DE69821341T2

DE69821341T2 - Sonden zum nachweis von infektion durch klebsiella pneumoniae

Info

Publication number: DE69821341T2
Application number: DE69821341T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Ueyama; Kanako Abe; Hiroyuki Keshi; Akio Matsuhisa
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-03-24
Also published as: CA2284858C; JP3520172B2; JPH10262677A; EP0972833A1; CA2284858A1; DK0972833T3; EP0972833B1; DE69821341D1; KR100343105B1; ATE258600T1; EP0972833A4; KR20010005666A; US6225453B1; WO1998042843A1; AU6422998A; AU716947B2

Description

[Gebiet der Erfindung]
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Sonde, welche für das Detektieren und Identifizieren von Klebsiella pneumoniae geeignet ist, dem Verursacherbakterium für Infektionskrankheiten, insbesondere von typischen Bakterien, die Sepsis sowie Klebsiella pneumonia verursachen.
[Stand der Technik]
Eine „Infektion" wird pathologisch als eine Invasion von pathogenen Mikroorganismen (im Folgenden als „Bakterien" bezeichnet) und das Sichern von Ausgangspositionen für das Wachstum der pathogenen Mikroorganismen im Wirtsorganismus definiert. Danach hängt der Ausbruch der Krankheitszustände, die durch die Vermehrung der pathogenen Mikroorganismen in vivo hervorgerufen werden, von dem Verhältnis zwischen der Resistenz des Wirts und der Toxizität der Bakterien ab.
Die durch die Infektion mit pathogenen Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheiten nennt man Infektionskrankheiten. Im Allgemeinen wird Bakteriämie in ihren breiten Bedeutungen als solche Fälle definiert, in denen die phagozytischen Fähigkeiten der Wirtszellen die proliferativen Fähigkeiten der Bakterien nicht überwinden können und die Bakterien sich systemisch über die Blutbahn ausbreiten. Sepsis nennt man denjenigen Krankheitszustand unter den Bakteriämien, in dem die Verursacherbakterien ständig oder mit Unterbrechungen aus einem bestimmten Fokus (Infektionsfokus) des Wirtskörpers in die Blutbahn abgegeben werden, wodurch ein neuer Infektionsfokus in einem anderen Teil des Körpers entsteht, was zu schweren systemischen Symptomen führt. Insbesondere wenn die Abwehrmechanismen des Körpers gegen die Infektion aufgrund der zugrunde liegenden Krankheit und der therapeutischen Behandlung dieser Krankheit verschlechtert sind, insbesondere bei dem Krankheitszustand von bösartigen Tumoren, Leukämie, Kollagenkrankheit oder dergleichen, kann die Infektion oft zur Sepsis führen, dann sogar zu dem Schockzustand, dann DIC (disseminated intravascular coagulation; disseminierte intravasale Koagulation), ARDS (adult respiratory distress syndrome; akute respiratorische Insuffizienz) und dgl., und endgültig zum Tod.
Es besteht somit ein Bedarf für die Verbesserung des schnellen Diagnoseverfahrens für Infektionskrankheiten, denn eine genaue Diagnose ist in einem frühen Stadium der Infektion notwendig, was für die angemessene therapeutische Behandlung extrem wichtig ist.
Des Weiteren spielen Phagozyten, wie etwa Neutrophile, Monozyten und Makrophagen, in den Geweben in vivo hauptsächlich bekämpfende Rollen, während die vorherrschend vermehrten Bakterien von den phagozytischen Zellen in die Blutbahn des Wirts ausgestoßen werden, und dann erscheinen die Bakterien im Blut.
In herkömmlichen Diagnoseverfahren ist es unerlässlich, (1) die klinischen Symptome zu analysieren; (2) Proben für die Vermehrung der Verursacherbakterien zu kultivieren; (3) die aus der Probe isolierten Verursacherbakterien zu identifizieren; und (4) den Schockzustand des Patienten zu überprüfen und anschließend, nachdem diese Punkte ausreichend untersucht wurden, die therapeutische Strategie zu bestimmen. Für eine bestimmende Diagnose müssen die Verursacherbakterien aus der Probe, wie etwa Blut, genau nachgewiesen und identifiziert werden, anschließend sollte die therapeutische Behandlung durch die Verabreichung eines geeigneten Antibiotikums und dgl. zum Abtöten der identifizierten Bakterien durchgeführt werden. Insbesondere sollte die Möglichkeit des Vorhandenseins von medikamentresistenten Stämmen sowie die mögliche Einführung von ersetzenden Bakterien in Betracht gezogen werden. Daher ist es sehr wichtig, ein Pathogen zu isolieren und zu identifizieren und in einem frühen Stadium auf der Grundlage des Medikamenten-Sensitivitätstests des Pathogens geeignete Medikamente auszuwählen.
Viele der Verursacherbakterien für Sepsis gehören zu den gram-negativen Stäbchenbakterien, und unter allen diesen Bakterien machen aerobe gram-negative Stäbchen, wie etwa Pseudomonas, Klebsiella und Escherichia coli 60 bis 70% aus. Insbesondere ist Klebsiella pneumoniae repräsentativ für die Verursacherbakterien für Sepsis.
Andererseits ist Klebsiella pneumonia eine Art von Lungenentzündung, die durch Klebsiella pneumoniae verursacht wird. Diese Lungenentzündung ist durch die Herstellung großer Mengen einer viskosen Kapselsubstanz und das Auftreten von resistenten Bakterien gegen die Medikamente gekennzeichnet. Somit können Prognosen unvorteilhaft sein, was mit der Komplikation eines septischen Schocks oft zum Tod führt.
