DE10051174A1

DE10051174A1 - Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken und dazu geeignete Mittel

Info

Publication number: DE10051174A1
Application number: DE10051174A
Authority: DE
Inventors: Lars Wassill
Original assignee: MICRODIAGNOSTICS AG
Current assignee: MICRODIAGNOSTICS AG
Priority date: 2000-10-16
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2002-05-02

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken-DNA. Es werden Oligonukleotide zur Verfügung gestellt, die den Nachweis verschiedener Toxingene und Staphylokokkenarten durch eine Amplifikationsreaktion erlauben. Ebenfalls kann eine Methicillinresistenz nachgewiesen werden. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und Testkits, die diese Oligonukleotide enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die geeignet sind um Staphylococcus aureus-Bakterien nachzuweisen.

Staphylococcus aureus ist seit langem als Eitererreger bekannt, während andere Vertreter der Gattung Staphylococcus apathogene Besiedler der menschlichen Haut sind. In der Medizin spielen neben S. aureus nur noch S. epidermidis und S. saprophyticus eine, wenn auch untergeordnete Rolle.

Verschiedene Stämme von Staphylococcus aureus sind in der Lage Enterotoxine (Staphylokokken-Enterotoxin = SE) zu produzieren. Insgesamt sind bislang acht verschiedene Vertreter dieser Toxinklasse (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH und SEI) entdeckt und charakterisiert worden. Dabei zeigen die Proteine auf Aminosäureebene eine Identität zwischen 21 und 82% (Dinges et al., Clin. Microbiol. Rev. 13 (2000), 16-34). Zudem produzieren bestimmte Staphylokokkenstämme das Toxic Shock Syndrome Toxin (TSST), welches eher mit dem streptokokkalen Exotoxin strukturverwandt ist.

SEs sind verantwortlich für Lebensmittelvergiftungen, Auslöser des Toxic Shock Syndroms (TSS) und zudem Superantigene, die in der Lage sind, alle T-Zellen, die ein bestimmtes Vβ-Element besitzen, zu stimulieren (Bohach et al., Crit. Rev. Microbiol. 17 (1990), 251-272).

Zusätzlich ist eine steigende Anzahl von Isolaten zu beobachten, die über Resistenzen gegenüber Methicillin und dessen Derivaten (Oxacillin etc.) verfügen. Die sogenannten MRSAs (Methicillin-resistenten-Staph.-aureus) bilden durch die Schwierigkeit der Therapierbarkeit einen signifikanten Risikofaktor für betroffene Patienten.

Die Resistenz ist auf dem mecA-Gen plasmidkodiert, welches zusammen mit den Genen mecR und mecI ein Cluster bildet. Dieser Gencluster kann aber auch in das Genom integriert werden (Chambers, Clin Microbiol. Rev. 10 (1997), 781-791). Auffällig ist die Tatsache, daß der Anteil der resistenten Staphylokokken, die zudem über Enterotoxingene verfügen, stetig steigt.

In der medizinischen Routinediagnostik sowie in der Lebensmittelanalytik sind schnelle Nachweissysteme für Enterotoxinproduzenten und/oder resistente Staphylokokken von großer Bedeutung. Der klassische Nachweis von Staphylokokken über Selektivmedien (z. B. Vogel-Johnson-Agar) und anschließende Untersuchung der biochemischen Eigenschaften (Zuckerverwertung, pH-Toleranz etc.) erlaubt aber keine weitere Aussage als die Speziesidentifizierung. Mittels Antibiotikagramm können mögliche Resistenzen detektiert werden.

Diese Untersuchungen benötigen aber zumindest 48 h, zudem muß für die weitergehenden Untersuchungen eine Reinkultur vorliegen.

In der letzten Zeit wurden eine Reihe von Schnelltests entwickelt mit denen der Nachweis von Staph. aureus verkürzt werden konnte. Zu diesen gehören Koagulase-Tests, verschiedene Agglutinationstests sowie TNase-Tests (Enzymtätigkeit, monoklonale Antikörper).

Verschiedenen Arbeitsgruppen gelang es die diversen Enterotoxingene zu klonieren und zu charakterisieren.

So sind die Sequenzen der verschiedenen Gene in der EMBL- Datenbank hinterlegt worden:

Die Möglichkeit, über die Detektion der Gene medizinische Diagnostik zu betreiben, wurde schnell erkannt. (z. B. Johnson et al., J. Clin. Microbiol. 29 (1991), 426-430 oder Kolbert et al., J. Clin. Microbiol. 33 (1995), 2179-2182).

Allerdings war es bislang nicht möglich die genannten Charakteristika (Toxinproduktion, Antibiotikaresistenz, Artidentifizierung) in einer Prozedur festzustellen.

