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[Gebiet des Fachgebiets]
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Sonde, welche zum Detektieren,
Identifizieren und Diagnostizieren von verursachenden Pilzen von
Infektionskrankheiten nützlich
ist.
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[Stand der Technik]
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In
der Pathologie wird Infektion als Invasion und Errichtung einer
Basis zum Wachstum in einem Organismus durch einen pathogenen Organismus
(nachstehend als „Bakterium" bezeichnet) definiert.
Der Ausbruch einer Krankheit, der durch Proliferation des pathogenen
Organismus verursacht wird, hängt
in vivo von der Wechselbeziehung zwischen der Abwehr des Wirts und
der Virulenz der Bakterien ab.
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Was
Infektionskrankheiten betrifft, ist die Verbesserung der Behandlungsmethoden
von Fungämie
zu einer wichtigen Kernfrage erhoben worden, weil Fungämie eine
ernsthafte und dringliche Krankheit ist. Insbesondere wenn ein Patient
ein Kind ist, das an Krebs leidet, kann der Patient in seinem gewöhnlichen
Fall in wenigen Tagen sterben, oder im Endstadium des Krebses mit
geschwächter
Abwehr in einem oder zwei Tagen sterben. Deshalb ist die Verbesserung
der Behandlungsmethoden davon erwartet worden.
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Bei
einer Infektionskrankheit arbeiten Phagozyten, einschließlich Neutrophile,
Monozyten und Makrophagen, hauptsächlich an der Immunabwehr des
Körpers.
Man stellt sich vor, dass bei Fungämie das Auftreten von Pilzen
im Blut eine Invasion von vorherrschenden Pilzen ist, welche aus
der Textur der Phagozyte abgesondert wurden.
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Bakteriämie (einschließlich Fungämie) ist
ein Zustand, wobei die Bakterien in das Blut abgesondert werden
und eine große
Menge von Antibiotika verabreichte wird, um sie zu behandeln, wenn
die verursachenden Bakterien sensitiv gegenüber dem Antibiotikum sind.
Jedoch ist es allgemein notwendig, weil Antibiotika die Funktionen
innerer Organe, wie Leber, verringern, darauf zu achten, die Verabreichung
eines unwirksamen Antibiotikums an einen Patienten in einem ernsthaften
Zustand zu verringern.
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Bakteriämie ist
definiert als ein Fall, worin die Fähigkeit von Zellen zur Phagozytose
die Virulenz der Bakterien nicht überwinden kann, und dann breiten
sich die Bakterien über
das Blut im gesamten Körper
aus. Allgemein wird die Bakteriämie
mit ernsthaften Symptomen wegen Toxinen, die durch die Bakterien
produziert werden, Sepsis genannt. Die Identifizierung von Sepsis,
mit anderen Worten die Aufstellung seiner Diagnose, erfordert das Überprüfen der
folgenden Punkte:1) klinische Symptome, 2) Kultivieren von Proben,
3) Gram-Färbung
der Bakterien, die in den Proben enthalten sind, und 4) Schockzustand.
Dann wird bei Beendigung der Überprüfungen dieser
Punkte die Behandlungsmethode bestimmt. Dementsprechend ist die
schnelle und zuverlässige
Identifizierung der Bakterien in der Klinik abgewartet worden.
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Bei
den Verfahren zum Detektieren und Identifizieren von Bakterien in
einer Bakterienprobe ist es ein übliches
Verfahren, eine Probe zu identifizieren, welche ein positives Signal
in einem selektiven Medium unter Verwendung eines Routineverfahrens
mittels einer Kulturflasche aufweist. Jedoch ist es tatsächlich ziemlich schwierig,
die Bakterien von dieser Blutprobe erfolgreich zu kultivieren. Außerdem werden,
wenn eine große Dosis
von Antibiotika verabreicht wird, wenn eine Bakteriämie vermutet
wurde, in vielen Fällen
Bakterien in dem Blut nicht kultiviert und wachsen gelassen, trotz
der Tatsache, dass Bakterien in der Blutprobe enthalten sind. Deshalb
wird die Rate positiver Fälle
mittels einer Kulturflasche äußerst gering.
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Obwohl
verfügbare
Subroutine-Verfahren Verfahren instrumenteller Analyse von Bestandteilen
von Bakterien und metabolischen Produkten durch Bakterien einschließen (siehe
Yoshimi Benno, „Quick
identification of bacteria with gas chromatography", Rinsho Kensa, Bd.
29, Nr. 12, November 1985, Igaku Shoin.), sind ein Verfahren, das
einen spezifischen Antikörper
verwendet (siehe vorläufige
Japanische Patentveröffentlichung
Nr. 60-224068.), und ein Hybridisierungsverfahren, das eine Spezifität von DNA
verwendet (vorläufige Japanische
Patentveröffentlichung
Nr. 61-502376), entwickelt worden, welche das Trennen der Bakterien
und Kultivieren und Wachsenlassen der Bakterien erfordert.
