EP1208237A2 - Schneller, hochspezifischer nachweis von pseudomonas aeruginosa durch mehrfachsondendetektion - Google Patents

Schneller, hochspezifischer nachweis von pseudomonas aeruginosa durch mehrfachsondendetektion

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Publication number
EP1208237A2
EP1208237A2 EP00956495A EP00956495A EP1208237A2 EP 1208237 A2 EP1208237 A2 EP 1208237A2 EP 00956495 A EP00956495 A EP 00956495A EP 00956495 A EP00956495 A EP 00956495A EP 1208237 A2 EP1208237 A2 EP 1208237A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probes
aeruginosa
probe
detection
sequences
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00956495A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Meier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1208237A2 publication Critical patent/EP1208237A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the invention relates to agents for the detection of Pseudomonas ae ruginosa, methods for the specific detection of Ps. aeruginosa and the use of the agent disclosed according to the invention.
  • Pseudomonas aeruginosa are widespread germs in the environment (e.g. in surface waters). They are gram negative, need oxygen for growth (aerobic) and are oxidase positive. As a rule, they grow at 41 ° C in the presence of cetyltrimethylammonium bromide (cetrimide) in the nutrient medium, form the pigments pyocyanin and pyoverdin (fluoresce weakly blue-green under UV excitation), form nitrate and nitrite and are sensitive towards polymyxin. They are able to utilize a wide range of nutrients and can multiply even with a very limited supply of usable carbon sources. Only a small part of all germs of the Pseudomonas aeruginosa bacterial species is pathogenic. This ubiquitous type of bacteria, however, has considerable secondary pathogenic significance as an opportunistic germ in connection with hospitalism.
  • Pseudomonas aeruginosa can cause wound infections, sepsis, endocarditis, inflammation of the genitourinary tract, but in particular infections of the respiratory tract, including pneumonia.
  • Immun-suppressed patients in particular are often affected. Patients with neutropenia or cystic fibrosis usually have very poor prognoses when they are infected with Pseudomonas aeruginosa. A quick and specific early detection of this germ is therefore of great importance in medicine, especially in medical diagnostics.
  • this germ is also a valuable indicator of contamination with surface water and unhygienic production. Therefore, according to legal regulations in Germany and Europe, e.g. the regulation on mineral, spring and table water, bottled products containing mineral, spring or table water are checked for the presence of this germ.
  • a means for the detection of Ps. aeruginosa which is characterized in that it contains at least two probes with e at least ten successive nucleotides of the following two sequences:
  • PAE1 5 - tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg -3 x
  • PAE2 5 - tct cct tag agt gcc cac ccg agg tgc tgg taa cta ag - 3
  • the detection method according to the invention is based on the detection of defined nuclear acid sections of Ps. aeruginosa, with highly specific sequences of the 16S ⁇ bosomal ribonucleic acid (16S rRNA) from Pseudomonas aeruginosa and strains derived therefrom being recognized selectively.
  • the agent provided according to the invention can be used for the rapid identification of Ps. Aeruginosa, since neither selective cultivation of Ps. aeruginosa to pure cultures still the formation of a defined phanotype are necessary. It differentiates Ps reliably and reproducibly. aeruginosa from other closely related Pseudomonas species, for example Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas mendocma and Pseudomonas fluorescens.
  • the agent according to the invention is characterized in that it comprises a combination of two probes which are characterized by the nucleotide sequences PAE1 and PAE2. Only the combined use of both probes leads to a reliably discriminatory detection of Ps. aeruginosa and its strains from other Pseudomonas species and their strains.
  • the probes disclosed here specifically bind to sequences of the 16S rRNA on Ps. aeruginosa.
  • a germ that reacts positively with both probes is called Ps. aeruginosa identified.
  • a single identification probe can identify Ps. Do not guarantee aeruginosa. Only the combination according to the invention tion from both probes allows the specific identification of Ps. aeruginosa.
  • Standard detection in the beverage industry Incubation of the sample on cetrimides (US Pat. No. 4072573, Ald ⁇ dge et al., 1978) - agar at 41 ° C. for 48 h. Illuminate the agar plates with ultraviolet light. Identification of bluish green fluorescent colonies as Pseudomonas aeruginosa.
  • the developed probe is directed against the 23S rRNA. It detects Ps. aeruginosa, but also other fluorescent pseudomonas, e.g. Ps. trim, Ps. mendocma, Ps fluorescens, Ps putida and many more. A distinction between Ps. aeruginosa and other Group I pseudomonas is not possible. Furthermore, this probe cannot be used for the detection of Pseudomonas aeruginosa cells using FISH, but only for the detection of m nuclear acid extracts.
  • the probe designated PAE3 in FIGS. 1 and 2 was found as an additional probe. This is one of the 23S rRNA derived probe with the following sequence: 5 -GACCAGCCAGAGCTTACG-3. However, as Figure 2 shows, this PAE3 probe does not succeed in detecting all Pseudomonas aeruginosa isolates from mineral waters. Isolates NE54 and NE55 are not detected by the probe.
  • the agent proposed according to the invention for the detection of Ps. aeruginosa comprises at least two probes with the sequences PAE1 and PAE2 mentioned in claim 1 and derivatives thereof.
  • the detection method according to the invention at least 10 consecutive nucleotides from PAE1 and PAE2 are used in combination.
  • “combination * ” means both the sequential use of PAEl and PAE2 and the use of PAEl and PAE2 in one step.
  • the probes comprise more than 10 consecutive nucleotides, preferably 12 to 26 nucleotides, further preferably 14 to 22 nucleotides, more preferably 16 to 20 nucleotides and particularly preferably 18 nucleotides. It is obvious to the person skilled in the art that probes with lengths other than those specifically described here can also be used, provided they are in the range from 12 to 26 successive nucleotides of the sequences PAE1 and PAE2. According to the invention, probes with the following sequences are particularly preferably used in combination: gt aac cgt cccct tgc g
  • modifications * are to be understood as meaning derivatives of the sequences in which one, two or three nucleotides on one or both edges of the probe have been replaced by other nucleotides. The prerequisite here is that a specific binding to the 16 rRNA on Ps. aeruginosa remains, so that the object of the invention is achieved.
  • “derivatives *” are also to be understood to mean those probes which are derived from the probes PAE1 and PAE2 and in which one or two nucleotides have been deleted or replaced by another nucleotide in the interior of the probe, but of course only such ones Variations are to be considered in which the specific binding to Ps. aeruginosa nucleotide sequences are retained.