Bei nukleinsäuregestützten Methoden kann die Detektion durch direkte Hybridisierung von Sonden an keimspezifische DNA bzw. RNA erfolgen (siehe z. B. Datta et al., Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 2256-2259). Dazu bedarf es aber rund 10⁵-10⁶ Moleküle der Zielnukleinsäure. Diese niedrige Sensitivität kann durch Kombination, z. B. mit einer PCR zur Vervielfältigung der Zielnukleinsäuresequenz ausgeglichen werden. Mehrere PCR-Nachweise zur Detektion von diversen Arten der Gattung Staphylococcus wurden beschrieben (Überblick siehe Brakstand und Maeland (1995) APMIS 103, 209-218; siehe auch die internationale Patentanmeldung WO 99/05159).

Ferner können die Ligase-Kettenreaktion (WO 89/09835), die "self-sustained sequence replication" (EP 329 822), das "transcription based amplification system" (EP 310 229) oder das Qβ RNA-Replikase-System (US 4,957,858) zur Amplifikation von Nukleinsäuren eingesetzt werden.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun ein geeignetes Nachweisverfahren zu entwickeln, das in der Lage ist, simultan die verschiedenen Gene der Enterotoxine zu detektieren, sowie die medizinisch relevanten Staphylokokkenarten zu identifizieren.

Dazu wurde ein Primerset bestehend aus zehn verschiedenen Oligonukleotiden entwickelt, welches die Amplifikation bestimmter Bereiche der verschiedenen Gene erlaubt. Überraschenderweise können die zehn verschiedenen Oligonukleotide als Primer in einer einzigen Amplifikationsreaktion unter identischen Bedingungen eingesetzt werden.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus-DNA in einer Probe durch eine DNA-Amplifikationsreaktion, in der als Primer die Oligonukleotide SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 23 und 24 eingesetzt werden.

Es können aber nicht nur die spezifischen genannten Oligonukleotide verwendet werden, sondern auch Varianten davon. Dem Fachmann ist klar, daß nur geringfügige Änderungen der Nukleotidsequenz nicht unbedingt die Funktionalität des Moleküls beeinflussen müssen. Insbesondere Verlängerungen oder Verkürzungen der Sequenz der erfindungsgemäßen Oligonukleotide um wenige Nukleotide, vorzugsweise um höchstens fünf Nukleotide, bevorzugter um höchstens drei Nukleotide, am bevorzugtesten um höchstens ein Nukleotid, können zu Molekülen führen, die genauso für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. Dies betrifft insbesondere Verlängerungen am 5'-Ende des Oligonukleotids. Auch einzelne Nukleotidaustausche müssen die Amplifikationsfähigkeit der Primer nicht beeinträchtigen. Solche Varianten, bei denen ein oder zwei Nukleotide an solchen Stellen ausgetauscht sind, daß diese noch ausreichend hybridisieren, können daher auch erfindungsgemäß eingesetzt werden. Daher ist die Verwendung der genannten Varianten in dem erfindungsgemäßen Verfahren von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Für alle in dieser Anmeldung offenbarten Oligonukleotide können auch Varianten im oben definierten Sinn eingesetzt werden.

Als Probe, die auf die Anwesenheit von Staphylococcus aureus- DNA hin untersucht werden soll, sind verschiedenste Zusammensetzungen möglich. Es kann sich um Proben handeln, die aus Patienten isoliert worden sind, beispielsweise Blut- oder Gewebeproben. Proben können zudem aus fertigen Lebensmitteln, Lebensmittelrohstoffen oder reinem Wasser bestehen. Es ist ebenfalls möglich, daß es sich um eine Bakterienkultur handelt, die bereits auf Kulturplatten oder in flüssiger Nährlösung kultiviert worden ist. Schließlich kann es sich auch um DNA-Zubereitungen handeln, die aus den genannten Proben bzw. Kulturen isoliert worden sind.

Vorzugsweise handelt es sich bei der DNA- Amplifikationsreaktion um eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Technik der PCR ist beispielsweise in Saiki et al., Science 293 (1988), 487-491) beschrieben. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß nach der Amplifikationsreaktion zumindest ein Teil des Amplifikats auf einem Gel, vorzugsweise auf einem Agarosegel, aufgetrennt wird und sichtbar gemacht wird. Die Visualisierung kann durch Ethidiumbromid oder andere bekannte Substanzen zur Anfärbung von DNA erfolgen.

Die PCR kann auch als Festphasen-PCR durchgeführt werden. Dabei wird ein Oligonukleotidprimer ("Festphasen-Primer") über eine kovalente Bindung an eine Oberfläche (z. B. Polystyrol) gebunden. Die PCR-Reagenzien einschließlich eines Primer-Mix aus "Festphasen-Primer" und zweitem Primer im Verhältnis 1 : 8 werden dazugegeben und die PCR in einem geeigneten Thermocycler durchgeführt. Amplifikationsprodukte werden an den immobilisierten Oligonukleotidprimern gebildet und können z. B. über eine Markierung des zweiten Oligonukleotidprimers gebildet werden. Daher können die verwendeten Oligonukleotide markiert sein. Der Ausdruck "Oligonukleotid" in dieser Anmeldung umfaßt auch markierte Oligonukleotide. Mögliche Markierungen sind gekoppelte Fluorophore, Aminolinker oder Phosphatgruppen.

