JP2004089046A - カンジダアルビカンス菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】検体内に取り込まれたカンジダ アルビカンス菌の存在を特異的かつ迅速に検出する手段を提供する。
【解決手段】カンジダ アルビカンス菌に対して特異的な交差反応を示し、かつカンジダ アルビカンスの特定な塩基配列またはその配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列、又はある特定な塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む、カンジダ アルビカンス菌の検出用プローブにある。また、該検出プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出方法も提供される。本検出方法は、（ａ）臨床検体より取得した食細胞を支持体上に固定し、（ｂ）固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進させる化学処理を行い、（ｃ）食細胞に含まれる感染症原因菌のＤＮＡを得、（ｄ）ストリンジェントな条件下で、得られたＤＮＡと検出用プローブとの間でハイブリダイゼーションを行いそのシグナルを検出する。
【選択図】 図１２
【解決手段】カンジダ アルビカンス菌に対して特異的な交差反応を示し、かつカンジダ アルビカンスの特定な塩基配列またはその配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列、又はある特定な塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む、カンジダ アルビカンス菌の検出用プローブにある。また、該検出プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出方法も提供される。本検出方法は、（ａ）臨床検体より取得した食細胞を支持体上に固定し、（ｂ）固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進させる化学処理を行い、（ｃ）食細胞に含まれる感染症原因菌のＤＮＡを得、（ｄ）ストリンジェントな条件下で、得られたＤＮＡと検出用プローブとの間でハイブリダイゼーションを行いそのシグナルを検出する。
【選択図】 図１２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌の検出技術の改良に関し、詳細には、カンジダ アルビカンス菌の検出のための新規のプローブ、これらプローブを利用したカンジダ アルビカンス菌の検出方法、およびこれら方法の関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
カンジダ アルビカンス菌は、正常人の口腔咽頭、消化管、膣などに常在している真菌であり、感染経路として、性交感染、自己感染、産道感染、院内感染、家族間感染などがある。
【０００３】
カンジダ アルビカンス菌による感染症には、浅在性カンジダ症と深在性カンジダ症とに大別される。 この内、浅在性カンジダ症においては、皮膚の灼熱感および掻痒感、鵞口瘡、口内炎、膣炎、子宮頚部炎等の臨床症状が現れ、一方で、深在性カンジダ症においては、咽頭炎、気管支炎、膀胱炎、敗血症、膿血症、網脈絡膜炎、心内膜炎、脳における微小膿瘍の形成等の臨床症状が現れる。 特に、悪性腫瘍、白血病、膠原病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の原疾患、それに、当該原疾患に対する治療のために生体の感染防衛機構が低下している状態の患者、あるいはカテーテル装着、手術等により局所的感染防御能が低下している患者に対して、その病原性をよく発揮し、敗血症等の重篤な症状へ進展する可能性が高い。
【０００４】
また、敗血症、膿血症および心内膜炎等に移行すると、予後は極めて悪いことが明らかとなっている。 敗血症の状態がさらに進行すると、ショックや、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）などを合併し、多臓器障害を引き起こして、死に至る場合がよくある。
【０００５】
浅在性カンジダ症は、診断・治療が比較的容易であり、少数の難治例を除いて抗真菌薬の投与により通常は短期間に治癒する。 しかし、深在性カンジダ症は、現在市販されている診断キットの感度および再現性が完全ではなく、また、カンジダ アルビカンス菌に対する特異性が低いなど、改善すべき点が多いのが実情である。 カンジダ アルビカンス菌が原因となる敗血症は重篤な感染症であり、正確な診断に導かれた早期の抗菌薬治療の有無が、患者の予後を左右するといえる。 従って、当該技術分野の従事者、特に、臨床医からは、カンジダ アルビカンス菌に関する迅速で確実な検査方法の確立が切望されていた。
【０００６】
現在、浅在性カンジダ症起因菌の同定および検出方法として、生標本の直接検鏡法や真菌培養・グラム染色法などが、一般的に用いられている。 しかし、カンジダ アルビカンス菌は常在菌であるので、これら検出方法は、感染症原因菌の可能性を示唆できても、感染症原因菌の特定には至らない。 また、これら検出方法によれば、検査結果が得られるまでに、通常、４８時間〜７２時間もの時間を要するため、その迅速性に問題があった。 さらに、培養方法や培養条件によっては、コンタミネーションを引き起こしてしまい、検査結果の信頼性を損なう場合もある。
【０００７】
深在性カンジダ症起因菌の同定および検出方法としては、血清診断法を利用する方法が一般的である。 例えば、▲１▼ カンジダ属真菌に特徴的な代謝産物であるＤ−アラビニトールを測定する方法［商品名：アラビニテック・オート、極東製薬工業（Ｓｏｙａｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １４９， ｐｐ．１４９−１５４ （１９８５）、Ｓｏｙａｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｊｐｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｙｃｏｌ．， ２７， ｐｐ．１６５−１６９ （１９８６））］、▲２▼ 真菌全般に共通して存在する抗原である（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法［商品名：ファンギテックＧテスト、生化学工業（Ｏｂａｙａｓｈｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．； Ｌａｎｃｅｔ， ３４５， ８９４１， ｐｐ．１７−２０ （１９９５））、商品名：β−グルカンテストワコー、和光純薬工業（Ｍｏｒｉ， Ｔ ｅｔ ａｌ．； Ｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３５， ｐｐ．５５３−５６０ （１９９７））］、および▲３▼ 真菌細胞壁成分のマンナン多糖体を抗原とする抗体をラテックス粒子と結合させるラテックス凝集法［Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｐ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８， ｐｐ．２３２０−２３２６ （１９９０）、Ｍｉｔｓｕｔａｋｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４， ｐｐ．１９１８−１９２１ （１９９６）］などの方法が挙げられる。 その他に、真菌に対する遺伝子診断法として、▲４▼ ＰＣＲ法を利用した方法も開発されてきている（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４０， ｐｐ．３５８−３６４ （１９９４））。
【０００８】
方法▲１▼は、カンジダ属に対しては有効であるが、カンジダ アルビカンス菌に特異的ではない。 また、抗菌剤の投与などによりカンジダ属真菌の増殖が抑えられると、Ｄ−アラビニトールの血清中濃度が低下することから、検査前に抗菌剤を投与されてしまうと正確に判定できないおそれがある。 加えて、方法▲１▼での正診率は、他の方法に比較して低いという難点がある。 方法▲２▼では、真菌の正診率は高いが、カンジダ属真菌に対する特異性は低く、カンジダ属真菌あるいはカンジダ アルビカンス菌が特定できないという問題がある。 方法▲３▼では、宿主の体内に侵入しないコロニゼーションでも陽性になることがある。 また、真菌細胞壁成分を標的としているため、カンジダ属真菌に対する特異性は低く、カンジダ属真菌あるいはカンジダ アルビカンス菌が特定できないという問題がある。
【０００９】
方法▲４▼では、培養法や血清診断法と比較して、感度・特異性は高い方であるが、検査の迅速性は血清診断よりも劣っている。 また、真菌の属または菌種を特異的に検出するＰＣＲ法では、第１次のＰＣＲでの産物の属または菌種に特異的な配列に基づいた第２次のＰＣＲを行う方法も提案されている。 しかし、単一の検体に対してＰＣＲを２回行うことは、操作が煩雑になるために、臨床上利用しにくいという問題がある。 このように、カンジダ アルビカンス菌が関与する感染症にあっては、迅速・確実な診断が求められているにもかかわらず、従来の診断方法では、十分対応できていなかったのが実情である。
【００１０】
従って、感染症原因菌の確定と、それに即した抗生物質の選択が従前より必要とされていたにもかかわらず、臨床的にカンジダ アルビカンス菌による感染症の可能性が疑われた投階で、検出結果が出るのを待たずに治療に踏み込んでいるのが、大方の臨床現場での実情である。 すなわち、起因菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に対して有効な抗生物質をまず投与し、１〜２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
【００１１】
このような諸問題を解決するために、本出願人は、貪食細胞に貪食された外来微生物の検出および／または同定のための方法を発明した（特公平７−４０号）。
【００１２】
すなわち、この方法によれば、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子は、これら遺伝子に対して特異的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出される。 具体的には、この方法は、生体由来の臨床検体より取得した食細胞を固定し、これら食細胞に対して細胞膜の透過性を亢進させるための処理を施し、食細胞内に取り込まれた感染症原因菌のＤＮＡを露出し、ストリンジェントな条件下で感染症原因菌のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および、ハイブリダイズシグナルの出現の有無によって感染症原因菌を検出および／または同定する、との一連の工程を含む。
【００１３】
敗血症が疑われた患者の血液を、この方法に従って検査したところ、血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出し、さらに２４時間以内に判定を終えることができたことから、この方法は感染症分野において脚光を浴びている。
【００１４】
また、本出願人は、カンジダ アルビカンス菌が保有するＤＮＡと特異的に反応するプローブも発明している（日本国特許第２５５８４２０号）。 それらプローブは、カンジダ アルビカンス菌の存在を的確に検出し、なおかつ検出精度も高い。
【００１５】
そのため、患者に投与する抗生物質を選択する上での、貴重な判断材料を提供する可能性が注目されている。
【００１６】
このように、本願発明は、カンジダ アルビカンス菌の検出感度および／またはカンジダ アルビカンス菌に対する特異性がさらに改善された新規プローブ、特に、ハイブリダイゼーション用プローブの提供に加え、これらプローブを利用することで、従前の検出方法よりも検出効率ならびに検出感度に優れた検出方法や検出手段の実現をも、その目的としている。
【００１７】
【課題を解決するための手投】
本発明は、従来技術で認識されていた上掲の様々な不都合に鑑みて発明されたものであって、その要旨とするところは、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌に対して特異的な交差反応を示し、かつ（ａ） 配列番号：１乃至３のいずれかに記載の塩基配列；（ｂ） 塩基配列（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列；または、（ｃ） 塩基配列（ａ）および／または塩基配列（ｂ）に対して相補的な塩基配列を含む、カンジダ アルビカンス菌の検出用プローブにある。
【００１８】
また、本発明によれば、前述した検出用プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出方法も提供される。 この検出方法は、（ａ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｂ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｃ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｄ） ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとの間でｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および（ｅ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出する工程を含む。
【００１９】
さらに、本発明の他の態様によれば、感染症原因菌の検出方法が提供される。
【００２０】
この検出方法は、（１） 感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（２） 本発明の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、（３）得られた染色体ＤＮＡと当該プライマーとの共存系でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって当該ＤＮＡを増幅し、および（４） 増幅されたＤＮＡを検出する工程を含む。
【００２１】
そして、本発明のさらに他の態様によれば、食細胞に貪食された外来微生物の遺伝子を観察する方法が提供される。 この観察方法は、（ｉ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｉｉ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｉｉｉ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｉｖ） ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、（ｖ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返して実施し、および（ｖｉｉ） ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする工程を含む。
【００２２】
加えて、本発明のさらに他の態様によれば、本発明の検出用プローブ、食細胞含有検体調製器具、支持担体、細胞膜用化学処理剤、ＤＮＡ露出処理剤、ハイブリダイゼーション用具およびハイブリダイゼーションシグナル検出器具を含むカンジダ アルビカンス菌の検出キットが提供される。
【００２３】
そして、本発明のさらに別の態様によれば、チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなる本発明の検出用プローブまたはその断片とを具備したＤＮＡチップが提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００２５】
定 義
まず、本明細書で使用する「臨床検体」の語は、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体を総称するものであり、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。 また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液などの他に、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の組織洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも臨床検体の範疇に包含される。 加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。 これはすなわち、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、固定マクロファージ、遊離マクロファージ、ハンゼマンマクロファージ、炎症性マクロファージ、肝クッパー細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含有する組織までもが本発明の臨床検体として用いることができることによる。 例えば、腎炎が疑われる患者から、腎生検に従って腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることによって細胞を剥離してこの組織内に存在する食細胞を取得し、得られた食細胞を用いることで、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。
【００２６】
次に、本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物を含めた異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞を指すものであって、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。 また、Ｕ９３７細胞、ＨＬ６０細胞などの食細胞系も、本発明において好適に使用することができる。
【００２７】
食細胞（白血球）画分は、公知の方法によって臨床検体から取得することができる。 例えば、約５ｍｌのヘパリン加静脈血（白血球数の少ない場合は１０ｍｌ）を採取し、この血液と血液分離試薬［塩化ナトリウム２２５ｍｇとデキストラン（分子量 ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを含み、滅菌精製水にて全量を２５ｍｌに調製したもの］とを４：１程度の割合で混和した後、約１０℃〜約４０℃で、約１５分〜約１２０分間、好ましくは、約３７℃で、約３０分間静置することによって、白血球画分（上層）を取得することができる。
【００２８】
食細胞の固定
このようにして得た白血球画分を、約０℃〜約２０℃にて、約１００×ｇ〜約５００×ｇで、約３分〜約６０分間、好ましくは、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。
【００２９】
遠心分離の際に赤血球が混入してしまった場合には、溶血操作を行うのが好ましい。 例えば、白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁した後、直ちに、過剰量のＰＢＳ［塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇおよびリン酸二水素ナトリウム二水和物１．１２３ｇを含み、かつ滅菌精製水で全量を１２０ｍｌに調製したもの（以下、単に『ＰＢＳ原液』と称する）を、滅菌精製水で２０倍に希釈して得たもの］（以下、単に『ＰＢＳ』と称する）を加えて等張化した後、再度、約４℃の温度下にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離する。
【００３０】
あるいは、このような遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本質的に有する接着能力を利用して、以下のようにして、スライドグラスに接着させることもできる。 白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。 具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球のペレットを載置し、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た液）に２０分間程度浸した後、約５０％〜約９０％、好ましくは、約７５％のエタノール液に約５分間浸して、完全に風乾する。
【００３１】
このような支持担体としては、不溶性素材から形成されたものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、アガロースなど）が好適に使用できる。 不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができる。
【００３２】
特に、本発明の実施態様において好ましい支持担体として、スライドグラスがある。 このようなスライドグラスとして、例えば、スライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ：日本エアーブラウン社製）がある。 このＭＳ３１１ＢＬスライドグラスは、その表面に、直径５ｍｍの円形ウェルを１４個有している。
【００３３】
また、実際の適用を考慮すれば、支持担体への細胞の接着性を改善する目的で、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）を、その表面にコートしてなるＡＰＳコートスライドグラスが好ましい。 その他に、ポリ−Ｌ−リジンやゼラチンをコートしてなるスライドグラスも好適に使用できる。 これらＡＰＳコートスライドグラスの作製手順は、まず、スライドホルダーにスライドグラスを固定する。 固定したスライドグラスを、希釈した中性洗剤に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に除去し、精製水で洗浄した後に、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させ、その後、室温で放置冷却する。 次いで、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。 さらに再度、スライドグラスを１〜１０％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾を行った後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約４２℃で乾燥させることで、ＡＰＳコートスライドグラスが得られる。
【００３４】
ＡＰＳコートスライドグラス表面に白血球を支持させる場合、各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹して、風乾するのが好ましい。 固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）は、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、約１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦約５×１０７個／ｍｌに調整する。 また、これに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、約２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜約５×１０５個／ウェル、好ましくは、約５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦約２．５×１０５個／ウェルに調整する。
【００３５】
具体的には、白血球画分を、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【００３６】
そして、約５×１０４個／ウェル〜約２．５×１０５個／ウェルの細胞数となるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾させることによって、白血球がその表面に固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスが調製される。
【００３７】
細胞膜の透過性亢進処理
食細胞の細胞膜の透過性を亢進させるための処理を行う。 この処理方法として、白血球が固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスを、ＰＢＳに約３〜約３０分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％） ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を、滅菌精製水で約２〜約５０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約３〜約３０分間振とうする方法を用いることができる。
【００３８】
内在細菌ＤＮＡの取得
次に、食細胞内に存在する感染症原因菌のＤＮＡを得る。 具体的には、まず、スライドグラス１枚につき酵素試薬（ザイモラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームおよび／またはリゾスタフィン；以下、単に『酵素試薬』と称する）に対して、酵素試薬溶解液（フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を、ＰＢＳで１００倍希釈したもの］を１ｍｌ加えて酵素試液を調製した。 その後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、この酵素試薬１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下して、約１０〜約６０分間静置して、感染症原因菌のＤＮＡを露出する。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌの塩酸を含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水で２０倍希釈して、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で約３〜約３０分間振とうする。 ＤＭＳＯは、５％以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフィンの活性を低下させる可能性があるため、５％未満の濃度で使用するのが好ましい。
【００３９】
食細胞の形態を保持させる物質であるＰＭＳＦ以外に、他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびそれらの混合物などを用いることもできる。 そのような場合は、ＤＭＳＯなどの溶解剤を適宜変更すればよい。
【００４０】
酵素試薬として用いられる各酵素の力価範囲は、次の通りである。 リゾスタフィンの力価範囲は、約１単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌである。 また、Ｎ−アセチルムラミダーゼの力価範囲は、約１０単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌである。そして、リゾチームの力価範囲は、約１，０００単位／ｍｌ〜約１，０００，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０，０００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌである。 なお、原因菌がカンジダ アルビカンス菌等の真菌である場合には、ザイモラーゼを使用することが重要で、その力価範囲は、約５０〜約５００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌであり、また、ザイモラーゼを使用する場合、ＰＭＳＦまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を併用するのが特に好ましい。 さらに、ザイモラーゼを使用するときは、ザイモラーゼ単独または上記の他の酵素を混合して使用しても良い。
【００４１】
また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の菌体成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、使用酵素を適宜選択することができる。 特に、グラム陽性菌とグラム陰性菌の種別にかかわらず、より効果的に菌体を溶菌させるために、２種類以上の酵素を使用することもできる。 リゾチーム、リゾスタフィン、およびＮ−アセチルムラミダーゼの３種類の酵素を混合した酵素試薬を使用することによって、１種類の酵素に依った場合と比較して溶菌活性が高まる。
【００４２】
酵素試薬の至適酵素処理温度は、約２６℃〜約５９℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃に設定する。 また、酵素試薬の酵素処理時間は、少なくとも約１５分以上、好ましくは、約１５分〜約１２０分、あるいは、少なくとも約２０分以上、好ましくは、約３０分〜約６０分とする。
【００４３】
Ｎ−アセチルムラミダーゼに関しては、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の熱処理乾燥粉末ならびにＮ−アセチルムラミダーゼと共に、２ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムを含む５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ６．０）中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍでの吸光度が下がる現象が認められる。 また、ストレプトコッカス サリヴァリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：ＩＦＯ ３３５０）の熱処理細胞を、３７℃、ｐＨ ７．０の条件下で、１分間に１μｇを溶菌する酵素活性を１単位とした場合、２，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すＮ−アセチルムラミダーゼを使用することが望ましい。
【００４４】
リゾチームに関しては、ミクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）とリゾチームと共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。
【００４５】
また、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓを、３５℃、ｐＨ ６．２の条件下で、１分間に５４０ｎｍの吸光度を０．００１下げる時の酵素活性を１単位とした場合、５０，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾチームを使用することが望ましい。
【００４６】
リゾスタフィンに関しては、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とリゾスタフィンが共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。 また、スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を、３７℃、ｐＨ ７．５の条件下で、１０分間で、６２０ｎｍの吸光度を０．２４０から０．１２５に下げる酵素活性を１単位とした場合、５００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾスタフィンを使用することが望ましい。
【００４７】
ザイモラーゼ（商品名：ザイモリエイス、生化学工業）は、アルスロバクタールテサル（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｓｕ１）の培養液から調製された酵素で、酵母生細胞の細胞壁に対する溶解活性が大きい。 ザイモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関与する必須酵素は、β−１，３−グルカン・ラミナリペンタオヒドロラーゼ（β−１，３−ｇｌｕｃａｎ ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であり、これは、β−１，３−結合のグルコースポリマーに作用して、主生成物としてラミナリペンタオースを生成する。 ザイモリエイス−１００Ｔは、硫安分画に精製され、さらにアフィニティークロマトグラフィーにより精製された酵素であって（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６０， ｐ．２５７ （１９８２））、１００，０００単位／ｇの活性を有している。 しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２０， ｐ．３２３ （１９７４）；Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４５， ｐ．１７６１ （１９８１）； Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４６， ｐ．５５３ （１９８２））。 ザイモリエイス−１００Ｔは、β−１，３−グルカナーゼを約１．０×１０７単位／ｇ、プロテアーゼを約１．７×１０４単位／ｇ、そして、マンナーゼを約６．０×１０４単位／ｇを含み、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは認められない（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １８， ｐ．５７ （１９７２））。 また、ザイモリエイスの至適ｐＨは約５．５〜約８．５であり、約６．５〜約７．５のｐＨが特に至適性に優れており、至適温度は約２５〜約５５℃であり、約３５〜約４５℃の温度が特に望ましい。
【００４８】
さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スペクトラム（属名）として、Ａｓｈｂｙａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋｌｏｅｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｋｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓなどがある。 特に、カンジダ属には、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ パラシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ ガラクタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌａｃｔａ）、カンジダ ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）等がある。
【００４９】
これらの属に属する菌も、本発明の適用対象に加えることができる。
【００５０】
ザイモラーゼの賦活剤として、ＳＨ化合物、例えば、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを用いることができる。 ザイモラーゼは、ビール酵母懸濁液を基質として、約２５℃の温度下で、約２時間置いた反応液（ザイモラーゼ：０．０５〜０．１ｍｇ／溶液ｍｌの１ｍｌ、基質：ビール酵母懸濁液（２ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）３ｍｌ、緩衝液：Ｍ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）５ｍｌを含み、滅菌精製水１ｍｌで全量を１０ｍｌに調製したもの）でのＡ８００を３０％減少するに必要な酵素活性を１単位とする。 なお、ザイモリエイス−１００Ｔは、約１００，０００単位／ｇの活性を有している。
【００５１】
酵素試薬溶解液として用いられる（プロテアーゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加される）ＰＭＳＦは、約１０μｍｏｌ／ｌ 以上の濃度で効果が認められ、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ 以上の濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約１０μｍｏｌ／ｌ〜約１０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜約１ｍｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。 また、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の濃度としては、約５％未満の濃度で使用でき、約２％以下の濃度が好ましく、約１％程度の濃度が最も好ましい。 従って、酵素試薬溶解液としては、０．１ｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ含有ＤＭＳＯを、ＰＢＳで約１００〜約１，０００倍希釈して調製したものが好ましい。
【００５２】
感染症原因菌のＤＮＡを得た後に、細胞膜タンパク質のアセチル化工程を加えてもよい。 具体的には、アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約２〜約５０倍に希釈し、好ましくは、約１０倍に希釈して、無水酢酸の終濃度を約０．１〜約３．０％、好ましくは、約０．８％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。 その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５３】
また、アセチル化工程の後に、感染症原因菌のＤＮＡをアルカリ処理する工程を挿入することができる。 これにより、感染症原因菌のＤＮＡは、一本鎖のＤＮＡになる。 具体的には、スライドグラスを、約１０ｍｍｏｌ／ｌ 〜約３００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で約２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ に調製したもの）に約２〜約５分間浸して、アルカリ処理を行う。 その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５４】
Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ストリンジェントな条件下にて、感染症原因菌のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う。
【００５５】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するにあたって、まず、プローブ希釈液を用いて調製した検出用ＤＮＡプローブ含有液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約２５℃〜約５０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、約１〜約３時間、好ましくは、約２時間静置させる。 その後、ハイブリダイゼーション洗浄液［ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇとクエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇとを含み、滅菌精製水にて全量を７５ｍｌに調整したもの、以下、単に、『ハイブリダイゼーション原液』と称する）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの］を３つの染色ビンに用意し、それぞれを順に、約３５〜約４５℃、好ましくは、約４２℃で、約１０分間ずつ浸す。 その後、ＰＢＳに浸したままで、振とう機上で、約５〜約３０分間振とうさせる。 詳細には、プローブ希釈液は、サケ精子ＤＮＡ ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、前出のハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌを含んでいる。 プローブ液には、１５ｎｇの各検出用ＤＮＡプローブを含有せしめるのが好ましく、プローブ希釈液にて全量を５０μｌとするのが望ましい。
【００５６】
ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ（各プローブの調製方法については、日本国特許第２７９８４９９号を参照されたい）の濃度については、約０．０６ｎｇ／μｌの濃度では検出が不調（以下、「不適」と称する）であり、また、約０．６ｎｇ／μｌの濃度では検出可能（以下、「適」と称する）であったことから、少なくとも約０．１ｎｇ／μｌ以上の濃度に調整すべきである。 さらに、約２．４ｎｇ／μｌおよび約３．０ｎｇ／μｌの濃度では「不適」であり、また、約１．８ｎｇ／μｌの濃度では「適」であったため、約２．２ｎｇ／μｌ以下の濃度に調整すべきである。 従って、好ましいプローブ濃度は、約０．１〜約２．２ｎｇ／μｌ、好ましくは、約０．６〜約１．２ｎｇ／μｌとする。 特に、本発明のカンジダ アルビカンスに対するプローブについて２．０ｎｇ／μｌのプローブ濃度で試験したところ、「適」であることを証明している。 また、陽性コントロールおよび陰性コントロールの至適濃度は、それぞれ約０．４〜約２．０ｎｇ／μｌおよび約０．６〜約２．０ｎｇ／μｌとし、好ましくは、両者共に約０．６〜約１．０ｎｇ／μｌの濃度とするのが良い。
【００５７】
また、ハイブリダイゼーションの試験時間は、少なくとも約３０分以上、好ましくは、約６０分以上、より好ましくは、約９０分以上とする。 最も好ましくは、ハイブリダイゼーション時間を、約１２０分〜約９００分に設定すべきである。