  • the person skilled in the art can easily determine which modifications of the sequences for the highly specific detection of Ps. aeruginosa are suitable and which are not.
  • the invention also encompasses the sequences and reverse-complementary sequences which are reverse to PAE1 and PAE2 and their derivatives.
  • the probes provided in the present invention are used in methods for the specific detection of Ps. aeruginosa used. Methods in which DNA probes are specific Detection of a microorganism are known per se. The person skilled in the art can use these methods known per se with the present probes.
  • the DNA or the RNA is based on the presence of Ps. aeruginosa sample to be examined with at least the two probes PAEl and PAE2 or derivatives of these probes, as described in more detail above, brought into contact.
  • the hybridization of the probes with the RNA or the DNA of the sample is then detected in order to determine the presence of Ps. to show aeruginosa specific DNA and / or RNA sequences.
  • the probes can be provided with a label, for example a radioactive label, digoxigenin, peroxidase-biotin label, or a fluorescent label in order to carry out a specific hybridization with Ps. to detect aeruginosa specific DNA or RNA.
  • a label for example a radioactive label, digoxigenin, peroxidase-biotin label, or a fluorescent label in order to carry out a specific hybridization with Ps. to detect aeruginosa specific DNA or RNA.
  • probes are e.g. PNAs in which the bases are bound to PNA and not to a sugar-phosphate backbone.
  • the probes are bound to a matrix (reverse hybridizations) and hybridization is carried out with fluorescence-labeled DNA or a PCR amplificate.
  • matrices are microchips and microtiter plates.
  • the invention also encompasses derivatives of the probes or the individual nucleotides of the probes that are not described separately here, for example chemical changes. improvements to the probes that facilitate the detection procedure. Such derivatives are known to the person skilled in the art and can be applied to the probes provided according to the invention.
  • the present invention serves for the highly specific detection of Pseudomonas aeruginosa with the aid of a combination of at least two probes. It is known that a species like Ps. aeruginosa is naturally inconsistent, i.e. split up into individual trunks. In terms of taxonomy, a "strain" is usually understood to mean a bacterial clone defined by a strain number and its descendants. There is a so-called type strain that represents the species and thus the properties of the species. Since all strains of a species, such as Ps. aeruginosa, closely related to each other, the detection methods and probes provided according to the invention can of course also be applied to all strains of Ps. aeruginosa.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined is either isolated from the sample organisms or the organisms are disrupted in a suitable manner so that direct contact of the probes with the DNA and / or the RNA of the sample organisms is made possible without extensive and time-consuming cleaning procedures beforehand must be carried out.
  • the probes are hybridized with the DNA and / or the RNA of the sample organisms under stringent conditions, preferably highly stringent conditions. These conditions are explained in more detail below.
  • reaction buffer and wash buffer are composed of the following functional components: a) Buffer system for adjusting and stabilizing the pH between 7 and 8 (eg Tris / HCl) b) Water as ⁇ solvent 'c) Possibly chelating agents, which at low concentrations of monovalent cations have the influence of divalent cations
  • Nonionic, aprotic detergents eg formamide
  • Salt functional units are cations that neutralize the negative charges of the nuclear acid phosphate groups and thereby facilitate the duplex formation of two single-stranded nucleic acids (eg Na + m NaCl).
  • Components e) and f) influence the binding strengths of duplex nuclear acid. Increasing the monovalent cations in the reaction or wash solution stabilizes the duplex molecules formed, while with an increasing content of e.g. Formamide the duplex formulations are weakened.
  • a suitable probe concentration must be used.
  • the hybridization must take place at a suitable temperature ⁇ the higher the temperature, the weaker the binding of the hybrids.
  • Strict hybridization and washing conditions are the reaction conditions (the correct choice of the four factors) under which only duplex molecules between the probe and the desired target molecules (perfect hybrids) are formed or only the desired target organism is detected.
  • Strict reaction conditions mean, for example, a hybridization temperature of approximately 5-10 ° C. below the respective primer melting point.
  • the stability of the DNA / DNA or RNA / DNA hybrids must be ensured even at low salt concentrations corresponding to 0.1 x SSC / 0.5% SDS. In this way undesirable cross-reactions with other species can be prevented.
  • the respective temperature conditions can differ depending on the chosen test conditions and depending on the DNA sample to be examined and must then be adapted accordingly.
  • the hybridization product can be detected, for example, by autoradiography in the case of radioactively labeled primer molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled oligonucleotides.
  • the above probes are complementary to areas of rRNA. Therefore these probes can bind to the rRNA. However, you can also bind to the anti-Smn DNA strand of the rRNA gene (which is the same sequence as the rRNA). In order to amplify the rRNA gene region between the two probe regions by means of PCR, a primer must bind to the anti-Smn strand, the second primer to the sense strand.
  • PAE2 The area complementary to PAE2 (5'-ctt agt tac cag cac ctc ggg tgg gca Ctc taa gga ga -3 ⁇ ) offers itself as a forward primer '(PAE vorwa ⁇ : t ⁇ ), as a' backward primer '(PAE ruckwar r s ) Area PAEl (5'- tca ctc cgt ggt aac cgt ccc ct tgc ggt tag act agc tac ttc tg -3 ').
  • the probes according to the invention thus enable highly specific and rapid detection of representatives of the bacterial species Ps. Aeruginosa. For example, by marking of probes with different fluorescent dyes and their use at FISH in fixed samples Ps. aeruginosa can be identified at the single cell level when a cell fluoresces in two colors. In this way Ps. aeruginosa can also be specifically detected in mixed cultures. Growing on selective nutrient media and obtaining pure cultures is no longer necessary. Since it is based on the optical perception or measurement of two different fluorescent dyes, the identification can also be carried out by laypersons.
  • the PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected. Depending on the material to be detected, the temperature conditions and the cycle numbers of the PCR have to be modified. The optimal reaction conditions can be determined by hand tests in a manner known per se.
  • An example of a PCR is as follows:
  • the characteristic, species-specific DNA marker fragments formed in the course of the PCR amplification by the extension of the primer sequences can be detected, for example, by gel electrophoresis or fluorimetry using fluorescence-labeled oligonucleotides. Of course, other detection methods known to the person skilled in the art can also be used.
