can also have unfavorable living conditions such as extreme temperatures and chlorination of water survive.
  • Legionella are pathogens; they cause an acute bacterial pneumonia with an optionally lethal course in humans, which is commonly known as "legionnaires'disease". This name comes from the examination of a conspicuous accumulation of pneumonia cases (189 diseases with 29 deaths) among the approximately 3000 delegates of the annual meeting the "Pennsylvania Division of the American Legion” in July 1976. The investigation led to the isolation of a previously unknown bacterium, L. pneumophila (McDade et al., 1977. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease, N. Engl. J. Med.
  • E. coli as a so-called index organism, is a potential one in the analysis of food, drinking and surface water
  • the coliform bacteria represent an extremely heterogeneous group of bacteria.
  • the genera Escherichia, Enterobacter, Klebsiella and Citrobacter belong to the group of coliforms.
  • the affiliation of bacteria to this group is therefore not defined by taxonomic characteristics, but by the behavior of the bacteria in corresponding detection methods.
  • all gram-negative, aerobic, facultative anaerobic, rods are assigned to the coliforms, which ferment lactose within 48 hours at temperatures between 30 ° C and 37 ° C with the formation of gas and acid.
  • E. coli is by no means only used as an index bacterium in microbiological analyzes, but a number of pathogenic strains of this organism are known. These enterovirulent strains are divided into different subgroups (enterotoxin formers, enteropathogens, enterohemorrhagic, enteroinvasive, enteroadherent E. coli). All bacteria this Subgroups trigger diarrheal diseases of various degrees of severity up to life-threatening.
  • E. coli and coliforms are detected by cultivation, which leads to a result within two to four days through several successive cultivation steps on different media.
  • cultivation on Fluorocult LMX broth produces a result after only 30 hours.
  • the membrane filter method for the detection of E. coli (the detection of coliforms is not possible in this way) still takes 22 to 32 hours to get the result.
  • false positive results are not uncommon, since indole-positive Klebsiella oxytoca and Providencia axes are not uncommon in fresh meat.
  • Faecal streptococci are further indicators of faecal contamination of drinking and surface water. Similar to the coliforms, these are also a non-uniform group. Faecal streptococci are phylogenetically assigned to the genera Streptococcus and Enterococcus. These are Gram-positive bacteria, which typically form diplococci or short chains and are common in the intestinal tract of warm-blooded animals.
  • a limit value for faecal streptococci is also laid down in the German regulation for drinking water and water for food businesses, which was valid in 2001. No faecal streptococci should be detectable in 100 ml of drinking water, otherwise the examined water is no longer of drinking water quality.
  • the detection methods recommended in the Drinking Water Ordinance are based on direct cultivation of the water sample or on membrane filtration and subsequent introduction of the filter in 50 ml azide-glucose broth.
  • the cultivation should take place for at least 24 h, if the result is negative for 48 h, at 36 ° C. There is no turbidity or sediment formation in the broth even after 48 hours Ascertainable, the absence of faecal streptococci in the examined sample is considered to be proven.
  • the culture is smeared on enterococcal selective agar according to Slanetz-Barthley and incubated again at 36 ° C. for 24 h. If red-brown or pink colonies are formed, these are examined in more detail.
  • fecal streptococci After transfer to a suitable liquid medium and cultivation for 24 h at 36 ° C, fecal streptococci are considered to have been proven if they multiply in nutrient broth at pH 9.6 and multiply in 6.5% NaCl broth as well as in the case of asculin degradation.
  • the asculin breakdown is checked by adding freshly prepared 7% aqueous solution of iron (II) chloride to the asculin broth. A brown-black color develops when broken down.
  • a Gram stain is often used to distinguish the bacteria from Gram-negative cocci and a catalase test to distinguish between staphylococci. Faecal streptococci are Gram-positive and Catalase-negative. The traditional proof is thus a lengthy (48 - 100 h) and, if suspected, extremely complex procedure.
  • nucleic acid-based detection methods are therefore available.
  • PCR the polymerase chain reaction
  • a characteristic piece of the respective bacterial genome is amplified with specific primers. If the primer finds its destination, a piece of the genetic material multiplies millions of times.
  • a qualitative evaluation can take place. In the simplest case, this leads to the statement that the target sites for the primers used were present in the examined sample. No further statements are possible; these target sites can originate from a living bacterium as well as from a dead bacterium or from naked DNA. A Differentiation is not possible here. This is particularly problematic when examining samples for ubiquitous germs such as E. coli and coliforms.
  • PCR reaction Since the PCR reaction is positive even in the presence of a dead bacterium or naked DNA, false positive results often occur.
  • quantitative PCR in which an attempt is made to establish a correlation between the amount of bacteria present and the amount of amplified DNA.
  • the advantages of PCR lie in its high specificity, ease of use and in the short amount of time. Significant disadvantages are their high susceptibility to contamination and thus false positive results as well as the aforementioned lack of ability to differentiate between living and dead cells or naked DNA.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the FISH technique is based on the fact that there are certain molecules in bacterial cells that, due to their vital function, have undergone only little mutation in the course of evolution: the 16S and the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA). Both are components of the ribosomes, the sites of protein biosynthesis, and due to their ubiquitous distribution, their size, and their structural and functional constancy, they can serve as specific markers (Woese, CR, 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, p. 221 -271). Based on a comparative sequence analysis, phylogenetic relationships can be established based solely on this data. To do this, this sequence data must be aligned. Alignment, which is based on knowledge of the Supporting the secondary structure and tertiary structure of these macromolecules, the homologous positions of the ribosomal nucleic acids are brought into harmony with one another.
  • phylogenetic calculations can be carried out.
  • the use of the latest computer technology makes it possible to carry out large-scale calculations quickly and effectively, and to create large databases that contain the alignment sequences of the 16S rRNA and 23S rRNA. By quickly accessing this data material, newly obtained sequences can be analyzed phylogenetically in a short time.
  • These rRNA databases can be used to construct species- and genus-specific gene probes. Here, all available rRNA sequences are compared with each other and probes designed for specific sequence sites that specifically record a bacterial species, genus or group.
  • these gene probes which are complementary to a specific region on the ribosomal target sequence, are introduced into the cell.
  • the gene probes are usually small, 16-20 base long, single-stranded deoxyribonucleic acid pieces and are directed against a target region, which is typical for a type or group of bacteria. If the fluorescence-labeled gene probe finds its target sequence in a bacterial cell, it binds to it and the cells can be detected in the fluorescence microscope due to their fluorescence.
  • the FISH analysis is always carried out on a slide, since during the evaluation the bacteria are visualized, ie made visible, by irradiation with high-energy light.
  • this is one of the disadvantages of the classic FISH analysis: since only relatively small volumes can naturally be analyzed on a slide, the sensitivity of the method can be unsatisfactory and not sufficient for a reliable analysis.
  • the present invention therefore combines the advantages of classic FISH analysis with those of cultivation.
  • a comparatively short cultivation step ensures that the bacteria to be detected are present in sufficient numbers before the bacteria are detected using specific FISH.
  • “cultivation” means the multiplication of the bacteria contained in the sample in a suitable cultivation medium.
  • the methods suitable for this are well known to the person skilled in the art.
  • fixing the bacteria is understood to mean a treatment with which the bacterial envelope is made permeable to nucleic acid probes. Ethanol is usually used for fixing. If the cell wall cannot be penetrated by the nucleic acid probes with these measures, the person skilled in the art will know Sufficient additional measures are known that lead to the same result. These include, for example, methanol, Mixtures of alcohols, a low paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution, enzymatic treatments or the like.
  • the “fixed” bacteria are incubated with fluorescence-labeled nucleic acid probes for the “hybridization”.