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Auf
der anderen Seite gibt es trotz eines etablierten Verfahrens, das
auf der Funktion des Phagozyten bei Infektionskrankheiten beruht,
ein Verfahren, einen gefärbten
Buffy coat-Abstrichs,
wobei die Leukozyten in der Blutprobe konzentriert sind, unter einem
optischen Mikroskop zu untersuchen. Allgemein gesprochen, beträgt die Rate
der Detektion von Bakterien in Buffy coat-Proben von erwachsenen
Bakteriämie-
Patienten mindestens 30 Prozent, welches dem in Blutproben aus einem
Ohrläppchen ähnelt. Jedoch
wurde davon berichtet, dass, wenn die Patienten neugeborene Kinder
waren, Bakterien in sieben Fällen
von zehn Fällen
(70%) detektiert worden sind. Deshalb ist Information, die das Vorhandensein
von Bakterien im peripheren Blut betrifft, die durch eine mikroskopische
Untersuchung eines Abstrichs erhalten wurde, ein wichtiger Index
zur Behandlung.
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Weil
die vorstehend erwähnten
herkömmlichen
Verfahren die Vorbehandlung notwendig machen, welche insgesamt mindestens
drei oder vier Tage erfordert (enthaltend ein oder zwei Tage zur
selektiven Isolierung von Bakterien aus einer Probe, einen Tag zur
Kultivierung und einen oder mehrere Tage zur Durchführung der
Fixierung), und die Kultur davon in der Praxis fortgesetzt wird,
bis die Bakterien wachsen, würde
die Vorbehandlung eine Woche oder mehr erfordern, sogar für viele
C.B. (Kulturflasche)-positive Fälle.
Deshalb ist dies ein Faktor hoher Mortalität von C.B.-positiven Patienten
gewesen, die durch die herkömmlichen
Verfahren untersucht wurden. Zum Beispiel betrug gemäß eines
Berichts, veröffentlicht
in „The
Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases", Bd.58, Nr. 2, S.122,
1984, auch wenn die positive Rate der Blutkultur 28,6 % (163 Fälle von
569 Fällen)
betrug, die Mortalität
mindestens 84,6 % (138 Fälle
von 163 Fällen).
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Ferner
kann es unmöglich
sein, Kontamination durch indigene Bakterien bei ihrer Kultivierung
zu erkennen. Wenn zum Beispiel Staphylococcus epidermides, welches
eines der verursachenden Bakterien der Bakteriämie ist, sich auch auf der
Haut der normalen Person aufhält,
dann gibt es ein Risiko der Kontamination einer Probe mit diesem
Bakterium, wenn eine Nadel in die Haut eingeführt wird.
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Als
wichtige Tatsache ist unter solchen vorstehenden Umständen, weil
viele Bakterien in einer zu kultivierenden Probe in Phagozyten eingeführt worden
sind und wegen verabreichter Antibiotika tot oder stationär und immobilisiert
sind, die Anzahl von Bakterien, die wachsen gelassen werden können, auch
unter geeigneten Kultivierungsbedingungen klein. Dadurch beträgt die tatsächliche
Detektionsrate von Bakterien höchstens etwa
10%, wenn eine klinische Kulturprobe verwendet wird. Mit anderen
Worten, gegenwärtig
kann für
90 Prozent des untersuchten Bluts, welches für weitere einen oder mehrere
Tage kultiviert worden ist, vom Patienten, der klinisch unter dem
Verdacht stehen, unter Bakteriämie
zu leiden, überhaupt
nicht das Vorhandensein von Bakterien geklärt werden.
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Folglich
ist es in vielen Fällen
von Bakteriämie
unklar, ob die Infektionskrankheit Folge von Bakterien oder Pilzen
ist, und das verwendete Verfahren zur Behandlung, wie Antibiotika,
unterscheidet sich gemäß der Art
der verursachenden Bakterien sehr. In Anbetracht der vorstehend
beschriebenen Sachlage hängt
die gegenwärtige
Praxis vom Beginn einer Behandlung ab, wenn klinisch der Verdacht
auf Bakteriämie
besteht ohne die Detektionsergebnisse abzuwarten, d.h. es ist ein
empirisches Verfahren, wobei zuerst ein Antibiotikum mit der Wirksamkeit
gegen den breitesten Bereich von verursachenden Bakterien verabreicht
wird, und wenn das Antibiotikum nach ein oder zwei Tagen nicht wirksam
ist, ein anderes Antibiotikum getestet wird.
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Gemäß dem Verfahren,
die Bakterien in der Probe zu färben,
werden die Bestandteile des lebenden Körpers auch zusammen mit den
Bakterien gefärbt.
Deshalb ist Erfahrung erforderlich, Bakterien schnell gemäß ihrer
Erscheinung durch ein Mikroskop zu identifizieren, und es kann Fälle geben,
die kaum identifiziert werden können.
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Obwohl
Bakteriämie
eine Krankheit ist, bei der eine schnelle und genaue Diagnose erforderlich
ist, wie vorstehend ausgeführt,
kann das herkömmliche
Diagnoseverfahren solche Erfordernisse nicht erfüllen.
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J.
Med. Microbiol., Bd. 37 (1992) 346–351 offenbart Hefe-spezifische
DNA-Sonden und ihre Anwendung zur Detektion von Candida albicans.