Die als Primer eingesetzten Oligonukleotide sind in der Lage, spezifische DNA-Abschnitte zu amplifizieren. Aufgrund der Größe der Amplifikationsprodukte ist eine Aussage darüber möglich, ob bestimmte Staphylococcus aureus-Stämme in der Probe vorhanden sind, die Enterotoxine bilden können. Weiterhin ist es möglich, das Vorhandensein der medizinisch relevanten Staphylokokkenarten zu überprüfen.

Das Primerpaar bestehend aus den Oligonukleotiden SEQ ID NO 1 und 2 amplifiziert spezifisch DNA, die für die Enterotoxine SEA oder SEE kodiert. Das Primerpaar bestehend aus den Oligonukleotiden SEQ ID NO 3 und 4 amplifiziert spezifisch DNA, die für die Enterotoxine SEB oder SEC kodiert. Schließlich amplifiziert das Primerpaar bestehend aus den Oligonukleotiden SEQ ID NO 5 und 6 spezifisch DNA, die für das Enterotoxin SED kodiert.

Das Primerpaar bestehend aus den Oligonukleotiden SEQ ID NO 7 und 8 ist in der Lage, DNA aus verschiedenen Staphylokokkenarten zu amplifizieren. Darunter sind die medizinisch relevanten Staphylokokken S. aureus, S. epidermidis und S. saprophyticus.

Primerpaar 1 (siehe Fig. 1) führt zu einem Amplifikat der Größe 296 bp, Primerpaar 2 führt zu einem Amplifikat von 453 bp, Primerpaar 3 führt zu einem Amplifikat von 242 bp. SEQ ID NO 7 und 8, die für DNA aus verschiedenen Staphylokokkenarten spezifisch sind, führen zu einem Amplifikationsprodukt von 366 bp.

In der medizinischen Routinediagnostik erfolgt die eindeutige Identifizierung eines Keimes als Staphylococcus aureus über den Nachweis der Koagulase in Form eines Agglutinationstests. Die diagnostische Bedeutung dieses Proteins wird dadurch deutlich, daß in der Medizin Staphylokokken in Koagulase positive bzw. -negative (CPS bzw. CNS) Vertreter eingeteilt werden. Die DNA-Sequenz des coa-Gens, welches die Koagulase kodiert, wurde Ende der 80er Jahre analysiert (z. B. Kaida et al., J. Biochem. 102 (1987), 1177-1186) und weist am C- terminalen Ende sich wiederholende Sequenzelemente auf. Hingegen ist der zentrale Teil des Gens in seiner Sequenz recht konserviert und eignet sich daher für einen molekularbiologischen Nachweis des Gens und somit zur Identifizierung von Staphylococcus aureus. Zu den genannten, simultan verwendbaren PCR-Primern wird zusätzlich ein weiteres Primerpaar eingesetzt, welches einen 455 bp großen Bereich des coa-Gens amplifiziert. Das Primerpaar zur Amplifizierung des Teilbereichs des coa-Gens besteht aus den Oligonukleotiden SEQ ID NO 23 und SEQ ID NO 24.

Nach Auftrennung der Amplifikationsprodukte und Sichtbarmachung der aufgetrennten DNA in dem Gel können die verschiedenen Produkte aufgrund der Größe der Banden identifiziert werden. Somit kann auf die Anwesenheit von DNA, die für die verschiedenen Enterotoxine kodiert, geschlossen werden. Außerdem ist eine Aussage darüber möglich, ob ein medizinisch relevanter Staphylokokkenstamm vorliegt. Durch die erfindungsgemäßen Oligonukleotidprimer ist eine Amplifikation von DNA-spezifischen Abschnitten der Enterotoxingene A und E bzw. B und C (alle Unterklassen des Toxintyps) mit Hilfe nur jeweils eines Primerpaars möglich. Mit den Primern SEQ ID NO 7 und 8 ist es möglich einen DNA-Bereich zu amplifizieren, der für einige Arten der Gattung Staphylococcus spezifisch ist (siehe Tabelle I). Durch die Primer SEQ ID NO 23 und 24 kann schließlich festgestellt werden, ob S. aureus vorliegt oder nicht.

Dadurch konnte die Zahl der zu verwendenden Primer begrenzt werden, was zu einer Reduzierung der Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikationsprodukte führt.