  • These nucleic acid probes which consist of an oligonucleotide and a marker attached to it, can then penetrate the cell envelope and bind to the target sequence corresponding to the nucleic acid probe inside the cell.
  • the bond is to be understood as the formation of hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid.
  • the nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is advantageous to choose a nucleic acid probe that is complementary to an area that is present in the number of copies of more than 1 in the microorganism to be detected.
  • the sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times.
  • the rRNA is preferably used as the target site, since the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis are present thousands of times in each active cell.
  • the nucleic acid probe in the sense of the invention can be a DNA or RNA probe which is generally between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200, particularly preferably between 12 and 50 and between 15 and 40, and most preferably between 17 and 25 nucleotides.
  • the nucleic acid probes are selected on the basis of whether a complementary sequence is present in the microorganism to be detected. By selecting a defined sequence, a bacterial species, a bacterial genus or an entire bacterial group can be recorded. Complementarity should be at a probe of 15 Nucleotides must be given over 100% of the sequence. In the case of oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one or more mismatching sites are permitted.
  • stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid molecule actually hybridizes with the target sequence.
  • stringent conditions in the sense of the invention mean, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer.
  • “specifically hybridize” means that a molecule binds preferentially to a certain nucleotide sequence under stringent conditions if this sequence is present in a complex mixture of (for example total) DNA or RNA.
  • stringent conditions stands for conditions under which a probe will preferentially hybridize to its target sequence and to a significantly lesser extent or not at all to other sequences. Stringent conditions are in part sequence-dependent and will be different under different circumstances. Longer Sequences hybridize specifically at higher temperatures.
  • stringent conditions are selected so that the temperature is about 5 ° C below the thermal melting point (T m ) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH.
  • T m is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe molecules complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in an equilibrium state (since the target sequences are usually in excess, 50% of the probes are occupied in equilibrium) .
  • Typical stringent e Conditions where the salt concentration is at least about 0.01 to 1.0 M sodium ion concentration (or other salt) at a pH between 7.0 and 8.3 and the temperature is at least about 30 ° C for short probes (e.g. 10-50 Nucleotides).
  • stringent conditions can be achieved by adding destabilizing agents such as formamide.
  • the inventive method has
  • Nuclein probe molecules the following lengths and sequences (all sequences are given in the 5 '-3' direction).
  • Nucleic acid molecules or one of the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47 are complementary or hybridize specifically with them under stringent conditions.
  • the degree of sequence identity of a nucleic acid molecule with the probes SEQ ID No. 1 to SEQ JD No. 47 can be determined using conventional algorithms.
  • the program for determining sequence identity is suitable here, which is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (on this page e.g. the link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]").
  • hybridizing can be synonymous with complementary.
  • those oligonucleotides are also included which are those with the (theoretical) counter strand of an inventive one
  • Oligonucleotide including the modifications of SEQ ID No. 1 to 47, hybridize.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention can be used with various hybridization solutions as part of the detection method.
  • Nucleic acid probe molecule also actually hybridizes to the target sequence.
  • Moderate conditions in the sense of the invention are, for example, 0% formamide in one Hybridization buffer as described below.
  • Stringent conditions in the sense of the invention are, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer.
  • a typical hybridization solution contains 0% - 80% formamide, preferably 20% - 60% formamide, particularly preferably 35% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol 1, preferably 0.5 mol 1 - 1.0 mol / 1, more preferably 0.7 mol / 1 - 0.9 mol / 1, particularly preferably from 0.9 mol 1, the salt preferably being sodium chloride.
  • the hybridization solution usually comprises a detergent, such as e.g.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • Hybridization solution various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES can be used, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / 1, preferably from 0.01 to 0.08 mol / 1, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / 1 Tris-HCl, pH 8.0.
  • a typical hybridization solution contains 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 35% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / 1 - 1.5 mol / 1, preferably 0.5 mol / 1 - 1.0 mol 1, preferably 0.7 mol / 1 - 0.9 mol / 1 , particularly preferably of 0.9 mol / 1, the salt preferably being sodium chloride.
  • the hybridization solution usually comprises a detergent, such as sodium doo decyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% - 0.2%, preferably in a concentration of 0.005 - 0.05%, more preferably 0.01 - 0.03%, particularly preferably in a concentration of 0.01%.
  • a detergent such as sodium doo decyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium doo decyl sulfate
  • Various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PTPES or HEPES can be used to buffer the hybridization solution, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / 1, preferably from 0.01 to 0.08 mol 1 , in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / l Tris-HCl, pH 8.0.
  • a typical hybridization solution contains 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 50% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / l - 1.5 mol / l, preferably 0.7 mol / l - 0.9 mol / l, particularly preferably 0.9 mol l, which is Salt is preferably sodium chloride. Furthermore, the hybridization solution usually comprises a detergent, such as e.g.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • Hybridization solution various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES can be used, which are usually used in concentrations of 0.01-0.1 mol / l, preferably from 0.01 to 0.08 mol / l, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0.
  • the particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / l Tris-HCl, pH 8.0.
  • the concentration of the probe can vary greatly depending on the marking and the number of target structures to be expected. To enable fast and efficient hybridization, the amount of probes should be the number of
  • the amount of probe should therefore be in a range between 0.5 ng / ⁇ l and 500 ng / ⁇ l, preferably between 1.0 ng / ⁇ l and 100 ng / ⁇ l and particularly preferably 1.0–50 ng / ⁇ l.
  • the preferred concentration in the context of the method according to the invention is 1-10 ng of each nucleic acid molecule used per ⁇ l hybridization solution.
  • the volume of the hybridization solution used should be between 8 ⁇ l and 100 ml, in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention it is 40 ⁇ l.
  • the duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours.
  • Hybridization temperature is preferably between 44 ° C and 48 ° C, particularly preferably 46 ° C, the parameter of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and detergents in the hybridization solution depending on the nucleic acid probes, in particular their lengths and the Degree of complementarity to the target sequence in the cell to be detected can be optimized.
  • the person skilled in the art is familiar with the relevant calculations here.
  • This washing solution can, if desired, 0.001-0.1%) of a detergent such as SDS, a concentration of 0.01% being preferred, and Tris-HCl in a concentration of 0.001-0.1 mol / l, preferably 0 01-0.05 mol / l, particularly preferably 0.02 mol / l, the pH of Tris-HCl in the range from 6.0 to 9.0, preferably from 7.0 to 8.0, is particularly preferably 8.0.
  • a detergent may be included, but is not essential.
  • the washing solution usually also contains NaCl, the concentration depending on the stringency required being from 0.003 mol / l to 0.9 mol / l, preferably from 0.01 mol / l to 0.9 mol / l.
  • a NaCl concentration of 0.07 mol / l (method for simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella of the species L. pneumophila) or 0.07 mol / l (method for specific detection of faecal streptococci) or of 0.018 mol / l (method for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species E. coli).
  • the washing solution can contain EDTA in a concentration of up to 0.01 mol / l, the concentration preferably being 0.005 mol / l. Furthermore, the washing solution can also contain preservatives known to the person skilled in the art in suitable amounts.
  • buffer solutions are used in the washing step, which in principle can look very similar to hybridization buffers (buffered sodium chloride solution), except that the washing step is carried out in a buffer with a lower salt concentration or at a higher temperature.
  • Td 81.5 + 16.6 lg [Na +] + 0.4 x (% GC) - 820 / n - 0.5 X (% FA)
  • the “washing off” of the unbound nucleic acid probe molecules usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C. to 52 ° C., preferably from 44 ° C. to 50 ° C. and particularly preferably at 46 ° C. for a period of 10-40 minutes, preferably for 15 minutes.