【００５８】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実施において、検出感度を高める観点からして、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の使用が好ましい。 ＳＤＳの好ましい濃度は、約１％以下、より好ましくは、約０．１％〜約０．７５％、さらに好ましくは約０．２５％〜約０．５％である。 ＳＤＳは、ハイブリダイゼーションの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合して用いてもよい。
【００５９】
また、検出用プローブとしては、約２００〜約６００塩基長、好ましくは、約２００〜約５００塩基長、最も好ましくは、約２００〜約３００塩基長の長さを有する１種以上の核酸断片とするのが好ましい。 これはすなわち、食細胞内へのプローブの導入を円滑にし、かつ取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されることによる。 ところで、対象となるプローブの塩基長は、必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意味するものではなく、プローブ塩基長の分布に上記範囲の塩基長が含まれていればよい。 これらプローブは、１種で用いても数種（１種以上）で用いても良い。 １種以上のプローブとは、一菌種に対してハイブリダイズできる複数種のプローブであってもよく、また、一菌種に対してプローブは１つであるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていてもよく、プローブの種類が１種以上であれば特に制限されない。
【００６０】
なお、プローブは、食細胞自体との交差反応性に乏しい（ハイブリダイズしない）配列を有するＤＮＡ断片を含むものとすることが好ましく、プローブの起源種と異なる他の菌種に由来する遺伝子とハイブリダイズするものであってはならない。
【００６１】
例えば、サブトラクション法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。 これらプローブは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰ）等の非放射性同位体標識用物質を用いて、定法のニックトランスレーション法に従って、調製およびラベルすることができる。 プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加するＤＮａｓｅＩとＤＮＡポリメラーゼＩの量比を変化させることによって、最も効率よく標識付け可能なように制御できる。
【００６２】
一例として、本願発明のプローブＣＡ−５０（配列番号：１）の２μｇを効率よくラベル化し、また、外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ可能なプローブ鎖長（２００〜３００）にするためには、全量１００μｌの反応液中に、１０Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼＩの２μｌに対し、全量１００μｌの反応液中に約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵに調製されたＤＮａｓｅＩを６μｌ存在するように調製する。 この場合、各酵素の容量および反応液全量などは、上記した至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更してもよい。 換言すれば、全量１００μｌでの２０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩの濃度を、約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵの濃度に調整する。 さらに換言すれば、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩに対して、約０．５／１０００〜約１７．５／１０００、好ましくは、約１．２５／１０００〜約１０／１０００、より好ましくは、約２．５／１０００〜約７．５／１０００単位のＤＮａｓｅＩを用いてニックトランスレーション反応を行うのが望ましい。 また、１μｇのＤＮＡに関して着眼すれば、１０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩを約５〜約１７５ｍＵ、好ましくは、約１２．５〜約１００ｍＵ、より好ましくは、約２５〜約７５ｍＵにすればよい。 他のプローブに関しては、上記した至適反応条件を参考にして、ＤＮＡ量、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮａｓｅＩに関する至適反応条件を決定することができる。 加えて、効率よくラベル化でき、しかも外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約２００〜約３００塩基長）に調節することもできる。
【００６３】
ところで、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する際に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ホルムアミド約３０％〜約６０％、好ましくは、約５０％の存在下、約３０〜約５０℃、好ましくは、約３８〜約４２℃でインキュベートし、その後、洗浄を行う条件である。
【００６４】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの工程を加えることもできる。 具体的には、湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、かつ滅菌精製水にて全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、約１５〜約６０分間静置する。 その後、ブロッキング試薬を除去する。
【００６５】
ハイブリダイズシグナルの検出
菌由来の遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズした結果に生じるシグナルを検出するために、定法の抗原−抗体反応等を利用した呈色反応を行う。
【００６６】
すなわち、ハイブリダイゼーションを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング処理を行い、次いで、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、その後、接合物の発色系にてシグナルを発色して、ハイブリダイゼーションの状況を確認する。 例えば、プローブとして、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたプローブを用いた場合、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファターゼに対する基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート等）を利用して検出すればよい。
【００６７】
呈色反応の後に洗浄して得た塗沫標本は、ナフトールブラック、Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ（２０ｍｇ／５０ｍｌ、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡（蛍光顕微鏡）によって検鏡すると細胞内シグナルが観察される。
【００６８】
詳細には、ハイブリダイゼーションによるシグナルを得るには、例えば、検出用ＤＮＡプローブとしてジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ滅菌精製水適量にて全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび塩酸適量を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で約１０〜約２００倍、好ましくは、約５０倍に希釈した標識抗体液を調製し、これを塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、約１５〜約６０分間静置する。 その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、かつ滅菌精製水にて全量を１００ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に浸し、そのままの状態で、振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。 この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、かつ滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのままの状態で振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。その後、スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ））１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジでろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱中で約１０℃〜約４５℃、好ましくは、約３７℃で、約１５〜約６０分間遮光静置する。 その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に約２〜約１０分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を約５０ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液、それに約０．１〜約５％、好ましくは、約１％の酢酸溶液に浸す。 その後、前出の発色試薬洗浄液を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾する。 また、発色試薬は、個別に調製した試薬でもよい。
【００６９】
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンに、ジゴキシゲニンをラベルしたＤＮＡを１ｎｇブロットし、ブロッキング後、１０，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を反応させると、ＤＮＡのブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンがラベルされていないＤＮＡで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが望ましい。 また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒツジ由来のものが好ましい。 詳細には、免疫処置したヒツジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィーを経て精製したものが好ましい。
【００７０】
発色試薬（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液、ｐＨ ９．０〜１０．０）としては、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）３．３ｍｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）１．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇ、および塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を約１０ｍｌに調製したものが好ましい。 この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッティング用メンブレンにブロットし、発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れる試薬が好ましい。
【００７１】
このような対比染色を行う場合、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色４号（タートラジン）を使用することができる。 その理由として、基質によって紫色を呈色し、また、ナフトールブラックにより青色を呈色するなど、発現した色が互いに類似していると、明確な対比染色が行いにくいことが挙げられる。 後述するように、これまでに試されなかった食用色素を用いたところ、対比染色時の色相の差異が明確になり、実用的であることが判明した。
【００７２】
ところで、ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレーション法を用いることができる。 また、ジゴキシゲニンを標識化するその他の方法として、ＰＣＲ法、ランダムプライマーラベリング法、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスクリプションラベリング法、ターミナルトランスフェラーゼラベリング法なども使用可能である。
【００７３】
交差反応の有無の判定は、光学顕微鏡（蛍光顕微鏡）で鏡検（×１，０００）した際に、単一ウェルにおいて、対比染色液によって染色された細胞において、青紫色の発色が１つでも認められた場合に陽性と判定する。
【００７４】
また、検出用プローブの調製方法は、日本国特許第２９６５５４４号を参照することで明らかになろう。
【００７５】
さらに、本発明のプローブ（プローブＣＡ−５０、配列番号：１）を、例えば、ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、ワーキングセルバンク（ＣＡ−５０）を、白金耳または使い捨てプラスチックループ等で釣菌して、これを滅菌シャーレ内に置いた５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロス固形培地に画線塗抹する。 一晩培養した後、シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬ−ブロス培地５ｍｌに植菌して、３７℃で終夜振とう培養する［前培養］。 次いで、前出の固形培地４００ｍｌが入った培養用フラスコに、前培養液を２．５ｍｌずつ植菌して、約３７℃で終夜振とう培養する［本培養］。
【００７６】
そして、プローブＣＡ−５０のプラスミドＤＮＡを抽出すべく、本培養した培養液を約４℃にて、約４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。 培養上清を除去し、ＳＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ エチレンジアミン−四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム）を２０ｍｌ加えて菌体を再懸濁し、約４℃にて、４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。 １０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液−１（５０ｍｍｏｌ／ｌ グルコース、２５ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、菌体を懸濁して、室温で５分間放置する。 溶液−２（０．２ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））１０ｍｌを加え、転倒混和して、氷上で１０分間放置する。 氷冷した溶液−３（３ｍｏｌ／ｌ 酢酸カリウム（ｐＨ ４．８））７．５ｍｌを加え、転倒混和して氷上で１０分間放置する。 高速冷却遠心機を用いて、約４℃にて、約４５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。 その後、０．６容量（約２４ｍｌ）のイソプロパノールを加え、転倒混和して、室温で１５分以上放置する。 高速冷却遠心機を用いて、約２５℃にて、約２８，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨て、７０％エタノールでペレットを洗浄し風乾する。 風乾した後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）を８ｍｌ加えて、溶解する［プラスミドＤＮＡの抽出］。
【００７７】
次に、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの精製を行う。 得られたプラスミドＤＮＡに、１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド８００μｌおよび塩化セシウム８．６ｇを加え、転倒混和して溶解させる。 その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。 垂直型ローターにより、約２０℃にて、約５００，０００×ｇで約５時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用して、プラスミドＤＮＡのバンドを分取する。 分取したプラスミドＤＮＡ溶液に、等量のＴＥ飽和 ｌ−ブタノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機を用いて、約１５，０００×ｇで、５分間遠心分離し、上清を取り除く。 この操作を繰り返し、プラスミドＤＮＡ溶液中のエチジウムブラマイドを取り除く。 次に、ＴＥを加えて１．５ｍｌの体積とし、脱塩カラム（ＮＡＰ−１０）で脱塩する。 脱塩したプラスミドＤＮＡ溶液に、３ｍｏｌ／ｌ 酢酸ナトリウム溶液を３０μｌ加えて混和した後、３倍量の９９．５％エタノールを加えて転倒混和し、−約２０℃で、３０分以上放置する。 その後、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除いた後、冷７０％エタノールを加えて懸濁する。 そして、再度、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除き、プラスミドＤＮＡの沈渣を減圧下で乾固させる。 プラスミドＤＮＡに１００μｌのＴＥを加えて完全に溶解させ、２６０ｎｍの吸光度で濃度を測定する［プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの精製］。 その後、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理、およびアガロース電気泳動によるプローブＣＡ−５０のサイズチェックを行う。
【００７８】
次いで、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動によるプローブＣＡ−５０の精製を行う。 そのために、分子量確認が終了したプローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡ１ｍｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、３７℃で、１．５時間以上の時間をかけて反応を進行せしめて消化する。
【００７９】
プラスミドＤＮＡを消化した後、反応液の一部を０．８％アガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。 消化を確認した後、分取用の０．８％アガロースゲルで電気泳動し、プローブＣＡ−５０のバンドを採取する。 採取したプローブＣＡ−５０をアガロースゲルから抽出および精製して、吸光度計にてその濃度を測定する。
【００８０】
精製したプローブＣＡ−５０の一部を、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。
【００８１】
次に、プローブＣＡ−５０のラベル化を行うために、以下の表１に記載の組成を有する反応液において、精製したプローブＣＡ−５０の２μｇに対してジゴキシゲニンの標識付けを行う。
【００８２】
【表１】
【００８３】
表１において、「Ｘ」とは、プローブ原液の濃度に応じて好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量を指し、この容量に伴い精製水量Ｙを決定して最終容量を調整する。
【００８４】
標識付けした後、反応液にＴＥを１００μｌ 加えて反応を停止させる。 反応停止液をスピンカラムに注入し、約４℃にて、約３８０×ｇで約１０分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。 次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、ＴＥで約１０ｎｇ／μｌ に調製する。
【００８５】
標識付けを確認するために、標識付けしたプローブＣＡ−５０の０．５μｌをメンブレンに滴下して、風乾する。 ブロッキング試薬にこのメンブレンを浸し、室温で３０分間ブロッキングする。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）と０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムで５，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、そのメンブレンを室温で３０分間浸す。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で約１０分間振とうして、２回洗浄する。 ０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ９．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムに、室温下で、メンブレンを約１０分間浸す。
【００８６】
室温および遮光下で、発色試薬にメンブレンを、約１０分間浸す。 メンブレンをＴＥに浸し、発色を停止させる。 スポット下部分の青紫色の発色で、標識付の確認を行う。
【００８７】
１ｍｌのディスポーザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填してスピンカラムを作製する。 １ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳで膨潤させたセファデックスＧ−５０をシリンジに充填する。 １５ｍｌのディスポーザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、約４℃にて、約３２０×ｇで約１０分間遠心分離し、過剰の緩衝液を落とす。 ディスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れる。
【００８８】
ドットブロットハイブリダイゼーション
プローブの特異性を確認するために、以下の手順に従って、ドットブロットハイブリダイゼーションを行う。
【００８９】
まず、スポットした各ゲノムＤＮＡを変性するために、定法に従い０．５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製３ＭＭ）上に、調製した各種細菌ゲノム１００ｎｇ をナイロンメンブレン（ポールバイオダインタイプＢ、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを１０分間静置する。 次に、０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１．５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で飽和した前出の濾紙上に１０分間静置して変性ＤＮＡを中和する。 さらに２×ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）溶液で飽和した前記濾紙上に５分間静置し、洗浄する。
【００９０】
そして、メンブレンを風乾し、２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間浸透する。 定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイブリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、４２℃で、６０分間親和させる。 プラスチックバッグ内でプローブ４００ｎｇを含むハイブリタイゼーション溶液の１５ｍｌにメンブレンを浸し、４２℃で、一晩反応させる。 次に、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する（この工程を２回繰り返す）。 その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液にメンブレンを浸し、６０℃で、１０分間洗浄する（この工程を３回繰り返す）。 ２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する。 メンブレンを３％ウシ血清アルブミン、１％ブロッキングバッファー（ベーリンガー社製）、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムを含む溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。
【００９１】
次いで、アルカリフォスフアターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）を、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で５，０００倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。 次に、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、１５分間振とうする（この工程を２回繰り返す）。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ９．５）、０．１ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムを含む溶液にメンブレンを浸し、５分間振とうする。 ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。 ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。 プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液の組成を、以下の表２に示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
前述したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。
【００９４】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。
【００９５】
アニオン界面活性剤とは、陰イオン界面活性剤とも称されるものであって、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。 界面活性剤の分子中の親油基をＲとして表現すると、ＲＣＯＯＮａ、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａの式で表される。 ＲＣＯＯＮａのように弱酸性基を含有するものでは、その水溶液は加水分解しやすく弱アルカリ性を呈するが、ＲＳＯ３Ｎａ， ＲＳＯ４Ｎａなどの強酸性基を有するものでは、その水溶液は、加水分解を受けにくく、中性を呈する。 陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。
【００９６】
非イオン性界面活性剤とは、親水基が非イオン性のものをいう。 親水基として酸化エチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）が多用され、この官能基の数が多くなるに従って、親水性が増す。 反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。
【００９７】
従って、親水性・親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。 非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。 しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ないため、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などの様々な用途で使用される。 水溶性の非イオン性界面活性剤は、温度が上昇すると、ある時点で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。
【００９８】
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤とも称され、これは、水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。 カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのアニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。 また、繊維やプラスチックでの帯電防止能もある。 代表的なカチオン界面活性剤であるドデシルトリメチルクロリド［Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ３）３Ｎ］Ｃｌは水溶性であるが、一方で、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド［（Ｃ１２Ｈ２５）２（ＣＨ３）２Ｎ］Ｃｌは水に溶解しにくく、水中では２分子膜状のベシクルを形成し、これはベンゼンには溶解する。
【００９９】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。 水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。 従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側にある場合にはアニオン界面活性剤として、酸性側にある場合にはカチオン界面活性剤として作用する。 等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。 両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などの用途に用いられている。
【０１００】
また、アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分類され、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型およびアルカノールアミド型に分類される。 カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモニウム塩型に分類され、両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型およびグリシン型に分類される。
【０１０１】
さらに、アニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、Ｎ−アシルサルコシン塩およびＮ−アシルグルタミン酸塩に細分される。 それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩として、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用石鹸が、Ｎ−アシルサルコシン塩として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、それに、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸二ナトリウムなどがある。 また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物およびＮ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩に細分される。 その代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩として、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、また、アルカンスルホン酸塩としてドデカンスルホン酸ナトリウム、また、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩として直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが、そして、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、また、アルキルナフタレンスルホン酸塩として、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、それに、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩としてはＮ−メチル−Ｎ−ステアロイルタウリンナトリウムなどがある。 また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。 その代表例として、アルキル硫酸塩として、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）およびセチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミンなどがある。 また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩に細分される。 その代表例として、アルキルリン酸塩として、モノラウリルリン酸二ナトリウムがある。
【０１０２】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル（８ＭＯＬ）がある。
【０１０３】
非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。 それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンとして、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンとしてはモノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。 また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。 その代表例として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルエーテルなどがあり、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとして、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがある。 また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。 それそれの代表例として、脂肪酸ポリエチレングリコールには、オレイン酸ポリエチレングリコールが、また、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどがある。 また、アルカノールアミド型は、脂肪酸アルカノールアミドだけであり、ラウリン酸ジエタノールアミドがその代表例である。
【０１０４】
カチオン界面活性剤のアルキルアミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩およびトリアルキルアミン塩があり、モノステアリルアミン塩酸塩がその代表例である。 また、第四級アンモニウム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化アルキルベンザルコニウムに細分される。それぞれの代表例として、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムが、また、塩化アルキルベンザルコニウムとして、塩化ラウリルベンザルコニウムがある。
【０１０５】
両性界面活性剤のカルボキシベタイン型には、アルキルベタインしかなく、ラウリルベタインが、その代表例である。 また、２−アルキルイミダゾリンの誘導型としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインだけであり、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが、その代表例として挙げられる。 また、グリシン型として、アルキル（またはジアルキル）ジエチレントリアミノ酢酸があり、その代表例として、ジオクチルジエチレントリアミノ酢酸がある。
【０１０６】
さらに、上掲のものに加えて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ラウリルサルコシン、サポニン、ＢＲＩＪ３５、アルキルアリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクワラン、ステアリルアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セタノール、セトマクロゴール１０００、セバシン酸ジエチル、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル３５ヒマシ油、マクロゴール４００、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシルＬ−アルギニンエチル・ＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウロマクロゴール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド、ノニデットＰ４０、ｎ−オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート等も利用することができる。
【０１０７】
上掲の各種界面活性剤は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程において使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。 例えば、プローブ液またはプローブ希釈液中に混合されていてもよいし、プローブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加してもよいし、当業者は適宜変更することができる。
【０１０８】
なお、本発明において、必要に応じて、陽性コントロールフローブを調製することもできる。 例えば、まず、Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３．２）のゲノムＤＮＡの抽出と精製を行うために、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ１６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内でＵ９３７細胞を培養する。
【０１０９】
Ｕ９３７培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃にて、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収する。 細胞を１０ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃にて、１８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞を回収する。 その後、上清を廃棄して、細胞を１ｍｌの２００μｇ／ｍｌプロテネースＫ含有１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置する。 フェノール抽出を３〜４回繰り返し、除蛋白を行う。 エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌの２．５μｇリボヌクレアーゼ含有滅菌精製水に溶解し、４２℃で３０分間放置する。 フェノール抽出を２〜３回繰り返し、除蛋白を行う。 エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌのＴＥに溶解する。 その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コントロールプローブを作製することができる。
また、陽性コントロールプローブは、Ｕ９３７ゲノムを１００ｎｇスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼーションした時に、ハイブリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。
【０１１０】
同様に、必要に応じて、陰性コントロールプローブを公知の方法で調製することもできる。
【０１１１】
その他の実施態様
本発明の検出方法を利用したカンジダ アルビカンス菌の検出および／または同定用キットも、本発明によって提供される。 本発明のキットによれば、ＤＮＡを得る工程で使用される酵素（ＤＮＡ露出処理剤）が、少なくとも、ザイモラーゼを含み、その他にも、リゾスタフィン、リゾチームおよびＮ−アセチルムラミダーゼからなるグループから選択される１種以上の酵素を具備していてもよく、また、界面活性剤が添加されたプローブ液、それに、１種以上の検出用ＤＮＡプローブを具備している。 本発明のキットには、以下の実施例に例示するような、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液−１、発色前処理液−２、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、ＡＰＳコートスライドグラス、プローブ希釈液、バッファーＡ等を利用することが可能である。 これらの内、少なくとも、酵素試薬とプローブ液とを含むことが好ましい。 また、クロロホルム、エタノール、無水酢酸、ＤＭＳＯ、ＰＭＳＦ、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等の各種試薬を用いることも可能である。 さらに、低速遠心機、恒温器、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、０．２μｍシリンジトップフィルターなどの器具を装備していてもよい。