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Nucleic
Acids Research, Bd. 19 Nr. 25, 7113–7116 offenbart die Isolierung
und Charakterisierung einer Spezies-spezifischen DNA-Sonde für Candida
albicans.
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[Offenbarung]
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Die
vorliegende Erfindung wurde angesichts der vorstehend beschriebenen
Probleme auf dem Fachgebiet eingeführt und betrifft eine Nukleinsäuremolekül-Sonde,
wobei das Molekül
ein DNA-Molekül
ist, bestehend aus einer Sequenz, die in der SEQ ID NR. 1 oder SEQ
ID NR. 4 aufgezeigt ist; oder es ist ein DNA-Molekül, bestehend
aus dem Komplementär
der Sequenz; oder es ist ein RNA-Molekül, bestehend aus einer RNA Sequenz,
entsprechend dem DNA-Molekül
oder Komplementär.
Das Nukleinsäuremolekül weist
insbesondere eine spezifische Reaktivität mit DNA oder RNA auf, die
aus Candida-Spezies, die an Infektionskrankheiten beteiligt sind,
erhalten wurde. Die aufgeklärte
Basensequenz der DNA in der Sonde wird in SEQ ID NR. 1 und SEQ ID
NR. 4 bereitgestellt. Außerdem
können,
wenn ein Primer mit Bezug auf Information über die Basensequenz der Sonde
entworfen wird, verursachende Pilze ohne Hybridisierung durch Amplifizieren
von DNA mit der PCR-Technik
identifiziert werden.
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Außerdem kann,
wenn eine nicht-radioaktive Sonde, zum Beispiel eine biotinylierte
Sonde zur Hybridisierung verwendet wird, die Detektion auch in einem
herkömmlichen
Laboratorium ohne Handhabungseinrichtung für Radioisotope durchgeführt werden,
und das Detektionsverfahren wird schnell und einfach durchgeführt.
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[Kurze Beschreibung der
Zeichnungen]
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1 ist
eine Restriktionenzymkarte des EcoRI-Fragments einer Sonde zum Detektieren
von Candida albicans.
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2 ist
das Ergebnis der Elektrophorese, die die Reaktivitäten einer
Sonde, die die Basensequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2
(nur für
Referenzzwecke eingeschlossen) enthält, gegen die genomische DNA
von jeder Art von Pilzen und Bakterien zeigt.
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3 ist
das Ergebnis der Elektrophorese, die die Reaktivitäten einer
Sonde, die die Basensequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 3
(nur für
Referenzzwecke eingeschlossen) enthält, gegen die genomische DNA
von jeder Art von Pilzen und Bakterien zeigt.
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4 ist
das Ergebnis der Elektrophorese, die die Reaktivitäten einer
Sonde, die die Basensequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 4
enthält,
gegen die genomische DNA von jeder Art von Pilzen und Bakterien
zeigt.
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5 ist
das Ergebnis der Elektrophorese, die die Reaktivitäten einer
Sonde, die die Basensequenz der Sequenzidentifizierungsnummer 2
(nur für
Referenzzwecke eingeschlossen) enthält, gegen verschiedene Konzentrationen
der genomischen DNA, die sich von Candida albicans und Menschen
ableitet, zeigt.
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[Beste Art und Weise zum
Durchführen
der Erfindung]
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Das
Folgende sind Beispiele der Sonden von Candida albicans:
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Beispiel 1: DNA-Sonde
von Candida albicans
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(1) Selektion der DNA-Sonde
von Candida albicans
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Ein
klinisches Isolat von Candida albicans (C.A.-26) wurde über Nacht
in Sabouraud's Medium
kultiviert, die kultivierten Pilze gesammelt, dazu Zymolyeis (Seikagaku
Kogyo) anstelle von Lysozym zugegeben, dann wurde genomische DNA
gemäß Saito-Miura's Verfahren extrahiert
(„Preparation
of Transforming Deoxyribonucleic Acid by Phenol Treatment", Biochem. Biophys.
Acta, Bd. 72, S.619–629
(1963)).
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Die
extrahierte DNA wurde vollständig
mit Restriktionenzym EcoRI gespalten und zufällig in den Vektor pGEM-3Z
kloniert. DNA-Fragment, das für
Candida albicans spezifisch war, wurde aus den so erhaltenen Klonen
ausgewählt.
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Das
ausgewählte
DNA-Fragment wurde dann als Sonde CA-26 bezeichnet, und die Restriktionskarte davon
wurde in 1 veranschaulicht.
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(2) Bewertung der Spezies-Spezifität der DNA-Sonde
von Candida albicans
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Reaktivitäten zwischen
dem DNA-Fragment, das im vorstehenden Beispiel 1 (1) selektiert
wurde, und DNA von mehreren Arten von verursachenden Bakterien von
Infektionskrankheiten wurden gemäß dem folgenden
Verfahren untersucht.
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Zuerst
wurden als Versuchsstämme
für eine
Untersuchung klinische Isolate (insgesamt 31 Stämme) erzeugt.