  • the nucleic acid probe molecules according to the invention are used in the so-called Fast-FISH method for the specific detection of the specified target organisms.
  • the Fast FISH method is known to the person skilled in the art and is described, for example, in German patent application DE 199 36 875.9 and international application WO 99/18234. Reference is hereby expressly made to the disclosure contained in these documents for carrying out the detection methods described there.
  • the specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells. The prerequisite for this is that the nucleic acid probe molecule can be detected, for example by the nucleic acid probe molecule being linked to a marker by covalent binding.
  • fluorescent groups such as CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (also available from Amersham Life Sciences), CY5 (also available from Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (available from Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), TRITC
  • chromogens are known for each of these enzymes, which can be converted instead of the natural substrate and can be converted into either colored or fluorescent products. Examples of such chromogens are given in the table below:
  • nucleic acid probe molecules in such a way that a further nucleic acid sequence suitable for hybridization is present at their 5 'or 3' end.
  • This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15-50 nucleotides.
  • This second nucleic acid region can in turn be recognized by a nucleic acid probe molecule which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable nucleic acid probe molecules with a hapten, which can then be brought into contact with an antibody recognizing the hapten.
  • Digoxigenin can be cited as an example of such a hapten. The skilled worker is also well known about the examples given.
  • the final evaluation is possible depending on the type of marking of the probe used with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer etc.
  • Another advantage is the simultaneous detection of bacteria of the genus Legionella and the species Legionella pneumophila. So far, only bacteria of the species Legionella pneumophila can be detected with more or less great reliability using methods that have been familiar to date. Epidemiological studies have shown, however, that besides Legionella pneumophila also others Species of the genus Legionella that can cause dangerous Legionnaires' disease, eg Legionella micdadei. The sole detection of Legionella pneumophila must therefore, according to the current state of knowledge, no longer be considered sufficient.
  • Another advantage is the ability to differentiate between bacteria of the genus Legionella and those of the species Legionella pneumophila. This is easily and reliably possible through the use of differently labeled nucleic acid probe molecules.
  • nucleic acid probe molecules used can be used to specifically detect and visualize all species of the genus Legionella, but also highly specifically only the species L. pneumophila. All types of heterogeneous groups of faecal streptococci and coliforms are detected just as reliably, as are all subgroups of the species E. coli. By visualizing the bacteria, simultaneous visual control can take place. False positive results are therefore excluded.
  • the method can be used to easily test large quantities of samples for the presence of the bacteria mentioned.
  • environmental samples can be examined for the presence of Legionella.
  • these samples can be taken, for example, from water or from the ground.
  • the method according to the invention can also be used to examine medical samples. It is suitable, among other things, for the examination of samples from sputum, bronchoalveolar lavage or endotrachial suction. It is also suitable for the examination of tissue samples, eg biopsy material from the lungs, tumor or inflammatory tissue, from secretions such as sweat, saliva, sperm and discharge from the nose, urethra or vagina as well as for urine or stool samples.
  • Another area of application for the present method is the investigation of water, e.g. shower and bath water or drinking water.
  • the food samples are taken from milk or milk products (yoghurt, cheese, curd cheese, butter, buttermilk), drinking water, beverages (lemonades, beer, juices), baked goods or meat products.
  • Another area of application for the method according to the invention is the examination of pharmaceutical and cosmetic products, e.g. Ointments, creams, tinctures, juices, solutions, drops etc. are possible with the method according to the invention.
  • pharmaceutical and cosmetic products e.g. Ointments, creams, tinctures, juices, solutions, drops etc.
  • kits for carrying out the corresponding methods are also made available.
  • the hybridization arrangement included in these kits is e.g. described in German patent application 100 61 655.0.
  • the disclosure contained in this document regarding the in situ hybridization arrangement is hereby expressly incorporated by reference.
  • kits comprise the most important component of the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected (referred to as VIT solution).
  • VIT solution the most important component of the respective hybridization solution with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected
  • the corresponding hybridization buffer (Solution C) and a concentrate of the corresponding washing solution (Solution D) are also included. It also contains fixation solutions (Solution A and Solution B) and an embedding solution (Finisher). Finishers are commercially available, among other things they prevent the rapid fading of fluorescent probes under the fluorescence microscope. If necessary, solutions for the parallel execution of a positive control and a negative control are included.
  • a suitable aliquot of the fixed cells (preferably 40 ⁇ l) is applied to a slide and dried (46 ° C., 30 min or until completely dry).
  • the dried cells are then completely dehydrated by adding a further fixation solution (Solution B, absolute ethanol, preferably 40 ⁇ l).
  • Solution B absolute ethanol, preferably 40 ⁇ l.
  • the slide is dried again (room temperature, 3 min or until completely dry).
  • the hybridization solution (VIT solution) with the nucleic acid probe molecules described above for the microorganisms to be detected is then applied to the fixed, dehydrated cells.
  • the preferred volume is 40 ul.
  • the slide is then placed in a with hybridization buffer (Solution C, corresponds to the
  • Hybridization solution without probe molecules humidified chamber, preferably the VIT reactor, incubated (46 ° C, 90 min).
  • the slide is then removed from the chamber, the chamber is filled with washing solution (Solution D, 1:10 diluted in distilled water) and the slide is incubated in it (46 ° C, 15 min).
  • washing solution Solution D, 1:10 diluted in distilled water
  • the chamber is then filled with distilled water, the slide is briefly immersed and then air-dried in the lateral position (46 ° C, 30 min or until completely dry).
  • the slide is then embedded in a suitable medium (finisher).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Trink- und Oberflächenwasser, insbesondere ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies Legionella pneumophila durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken mittels in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli sowie entsprechende Oligonukleotidsonden und Kits, mit denen die erfindungsgemässen Verfahren durchgeführt werden können.

Description

Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis von Trinkwasser relevanten Bakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Trink- und Oberflächenwasser, insbesondere ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies Legionella pneumophila durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken mittels in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli sowie entsprechende Oligonukleotidsonden und Kits, mit denen die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.
Legionellen sind gram-negative, nicht sporenbildende stäbchenfbrmige Bakterien einer Länge von 0,5 - 20 μM und einem Durchmesser von 0,3 - 0,9 μm. Sie sind motil aufgrund ihrer polaren Begeißelung mit ein bis drei Flagellen. Legionellen sind ubiquitäre Bewohner feuchter Böden sowie aller nicht-marinen aquatischen Habitate. Ideale Bedingungen für ihre Vermehrung bestehen bei Temperaturen zwischen 25 °C und 55 °C. Folglich finden sie sich auch in vom Menschen geschaffenen entsprechenden Lebensräumen, wie z.B. Warm- und Kaltwasseranlagen, Kühltürmen von Klimaanlagen und Wasserverdunstem. Als intrazelluläre Parasiten von Amöben und Ciliaten können sie auch ungünstige Lebensbedingungen wie z.B. extreme Temperaturen und Chlorung von Wasser überleben.
Legionellen sind Krankheitserreger; sie verursachen beim Menschen eine akute bakterielle Pneumonie mit fakultativ letalem Verlauf, die allgemein unter dem Namen „Legionärskrankheit" bekannt ist. Dieser Name stammt von der Untersuchung einer auffälligen Häufung von Pneumoniefällen (189 Erkrankungen mit 29 Todesfällen) unter den etwa 3000 Delegierten des jährlichen Treffens der „Pennsylvania Division of the American Legion" im Juli 1976. Die Untersuchung führte zur Isolierung eines bis dahin unbekannten Bakteriums, L. pneumophila (McDade et al., 1977. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N. Engl. J. Med. 297(22): 1197- 203), das einer neuen Familie, den Legionellaceae, zugeordnet wurde (Brenner, D. J. 1979, Speciation in Yersinia, S. 33-43. In: Carter, P. B., Lafleur, L. und Toma, S. (Hrsg.), Contributions to microbiology and immunology, Vol. 5. Karger, Basel, Switzerland). Als weitere Form der durch Legionellen ausgelösten Erkrankung ist inzwischen das sogenannte Pontiac Fieber bekannt, welches durch grippeähnliche Symptome gekennzeichnet und nicht mit einer Pneumonie verbunden ist. Die Gründe dafür, dass Patienten die eine oder andere Erkrankungsform entwickeln, sind nicht bekannt.