【０１１２】
本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
【０１１３】
また、本発明によれば、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌を特定する方法も提供される。 この方法によれば、様々な敗血症が疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約４倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになっている。 そして、血液培養では、検査に少なくとも３日以上、通常は１４日程度を要するのに比較して、本発明の方法によれば全操作完了までに約８時間という極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができる。 従って、本発明の方法によれば、敗血症または菌血症などの、速やかに、かつ的確な対処が必要とされる感染症の診断や予後診断のモニター等において非常に有用なマーカーが提供されるのである。
【０１１４】
また、本発明のプローブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅によって、感染症原因菌の同定も可能となるのである。
【０１１５】
さらに、本願発明のプローブまたはその断片をＤＮＡチップに組み込んで利用できることも明らかである。 そうすれば、ＤＮＡチップを用いて、カンジダ アルビカンス菌の存在の確定が可能となる。
【０１１６】
加えて、本発明で開示した塩基配列は、カンジダ アルビカンス菌のゲノミックＤＮＡをランダムにクローニングして得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。 さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部分が存在することは当然考えられるが、一般的に、本発明のプローブと７０％程度、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のホモロジーを有する塩基配列は、本発明の目的を達成することができると考えられるので、本発明にはこれら相同配列も当然に包含されるものである。
【０１１７】
臨床検体からのカンジダ アルビカンス菌の一般的な検出手順の事例を、以下に詳述する。
［実施手順例］
（１） 採血および血液検体の処理
臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液検体を用いる。 各患者からヘパリン加静脈血１０ｍｌを採取し、採取した血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（分子量：２００，０００〜３００，０００）１．５ｇ、滅菌精製水にて全量２５ｍｌに調製したもの）を４：１の割合で混和した後、３７℃で３０分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得する。 このようにして得た白血球画分を４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離することによって、白血球を得る。
次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁し、直ちに過剰量のＰＢＳ（塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物１．１２３ｇ、滅菌精製水にて全量１２０ｍｌにしたもの（ＰＢＳ原液）を滅菌精製水にて２０倍に希釈したもの）を加えて等張化した後、再度４℃下で、１６０×ｇで１０分間遠心分離を行う。
【０１１８】
（２） 白血球の固定
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）をスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ、日本エアーブラウン社製）にコートしてなるＡＰＳコートスライドグラスを使用する。
【０１１９】
ＡＰＳコートスライドグラスの作製に当たって、まず、スライドホルダーにスライドグラス（ＭＳ３１１ＢＬ）を固定した後、希釈した中性洗剤中に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却する。 その後、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾する。 さらに再度、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄する。 その後、風乾のための操作を行った後に、４２℃で乾燥させることで、ＡＰＳコートスライドグラスを作製する。
【０１２０】
白血球画分を、４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【０１２１】
細胞数が１×１０５個／ウェルとなるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球をＡＰＳコートスライドグラスに支持させる。
【０１２２】
その後、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た固定液）に２０分間浸した後、７５％エタノール液に５分間浸し、完全に風乾させる。
【０１２３】
（３） 白血球細胞膜の透過性亢進処理
ＰＢＳに１０分間浸した後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％） ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を滅菌精製水で１０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で１０分間振とうさせる。
【０１２４】
（４） 菌体壁の溶菌酵素処理
スライドグラス１枚につき酵素試薬（ザイモラーゼ２００単位／ｍｌ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ１，０００単位／ｍｌ、リゾチーム１００，０００単位／ｍｌおよび／またはリゾスタフィン１００単位／ｍｌ）に酵素試薬溶解液（ＰＢＳで０．１ｍｏｌ／ｌ フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１００倍希釈して調製したもの）を１ｍｌ加えて酵素試液を調製する。 その後、感染症原因菌のＤＮＡを得るために、３７℃〜４２℃の湿潤箱中で、この酵素試液１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下し、３０分間静置することによって、感染症原因菌のＤＮＡを露出させる。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌ 塩酸含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて２０倍希釈し、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２５】
（５） 細胞膜タンパク質のアセチル化
アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で１０倍希釈し、無水酢酸の終濃度を０．８％に調整したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で１０分間振とうする。 その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２６】
（６） 菌体 ＤＮＡ のアルカリ処理［二本鎖 ＤＮＡ から一本鎖 ＤＮＡ への変性］
スライドグラスを、７０ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ に調製したもの）に３分間浸す。 その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２７】
（７） ハイブリダイゼーション
プローブ希釈液（０．５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、ハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌが含まれる）にて調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ１５ｎｇを含有する液（プローブ液、１．０ｎｇ／μｌ）を塗抹部位に塗布し、３７℃〜４２℃の湿潤箱内に２時間静置させる。 ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーション法で調製する。 その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇ、滅菌精製水にて全量７５ｍｌに調製したもの、前出）をハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次、４２℃で１０分間ずつ浸す。 その後、ＰＢＳに浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２８】
ジゴキシゲニンを標識付けしたＤＮＡプローブは、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９のプローブ配列を用いて、ニックトランスレーション法により調製する。
【０１２９】
（８） ブロッキング
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行う。
【０１３０】
具体的には、湿潤箱内にてスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、これを３０分間静置する。 その後、ブロッキング試薬を除去する。
【０１３１】
（９） 標識抗体との反応
標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび塩酸適量を含み、滅菌精製水適量で全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を、標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で５０倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、これを３０分間静置する。 その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、滅菌精製水で全量を１００ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうさせた。 この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１３２】
（１０） シグナル検出
スライドグラス１枚につき発色試薬［ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）溶液、ｐＨ ９．０〜１０．０：ＮＢＴ ３．３ｍｇ、ＢＣＩＰ １．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇおよび塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、適量の滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの］１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、３７℃で、３０分間遮光静置する。 その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に５分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇ、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液および１％酢酸溶液に浸す。 その後、前記発色試薬洗浄液を１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾させる。
【０１３３】
（１１） 判 定
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）した場合に、単一のウェル内の対比染色液により染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが１つでも認められた場合に「陽性」と判定する。
【０１３４】
【実施例】
本発明を、実施例に沿って以下に詳細かつ具体的に説明するが、これら実施例の開示に基づいて、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【０１３５】
実施例１：カンジダ アルビカンス （Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ） 菌検出用プローブ
（１） カンジダ アルビカンス菌特異的サブトラクトライブラリーの作製
カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌由来ＤＮＡプローブの選別は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。 Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ １４０５３）およびカンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ６６０２９）ゲノムＤＮＡ ２μｇをキットに添付されていた制限酵素ＲｓａＩで完全消化し、エタノール沈澱により精製し、６．５μｌの滅菌蒸留水
に溶解した。 ＲｓａＩ消化したＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡ １．２μｌを滅菌蒸留
水１．８μｌで希釈し、このＤＮＡ試料にキットに添付されていた２種類のアダプターをライゲートした。 反応液組成は、反応液１［ＤＮＡ試料１μｌ、ＤＮＡライゲーションバッファー（キットに添付のもの）２μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（キットに添付のもの）１μｌ、滅菌蒸留水４μｌ、アダプター１（キットに添付のもの）２μｌ］、反応液２［ＤＮＡ試料１μｌ、ＤＮＡライゲーションバッファー２μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ、滅菌蒸留水４μｌ、アダプター２Ｒ（キットに添付のもの）２μｌ］であり、１６℃で一晩反応した。 次に、反応液１および反応液２にＲｓａＩ消化したカンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡを加えて、１回目のハイブリダ
イゼーションを行った。 反応液組成は、ハイブリダイゼーション液１［反応液１を１μｌ、ＲｓａＩ消化カンジダ トロピカルスゲノムＤＮＡ２μｌ、ハイブリダ
イゼーションバッファー（キットに添付のもの）１μｌ］、ハイブリダイゼーション液２［反応液２を１μｌ、ＲｓａＩ消化カンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡ２
μｌ、ハイブリダイゼーションバッファー１μｌ］であり、ミネラルオイルを重層し、９８℃で１．５分間熱変性した後、６３℃で１．５時間保温した。 ハイブリダイゼーション液２を直前に熱変性したＲｓａＩで消化したカンジダ トロピカリスゲ
ノムＤＮＡ（ＲｓａＩで消化したカンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡ１μｌにバイブ
リダイゼーションバッファー１μｌを加え、９８℃で１．５分間熱変性した）と混合し、さらにハイブリダイゼーション液２に加えた。 この混合液を６３℃で一晩保温し、２回目のハイブリダイゼーションを行った。 一晩保温後、Ｄｉｌｕｔｉｏｎバッファー２００μＬを加え、６３℃で７分間保温した。 このハイブリダイゼーション混合液を添付のＰＣＲプライマー１（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；配列番号：４）を用いて１回目のＰＣＲを行った。 反応組成は、ハイブリダイゼーション混合液１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー２．５μｌ、ｄＮＴＰ混合液２μｌ、ＰＣＲプライマー１を１μｌ、滅菌蒸留水１８μｌ、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．５μｌ（以上、Ｔａｋａｒａ社製）であり、ＰＣＲは、９４℃で２５秒間の熱変性、６６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１．５分間の伸長反応からなるサイクルを３０サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、７２℃で２分間の伸長反応、９４℃で２５秒間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。
【０１３６】
第１回目のＰＣＲ後、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを実施した。 滅菌蒸留水で４０倍に希釈した第１回目のＰＣＲによる産物１μｌを鋳型とし、プライマーとして、キットに添付されていたＮｅｓｔｅｄ プライマー１（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’；配列番号：５）およびＮｅｓｔｅｄ プライマー２Ｒ（５’−ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴ−３’；配列番号：６）を用いて、第１回目のＰＣＲと同様の反応組成で行った。 ＰＣＲは、９４℃で１０秒間の熱変性、６８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、９４℃で２５秒間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。 以上のＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒＰＥＲＳＯＮＡＬ（Ｔａｋａｒａ社製）により行った。 得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認した後、バンドをゲルより切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した。 精製したＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだ。 組み換えたベクターは、コンピテントセルＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社製）に形質転換し、カンジダ アルビカンス菌特異的サブトラクトライブラリーとした。
【０１３７】
（２） カンジダ アルビカンス菌特異的クローンの選抜
得られたライブラリーからカンジダ アルビカンス菌に特異的なクローンを選抜するために、以下の方法によって、各種真菌ＤＮＡとの反応性を検討した。 形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。 得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いてラベルした。 反応組成は、プラスミドＤＮＡ ５０ｎｇ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー５μｌ、ＰＣＲ Ｄｉｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）５μｌ、Ｎｅｓｔｅｄプライマー１を１μｌ、Ｎｅｓｔｅｄプライマー２を１μｌ、滅菌蒸留水１７μｌ、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．５μｌであり、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長反応からなるサイクルを３５サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、９６℃で１分間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。 得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドをゲルより切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて精製し、ＤＮＡプローブとした。
【０１３８】
各種真菌ゲノムＤＮＡ ５０ｎｇをＰＡＬＬ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂメンブレン（ＰＡＬＬ社製）にスポットし、風乾した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌで１０分間アルカリ変性し、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌで１０分間中和して風乾したものを、ドットブロットハイブリダイゼーションの試料とした。 メンブレンをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）で、６８℃で、１時間インキュベートした後、１０ｎｇ／ｍｌ ＤＮＡプローブを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液で、６０℃で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。 終夜ハイブリダイゼーション後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間２回洗浄し、６０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる １５分間の洗浄を２回行った。 バッファー２［１％ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で３０分間インキュベートした後、抗ジゴケシゲニン抗体希釈液［抗ジゴケシゲニン抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス社製をバッファー２で５０００倍希釈したもの）］で３０分間インキュベートした。 バッファー１［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で１５分間２回洗浄し、バッファー３［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２］で平衡化した。 ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）でインキュベートし発色させた後、ＴＥバッファーで反応を停止した。
【０１３９】
その結果、カンジダ アルビカンス菌に特異的に反応するクローンを選抜し、これらをプローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９と命名した。
【０１４０】
（３） 塩基配列の決定
プローブＣＡ−５０（配列番号：１）、ＣＡ−５１（配列番号：２）、ＣＡ−６９（配列番号：３）の塩基配列の決定は、以下のように実施した。
【０１４１】
すなわち、ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ社製）で解析し、塩基配列を決定した。 シークエンシング反応液組成は、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇ、プレミックス８μｌ、プライマー３μｌを滅菌蒸留水で２０μｌとしたものであり、９５℃で２０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で１分間を３０サイクル行った。 プライマーは、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｙｃｌｅプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’；配列番号：７）、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’；配列番号：８）および合成プライマーを用いた。
【０１４２】
実施例２：各プローブの特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１４３】
まず、検討対象菌株として、下記表３に列挙した臨床分離株および寄託菌株を準備（全６４種類）した。 表３に示した各種細菌および真菌ゲノムＤＮＡ５０ｎｇをメンブレンにスポットし、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法により各プローブの特異性の検討を行った。 具体的には、各臨床菌株または寄託菌株に関して、実施例１に記載の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡの一定量（例えば、約１０〜約１００ｎｇ）をナイロンフィルターにスポットして、アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料とした。 次いで、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＢＲＬ社製）でラベルしたプローブで、マニアティスのマニュアル（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９））に従い、４５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃の条件下で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。 終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料に関して、同マニュアルに従い、５５℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる２０分間の洗浄を２回行った後に、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇ−ＡＬＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＲＬ社製）で検出および発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認した。 表３に示した結果から明らかなように、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９のいずれもが、カンジダ アルビカンス菌のゲノムＤＮＡに対してのみ特異的に反応することが確認された。
【０１４４】
【表３Ａ】
【０１４５】
【表３Ｂ】
【０１４６】
同様に、表３に示した結果から、いずれのプローブもカンジダ アルビカンス菌に由来するＤＮＡに対してのみ反応性を示し、他の菌種由来のＤＮＡに対して反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その特異性が確認された。
【０１４７】
実施例３：各プローブの種特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブとカンジダ属およびその他真菌のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１４８】
まず、検討対象菌株として、下記表４に列挙した臨床分離株および寄託菌株を準備（全１７種類）した。 表４に示したカンジダ属およびその他真菌ゲノムＤＮＡ ５０ｎｇをメンブレンにスポットし、実施例２に示した方法により各プローブの特異性の検討を行った。 その結果、表４に示す様に、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９のいずれもが、カンジダ アルビカンス菌のゲノムＤＮＡにのみ特異的に反応することが確認された。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
表４に示した結果から明らかなように、いずれのプローブもカンジダ アルビカンス菌に由来するＤＮＡに対してのみ反応性を示し、カンジダ属の他の菌種由来のＤＮＡに対して反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その種特異性が確認された。
【０１５１】
実施例４：塗抹固定する至適白血球数（貪食細胞数）の検討
ＡＰＳコートスライドグラスのウェル（直径５ｍｍの円形ウェル）に塗抹する至適白血球数の検討を行った。
【０１５２】
ヘパリン加健常ヒト血液１０ｍｌを採取し、前出の実施手順例（１）の記載に従って白血球を採取した。 次に、得られた白血球を、適量のＰＢＳを用いて懸濁した後、血球計算盤を用いて１ｍｌ当たりの白血球数を測定し、（ａ）１×１０８個／ｍｌを始点として、（ｂ）５×１０７個／ｍｌ、（ｃ）１×１０７個／ｍｌ、（ｄ）５×１０６個／ｍｌ、（ｅ）１×１０６個／ｍｌ、（ｆ）５×１０５個／ｍｌ、および（ｇ）１×１０５個／ｍｌの希釈系列を調製した後、各々５μｌをスライドグラスに塗抹した。 風乾した後、カルノア固定（実施手順例（２）参照）を行い、直ちに対比染色液で染色し、実施手順例（１１）に記載した方法を用いて判定を行った。
【０１５３】
その結果、細胞数が１×１０８個／ｍｌでは細胞数が過剰であり、検出不適であった。 また、５×１０６個／ｍｌ以下では、ウェルに観察される細胞数が少なく、検出不適であった。 よって、固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）が、５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦５×１０７個／ｍｌに調製したものを使用するのが好ましいことが判明した。 また、これに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜５×１０５個／ウェル、好ましくは５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦２．５×１０５個／ウェルとなるように調製するのがよいことも判明した。
【０１５４】
実施例５：溶菌酵素ザイモラーゼの至適力価の検討
カンジダ アルビカンス菌を溶菌して、そのＤＮＡを得るためのザイモラーゼの至適力価を検討した。
【０１５５】
カンジダ アルビカンス菌をＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で一昼夜培養した。 その後、基質としてカンジダ アルビカンス菌をＰＢＳにて懸濁した溶液（基質１）と、カルノア固定した後に、７０％エタノールに浸し、風乾し、ＰＢＳにて懸濁した溶液（基質２）の２種類を調製した。
【０１５６】
反応は、ザイモラーゼ／ＰＢＳを０．５ｍｌ、基質を１．５ｍｌ、そしてＭ／１５リン酸緩衝液を２．５ｍｌを含み、０．５ｍｌの滅菌精製水で全量を５．０ｍｌに調製したものを用いた。 その後、３７℃で、２時間反応させ、ＯＤ８００を測定した。 また、ザイモラーゼ（ザイモリエイス−１００Ｔ）濃度として、０ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌのものを用いた。
【０１５７】
その結果、基質１を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．５３３、０．５２１、０．５５３、０．５５４、０．５４８、０．４１７、０．３９４、０．２８８、０．１６３、０．１１３であり、基質２を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．４４５、０．４１１、０．３５９、０．２８２、０．２３２、０．１４６、０．１１５、０．０９６、０．０８、０．０５７であった。 基質１および基質２共に、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、特に、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲が有効であることが判明した。
【０１５８】
すなわち、ザイモラーゼの使用量は、５０単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌ、特に１００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌであることが好ましい。 また、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合には、真菌である場合も考慮してザイモラーゼを適宜添加するのが好ましい。
【０１５９】
実施例６：カンジダ アルビカンス菌の貪食サンプルからの検出
（１） 貪食サンプルの作製
（ｉ） Ｕ９３７細胞の調製
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ １６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内でＵ９３７細胞（ヒト単球株化細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３．２）を培養した。 次に、Ｕ９３７細胞培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収した。 その後、回収したＵ９３７細胞を、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を約１×１０４個／μｌ〜約２×１０４個／μｌに調製した。
【０１６０】
（ｉｉ） 細菌貪食サンプルの調製
カンジダ アルビカンス菌を、５ｍｌのＹＰＤ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。
【０１６１】
上清を捨てた後、菌のペレットを５ｍｌのＰＢＳで懸濁し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 集菌した菌を５ｍｌのＰＢＳで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して、吸光度計により菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）を、０．０１６〜０．０２４にしたものを１５ｍｌ調製した。 こうして得られた菌液を、１７５ｃｍ３の培養用フラスコに移し、３０分間室温で静置した。
【０１６２】
ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍｌを採取し、血球分離試薬を４：１の割合で加え、３７℃で３０分間静置し、白血球画分を分取し、これをＰＢＳで５０ｍｌにした。 培養用フラスコ内の上清を静かに捨て、ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍｌずつフラスコに加え、室温で１０分間静置した。 培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ １０ｍｌで１５ｍｌの遠沈管に回収し、４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。 収集した白血球に赤血球の混入が認められたので、１ｍｌの滅菌精製水にて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳを１４ｍｌ加えて等張化し、再度４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集した。 収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μｌ〜５×１０４個／μｌの密度に調製した。
【０１６３】
こうして得られた貪食サンプルを、ＣＡ貪食サンプルとした。
【０１６４】
当該貪食サンプルの利点は、▲１▼ カンジダ アルビカンス菌が検出される臨床検体の入手が困難であり、そのため本発明のプローブの特異性評価などの各種試験ができないという問題点を、臨床検体の代わりに人為的に作製した当該貪食サンプルを使用することにより回避できる、▲２▼ 本発明のプローブまたはキット等の特異性試験、感度試験、再現性試験などの性能試験に利用できる、そして、▲３▼貪食サンプルで得られた各種試験結果を、臨床検体に適用できる、ことなどが挙げられる。
【０１６５】
（ｉｉｉ） 塗抹固定
（ｉ）で得たＵ９３７細胞と、（ｉｉ）で調製した各細菌貪食サンプルを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに５μｌずつ塗抹し、風乾させた。
【０１６６】
次に、実施例４（２）に記載のカルノア固定液にスライドグラスを２０分間浸した後、７５％エタノールに５分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで４℃で保存した（実施手順例（２）参照）。 次いで、固定サンプルの前処理を、実施手順例（３）に記載の手順に従って行った。
【０１６７】
（２） 貪食サンプルの規格及び試験方法
（ｉ） 細胞数
各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定すべき細胞数を、約５．０×１０４〜約２．５×１０５個／ウェルとし、また、Ｕ９３７細胞の細胞数を、約５．０×１０４〜約１．０×１０５個／ウェルとした。
【０１６８】
（ｉｉ） 貪食率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルをアクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（×１，０００）で無作為に約２００個の細胞を計測した。
【０１６９】
計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞を陽性細胞とし、以下の数式に従って貪食率を算出した。
【０１７０】
【数１】
【０１７１】
この時に算出したＣＡ貪食サンプルの貪食率（％）は、１０％以上であった。
【０１７２】
（３） 試験方法
実施例７（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。
【０１７３】
使用したＣＡ貪食サンプルの貪食率は１６％であり、約１．３×１０５個／ウェルであった。 貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施手順例（２）〜（１１）に記載の方法に従って各プローブの特異性を検討した。 プローブＣＡ−５０の結果を図１に、プローブＣＡ−５１の結果を図２に、そして、プローブＣＡ−６９の結果を図３にそれぞれ示した。 また、プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９を混合した場合の特異性の結果を、図４に示した。
【０１７４】
（４） 結 果
プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９のいずれもが、貪食細胞中に取り込まれたカンジダ アルビカンス菌由来のＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが判明した。 また、混合プローブ（プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９の混在体）においては、単独プローブに比較して強いシグナルが得られることが判明した。 このことから、使用するプローブは複数種混合して使用するのが好ましいことが明らかとなった。
【０１７５】
貪食サンプルで得られた結果は、臨床検体にも適用できるので、本発明のプローブは、臨床検体においても有用であることが証明された。
【０１７６】
実施例７：真菌以外の菌種に対する溶菌酵素の選択
スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ １２６００）、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：ＡＴＣＣ １４９９０）、シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ＡＴＣＣ １０１４５）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ １９４３３）、エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＡＴＣＣ １１７７５）を溶菌するための酵素条件を検討した。
【０１７７】
スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスに対しては、溶菌酵素としてリゾスタフィン（Ｂｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３８， ２９３−３００，１９７３）を使用した。 また、エンテロコッカス フェカーリスに対しては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（Ａｒｃｈｓ． Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．， ２３， ５４３−５４９， １９７８）とリゾチーム（生化学工業）を使用した。 また、シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリについては、７０ｍｍｏｌ／ｌ の水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（前出）を使用した。