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Dann
wurde DNA von jedem klinischen Isolat gemäß dem Verfahren von Beispiel
1 (1) extrahiert, und Proben für
Dot-Blot-Hybridisierung wurden durch Tüpfeln einer bestimmten Menge
(z.B. 5 μg/μl) der extrahierten
DNA auf ein Byodyne-Nylonfilter (Typ B), Trocknen an der Luft und
10 Minuten langes Denaturieren mit 0,5 N NaOH-1,5 M NaCl, 10 Minuten
langes Neutralisieren mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)-1,5 M NaCl, 5
Minuten langes Waschen mit 1 % SSC, und Trocknen an der Luft erhalten.
Hybridisierung an DNA-Sonden, erzeugt aus Candida albicans und markiert
mit Digoxigenin-dUTP mittels DNA-Markierungs- und – Detektionskit
(Katalognr. 1175033: Boehringer Mannheim Biochemica), wurde dann über Nacht
gemäß dem Handbuch
von Maniatis durchgeführt
(Maniatis, et al., „Molecular
Cloning (A Laboratory Manual)",
Cold Spring Harbour Laboratory (1982)) unter der Bedingung von 45%
Formamid, 5 × SSC,
42°C, im
Anschluss an die Prähybridisierung
unter derselben Bedingung 2 Stunden lang bei 42°C.
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Die
Proben, die durch Hybridisierung über Nacht erhalten wurden,
wurden zweimal mit 1 × SSC,
0,1 % SDS 20 Minuten lang bei 50°C
gewaschen, wurden dann 30 Minuten lang mit 2% Blockierreagens inkubiert (Magermilch:
Yukijirushi). So erhaltene Filter wurden 30 Minuten lang mit etwa
5 ml verdünnter
Antikörperkonjugat-Lösung (150
mU/ml (1:5000)) inkubiert, zweimal 15 Minuten lang mit 50 ml Puffer
(0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl) gewaschen, um nichtgebundenes
Antikörperkonjugat
zu entfernen, 2 Minuten lang mit 10 ml A.P. 9,5 equilibriert. Die
Filter wurden in einem Plastikbeutel, der 10 ml NBT/BCIP (BRL) enthält, versiegelt und
inkubiert, um durch Farbreaktion zu detektieren, und die Reaktion
wurde durch 10 Minuten langes Waschen der Membranen mit 30 ml TE-Puffer
beendet.
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Experimentelle
Ergebnisse der Reaktivität
der Hybridisierung zwischen einer Sonde der vorliegenden Erfindung
und DNA von jedem klinischen Isolat sind in der folgenden Tabelle
1 veranschaulicht. Tabelle
1
| Name
des Stamms | Reaktivität |
| - Bakterien – | – |
| Staphylococcus
aureus | – |
| Staphylococcus
epidermidis | – |
| Enterococcus
faecalis | – |
| Escherichia
coli | – |
| Klebsiella
pneumoniae | – |
| Streptococcus
pneumoniae | – |
| Streptococcus
sanguis | – |
| Pseudomonas
fluorescens | – |
| Pseudomonas
maltophilia | – |
| Pseudomonas
diminuta | – |
| Pseudomonas
putida | – |
| Pseudomonas
alcligenes | – |
| Enterococcus
agglomerans | – |
| Haemophilis
parainfluenzae | – |
| Haemophilis
influenzae | – |
| Haemophilis
haemolyticus | – |
| Haemophilis
parahaemolyticus | – |
| - Pilze – | |
| Candida
albicans (40083) | + |
| Candida
albicans (40084) | + |
| Candida
albicans (40107) | ++ |
| Candida
albicans (7N) | ++ |
| Candida
albicans (1623) | + |
| Candida
albicans (klinisches Isolat) | ++ |
| Candida
krusei | ++ |
| Candida
tropicalis | ++ |
| Candida
parapsilosis | ++ |
| Candida
guilliermondii | + |
| Aspergillus
fumigatus (0063) | – |
| Aspergillus
flavus | – |
| Cryptococcus
neoformans (0354) | – |
| Mucor
spinosus (1322) | – |
Anmerkung: die Bezeichnung „++" bedeutet das Vorhandensein eines bemerkenswerten
Hybridisierungssignals, die Bezeichnung „+" bedeutet das Vorhandensein eines Hybridisierungssignals,
während
die von „–" das Fehlen eines
Hybridisierungssignals bedeutet.
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Aus
der vorstehenden Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die Sonde der vorliegenden
Erfindung spezifisch nur mit der DNA reagiert hat, die aus mehreren
Pilzen erhalten wurde, und mit keiner DNA kreuzreagiert hat, die
aus Bakterien erhalten wurde, weshalb ihre Spezifität für Pilze
bestätigt
worden ist.
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Beispiel 2: Analyse der
Basenseauenz
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Eine
Basensequenz der DNA-Sonde, deren Spezifität für Pilze in Beispiel 1 bestätigt worden
ist, wurde gemäß dem folgenden
Verfahren sequenziert.