Überraschenderweise können die zehn Primer in einer einzigen PCR unter identischen Bedingungen eingesetzt werden. Dies konnte nicht erwartet werden, da die optimalen Bedingungen eines Primers von zahlreichen Faktoren wie Primerlänge, GC- Gehalt, Sekundärstruktur, usw. abhängen. Bei zehn Primern ist auch die Gefahr der Primer-Dimer-Bildung nicht unerheblich. Es stellt daher einen überraschenden Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß die zehn Primer unter identischen Bedingungen funktionieren. Dadurch können separate Versuchsansätze mit jeweils nur einem Primerpaar vermieden werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann auch noch die Anwesenheit von DNA, die für das "Toxic Shock Syndrome Toxin-1" (TSST-1) kodiert, überprüft werden. Dazu werden in einer Amplifikationsreaktion neben den obenstehend genannten Oligonukleotiden auch noch die Oligonukleotide SEQ ID NO 9 und 10 oder Varianten davon eingesetzt. Diese sind spezifisch für TSST-1-DNA. Durch die Primer SEQ ID NO 9 und 10 kann DNA mit einer Größe von 216 bp spezifisch amplifiziert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind zwei weitere Oligonukleotide als Primer anwesend. Die Oligonukleotide SEQ ID NO 11 und 12 oder Varianten davon erlauben die spezifische Amplifikation eines Abschnitts der Plasmid-DNA, die das Gen für Methicillinresistenz trägt. Die Größe des Amplifikationsprodukts ist 376 bp. Die Resistenz gegenüber Methicillin und dessen Derivaten hat erhebliche klinische Bedeutung.

Überraschenderweise können die 14 verschiedenen Oligonukleotidprimer in einer PCR unter identischen Bedingungen eingesetzt werden. Durch eine einzige PCR ist damit eine Aussage darüber möglich, ob bestimmte Enterotoxine von S. aureus vorliegen, ob eine medizinisch relevante Staphylokokkenart vorliegt und ob die Staphylokokkenart gegen Methicillin resistent ist.

Zur Bestätigung und Konkretisierung der durch die Amplifikationsreaktion gemachten Aussage kann wenigstens ein Teil der Amplifikationsprodukte einem Hybridisierungsverfahren mit einer oder mehreren Oligonukleotidsonden unterworfen werden. Erfindungsgemäß wird die Hybridisierung mit wenigstens einer Sonde durchgeführt, die ausgewählt ist aus SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25 und 26. Selbstverständlich können auch dazu komplementäre Oligonukleotide als Sonden eingesetzt werden. Auch Varianten der genannten Oligonukleotide oder ihrer komplementären Oligonukleotide können als Sonden verwendet werden. Die Oligonukleotidsonden SEQ ID NO 13, 14, 15, 16 und 17 hybridisieren spezifisch mit DNA, die für die Enterotoxine SEA, SEB, SEC, SED bzw. SEE kodiert. Oligonukleotid SEQ ID NO 18 hybridisiert spezifisch mit DNA, die für TSST kodiert. SEQ ID NO 19 ist spezifisch für das Regulatorgen des Methicillinresistenzgens. Schließlich hybridisieren die Oligonukleotide SEQ ID NO 20, 21 und 22 spezifisch mit DNA aus Staphylococcus aureus, S. saprophyticus bzw. S. epidermidis. Die beiden Oligonukleotidsonden SEQ ID NO 25 und SEQ ID NO 26 hybridisieren spezifisch mit DNA, die für die staphylokokkale Koagulase kodiert. SEQ ID NO 25 und 26 können jeweils einzeln eingesetzt werden, oder auch zusammen, um dadurch ein stärkeres Signal zu erhalten. Selbstverständlich ist die Verwendung der komplementären Sequenzen bzw. geringfügig modifizierter (besonders am 5'-Ende verlängerter) Sequenzen als Sonden möglich. Durch eine Hybridisierungsreaktion nach der Amplifikationsreaktion kann damit der Enterotoxintyp genau ermittelt werden, darüber hinaus ist es möglich, die tatsächlich vorhandene Staphylokokkenart zu ermitteln. Somit ist es möglich, in einer einzigen Amplifikationsreaktion, gefolgt von einer Hybridisierungsreaktion, zehn Aussagen zu gewinnen. Die Hybridisierungsreaktion wird bevorzugt als Southern Blot, Dot/Slot Blot oder als reverse Hybridisierung durchgeführt. Diese Techniken sind an sich bekannt (z. B. Southern E. M., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517; Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1541-1552 oder Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6230-6234). Die Oligonukleotide können dabei radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Die Oligonukleotide dieser Anmeldung, die als Sonden zur Hybridisierung eingesetzt werden können, können vorteilhaft auch an kleinen Kügelchen, sogenannten "microbeads" immobilisiert sein. Diese "microbeads" können beispielsweise magnetisch oder farblich kodiert sein. Sind die "microbeads" farblich kodiert, so handelt es sich in der Regel um Polystyrolpartikel mit einer Größe kleiner als 1 mm. Es sind aber auch andere Polymerpartikel denkbar. Die farbliche Kodierung der "microbeads" erfolgt über eine Kombination von zwei verschiedenen Farbstoffen, die jeweils in unterschiedlicher Abstufung im Kugelinneren vorliegen. Werden beispielsweise zehn verschiedene Farbstoffnuancen verwendet, so ergeben sich 10 × 10 = 100 Farbkombinationen. Durch Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren die "microbeads" ein Fluoreszenzsignal bestimmter Farbe und Intensität, das die Identifizierung der "beads" erlaubt. Die Herstellung und Verwendung farbkodierter "microbeads" ist in den Druckschriften WO 99/19515 und WO 99/36564 näher erläutert.