Die Lebensbedrohlichkeit einer durch Legionellen ausgelösten Erkrankung sowie die Fähigkeit der Legionellen, auch unter ungünstigen Lebensbedingungen lange Zeit zu überdauern, belegen die Notwendigkeit eines schnellen und zuverlässigen Nachweisverfahrens.
Der traditionelle Nachweis von Legionellen mittels Kultivierung ist ein äußerst aufwendiges Verfahren, welches erst durch mehrere aufeinanderfolgende Kultivierungsschritte auf verschiedenen Medien innerhalb von sieben bis 14 Tagen zu einem Ergebnis führt.
Trotz des hohen damit verbundenen Aufwandes ist die Kultivierung bis heute das Mittel der Wahl zum Nachweis von Legionellen, da verschiedene alternative Verfahren die in sie gesetzten Erwartungen nicht erfüllen konnten.
So ist die Analyse verdächtiger Proben anhand biochemischer Parameter, wie der Ermittlung von Quinon-Profilen mittels HPLC oder der Fettsäurezusammensetzung mittels GLC-MS (z.B. Ehret et al., 1987, Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. [A], 266 (1-2), 261-75) für die Routine-Diagnose aufgrund des sehr hohen Geräte- und Zeitaufwandes ungeeignet. Außerdem stellt die sachgerechte Durchführung dieser Analysen höchste Anforderungen an die Qualifikation des ausführenden Personals. Die direkte Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antiköφern (DFA; direct fluorescent antibody staining) liefert Ergebnisse zwar bereits innerhalb weniger Stunden, die Methode ist aber weder ausreichend sensitiv noch ausreichend spezifisch. Nur zwischen 25 % und 70 % der mittels Kultivierung positiv getesteten Proben waren auch mittels DFA positiv (Zuravleff, J. L., V. L. Yu, J. L. Shonnard, 1983. Diagnosis of Legionnaires' disease and update of laboratory methods with new emphasis on isolation by culture. JAMA, Vol. 250, S. 1981-1985; Buesching, W. J., R. A. Brust, L. W. Ayers, 1983. Enhanced primary isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens by low pH treatment. J. Clin. Microbiol., Vol. 17, S. 153-1155; Edelstein, P. H., 1987. The laboratory diagnosis of Legionnaires' disease. Sem.
Respir. Infect., Vol. 2, S. 235-241.). Darüber hinaus sind zahlreiche Spezies bekannt, die durch Legionella DFA-Konjugate fälschlicherweise ebenfalls angefärbt werden, z.B. Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa und P. putida sowie verschiedene Bacteroides Species. Dies führt zwangsläufig immer wieder zu falsch positiven Ergebnissen. Außerdem problematisch bei diesem Testverfahren, ebenso wie bei allen anderen auf Antiköφerbindung beruhenden Verfahren (z.B. RIA, ELISA, IFA), ist außerdem die immense Vielzahl unterschiedlicher Legionella-Seτotypen. Die große Zahl der zur Detektion aller Serotypen somit erforderlichen Antisera ist kaum mehr zu handhaben, andererseits ist, bei Beschränkung auf einige wenige Antisera, die Aussagekraft eines negativen Testergebnisses unvertretbar gering.
Auf Escherichia coli und coliforme Bakterien, als sogenannte Markerorganismen, wird bei zahlreichen mikrobiologischen Analysen untersucht. Während beispielsweise bei der Untersuchung von Lebensmitteln, Trink- und Oberflächenwassern E. coli, als sogenannter Indexorganismus, eine potentielle
Gesundheitsgefährdung anzeigt, gelten coliforme Bakterien als Indikatoren für eine generell unzureichende Hygiene. Die Untersuchung mikrobiologischer Proben auf Index- und Indikatororganismen ermöglicht es auf die aufwendige Untersuchung derselben Proben auf eine Vielzahl von Krankheitserregern zu verzichten, da die Anwesenheit dieser Bakterien wird allgemein ein Hinweis auf fäkale Verunreinigungen ist. Dadurch ist eine mögliche Anwesenheit anderer pathogener Keime sehr wahrscheinlich.
Die coliformen Bakterien stellen eine äußerst heterogene Bakteriengruppe dar. Zur Gruppe der Coliformen gehören die Genera Escherichia, Enterobacter, Klebsiella und Citrobacter. Die Zugehörigkeit von Bakterien zu dieser Gruppe ist somit nicht durch taxonomische Merkmale definiert, sondern durch das Verhalten der Bakterien in entsprechenden Nachweisverfahren. Insofern werden den Coliformen alle gramnegativen, aeroben, fakultativ anaeroben, Stäbchen zugeordnet, welche Laktose unter Gas- und Säurebildung innerhalb von 48 Stunden bei Temperaturen zwischen 30 °C und 37 °C fermentieren. Coliforme, die unter höheren Temperaturen, nämlich bei 44 °C bis 45,5 ° C Laktose zu fermentieren vermögen, werden auch als Fäkal- Coliforme, thermotrophe Coliforme oder präsumtive E. coli bezeichnet.
Während der Sinn des Coliformen-Nachweises inzwischen durchaus umstritten ist (Means, E. G., Olson, B. H., 1981. Coliforms inhibition by bacteriocin-like substances in drinking water distribution Systems. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 42, S. 506-512; Burlingame, G. A.; McElhaney, J.; Pipes, W. O., 1984. Bacterial interference with coliform colony sheen production on membrane filters. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 47, S. 56-60; Schmidt-Lorenz et al., 1988, Kritische
Überlegungen zum Aussagewert von E. coli, Coliformen und Enterobacteriaceen in Lebensmitteln, Arch. Lebensmittelhyg. 39, 3-15.) steht der Wert des Nachweises von E. coli als Markerorganismus außer Frage.
Darüber hinaus dient E. coli keineswegs nur als Indexbakterium in mikrobiologischen Analysen, sondern es sind eine Reihe pathogener Stämme dieses Organismus bekannt. Diese enterovirulenten Stämme werden in verschieden Subgruppen (Enterotoxinbildner, Enteropathogene, Enterohämorrhagische, Enteroinvasive, Enteroadhärente E. coli) eingeteilt. Alle Bakterien dieser Subgruppen lösen Durchfallerkrankungen unterschiedlicher Schweregrade bis hin zur Lebensbedrohlichkeit aus.
Standardmäßig erfolgt der Nachweis von E. coli und Coliformen mittels Kultivierung, die durch mehrere aufeinanderfolgende Kultivierungsschritte auf verschiedenen Medien innerhalb von zwei bis vier Tagen zu einem Ergebnis führt. Als alternatives Kultivierungsverfahren bringt die Kultivierung auf Fluorocult LMX- Bouillon bereits nach 30 Stunden ein Ergebnis. Auch das Membranfilterverfahren zum Nachweis von E. coli (der Nachweis von Coliformen ist so nicht möglich) benötigt immer noch 22 bis 32 Stunden bis zum Ergebnis. Hierbei kommt es jedoch nicht selten zu falsch positiven Ergebnissen, da gerade bei Frischfleisch nicht selten Indol-positive Klebsiella oxytoca und Providencia-Axten vorkommen.