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(1) Erzeugung von Plasmid-DNA
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Escherichia
coli K-12, JM109-Transformante, wobei die (zu sequenzierenden) subklonierten
Insertionsfragmente in pGem-3Z (Promega) enthalten sind, wurde in
5 ml Luria-Bactani-Medium
(Bactotrypton, 10 g/1 l; Bactohefeextrakt, 5 g/1 l; NaCl, 10 g/1
l; mit 5 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt) geimpft und über Nacht kultiviert.
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Die
Kulturflüssigkeit
wurde zentrifugiert (5.000 Upm, 5 min), um die Pilze zu sammeln.
100 μl einer
Lösung
von 50 mM Glukose/50mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA, die 2,5 mg/ml
Lysozym (Sigma) enthielt, wurde zum Präzipitat zugegeben, und 5 Minuten
lang bei Raumtemperatur stehengelassen. 0,2 M NaOH-Lösung, die
1% Natriumdodecylsulfat (Sigma) enthielt, wurde zu der so erhaltenen
Suspension zugegeben und damit gemischt. 150 μl 5 M Kaliumacetatlösung (pH
4,8) wurden ferner dazugegeben und damit gemischt, dann 15 Minuten
lang auf Eis gestellt.
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Der
bei der Zentrifugation (15.000 Upm, 15 min) erhaltene Überstand
wurde mit Phenol/CHCl3 behandelt und das
zweifache Volumen Ethanol dazugegeben, dann wurde das Präzipitat
durch Zentrifugation (12.000 Upm, 5 min) erhalten. Dieses Präzipitat
wurde in 100 μl
einer Lösung
von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst und dazu 10 mg/ml Rnase
A- (Sigma) Lösung
zugegeben, dann wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
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300 μl einer 0,1
M Natriumacetatlösung
(pH 4,8) wurden zu dieser Präparation
zugegeben und mit Phenol/CHCl3 behandelt,
dann wurde daraus das Präzipitat,
durch Zufügen
von Ethanol zum Überstand
erhalten. Dieses Präzipitat
wurde getrocknet und in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst,
wobei DNA-Proben erhalten wurden.
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(2) Vorbehandlung zum
Sequenzieren
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Die
Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit AutoReadTM Sequencing
Kit (Pharmacia) durchgeführt.
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Die
Konzentration der DNA, die Matrize wird, wurde auf 5–10 μg in 32 μl Lösung eingestellt.
32 μl der Matrize-DNA
wurden in 1,5 ml-Miniröhrchen
(Eppendorf) überführt und
8 μl 2 M
NaOH-Lösung
dazugegeben, dann leicht damit gemischt. Nach sofortiger Zentrifugation
wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
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7 μl 3 M Natriumacetat
(pH 4,8) und 4 μl
destilliertes Wasser, dann 120 μl
Ethanol wurden dazugegeben und dann damit gemischt, und 15 Minuten
lang auf Trockeneis stehengelassen. DNA, welche durch 15 Minuten
lange Zentrifugation gefällt
worden ist, wurde gesammelt, und der Überstand wurde sorgfältig entfernt. Das
so erhaltene Präzipitat
wurde mit 70% Ethanol gewaschen und 10 Minuten lang zentrifugiert.
Dann wurde, nachdem der Überstand
erneut sorgfältig
entfernt worden war, der Niederschlag unter verringertem Druck getrocknet.
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Das
Präzipitat
wurde in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst,
dann wurden 2 μl
Fluoreszenzprimer (0,42 A260 Unit/10ml,
4–6 pmol
(Fluoreszenzprimer; M13-Universalprimer: 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3' (1,6 pmol/μl, 0,42 A260 Unit/ml); M13-Reverseprimer: 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC]-3' (2,1 pmol/μl, 0,42 A260 Unit/ml)) und 2 μl Annealing-Puffer dazugegeben
und leicht gemischt.
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Nach
sofortiger Zentrifugation wurde das Gemisch bei 65°C 5 Minuten
lang wärmebehandelt
und schnell in eine Umgebung von 37°C überführt und die Temperatur 10 Minuten
lang gehalten. Nach dem Halten der Temperatur wurde es 10 Minuten
lang oder mehr bei Raumtemperatur stehengelassen und sofort zentrifugiert.
Dann wurde die Probe durch Zufügen
von 1 μl
Elongationspuffer und 3 μl
Dimethylsulfoxid dazu erzeugt.
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Vier
Miniröhrchen
sind mit einer der Markierungen von „A", „C", „G" und „T" gekennzeichnet worden, und
gemäß der Markierung
wurden 2,5 μl
A-Mischung (gelöstes
ddATP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP), C-Mischung
(gelöstes
ddCTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP),
G-Mischung (gelöstes
ddGTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) und
T-Mischung (gelöstes
ddTTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) in
jedes gekennzeichnete Röhrchen
gegossen. Jede Lösung
wurde vor Gebrauch auf Eis aufbewahrt, und wurde, wenn sie verwendet
wurde, eine Minute lang oder mehr bei 37°C gehalten.