Die Bakteriämie, einschließlich der Sepsis, ist ein Krankheitszustand, in dem die Bakterien in die Blutbahn gelangen, und es wird eine hohe Dosis an wirksamen Antibiotika für die Verursacherbakterien bei der therapeutischen Behandlung verabreicht. Da Antibiotika im Allgemeinen einige Funktionen der Organe, wie etwa der Leber, beeinträchtigen, sollte die Verabreichung von antibakteriellen Mitteln, die keine Wirksamkeit aufweisen, an einen Patienten in einem kritischen Zustand vermieden werden. Daher ist eine schnelle und genaue Methode zum Identifizieren der Verursacherbakterien im klinischen Bereich erwünscht.
Wie oben erwähnt, besteht die Grundlage einer therapeutischen Behandlung der Bakteriämie, einschließlich der Sepsis, in der Verabreichung von geeigneten Antibiotika zum frühestmöglichen Zeitpunkt. Um eine solche schnelle Behandlung zu ermöglichen, müssen zuerst die Verursacherbakterien untersucht werden. Im Allgemeinen wird das Identifizieren von Verursacherbakterien durch die Kultivierung der Blutprobe aus einem Patienten durchgeführt, bei dem der Verdacht einer Bakteriämie besteht, wobei die Kultur in einer Flasche mit einer Kulturflaschenmethode durchgeführt wird, und anschließend wird die Probe, die in diesem Verfahren ein positives Signal zeigte, auf einem Selektionsmedium kultiviert. Gemäß diesem Verfahren sind jedoch mindestens zwei getrennte Flaschen erforderlich, die das Medium für aerobe Bakterien und ein weiteres Medium für anaerobe Bakterien enthalten. Darüber hinaus ist eine längere Kultur notwendig, und auf der Haut vorhandene Bakterien können die Probe verunreinigen. Zusätzlich kann das Wachstum und die Vermehrung der Bakterien in Fällen einer Diagnose von Patienten, die bereits mit einer hohen Dosis an Antibiotika behandelt wurden, wenn eine mögliche Bakteriämie vermutet wurde, verhindert werden, selbst wenn die Bakterien in der Probe vorhanden sind. Dem gemäß kann die Chance einer erfolgreichen Kultur von Bakterien auf einer solchen Probe sehr gering sein.
Des Weiteren können bisher entwickelte alternative weitere Routineverfahren die folgenden umfassen: ein instrumentelles Analyseverfahren von Bestandteilen von Bakterien sowie Stoffwechselprodukten aus Bakterien (siehe Yoshimi Benno, „Quick identification of bacteria with gas chromatography", Rinsho Kensa, Vol. 29, No. 12, Seiten 1618–1623, November 1985, Igaku Shoin.); ein Verfahren, das einen bestimmten Antikörper verwendet (siehe Japanese Patent Provisional Publication No. 60-224068) und ein Hybrisisierungsverfahren, das eine DNA-Spezifität verwendet (Japanese Patent Provisional Publication No. 61-502376). Alle die genannten erfordern jedoch die Schritte der Trennung der Bakterien sowie die Schritte des Kultivierens und Vermehrens der Bakterien.
Auf der anderen Seite wurde eine etablierte Methode vorgeschlagen, die auf der Funktion des Phagozyten in den Infektionskrankheiten basiert, wobei ein gefärbter Abstrich eines Buffy Coat (Leukozytenfilms), in dem Leukozyten in der Blutprobe konzentriert sind, unter einem optischen Mikroskop untersucht wird. Im Allgemeinen beträgt die Detektionsrate von Bakterien in Leukozytenfilm-Proben aus erwachsenen Bakteriämie-Patienten höchstens 30%, ähnlich zu den Blutproben aus Ohrläppchen. Es wurde jedoch berichtet, dass in Fällen, in denen die Patienten neugeborene Kinder sind, die Bakterien in 7 Fällen aus 10 (70%) nachgewiesen werden konnten. Daher können Informationen über das Vorhandensein von Bakterien im peripheren Blut, die durch eine mikroskopische Untersuchung eines Abstrichs erhalten werden, eine wichtige Richtlinie für die therapeutische Behandlung bereitstellen.
Die oben erwähnten herkömmlichen Verfahren machen eine Vorbehandlung notwendig, welche mindestens 3–4 Tage insgesamt erfordert, wobei dies 1–2 Tage für die selektive Isolierung von Bakterien aus einer Probe beinhaltet, einen Tag für die vermehrende Kultivierung und einen oder mehrere Tage für die Fixierung, und die Kultur sollte in der Praxis weitergeführt werden, bis die Bakterien genug gewachsen sind. Somit kann die Vorbehandlung eine Woche oder mehrere Tage erfordern. Zusätzlich können andere Bakterien als die Verursacherbakterien während der Kultivierungsschritte in einigen Fällen kontaminieren, und solche Verunreinigungen können nicht unbedingt von den Verursacherbakterien unterschieden werden.
Wie oben erwähnt, kann auch, was noch wichtiger ist, die Anzahl der Bakterien, die vermehrt werden können, selbst unter den geeigneten Bedingungen für die Kultur von Verursacherbakterien klein sein, da viele der Verursacherbakterien in der zu vermehrenden und nachzuweisenden Probe bereits in Phagozyten eingeführt wurden und aufgrund der verabreichten Antibiotika bereits tot oder stationär immobilisiert sind. Dadurch kann die tatsächliche Nachweisrate von Bakterien sehr gering sein, bis zu 10 %, wenn die klinische Kulturprobe verwendet wird. Mit anderen Worten heißt das, dass 90% des untersuchten Blutes aus dem Patienten unter Infektionsverdacht bis heute nicht für das Vorhandensein der Bakterien identifiziert werden können, selbst wenn die Kultur für einen oder mehrere Tage weitergeführt wird.