Als weitere Indikatoren für Fäkalkontaminationen von Trink- und Oberflächenwasser gelten die sogenannten Fäkalstreptokokken. Ähnlich wie die Coliformen sind auch diese eine uneinheitliche Gruppe. Fäkalstreptokokken werden welche phylogenetisch den Gattungen Streptococcus und Enterococcus zugeordnet. Es handelt sich um Gram-positive Bakterien, welche typischerweise Diplokokken oder kurze Ketten bilden, und im Intestinaltrakt von Warmblütern verbreitet sind.
In der im Jahre 2001 gültigen Deutschen Verordnung für Trinkwasser und Wasser für Lebensmittelbetriebe ist auch ein Grenzwert für Fäkalstreptokokken festgelegt. In 100 ml Trinkwasser dürfen keine Fäkalstreptokokken nachweisbar sein, andernfalls hat das untersuchte Wasser keine Trinkwasserqualität mehr.
Die in der Trinkwasserverordnung empfohlenen Nachweisverfahren basieren auf direkter Kultivierung der Wasseφrobe oder auf Membranfiltration und anschließendem Einbringen des Filters in 50 ml Azid-Glucose-Bouillon. Die Kultivierung soll für mindestens 24 h, bei negativem Ergebnis für 48 h, bei 36 °C erfolgen. Ist auch nach 48 h keine Trübung oder Sedimentbildung der Bouillon feststellbar, gilt die Abwesenheit von Fäkalstreptokokken in der untersuchten Probe als belegt. Im Falle einer Trübung oder Sedimentbildung erfolgt ein Ausstrich der Kultur auf Enterokokken-Selektivagar nach Slanetz-Barthley und die erneute Inkubation bei 36 °C für 24 h. Im Falle der Bildung rotbrauner bzw. rosafarbener Kolonien werden diese genauer untersucht. Nach Überführung in ein geeignetes Flüssigmedium und Kultivierung für 24 h bei 36 °C, gelten Fäkalstreptokokken als nachgewiesen, wenn eine Vermehrung in Nährbouillon bei pH 9,6 erfolgt und Vermehrung in 6,5 % NaCl-Bouillon möglich ist sowie bei Äsculinabbau. Der Äsculinabbau wird durch Zugabe von frisch hergestellter 7%iger wässriger Lösung von Eisen(II)-chlorid zur Asculinbouillon geprüft. Bei Abbau entsteht eine braunschwarze Farbe. Häufig wird zusätzlich eine Gramfärbung zur Unterscheidung der Bakterien von Gram-negativen Kokken durchgeführt sowie ein Katalasetest zur Unterscheidung von Staphylokokken durchgeführt. Fäkalstreptokokken reagieren Gram-positiv und Katalase-negativ. Der traditionelle Nachweis stellt sich somit als langwieriges (48 - 100 h) und im Verdachtfall überaus aufwendiges Verfahren dar.
Als logische Konsequenz aus den Schwierigkeiten, welche die oben genannten Verfahren beim Nachweis von Legionellen, E. coli und Coliformen sowie Fäkalstreptokokken haben, bieten sich daher Nachweisverfahren auf Nukleinsäurebasis an.
Bei der PCR, der Polymerase-Kettenreaktion wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Bakteriengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA- Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Dies ist insbesondere bei der Untersuchung von Proben auf ubiquitäre Keime wie E. coli und Coliforme problematisch. Da die PCR-Reaktion auch bei Anwesenheit eines toten Bakteriums oder nackter DNA positiv ausfallt, kommt es hier häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Eine Weiterführung dieser Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Bakterien und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität, leichten Anwendbarkeit und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und damit falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden.
Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität der molekularbiologischen Methoden wie der PCR mit der Möglichkeit der Bakterienvisualisierung, wie sie die Antiköφer- Methoden ermöglichen, zu verbinden, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ- Hybridisierung (FISH; Amann, R. I., W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, - gattungen oder -gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert werden.
Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und fünktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C. R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271). Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Jm Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht.
Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszuführen, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen.
Bei der FISH (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i.d.R. kleine, 16-20 Basen lange, einzelsträngige Desoxyribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.
Die FISH- Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgeführt, da bei der Auswertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden. Hierin liegt allerdings einer der Nachteile der klassischen FISH- Analyse: da auf einem Objektträger naturgemäß nur relative kleine Volumina analysiert werden können, kann die Sensitivität der Methode unbefriedigend und für eine verlässliche Analyse nicht ausreichend sein. Mit der vorliegenden Erfindung werden daher die Vorteile der klassischen FISH- Analyse mit denen der Kultivierung verknüpft. Durch einen vergleichsweise kurzen Kultivierungsschritt wird sichergestellt, dass die nachzuweisenden Bakterien in ausreichender Zahl vorliegen, bevor der Nachweis der Bakterien mittels spezifischer FISH durchgeführt wird.
Die Durchführung der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella sowie der Spezies L. pneumophila oder zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken oder zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli umfasst somit die folgenden Schritte:
- Kultivierung der in der untersuchten Probe enthaltenen Bakterien
- Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien
- Inkubation der fixierten Bakterien mit Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
- Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle und
- Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Kultivieren" die Vermehrung der in der Probe enthaltenen Bakterien in einem geeigneten Kultivierungsmedium verstanden. Die hierzu geeigneten Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niedeφrozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung, enzymatische Behandlungen oder ähnliches.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die „Hybridisierung" die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden inkubiert. Diese Nukleinsäuresonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die der Nukleinsäuresonde entsprechenden Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.
Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 - 100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000 - 50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.
Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen 12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200, besonders bevorzugt zwischen 12 und 50 und zwischen 15 und 40, und am meisten bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide umfassen wird. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz, kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.
Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuremolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Wie im folgenden noch erläutert, bedeuten stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung bspw. 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer.
Darüber hinaus können stringente Hybridisierungsbedingungen natürlich auch der Literatur und Standardwerken entnommen werden (wie z.B. dem Manual von
Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Allgemein bedeutet "spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z.B. Gesamt-) DNA oder RNA vorliegt. Der Begriff „stringente Bedingungen" steht für Bedingungen, unter denen eine Sonde präferenziell an ihre Zielsequenz hybridisieren wird, und zu einem deutlich geringeren Ausmaß oder überhaupt nicht an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind z.T. Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5 °C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Sondenmoleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. (Da die Targetsequenzen in der Regel im Überschuss vorliegen, sind im Gleichgewicht 50% der Sonden besetzt). Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen- Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 beträgt und die Temperature mindestens ungefähr 30 °C für kurze Sonden (also z.B. 10-50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen, wie oben bereits erwähnt, durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren haben die erfindungsgemäßen
Nukleinsondenmoleküle die folgenden Längen und Sequenzen (alle Sequenzen sind in 5 '-3 '-Richtung angegeben).
Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila:
5'- cac tac cct ctc cca tac
5Λ- cac tac cct ctc cta tac
5'- c cac cac cct ctc cca tac
5'- c cac ttc cct ctc cca tac 5 Λ - c cac tac cct ctc ccg tac
5'- c cac tac cct cta cca tac
5'- 1 atc tga ccg tcc cag gtt a
Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken: 5'- ccc tct gat ggg tag gtt
5V- ccc tct gat ggg cag gtt
5'- tag gtg ttg tta gca ttt cg
5'- cac tcc tct ttt tcc ggt
5'-c cac ttc tct ttt tcc ggt 5 ' - c cac tct tct ttt tcc ggt
5'- c cac tct tct ttt ccc ggt
5' -cac aca atc gta aca tcc ta
5Λ- agg gat gaa ctt tcc act c
5V- cca ctc att ttc ttc egg 5%-ccc ccg ctt gag ggc agg 5 - cct ctt ttc ccg gtg gag 5'- cct ctt ttt ccg gtg gag c 5'- cac tcc tct ttt cca atg a 5Λ- cac tcc tct tac ttg gtg 5'- tag gtg cca gtc aaa ttt tg 5'- ccc ctt ctg atg ggc agg 5'- ccc cct ctg atg ggc agg 5"- cga ctt cgc aac tcg ttg 5"- cga ctt cgc gac tcg ttg 5'- cga gtt cgc aac tcg ttg
Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli: 5' gac ccc ctt gcc gaa a 5' atg acc ccc tag ccg aaa
5Λ- ggc aca acc tcc aag tcg ac
5'- gga caa cca gcc tac atg et
5'- aca aga ctc cag cct gcc
5'- cag geg gtc tat tta aeg cgt t 5'- ggc aca acc tcc aaa tcg ac
5'- ggc cac aac ctc caa gta ga
5'- acc aca ctc cag cct gcc
5'- aca aga ctc tag cct gcc
5'- ggc ggt cga ttt aac geg tt 5 '- ggc ggt cta ctt aac geg tt
5'- ggc ggt cta ttt aat geg tt
5'- agc tcc gga agc cac tcc tca
5λ- gga aca acc tcc aag tcg 5'- gcc aca acc tcc aag tag
5λ- atg gcc ccc tag ccg aaa
5'- g atg acc ccc tag ccg aaa
5'- aac ctt geg gcc gta ctc cc
Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotidsequenzen, die trotz der Abweichungen in der Sequenz und/oder Länge eine spezifische Hybridisierung mit Ziel-Nukleinsäuresequenzen des jeweiligen Bakteriums zeigen und somit für den Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Hierunter fallen insbesondere a) Nukleinsauremolekule, die (i) mit einer der obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) in mindestens 80 %, 84 %, 87 % und bevorzugt in mindestens 90 %, 92 % und besonders bevorzugt in mindestens 94 %, 96 %, 98% der Basen übereinstimmen (wobei der Sequenzbereich des Nukleinsäuremoleküls zu betrachten ist, der dem Sequenzbereich eines der oben angegebenen Oligonukleotide (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) entspricht, und nicht etwa die gesamte Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das u.U. im Vergleich zu den oben angegebenen Oligonukleotiden (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) um eine bis zahlreiche Basen verlängert ist) oder (ii) sich von obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No.
47) durch eine oder mehr Deletionen und/oder Additionen unterscheiden und die eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila, von Fäkalstreptokokken oder von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli ermöglichen. Dabei bedeutet „spezifische Hybridisierung", dass unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-Hybridisierungstechniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel-Organismen, nicht aber die rRNA von Nicht-Ziel-Organismen an das Oligonukleotid bindet. b) Nukleinsauremolekule, die mit den unter a) genannten
Nukleinsäuremolekülen oder einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47 komplementär sind oder mit diesen unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisieren. c) Nukleinsauremolekule, die eine Oligonukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47 oder die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach a) oder b) umfassen und zusätzlich zu den genannten Sequenzen bzw. deren Abwandlungen nach a) oder b) mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen, und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Ziel- Organismen ermöglichen.
Der Grad der Sequenzidentität eines Nukleinsäuremoleküls mit den Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ JD No. 47 kann mit üblichen Algorithmen bestimmt werden. Geeignet ist hier beispielsweise das Programm zur Bestimmung der Sequenzidentität, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (auf diese Seite z.B. der Link „Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist.
„Hybridisieren" kann im Rahmen dieser Erfindung gleichbedeutend sein mit komplementär. Im Rahmen dieser Erfindung sind auch solche Oligonukleotide umfasst, die mit dem (theoretischen) Gegenstrang eines erfindungsgemäßen
Oligonukleotids, einschließlich der erfindungsgemäßen Abwandlungen der SEQ ID No. 1 bis 47, hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle können im Rahmen des Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden.
Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0 -
80 % eingesetzt werden. Durch das Einhalten von stringenten
Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das
Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 35 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol 1, bevorzugt von 0,5 mol 1 - 1,0 mol/1, bevorzugter von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol 1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter von 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der
Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium- Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/1 eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/1, in einem pH- Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/1 Tris- HCl, pH 8,0.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 35 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/1 - 1,5 mol/1, bevorzugt von 0,5 mol/1 - 1,0 mol 1, bevorzugt von 0,7 mol/1 - 0,9 mol/1, besonders bevorzugt von 0,9 mol/1, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdo- decylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium- Citrat, PTPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/1 eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol l, in einem pH-Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/l Tris- HCl, pH 8,0.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und der Spezies E. coli enthält eine typische Hybridisierungslösung 0 % - 80 % Formamid, bevorzugt 20 % - 60 % Formamid, besonders bevorzugt 50 % Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/l - 1,5 mol/l, bevorzugt von 0,7 mol/l - 0,9 mol/l, besonders bevorzugt von 0,9 mol l, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001 % - 0,2 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005 - 0,05 %, bevorzugter 0,01 - 0,03 %, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 %. Zum Puffern der
Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium- Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/l eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/l, in einem pH- Wert-Bereich von 6,0 - 9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/l Tris- HCl, pH 8,0.
Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der Bestandteile des Hybridisierungspuffer derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausfübrungsformen geben stringente bis besonders stringente Hybrisidierungs- bedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Ziel-Organismen ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kann.
Die Konzentration der Sonde, kann je nach Markierung und Anzahl der zu erwartenden Zielstruktur stark schwanken. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Sondenmenge die Anzahl der
Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonde zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Menge an Sonde sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 ng/μl und 500 ng/μl, bevorzugt zwischen 1,0 ng/μl und 100 ng/μl und besonders bevorzugt bei 1,0 - 50 ng/μl liegen.
Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1-10 ng jedes verwendeten Nukleinsäuremoleküls pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren beträgt es 40 μl.
Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die
Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.
Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Nukleinsäuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1%) eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01% bevorzugt wird, sowie Tris-HCl in einer Konzentration von 0,001-0,1 mol/l, bevorzugt 0,01-0,05 mol/l, besonders bevorzugt 0,02 mol/l, enthalten, wobei der pH- Wert von Tris-HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 7,0 bis 8,0, besonders bevorzugt bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 mol/l bis 0,9 mol/l, bevorzugt von 0,01 mol/l bis 0,9 mol/l, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von 0,07 mol/l (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella der Spezies L. pneumophila) bzw. von 0,07 mol/l (Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken) bzw. von 0,018 mol/l (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli). Des Weiteren kann die Waschlösung EDTA in einer Konzentration bis zu 0,01 mol/l enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 mol/l beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.
Allgemein kommen bei dem Waschschritt Pufferlösungen zum Einsatz, die prinzipiell sehr ähnlich aussehen können, wie Hybridisierungspuffer (gepufferte Natriumchloridlösung), nur dass der Waschschritt in einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration, bzw. bei höherer Temperatur durchgeführt wird.
Zur theoretischen Abschätzung der Hybridisierungsbedingungen kann folgende Formel verwendet werden: Td = 81,5 + 16,6 lg[Na+] + 0,4 x (% GC) - 820/n - 0,5 X (% FA)
Td = Dissoziationstemperatur in °C [Na+] = Molarität der Natriumionen
% GC = Anteil der Guanin- und Cytosinnukleotide an der Anzahl der Basen n = Länge des Hybrids % FA= Formamidgehalt
Mit Hilfe dieser Formel kann z.B. der Formamidanteil (der wegen der Toxizität des Formamids möglichst gering sein sollte) des Waschpuffers ersetzt werden durch einen entsprechend niedrigeren Natriumchloridgehalt. Allerdings ist dem Fachmann aus der umfangreichen Literatur zu in situ-Hybridisierungsmethoden bekannt, dass und aufweiche Weise die genannten Bestandteile variiert werden können. Bezüglich der Stringenz der Hybrdisierungsbedmgungen gilt das oben im Zusammenhang mit dem Hybridisierungspuffer Gesagte.
Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 46 °C für eine Dauer von 10 - 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle im sogenannten Fast-FISH- Verfahren zum spezifischen Nachweis der angegebenen Ziel-Organismen eingesetzt. Das Fast-FISH- Verfahren ist dem Fachmann bekannt und z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 199 36 875.9 und der internationalen Anmeldung WO 99/18234 beschrieben. Auf die in diesen Dokumenten enthaltene Offenbarung zur Durchführung der dort beschriebenen Nachweisverfahren wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresondenmolekül nachweisbar ist, z.B. dadurch dass das Nukleinsäuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z.B. fluoreszierende Gruppen wie z.B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC
(erhältlich von Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6-FAM oder FLUOS-PRTME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
Tabelle
Enzyme Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und 4-Methylumbelliferylphosphat (*), saure Phosphatase Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), (*) 3-O- Methylfluoreszein, Flavon-3- Diphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*), 3-(p-Hydroxyphenyl)- Propionsäure (*), p-Hydroxyphenethyl- alkohol(*), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolin- sulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamin- dihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicyl- säure, p-Ucresol (*), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase H2O2 + Diammoniumbenzidin H2O2 + Tetramethylbenzidin
4. ß-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl- ß -D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau
*Fluoreszenz
Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, dass an ihrem 5 '- oder 3 '-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Nukleinsäuresondenmolekül erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antiköφer in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.
Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.
Ein wichtiger Vorteil der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila oder zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken oder Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli gegenüber den weiter oben beschriebenen Nachweismethoden ist die Schnelligkeit. Im Vergleich zu herkömmlichen Kultivierungsverfahren, die sieben bis 14 Tage für den Nachweis von Legionellen, 48 bis 100 Stunden für den Nachweis von Fäkalstreptokokken bzw. 30 bis 96 Stunden für den Nachweis von coliformen Bakterien und E. coli benötigen, liegt das Ergebnis bei Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren innerhalb von 24 - 48 Stunden vor.
Ein weiterer Vorteil liegt im gleichzeitigen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies Legionella pneumophila. Mit bislang geläufigen Verfahren können lediglich Bakterien der Spezies Legionella pneumophila mit mehr oder weniger großer Zuverlässigkeit nachgewiesen werden. Epidemiologische Untersuchungen haben aber gezeigt, dass neben Legionella pneumophila auch andere Spezies der Gattung Legionella die gefährliche Legionärskrankheit auslösen können, z.B. Legionella micdadei. Der alleinige Nachweis von Legionella pneumophila muss daher nach dem heutigen Kenntnisstand als nicht länger ausreichend angesehen werden.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Gattung Legionella und denen der Spezies Legionella pneumophila. Diese ist durch die Verwendung unterschiedlich markierter Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Spezifität dieser Verfahren. Durch die verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküle können sowohl spezifisch sämtliche Arten der Gattung Legionella, aber auch hochspezifisch nur die Spezies L. pneumophila nachgewiesen und visualisiert werden. Ebenso zuverlässig werden sämtliche Arten der heterogenen Gruppen der Fäkalstreptokokken und der Coliformen nachgewiesen sowie sämtliche Subgruppen der Spezies E. coli. Durch die Visualisierung der Bakterien kann eine gleichzeitige visuelle Kontrolle stattfinden. Falsch positive Ergebnisse sind somit ausgeschlossen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren liegt in der leichten
Handhabbarkeit. So können durch die Verfahren leicht große Mengen an Proben auf das Vorhandensein der genannten Bakterien getestet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können vielfältig angewendet werden.
So können beispielsweise Umweltproben auf das Vorhandensein von Legionellen untersucht werden. Diese Proben können hierzu z.B. aus Wasser oder aus dem Boden entnommen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist u.a. für die Untersuchung von Proben aus Sputum, Bronchoalveolärer Lavage oder endotrachialer Absaugung geeignet. Es ist des weiteren für die Untersuchung von Gewebeproben, z.B. Biopsiematerial aus der Lunge, Tumor- oder entzündlichem Gewebe, aus Sekreten wie Schweiß, Speichel, Sperma und Ausfluß aus der Nase, Harnröhre oder Vagina sowie für Urin- oder Stuhlproben geeignet.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende Verfahren ist die Untersuchung von Wässern, z.B. Dusch- und Badewässern oder Trinkwasser.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Kontrolle von Lebensmitteln. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte, Lösungen, Tropfen etc. ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.
Erfindungsgemäß werden weiterhin drei Kits zur Durchführung der entsprechenden Verfahren zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene Hybridisierungsanordnung ist z.B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ-Hybridisierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reactor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die jeweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen (als VIT-Lösung bezeichnet). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisierungspuffer (Solution C) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung (Solution D). Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixierungslösungen (Solution A und Solution B) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u.a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken:
Beispiel
Spezifischer Schnellnachweis trinkwasserrelevanter Bakterien in einer Probe
Eine Probe wird in geeigneter Weise 20 - 44 h kultiviert. Verschiedene hierzu geeignete Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Zu einem Aliquot dieser Kultur wird dasselbe Volumen Fixierungslösung (Solution A, 50% Ethanol) zugegeben.
Zur Durchführung der Hybridisierung wird ein geeignetes Aliquot der fixierten Zellen (bevorzugt 40 μl) auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken). Anschließend werden die getrockneten Zellen vollständig dehydratisiert durch Zusatz einer weiteren Fixierungslösung (Solution B, Ethanol absolut, bevorzugt 40 μl). Der Objektträger wird erneut getrocknet (Raumtemperatur, 3 min oder bis vollständig trocken). Anschließend wird auf die fixierten, dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung (VIT-Lösung) mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen aufgebracht. Das bevorzugte Volumen beträgt 40 μl. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungspuffer (Solution C, entspricht der
Hybridisierungslösung ohne Sondenmoleküle) befeuchteten Kammer, bevorzugt dem VIT-Reaktor, inkubiert (46 °C, 90 min).
Anschließend wird der Objektträger aus der Kammer entnommen, die Kammer mit Waschlösung befüllt (Solution D, 1:10 verdünnt in destilliertem Wasser) und der Objektträger in dieser inkubiert (46 °C, 15 min).
Anschließend wird die Kammer mit destilliertem Wasser befüllt, der Objektträger kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Medium (Finisher) eingebettet.
Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Oligonukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ) Oligonukleotiden mit einer der nachfolgenden Nukleotidsequenzen (jeweils in '->3'-Richtung) '- cac tac cct ctc cca tac '- cac tac cct ctc cta tac '- c cac cac cct ctc cca tac '- c cac ttc cct ctc cca tac '- c cac tac cct ctc ccg tac Λ- c cac tac cct cta cca tac '- 1 atc tga ccg tcc cag gtt a '- ccc tct gat ggg tag gtt ' - ccc tct gat ggg cag gtt Λ- tag gtg ttg tta gca ttt cg Λ- cac tcc tct ttt tcc ggt Λ-c cac ttc tct ttt tcc ggt "- c cac tct tct ttt tcc ggt Λ - c cac tct tct ttt ccc ggt " -cac aca atc gta aca tcc ta Λ- agg gat gaa ctt tcc act c Λ- cca ctc att ttc ttc egg Λ-ccc ccg ctt gag ggc agg '- cct ctt ttc ccg gtg gag '- cct ctt ttt ccg gtg gag c "- cac tcc tct ttt cca atg a '- cac tcc tct tac ttg gtg Λ- tag gtg cca gtc aaa ttt tg '- ccc ctt ctg atg ggc agg V- ccc cct ctg atg ggc agg λ- cga ctt cgc aac tcg ttg λ- cga ctt cgc gac tcg ttg Λ- cga gtt cgc aac tcg ttg ' gac ccc ctt gcc gaa a ' atg acc ccc tag ccg aaa '- ggc aca acc tcc aag tcg ac Λ- gga caa cca gcc tac atg et '- aca aga ctc cag cct gcc '- cag geg gtc tat tta acg cgt t '- ggc aca acc tcc aaa tcg ac '- ggc cac aac ctc caa gta ga '- acc aca ctc cag cct gcc '- aca aga ctc tag cct gcc '- ggc ggt cga ttt aac geg tt '- ggc ggt cta ctt aac geg tt '- ggc ggt cta ttt aat geg tt '- agc tcc gga agc cac tcc tca '- gga aca acc tcc aag tcg '- gcc aca acc tcc aag tag λ- atg gcc ccc tag ccg aaa λ- g atg acc ccc tag ccg aaa '- aac ctt geg gcc gta ctc cc, ii) Oligonukleotiden, die mit einem Oligonukleotid unter i) in mindestens 80% und bevorzugt mindestens 90, 92, 94, 96% übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von trinkwasserrelevanten Bakterienzellen ermöglichen, iii) Oligonukleotiden, die sich von einem Oligonukleotid unter i) durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von trinkwasserrelevanten Bakterienzellen ermöglichen, und iv) Oligonukleotiden, die mit einer Sequenz, die zu einem Oligonukleotid unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
2. Verfahren zum Nachweis von trinkwasserrelevanten Bakterien in einer Probe, umfassend die Schritte a) Kultivieren der in der Probe enthaltenen trinkwasserrelevanten Bakterien, b) Fixieren der in der Probe enthaltenen trinkwasserrelevanten Bakterien, c) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 1 um eine Hybridisierung herbeizuführen, d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide, e) Detektieren und Visualisieren sowie gegebenenfalls Quantifizieren der trinkwasserrelevanten Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotiden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mit einem detektierbaren Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) Fluoreszenzmarker, b) Chemolumineszenzmarker, c) radioaktive Marker, d) enzymatisch aktive Gruppen, e) Hapten, f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäuren gekoppelt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Probe eine Trinkwasseroder Oberflächenwasseφrobe ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Detektieren mittels Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer Durchflusszytometer erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei es sich bei den trinkwasserrelevanten Bakterien um Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila oder um Fäkalstreptokokken oder um coliforme Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli handelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5Λ- cac tac cct ctc cca tac
5Λ- cac tac cct ctc cta tac
5'- c cac cac cct ctc cca tac
5 - c cac ttc cct ctc cca tac 5Λ- c cac tac cct ctc ccg tac
5'- c cac tac cct cta cca tac
5'- 1 atc tga ccg tcc cag gtt a.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'- ccc tct gat ggg tag gtt 5Λ- ccc tct gat ggg cag gtt 5Λ- tag gtg ttg tta gca ttt cg 5'- cac tcc tct ttt tcc ggt 5 -c cac ttc tct ttt tcc ggt
5'- c cac tct tct ttt tcc ggt
5'- c cac tct tct ttt ccc ggt
5' -cac aca atc gta aca tcc ta 5'- agg gat gaa ctt tcc act c
5'- cca ctc att ttc ttc egg
5λ-ccc ccg ctt gag ggc agg
5'- cct ctt ttc ccg gtg gag
5'- cct ctt ttt ccg gtg gag c 5'- cac tcc tct ttt cca atg a
5 - cac tcc tct tac ttg gtg
5"- tag gtg cca gtc aaa ttt tg
5λ- ccc ctt ctg atg ggc agg
5'- ccc cct ctg atg ggc agg 5'- cga ctt cgc aac tcg ttg
5'- cga ctt cgc gac tcg ttg
5 - cga gtt cgc aac tcg ttg.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies
Escherichia coli, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5' gac ccc ctt gcc gaa a 5' atg acc ccc tag ccg aaa 5'- ggc aca acc tcc aag tcg ac 5'- gga caa cca gcc tac atg et 5'- aca aga ctc cag cct gcc 5'- cag geg gtc tat tta acg cgt t 5'- ggc aca acc tcc aaa tcg ac 5'- ggc cac aac ctc caa gta ga 5'- acc aca ctc cag cct gcc 5'- aca aga ctc tag cct gcc 5'- ggc ggt cga ttt aac geg tt 5 '- ggc ggt cta ctt aac geg tt 5'- ggc ggt cta ttt aat geg tt 5'- agc tcc gga agc cac tcc tca 5'- gga aca acc tcc aag tcg 5'- gcc aca acc tcc aag tag 5Λ- atg gcc ccc tag ccg aaa 5'- g atg acc ccc tag ccg aaa 5'- aac ctt geg gcc gta ctc cc.
10. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 zum Nachweis von trinkwasserrelevanten Bakterien in einer Probe.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5'- cac tac cct ctc cca tac 5'- cac tac cct ctc cta tac
5'- c cac cac cct ctc cca tac
5Λ- c cac ttc cct ctc cca tac
5'- c cac tac cct ctc ccg tac
5"- c cac tac cct cta cca tac 5'- t äte tga ccg tcc cag gtt a und das Oligonukleotid zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der
Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila dient.
12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5'- ccc tct gat ggg tag gtt
5'- ccc tct gat ggg cag gtt 5Λ- tag gtg ttg tta gca ttt cg
5"- cac tcc tct ttt tcc ggt
5'-c cac ttc tct ttt tcc ggt
5λ- c cac tct tct ttt tcc ggt
5λ- c cac tct tct ttt ccc ggt 5' -cac aca atc gta aca tcc ta
5'- agg gat gaa ctt tcc act c
5λ- cca ctc att ttc ttc egg
S^-ccc ccg ctt gag ggc agg
5Λ- cct ctt ttc ccg gtg gag 5'- cct ctt ttt ccg gtg gag c
5'- cac tcc tct ttt cca atg a
5'- cac tcc tct tac ttg gtg
5λ- tag gtg cca gtc aaa ttt tg
5Λ- ccc ctt ctg atg ggc agg 5'- ccc cct ctg atg ggc agg
5'- cga ctt cgc aac tcg ttg
5'- cga ctt cgc gac tcg ttg
5'- cga gtt cgc aac tcg ttg. und das Oligonukleotid zum Nachweis von Fäkalstreptokokken dient.
13. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
5' gac ccc ctt gcc gaa a 5' atg acc ccc tag ccg aaa - ggc aca acc tcc aag tcg ac
- gga caa cca gcc tac atg et
- aca aga ctc cag cct gcc
- cag geg gtc tat tta acg cgt t
- ggc aca acc tcc aaa tcg ac
- ggc cac aac ctc caa gta ga
- acc aca ctc cag cct gcc
- aca aga ctc tag cct gcc
- gc ggt cga ttt aac geg tt
- ggc ggt cta ctt aac geg tt
- g c ggt cta ttt aat geg tt
- agc tcc gga agc cac tcc tca
- gga aca acc tcc aag tcg
- gcc aca acc tcc aag tag
- atg gcc ccc tag ccg aaa
- g atg acc ccc tag ccg aaa aac ctt geg gcc gta ctc cc und das Oligonukleotid zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli dient.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 9, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 1.
15. Kit nach Anspruch 14, in dem das mindestens eine Oligonukleotid in einer Hybridisierungslösung enthalten ist.
16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, weiter enthaltend eine Waschlösung und ggf. eine oder mehrere Fixierungslösungen.
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