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2 μl verdünnte T7-DNA-Polymerase
(Pharmacia; 6–8
Units/2 μl)
wurden zur DNA-Probe zugegeben und durch Pipettieren oder leichtes
Mischen vollständig
gemischt. Sofort nach dem Beenden des Mischens wurde die gemischte
Lösung
auf jeweils 4,5 μl
der vier Arten von Lösung
verteilt, welche bei der Temperatur gehalten worden sind. Frische
Spitzen wurden zur Zeit jeder Verteilung verwendet.
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Die
Lösung
wurde 5 Minuten lang bei 37°C
gehalten, dann wurden 5 μl
Terminationslösung
zu jeder Reaktionslösung
zugegeben.
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Frische
Spitzen wurden auch für
diesen Schritt verwendet. Sofort nach dem 2–3 Minuten langen Halten der
Lösung
bei 90°C,
wurde sie auf Eis gekühlt.
4–6 μl/Bahn der
Lösung
wurde auf die Elektrophorese aufgetragen.
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(3) Sequenzieren der Basensequenz
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Sequenzieren
der Basensequenz der Sonde, die in Beispiel 1 offenbart ist, mit
der Spezifität
gegen Candida albicans wurde unter Verwendung eines A.L.F. DNA-Sequenziersystems
(Pharmacia) unter einer Elektrophoresebedingung von 45°C 6 Stunden
lang durchgeführt.
Als Ergebnis davon ist die Gesamtbasensequenz von Candida albicans
CA-26 (SEQ ID NR. 1) aufgeklärt
worden.
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Außerdem wurden
Einzelheiten der Gesamtbasensequenz analysiert, und drei Stellen
der Sequenz (SEQ ID NR. 2, 3 und 4), die in der Gesamtsequenz enthalten
sind, wurden ausgewählt,
welche die Grundlage der Sonden (Matrize-DNA) im folgenden Beispiel
3 werden soll.
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Beispiel 3: Amplifikation
von Matrize-DNA durch PCR-Technik
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(1) Herstellung des Reagens
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Das
folgende Reagens wurde durch Mischen gemäß der Reihenfolge (a) bis (e)
hergestellt.
- (a) 10fach verdünnter Puffer:
2 μl
- (b) 0,5 nM dATP, dCTP, dGTP und dTTP: jeweils 1 μl
- (c) Oligonukleotidprimer Nr. 14 (20mer: SEQ ID NR. 5): 2 μl
Oligonukleotidprimer
Nr. 17 (20mer: SEQ ID NR. 6): 2 μl
- (d) Matrize-DNA: 5 ng/2 μl
- (e) Taq-Polymerase (Cetus): 1,25 U/0,25 μl
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(2) Amplifikation von
Matrize-DNA
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Amplifikation
von Matrize-DNA wurde unter Verwendung des hergestellten Reagens
und des DNA-Amplifizierers (Handelsname: „BiGene PHC-1 ", Techne) durchgeführt.
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Thermische
Kontrolle des DNA-Amplifizierers wurde wie folgt eingestellt, und
der Reaktionszyklus wurde 30mal wiederholt: 1 Minute lang 94°C zur Wärmedenaturierung;
1 Minute lang 62°C
zum Annealing der Primer; und 1 Minute lang 74°C zur Synthese der komplementären Kette.
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(3) Bewertung der Spezifität der Matrize-DNA
und DNA aus Bakterien durch Hybridisierungsverfahren
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(a)
10 μl des
Produkts, das aus der Amplifikation von Matrize-DNA erhalten wurde,
mit einer Basensequenz von SEQ ID NR. 2 wurden auf ein 2%-Agarosegel
(Seakem GTG Agarose) aufgebracht. Nachdem das Gel mit Ethidiumbromid
gefärbt
worden war, wurden alkalische Denaturierung durch 30 Minuten langes Waschen
mit 0,5 N NaOH-1,5 M NaCl und 10 Minuten langes Neutralisieren mit
0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)-1,5 M NaCl durchgeführt, dann wurde das Gel auf
ein Byodyne-Nylonfilter (Typ B) verschoben und 12 Stunden lang stehengelassen,
wobei der Luft-getrocknete Filter als Probe für Southern-Hybridisierung erhalten
wurde. Hybridisierung mit genomischer DNA von jedem der Pilze und
Bakterien, die in der folgenden Tabelle 2 gezeigt sind (jede Zahl
des Stamms entspricht der Zahl der Spur in den
2 und
3),
wurde dann über
Nacht unter der Bedingung von 45% Formamid, 5 × SSC bei 42°C nach Prähybridisierung
unter derselben Bedingung bei 42°C
zwei Stunden lang durchgeführt.