  • a particular advantage of the probe combination provided according to the invention is its use in situ detection methods. Often there are problems with hybridization, and the proteins present in the cell can jeopardize the success of m situ hybridization by masking important nucleotides. The possibility of using the present probe combination for hybridizations, in particular for in situ hybridizations, and not only PCR methods was therefore also not predictable.
  • Hybridization methods and PCR methods are known per se to the person skilled in the art, and reference is only made here, for example, to the publication by C. Mulhardt, The Experimentator: Molecular Biology, G. Fischer, Stuttgart, Jena, Luebeck, Ulm, 1999. Reference is hereby made in full to this publication.
  • Fig. 1 Identification of Pseudomonas aeruginosa reference strains and kimic isolates with rRNA-directed probes.
  • Fig. 2 25 isolates from bottled non-carbonated natural mineral water.
  • Example 1
  • Fluorescence microscopic detection of fixed Ps. aeruginosa m water samples (bottled mineral water, spring or table water) or river enrichments.
  • 250 ml of mineral water or bacterial enrichment from 250 ml of liquid medium is filtered through bacteria-proof, white membrane filters (e.g. polycarbonate filter, Mill pore GTTP02500, Eschborn) with standard filtration systems.
  • hybridization solution 62.5 ng PAE1-CY3 and 250 ng PAE2 fluorescence with hybridization buffer (0.9M NaCl, 0.01 M Tris / HCl (pH 7.2 - 8.0), 0.01% SDS , 60% formamide
  • the filter is then m 50 ml wash solution (14 mM NaCl, To remove unbound probe, incubate 0.01 M Tris / HCl, 0.01% SDS, 5mM EDTA (pH8.0) for 15 minutes at 48 ° C. After drying, the filter is placed on a carrier surface (eg glass object carrier) and with an anti-thread g - Dripped medium (eg Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) and covered with a cover glass To detect the signals, the filter is placed in the epifluorescence microscope under excitation with blue and green light (equipped with fluorescence filters for fluorescem and rhodam) at 400- bis 1000x Magnification examined. Pseudomonas aeruginosa cells fluoresce green when excited blue and red when excited green.
  • a carrier surface eg glass object carrier
  • an anti-thread g - Dripped medium eg Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London
  • Example 2 Identification of Pseudomonas aeruginosa m liquid enrichments from clinical samples m selective or non-selective nutrient medium on slides.
  • 1 ml of slightly cloudy liquid enrichment is mixed with 1 ml of absolute ethanol and incubated at 4 ° C for at least 15 minutes. Centrifuge at 5000g for 3 minutes. Discard the supernatant. Resuspend the pellet in 500 ⁇ l phosphate-buffered NaCl solution (PBS buffer), add 500 ⁇ l 100% ethanol. Mix well. Distribute 10 ⁇ l of the enrichment thus prepared in a reaction field of the hybridization slide (e.g. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Germany; Art. No. 1215130 - slide with 6 reaction fields) and allow it to dry 10 mm at 46 ° C. 6 different samples can be placed on one of the slides mentioned above and examined at the same time.
  • a reaction field of the hybridization slide e.g. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Germany; Art. No. 1215130 - slide with 6 reaction fields
  • hybridization solution 12.5 ng PAE1-CY3 and 50 ng PAE2 fluorescence in in hybridization buffer (0.9M NaCl, 0.01M Tris / HCl (pH 7.2 - 8.0 ), 0.01% SDS, 60% formamide
  • Wells of a sterile microtiter plate are filled with 50 ⁇ l PBS buffer each. Samples of the bacterial colonies are now suspended from the agar plate in the wells using sterile toothpicks. Add 50 ⁇ l of 100% ethanol each to the wells that contain suspended colonial samples. Mix. Distribute 10 ⁇ l of the samples fixed in this way per reaction field of the hybridization slide (e.g. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Germany; Art. No. 1215130 - slide with 6 reaction fields) and allow it to dry 10 mm at 46 ° C. 6 different fixed colonies can be placed on one of the slides mentioned above and examined at the same time.
  • reaction field of the hybridization slide e.g. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Germany; Art. No. 1215130 - slide with 6 reaction fields
  • 10 ⁇ l hybridization solution 12.5 ng PAE1-CY3 and 50 ng PAE2-Fluorescem m Hyb ⁇ dleitersbuffer (0.9M NaCl, 0.01 M Tris / HCl (pH 7.2 - 8.0;, 0.01% SDS, 60-formamide)
  • the hybridization solution is then rinsed from the microscope slide with a wash solution preheated to 48 ° C. (14 mM NaCl, 0.01 M Tris / HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0)) and this 50 ml wash solution for 15 minutes at 48 ° C. mcubated to remove unbound probe. Rinse the slides carefully with distilled water and let them dry. Drip slides with anti-dmg medium (eg Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) and cover with cover glass.
  • a wash solution preheated to 48 ° C. (14 mM NaCl, 0.01 M Tris / HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0)
  • this 50 ml wash solution for 15 minutes at 48 ° C. mcubated to remove unbound probe. Rinse the slides carefully with distilled water and let them dry. Drip slides with anti-dmg medium (eg Citifluor
  • the individual reaction fields are examined in the epifluorescence microscope under excitation with blue and green light (equipped with fluorescence filters for Fluoresce and Rhodamm) at a magnification of 400 to 1000 times.
  • Pseudomonas aeruginosa cells fluoresce green when excited blue and red when excited green.
  • Mucus sample is placed in 100-1000 ul PBS buffer (pH 7.2-7.4) and mixed with 100-1000 ul absolute ethanol and incubated at 4 ° C for at least 15 minutes.
  • Spread the fixed mucus sample over the reaction field of the hybridization slide eg Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Germany; Art. No. 1215130 - slide with 6 reaction fields
  • let it dry 10 mm at 46 ° C. 6 different samples can be placed on one of the slides mentioned above brought and examined at the same time.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt einen schnellen, hochspezifischen molekularen Nachweis von Pseudomonas aeruginosa.

Description

SCHNELLER, HOCHSPEZIFISCHER NACHWEIS VON PSEUDOMONAS AERUGINOSA DURCH MEHRFACHSONDENDETEKTION
B E S C H R E I B U N G
Die Erfindung betrifft Mittel zum Nachweis von Pseudomonas ae- ruginosa, Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps . aerugi- nosa sowie die Verwendung des erfindungsgemäß offenbarten Mittels.