【０１７８】
上記各種細菌を、５ｍｌのＢＨＩ液体培地（ブレインハートインフュージョン液体培地（ＤＩＦＣＯ社製））に植菌し、３７℃で、８時間以上培養した。 培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 このようにして集めた菌をＰＢＳに懸濁し試料とした。 溶菌は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける菌液の濁度の減少により評価した。
【０１７９】
その結果、スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスは、リゾスタフィンによって溶菌した。 シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリについては、７０ｍｍｏｌ／ｌ の水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（前出）によって溶菌したため、酵素処理は不要であった。 また、エンテロコッカス フェカーリスについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ単独よりも、リゾチームと併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。 また、貪食作用を受けて取り込まれた菌が、例えば、シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリなどである場合には、アルカリ処理に際して菌の細胞壁が溶解され、遺伝子が露出した状態となるので、必ずしもこの酵素処理を行う必要はない。 また、アルカリ処理は、実施手順例（６）に記載の手順に従って行うこともできる。 しかしながら、確実に菌の細胞壁を溶解するのであれば、酵素処理を行う方がよいと考えられる。
【０１８０】
本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処理用の各酵素は、前述したような細菌株に対して有効であるのみならず、他のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属を初めとする他の菌種等でも有効である。 また、かような酵素は、ザイモラーゼに加えて、各々単独で用いることもできる。 さらに、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合、またはキットに酵素を付属させる場合には、酵素試薬を構成する酵素を複数混合するのが有効であり好ましい。
【０１８１】
なお、図５に、（ａ） スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディス、（ｂ） シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキアコリ、ならびに（ｃ） エンテロコッカス フェカーリスに関して実施した試験結果を示した。
【０１８２】
実施例８：酵素溶解液でのジメチルスルフォキシド （ＤＭＳＯ） の至適濃度の検討
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するＰＭＳＦの溶解剤である、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の酵素活性に及ぼす影響を検討した。
【０１８３】
エンテロコッカス フェカーリスを５０ｍｌのＢＨＩ液体培地（前出）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 この培養液を、４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌し、ＰＢＳにて懸濁した後、オートクレーブ（１２０℃、１０分）で熱処理を行った。 次に、４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌのＰＢＳで沈渣を懸濁させた後、凍結乾燥させた。 この凍結乾燥試料を、０〜１０％ＤＭＳＯ含有５ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ ６．０）、２ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムで懸濁し、Ｎ−アセチルムラミダーゼに対する試料とした。 また、ミクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ：ＪＣＭ １４６４）を、５ｍｌのＢＨＩ液体培地（前出）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 培養した菌液を４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 上清を捨て、菌のペレットを５ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃にて、２，０００×ｇで、１０分間遠心分離して集菌した。
【０１８４】
このようにして集めた菌を、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾチームに対する試料とした。 一方、スタフィロコッカス エピデルミディスをリゾチームの場合と同様にして培養、集菌し、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾスタフィンに対する試料とした。
【０１８５】
酵素活性は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける試料の濁度の減少により評価した。 ただし、本試験でのそれぞれの酵素力価は、（ａ） Ｎ−アセチルムラミダーゼ ３００単位／ｍｌ、（ｂ） リゾチーム １０，０００単位／ｍｌ、（ｃ） リゾスタフィン５０単位／ｍｌとし、酵素活性に対するＤＭＳＯの影響を検討した。 それぞれの酵素活性を、単位時間当たりにおける菌濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）の減少で評価した結果、ＤＭＳＯは、Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、リゾチームおよびリゾスタフィンに対しては、共に５％以上のＤＭＳＯで活性の低下が認められた。 また、２％以下のＤＭＳＯの濃度では、酵素活性の低下は認められなかった。 ゆえに、ＰＭＳＦを溶解させるＤＭＳＯ濃度は少なくとも５％未満、好ましくは２％以下、さらには１％程度とするのが好ましい。 また、上記設定した濃度においてはザイモラーゼの活性に何ら悪影響を与えなかったので、ザイモラーゼに対するＤＭＳＯの濃度も同一とした。
【０１８６】
その検討結果を、図６（ａ）〜（ｃ）および下記表５に示した。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
実施例９：酵素溶解液でのフェニルメチルスルフォニル
フルオライド （ＰＭＳＦ） の至適濃度の検討
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ：ＰＩＥＲＣＥ社製）の効果を検討した。
【０１８９】
１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ：和光純薬社製）にＰＭＳＦを溶解し、ＰＭＳＦの終濃度が０（無添加）〜１ｍｍｏｌ／ｌ となるようにＰＢＳで１０ｍｌに希釈した。 この溶液に、プロテアーゼの力価が０．２単位／ｍｌとなるよう、プロテイネースＫ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加した。 ヘパリン加健常ヒト血液５ｍｌを採取し、実施手順例（１） に記載の方法に従って白血球を採取した。 次に、白血球を適当量のＰＢＳで懸濁して、血球計算盤で細胞数を計測し、細胞数を、約５×１０４〜約２．５×１０５個／ウェルに調製し、その５μｌをＡＰＳコートスライドグラスのウェルに塗抹し、風乾した後、実施手順例（２）に記載のカルノア固定法に従って固定した。
【０１９０】
このサンプルを用いて、実施手順例（３）および（４）に記載の方法に従って試験を行った。 １μｍｏｌ／ｌ 〜１ｍｍｏｌ／ｌ のＰＭＳＦの濃度で試験を実施した結果、１０μｍｏｌ／ｌ 以上の濃度で効果が認められ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ 以上のＰＭＳＦ濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。
【０１９１】
その結果を、プロテアーゼ０．２単位／ｍｌのみ（図７（ａ））、ＰＭＳＦ１μｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｂ））、ＰＭＳＦ １０μｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｃ））、ＰＭＳＦ ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｄ））、およびＰＭＳＦ １ｍｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｅ））に、それぞれ示した。
【０１９２】
実施例 １０ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［力価］の検討
（１） 貪食サンプルの作製
（ｉ） Ｕ９３７細胞の調製
実施例６（１）（ｉ）に記載の方法により Ｕ９３７細胞を調製した。
【０１９３】
（ｉｉ） 細菌貪食サンプルの調製
スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ １２６００）、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：ＡＴＣＣ １４９９０）、シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ＡＴＣＣ １０１４５）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ １９４３３）、エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＡＴＣＣ １１７７５）を、各々５ｍｌのＢＨＩ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 その後、実施例６（１）（ｉｉ）に準じて、それぞれＳＡ貪食サンプル、ＳＥ貪食サンプル、ＰＡ貪食サンプル、ＥＦ貪食サンプル、ＥＫ貪食サンプルを作製した。
【０１９４】
（ｉｉｉ） 塗抹固定
実施例６（１）（ｉｉｉ）に準じて行った。
【０１９５】
（２） 貪食サンプルの規格及び試験方法
（ｉ） 細胞数
実施例６（２）（ｉ）と同様とした。
【０１９６】
（ｉｉ） 貪食率
実施例６（２）（ｉｉ）と同様にして算出した。 この時に得られた各細菌貪食サンプルの貪食率（％）は、１０％以上であった［図８で矢印にて示す、貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞］。
【０１９７】
（３） 試験方法
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。
【０１９８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２３％であり、約１．９８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２７％であり、約１．７４×１０５個／ウェルであった。
【０１９９】
また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、約６．４０×１０４個／ウェルであった。 各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施手順例４（３）に記載の方法に従って酵素前処理を行った。 次に、酵素前処理済みのスライドグラスを湿潤箱に置き、各種力価に調製した各酵素溶液１ｍｌを検体塗抹部位に滴下して反応させた。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌ 塩酸含有ＰＢＳ、７０％エタノールにそれぞれ１０分間浸し、風乾させた。 このスライドグラスを７０ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム含有ＰＢＳに３分間、７０％エタノールに１０分間浸した後に風乾し、１％アクリジンオレンジ染色液で染色した。 その後、蛍光顕微鏡（×１，０００）により評価した。
【０２００】
スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスは、リゾスタフィンで至適力価の検討を行った。 エンテロコッカス フェカーリスは、Ｎ−アセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討するため、Ｎ−アセチルムラミダーゼを１００単位／ｍｌに固定した場合のリゾチーム至適力価の検討と、リゾチームを１０，０００単位／ｍｌに固定した場合のＮ−アセチルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。 判定は、酵素処理することで菌体が白血球内で確認されなくなった事例について「適」とした。
【０２０１】
（４） 結 果
スタフィロコッカス アウレウスの溶菌においては、リゾスタフィンの力価は１単位／ｍｌで十分効果を示すが、スタフィロコッカス エピデルミディスの溶菌には、１０単位／ｍｌ以上のリゾスタフィン力価が必要であった（表６）。 従って、リゾスタフィンの至適力価を、１０単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌに設定した。
【０２０２】
【表６】
【０２０３】
また、エンテロコッカス フェカーリスの溶菌においては、リゾチームの力価を１０，０００単位／ｍｌで固定したとき、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価が１０単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった（表７）。 リゾチームについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価を１００単位／ｍｌに固定した場合、リゾチーム力価が１，０００単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった（表７）。 従って、Ｎ−アセチルムラミダーゼの至適力価は１００単位／ｍｌ〜１，０００単位／ｍｌ、リゾチームの至適力価は１０，０００単位／ｍｌ〜１００，０００単位／ｍｌに設定した。 また、シュードモナス アエルギノーザに対しても、同様の力価で使用することができる。
【０２０４】
【表７】
【０２０５】
実施例１０（３）で「適」と判定した一例を、図９に示す。 図９において、（ａ） は酵素処理前のスタフィロコッカス アウレウスの貪食サンプル、（ｂ） は酵素処理前のエンテロコッカス フェカーリスの貪食サンプル、（ｃ） はサンプル（ａ）を酵素処理した後、そして、（ｄ）はサンプル（ｂ）を酵素処理した後の様子をそれぞれ示している。
【０２０６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各酵素の至適力価も同様とした。
【０２０７】
実施例 １１ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［温度］の検討
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて酵素試薬の至適温度を検討した。 ただし、本試験の酵素処理時間を３０分、検討温度は、４℃、２５℃、３７℃、４２℃、６０℃とし、各酵素力価は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社製）とした。
【０２０８】
各酵素は、実施例７に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２０９】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２２％であり、約１．１２×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２９％であり、約１．６２×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２３％であり、約１．３８×１０５個／ウェルであった。
【０２１０】
判定は、実施例１０（３）に記載の方法に準じて行った。 その結果、スタフィロコッカス アウレウスは、４℃〜６０℃の温度範囲において、白血球の菌体は確認されなかった。 また、スタフィロコッカス エピデルミディスは、処理温度４℃および２５℃では白血球中の菌体が残存していたが、３７℃以上では菌体が確認されなかった。 そして、エンテロコッカス フェカーリスでは、処理温度４℃、２５℃および６０℃で菌体が残存していたが、３７℃および４２℃では菌体の残存が確認されなかった。
【０２１１】
これらのことから、至適酵素処理温度を３７℃〜４２℃に設定した。
【０２１２】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、ザイモラーゼの温度条件をこれと同一にしたところ、好ましい結果が得られたので、ザイモラーゼの至適温度もこれと同一に設定した。 その結果を、表８に示した。
【０２１３】
【表８】
【０２１４】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適温度も同様とした。
【０２１５】
実施例 １２ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［時間］の検討
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体として、溶菌酵素の至適酵素処理時間を検討した。
【０２１６】
検討した時間は、０分、１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分とした。
【０２１７】
各酵素は、実施例７に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２１８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は１８％であり、約７．８０×１０４個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、約１．１０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、約１．３０×１０５個／ウェルであった。
【０２１９】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて検討した。 ただし、本試験の酵素処理温度は３７℃、各酵素力価はＮ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ）とした。
【０２２０】
判定は、実施例１０（３）に記載の方法に準じて行った。 その結果、スタフィロコッカス アウレウス、スタフィロコッカス エピデルミディス、エンテロコッカス フェカーリス貪食サンプルのいずれもが、酵素処理時間２０分以上（０分および１０分においては「不適」であった）で、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも１５分以上、好ましくは２０分以上、さらに至適酵素処理時間を３０分〜６０分とするのが好ましい、ことが明らかとなった。
【０２２１】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、ザイモラーゼの処理時間条件をこれと同一にしたところ、好ましい結果が得られたので、ザイモラーゼの至適時間もこれと同一に設定した。 その結果を、表９に示した。
【０２２２】
【表９】
【０２２３】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同一の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。
【０２２４】
実施例 １３ ：プローブ濃度の検討
本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応において、プローブ濃度は、ハイブリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。 プローブ濃度が低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。 また、過剰量のプローブの使用は、非特異的反応を招きかねない。 それ故、各種プローブ液について、至適濃度を検討した。
【０２２５】
まず、実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。 使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、約１．４８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、約２．０７×１０５個／ウェルであった。 ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１８％であり、約１．５０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、約１．７２×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１２％であり、約１．６３×１０５個／ウェルであった。
【０２２６】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて検討した。 プローブとして、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、スタフィロコッカス アウレウス（ＳＡ−２４、ＳＡ−３６、ＳＡ−７７の混合物）、スタフィロコッカス エピデルミディス（ＳＥ−３、ＳＥ−２２、ＳＥ−３２の混合物）、エンテロコッカス フェカーリス（ＥＦ−１、ＥＦ−７、ＥＦ−２７の混合物）、シュードモナス アエルギノーザ（ＰＡ−２−３１、ＰＡ−１３−３の混合物）、エシェリキア コリ（ＥＣ−２４、ＥＴ−４９、ＫＩ−５０の混合物）に対する各プローブ濃度を、それぞれ０．０４ｎｇ／μｌ、０．４ｎｇ／μｌ、１．２ｎｇ／μｌ、１．８ｎｇ／μｌ、２．４ｎｇ／μｌ、３ｎｇ／μｌに調製した（日本国特許第２７９８４９９号参照）。
【０２２７】
貪食サンプルを塗抹したスライドグラス（図１０参照）に、上記の各種濃度に調製したプローブ液を使用し、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従って検討した。 ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を３種類混合して用いた。
【０２２８】
その結果、低濃度（０．０６ｎｇ／μｌ）ではシグナルが明確でなくなり、高濃度（２．４ｎｇ／μｌおよび３ｎｇ／μｌ）ではバックグラウンドの増大が認められた。 また、０．０６ｎｇ／μｌにおいては「不適」であり、０．６ｎｇ／μｌにおいては「適」であったことから、少なくとも０．１ｎｇ／μｌ以上とするのが好ましい。 さらに、２．４ｎｇ／μｌでは「不適」であり、１．８ｎｇ／μｌでは「適」であったことから、２．２ｎｇ／μｌ以下の濃度とすることが、好ましいことが明らかとなった。 それ故、ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ濃度を、０．１〜２．２ｎｇ／μｌ、好ましくは０．６〜１．２ｎｇ／μｌとした。
【０２２９】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、本発明のカンジダ アルビカンスに対するプローブについて２．０ｎｇ／μｌのプローブ濃度で試験したところ、「適」であることを証明している。
【０２３０】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 このことから、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各プローブの至適濃度も同様とした。
【０２３１】
実施例 １４ ：ハイブリダイゼーション温度の検討
ハイブリダイゼーション反応における反応温度は、ハイブリッド形成速度とハイブリッドの安定性に影響を与えるパラメーターである。 ハイブリダイゼーション反応を高温下で行うと、細胞の形態が劣化することが知られていることから、至適温度の検討（４℃、２５℃、３７℃、４２℃、５０℃、６０℃）を行った。
【０２３２】
まず、実施例１０（１）および（２）に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。 使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は３１％であり、約１．３８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４２％であり、約１．９５×１０５個／ウェルであった。 ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１５％であり、約１．３０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４８％であり、約１．０５×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１７％であり、約１．８５×１０５個／ウェルであった。 貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（図１１を参照）を使用して、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従い検討した。 ただし、使用したプローブは、対象となる菌に対応したものを使用した（実施例１３を参照）。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２３３】
その結果、ハイブリダイゼーション温度が４℃以下では、ハイブリッド形成速度が低下し、各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。 また、６０℃においては細胞形態の変化が認められ、安定なシグナルが観察されなかった。
【０２３４】
また、２５℃および５０℃では、３７℃および４２℃に比べ、シグナルが明確でなかったが検出することは可能であった。 従って、至適ハイブリダイゼーションの温度は、２５℃〜５０℃、より好ましくは３７〜４２℃に設定するとよい。
【０２３５】
なお、実施例６に記載の方法に準じて作製したＣＡ貪食サンプルおよび本発明のプローブを用いて前記温度条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、好ましい結果が得られた。従って、本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションの温度条件も、前記温度条件と同一とした。
【０２３６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同様とした。
【０２３７】
実施例 １５ ：ハイブリダイゼーション時間の検討
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とし、１０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、９００分間のハイブリダイゼーション時間について検討した。
【０２３８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、約１．４５×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、約１．３３×１０５個／ウェルであった。ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１７％であり、約１．９５×１０５個／ウェルであった。 また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４１％であり、約１．４５×１０５個／ウェルであった。 ＥＫ貪食サンプルの貪食率は２０％であり、約１．２３×１０５個／ウェルであった。
【０２３９】
貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（図１１に示すものと同じ）を使用して、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従って検討を行った。 ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した（実施例１３参照）。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２４０】
その結果、ハイブリダイゼーション時間が１０分ではシグナルが観察されなかったが、６０分以上でシグナルが観察され、９０分以上で安定したシグナルが観察された。 また、ハイブリダイゼーション時間を９００分としても、シグナルの検出には変化は認められなかった。 従って、少なくとも３０分以上、好ましくは６０分以上、より好ましくは９０分以上とするのが好ましい。 さらに、至適ハイブリダイゼーション時間として、１２０分〜９００分の時間を設定するのが好ましい。
【０２４１】
なお、実施例６に記載の方法に準じて作製したＣＡ貪食サンプルおよび本発明のプローブを用いて前記時間条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、好ましい結果が得られた。 従って、本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションの時間条件も、前記温度条件と同一とした。
【０２４２】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 従って、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適時間も同様とした。
【０２４３】
実施例 １６ ：ハイブリダイゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響
実施例６に記載の方法で作成したＣＡ貪食サンプルを検体とした。
【０２４４】
プローブ（プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９）希釈液に各種界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．５％添加し、実施手順例の記載に従ってハイブリダイゼーションを行ったところ、０．５％のＳＤＳを添加することにより検出感度が飛躍的に増強した。 また、ラウリルサルコシン、ＢＲＩＪ ３５、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）によっても検出感度を高めることができる。
【０２４５】
また、ＳＤＳの好ましい濃度は、１％以下、より好ましくは０．１％〜０．７５％、さらに好ましくは０．２５〜０．５％である。
【０２４６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 ゆえに、臨床検体においてもｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程に界面活性剤、特に、ＳＤＳを添加するのが好ましい。
【０２４７】
実施例 １７ ：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブ鎖長の検討
カンジダ アルビカンス菌プローブ（プローブＣＡ−５０、配列番号：１）を用いて、ジゴキシゲニンにてラベル化を行った。
【０２４８】
まず、精製したＤＮＡプローブ１μｇを、１０×Ｌ．Ｂ．（０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）５μｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウム、０．５ｍｇウシ血清アルブミン）５μｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ジチオスレイトール５μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ａ、Ｇ、Ｃ）各１ｎｍｏｌ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）０．５ｎｍｏｌ、ｄＴＴＰ各０．５ｎｍｏｌ、ＤＮａｓｅ３μｌ（２５ｍＵおよび５０ｍＵ相当量）、１０Ｕ／μｌ ＤＮＡポリメラーゼ１μｌを含み、適量の滅菌精製水で全量を５０μｌとなるように調製した。 １５℃、２時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。 ラベル化した後、５分間煮沸して反応を停止させた。 反応停止液をスピンカラム（ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ ＣＯＬＵＭＵＮＳ ＣＳ９０１、ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ， ＩＮＣ．）に注入し、２５℃で２分間遠心分離（３，０００×ｇ）を行って、遊離しているヌクレオチドを除去した。
【０２４９】
そして、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、３％アガロースゲルにて電気泳動してサイズを確認した。 次に、サザンブロッティング法によりアガロースゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜に転写させた。 その後、２％ブロッキング試薬（ロシュ社製）に３０分間浸した後、１／５，０００量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加えて３０分間浸した。 次に、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうし、２回洗浄した。 そして、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ ９．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうして洗浄した。 その後、前出のＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液に浸して発色させた。 最後に、精製水に浸し、発色を止めて乾燥させた。
【０２５０】
その結果を、図１２に示す。 図１２から明らかなように、５０ｍＵのＤＮａｓｅ（図１２のレーン２）を用いて、主として約２００〜約３００塩基長に分布するように切断した場合に、ラベル効率が高いことが示された。 こうして得られた検出用プローブを、貪食サンプルや感染症患者からの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用し、ハイブリダイゼーションを行ったところ、優れた感度でシグナルが検出された。 従って、効率よくカンジダ アルビカンス菌を検出する上で、ハイブリダイゼーションに使用するプローブの鎖長としては、約２００〜約６００塩基長、好ましくは約２００〜約５００塩基長、そして、最も好ましくは約２００〜約３００塩基長が良いことが判明した。 また、シグナルの検出の際に約５００塩基長を超えるプローブ鎖長を用いた場合にはバックグラウンドの増大が認められることから、約５００塩基長を超えないのが好ましい。
【０２５１】
【発明の効果】
このように、本発明の検出用プローブは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適用することで、短時間の内に、検出対象菌に対して安定なシグナルを発現することができるため、迅速かつ的確な検査結果をもたらすことが可能となる。
【０２５２】
また、これにより、カンジダ アルビカンス菌のみならず、敗血症や菌血症などの疾患に対する診断材料を医療現場に迅速に提供でき、人命救助の観点からも多大な貢献が期待されるものである。
【０２５３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＡ−５０プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図２】ＣＡ−５１プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図３】ＣＡ−６９プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図４】ＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９による混合プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図５】（ａ） スタフィロコッカス アウレウスとスタフィロコッカス エピデルミディスに対する溶菌酵素の経時的活性、（ｂ） シュードモナス アエルギノーザとエシュリキア コリに対するアルカリ剤に対する活性、および（ｃ） エンテロコッカス フェカーリスに対する溶菌酵素の経時的活性を示すグラフである。
【図６】（ａ） Ｎ−アセチルムラミダーゼ ３００単位／ｍｌ、（ｂ） リゾチーム１０，０００単位／ｍｌ、および（ｃ） リゾスタフィン５０単位／ｍｌに対するＤＭＳＯの濃度依存的効果を示すグラフである。
【図７】（ａ） プロテアーゼ ０．２単位／ｍｌのみ、（ｂ） ＰＭＳＦ１μｍｏｌ／ｍｌ、（ｃ）ＰＭＳＦ １０μｍｏｌ／ｍｌ、（ｄ）ＰＭＳＦ ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ、および（ｅ）ＰＭＳＦ１ｍｍｏｌ／ｍｌに対するＰＭＳＦの添加効果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、貪食サンプルにおいて、細菌が食細胞に貪食されて形態変化を起こしている状態を指し示す図である。
【図９】（ａ） 酵素処理前のスタフィロコッカス アウレウスの貪食サンプル、（ｂ） 酵素処理前のエンテロコッカス フェカーリスの貪食サンプル、（ｃ）貪食サンプル（ａ）を酵素処理して得たサンプル、および（ｄ）は貪食サンプル（ｂ）を酵素処理して得た貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図である。
【図１０】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適プローブ濃度を検定するための貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概略図である。
【図１１】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適温度を検定するための貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概略図である。
【図１２】ジゴキシゲニンラベル化ＣＡプローブＣＡ−５０の鎖長とジゴキシゲニンによるシグナル強度を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌の検出技術の改良に関し、詳細には、カンジダ アルビカンス菌の検出のための新規のプローブ、これらプローブを利用したカンジダ アルビカンス菌の検出方法、およびこれら方法の関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
カンジダ アルビカンス菌は、正常人の口腔咽頭、消化管、膣などに常在している真菌であり、感染経路として、性交感染、自己感染、産道感染、院内感染、家族間感染などがある。
【０００３】
カンジダ アルビカンス菌による感染症には、浅在性カンジダ症と深在性カンジダ症とに大別される。 この内、浅在性カンジダ症においては、皮膚の灼熱感および掻痒感、鵞口瘡、口内炎、膣炎、子宮頚部炎等の臨床症状が現れ、一方で、深在性カンジダ症においては、咽頭炎、気管支炎、膀胱炎、敗血症、膿血症、網脈絡膜炎、心内膜炎、脳における微小膿瘍の形成等の臨床症状が現れる。 特に、悪性腫瘍、白血病、膠原病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の原疾患、それに、当該原疾患に対する治療のために生体の感染防衛機構が低下している状態の患者、あるいはカテーテル装着、手術等により局所的感染防御能が低下している患者に対して、その病原性をよく発揮し、敗血症等の重篤な症状へ進展する可能性が高い。
【０００４】
また、敗血症、膿血症および心内膜炎等に移行すると、予後は極めて悪いことが明らかとなっている。 敗血症の状態がさらに進行すると、ショックや、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）などを合併し、多臓器障害を引き起こして、死に至る場合がよくある。
【０００５】
浅在性カンジダ症は、診断・治療が比較的容易であり、少数の難治例を除いて抗真菌薬の投与により通常は短期間に治癒する。 しかし、深在性カンジダ症は、現在市販されている診断キットの感度および再現性が完全ではなく、また、カンジダ アルビカンス菌に対する特異性が低いなど、改善すべき点が多いのが実情である。 カンジダ アルビカンス菌が原因となる敗血症は重篤な感染症であり、正確な診断に導かれた早期の抗菌薬治療の有無が、患者の予後を左右するといえる。 従って、当該技術分野の従事者、特に、臨床医からは、カンジダ アルビカンス菌に関する迅速で確実な検査方法の確立が切望されていた。
【０００６】
現在、浅在性カンジダ症起因菌の同定および検出方法として、生標本の直接検鏡法や真菌培養・グラム染色法などが、一般的に用いられている。 しかし、カンジダ アルビカンス菌は常在菌であるので、これら検出方法は、感染症原因菌の可能性を示唆できても、感染症原因菌の特定には至らない。 また、これら検出方法によれば、検査結果が得られるまでに、通常、４８時間〜７２時間もの時間を要するため、その迅速性に問題があった。 さらに、培養方法や培養条件によっては、コンタミネーションを引き起こしてしまい、検査結果の信頼性を損なう場合もある。