Es ist auch möglich die Identität des PCR-Produkts anstatt durch eine Hybridisierung über eine Schmelzkurvenanalyse eindeutig zu klären (Ririe et al., Anal. Biochem. 245 (1997), 154-160). Damit kann festgestellt werden, ob ein mit den Primern 1 und 2 amplifiziertes PCR-Produkt (Größe 296 bp) einen Sequenzbereich des Gens sea oder des Gens see repräsentiert. Die unterschiedlichen Profile der Schmelzkurven der Amplifikationsprodukte sind durch den unterschiedlichen GC%-Gehalt und die Sequenzunterschiede der beiden DNA-Bereiche bedingt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann daher nach der Amplifikationsreaktion eine Schmelzkurvenanalyse bestimmter PCR-Produkte durchgeführt werden. Dazu werden nach erfolgter PCR die Produkte hitzedenaturiert, schnell auf 50°C abgekühlt und dann langsam (0,1°C/s) auf 94°C geheizt. Dabei wird die Fluoreszenz des in den Doppelstrang interkalierenden Farbstoffs (z. B. SYBR Green) im Verlauf der Aufheizphase gemessen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die die Oligonukleotide SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 23 und 24 oder Varianten davon enthält. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält zusätzlich die Oligonukleotide SEQ ID NO 9 und 10 oder Varianten davon, eine weitere bevorzugte Zusammensetzung kann auch die Oligonukleotide SEQ ID NO 11 und 12 oder Varianten davon enthalten. Die Zusammensetzung kann in verschiedener Form vorliegen, z. B. als wäßrige Lösung oder als Feststoff, beispielsweise als Lyophilisat. Es können verschiedene weitere Stoffe enthalten sein, wie Puffersubstanzen (Tris, Phosphat, usw.) und/oder bestimmte Salze (NaCl, MgCl₂, usw.).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Testkit, der die Oligonukleotide SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 23 und 24 oder Varianten davon enthält. Bevorzugte Testkits enthalten auch noch die Oligonukleotide SEQ ID NO 9 und 10 oder Varianten davon und/oder die Oligonukleotide SEQ ID NO 11 und 12 oder Varianten davon. Die Oligonukleotide können markiert sein. Die erfindungsgemäßen Testkits können weiterhin als Hybridisierungssonden eines oder mehrere der Oligonukleotide SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25 und 26 enthalten. Der Testkit kann auch dazu komplementäre Oligonukleotide oder Varianten davon enthalten. Die letztgenannten Oligonukleotide, die als Sonden verwendet werden können, können radioaktiv oder Fluoreszenz-markiert sein. Die Sonden können auch auf einem festen Träger immobilisiert sein. Dabei kann es sich um Membranen, "microbeads" oder Mikrotiterplatten handeln. Schließlich können in dem erfindungsgemäßen Testkit auch Reagenzien enthalten sein, die bei einer PCR- oder Hybridisierungsreaktion Anwendung finden können. Das kann beispielsweise eine Hybridisierungslösung, eine Waschlösung oder ein Konzentrat davon sein. Zur Durchführung einer PCR kann auch ein Pufferkonzentrat, eine Magnesiumchloridstammlösung und/oder eine DNA-Polymerase enthalten sein. Vorzugsweise ist eine thermostabile DNA- Polymerase enthalten.

Fig. 1 zeigt sieben Primerpaare, mit denen die links angegebenen DNA-Spezies amplifiziert werden können. "V" steht für "Vorwärts-Primer" (engl. forward primer), "R" steht für "Rückwärts-Primer" (engl. reverse primer). Das in SEQ ID NO 4 vorkommende Symbol "w" steht für "A oder T". In der rechten Spalte sind die Größen der jeweiligen Amplifikationsprodukte angegeben.

Primerpaar 1 amplifiziert einen Abschnitt der für SEA oder der für SEE kodierenden DNA.

Primerpaar 2 amplifiziert einen Abschnitt der für SEB oder der für SEC kodierenden DNA.

Primerpaar 3 amplifiziert einen Abschnitt der für SED kodierenden DNA.

Primerpaar 4 amplifiziert einen Abschnitt der für mecR1 und mecA kodierenden DNA, sowie einem dazwischenliegenden, nichtkodierenden Spacerbereich.

Primerpaar 5 amplifiziert einen Abschnitt der für TSST-1 kodierenden DNA.

Primerpaar 6 amplifiziert einen DNA-Abschnitt aus mehreren Staphylokokkenarten, darunter S. aureus, S. epidermidis und S. saprophyticus.

Primerpaar 7 amplifiziert einen DNA-Abschnitt des Koagulase- Gens von S. aureus.

Fig. 2 zeigt zwölf Sonden, die in einer Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden können. Links ist jeweils die DNA-Spezies angegeben, die mit der jeweiligen Sonde spezifisch hybridisiert.