Vertreter der Bakterienart Pseudomonas aeruginosa sind in der Umwelt (z.B. in Oberflächengewässern) weit verbreitete Keime. Sie sind Gram-negativ, benötigen Sauerstoff zum Wachstum (aerob) und sind Oxidase positiv. In der Regel wachsen sie bei 41 °C unter Anwesenheit von Cetyl-trimethylammoniumbromid (Cetri- mide) im Nährmedium, bilden die Pigmente Pyocyanin und Pyover- din (fluoreszieren unter UV-Anregung schwach blau-grün), bilden Nitrat und Nitrit und sind sensitiv gegenüber Polymyxin. Sie sind in der Lage, ein breites NährstoffSpektrum zu verwerten und können sich selbst bei einem sehr geringen Angebot an verwertbaren Kohlenstoff-Quellen vermehren. Nur ein kleiner Teil aller Keime der Bakterienart Pseudomonas aeruginosa ist pathogen. Diese ubiquitare Bakterienart hat allerdings erhebliche sekundäre pathogene Bedeutung als opportunistischer Keim im Zusammenhang mit Hospitalismus.
Im Rahmen sogenannter nosokomialer (=ιm Krankenhaus erworbener) Infektionen kann Pseudomonas aeruginosa Wundinfektionen, Sepsis, Endokarditis, Entzündungen des Urogenitaltraktes, insbesondere aber Infektionen des Respirationstraktes em- schliesslich Lungenentzündungen verursachen. Insbesondere lm- mun-supprimierte Patienten sind häufig davon betroffen. Patienten mit Neutropenie oder zystischer Fibröse haben m der Regel bei Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa sehr schlechte Prognosen. Eine schnelle und spezifische Fruherkennung dieses Keims ist deshalb m der Medizin, insbesondere m der medizinischen Diagnostik, von großer Bedeutung.
In der Getränkeindustrie ist dieser Keim zudem ein wertvoller Indikator für Kontaminationen mit Oberflachenwasser und unhy- gienischer Produktion. Daher müssen laut gesetzlicher Verordnungen m Deutschland und Europa, z.B. der Verordnung über Mineral-, Quell- und Tafelwasser, abgefüllte Produkte, die Mineral-, Quell-, oder Tafelwasser enthalten, auf das Vorhandensein dieses Keims überprüft werden.
Konventionelle Verfahren, die auf der Anzucht dieser Keime m Reinkultur und nachfolgender Identifizierung des Phanotyps beruhen, sind langwierig und nicht immer eindeutig. Dies beruht auf der Eigenschaft dieses Keims und nahe verwandter Organismen (Pseudomonaden) , genetisches Material von anderen Keimen aufzunehmen und auch den zugehörigen Phanotyp auszubilden. Ferner sind Beispiele bekannt m denen einige Stamme von Ps . aeruginosa sonst typische Eigenschaften (wie z.B. Bildung des Pigmentes Pyocyanin) nicht mehr zeigen, gelegentlich auch vollständig verloren haben. Eine Aufgabe der Erfindung ist die Beschreibung eines schnell durchfuhrbaren, hochspeziflschen Verfahrens zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa sowie die Nennung der hierfür notwendigen Materialien.
Diese Aufgabe wird erfmdungsgemaß durch ein Mittel zum Nachweis von Ps . aeruginosa gelost, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zumindest zwei Sonden mit e zumindest zehn aufeinanderfolgenden Nukleotiden der nachfolgenden zwei Sequenzen enthalt :
PAE1 : 5 - tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg -3 x
PAE2 : 5 - tct cct tag agt gcc cac ccg agg tgc tgg taa cta ag - 3
und/oder zumindest ein oder zwei Derivate dieser Sequenzen, die je m Kombination von zumindest zwei dieser Sequenzen zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa geeignet sind.
Weiterhin wird ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa mit den nachfolgenden Verfahrensschritten offenbart:
Inkontaktbnngen der DNA oder der RNA einer auf die Anwesenheit von Ps . aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zumindest den zwei Sonden PAE1 und PAE2 und/oder ihren Derivaten und Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps . aeruginosa spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteranspruchen sowie der nachfolgenden Beschreibung und den Ausfuhrungsbeispielen. Die Erfindung ist nicht auf die nachfolgend genannten bevorzugten Ausgestaltungen beschrankt, sondern umfaßt sämtliche, unter die Patentansprüche fallenden Ausfuhrungsformen, auch wenn sie nachfolgend nicht speziell genannt sind.
Das erfmdungsgemaße Nachweisverfahren basiert auf dem Nachweis definierter Nuklemsaureabschnitte von Ps . aeruginosa, wobei hochspezifisch Sequenzen der 16S πbosomalen Ribonukleinsäure (16S rRNS ) von Pseudomonas aeruginosa sowie hiervon abgeleiteter Stamme selektiv erkannt werden. Das erfmdungsge- maß bereitgestellte Mittel kann zur schnellen Identifizierung von Ps. aeruginosa eingesetzt werden, da weder eine selektive Anzucht von Ps . aeruginosa zu Reinkulturen noch die Ausbildung eines definierten Phanotyps notwendig sind. Es differenziert sicher und reproduzierbar Ps . aeruginosa von anderen, nahe verwandten Pseudomonas-Arten, beispielsweise Pseudomonas alca- ligenes, Pseudomonas mendocma und Pseudomonas fluorescens.
Das erfmdungsgemaße Mittel zeichnet sich dadurch aus, daß es eine Kombination aus zwei Sonden umfaßt, die durch die Nukleo- tidsequenzen PAE1 und PAE2 gekennzeichnet sind. Erst die kombinierte Anwendung beider Sonden bewirkt einen sicher diskriminierenden Nachweis von Ps . aeruginosa und seiner Stamme von anderen Pseudomonas- Arten und deren Stammen.
Die hier offenbarten Sonden binden spezifisch an Sequenzen der 16S rRNS an Ps . aeruginosa. Ein Keim, der mit beiden Sonden positiv reagiert, wird als Ps . aeruginosa identifiziert. Eine einzelne Identifizierungssonde kann die Identität von Ps . aeruginosa nicht garantieren. Nur die erfmdungsgemaße Kombina- tion aus beiden Sonden erlaubt die spezifische Identifizierung von Ps . aeruginosa.