【０００７】
深在性カンジダ症起因菌の同定および検出方法としては、血清診断法を利用する方法が一般的である。 例えば、▲１▼ カンジダ属真菌に特徴的な代謝産物であるＤ−アラビニトールを測定する方法［商品名：アラビニテック・オート、極東製薬工業（Ｓｏｙａｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １４９， ｐｐ．１４９−１５４ （１９８５）、Ｓｏｙａｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｊｐｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｙｃｏｌ．， ２７， ｐｐ．１６５−１６９ （１９８６））］、▲２▼ 真菌全般に共通して存在する抗原である（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法［商品名：ファンギテックＧテスト、生化学工業（Ｏｂａｙａｓｈｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．； Ｌａｎｃｅｔ， ３４５， ８９４１， ｐｐ．１７−２０ （１９９５））、商品名：β−グルカンテストワコー、和光純薬工業（Ｍｏｒｉ， Ｔ ｅｔ ａｌ．； Ｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３５， ｐｐ．５５３−５６０ （１９９７））］、および▲３▼ 真菌細胞壁成分のマンナン多糖体を抗原とする抗体をラテックス粒子と結合させるラテックス凝集法［Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｐ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８， ｐｐ．２３２０−２３２６ （１９９０）、Ｍｉｔｓｕｔａｋｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４， ｐｐ．１９１８−１９２１ （１９９６）］などの方法が挙げられる。 その他に、真菌に対する遺伝子診断法として、▲４▼ ＰＣＲ法を利用した方法も開発されてきている（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４０， ｐｐ．３５８−３６４ （１９９４））。
【０００８】
方法▲１▼は、カンジダ属に対しては有効であるが、カンジダ アルビカンス菌に特異的ではない。 また、抗菌剤の投与などによりカンジダ属真菌の増殖が抑えられると、Ｄ−アラビニトールの血清中濃度が低下することから、検査前に抗菌剤を投与されてしまうと正確に判定できないおそれがある。 加えて、方法▲１▼での正診率は、他の方法に比較して低いという難点がある。 方法▲２▼では、真菌の正診率は高いが、カンジダ属真菌に対する特異性は低く、カンジダ属真菌あるいはカンジダ アルビカンス菌が特定できないという問題がある。 方法▲３▼では、宿主の体内に侵入しないコロニゼーションでも陽性になることがある。 また、真菌細胞壁成分を標的としているため、カンジダ属真菌に対する特異性は低く、カンジダ属真菌あるいはカンジダ アルビカンス菌が特定できないという問題がある。
【０００９】
方法▲４▼では、培養法や血清診断法と比較して、感度・特異性は高い方であるが、検査の迅速性は血清診断よりも劣っている。 また、真菌の属または菌種を特異的に検出するＰＣＲ法では、第１次のＰＣＲでの産物の属または菌種に特異的な配列に基づいた第２次のＰＣＲを行う方法も提案されている。 しかし、単一の検体に対してＰＣＲを２回行うことは、操作が煩雑になるために、臨床上利用しにくいという問題がある。 このように、カンジダ アルビカンス菌が関与する感染症にあっては、迅速・確実な診断が求められているにもかかわらず、従来の診断方法では、十分対応できていなかったのが実情である。
【００１０】
従って、感染症原因菌の確定と、それに即した抗生物質の選択が従前より必要とされていたにもかかわらず、臨床的にカンジダ アルビカンス菌による感染症の可能性が疑われた投階で、検出結果が出るのを待たずに治療に踏み込んでいるのが、大方の臨床現場での実情である。 すなわち、起因菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に対して有効な抗生物質をまず投与し、１〜２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
【００１１】
このような諸問題を解決するために、本出願人は、貪食細胞に貪食された外来微生物の検出および／または同定のための方法を発明した（特公平７−４０号）。
【００１２】
すなわち、この方法によれば、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子は、これら遺伝子に対して特異的にハイブリダイゼーション可能なプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出される。 具体的には、この方法は、生体由来の臨床検体より取得した食細胞を固定し、これら食細胞に対して細胞膜の透過性を亢進させるための処理を施し、食細胞内に取り込まれた感染症原因菌のＤＮＡを露出し、ストリンジェントな条件下で感染症原因菌のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および、ハイブリダイズシグナルの出現の有無によって感染症原因菌を検出および／または同定する、との一連の工程を含む。
【００１３】
敗血症が疑われた患者の血液を、この方法に従って検査したところ、血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出し、さらに２４時間以内に判定を終えることができたことから、この方法は感染症分野において脚光を浴びている。
【００１４】
また、本出願人は、カンジダ アルビカンス菌が保有するＤＮＡと特異的に反応するプローブも発明している（日本国特許第２５５８４２０号）。 それらプローブは、カンジダ アルビカンス菌の存在を的確に検出し、なおかつ検出精度も高い。
【００１５】
そのため、患者に投与する抗生物質を選択する上での、貴重な判断材料を提供する可能性が注目されている。
【００１６】
このように、本願発明は、カンジダ アルビカンス菌の検出感度および／またはカンジダ アルビカンス菌に対する特異性がさらに改善された新規プローブ、特に、ハイブリダイゼーション用プローブの提供に加え、これらプローブを利用することで、従前の検出方法よりも検出効率ならびに検出感度に優れた検出方法や検出手段の実現をも、その目的としている。
【００１７】
【課題を解決するための手投】
本発明は、従来技術で認識されていた上掲の様々な不都合に鑑みて発明されたものであって、その要旨とするところは、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌に対して特異的な交差反応を示し、かつ（ａ） 配列番号：１乃至３のいずれかに記載の塩基配列；（ｂ） 塩基配列（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列；または、（ｃ） 塩基配列（ａ）および／または塩基配列（ｂ）に対して相補的な塩基配列を含む、カンジダ アルビカンス菌の検出用プローブにある。
【００１８】
また、本発明によれば、前述した検出用プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出方法も提供される。 この検出方法は、（ａ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｂ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｃ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｄ） ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとの間でｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および（ｅ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出する工程を含む。
【００１９】
さらに、本発明の他の態様によれば、感染症原因菌の検出方法が提供される。
【００２０】
この検出方法は、（１） 感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（２） 本発明の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、（３）得られた染色体ＤＮＡと当該プライマーとの共存系でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって当該ＤＮＡを増幅し、および（４） 増幅されたＤＮＡを検出する工程を含む。
【００２１】
そして、本発明のさらに他の態様によれば、食細胞に貪食された外来微生物の遺伝子を観察する方法が提供される。 この観察方法は、（ｉ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、（ｉｉ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、（ｉｉｉ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、（ｉｖ） ストリンジェントな条件下で、得られた染色体ＤＮＡと本発明の検出用プローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、（ｖ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返して実施し、および（ｖｉｉ） ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする工程を含む。
【００２２】
加えて、本発明のさらに他の態様によれば、本発明の検出用プローブ、食細胞含有検体調製器具、支持担体、細胞膜用化学処理剤、ＤＮＡ露出処理剤、ハイブリダイゼーション用具およびハイブリダイゼーションシグナル検出器具を含むカンジダ アルビカンス菌の検出キットが提供される。
【００２３】
そして、本発明のさらに別の態様によれば、チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなる本発明の検出用プローブまたはその断片とを具備したＤＮＡチップが提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を詳細に説明する。
【００２５】
定 義
まず、本明細書で使用する「臨床検体」の語は、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体を総称するものであり、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。 また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液などの他に、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の組織洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも臨床検体の範疇に包含される。 加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。 これはすなわち、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、固定マクロファージ、遊離マクロファージ、ハンゼマンマクロファージ、炎症性マクロファージ、肝クッパー細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含有する組織までもが本発明の臨床検体として用いることができることによる。 例えば、腎炎が疑われる患者から、腎生検に従って腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることによって細胞を剥離してこの組織内に存在する食細胞を取得し、得られた食細胞を用いることで、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。
【００２６】
次に、本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物を含めた異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞を指すものであって、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。 また、Ｕ９３７細胞、ＨＬ６０細胞などの食細胞系も、本発明において好適に使用することができる。
【００２７】
食細胞（白血球）画分は、公知の方法によって臨床検体から取得することができる。 例えば、約５ｍｌのヘパリン加静脈血（白血球数の少ない場合は１０ｍｌ）を採取し、この血液と血液分離試薬［塩化ナトリウム２２５ｍｇとデキストラン（分子量 ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを含み、滅菌精製水にて全量を２５ｍｌに調製したもの］とを４：１程度の割合で混和した後、約１０℃〜約４０℃で、約１５分〜約１２０分間、好ましくは、約３７℃で、約３０分間静置することによって、白血球画分（上層）を取得することができる。
【００２８】
食細胞の固定
このようにして得た白血球画分を、約０℃〜約２０℃にて、約１００×ｇ〜約５００×ｇで、約３分〜約６０分間、好ましくは、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。
【００２９】
遠心分離の際に赤血球が混入してしまった場合には、溶血操作を行うのが好ましい。 例えば、白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁した後、直ちに、過剰量のＰＢＳ［塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇおよびリン酸二水素ナトリウム二水和物１．１２３ｇを含み、かつ滅菌精製水で全量を１２０ｍｌに調製したもの（以下、単に『ＰＢＳ原液』と称する）を、滅菌精製水で２０倍に希釈して得たもの］（以下、単に『ＰＢＳ』と称する）を加えて等張化した後、再度、約４℃の温度下にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、約１０分間遠心分離する。
【００３０】
あるいは、このような遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本質的に有する接着能力を利用して、以下のようにして、スライドグラスに接着させることもできる。 白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。 具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球のペレットを載置し、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た液）に２０分間程度浸した後、約５０％〜約９０％、好ましくは、約７５％のエタノール液に約５分間浸して、完全に風乾する。
【００３１】
このような支持担体としては、不溶性素材から形成されたものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、アガロースなど）が好適に使用できる。 不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができる。
【００３２】
特に、本発明の実施態様において好ましい支持担体として、スライドグラスがある。 このようなスライドグラスとして、例えば、スライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ：日本エアーブラウン社製）がある。 このＭＳ３１１ＢＬスライドグラスは、その表面に、直径５ｍｍの円形ウェルを１４個有している。
【００３３】
また、実際の適用を考慮すれば、支持担体への細胞の接着性を改善する目的で、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）を、その表面にコートしてなるＡＰＳコートスライドグラスが好ましい。 その他に、ポリ−Ｌ−リジンやゼラチンをコートしてなるスライドグラスも好適に使用できる。 これらＡＰＳコートスライドグラスの作製手順は、まず、スライドホルダーにスライドグラスを固定する。 固定したスライドグラスを、希釈した中性洗剤に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に除去し、精製水で洗浄した後に、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させ、その後、室温で放置冷却する。 次いで、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。 さらに再度、スライドグラスを１〜１０％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾を行った後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約４２℃で乾燥させることで、ＡＰＳコートスライドグラスが得られる。
【００３４】
ＡＰＳコートスライドグラス表面に白血球を支持させる場合、各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹して、風乾するのが好ましい。 固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）は、約５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜約１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、約１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦約５×１０７個／ｍｌに調整する。 また、これに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、約２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜約５×１０５個／ウェル、好ましくは、約５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦約２．５×１０５個／ウェルに調整する。
【００３５】
具体的には、白血球画分を、約４℃にて、約１４０×ｇ〜約１８０×ｇで、１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【００３６】
そして、約５×１０４個／ウェル〜約２．５×１０５個／ウェルの細胞数となるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾させることによって、白血球がその表面に固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスが調製される。
【００３７】
細胞膜の透過性亢進処理
食細胞の細胞膜の透過性を亢進させるための処理を行う。 この処理方法として、白血球が固定支持されたＡＰＳコートスライドグラスを、ＰＢＳに約３〜約３０分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％） ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を、滅菌精製水で約２〜約５０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約３〜約３０分間振とうする方法を用いることができる。
【００３８】
内在細菌ＤＮＡの取得
次に、食細胞内に存在する感染症原因菌のＤＮＡを得る。 具体的には、まず、スライドグラス１枚につき酵素試薬（ザイモラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リゾチームおよび／またはリゾスタフィン；以下、単に『酵素試薬』と称する）に対して、酵素試薬溶解液（フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を、ＰＢＳで１００倍希釈したもの］を１ｍｌ加えて酵素試液を調製した。 その後、約２０℃〜約６０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、この酵素試薬１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下して、約１０〜約６０分間静置して、感染症原因菌のＤＮＡを露出する。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌの塩酸を含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水で２０倍希釈して、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で約３〜約３０分間振とうする。 ＤＭＳＯは、５％以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフィンの活性を低下させる可能性があるため、５％未満の濃度で使用するのが好ましい。
【００３９】
食細胞の形態を保持させる物質であるＰＭＳＦ以外に、他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびそれらの混合物などを用いることもできる。 そのような場合は、ＤＭＳＯなどの溶解剤を適宜変更すればよい。
【００４０】
酵素試薬として用いられる各酵素の力価範囲は、次の通りである。 リゾスタフィンの力価範囲は、約１単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌである。 また、Ｎ−アセチルムラミダーゼの力価範囲は、約１０単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約１，０００単位／ｍｌである。そして、リゾチームの力価範囲は、約１，０００単位／ｍｌ〜約１，０００，０００単位／ｍｌ、好ましくは、約１０，０００単位／ｍｌ〜約１００，０００単位／ｍｌである。 なお、原因菌がカンジダ アルビカンス菌等の真菌である場合には、ザイモラーゼを使用することが重要で、その力価範囲は、約５０〜約５００単位／ｍｌ、好ましくは、約１００単位／ｍｌ〜約５００単位／ｍｌであり、また、ザイモラーゼを使用する場合、ＰＭＳＦまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を併用するのが特に好ましい。 さらに、ザイモラーゼを使用するときは、ザイモラーゼ単独または上記の他の酵素を混合して使用しても良い。
【００４１】
また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の菌体成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、使用酵素を適宜選択することができる。 特に、グラム陽性菌とグラム陰性菌の種別にかかわらず、より効果的に菌体を溶菌させるために、２種類以上の酵素を使用することもできる。 リゾチーム、リゾスタフィン、およびＮ−アセチルムラミダーゼの３種類の酵素を混合した酵素試薬を使用することによって、１種類の酵素に依った場合と比較して溶菌活性が高まる。
【００４２】
酵素試薬の至適酵素処理温度は、約２６℃〜約５９℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃に設定する。 また、酵素試薬の酵素処理時間は、少なくとも約１５分以上、好ましくは、約１５分〜約１２０分、あるいは、少なくとも約２０分以上、好ましくは、約３０分〜約６０分とする。
【００４３】
Ｎ−アセチルムラミダーゼに関しては、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の熱処理乾燥粉末ならびにＮ−アセチルムラミダーゼと共に、２ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムを含む５ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ６．０）中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍでの吸光度が下がる現象が認められる。 また、ストレプトコッカス サリヴァリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：ＩＦＯ ３３５０）の熱処理細胞を、３７℃、ｐＨ ７．０の条件下で、１分間に１μｇを溶菌する酵素活性を１単位とした場合、２，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すＮ−アセチルムラミダーゼを使用することが望ましい。
【００４４】
リゾチームに関しては、ミクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）とリゾチームと共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。
【００４５】
また、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓを、３５℃、ｐＨ ６．２の条件下で、１分間に５４０ｎｍの吸光度を０．００１下げる時の酵素活性を１単位とした場合、５０，０００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾチームを使用することが望ましい。
【００４６】
リゾスタフィンに関しては、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とリゾスタフィンが共に、ＰＢＳ中にて、３７℃で、５分間反応させた場合、６００ｎｍの吸光度が下がる現象が認められる。 また、スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を、３７℃、ｐＨ ７．５の条件下で、１０分間で、６２０ｎｍの吸光度を０．２４０から０．１２５に下げる酵素活性を１単位とした場合、５００単位／ｍｇ以上の活性を示すリゾスタフィンを使用することが望ましい。
【００４７】
ザイモラーゼ（商品名：ザイモリエイス、生化学工業）は、アルスロバクタールテサル（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｓｕ１）の培養液から調製された酵素で、酵母生細胞の細胞壁に対する溶解活性が大きい。 ザイモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関与する必須酵素は、β−１，３−グルカン・ラミナリペンタオヒドロラーゼ（β−１，３−ｇｌｕｃａｎ ｌａｍｉｎａｒｉｐｅｎｔａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であり、これは、β−１，３−結合のグルコースポリマーに作用して、主生成物としてラミナリペンタオースを生成する。 ザイモリエイス−１００Ｔは、硫安分画に精製され、さらにアフィニティークロマトグラフィーにより精製された酵素であって（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６０， ｐ．２５７ （１９８２））、１００，０００単位／ｇの活性を有している。 しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２０， ｐ．３２３ （１９７４）；Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４５， ｐ．１７６１ （１９８１）； Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４６， ｐ．５５３ （１９８２））。 ザイモリエイス−１００Ｔは、β−１，３−グルカナーゼを約１．０×１０７単位／ｇ、プロテアーゼを約１．７×１０４単位／ｇ、そして、マンナーゼを約６．０×１０４単位／ｇを含み、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは認められない（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １８， ｐ．５７ （１９７２））。 また、ザイモリエイスの至適ｐＨは約５．５〜約８．５であり、約６．５〜約７．５のｐＨが特に至適性に優れており、至適温度は約２５〜約５５℃であり、約３５〜約４５℃の温度が特に望ましい。
【００４８】
さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スペクトラム（属名）として、Ａｓｈｂｙａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋｌｏｅｋｅｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｋｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓなどがある。 特に、カンジダ属には、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ パラシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ ガラクタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌａｃｔａ）、カンジダ ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）等がある。
【００４９】
これらの属に属する菌も、本発明の適用対象に加えることができる。
【００５０】
ザイモラーゼの賦活剤として、ＳＨ化合物、例えば、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどを用いることができる。 ザイモラーゼは、ビール酵母懸濁液を基質として、約２５℃の温度下で、約２時間置いた反応液（ザイモラーゼ：０．０５〜０．１ｍｇ／溶液ｍｌの１ｍｌ、基質：ビール酵母懸濁液（２ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）３ｍｌ、緩衝液：Ｍ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）５ｍｌを含み、滅菌精製水１ｍｌで全量を１０ｍｌに調製したもの）でのＡ８００を３０％減少するに必要な酵素活性を１単位とする。 なお、ザイモリエイス−１００Ｔは、約１００，０００単位／ｇの活性を有している。
【００５１】
酵素試薬溶解液として用いられる（プロテアーゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加される）ＰＭＳＦは、約１０μｍｏｌ／ｌ 以上の濃度で効果が認められ、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ 以上の濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約１０μｍｏｌ／ｌ〜約１０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜約１ｍｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。 また、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の濃度としては、約５％未満の濃度で使用でき、約２％以下の濃度が好ましく、約１％程度の濃度が最も好ましい。 従って、酵素試薬溶解液としては、０．１ｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ含有ＤＭＳＯを、ＰＢＳで約１００〜約１，０００倍希釈して調製したものが好ましい。
【００５２】
感染症原因菌のＤＮＡを得た後に、細胞膜タンパク質のアセチル化工程を加えてもよい。 具体的には、アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約２〜約５０倍に希釈し、好ましくは、約１０倍に希釈して、無水酢酸の終濃度を約０．１〜約３．０％、好ましくは、約０．８％に調製したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。 その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５３】
また、アセチル化工程の後に、感染症原因菌のＤＮＡをアルカリ処理する工程を挿入することができる。 これにより、感染症原因菌のＤＮＡは、一本鎖のＤＮＡになる。 具体的には、スライドグラスを、約１０ｍｍｏｌ／ｌ 〜約３００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で約２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ に調製したもの）に約２〜約５分間浸して、アルカリ処理を行う。 その後、スライドグラスを、７５％、８５％、９８％のエタノールに順に、それぞれ約２〜約５分間ずつ浸して、完全に風乾させる。
【００５４】
Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ストリンジェントな条件下にて、感染症原因菌のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な検出用ＤＮＡプローブを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う。
【００５５】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するにあたって、まず、プローブ希釈液を用いて調製した検出用ＤＮＡプローブ含有液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約２５℃〜約５０℃、好ましくは、約３７℃〜約４２℃の湿潤箱内で、約１〜約３時間、好ましくは、約２時間静置させる。 その後、ハイブリダイゼーション洗浄液［ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇとクエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇとを含み、滅菌精製水にて全量を７５ｍｌに調整したもの、以下、単に、『ハイブリダイゼーション原液』と称する）を、ハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの］を３つの染色ビンに用意し、それぞれを順に、約３５〜約４５℃、好ましくは、約４２℃で、約１０分間ずつ浸す。 その後、ＰＢＳに浸したままで、振とう機上で、約５〜約３０分間振とうさせる。 詳細には、プローブ希釈液は、サケ精子ＤＮＡ ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、前出のハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌを含んでいる。 プローブ液には、１５ｎｇの各検出用ＤＮＡプローブを含有せしめるのが好ましく、プローブ希釈液にて全量を５０μｌとするのが望ましい。
【００５６】
ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ（各プローブの調製方法については、日本国特許第２７９８４９９号を参照されたい）の濃度については、約０．０６ｎｇ／μｌの濃度では検出が不調（以下、「不適」と称する）であり、また、約０．６ｎｇ／μｌの濃度では検出可能（以下、「適」と称する）であったことから、少なくとも約０．１ｎｇ／μｌ以上の濃度に調整すべきである。 さらに、約２．４ｎｇ／μｌおよび約３．０ｎｇ／μｌの濃度では「不適」であり、また、約１．８ｎｇ／μｌの濃度では「適」であったため、約２．２ｎｇ／μｌ以下の濃度に調整すべきである。 従って、好ましいプローブ濃度は、約０．１〜約２．２ｎｇ／μｌ、好ましくは、約０．６〜約１．２ｎｇ／μｌとする。 特に、本発明のカンジダ アルビカンスに対するプローブについて２．０ｎｇ／μｌのプローブ濃度で試験したところ、「適」であることを証明している。 また、陽性コントロールおよび陰性コントロールの至適濃度は、それぞれ約０．４〜約２．０ｎｇ／μｌおよび約０．６〜約２．０ｎｇ／μｌとし、好ましくは、両者共に約０．６〜約１．０ｎｇ／μｌの濃度とするのが良い。
【００５７】
また、ハイブリダイゼーションの試験時間は、少なくとも約３０分以上、好ましくは、約６０分以上、より好ましくは、約９０分以上とする。 最も好ましくは、ハイブリダイゼーション時間を、約１２０分〜約９００分に設定すべきである。
【００５８】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実施において、検出感度を高める観点からして、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の使用が好ましい。 ＳＤＳの好ましい濃度は、約１％以下、より好ましくは、約０．１％〜約０．７５％、さらに好ましくは約０．２５％〜約０．５％である。 ＳＤＳは、ハイブリダイゼーションの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合して用いてもよい。
【００５９】
また、検出用プローブとしては、約２００〜約６００塩基長、好ましくは、約２００〜約５００塩基長、最も好ましくは、約２００〜約３００塩基長の長さを有する１種以上の核酸断片とするのが好ましい。 これはすなわち、食細胞内へのプローブの導入を円滑にし、かつ取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されることによる。 ところで、対象となるプローブの塩基長は、必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意味するものではなく、プローブ塩基長の分布に上記範囲の塩基長が含まれていればよい。 これらプローブは、１種で用いても数種（１種以上）で用いても良い。 １種以上のプローブとは、一菌種に対してハイブリダイズできる複数種のプローブであってもよく、また、一菌種に対してプローブは１つであるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていてもよく、プローブの種類が１種以上であれば特に制限されない。
【００６０】
なお、プローブは、食細胞自体との交差反応性に乏しい（ハイブリダイズしない）配列を有するＤＮＡ断片を含むものとすることが好ましく、プローブの起源種と異なる他の菌種に由来する遺伝子とハイブリダイズするものであってはならない。
【００６１】
例えば、サブトラクション法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。 これらプローブは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰ）等の非放射性同位体標識用物質を用いて、定法のニックトランスレーション法に従って、調製およびラベルすることができる。 プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加するＤＮａｓｅＩとＤＮＡポリメラーゼＩの量比を変化させることによって、最も効率よく標識付け可能なように制御できる。
【００６２】
一例として、本願発明のプローブＣＡ−５０（配列番号：１）の２μｇを効率よくラベル化し、また、外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ可能なプローブ鎖長（２００〜３００）にするためには、全量１００μｌの反応液中に、１０Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼＩの２μｌに対し、全量１００μｌの反応液中に約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵに調製されたＤＮａｓｅＩを６μｌ存在するように調製する。 この場合、各酵素の容量および反応液全量などは、上記した至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更してもよい。 換言すれば、全量１００μｌでの２０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩの濃度を、約１０〜約３５０ｍＵ、好ましくは、約２５〜約２００ｍＵ、より好ましくは、約５０〜約１５０ｍＵの濃度に調整する。 さらに換言すれば、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩに対して、約０．５／１０００〜約１７．５／１０００、好ましくは、約１．２５／１０００〜約１０／１０００、より好ましくは、約２．５／１０００〜約７．５／１０００単位のＤＮａｓｅＩを用いてニックトランスレーション反応を行うのが望ましい。 また、１μｇのＤＮＡに関して着眼すれば、１０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩに対して、ＤＮａｓｅＩを約５〜約１７５ｍＵ、好ましくは、約１２．５〜約１００ｍＵ、より好ましくは、約２５〜約７５ｍＵにすればよい。 他のプローブに関しては、上記した至適反応条件を参考にして、ＤＮＡ量、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮａｓｅＩに関する至適反応条件を決定することができる。 加えて、効率よくラベル化でき、しかも外来微生物ＤＮＡと効率よくｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションできるプローブ鎖長（約２００〜約３００塩基長）に調節することもできる。
【００６３】