Fig. 3 zeigt einen Teil der Ergebnisse von Beispiel 1. Dabei wurden nach Amplifikation mit den Primerpaaren 1 bis 6 die PCR-Produkte der Ansätze MD16, MD17 und MD18 auf einem Gel aufgetrennt und sichtbar gemacht. Alle drei Ansätze sind positiv für Staphylokokken (Primerpaar 6) und sind Methicillin-resistent (Primerpaar 4). MD16 ist positiv für SEA/SEE (Primerpaar 1), MD18 ist positiv für SED (Primerpaar 3).

Fig. 4 zeigt das Ergebnis des Versuchs von Beispiel 2. Verschiedene Ansätze wurden mit den Primerpaaren 1 bis 6 amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem Gel aufgetrennt und sichtbar gemacht. Spur 1 zeigt einen Ansatz, in dem nur MD19-DNA anwesend war. Die Spuren 2, 3 und 5 zeigen Ansätze mit verschiedenen Mischungsverhältnissen MD18 : MD19. In Spur 4 ist ein Größenmarker aufgetragen (1 Kb Plus DNA Ladder™ (GibcoBRL®)). Spur 6 zeigt die Nullprobe, die anstatt DNA nur Wasser enthält und der Überprüfung möglicher Kontaminationen im Reaktionsansatz dient.

Fig. 5 zeigt das Ergebnis des Versuchs von Beispiel 3. Das Isolat MD18 wurde einer PCR mit 14 Primern unter den Bedingungen von Beispiel 1 unterworfen. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und visualisiert.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Nachweis von enterotoxinproduzierenden MRSAs mit der Polymerase-Kettenreaktion

Aus Reinkulturen der in Tabelle I aufgeführten Bakterien wurde mittels eines Standardverfahrens DNA isoliert. Je ca. 10 bis 100 ng dieser DNA-Präparationen wurde dann in Gegenwart der Primerpaare 1) bis 6) (siehe Fig. 1), 200 µM dNTPs, 2,5 mM MgCl₂ und 1 U Taq-DNA-Polymerase (Promega) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR-Reaktionspuffer (Typ B, enthält Triton X-100) in die PCR eingesetzt. Alternativ wurde auch direkt Zellmaterial aus Flüssigkulturen verwendet.

Die PCR wurde in einem Eppendorf-Gradientencycler mit dem folgenden Thermoprofil durchgeführt:

Nach Beendigung der PCR wurden die Amplifikationsprodukte mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung visualisiert. Produkte mit einer Länge, die mit der erwarteten Länge eines möglichen spezifischen Amplifikats übereinstimmt, wurde nur in Fällen beobachtet, bei denen DNA von Staph. aureus (Primer 1) bis 6)) oder anderer Staphylokokkenarten (nur Primer 6)) in der PCR anwesend war.

Fig. 3 zeigt die PCR-Produkte der drei Ansätze MD16, MD17 und MD18.

Die Stämme MD16 bis MD18 stammen aus der Routinediagnostik eines medizinischen Labors. Sie wurden dort physiologisch als Staph. aureus identifiziert.

Die DNA aller Isolate von Fig. 3 wird mittels Primerpaar 4) (oberste Bande = 376 bp) und Primerpaar 6 (zweitoberste Bande = 366 bp) amplifiziert. Dies bedeutet, daß sie alle Staphylokokken mit einem Methicillinresistenzgen sind.

MD16 bildet zusätzlich eine Bande der Größe 296 bp (Primerpaar 1)), was die Existenz des Enterotoxingens sea oder see im Genom des Isolats anzeigt.

MD17 verfügt über keine Enterotoxingene, während MD18 das Gen für das Enterotoxin D (Primerpaar 3)) besitzt.

Ob die Isolate wirklich S. aureus bzw. ob MD16 das Gen für Enterotoxin A oder E besitzt, müßte durch eine folgende Hybridisierung der PCR-Produkte mit den oben genannten Sonden geklärt werden.

In der folgenden Tabelle I sind die Resultate aller durchgeführten PCRs mit verschiedenen Bakterienstämmen zusammengefaßt:

Beispiel 2 Nachweis von enterotoxinproduzierenden MRSA aus künstlicher Mischkultur

Zellen der Isolate MD18 (MRSA) und MD19 (Salmonella chester) aus Flüssigkulturen mit identischer OD_{600 nm} wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt (1 : 10; 1 : 100 und 1 : 1000) und direkt ohne vorhergegangene DNA-Isolierung für die PCR verwendet. Die in die PCR eingesetzte Zellzahl von MD19 betrug jeweils rund 8 × 10⁵, die von MD18 entsprechend circa 8 × 10⁴, 8 × 10³ und 8 × 10². Die PCR wurde in einem Eppendorf-Gradientencycler mit dem unter Beispiel 1 aufgeführten Thermoprofil und mit den gleichen Primerpaaren durchgeführt. Anschließend wurden 10 µl des Reaktionsansatzes auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Ethidiumbromid-Färbung visualisiert.