Aus dem Stand der Technik sind bereits verschiedenen Losungsansatze bekannt, um Ps . aeruginosa zu identifizieren. Im Vergleich zur vorliegenden Erfindung weisen die bekannten Verfahren jedoch gravierende Nachteile auf, die erfmdungsgemaß vermieden werden. Der Stand der Technik wird nachfolgend diskutiert :
1. Standardnachweis m der Getrankebranche : Inkubation der Probe auf Cetrimide (US-Patent No 4072573, Aldπdge et al . , 1978) - Agar bei 41 °C für 48 h. Beleuchten der Agarplatten mit ultraviolettem Licht. Identifizierung von blaugrun fluoreszierenden Kolonien als Pseudomonas aeruginosa.
2. Sonde zur Diagnose von Pseudomonas aeruginosa (US-Patent No 5798211, Appl. No . 921177, Ohno et al . , 1998)
3. Isolierung verdachtiger Keime und Anzucht Reinkultur. I- dentiflzierung von Pseudomonas aeruginosa durch Fourier - Transformations Infra-Rot Spektroskopie (Helm et al . , 1991; Naumann et al . , 1991) .
4. Nukle saure-Sonden und Methoden zur Detektion von Pseudomo- naden der Gruppe I ( US-Patent No 5677127, Hogan et al . , 1997; Gen-Probe Incorporated, Appl. No . 453439) .
Die Nachteile der oben genannten Nachweisverfahren sind wie folgt:
Zu 1. Der Nachweis dauert zu lange (2 Tage) . Bei zweifelhaften Resultaten (nur etwa 75% aller Pseudomonas aeruginosa Stamme bilden das Pigment Pyocyanm) müssen zur Prüfung langwierige Bestatigungstests (auf physiologische Eigenschaften) durchgeführt werden. Geschadigte und ausgehungerte Keime wachsen auf dem Selektivmedium nur noch schlecht oder nicht mehr an.
Zu 2. Die Bindungsstellen dieser , Sonden λ sind nicht bekannt, da es sich um HINDIII - Fragmente der DNS handelt, die m E. coli kloniert wurden. Dadurch ist die Produktion der Sonde aufwendig und teuer im Vergleich zu Oligonukleotiden. Ein Nachweis auf Einzelzellebene ist nicht möglich, da die Sonde gegen die DNS gerichtet ist und demnach zu wenige molekulare Zielstellen pro Zelle vorhanden sind. Die Sonde kann vermutlich nur für einen Nachweis m Nuklemsaureextrakten angewendet werden. Ferner ist nicht ersichtlich, ob mit der Sonde zwischen Ps . aeruginosa und nahe verwandten Pseudomonaden unterschieden werden kann.
Zu 3. Mischkulturen können mit der FT-IR Spektroskopie nicht analysiert werden. Daher ist die Gewinnung von Reinkulturen und deren Anzucht auf standardisierten Medien die Grundvoraussetzung für deren FT-IR Analyse. Dementsprechend dauert die gesamte Nachweisprozedur mit mindestens 48 h zu lange.
Zu 4. Die entwickelte Sonde ist gegen die 23S rRNS gerichtet. Sie detektiert zwar Ps . aeruginosa, allerdings auch andere fluoreszierende Pseudomonaden, wie z.B. Ps . stutzen, Ps . mendocma, Ps fluorescens, Ps putida u.v.a.. Eine Unterscheidung zwischen Ps . aeruginosa und anderen Pseudomonaden der Gruppe I ist nicht möglich. Desweiteren kann diese Sonde nicht für den Emzelzellnachweis von Pseudomonas aeruginosa mittels FISH verwendet werden, sondern nur für den Nachweis m Nuklemsaureextrakten.
Bei den erf dungsgemaß durchgeführten Versuchen wurde als weitere Sonde die m den Abbildungen 1 und 2 mit PAE3 bezeichnete Sonde gefunden. Hierbei handelt es sich um eine von der 23S rRNA abgeleitete Sonde mit der nachfolgenden Sequenz: 5 -GACCAGCCAGAGCTTACG-3 . Wie die Abbildung 2 zeigt, gelingt es mit dieser Sonde PAE3 allerdings nicht, sämtliche Pseudomonas aeruginosa-Isolate aus Mineralwässern zu erfassen. So werden die Isolate NE54 und NE55 von der Sonde nicht erfaßt.
Der erfindungsgemäß vorgeschlagene Weg, durch den Einsatz von mindestens zwei Sonden Ps . aeruginosa sicher von nahe verwandten Arten zu diskriminieren und hierbei Sonden auszuwählen, die spezifisch die 16S rRNS erkennen, ist neu und weist gegenüber dem genannten Stand der Technik auch eine erfinderische Leistung auf.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mittel zum Nachweis von Ps . aeruginosa umfaßt zumindest zwei Sonden mit den im Anspruch 1 genannten Sequenzen PAEl und PAE2 sowie Derivate hiervon. Beim erfindungsgemäßen Nachweisverfahren werden zumindest 10 aufeinander folgende Nukleotide aus PAEl und PAE2 in Kombination eingesetzt. Unter „Kombination* ist erfindungsgemäß sowohl der nacheinander erfolgende Einsatz von PAEl und PAE2 als auch der Einsatz von PAEl und PAE2 in einem Schritt zu verstehen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Sonden mehr als 10 aufeinanderfolgende Nukleotide, bevorzugt 12 bis 26 Nukleotide, weiterhin bevorzugt 14 bis 22 Nukleotide, noch bevorzugter 16 bis 20 Nukleotide und insbesondere bevorzugt 18 Nukleotide. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß auch Sonden mit anderen Längen als die hier konkret beschriebenen eingesetzt werden können, soweit sie im Bereich von 12 bis 26 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenzen PAEl und PAE2 liegen. Insbesondere bevorzugt werden erfindungsgemäß Sonden mit den nachfolgenden Sequenzen in Kombination eingesetzt: gt aac cgt ccc cct tgc g
gt gcc cac ccg agg tgc t.