Für das
3'-Ende der Sonde
wurde das markierte Oligonukleotid eines 20mer mittels DIG-Oligonukleotid
3'-Endo Labeling
Kit (Katalog Nr. 1362372: Boehringer Mannheim Biochimica) verwendet. Tabelle
2
| Nr. | Stammname
der Pilze |
| 1 | Candida
albicans (40083) |
| 2 | Candida
albicans (40084) |
| 3 | Candida
albicans (40107) |
| 4 | Candida
albicans (7N) |
| 5 | Candida
albicans (1623) |
| 6 | Candida
albicans (klinisches Isolat) |
| 7 | Candida
guilliermondii |
| 8 | Candida
krusei |
| 9 | Candida
parapsilosis |
| 10 | Candida
tropicalis |
| 11 | Cryptococcus
neoformans (0354) |
| 12 | Aspergillus
flavus (0057) |
| 13 | Aspergillus
fumigatus (0063) |
| 14 | Mucor
spinosus (1322) |
| 15 | Absidia
corymbifera (2435)
Stammname der Bakterien |
| 16 | Staphylococcus
aureus (ATCC 25923) |
| 17 | Staphylococcus
epidermidis |
| 18 | Escherichia
coli (ATCC 25922) |
| 19 | Klebsiella
pneumoniae |
| 20 | Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853) |
| 21 | Haemophilis
influenzae |
Anmerkung: als molekularer Marker wurde pBR328
(BgII-HincII: Boehringer Mannheim) in beiden Randspuren verwendet.
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Die
Probe, welche die Hybridisierung über Nacht beendet hat, wurde
10 Minuten lang bei 50°C
mit 1 × SSC,
0,1 % SDS und 10 Minuten lang bei 50°C mit 0,5 × SSC, 0,1 % SDS gewaschen,
dann an der Luft getrocknet und unter der Bedingung von –40°C gehalten.
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Aus
dem Ergebnis der in 2 gezeigten Elektrophorese ist
ersichtlich, dass die Reaktivitäten
der Sonde, die aus Matrize-DNA erzeugt wurde, mit einer Basensequenz
von SEQ ID NR. 2 gegen genomische DNA, die durch die Pilze konserviert
wurde, bestätigt
worden sind.
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(b)
Southern-Hybridisierung wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren,
das im vorstehenden (a) beschrieben wurde, unter Verwendung von
10 μl Produkt,
das durch Amplifikation von Matrize-DNA mit einer Basensequenz von
SEQ ID NR. 3 erhalten wurde, ähnlich
durchgeführt.
Die Ergebnisse davon sind in 3 gezeigt.
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Folglich
sind die Reaktivitäten
der Sonde, die aus Matrize-DNA mit einer Basensequenz von SEQ ID NR.
3 erzeugt wurde, gegen die Bakterien nicht bestätigt worden, sondern nur mit
der genomischen DNA von den Pilzen.
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(c)
Dann wurde eine Probe für
Southern-Hybridisierung in Übereinstimmung
mit dem Verfahren, das im vorstehenden (a) beschrieben wurde, aus
10 μl Produkt,
das durch Amplifikation von Matrize-DNA mit einer Basensequenz von
SEQ ID NR. 4 erhalten wurde, erzeugt, und Hybridisierung mit genomischer
DNA von jedem der Pilze und Bakterien, gezeigt in der folgenden
Tabelle 3 (jede Zahl entspricht der Zahl der Spur in
4),
wurde durchgeführt. Tabelle
3
| Nr. | Stammname
der Pilze |
| 1 | Candida
albicans (40083) |
| 2 | Candida
albicans (40084) |
| 3 | Candida
albicans (40107) |
| 4 | Candida
guilliermondii (klinisches Isolat) |
| 5 | Candida
krusei (klinisches Isolat) |
| 6 | Candida
parapsilosis (klinisches Isolat) |
| 7 | Candida
tropicalis (klinisches Isolat) |
| 8 | Cryptococcus
neoformans (0354) |
| 9 | Aspergillus
flavus (0057) |
| 10 | Aspergillus
fumigatus (0063) |
| 11 | Mucor
spinosus (1322) |
| 12 | Absidia
corymbifera (2435)
Stammname der Bakterien |
| 13 | Staphylococcus
aureus (ATCC 25923) |
| 14 | Staphylococcus
epidermidis (ATCC 12228) |
| 15 | Escherichia
coli (ATCC 25922) |
| 16 | Klebsiella
pneumoniae (klinisches Isolat) |
| 17 | Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853) |
| 18 | Enterococcus
agglomerans (klinisches Isolat) |
| 19 | Streptococcus
pneumoniae (HYSDH DP-2) |
| 20 | Streptococcus
faecalis (ATCC 29212) |
| 21 | menschliche
genomische DNA |
Anmerkung: als molekularer Marker wurde ÖX174/HaeIII
in beiden Randspuren verwendet.
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Als
Ergebnis davon sind die spezifischen Reaktivitäten der Sonde, die aus Matrize-DNA
mit einer Basensequenz von SEQ ID NR. 4 erzeugt wurde, für genomische
DNA aus Pilzen, die zur Gattung Candida gehören, bestätigt worden (4).
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(d)
Schließlich
wurden die Sensitivität
zur Detektion der Sonde der vorliegenden Erfindung und Kreuzreaktivitäten gegen
menschliche genomische DNA bewertet.