Obwohl im Lichte der derzeitigen Situation, wie oben beschrieben, die Bestimmung der Verursacherbakterien und die Auswahl der für das schnellstmögliche Abtöten der Bakterien geeigneten Antibiotika in hohem Maße erwünscht sind, hängt die bisher angewandte Praxis von einer therapeutischen Behandlung ab, die dann begonnen wird, wenn ein klinischer Verdacht auf eine Infektion besteht, ohne die Ergebnisse des Nachweises der Verursacherbakterien abzuwarten. Das heißt, es wurde ein „trial-and-error" Verfahren praktiziert, bei dem zunächst ein Antibiotikum mit Wirksamkeit gegen das breiteste Spektrum an Verursacherbakterien verabreicht wird und anschließend, wenn das Antibiotikum nicht innerhalb von einem oder zwei Tagen anschlägt, ein weiteres Antibiotikum getestet wird.
Darüber hinaus sind bei dem Verfahren zum Nachweis von Bakterien in der Probe durch Färbung fachmännische Erfahrungen notwendig, um die Bakterien schnell unterscheiden zu können, wenn dies lediglich auf der Grundlage ihrer unter dem Mikroskop erkennbaren Formen geschieht, da die Komponenten des Wirtsgewebes auch gefärbt werden können. In solchen Fällen kann es schwierig sein, zu einer endgültigen Bestimmung zu kommen.
Obgleich die Infektionskrankheiten, die durch Klebsiella pneumoniae hervorgerufen werden, diejenigen Krankheiten sind, für die eine schnelle und genaue Diagnose gefordert wurde, konnte, wie oben erwähnt, das herkömmliche Diagnoseverfahren nicht mit solchen Forderungen Schritt halten.
[Offenbarung der Erfindung]
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die oben beschriebenen Probleme im Stand der Technik bereitgestellt und betrifft eine Sonde für die Diagnose von Infektionskrankheiten, welche ein DNA-Fragment umfasst, das erhältlich ist durch Behandeln von DNA aus dem Verursacherbakterium Klebsiella pneumoniae mit dem Restriktionsenzym HindIII, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 und 5 besteht, und wobei die Sonde mit der DNA aus Klebsiella pneumoniae spezifisch hybridisiert.
Dem gemäß ist die bakterielle DNA immer noch in den Bakterien vorhanden, aber im Verfahren der Auflösung durch Aufnahme in Phagozyten kann sie signifikant nachgewiesen werden auf der Basis ihrer Spezifität unter Verwendung einer Hybridisierungsmethode. Dadurch kann ein schneller und genauer Nachweis der Verursacherbakterien von Infektionskrankheiten erzielt werden, ohne die Bakterien zu kultivieren und zu vermehren. Darüber hinaus kann die Identifizierung der Verursacherbakterien durch DNA-Amplifikation unter Verwendung des PCR-Verfahrens ohne das Hybridisierungsverfahren erreicht werden, wenn ein Primer im Hinblick auf die Nukleotidsequenzinformation der Sonden der vorliegenden Erfindung entworfen wird.
Zusätzlich kann die für die Hybridisierung verwendete Sonde mit einem nicht-radioaktiven Argens markiert werden. Wenn beispielsweise eine biotinylierte Sonde verwendet wird, kann der Nachweis in einem allgemeinen Untersuchungslabor durchgeführt werden, welches keine Facilitäten für die Handhabung von Radioisotopen hat. Somit kann die Durchführung des Nachweises auf eine schnelle und einfache Art und Weise praktiziert werden.
[Kurze Beschreibung der Zeichnungen]
1(a) ist eine Zeichnung, welche die Positionen der ursprünglichen bakteriellen Stämme der DNAs auf jedem der Filter einer Dot-blot-Hybridisierung zeigt. 1(b) zeigt die Ergebnisse, die nach dem Hybridisierungsverfahren unter Verwendung jeder der Sonden durch Farbentwicklung erhalten wurden.
[Bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung]
Um die vorliegende Erfindung detaillierter zu erklären, werden im Folgenden die nicht-limitierenden Beispiele im Hinblick auf die aus Klebsiella pneumoniae, dem Verursacherbakterium für Infektionskrankheiten, erhaltenen Sonden gezeigt.
Beispiel 1: Aus Klebsiella pneumoniae abgeleitete DNA-Sonde
(1) Herstellung von DNA-Sonden, die aus dem Bakterium Klebsiella pneumoniae erhalten wurden
Ein klinisches Isolat von Klebsiella pneumoniae wurde über Nacht in BHI- (Brain Heart Infusion; Hirn-Herz-Infusions-) Medium, kultiviert, anschließend wurden die kultivierten Zellen geerntet und es wurde gemäß der Saito-Miura-modidizierten Methode („Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta, Vol. 72, Seiten 619–629 (1963)) genomische DNA daraus extrahiert, indem ein Zell-Lyse-Schritt durch Hinzufügen von N-Acetylmuramidase SG zum Lysepuffer durchgeführt wurde.
Die extrahierte DNA wurde komplett mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und anschließend in den Vektor pGEM-3Z zufallskloniert. Fünf für Klebsiella pneumoniae spezifische Sonden, d. h. die Sonden, welche DNA-Fragmente umfassen, die spezifische Reaktivitäten gegenüber DNA, die in natürlicher Klebsiella pneumoniae vorkommt, zeigten, wurden aus den so erhaltenen ausgewählt.
Anschließend wurden die ausgewählten Sonden wie folgt benannt: Sonde KP-77-46, Sonde KP-85-43, Sonde KP-98-22, Sonde KP-98-33 und Sonde KP-110-32.
(2) Studien der Speziesspezifität der aus Klebsiella pneumoniae abgeleiteten DNA-Sonden
Die Wechselwirkungen zwischen jeder der Sonden und DNAs aus mehreren Arten von Verursacherbakterienstämmen aus Infektionen wurden wie folgt untersucht.
Zunächst wurden klinische Isolate und hinterlegte Bakterienstämme hergestellt, wie in Tabelle 1 unten aufgeführt. Um die Quellen der humangenomischen DNA in Tabelle 1 und einer Kontrollprobe zu erhalten, wurden von vier gesunden erwachsenen Männern Leukozyten gesammelt, und Escherichia coli K-12, JM109-Transformante, die das Plasmid pGEM-3Z enthält, bereitgestellt.
Tabelle 1
[Abkürzung]