Wie Fig. 4 zeigt, konnten die MRSA-spezifischen DNA- Abschnitte (siehe Tabelle I) auch bei einem Verhältnis von einer Zielzelle unter 1000 anderen (wenn auch schwächer) amplifiziert und somit die Staphylokokkenpräsenz in dieser Mischkultur nachgewiesen werden.

In Spur 1 von Fig. 4 ist die PCR-Reaktion aufgetragen, bei der nur Zellen von Salmonella chester anwesend waren, sie zeigt kein Amplifikationsprodukt.

Beispiel 3

Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wurde DNA des Isolats MD18 amplifiziert, wobei neben den 12 Primern aus Beispiel 1 noch die Primer SEQ ID NO 23 und 24 anwesend waren. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. Es sind vier PCR-Produkte zu beobachten (von oben nach unten):

1. Teilbereich des coa-Gens (455 bp), amplifiziert durch die Primer SEQ ID NO 23 und 24;
2. Teilbereich des mec-Genclusters (376 bp); amplifiziert durch die Primer SEQ ID NO 11 und 12;
3. Staphylokokken-Marker (366 bp), amplifiziert durch die Primer SEQ ID NO 7 und 8;
4. Teilbereich des sed-Gens (242 bp), amplifiziert durch die Primer SEQ ID NO 5 und 6.

Beispiel 4

Zur Überprüfung der Sondenspezifitäten und zur Ermittlung der Systemsensitivität wurden reverse Oligonukleotidsonden hybridisierungen im Mikrotiterplattenformat durchgeführt.

Es wurden 25 µmol der jeweiligen Oligonukleotidsonde in einer einzelnen Mikrotiterplattenkavität immobilisiert. Dies geschah unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen der Polystyroloberfläche der Kavität und den Oligonukleotiden unter Verwendung von 10 mM EDC (1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid). Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Kavitäten dreimal mit Beschichtungswaschpuffer (10 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,5% Tween 20) gewaschen und anschließend getrocknet.

Jeweils 5 µl denaturiertes PCR-Produkt, welches durch Verwendung von DIG-markierten Oligonukleotidprimern in der PCR markiert worden ist, werden zu 50 µl kalter (4°C) Hybridisierungslösung (5 × SSC; 1% Blocking Reagenz; 0,1% N- Lauryl-Sarkosin und 0,02% SDS) gegeben und diese anschließend in die Mikrotiterplattenkavität mit der immobilisierten Oligonukleotidsonde pipettiert. Die Kavitäten werden in Klebefolie verschlossen, um ein Verdunsten von Flüssigkeit während der folgenden einstündigen Inkubation bei 50°C zu verhindern.

Es folgen drei fünfminütige stringente Waschschritte bei 50°C mit Waschlösung, die vorher auf die entsprechende Temperatur vorgewärmt wurde. Die Waschlösung enthält 2 × SSC und 0,1% SDS.

Nach einem Waschschritt mit einem PBS-haltigen Waschpuffer bei Raumtemperatur folgt eine 30-minütige Inkubation mit Anti-DIG- Antikörpern-(Poly)-POD-Konjugat (Roche Diagnostics, Mannheim) (1 : 2000 Verdünnung in PBS-Waschpuffer = 2,5 mU/Kavität). Folgend werden die Kavitäten dreimal mit PBS-Waschpuffer gewaschen, bevor 100 µl TMB-Lösung zugegeben werden. Konjugierte Peroxidase (POD), welche über den an die DIG- Markierung des hybridisierten PCR-Produkteinzelstrangs gebundenen Anti-DIG-Antikörper in der Kavität immobilisiert wurde, setzt das Substrat (TMB) durch Spaltung in einen löslichen blauen Farbstoff um. Nach einer Inkubationszeit von 15 min wird diese Reaktion durch Zugabe von 100 µl 25°ige Phosphorsäure abgestoppt, und es erfolgt ein Farbumschlag nach Gelb. Die Signalstärke kann nun photometrisch bei 450 nm ausgewertet werden (Referenzwellenlänge 620 nm).

Im entwickelten System gelten folgende Auswertungskriterien:
Negativkontrolle: OD_{450 nm} < 0,200
Positives Ergebnis OD_{450 nm} < 0,400
Negatives Ergebnis OD_{450 nm} < 0,200
Graubereich 0,200 < OD_{450 nm} < 0,400

Beträgt das Signal (OD_{450 nm}) der Negativkontrolle mehr als 0,200, so ist der Testlauf nicht auswertbar, da ein zu hohes Maß an unspezifischen Signalen vorliegt.

In der folgenden Tabelle sind einige Hybridisierungsergebnisse mit Referenzorganismen bzw. Isolaten aus der klinischen Routine dargestellt (positive Resultate in fett gedruckt).