Es ist für den Fachmann auch naheliegend, ausgehend von den hier offenbarten Sequenzen auch Abwandlungen dieser Sequenzen zur Detektion von Ps . aeruginosa einzusetzen. Unter „Abwandlungen* sind erfindungsgemäß Derivate der Sequenzen zu verstehen, bei denen ein, zwei oder drei Nukleotide an einem oder beiden Rändern der Sonde durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die 16 rRNS an Ps . aeruginosa beibehalten bleibt, so daß die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe gelöst wird. Unter „Derivate* sind erfindungsgemäß aber auch solche Sonden zu verstehen, die sich von den Sonden PAEl und PAE2 ableiten und bei denen im Inneren der Sonde ein oder zwei Nukleotide dele- tiert oder durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind, wobei auch hier selbstverständlich nur solche Abwandlungen zu berücksichtigen sind, bei denen die spezifische Bindung an Ps . aeruginosa-Nukleotidsequenzen beibehalten bleibt. Ausgehend von den Nukleotidsequenzen der hier offenbarten Sonden kann der Fachmann durch einfaches Ausprobieren feststellen, welche Abwandlungen der Sequenzen zum hochspezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa geeignet sind und welche nicht.
Von der Erfindung umfaßt werden auch die zu PAEl und PAE2 und ihren Derivaten reversen Sequenzen und revers-komplementären Sequenzen.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Sonden werden in Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa eingesetzt. Verfahren, bei denen DNA-Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Sonden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit von Ps . aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zumindest den zwei Sonden PAEl und PAE2 oder Derivaten dieser Sonden, wie sie vorstehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps . aeruginosa spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.
Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden einzusetzen. So können die Sonden mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- Biotin-Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisierung mit Ps . aeruginosa spezifischer DNA oder RNA nachzuweisen.
Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z.B. PNAs, bei denen die Basen an PNA und nicht an ein Zucker- Phosphat-Rückgrat gebunden sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Sonden an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen) , und es wird mit fluoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikat hybridisiert. Beispiele für derartige Matrizes sind Mikrochips und Mikrotiterplatten.
Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Sonden beschrieben. Von der Erfindung umfaßt werden aber auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate der Sonden bzw. der einzelnen Nukleotide der Sonden, beispielsweise chemische Ände- rungen an den Sonden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Derivate sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfmdungsgemaß bereitgestellten Sonden angewandt werden.
Die vorliegende Erfindung dient zum hochspezifischen Nachweis von Pseudomonas aeruginosa mit Hilfe einer Kombination von mindestens zwei Sonden. Es ist bekannt, daß eine Art wie Ps . aeruginosa natürlicherweise uneinheitlich ist, d.h. sich m einzelne Stamme aufspaltet. Unter einem „Stamm" wird taxono- misch meist ein durch eine Stammnummer definierter Bakteπen- klon und dessen Nachkommen verstanden. Es gibt einen sogenannten Typstamm, der die Art und damit die Eigenschaften der Art repräsentiert. Da alle Stamme einer Art, wie beispielsweise Ps . aeruginosa, eng miteinander verwandt sind, können die er- fmdungsgemaß bereitgestellten Nachweisverfahren und Sonden selbstverständlich auch auf alle Stamme von Ps . aeruginosa angewandt werden.
Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden m geeigneter Weise aufgeschlossen, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen.
Die Hybridisierung der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter strmgenten Bedingungen, bevorzugt hoch-strmgenten Bedingungen. Diese Bedingungen werden nachfolgend naher ausgeführt.
Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt: a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH- Wertes zwischen 7 und 8 (z.B Tris/HCl) b) Wasser als λLösungsmittel' c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen
(z.B. Ca2+) , die als Verunreinigung Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt . d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflachenspannung von wäßrigen Losungen e) Nichtionische, aprotische Detergenzien (z.B. Formamid) schwachen die Bindungsenergie von Nuklemsaure- Duplexmolekulen . f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nuklemsaure - Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei emzelstrangigen Nukleinsäuren erleichtern (z.B. Na+ m NaCl).
Vier Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus Sonde und Zielmolekul:
Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstarken von Nuklemsaure-Duplexmolekulen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlosung stabilisiert die gebildeten Duplexmolekule, wahrend mit zunehmendem Gehalt an z.B. Formamid die Duplexbmdungen geschwächt werden.
Eine geeignete Sondenkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden { j e hoher die Temperatur, um so schwacher die Bindung der Hybride. Unter strmgenten Hybπdisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren) , unter denen nur noch Duplexmolekule zwischen Sonde und gewünschten Zielmolekulen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.
Unter strmgenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Primerschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA-Hybπden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 x SSC/0,5% SDS gewahrleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Spezies verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch m Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und m Abhängigkeit von der zu untersuchenden DNA-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisie- rungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermolekule oder durch Fluori- metrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleo- tiden erfolgen.
Weitere Beispiele für strmgente Bedingungen sind m den nachfolgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann m an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsachlich strmgente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stπngenzbedmgungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln, bei denen DNA oder RNA von Ps . aeruginosa mit Proben weiterer Pseudomo- nas-Arten mit den erfmdungsgemaß bereitgestellten Proben untersucht und verglichen wird. In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung werden die Sonden als Vorwärts- und Ruckwarts-Pπmer für eine PCR- Reaktion eingesetzt.
Die obengenannten Sonden sind komplementär zu Bereichen der rRNS. Deshalb können diese Sonden an die rRNS binden. Sie können allerdings auch an den Anti-Smn DNS-Strang des rRNS-Gens (der ja sequenzgleich zur rRNS ist) binden. Zur Vervielfältigung des rRNS-Gen-Bereichs zwischen den beiden Sondenregionen mittels PCR muß em Primer an den Anti-Smn Strang binden, der zweite Primer an den Sinn-Strang.
Als Vorwartsprιmer' (PAEvorwaι:tΞ) bietet sich der Bereich komplementär zu PAE2 (5'-ctt agt tac cag cac ctc ggg tgg gca Ctc taa gga ga -3λ) an, als 'Ruckwartsprimer' (PAEruckwarrs) der Bereich PAEl (5'- tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg -3') .
Die oben beschriebenen Derivate und bevorzugten Abwandlungen können analog angewandt werden.
Bei Anwendung dieser Primer m der PCR sollte bei geeigneter Annealmg-Temperatur nur bei Stammen von Ps . aeruginosa em spezifisches Amplifikat von 337 bp erzeugt werden. Als zu untersuchende Probe kann extrahierte DNS aus Reinkulturen oder Anreicherungen, bzw. ganze Zellen aus Reinkulturen oder Anreicherungen, bzw. Wasserproben vor und nach Anreicherungen, bzw. klinisches Material m die PCR eingesetzt werden.