ところで、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する際に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ホルムアミド約３０％〜約６０％、好ましくは、約５０％の存在下、約３０〜約５０℃、好ましくは、約３８〜約４２℃でインキュベートし、その後、洗浄を行う条件である。
【００６４】
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの工程を加えることもできる。 具体的には、湿潤箱内でスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、かつ滅菌精製水にて全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、約１５〜約６０分間静置する。 その後、ブロッキング試薬を除去する。
【００６５】
ハイブリダイズシグナルの検出
菌由来の遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリダイズした結果に生じるシグナルを検出するために、定法の抗原−抗体反応等を利用した呈色反応を行う。
【００６６】
すなわち、ハイブリダイゼーションを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング処理を行い、次いで、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、その後、接合物の発色系にてシグナルを発色して、ハイブリダイゼーションの状況を確認する。 例えば、プローブとして、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたプローブを用いた場合、抗ジゴキシゲニン−アルカリホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファターゼに対する基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート等）を利用して検出すればよい。
【００６７】
呈色反応の後に洗浄して得た塗沫標本は、ナフトールブラック、Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ（２０ｍｇ／５０ｍｌ、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡（蛍光顕微鏡）によって検鏡すると細胞内シグナルが観察される。
【００６８】
詳細には、ハイブリダイゼーションによるシグナルを得るには、例えば、検出用ＤＮＡプローブとしてジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ滅菌精製水適量にて全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび塩酸適量を含み、かつ適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で約１０〜約２００倍、好ましくは、約５０倍に希釈した標識抗体液を調製し、これを塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、約１５〜約６０分間静置する。 その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、かつ滅菌精製水にて全量を１００ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に浸し、そのままの状態で、振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。 この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、かつ滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのままの状態で振とう機上で約５〜約３０分間振とうする。その後、スライドグラス１枚につき発色試薬（ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ））１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジでろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱中で約１０℃〜約４５℃、好ましくは、約３７℃で、約１５〜約６０分間遮光静置する。 その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を５０ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に約２〜約１０分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を約５０ｍｌに調製したもの）を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液、それに約０．１〜約５％、好ましくは、約１％の酢酸溶液に浸す。 その後、前出の発色試薬洗浄液を約２〜約５０倍、好ましくは、約１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾する。 また、発色試薬は、個別に調製した試薬でもよい。
【００６９】
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンに、ジゴキシゲニンをラベルしたＤＮＡを１ｎｇブロットし、ブロッキング後、１０，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を反応させると、ＤＮＡのブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンがラベルされていないＤＮＡで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが望ましい。 また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒツジ由来のものが好ましい。 詳細には、免疫処置したヒツジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィーを経て精製したものが好ましい。
【００７０】
発色試薬（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液、ｐＨ ９．０〜１０．０）としては、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＢＴ）３．３ｍｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）１．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇ、および塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、かつ適量の滅菌精製水にて全量を約１０ｍｌに調製したものが好ましい。 この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッティング用メンブレンにブロットし、発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れる試薬が好ましい。
【００７１】
このような対比染色を行う場合、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色４号（タートラジン）を使用することができる。 その理由として、基質によって紫色を呈色し、また、ナフトールブラックにより青色を呈色するなど、発現した色が互いに類似していると、明確な対比染色が行いにくいことが挙げられる。 後述するように、これまでに試されなかった食用色素を用いたところ、対比染色時の色相の差異が明確になり、実用的であることが判明した。
【００７２】
ところで、ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレーション法を用いることができる。 また、ジゴキシゲニンを標識化するその他の方法として、ＰＣＲ法、ランダムプライマーラベリング法、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスクリプションラベリング法、ターミナルトランスフェラーゼラベリング法なども使用可能である。
【００７３】
交差反応の有無の判定は、光学顕微鏡（蛍光顕微鏡）で鏡検（×１，０００）した際に、単一ウェルにおいて、対比染色液によって染色された細胞において、青紫色の発色が１つでも認められた場合に陽性と判定する。
【００７４】
また、検出用プローブの調製方法は、日本国特許第２９６５５４４号を参照することで明らかになろう。
【００７５】
さらに、本発明のプローブ（プローブＣＡ−５０、配列番号：１）を、例えば、ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、ワーキングセルバンク（ＣＡ−５０）を、白金耳または使い捨てプラスチックループ等で釣菌して、これを滅菌シャーレ内に置いた５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロス固形培地に画線塗抹する。 一晩培養した後、シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬ−ブロス培地５ｍｌに植菌して、３７℃で終夜振とう培養する［前培養］。 次いで、前出の固形培地４００ｍｌが入った培養用フラスコに、前培養液を２．５ｍｌずつ植菌して、約３７℃で終夜振とう培養する［本培養］。
【００７６】
そして、プローブＣＡ−５０のプラスミドＤＮＡを抽出すべく、本培養した培養液を約４℃にて、約４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。 培養上清を除去し、ＳＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ エチレンジアミン−四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム）を２０ｍｌ加えて菌体を再懸濁し、約４℃にて、４，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌する。 １０ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液−１（５０ｍｍｏｌ／ｌ グルコース、２５ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、菌体を懸濁して、室温で５分間放置する。 溶液−２（０．２ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））１０ｍｌを加え、転倒混和して、氷上で１０分間放置する。 氷冷した溶液−３（３ｍｏｌ／ｌ 酢酸カリウム（ｐＨ ４．８））７．５ｍｌを加え、転倒混和して氷上で１０分間放置する。 高速冷却遠心機を用いて、約４℃にて、約４５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。 その後、０．６容量（約２４ｍｌ）のイソプロパノールを加え、転倒混和して、室温で１５分以上放置する。 高速冷却遠心機を用いて、約２５℃にて、約２８，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨て、７０％エタノールでペレットを洗浄し風乾する。 風乾した後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）を８ｍｌ加えて、溶解する［プラスミドＤＮＡの抽出］。
【００７７】
次に、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの精製を行う。 得られたプラスミドＤＮＡに、１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド８００μｌおよび塩化セシウム８．６ｇを加え、転倒混和して溶解させる。 その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。 垂直型ローターにより、約２０℃にて、約５００，０００×ｇで約５時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用して、プラスミドＤＮＡのバンドを分取する。 分取したプラスミドＤＮＡ溶液に、等量のＴＥ飽和 ｌ−ブタノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機を用いて、約１５，０００×ｇで、５分間遠心分離し、上清を取り除く。 この操作を繰り返し、プラスミドＤＮＡ溶液中のエチジウムブラマイドを取り除く。 次に、ＴＥを加えて１．５ｍｌの体積とし、脱塩カラム（ＮＡＰ−１０）で脱塩する。 脱塩したプラスミドＤＮＡ溶液に、３ｍｏｌ／ｌ 酢酸ナトリウム溶液を３０μｌ加えて混和した後、３倍量の９９．５％エタノールを加えて転倒混和し、−約２０℃で、３０分以上放置する。 その後、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除いた後、冷７０％エタノールを加えて懸濁する。 そして、再度、微量冷却高速遠心機を用いて、４℃にて、１５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を除き、プラスミドＤＮＡの沈渣を減圧下で乾固させる。 プラスミドＤＮＡに１００μｌのＴＥを加えて完全に溶解させ、２６０ｎｍの吸光度で濃度を測定する［プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの精製］。 その後、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理、およびアガロース電気泳動によるプローブＣＡ−５０のサイズチェックを行う。
【００７８】
次いで、プローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡの制限酵素処理およびアガロース電気泳動によるプローブＣＡ−５０の精製を行う。 そのために、分子量確認が終了したプローブＣＡ−５０含有プラスミドＤＮＡ１ｍｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、３７℃で、１．５時間以上の時間をかけて反応を進行せしめて消化する。
【００７９】
プラスミドＤＮＡを消化した後、反応液の一部を０．８％アガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。 消化を確認した後、分取用の０．８％アガロースゲルで電気泳動し、プローブＣＡ−５０のバンドを採取する。 採取したプローブＣＡ−５０をアガロースゲルから抽出および精製して、吸光度計にてその濃度を測定する。
【００８０】
精製したプローブＣＡ−５０の一部を、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。
【００８１】
次に、プローブＣＡ−５０のラベル化を行うために、以下の表１に記載の組成を有する反応液において、精製したプローブＣＡ−５０の２μｇに対してジゴキシゲニンの標識付けを行う。
【００８２】
【表１】
表１において、「Ｘ」とは、プローブ原液の濃度に応じて好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量を指し、この容量に伴い精製水量Ｙを決定して最終容量を調整する。
【００８４】
標識付けした後、反応液にＴＥを１００μｌ 加えて反応を停止させる。 反応停止液をスピンカラムに注入し、約４℃にて、約３８０×ｇで約１０分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。 次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、ＴＥで約１０ｎｇ／μｌ に調製する。
【００８５】
標識付けを確認するために、標識付けしたプローブＣＡ−５０の０．５μｌをメンブレンに滴下して、風乾する。 ブロッキング試薬にこのメンブレンを浸し、室温で３０分間ブロッキングする。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）と０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムで５，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、そのメンブレンを室温で３０分間浸す。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で約１０分間振とうして、２回洗浄する。 ０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ９．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムに、室温下で、メンブレンを約１０分間浸す。
【００８６】
室温および遮光下で、発色試薬にメンブレンを、約１０分間浸す。 メンブレンをＴＥに浸し、発色を停止させる。 スポット下部分の青紫色の発色で、標識付の確認を行う。
【００８７】
１ｍｌのディスポーザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填してスピンカラムを作製する。 １ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳで膨潤させたセファデックスＧ−５０をシリンジに充填する。 １５ｍｌのディスポーザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、約４℃にて、約３２０×ｇで約１０分間遠心分離し、過剰の緩衝液を落とす。 ディスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れる。
【００８８】
ドットブロットハイブリダイゼーション
プローブの特異性を確認するために、以下の手順に従って、ドットブロットハイブリダイゼーションを行う。
【００８９】
まず、スポットした各ゲノムＤＮＡを変性するために、定法に従い０．５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製３ＭＭ）上に、調製した各種細菌ゲノム１００ｎｇ をナイロンメンブレン（ポールバイオダインタイプＢ、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを１０分間静置する。 次に、０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１．５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で飽和した前出の濾紙上に１０分間静置して変性ＤＮＡを中和する。 さらに２×ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）溶液で飽和した前記濾紙上に５分間静置し、洗浄する。
【００９０】
そして、メンブレンを風乾し、２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間浸透する。 定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイブリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、４２℃で、６０分間親和させる。 プラスチックバッグ内でプローブ４００ｎｇを含むハイブリタイゼーション溶液の１５ｍｌにメンブレンを浸し、４２℃で、一晩反応させる。 次に、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する（この工程を２回繰り返す）。 その後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液にメンブレンを浸し、６０℃で、１０分間洗浄する（この工程を３回繰り返す）。 ２×ＳＳＣ溶液にメンブレンを浸し、５分間洗浄する。 メンブレンを３％ウシ血清アルブミン、１％ブロッキングバッファー（ベーリンガー社製）、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウムを含む溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。
【００９１】
次いで、アルカリフォスフアターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー社製）を、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）および０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液で５，０００倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、３０分間緩慢に振とうする。 次に、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、１５分間振とうする（この工程を２回繰り返す）。 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ９．５）、０．１ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムを含む溶液にメンブレンを浸し、５分間振とうする。 ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。 ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。 プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液の組成を、以下の表２に示す。
【００９２】
【表２】
前述したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。
【００９４】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。
【００９５】
アニオン界面活性剤とは、陰イオン界面活性剤とも称されるものであって、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。 界面活性剤の分子中の親油基をＲとして表現すると、ＲＣＯＯＮａ、ＲＳＯ３Ｎａ、ＲＳＯ４Ｎａの式で表される。 ＲＣＯＯＮａのように弱酸性基を含有するものでは、その水溶液は加水分解しやすく弱アルカリ性を呈するが、ＲＳＯ３Ｎａ， ＲＳＯ４Ｎａなどの強酸性基を有するものでは、その水溶液は、加水分解を受けにくく、中性を呈する。 陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。
【００９６】
非イオン性界面活性剤とは、親水基が非イオン性のものをいう。 親水基として酸化エチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）が多用され、この官能基の数が多くなるに従って、親水性が増す。 反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。
【００９７】
従って、親水性・親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。 非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。 しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ないため、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などの様々な用途で使用される。 水溶性の非イオン性界面活性剤は、温度が上昇すると、ある時点で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。
【００９８】
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤とも称され、これは、水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。 カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのアニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。 また、繊維やプラスチックでの帯電防止能もある。 代表的なカチオン界面活性剤であるドデシルトリメチルクロリド［Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ３）３Ｎ］Ｃｌは水溶性であるが、一方で、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド［（Ｃ１２Ｈ２５）２（ＣＨ３）２Ｎ］Ｃｌは水に溶解しにくく、水中では２分子膜状のベシクルを形成し、これはベンゼンには溶解する。
【００９９】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。 水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。 従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側にある場合にはアニオン界面活性剤として、酸性側にある場合にはカチオン界面活性剤として作用する。 等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。 両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などの用途に用いられている。
【０１００】
また、アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分類され、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型およびアルカノールアミド型に分類される。 カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモニウム塩型に分類され、両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型およびグリシン型に分類される。
【０１０１】
さらに、アニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、Ｎ−アシルサルコシン塩およびＮ−アシルグルタミン酸塩に細分される。 それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩として、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用石鹸が、Ｎ−アシルサルコシン塩として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、それに、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸二ナトリウムなどがある。 また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物およびＮ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩に細分される。 その代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩として、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、また、アルカンスルホン酸塩としてドデカンスルホン酸ナトリウム、また、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩として直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが、そして、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、また、アルキルナフタレンスルホン酸塩として、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、それに、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリン塩としてはＮ−メチル−Ｎ−ステアロイルタウリンナトリウムなどがある。 また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。 その代表例として、アルキル硫酸塩として、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）およびセチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミンなどがある。 また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸塩に細分される。 その代表例として、アルキルリン酸塩として、モノラウリルリン酸二ナトリウムがある。
【０１０２】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンオレイルエーテル（８ＭＯＬ）がある。
【０１０３】
非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。 それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンとして、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンとしてはモノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。 また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。 その代表例として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルエーテルなどがあり、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとして、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがある。 また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。 それそれの代表例として、脂肪酸ポリエチレングリコールには、オレイン酸ポリエチレングリコールが、また、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどがある。 また、アルカノールアミド型は、脂肪酸アルカノールアミドだけであり、ラウリン酸ジエタノールアミドがその代表例である。
【０１０４】
カチオン界面活性剤のアルキルアミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩およびトリアルキルアミン塩があり、モノステアリルアミン塩酸塩がその代表例である。 また、第四級アンモニウム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウム、および塩化アルキルベンザルコニウムに細分される。それぞれの代表例として、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニウムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニウムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムが、また、塩化アルキルベンザルコニウムとして、塩化ラウリルベンザルコニウムがある。
【０１０５】
両性界面活性剤のカルボキシベタイン型には、アルキルベタインしかなく、ラウリルベタインが、その代表例である。 また、２−アルキルイミダゾリンの誘導型としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインだけであり、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインが、その代表例として挙げられる。 また、グリシン型として、アルキル（またはジアルキル）ジエチレントリアミノ酢酸があり、その代表例として、ジオクチルジエチレントリアミノ酢酸がある。
【０１０６】
さらに、上掲のものに加えて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ラウリルサルコシン、サポニン、ＢＲＩＪ３５、アルキルアリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクワラン、ステアリルアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セタノール、セトマクロゴール１０００、セバシン酸ジエチル、ノニルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニウム、ポリオキシエチレンオレイルアミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル３５ヒマシ油、マクロゴール４００、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシルＬ−アルギニンエチル・ＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウロマクロゴール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド、ノニデットＰ４０、ｎ−オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート等も利用することができる。
【０１０７】
上掲の各種界面活性剤は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程において使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。 例えば、プローブ液またはプローブ希釈液中に混合されていてもよいし、プローブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加してもよいし、当業者は適宜変更することができる。
【０１０８】
なお、本発明において、必要に応じて、陽性コントロールフローブを調製することもできる。 例えば、まず、Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３．２）のゲノムＤＮＡの抽出と精製を行うために、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ１６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内でＵ９３７細胞を培養する。
【０１０９】
Ｕ９３７培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃にて、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収する。 細胞を１０ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃にて、１８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞を回収する。 その後、上清を廃棄して、細胞を１ｍｌの２００μｇ／ｍｌプロテネースＫ含有１％ＳＤＳ含有ＴＥ溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置する。 フェノール抽出を３〜４回繰り返し、除蛋白を行う。 エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌの２．５μｇリボヌクレアーゼ含有滅菌精製水に溶解し、４２℃で３０分間放置する。 フェノール抽出を２〜３回繰り返し、除蛋白を行う。 エタノール沈殿によって析出したゲノムを回収し、５００μｌのＴＥに溶解する。 その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コントロールプローブを作製することができる。
また、陽性コントロールプローブは、Ｕ９３７ゲノムを１００ｎｇスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼーションした時に、ハイブリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。
【０１１０】
同様に、必要に応じて、陰性コントロールプローブを公知の方法で調製することもできる。
【０１１１】
その他の実施態様
本発明の検出方法を利用したカンジダ アルビカンス菌の検出および／または同定用キットも、本発明によって提供される。 本発明のキットによれば、ＤＮＡを得る工程で使用される酵素（ＤＮＡ露出処理剤）が、少なくとも、ザイモラーゼを含み、その他にも、リゾスタフィン、リゾチームおよびＮ−アセチルムラミダーゼからなるグループから選択される１種以上の酵素を具備していてもよく、また、界面活性剤が添加されたプローブ液、それに、１種以上の検出用ＤＮＡプローブを具備している。 本発明のキットには、以下の実施例に例示するような、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液−１、発色前処理液−２、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、ＡＰＳコートスライドグラス、プローブ希釈液、バッファーＡ等を利用することが可能である。 これらの内、少なくとも、酵素試薬とプローブ液とを含むことが好ましい。 また、クロロホルム、エタノール、無水酢酸、ＤＭＳＯ、ＰＭＳＦ、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等の各種試薬を用いることも可能である。 さらに、低速遠心機、恒温器、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、０．２μｍシリンジトップフィルターなどの器具を装備していてもよい。
【０１１２】
本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
【０１１３】
また、本発明によれば、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌を特定する方法も提供される。 この方法によれば、様々な敗血症が疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約４倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになっている。 そして、血液培養では、検査に少なくとも３日以上、通常は１４日程度を要するのに比較して、本発明の方法によれば全操作完了までに約８時間という極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができる。 従って、本発明の方法によれば、敗血症または菌血症などの、速やかに、かつ的確な対処が必要とされる感染症の診断や予後診断のモニター等において非常に有用なマーカーが提供されるのである。
【０１１４】
また、本発明のプローブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅によって、感染症原因菌の同定も可能となるのである。
【０１１５】
さらに、本願発明のプローブまたはその断片をＤＮＡチップに組み込んで利用できることも明らかである。 そうすれば、ＤＮＡチップを用いて、カンジダ アルビカンス菌の存在の確定が可能となる。
【０１１６】
加えて、本発明で開示した塩基配列は、カンジダ アルビカンス菌のゲノミックＤＮＡをランダムにクローニングして得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。 さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部分が存在することは当然考えられるが、一般的に、本発明のプローブと７０％程度、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のホモロジーを有する塩基配列は、本発明の目的を達成することができると考えられるので、本発明にはこれら相同配列も当然に包含されるものである。
【０１１７】
臨床検体からのカンジダ アルビカンス菌の一般的な検出手順の事例を、以下に詳述する。
［実施手順例］
（１） 採血および血液検体の処理
臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液検体を用いる。 各患者からヘパリン加静脈血１０ｍｌを採取し、採取した血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（分子量：２００，０００〜３００，０００）１．５ｇ、滅菌精製水にて全量２５ｍｌに調製したもの）を４：１の割合で混和した後、３７℃で３０分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得する。 このようにして得た白血球画分を４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離することによって、白血球を得る。
次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水１ｍｌを加えて懸濁し、直ちに過剰量のＰＢＳ（塩化ナトリウム１８．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水和物６．０１２ｇ、リン酸二水素ナトリウム２水和物１．１２３ｇ、滅菌精製水にて全量１２０ｍｌにしたもの（ＰＢＳ原液）を滅菌精製水にて２０倍に希釈したもの）を加えて等張化した後、再度４℃下で、１６０×ｇで１０分間遠心分離を行う。