Tabelle II

Ausgewählte Hybridisierungsergebnisse (in OD_{450 nm})

In der folgenden Tabelle III sind die Resultate der durchgeführten reversen Oligonukleotidsondenhybridisierungen mit verschiedenen Vertretern der Gattung Staphylococcus zusammengefaßt:

Tabelle III

Hybridisierungsergebnisse

KHH = Isolate des städtischen Krankenhauses Harlaching;
BT = Isolate des medizinischen Labors Bieger, Tiller & Kollegen, München
ATCC = American Type Culture Collection
CCM = Czechoslovak Collection of Microorganisms
* Bei KHH 32402, KHH 9365, KHH 35252 und KHH 35083 wurde zum Nachweis des Koagulase-Gens ein Gemisch (1 : 1) aus SEQ ID NO 25 und 26 eingesetzt, ansonsten nur SEQ ID NO 25.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Staphylococcus-DNA in einer Probe durch eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikationsreaktion die Oligonukleotide
SEQ ID NO 1,
SEQ ID NO 2,
SEQ ID NO 3,
SEQ ID NO 4,
SEQ ID NO 5,
SEQ ID NO 6,
SEQ ID NO 7,
SEQ ID NO 8,
SEQ ID NO 23 und
SEQ ID NO 24
oder Varianten davon eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikationsreaktion weiterhin die Oligonukleotide
SEQ ID NO 9 und
SEQ ID NO 10
oder Varianten davon eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikationsreaktion weiterhin die Oligonukleotide
SEQ ID NO 11 und
SEQ ID NO 12
oder Varianten davon eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil der Amplifikationsprodukte nach der Amplifikationsreaktion auf einem Gel aufgetrennt und visualisiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil des Amplifikats aus der Amplifikationsreaktion einer Hybridisierung mit einem Oligonukleotid unterworfen wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
SEQ ID NO 13,
SEQ ID NO 14,
SEQ ID NO 15,
SEQ ID NO 16,
SEQ ID NO 17,
SEQ ID NO 18,
SEQ ID NO 19,
SEQ ID NO 20,
SEQ ID NO 21,
SEQ ID NO 22,
SEQ ID NO 25,
SEQ ID NO 26,
dazu komplementären Oligonukleotiden und Varianten davon.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung als Southern Blot, als dot/slot blot, oder als reverse Hybridisierung durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der verwendeten Oligonukleotide aus einer der Sequenzen SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 23 und 24 und ein bis fünf weiteren Nukleotiden am 5'-Ende besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der verwendeten Oligonukleotide markiert ist.

10. Zusammensetzung enthaltend die Oligonukleotide
SEQ ID NO 1,
SEQ ID NO 2,
SEQ ID NO 3,
SEQ ID NO 4,
SEQ ID NO 5,
SEQ ID NO 6,
SEQ ID NO 7,
SEQ ID NO 8,
SEQ ID NO 23 und
SEQ ID NO 24
oder Varianten davon.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide
SEQ ID NO 9 und
SEQ ID NO 10
oder Varianten davon enthalten sind.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide
SEQ ID NO 11 und
SEQ ID NO 12
oder Varianten davon enthalten sind.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der enthaltenen Oligonukleotide aus einer der Sequenzen SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 23 und 24 und ein bis fünf weiteren Nukleotiden am 5'-Ende besteht.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide markiert sind.

15. Testkit zum Nachweis von Staphylococcus-DNA, dadurch gekennzeichnet, daß es die Oligonukleotide
SEQ ID NO 1,
SEQ ID NO 2,
SEQ ID NO 3,
SEQ ID NO 4,
SEQ ID NO 5,
SEQ ID NO 6,
SEQ ID NO 7,
SEQ ID NO 8,
SEQ ID NO 23 und
SEQ ID NO 24
oder Varianten davon umfaßt.

16. Testkit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Oligonukleotide
SEQ ID NO 9 und
SEQ ID NO 10
oder Varianten davon umfaßt.

17. Testkit nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es die Oligonukleotide
SEQ ID NO 11 und
SEQ ID NO 12
oder Varianten davon umfaßt.

18. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es als Sonde für die Hybridisierung eines oder mehrere der Oligonukleotide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
SEQ ID NO 13,
SEQ ID NO 14,
SEQ ID NO 15,
SEQ ID NO 16,
SEQ ID NO 17,
SEQ ID NO 18,
SEQ ID NO 19,
SEQ ID NO 20,
SEQ ID NO 21,
SEQ ID NO 22,
SEQ ID NO 25,
SEQ ID NO 26,
dazu komplementären Oligonukleotiden und Varianten davon,
umfaßt.

19. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der enthaltenen Oligonukleotide markiert ist.

20. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der umfaßten Oligonukleotide aus einer der Sequenzen SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 23 und 24 und ein bis fünf weiteren Nukleotiden am 5'-Ende besteht.

21. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden(n) auf einem festen Träger immobilisiert ist/sind.

22. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hybridisierungslösung und/oder eine Waschlösung oder Konzentrate davon enthalten sind.

23. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pufferkonzentrat und/oder eine DNA- Polymerase enthalten sind.

24. Testkit nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine thermostabile DNA-Polymerase enthalten ist.