Die erfmdungsgemaßen Sonden ermöglichen somit einen hochspezifischen und schnellen Nachweis von Vertretern der Bakterienart Ps. aeruginosa. Beispielsweise kann durch die Markierung der Sonden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen und deren Einsatz bei der FISH in fixierten Proben Ps . aeruginosa auf Einzelzellebene identifiziert werden, wenn eine Zelle zweifarbig fluoresziert. Hierdurch kann Ps . aeruginosa auch in Mischkulturen spezifisch nachgewiesen werden. Eine Anzucht auf selektiven Nährmedien und die Gewinnung von Reinkulturen ist nicht mehr notwendig. Die Identifizierung kann, da sie auf der optischen Wahrnehmung bzw. Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen beruht, auch von Laien vorgenommen werden .
Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:
- Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 3 Minuten lang;
- Bindung der Sondenpaare 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA; zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxy- ribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA- Polymerase;
30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA- Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang) ;
- Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3 -Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5-8 Minuten lang). Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, speziesspezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel- elektrophoretisch oder fluorimetπsch unter Verwendung fluo- reszenz-markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.
Em besonderer Vorteil der erfmdungsgemaß bereitgestellten Sondenkombination ist ihr Einsatz in situ-Nachweisver- fahren. Häufig treten hier steπsche Probleme bei der Hybπdi- sierung auf, und die m der Zelle vorhandenen Proteine können den Erfolg einer m situ-Hybridisierung durch Maskierung wichtiger Nukleotide gefährden. Nicht vorhersehbar war somit auch die Möglichkeit, die vorliegende Sondenkombination für Hybridisierungen einzusetzen, insbesondere für in situ-Hybridi- sierungen, und nicht nur PCR-Verfahren. Hybridisierungsmetho- den und PCR-Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt, und es sei hier nur beispielsweise auf die Veröffentlichung von C. Mulhardt, Der Experimentator: Molekularbiologie, G. Fischer, Stuttgart, Jena, Lübeck, Ulm, 1999, hingewiesen. Auf diese Veröffentlichung wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von nicht beschrankenden Ausfuhrungsbeispielen und Abbildungen naher dargestellt. Die Abbildungen zeigen:
Fig.1 : Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa Referenzstammen und kimischen Isolaten mit rRNS-gerichteten Sonden.
Fig.2 : 25 Isolate aus abgef lltem nichtkarboniertem naturlichem Mineralwasser. Beispiel 1 :
Fluoreszenzmikroskcpischer Nachweis von fixiertem Ps . aeruginosa m Wasserproben (abgefülltes Mineralwasser, Quell- oder Tafelwasser) oder Flussiganreicherungen daraus.
250 ml Mineralwasser oder Bakterienanreicherung aus 250 ml m Flussigmedium wird durch bakteriendichte, weiße Membranfilter (z.B. Polycarbonatfilter, Mill pore GTTP02500, Eschborn) mit Standard-Filtrationsanlagen filtriert. Anschließend werden die Filter m 5 ml 3% Paraformaldehydlosung (3% PFA) für 15 Minuten mkubiert (=fιxιert) . Nach Absaugen der Fixierungslosung wird 5 ml steriles Wasser auf den Filter gegeben und abgesaugt. Die Filter werden auf Glasobj ekttrager gelegt und mit 50 μl Hybπdisierungslosung betropft (=62,5 ng PAE1-CY3 und 250 ng PAE2-Fluorescem m Hybπdisierungspuffer ( 0.9M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2 - 8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid) und für 90 Minuten m einer geschlossenen Kammer unter aquimolarer Atmosphäre (z.B. Kammer enthalt Tissue, das mit 2 ml des Hybridisierungspuffers getrankt ist) bei 46 °C mkubiert. Daraufhin wird das Filter m 50 ml Waschlosung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5mM EDTA (pH8.0) für 15 Minuten bei 48 °C mkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Nach dem Trocknen wird das Filter auf eine Trageroberflache (z.B. Glasobj ekttrager) gelegt und mit Antifad g - Medium betropft (z.B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit einem Deckglas bedeckt. Zur Detektion der Signale wird das Filter im Epifluoreszenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünen Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluorescem und Rhodam ) bei 400- bis 1000-facher Vergrosserung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grüner Anregung rot.
Beispiel 2: Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa m Flussiganreicherungen aus klinischen Proben m selektivem oder nichtselekti- vem Nahrmedium auf Objektträgern.
1 ml schwach trübe Flussiganreicherung wird mit 1 ml absolutem Ethanol gemischt und mindestens 15 Minuten bei 4°C mkubiert. Zentπfugation bei 5000g 3 Minuten. Verwerfen des Uberstandes. Resuspendieren des Pellets m 500 μl phosphatgepufferter NaCl- Losung (PBS-Puffer) , Zugabe von 500 μl 100% Ethanol. Gut mischen. 10 μl der so präparierten Anreicherung m einem Reakti- onsfeld des Hybridisierungs-Obj ekttragers verteilen (z.B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objektträger mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 mm bei 46 °C auftrocknen lassen. 6 unterschiedliche Proben können auf einem der oben genannten Objektträger aufgebracht und gleichzeitig untersucht werden.
Der Objektträger muß für je 3 Minuten 50%, 70- und 100% E- thanol mkubiert werden. Nach dem Trocknen wird auf jedes der mit einer Probe versehene Reaktionsfeld mit je 10 μl Hybπdi- sierungslosung (=12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescem in in Hybridisierungspuffer ( 0.9M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2 - 8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid)) uberschichtet und für 90 Minuten m einer geschlossenen Kammer unter aquimolarer Atmosphäre (z.B. Kammer enthalt Tissue, das mit 2 ml des Hybridisierungspuffers getrankt ist) bei 46 °C mkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslosung mit auf 48 °C vorgewärmter Waschlosung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5mM EDTA (pHδ.O)) vom Objektträger gespult und dieser m 50 ml Waschlosung für 15 Minuten bei 48 °C mkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser abspulen und trocknen lassen. Den Objektträger mit Antifadmg - Medium betropfen (z.B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Signale werden die einzelnen Reaktionsfeider im Epifluores- zenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzflltern für Fluorescem und Rhodamm) bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grüner Anregung rot.