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Es
wurde nämlich
eine Probe für
Southern-Hybridisierung in Übereinstimmung
mit dem Verfahren, das im vorstehenden (a) beschrieben wurde, aus
10 μl Produkt,
das durch Amplifikation von Matrize-DNA mit einer Basensequenz von
SEQ ID NR. 2 erhalten wurde, erzeugt, und Hybridisierung mit genomischer
DNA aus Candida albicans, die auf verschiedene Konzentrationen eingestellt
wurde, und mit jeder menschlichen genomischen DNA von vier gesunden
männlichen
Erwchsenen, gezeigt in der folgenden Tabelle 4 (jede Zahl entspricht
der Zahl der Spur in
5), wurde durchgeführt. Tabelle
4
| Nr. | Stammname
der Pilze |
| 1 | Candida
albicans (50 ng) |
| 2 | Candida
albicans (25 ng) |
| 3 | Candida
albicans (10 ng) |
| 4 | Candida
albicans (5 ng) |
| 5 | Candida
albicans (1 ng) |
| 6 | Candida
albicans (0,5 ng) |
| 7 | Candida
albicans (0,1 ng) |
| 8 | Candida
albicans (0,05 ng) |
| 9 | Candida
albicans (0,01 ng) |
| 10 | Candida
albicans (5 pg) |
| 11 | Candida
albicans (1 pg)
Stammname der Bakterien |
| 12 | Candida
albicans (40083) |
| 13 | menschliche
genomische DNA 1 |
| 14 | menschliche
genomische DNA 2 |
| 15 | menschliche
genomische DNA 3 |
| 16 | menschliche
genomische DNA 4 |
Anmerkung: Als molekularer Marker wurde pBR328[BgII-HincII]
in beiden Randspuren verwendet.
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Wie
aus den Ergebnissen, die in 5 gezeigt
sind, ersichtlich ist, wurde bewiesen, dass die Sonde der vorliegenden
Erfindung genomische DNA aus Candida albicans bei einer solch niedrigen
Konzentration wie 5 pg/μl
detektieren kann und nicht mit der menschlichen genomischen DNA
kreuzreagiert hat.
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[Industrielle Anwendbarkeit]
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Unter
Verwendung einer Sonde der vorliegenden Erfindung können Pilze
ohne Proliferation der Pilze direkt detektiert werden und schnell
und genau identifiziert werden. Das heißt, gemäß der Diagnose unter Verwendung
der Sonde der vorliegenden Erfindung kann die Identifizierung der
Pilze mit einer Einzelprobe verwirklicht werden. Die zur Diagnose
erforderliche Zeit kann auf etwa einen bis zwei Tage verringert
werden, während
das herkömmliche
Verfahren (mit niedriger Detektionsrate) 3–4 Tage erforderte, und die
Detektionsrate wird bemerkenswert verbessert. Deshalb kann die vorliegende
Erfindung einen objektiven Faktor zur Behandlung von Fungämie bereitstellen,
was zur wirksamen Behandlung im frühen Stadium der Infektionskrankheit,
sowie zu Erwartungen zur Verringerung der Sterblichkeit führt.
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Folglich
kann durch Aufklären
der Basensequenzen der Sonden, welche mit Candida albicans, einem der
am häufigsten
beobachteten verursachenden Pilze der Fungämie, spezifisch reagieren,
die künstliche
Herstellung dieser Sonden kann auch verwirklicht werden.
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Ferner
kann durch Vergleich der Basensequenzen von genomischer DNA von
der klinischen Probe mit der der vorliegenden Erfindung schnelle
Identifizierung der Spezies der verursachenden Pilze der Infektionskrankheiten
verwirklicht werden.
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Wie
vorstehend angeführt,
stellt die vorliegende Erfindung eine gewünschte Sonde zur Diagnose von Infektionskrankheiten
bereit, außerdem
werden hervorragende Nützlichkeiten
als Führung
zur Herstellung eines PCR-Primers und als Standardsequenz, die zum
Vergleich und Bezug der genomischen DNA aus der klinischen Probe
geeignet ist, erwartet, und ferner hervorragende Wirkungen, z.B.
das Bereitstellen wertvoller Anhaltspunkte zur Herstellung und Entwicklung
anderer Sonden, welche spezifisch mit den verursachenden Pilzen
der Fungämie
reagieren.
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Außerdem sollten,
weil die Basensequenz, die in der vorliegenden Anwendung offenbart
wurde, durch zufälliges
Klonieren genomischer DNA aus klinischen Isolaten erhalten wurde,
die Nützlichkeiten
der Basensequenz der vorliegenden Erfindung auf den komplementären Strang
davon ausgeweitet werden.
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Ferner
ist, obwohl angenommen werden kann, dass die DNA, die aus Wildstämmen erhalten
wurde, den mutierten Teil enthalten könnte, aus der vorstehenden
Offenbarung der Beispiele ersichtlich, dass der mutierte DNA-Teil
die sich abzuleitenden Nützlichkeiten
durch die vorliegende Erfindung, die die Spezifität der Sonde
der vorliegenden Erfindung in der Hybridisierung zur Diagnose der
Infektionskrankheiten umfasst, und die Verwendung der Information über die
Basensequenz, die in der vorliegenden Anwendung offenbart ist, um den
Primer für
das PCR-Verfahren mit dem Ziel einer schnellen Diagnose der Infektionskrankheiten
zu entwerfen, nicht beeinflussen würde.
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