【０１１８】
（２） 白血球の固定
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、ＳＩＧＭＡ社）をスライドグラス（商品番号ＭＳ３１１ＢＬ、日本エアーブラウン社製）にコートしてなるＡＰＳコートスライドグラスを使用する。
【０１１９】
ＡＰＳコートスライドグラスの作製に当たって、まず、スライドホルダーにスライドグラス（ＭＳ３１１ＢＬ）を固定した後、希釈した中性洗剤中に３０分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（１００℃以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却する。 その後、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾する。 さらに再度、スライドグラスを２％ＡＰＳ含有アセトンに１分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄する。 その後、風乾のための操作を行った後に、４２℃で乾燥させることで、ＡＰＳコートスライドグラスを作製する。
【０１２０】
白血球画分を、４℃にて１６０×ｇで１０分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量のＰＢＳを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。
【０１２１】
細胞数が１×１０５個／ウェルとなるようにＰＢＳで調製した白血球懸濁液５μｌを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球をＡＰＳコートスライドグラスに支持させる。
【０１２２】
その後、カルノア固定液（エタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１で混合して得た固定液）に２０分間浸した後、７５％エタノール液に５分間浸し、完全に風乾させる。
【０１２３】
（３） 白血球細胞膜の透過性亢進処理
ＰＢＳに１０分間浸した後、酵素前処理試薬（サポニン１．２５ｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃）、ｐＨ（５ｗ／ｖ％） ５．５〜７．５）１．２５ｍｌ、ＰＢＳ原液２５ｍｌを混合し、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を滅菌精製水で１０倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で１０分間振とうさせる。
【０１２４】
（４） 菌体壁の溶菌酵素処理
スライドグラス１枚につき酵素試薬（ザイモラーゼ２００単位／ｍｌ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ１，０００単位／ｍｌ、リゾチーム１００，０００単位／ｍｌおよび／またはリゾスタフィン１００単位／ｍｌ）に酵素試薬溶解液（ＰＢＳで０．１ｍｏｌ／ｌ フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１００倍希釈して調製したもの）を１ｍｌ加えて酵素試液を調製する。 その後、感染症原因菌のＤＮＡを得るために、３７℃〜４２℃の湿潤箱中で、この酵素試液１ｍｌを白血球塗抹部位に滴下し、３０分間静置することによって、感染症原因菌のＤＮＡを露出させる。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌ 塩酸含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて２０倍希釈し、塩酸の終濃度を０．２ｍｏｌ／ｌに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２５】
（５） 細胞膜タンパク質のアセチル化
アセチル化試薬（トリエタノールアミン７．４６ｇと適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で１０倍希釈し、無水酢酸の終濃度を０．８％に調整したアセチレーション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で１０分間振とうする。 その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２６】
（６） 菌体 ＤＮＡ のアルカリ処理［二本鎖 ＤＮＡ から一本鎖 ＤＮＡ への変性］
スライドグラスを、７０ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（ＰＢＳ原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で２０倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を７０ｍｍｏｌ／ｌ に調製したもの）に３分間浸す。 その後、７５％、８５％、９８％エタノールに、順次３分間ずつ浸し、完全に風乾させる。
【０１２７】
（７） ハイブリダイゼーション
プローブ希釈液（０．５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ６００μｌ、１００×デンハート溶液５０μｌ、ハイブリダイゼーション原液５００μｌ、ホルムアミド２２５０μｌ、５０％硫酸デキストラン１０００μｌが含まれる）にて調製したジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ１５ｎｇを含有する液（プローブ液、１．０ｎｇ／μｌ）を塗抹部位に塗布し、３７℃〜４２℃の湿潤箱内に２時間静置させる。 ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーション法で調製する。 その後、ハイブリダイゼーション洗浄液（ハイブリダイゼーション原液（塩化ナトリウム１３．１５ｇ、クエン酸三ナトリウム２水和物６．６１５ｇ、滅菌精製水にて全量７５ｍｌに調製したもの、前出）をハイブリダイゼーション原液：滅菌精製水：ホルムアミド＝５：４５：５０の割合で混合して調製したもの）を３つの染色ビンに用意し、順次、４２℃で１０分間ずつ浸す。 その後、ＰＢＳに浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１２８】
ジゴキシゲニンを標識付けしたＤＮＡプローブは、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９のプローブ配列を用いて、ニックトランスレーション法により調製する。
【０１２９】
（８） ブロッキング
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、ブロッキングの操作を行う。
【０１３０】
具体的には、湿潤箱内にてスライドグラス１枚につきブロッキング試薬（ウサギ正常血清２ｍｌとＰＢＳ原液０．５ｍｌを含み、滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの）１ｍｌを塗抹部位に滴下し、これを３０分間静置する。 その後、ブロッキング試薬を除去する。
【０１３１】
（９） 標識抗体との反応
標識抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液１．０５単位、バッファーＡ（トリエタノールアミン７４６ｍｇ、塩化ナトリウム１７．５ｍｇ、塩化マグネシウム６水和物２０．３ｍｇ、塩化亜鉛１．３６ｍｇ、ウシ血清アルブミン１０００ｍｇおよび塩酸適量を含み、滅菌精製水適量で全量を１００ｍｌに調製したもの）１２．６μｌにて全量を１４μｌに調製したもの）を、標識抗体希釈液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン８．４８ｍｇ、塩化ナトリウム６．１４ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を０．７ｍｌに調製したもの）で５０倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に１０μｌずつ滴下し、これを３０分間静置する。 その後、標識抗体洗浄液（１ｍｌのポリソルベート２０と５０ｍｌのＰＢＳ原液を含み、滅菌精製水で全量を１００ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうさせた。 この操作を２回繰り返した後、発色前処理液１（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６．０６ｇ、塩化ナトリウム２．９２ｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）と発色前処理液２（塩化マグネシウム６水和物５．０８ｇを含み、滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で５倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で１０分間振とうする。
【０１３２】
（１０） シグナル検出
スライドグラス１枚につき発色試薬［ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト（ＢＣＩＰ）溶液、ｐＨ ９．０〜１０．０：ＮＢＴ ３．３ｍｇ、ＢＣＩＰ １．６５ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９９μｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１ｍｇ、適量の塩酸、塩化ナトリウム５８．４ｍｇおよび塩化マグネシウム６水和物１０１．６ｍｇを含み、適量の滅菌精製水で全量を１０ｍｌに調製したもの］１ｍｌを、０．２μｍシリンジトップフィルターを装着したディスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、３７℃で、３０分間遮光静置する。 その後、発色試薬洗浄液（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン６０６ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム２水和物１８６ｍｇおよび適量の塩酸を含み、適量の滅菌精製水で全量を５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液に５分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーンＦＣＦ（食用緑色３号）５０ｍｇ、滅菌精製水にて全量５０ｍｌに調製したもの）を１０倍に希釈した溶液および１％酢酸溶液に浸す。 その後、前記発色試薬洗浄液を１０倍に希釈した溶液に再度浸して余分の対比染色液を洗い流し、完全に風乾させる。
【０１３３】
（１１） 判 定
判定は、光学顕微鏡で鏡検（×１，０００）した場合に、単一のウェル内の対比染色液により染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが１つでも認められた場合に「陽性」と判定する。
【０１３４】
【実施例】
本発明を、実施例に沿って以下に詳細かつ具体的に説明するが、これら実施例の開示に基づいて、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【０１３５】
実施例１：カンジダ アルビカンス （Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ） 菌検出用プローブ
（１） カンジダ アルビカンス菌特異的サブトラクトライブラリーの作製
カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌由来ＤＮＡプローブの選別は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。 Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ １４０５３）およびカンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ６６０２９）ゲノムＤＮＡ ２μｇをキットに添付されていた制限酵素ＲｓａＩで完全消化し、エタノール沈澱により精製し、６．５μｌの滅菌蒸留水
に溶解した。 ＲｓａＩ消化したＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡ １．２μｌを滅菌蒸留
水１．８μｌで希釈し、このＤＮＡ試料にキットに添付されていた２種類のアダプターをライゲートした。 反応液組成は、反応液１［ＤＮＡ試料１μｌ、ＤＮＡライゲーションバッファー（キットに添付のもの）２μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（キットに添付のもの）１μｌ、滅菌蒸留水４μｌ、アダプター１（キットに添付のもの）２μｌ］、反応液２［ＤＮＡ試料１μｌ、ＤＮＡライゲーションバッファー２μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ、滅菌蒸留水４μｌ、アダプター２Ｒ（キットに添付のもの）２μｌ］であり、１６℃で一晩反応した。 次に、反応液１および反応液２にＲｓａＩ消化したカンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡを加えて、１回目のハイブリダ
イゼーションを行った。 反応液組成は、ハイブリダイゼーション液１［反応液１を１μｌ、ＲｓａＩ消化カンジダ トロピカルスゲノムＤＮＡ２μｌ、ハイブリダ
イゼーションバッファー（キットに添付のもの）１μｌ］、ハイブリダイゼーション液２［反応液２を１μｌ、ＲｓａＩ消化カンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡ２
μｌ、ハイブリダイゼーションバッファー１μｌ］であり、ミネラルオイルを重層し、９８℃で１．５分間熱変性した後、６３℃で１．５時間保温した。 ハイブリダイゼーション液２を直前に熱変性したＲｓａＩで消化したカンジダ トロピカリスゲ
ノムＤＮＡ（ＲｓａＩで消化したカンジダ トロピカリスゲノムＤＮＡ１μｌにバイブ
リダイゼーションバッファー１μｌを加え、９８℃で１．５分間熱変性した）と混合し、さらにハイブリダイゼーション液２に加えた。 この混合液を６３℃で一晩保温し、２回目のハイブリダイゼーションを行った。 一晩保温後、Ｄｉｌｕｔｉｏｎバッファー２００μＬを加え、６３℃で７分間保温した。 このハイブリダイゼーション混合液を添付のＰＣＲプライマー１（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；配列番号：４）を用いて１回目のＰＣＲを行った。 反応組成は、ハイブリダイゼーション混合液１μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー２．５μｌ、ｄＮＴＰ混合液２μｌ、ＰＣＲプライマー１を１μｌ、滅菌蒸留水１８μｌ、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．５μｌ（以上、Ｔａｋａｒａ社製）であり、ＰＣＲは、９４℃で２５秒間の熱変性、６６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１．５分間の伸長反応からなるサイクルを３０サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、７２℃で２分間の伸長反応、９４℃で２５秒間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。
【０１３６】
第１回目のＰＣＲ後、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを実施した。 滅菌蒸留水で４０倍に希釈した第１回目のＰＣＲによる産物１μｌを鋳型とし、プライマーとして、キットに添付されていたＮｅｓｔｅｄ プライマー１（５’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’；配列番号：５）およびＮｅｓｔｅｄ プライマー２Ｒ（５’−ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴ−３’；配列番号：６）を用いて、第１回目のＰＣＲと同様の反応組成で行った。 ＰＣＲは、９４℃で１０秒間の熱変性、６８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、９４℃で２５秒間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。 以上のＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒＰＥＲＳＯＮＡＬ（Ｔａｋａｒａ社製）により行った。 得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認した後、バンドをゲルより切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した。 精製したＤＮＡ断片は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだ。 組み換えたベクターは、コンピテントセルＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社製）に形質転換し、カンジダ アルビカンス菌特異的サブトラクトライブラリーとした。
【０１３７】
（２） カンジダ アルビカンス菌特異的クローンの選抜
得られたライブラリーからカンジダ アルビカンス菌に特異的なクローンを選抜するために、以下の方法によって、各種真菌ＤＮＡとの反応性を検討した。 形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。 得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いてラベルした。 反応組成は、プラスミドＤＮＡ ５０ｎｇ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー５μｌ、ＰＣＲ Ｄｉｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）５μｌ、Ｎｅｓｔｅｄプライマー１を１μｌ、Ｎｅｓｔｅｄプライマー２を１μｌ、滅菌蒸留水１７μｌ、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．５μｌであり、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長反応からなるサイクルを３５サイクル行い、また繰り返し反応を行う前に、９６℃で１分間の熱変性工程を含むプログラムを実施した。 得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドをゲルより切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて精製し、ＤＮＡプローブとした。
【０１３８】
各種真菌ゲノムＤＮＡ ５０ｎｇをＰＡＬＬ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂメンブレン（ＰＡＬＬ社製）にスポットし、風乾した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌで１０分間アルカリ変性し、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌで１０分間中和して風乾したものを、ドットブロットハイブリダイゼーションの試料とした。 メンブレンをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）で、６８℃で、１時間インキュベートした後、１０ｎｇ／ｍｌ ＤＮＡプローブを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液で、６０℃で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。 終夜ハイブリダイゼーション後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間２回洗浄し、６０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる １５分間の洗浄を２回行った。 バッファー２［１％ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で３０分間インキュベートした後、抗ジゴケシゲニン抗体希釈液［抗ジゴケシゲニン抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス社製をバッファー２で５０００倍希釈したもの）］で３０分間インキュベートした。 バッファー１［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で１５分間２回洗浄し、バッファー３［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２］で平衡化した。 ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）でインキュベートし発色させた後、ＴＥバッファーで反応を停止した。
【０１３９】
その結果、カンジダ アルビカンス菌に特異的に反応するクローンを選抜し、これらをプローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９と命名した。
【０１４０】
（３） 塩基配列の決定
プローブＣＡ−５０（配列番号：１）、ＣＡ−５１（配列番号：２）、ＣＡ−６９（配列番号：３）の塩基配列の決定は、以下のように実施した。
【０１４１】
すなわち、ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ社製）で解析し、塩基配列を決定した。 シークエンシング反応液組成は、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇ、プレミックス８μｌ、プライマー３μｌを滅菌蒸留水で２０μｌとしたものであり、９５℃で２０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で１分間を３０サイクル行った。 プライマーは、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｙｃｌｅプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’；配列番号：７）、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’；配列番号：８）および合成プライマーを用いた。
【０１４２】
実施例２：各プローブの特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１４３】
まず、検討対象菌株として、下記表３に列挙した臨床分離株および寄託菌株を準備（全６４種類）した。 表３に示した各種細菌および真菌ゲノムＤＮＡ５０ｎｇをメンブレンにスポットし、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法により各プローブの特異性の検討を行った。 具体的には、各臨床菌株または寄託菌株に関して、実施例１に記載の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡの一定量（例えば、約１０〜約１００ｎｇ）をナイロンフィルターにスポットして、アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料とした。 次いで、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＢＲＬ社製）でラベルしたプローブで、マニアティスのマニュアル（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９））に従い、４５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃の条件下で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。 終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料に関して、同マニュアルに従い、５５℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる２０分間の洗浄を２回行った後に、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇ−ＡＬＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＲＬ社製）で検出および発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認した。 表３に示した結果から明らかなように、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９のいずれもが、カンジダ アルビカンス菌のゲノムＤＮＡに対してのみ特異的に反応することが確認された。
【０１４４】
【表３Ａ】
【表３Ｂ】
同様に、表３に示した結果から、いずれのプローブもカンジダ アルビカンス菌に由来するＤＮＡに対してのみ反応性を示し、他の菌種由来のＤＮＡに対して反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その特異性が確認された。
【０１４７】
実施例３：各プローブの種特異性の検討
実施例１で選抜した各プローブとカンジダ属およびその他真菌のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【０１４８】
まず、検討対象菌株として、下記表４に列挙した臨床分離株および寄託菌株を準備（全１７種類）した。 表４に示したカンジダ属およびその他真菌ゲノムＤＮＡ ５０ｎｇをメンブレンにスポットし、実施例２に示した方法により各プローブの特異性の検討を行った。 その結果、表４に示す様に、ＣＡ−５０、ＣＡ−５１、ＣＡ−６９のいずれもが、カンジダ アルビカンス菌のゲノムＤＮＡにのみ特異的に反応することが確認された。
【０１４９】
【表４】
表４に示した結果から明らかなように、いずれのプローブもカンジダ アルビカンス菌に由来するＤＮＡに対してのみ反応性を示し、カンジダ属の他の菌種由来のＤＮＡに対して反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その種特異性が確認された。
【０１５１】
実施例４：塗抹固定する至適白血球数（貪食細胞数）の検討
ＡＰＳコートスライドグラスのウェル（直径５ｍｍの円形ウェル）に塗抹する至適白血球数の検討を行った。
【０１５２】
ヘパリン加健常ヒト血液１０ｍｌを採取し、前出の実施手順例（１）の記載に従って白血球を採取した。 次に、得られた白血球を、適量のＰＢＳを用いて懸濁した後、血球計算盤を用いて１ｍｌ当たりの白血球数を測定し、（ａ）１×１０８個／ｍｌを始点として、（ｂ）５×１０７個／ｍｌ、（ｃ）１×１０７個／ｍｌ、（ｄ）５×１０６個／ｍｌ、（ｅ）１×１０６個／ｍｌ、（ｆ）５×１０５個／ｍｌ、および（ｇ）１×１０５個／ｍｌの希釈系列を調製した後、各々５μｌをスライドグラスに塗抹した。 風乾した後、カルノア固定（実施手順例（２）参照）を行い、直ちに対比染色液で染色し、実施手順例（１１）に記載した方法を用いて判定を行った。
【０１５３】
その結果、細胞数が１×１０８個／ｍｌでは細胞数が過剰であり、検出不適であった。 また、５×１０６個／ｍｌ以下では、ウェルに観察される細胞数が少なく、検出不適であった。 よって、固定化する食細胞の密度（ｘ個／ｍｌ）が、５×１０６個／ｍｌ＜ｘ個／ｍｌ＜１×１０８個／ｍｌ、好ましくは、１×１０７個／ｍｌ≦ｘ個／ｍｌ≦５×１０７個／ｍｌに調製したものを使用するのが好ましいことが判明した。 また、これに対応して、ＡＰＳコートスライドグラスに固定される１ウェル当たりの白血球の細胞数（ｙ個／ウェル（直径５ｍｍ））は、２．５×１０４個／ウェル＜ｙ個／ウェル＜５×１０５個／ウェル、好ましくは５×１０４個／ウェル≦ｙ個／ウェル≦２．５×１０５個／ウェルとなるように調製するのがよいことも判明した。
【０１５４】
実施例５：溶菌酵素ザイモラーゼの至適力価の検討
カンジダ アルビカンス菌を溶菌して、そのＤＮＡを得るためのザイモラーゼの至適力価を検討した。
【０１５５】
カンジダ アルビカンス菌をＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で一昼夜培養した。 その後、基質としてカンジダ アルビカンス菌をＰＢＳにて懸濁した溶液（基質１）と、カルノア固定した後に、７０％エタノールに浸し、風乾し、ＰＢＳにて懸濁した溶液（基質２）の２種類を調製した。
【０１５６】
反応は、ザイモラーゼ／ＰＢＳを０．５ｍｌ、基質を１．５ｍｌ、そしてＭ／１５リン酸緩衝液を２．５ｍｌを含み、０．５ｍｌの滅菌精製水で全量を５．０ｍｌに調製したものを用いた。 その後、３７℃で、２時間反応させ、ＯＤ８００を測定した。 また、ザイモラーゼ（ザイモリエイス−１００Ｔ）濃度として、０ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌのものを用いた。
【０１５７】
その結果、基質１を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．５３３、０．５２１、０．５５３、０．５５４、０．５４８、０．４１７、０．３９４、０．２８８、０．１６３、０．１１３であり、基質２を用いた場合のそれぞれのＯＤ８００値は、０．４４５、０．４１１、０．３５９、０．２８２、０．２３２、０．１４６、０．１１５、０．０９６、０．０８、０．０５７であった。 基質１および基質２共に、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、特に、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲が有効であることが判明した。
【０１５８】
すなわち、ザイモラーゼの使用量は、５０単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌ、特に１００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌであることが好ましい。 また、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合には、真菌である場合も考慮してザイモラーゼを適宜添加するのが好ましい。
【０１５９】
実施例６：カンジダ アルビカンス菌の貪食サンプルからの検出
（１） 貪食サンプルの作製
（ｉ） Ｕ９３７細胞の調製
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で、ＲＰＭＩ １６４０培地（２５ｍｌ）を入れた細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ３）内でＵ９３７細胞（ヒト単球株化細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３．２）を培養した。 次に、Ｕ９３７細胞培養液を５０ｍｌの遠沈管に入れ、４℃、２２０×ｇで１０分間遠心分離し、Ｕ９３７細胞を回収した。 その後、回収したＵ９３７細胞を、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を約１×１０４個／μｌ〜約２×１０４個／μｌに調製した。
【０１６０】
（ｉｉ） 細菌貪食サンプルの調製
カンジダ アルビカンス菌を、５ｍｌのＹＰＤ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。
【０１６１】
上清を捨てた後、菌のペレットを５ｍｌのＰＢＳで懸濁し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 集菌した菌を５ｍｌのＰＢＳで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して、吸光度計により菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）を、０．０１６〜０．０２４にしたものを１５ｍｌ調製した。 こうして得られた菌液を、１７５ｃｍ３の培養用フラスコに移し、３０分間室温で静置した。
【０１６２】
ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍｌを採取し、血球分離試薬を４：１の割合で加え、３７℃で３０分間静置し、白血球画分を分取し、これをＰＢＳで５０ｍｌにした。 培養用フラスコ内の上清を静かに捨て、ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍｌずつフラスコに加え、室温で１０分間静置した。 培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ １０ｍｌで１５ｍｌの遠沈管に回収し、４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。 収集した白血球に赤血球の混入が認められたので、１ｍｌの滅菌精製水にて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳを１４ｍｌ加えて等張化し、再度４℃、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集した。 収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μｌ〜５×１０４個／μｌの密度に調製した。
【０１６３】
こうして得られた貪食サンプルを、ＣＡ貪食サンプルとした。
【０１６４】
当該貪食サンプルの利点は、▲１▼ カンジダ アルビカンス菌が検出される臨床検体の入手が困難であり、そのため本発明のプローブの特異性評価などの各種試験ができないという問題点を、臨床検体の代わりに人為的に作製した当該貪食サンプルを使用することにより回避できる、▲２▼ 本発明のプローブまたはキット等の特異性試験、感度試験、再現性試験などの性能試験に利用できる、そして、▲３▼貪食サンプルで得られた各種試験結果を、臨床検体に適用できる、ことなどが挙げられる。
【０１６５】
（ｉｉｉ） 塗抹固定
（ｉ）で得たＵ９３７細胞と、（ｉｉ）で調製した各細菌貪食サンプルを、ＡＰＳコートスライドグラスの各ウェルに５μｌずつ塗抹し、風乾させた。
【０１６６】
次に、実施例４（２）に記載のカルノア固定液にスライドグラスを２０分間浸した後、７５％エタノールに５分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで４℃で保存した（実施手順例（２）参照）。 次いで、固定サンプルの前処理を、実施手順例（３）に記載の手順に従って行った。
【０１６７】
（２） 貪食サンプルの規格及び試験方法
（ｉ） 細胞数
各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定すべき細胞数を、約５．０×１０４〜約２．５×１０５個／ウェルとし、また、Ｕ９３７細胞の細胞数を、約５．０×１０４〜約１．０×１０５個／ウェルとした。
【０１６８】
（ｉｉ） 貪食率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルをアクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（×１，０００）で無作為に約２００個の細胞を計測した。
【０１６９】
計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞を陽性細胞とし、以下の数式に従って貪食率を算出した。
【０１７０】
【数１】
この時に算出したＣＡ貪食サンプルの貪食率（％）は、１０％以上であった。
【０１７２】
（３） 試験方法
実施例７（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。
【０１７３】
使用したＣＡ貪食サンプルの貪食率は１６％であり、約１．３×１０５個／ウェルであった。 貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施手順例（２）〜（１１）に記載の方法に従って各プローブの特異性を検討した。 プローブＣＡ−５０の結果を図１に、プローブＣＡ−５１の結果を図２に、そして、プローブＣＡ−６９の結果を図３にそれぞれ示した。 また、プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９を混合した場合の特異性の結果を、図４に示した。
【０１７４】
（４） 結 果
プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９のいずれもが、貪食細胞中に取り込まれたカンジダ アルビカンス菌由来のＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが判明した。 また、混合プローブ（プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９の混在体）においては、単独プローブに比較して強いシグナルが得られることが判明した。 このことから、使用するプローブは複数種混合して使用するのが好ましいことが明らかとなった。
【０１７５】
貪食サンプルで得られた結果は、臨床検体にも適用できるので、本発明のプローブは、臨床検体においても有用であることが証明された。
【０１７６】
実施例７：真菌以外の菌種に対する溶菌酵素の選択
スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ １２６００）、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：ＡＴＣＣ １４９９０）、シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ＡＴＣＣ １０１４５）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ １９４３３）、エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＡＴＣＣ １１７７５）を溶菌するための酵素条件を検討した。
【０１７７】
スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスに対しては、溶菌酵素としてリゾスタフィン（Ｂｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３８， ２９３−３００，１９７３）を使用した。 また、エンテロコッカス フェカーリスに対しては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（Ａｒｃｈｓ． Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．， ２３， ５４３−５４９， １９７８）とリゾチーム（生化学工業）を使用した。 また、シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリについては、７０ｍｍｏｌ／ｌ の水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（前出）を使用した。
【０１７８】
上記各種細菌を、５ｍｌのＢＨＩ液体培地（ブレインハートインフュージョン液体培地（ＤＩＦＣＯ社製））に植菌し、３７℃で、８時間以上培養した。 培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 このようにして集めた菌をＰＢＳに懸濁し試料とした。 溶菌は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける菌液の濁度の減少により評価した。
【０１７９】
その結果、スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスは、リゾスタフィンによって溶菌した。 シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリについては、７０ｍｍｏｌ／ｌ の水酸化ナトリウム含有ＰＢＳ（前出）によって溶菌したため、酵素処理は不要であった。 また、エンテロコッカス フェカーリスについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ単独よりも、リゾチームと併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。 また、貪食作用を受けて取り込まれた菌が、例えば、シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキア コリなどである場合には、アルカリ処理に際して菌の細胞壁が溶解され、遺伝子が露出した状態となるので、必ずしもこの酵素処理を行う必要はない。 また、アルカリ処理は、実施手順例（６）に記載の手順に従って行うこともできる。 しかしながら、確実に菌の細胞壁を溶解するのであれば、酵素処理を行う方がよいと考えられる。
【０１８０】
本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処理用の各酵素は、前述したような細菌株に対して有効であるのみならず、他のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属を初めとする他の菌種等でも有効である。 また、かような酵素は、ザイモラーゼに加えて、各々単独で用いることもできる。 さらに、菌が特定できていない臨床検体を使用する場合、またはキットに酵素を付属させる場合には、酵素試薬を構成する酵素を複数混合するのが有効であり好ましい。
【０１８１】
なお、図５に、（ａ） スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディス、（ｂ） シュードモナス アエルギノーザおよびエシェリキアコリ、ならびに（ｃ） エンテロコッカス フェカーリスに関して実施した試験結果を示した。