Beispiel 3:
Schnellscreenmg von auf selektiven oder nichtselektiven Nah- ragarplatten gewachsenen Kolonien aus klinischen Proben, Umweltproben oder Mineral-, Quell-, und Tafelwasserproben bzw. deren Produkten zur Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa .
Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte werden mit je 50 μl PBS-Puffer gefüllt. Mit sterilen Zahnstochern werden nun Proben der Bakterienkolonien von der Agarplatte in den Vertiefungen suspendiert. Zugabe von je 50 μl 100% Ethanol m die Vertiefungen, die suspendierte Kolonienproben enthalten. Mischen. Je 10 μl der so fixierten Proben pro Reaktionsfeld des Hybridisierungs-Objekttragers verteilen (z.B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objekt- trager mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 mm bei 46 °C auftrocknen lassen. 6 verschiedene fixierte Kolonien können auf einem der oben genannten Objektträger aufgebracht und gleichzeitig untersucht werden.
Nach Auftrocknung der Proben muß der Objektträger für je 3 Minuten m 50%, 70% und 100% Ethanol mkubiert werden. Nach dem Trocknen wird jedes der mit einer Probe einer fixierten Kolonie versehenen Reaktionsfeider mit je 10 μl Hybridisierungslo- sung (=12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescem m Hybπdisierungspuffer ( 0.9M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2 - 8.0; , 0.01% SDS, 60- Formamid)) uberschichtet und für 90 Minuten m einer geschlossenen Kammer unter aquimolarer Atmosphäre (z.B. Kammer enthalt Tissue, das mit 2 ml des Hybridisierungspuffers getrankt ist) bei 46 °C mkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslosung mit auf 48 °C vorgewärmter Waschlosung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5mM EDTA (pH8.0)) vom Objektträger gespult und dieser m 50 ml Waschlosung für 15 Minuten bei 48 °C mkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser abspulen und trocknen lassen. Objektträger mit Antifa- dmg - Medium betropfen (z.B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Signale werden die einzelnen Reaktionsfeider im Epifluoreszenz- mikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluoresce und Rhodamm) bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grüner Anregung rot.
Beispiel 4 :
Eventuelle Anwendung: Direkte in situ Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa im Mucus von Patienten mit cystischer Fibröse (=Mukovιszιdose-Patιenten) .
Mucusprobe wird in 100 - 1000 μl PBS-Puffer (pH 7,2 - 7,4) eingebracht und mit 100 - 1000 μl absolutem Ethanol gemischt und mindestens 15 Minuten bei 4°C mkubiert. Fixierte Mucusprobe auf Reaktionsfeld des Hybridisierungs-Obj ekttragers verteilen (z.B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objektträger mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 mm bei 46 °C auftrocknen lassen. 6 unterschiedliche Proben können auf einem der oben genannten Objektträger aufge- bracht und gleichzeitig untersucht werden.
Der Objektträger muß für je 3 Minuten in 50%, 70^ und 100% E- thanol mkubiert werden. Nach dem Trocknen wird jedes der mit einer Probe versehenen Reaktionsfelder mit je 10 μl Hybridi- sierungslosung (=12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescem m Hybridisierungspuffer ( 0.9M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2 - 8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid)) uberschichtet und für 90 Minuten einer geschlossenen Kammer unter aquimolarer Atmosphäre (z.B. Kammer enthalt Tissue, das mit 2 ml des Hybridisierungspuffers getrankt ist) bei 46 °C mkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslosung mit auf 48 °C vorgewärmter Waschlosung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5mM EDTA (pH8.0)) vom Objektträger gespult und dieser m 50 ml Waschlo- sung für 15 Minuten bei 48 °C mkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser abspulen und trocknen lassen. Objektträger mit Antifa- ding - Medium betropfen (z.B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Signale werden die einzelnen Reaktionsfeider im Epi- fluoreszenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluorescem und Rhodamm) bei 400- bis 1000-facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grüner Anregung rot.

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest zwei Sonden mit je zumindest zehn aufeinanderfolgenden Nukleotiden der nachfolgenden zwei Sequenzen enthält:
PAEl: 5'- tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg -3
PAE2 : 5'- tct cct tag agt gcc cac ccg agg tgc tgg taa cta ag -3 λ
die je in Kombination von zumindest zwei dieser Sequenzen zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa geeignet sind und/oder zumindest ein oder zwei Derivate dieser Sequenzen, bei denen ein, zwei oder drei der Nukleotide an einem oder beiden Rändern der Sonde und/oder ein oder zwei Nukleotide im Inneren der Sonde deletiert oder durch ein anderes Nukle- otid ersetzt sind, wobei die spezifische Bindung an die DNA oder RNA von Ps . aeruginosa beibehalten bleibt.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat eine Sonde mit zumindest 12 - 26 aufeinanderfolgenden Nukleotiden ist.
3. Mittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat eine Sonde mit 14 - 22, bevorzugt 18 aufeinanderfolgenden Nukleotiden ist.
4. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Sonde eine Kombination der nachfolgenden zwei Nukleotid- sequenzen eingesetzt wird:
gt aac cgt ccc cct tgc g
gt gcc cac ccg agg tgc t
5. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die komplementäre Sequenz der Sonden umfaßt.
6. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es spezifisch zu Sequenzen der 16S rRNA von Ps . aeruginosa komplementär ist.
7. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden eine Markierung aufweisen.
8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Digoxigenmmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Biotm-Markierung ist.
9. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.
10.Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden chemisch modifiziert vorliegen.
11.Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an PNA gebunden vorliegen.
12.Verwendung eines Mittels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, welches zumindest die zwei Sonden PAEl und PAE2 oder Derivate hiervon nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche enthalt, zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa.
3. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps . aeruginosa mit den nachfolgenden Verfahrensschritten:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer auf die Anwesenheit von Ps . aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zumindest den zwei Sonden PAEl und PAE2 und/oder ihren Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche und Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps . aeruginosa spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als PCR-Verfahren ausgestaltet ist.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt werden, um den Bereich zwischen den Sonden auf dem Gen für die rRNA zu vervielfältigen, und nachfolgender Nachweis des vervielfältigten, für Ps . aeruginosa spezifischen Bereichs der rRNA.
17. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als in situ-Hybridisierungsverfahren ausgestaltet ist.
18 . Kit , dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest ein Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche aufweist.
19. Festphasenmatrix, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der Sonden, wie sie in einem der Ansprüche 1-8 definiert sind, an die Matrix gebunden aufweist .
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