【０１８２】
実施例８：酵素溶解液でのジメチルスルフォキシド （ＤＭＳＯ） の至適濃度の検討
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するＰＭＳＦの溶解剤である、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の酵素活性に及ぼす影響を検討した。
【０１８３】
エンテロコッカス フェカーリスを５０ｍｌのＢＨＩ液体培地（前出）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 この培養液を、４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌し、ＰＢＳにて懸濁した後、オートクレーブ（１２０℃、１０分）で熱処理を行った。 次に、４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌのＰＢＳで沈渣を懸濁させた後、凍結乾燥させた。 この凍結乾燥試料を、０〜１０％ＤＭＳＯ含有５ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ ６．０）、２ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウムで懸濁し、Ｎ−アセチルムラミダーゼに対する試料とした。 また、ミクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ：ＪＣＭ １４６４）を、５ｍｌのＢＨＩ液体培地（前出）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 培養した菌液を４℃で、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。 上清を捨て、菌のペレットを５ｍｌのＰＢＳで懸濁洗浄し、再度４℃にて、２，０００×ｇで、１０分間遠心分離して集菌した。
【０１８４】
このようにして集めた菌を、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾチームに対する試料とした。 一方、スタフィロコッカス エピデルミディスをリゾチームの場合と同様にして培養、集菌し、０〜１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳで懸濁し、リゾスタフィンに対する試料とした。
【０１８５】
酵素活性は、マイクロプレートリーダーを用い、吸光度６００ｎｍにおける試料の濁度の減少により評価した。 ただし、本試験でのそれぞれの酵素力価は、（ａ） Ｎ−アセチルムラミダーゼ ３００単位／ｍｌ、（ｂ） リゾチーム １０，０００単位／ｍｌ、（ｃ） リゾスタフィン５０単位／ｍｌとし、酵素活性に対するＤＭＳＯの影響を検討した。 それぞれの酵素活性を、単位時間当たりにおける菌濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００ｎｍ）の減少で評価した結果、ＤＭＳＯは、Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、リゾチームおよびリゾスタフィンに対しては、共に５％以上のＤＭＳＯで活性の低下が認められた。 また、２％以下のＤＭＳＯの濃度では、酵素活性の低下は認められなかった。 ゆえに、ＰＭＳＦを溶解させるＤＭＳＯ濃度は少なくとも５％未満、好ましくは２％以下、さらには１％程度とするのが好ましい。 また、上記設定した濃度においてはザイモラーゼの活性に何ら悪影響を与えなかったので、ザイモラーゼに対するＤＭＳＯの濃度も同一とした。
【０１８６】
その検討結果を、図６（ａ）〜（ｃ）および下記表５に示した。
【０１８７】
【表５】
実施例９：酵素溶解液でのフェニルメチルスルフォニル
フルオライド （ＰＭＳＦ） の至適濃度の検討
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、白血球の形態を劣化させるので、白血球の形態を保持させるために添加するフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ：ＰＩＥＲＣＥ社製）の効果を検討した。
【０１８９】
１００μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ：和光純薬社製）にＰＭＳＦを溶解し、ＰＭＳＦの終濃度が０（無添加）〜１ｍｍｏｌ／ｌ となるようにＰＢＳで１０ｍｌに希釈した。 この溶液に、プロテアーゼの力価が０．２単位／ｍｌとなるよう、プロテイネースＫ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加した。 ヘパリン加健常ヒト血液５ｍｌを採取し、実施手順例（１） に記載の方法に従って白血球を採取した。 次に、白血球を適当量のＰＢＳで懸濁して、血球計算盤で細胞数を計測し、細胞数を、約５×１０４〜約２．５×１０５個／ウェルに調製し、その５μｌをＡＰＳコートスライドグラスのウェルに塗抹し、風乾した後、実施手順例（２）に記載のカルノア固定法に従って固定した。
【０１９０】
このサンプルを用いて、実施手順例（３）および（４）に記載の方法に従って試験を行った。 １μｍｏｌ／ｌ 〜１ｍｍｏｌ／ｌ のＰＭＳＦの濃度で試験を実施した結果、１０μｍｏｌ／ｌ 以上の濃度で効果が認められ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ 以上のＰＭＳＦ濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。
【０１９１】
その結果を、プロテアーゼ０．２単位／ｍｌのみ（図７（ａ））、ＰＭＳＦ１μｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｂ））、ＰＭＳＦ １０μｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｃ））、ＰＭＳＦ ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｄ））、およびＰＭＳＦ １ｍｍｏｌ／ｍｌ添加（図７（ｅ））に、それぞれ示した。
【０１９２】
実施例 １０ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［力価］の検討
（１） 貪食サンプルの作製
（ｉ） Ｕ９３７細胞の調製
実施例６（１）（ｉ）に記載の方法により Ｕ９３７細胞を調製した。
【０１９３】
（ｉｉ） 細菌貪食サンプルの調製
スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＡＴＣＣ １２６００）、スタフィロコッカス エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：ＡＴＣＣ １４９９０）、シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ＡＴＣＣ １０１４５）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ：ＡＴＣＣ １９４３３）、エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＡＴＣＣ １１７７５）を、各々５ｍｌのＢＨＩ培養液に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。 その後、実施例６（１）（ｉｉ）に準じて、それぞれＳＡ貪食サンプル、ＳＥ貪食サンプル、ＰＡ貪食サンプル、ＥＦ貪食サンプル、ＥＫ貪食サンプルを作製した。
【０１９４】
（ｉｉｉ） 塗抹固定
実施例６（１）（ｉｉｉ）に準じて行った。
【０１９５】
（２） 貪食サンプルの規格及び試験方法
（ｉ） 細胞数
実施例６（２）（ｉ）と同様とした。
【０１９６】
（ｉｉ） 貪食率
実施例６（２）（ｉｉ）と同様にして算出した。 この時に得られた各細菌貪食サンプルの貪食率（％）は、１０％以上であった［図８で矢印にて示す、貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞］。
【０１９７】
（３） 試験方法
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。
【０１９８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２３％であり、約１．９８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２７％であり、約１．７４×１０５個／ウェルであった。
【０１９９】
また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、約６．４０×１０４個／ウェルであった。 各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施手順例４（３）に記載の方法に従って酵素前処理を行った。 次に、酵素前処理済みのスライドグラスを湿潤箱に置き、各種力価に調製した各酵素溶液１ｍｌを検体塗抹部位に滴下して反応させた。 その後、０．２ｍｏｌ／ｌ 塩酸含有ＰＢＳ、７０％エタノールにそれぞれ１０分間浸し、風乾させた。 このスライドグラスを７０ｍｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム含有ＰＢＳに３分間、７０％エタノールに１０分間浸した後に風乾し、１％アクリジンオレンジ染色液で染色した。 その後、蛍光顕微鏡（×１，０００）により評価した。
【０２００】
スタフィロコッカス アウレウスおよびスタフィロコッカス エピデルミディスは、リゾスタフィンで至適力価の検討を行った。 エンテロコッカス フェカーリスは、Ｎ−アセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討するため、Ｎ−アセチルムラミダーゼを１００単位／ｍｌに固定した場合のリゾチーム至適力価の検討と、リゾチームを１０，０００単位／ｍｌに固定した場合のＮ−アセチルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。 判定は、酵素処理することで菌体が白血球内で確認されなくなった事例について「適」とした。
【０２０１】
（４） 結 果
スタフィロコッカス アウレウスの溶菌においては、リゾスタフィンの力価は１単位／ｍｌで十分効果を示すが、スタフィロコッカス エピデルミディスの溶菌には、１０単位／ｍｌ以上のリゾスタフィン力価が必要であった（表６）。 従って、リゾスタフィンの至適力価を、１０単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌに設定した。
【０２０２】
【表６】
また、エンテロコッカス フェカーリスの溶菌においては、リゾチームの力価を１０，０００単位／ｍｌで固定したとき、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価が１０単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった（表７）。 リゾチームについては、Ｎ−アセチルムラミダーゼ力価を１００単位／ｍｌに固定した場合、リゾチーム力価が１，０００単位／ｍｌ以下では溶菌されなかった（表７）。 従って、Ｎ−アセチルムラミダーゼの至適力価は１００単位／ｍｌ〜１，０００単位／ｍｌ、リゾチームの至適力価は１０，０００単位／ｍｌ〜１００，０００単位／ｍｌに設定した。 また、シュードモナス アエルギノーザに対しても、同様の力価で使用することができる。
【０２０４】
【表７】
実施例１０（３）で「適」と判定した一例を、図９に示す。 図９において、（ａ） は酵素処理前のスタフィロコッカス アウレウスの貪食サンプル、（ｂ） は酵素処理前のエンテロコッカス フェカーリスの貪食サンプル、（ｃ） はサンプル（ａ）を酵素処理した後、そして、（ｄ）はサンプル（ｂ）を酵素処理した後の様子をそれぞれ示している。
【０２０６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各酵素の至適力価も同様とした。
【０２０７】
実施例 １１ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［温度］の検討
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて酵素試薬の至適温度を検討した。 ただし、本試験の酵素処理時間を３０分、検討温度は、４℃、２５℃、３７℃、４２℃、６０℃とし、各酵素力価は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ、生化学工業社製）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社製）とした。
【０２０８】
各酵素は、実施例７に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２０９】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２２％であり、約１．１２×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２９％であり、約１．６２×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２３％であり、約１．３８×１０５個／ウェルであった。
【０２１０】
判定は、実施例１０（３）に記載の方法に準じて行った。 その結果、スタフィロコッカス アウレウスは、４℃〜６０℃の温度範囲において、白血球の菌体は確認されなかった。 また、スタフィロコッカス エピデルミディスは、処理温度４℃および２５℃では白血球中の菌体が残存していたが、３７℃以上では菌体が確認されなかった。 そして、エンテロコッカス フェカーリスでは、処理温度４℃、２５℃および６０℃で菌体が残存していたが、３７℃および４２℃では菌体の残存が確認されなかった。
【０２１１】
これらのことから、至適酵素処理温度を３７℃〜４２℃に設定した。
【０２１２】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、ザイモラーゼの温度条件をこれと同一にしたところ、好ましい結果が得られたので、ザイモラーゼの至適温度もこれと同一に設定した。 その結果を、表８に示した。
【０２１３】
【表８】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適温度も同様とした。
【０２１５】
実施例 １２ ：溶菌酵素（酵素試薬）の至適酵素処理条件［時間］の検討
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体として、溶菌酵素の至適酵素処理時間を検討した。
【０２１６】
検討した時間は、０分、１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分とした。
【０２１７】
各酵素は、実施例７に記載の通り、対象となる菌に対応したものを使用した。
【０２１８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は１８％であり、約７．８０×１０４個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は３４％であり、約１．１０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、約１．３０×１０５個／ウェルであった。
【０２１９】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて検討した。 ただし、本試験の酵素処理温度は３７℃、各酵素力価はＮ−アセチルムラミダーゼ（１００単位／ｍｌ）、リゾチーム（１０，０００単位／ｍｌ）、リゾスタフィン（１０単位／ｍｌ）とした。
【０２２０】
判定は、実施例１０（３）に記載の方法に準じて行った。 その結果、スタフィロコッカス アウレウス、スタフィロコッカス エピデルミディス、エンテロコッカス フェカーリス貪食サンプルのいずれもが、酵素処理時間２０分以上（０分および１０分においては「不適」であった）で、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも１５分以上、好ましくは２０分以上、さらに至適酵素処理時間を３０分〜６０分とするのが好ましい、ことが明らかとなった。
【０２２１】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、ザイモラーゼの処理時間条件をこれと同一にしたところ、好ましい結果が得られたので、ザイモラーゼの至適時間もこれと同一に設定した。 その結果を、表９に示した。
【０２２２】
【表９】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同一の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。
【０２２４】
実施例 １３ ：プローブ濃度の検討
本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応において、プローブ濃度は、ハイブリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。 プローブ濃度が低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。 また、過剰量のプローブの使用は、非特異的反応を招きかねない。 それ故、各種プローブ液について、至適濃度を検討した。
【０２２５】
まず、実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とした。 使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、約１．４８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は２８％であり、約２．０７×１０５個／ウェルであった。 ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１８％であり、約１．５０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は２４％であり、約１．７２×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１２％であり、約１．６３×１０５個／ウェルであった。
【０２２６】
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例１０（３）に記載の方法に準じて検討した。 プローブとして、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、スタフィロコッカス アウレウス（ＳＡ−２４、ＳＡ−３６、ＳＡ−７７の混合物）、スタフィロコッカス エピデルミディス（ＳＥ−３、ＳＥ−２２、ＳＥ−３２の混合物）、エンテロコッカス フェカーリス（ＥＦ−１、ＥＦ−７、ＥＦ−２７の混合物）、シュードモナス アエルギノーザ（ＰＡ−２−３１、ＰＡ−１３−３の混合物）、エシェリキア コリ（ＥＣ−２４、ＥＴ−４９、ＫＩ−５０の混合物）に対する各プローブ濃度を、それぞれ０．０４ｎｇ／μｌ、０．４ｎｇ／μｌ、１．２ｎｇ／μｌ、１．８ｎｇ／μｌ、２．４ｎｇ／μｌ、３ｎｇ／μｌに調製した（日本国特許第２７９８４９９号参照）。
【０２２７】
貪食サンプルを塗抹したスライドグラス（図１０参照）に、上記の各種濃度に調製したプローブ液を使用し、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従って検討した。 ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を３種類混合して用いた。
【０２２８】
その結果、低濃度（０．０６ｎｇ／μｌ）ではシグナルが明確でなくなり、高濃度（２．４ｎｇ／μｌおよび３ｎｇ／μｌ）ではバックグラウンドの増大が認められた。 また、０．０６ｎｇ／μｌにおいては「不適」であり、０．６ｎｇ／μｌにおいては「適」であったことから、少なくとも０．１ｎｇ／μｌ以上とするのが好ましい。 さらに、２．４ｎｇ／μｌでは「不適」であり、１．８ｎｇ／μｌでは「適」であったことから、２．２ｎｇ／μｌ以下の濃度とすることが、好ましいことが明らかとなった。 それ故、ＳＡ、ＳＥ、ＰＡ、ＥＦ、ＥＫのプローブ濃度を、０．１〜２．２ｎｇ／μｌ、好ましくは０．６〜１．２ｎｇ／μｌとした。
【０２２９】
なお、実施例６に記載の方法に準じてＣＡ貪食サンプルを作製し、本発明のカンジダ アルビカンスに対するプローブについて２．０ｎｇ／μｌのプローブ濃度で試験したところ、「適」であることを証明している。
【０２３０】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 このことから、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各プローブの至適濃度も同様とした。
【０２３１】
実施例 １４ ：ハイブリダイゼーション温度の検討
ハイブリダイゼーション反応における反応温度は、ハイブリッド形成速度とハイブリッドの安定性に影響を与えるパラメーターである。 ハイブリダイゼーション反応を高温下で行うと、細胞の形態が劣化することが知られていることから、至適温度の検討（４℃、２５℃、３７℃、４２℃、５０℃、６０℃）を行った。
【０２３２】
まず、実施例１０（１）および（２）に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。 使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は３１％であり、約１．３８×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４２％であり、約１．９５×１０５個／ウェルであった。 ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１５％であり、約１．３０×１０５個／ウェルであった。また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４８％であり、約１．０５×１０５個／ウェルであった。ＥＫ貪食サンプルの貪食率は１７％であり、約１．８５×１０５個／ウェルであった。 貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（図１１を参照）を使用して、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従い検討した。 ただし、使用したプローブは、対象となる菌に対応したものを使用した（実施例１３を参照）。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２３３】
その結果、ハイブリダイゼーション温度が４℃以下では、ハイブリッド形成速度が低下し、各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。 また、６０℃においては細胞形態の変化が認められ、安定なシグナルが観察されなかった。
【０２３４】
また、２５℃および５０℃では、３７℃および４２℃に比べ、シグナルが明確でなかったが検出することは可能であった。 従って、至適ハイブリダイゼーションの温度は、２５℃〜５０℃、より好ましくは３７〜４２℃に設定するとよい。
【０２３５】
なお、実施例６に記載の方法に準じて作製したＣＡ貪食サンプルおよび本発明のプローブを用いて前記温度条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、好ましい結果が得られた。従って、本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションの温度条件も、前記温度条件と同一とした。
【０２３６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 それ故、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同様とした。
【０２３７】
実施例 １５ ：ハイブリダイゼーション時間の検討
実施例１０（１）および（２）に記載の方法で調製した貪食サンプルを検体とし、１０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、９００分間のハイブリダイゼーション時間について検討した。
【０２３８】
使用したＳＡ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、約１．４５×１０５個／ウェルであった。 ＳＥ貪食サンプルの貪食率は４７％であり、約１．３３×１０５個／ウェルであった。ＰＡ貪食サンプルの貪食率は１７％であり、約１．９５×１０５個／ウェルであった。 また、ＥＦ貪食サンプルの貪食率は４１％であり、約１．４５×１０５個／ウェルであった。 ＥＫ貪食サンプルの貪食率は２０％であり、約１．２３×１０５個／ウェルであった。
【０２３９】
貪食サンプルおよびＵ９３７細胞を塗抹固定したスライドグラス（図１１に示すものと同じ）を使用して、実施手順例（３）〜（１１）に記載の方法に従って検討を行った。 ただし、使用したプローブは、各菌に対応したものを使用した（実施例１３参照）。 また、実施例１０（４）に示した力価の酵素を、３種類混合して用いた。
【０２４０】
その結果、ハイブリダイゼーション時間が１０分ではシグナルが観察されなかったが、６０分以上でシグナルが観察され、９０分以上で安定したシグナルが観察された。 また、ハイブリダイゼーション時間を９００分としても、シグナルの検出には変化は認められなかった。 従って、少なくとも３０分以上、好ましくは６０分以上、より好ましくは９０分以上とするのが好ましい。 さらに、至適ハイブリダイゼーション時間として、１２０分〜９００分の時間を設定するのが好ましい。
【０２４１】
なお、実施例６に記載の方法に準じて作製したＣＡ貪食サンプルおよび本発明のプローブを用いて前記時間条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、好ましい結果が得られた。 従って、本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーションの時間条件も、前記温度条件と同一とした。
【０２４２】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 従って、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適時間も同様とした。
【０２４３】
実施例 １６ ：ハイブリダイゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響
実施例６に記載の方法で作成したＣＡ貪食サンプルを検体とした。
【０２４４】
プローブ（プローブＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９）希釈液に各種界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．５％添加し、実施手順例の記載に従ってハイブリダイゼーションを行ったところ、０．５％のＳＤＳを添加することにより検出感度が飛躍的に増強した。 また、ラウリルサルコシン、ＢＲＩＪ ３５、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）によっても検出感度を高めることができる。
【０２４５】
また、ＳＤＳの好ましい濃度は、１％以下、より好ましくは０．１％〜０．７５％、さらに好ましくは０．２５〜０．５％である。
【０２４６】
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を臨床検体に応用したところ、同様の結果を得ることができた。 ゆえに、臨床検体においてもｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程に界面活性剤、特に、ＳＤＳを添加するのが好ましい。
【０２４７】
実施例 １７ ：ハイブリダイゼーションの際に使用するプローブ鎖長の検討
カンジダ アルビカンス菌プローブ（プローブＣＡ−５０、配列番号：１）を用いて、ジゴキシゲニンにてラベル化を行った。
【０２４８】
まず、精製したＤＮＡプローブ１μｇを、１０×Ｌ．Ｂ．（０．５ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）５μｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウム、０．５ｍｇウシ血清アルブミン）５μｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ジチオスレイトール５μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ａ、Ｇ、Ｃ）各１ｎｍｏｌ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）０．５ｎｍｏｌ、ｄＴＴＰ各０．５ｎｍｏｌ、ＤＮａｓｅ３μｌ（２５ｍＵおよび５０ｍＵ相当量）、１０Ｕ／μｌ ＤＮＡポリメラーゼ１μｌを含み、適量の滅菌精製水で全量を５０μｌとなるように調製した。 １５℃、２時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。 ラベル化した後、５分間煮沸して反応を停止させた。 反応停止液をスピンカラム（ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ ＣＯＬＵＭＵＮＳ ＣＳ９０１、ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ， ＩＮＣ．）に注入し、２５℃で２分間遠心分離（３，０００×ｇ）を行って、遊離しているヌクレオチドを除去した。
【０２４９】
そして、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、３％アガロースゲルにて電気泳動してサイズを確認した。 次に、サザンブロッティング法によりアガロースゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜に転写させた。 その後、２％ブロッキング試薬（ロシュ社製）に３０分間浸した後、１／５，０００量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加えて３０分間浸した。 次に、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうし、２回洗浄した。 そして、１００ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩酸（ｐＨ ９．５）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムにて１０分間振とうして洗浄した。 その後、前出のＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液に浸して発色させた。 最後に、精製水に浸し、発色を止めて乾燥させた。
【０２５０】
その結果を、図１２に示す。 図１２から明らかなように、５０ｍＵのＤＮａｓｅ（図１２のレーン２）を用いて、主として約２００〜約３００塩基長に分布するように切断した場合に、ラベル効率が高いことが示された。 こうして得られた検出用プローブを、貪食サンプルや感染症患者からの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用し、ハイブリダイゼーションを行ったところ、優れた感度でシグナルが検出された。 従って、効率よくカンジダ アルビカンス菌を検出する上で、ハイブリダイゼーションに使用するプローブの鎖長としては、約２００〜約６００塩基長、好ましくは約２００〜約５００塩基長、そして、最も好ましくは約２００〜約３００塩基長が良いことが判明した。 また、シグナルの検出の際に約５００塩基長を超えるプローブ鎖長を用いた場合にはバックグラウンドの増大が認められることから、約５００塩基長を超えないのが好ましい。
【０２５１】
【発明の効果】
このように、本発明の検出用プローブは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適用することで、短時間の内に、検出対象菌に対して安定なシグナルを発現することができるため、迅速かつ的確な検査結果をもたらすことが可能となる。
【０２５２】
また、これにより、カンジダ アルビカンス菌のみならず、敗血症や菌血症などの疾患に対する診断材料を医療現場に迅速に提供でき、人命救助の観点からも多大な貢献が期待されるものである。
【０２５３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＡ−５０プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図２】ＣＡ−５１プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図３】ＣＡ−６９プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図４】ＣＡ−５０、ＣＡ−５１およびＣＡ−６９による混合プローブを用いたカンジダ アルビカンス菌の検出系に適用された貪食サンプルの光学顕微鏡（蛍光顕微鏡：×１，０００）で確認された発色シグナルを示す図である。
【図５】（ａ） スタフィロコッカス アウレウスとスタフィロコッカス エピデルミディスに対する溶菌酵素の経時的活性、（ｂ） シュードモナス アエルギノーザとエシュリキア コリに対するアルカリ剤に対する活性、および（ｃ） エンテロコッカス フェカーリスに対する溶菌酵素の経時的活性を示すグラフである。
【図６】（ａ） Ｎ−アセチルムラミダーゼ ３００単位／ｍｌ、（ｂ） リゾチーム１０，０００単位／ｍｌ、および（ｃ） リゾスタフィン５０単位／ｍｌに対するＤＭＳＯの濃度依存的効果を示すグラフである。
【図７】（ａ） プロテアーゼ ０．２単位／ｍｌのみ、（ｂ） ＰＭＳＦ１μｍｏｌ／ｍｌ、（ｃ）ＰＭＳＦ １０μｍｏｌ／ｍｌ、（ｄ）ＰＭＳＦ ０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ、および（ｅ）ＰＭＳＦ１ｍｍｏｌ／ｍｌに対するＰＭＳＦの添加効果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、貪食サンプルにおいて、細菌が食細胞に貪食されて形態変化を起こしている状態を指し示す図である。
【図９】（ａ） 酵素処理前のスタフィロコッカス アウレウスの貪食サンプル、（ｂ） 酵素処理前のエンテロコッカス フェカーリスの貪食サンプル、（ｃ）貪食サンプル（ａ）を酵素処理して得たサンプル、および（ｄ）は貪食サンプル（ｂ）を酵素処理して得た貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図である。
【図１０】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適プローブ濃度を検定するための貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概略図である。
【図１１】Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの至適温度を検定するための貪食サンプル塗抹用スライドグラスの概略図である。
【図１２】ジゴキシゲニンラベル化ＣＡプローブＣＡ−５０の鎖長とジゴキシゲニンによるシグナル強度を示す図である。
Claims (18)
- カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）菌の検出用プローブであって、当該プローブが、カンジダ アルビカンス菌が保有するＤＮＡに対して特異的な交差反応性を示し、かつ以下の塩基配列、すなわち、
（ａ） 配列番号：１乃至３のいずれかに記載の塩基配列；
（ｂ） 塩基配列（ａ）と７０％以上の相同性を有する塩基配列；または、
（ｃ） 塩基配列（ａ）および／または塩基配列（ｂ）に対して相補的な塩基配列、
を含む、ことを特徴とするカンジダ アルビカンス菌の検出用プローブ。 - 前記塩基配列が、２００〜６００塩基長を有する１種以上の核酸断片である請求項１に記載の検出用プローブ。
- 前記ＤＮＡが、染色体ＤＮＡである請求項１または２に記載の検出用プローブ。
- 請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを用いることを特徴とするカンジダ アルビカンス菌の検出方法。
- 前記検出方法が、以下の工程、すなわち；
（ａ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持担体上に固定し、
（ｂ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ） ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、および
（ｅ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出する、
工程を含む請求項４に記載の検出方法。 - 前記臨床検体が、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、透析排液、組織洗浄液、皮膚、肺、腎、粘膜、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される請求項５に記載の検出方法。
- 請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを用いることを特徴とするカンジダ アルビカンス菌の同定方法。
- 前記同定方法が、以下の工程、すなわち；
（ａ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持担体上に固定し、
（ｂ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ） 当該ＤＮＡをアルカリ変性および中和処理し、および
（ｅ） ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのドットブロットハイブリダイゼーションを行う、
工程を含む請求項７に記載の同定方法。 - 前記臨床検体が、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、透析排液、組織洗浄液、皮膚、肺、腎、粘膜、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される請求項８に記載の同定方法。
- 感染症原因菌の検出方法であって、以下の工程、すなわち；
（ａ） 感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｂ） 請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブを構成する塩基配列の少なくとも一部からなるプライマーを調製し、
（ｃ） 当該ＤＮＡと当該プライマーとの共存系でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって当該ＤＮＡを増幅し、および
（ｄ） 増幅されたＤＮＡを検出する、
工程を含む、ことを特徴とする感染症原因菌の検出方法。 - 前記感染症原因菌が、カンジダ アルビカンス菌である請求項１０に記載の検出方法。
- 食細胞に貪食された外来微生物の遺伝子を観察する方法であって、以下の工程、すなわち；
（ａ） 臨床検体より取得した生体由来の食細胞を支持体上に固定し、
（ｂ） 固定した食細胞の細胞膜の透過性を亢進する化学処理を行い、
（ｃ） 食細胞に含まれる感染症原因菌の染色体ＤＮＡを得、
（ｄ） ストリンジェントな条件下で、当該ＤＮＡと請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、
（ｅ） ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、
（ｆ） 工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して実施し、および
（ｇ） ハイブリダイゼーションシグナルの経時的変化をモニターする、
工程を含む、ことを特徴とする食細胞に貪食された外来微生物の遺伝子を観察する方法。 - 請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブおよびＤＮＡ露出処理剤を含む、ことを特徴とするカンジダ アルビカンス菌の検出キット。
- 前記ＤＮＡ露出処理剤が、ザイモラーゼを含む酵素である請求項１３に記載の検出キット。
- 前記検出用プローブが、界面活性剤と共存している請求項１３または１４に記載の検出キット。
- 前記検出キットが、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、アセチル化試薬、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液、発色試薬、対比染色液、ＰＢＳ原液、ハイブリダイゼーション原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、プローブ希釈液、バッファーＡおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される試薬をさらに含む請求項１３乃至１５のいずれかに記載の検出キット。
- 前記検出キットが、ＡＰＳコートスライドグラス、低速遠心機、恒温機、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、シリンジトップフィルターおよびこれらの組み合わせからなるグループから選択される器具をさらに含む請求項１３乃至１６のいずれかに記載の検出キット。
- チップ基板および当該基板の表面にその一端が固定されてなるＤＮＡ断片を有するＤＮＡチップであって、当該断片が請求項１乃至３のいずれかに記載の検出用プローブまたはその断片である、ことを特徴とするＤＮＡチップ。
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