NYSDH: New York State Department of Health (Albany, New York, USA)

Anschließend wurden die in jedem der klinischen Isolate enthaltenen DNAs gemaß der in Beispiel 1 (1) beschriebenen Methode extrahiert, dann wurde das Aliquot der extrahierten DNA (z. B. 10–100 ng) auf einen Nylonfilter punktweise aufgebracht. Nach Denaturieren mit Alkali wurde der Filter einer Dot-Blot-Hybridisierung unterzogen. Die humangenomische DNA-Probe wurde aus den Leukozyten hergestellt, die nach dem zuvor genannten modifizierten Saito-Miura-Verfahren (siehe oben) erhalten wurden. Eine Kontrollprobe wurde aus Escherichia coli K-12, einer JM109-Transformante, die das Plasmid pGEM-3Z enthält, unter Verwendung des im folgenden Beispiel 2 (1) beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Plasmid-DNA hergestellt. Anschließend wurde über Nacht eine Hybridisierung unter Verwendung einer Digoxigenin-11-dUTP-markierten DNA-Sonde, die aus Klebsiella pneumoniae abgeleitet wurde, unter Hybridisierungsbedingungen von 45% Formamid, 5 × SSC bei 42°C gemäß dem Handbuch von Maniatis (T. Maniatis et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory (1989)) durchgeführt.
Nach dem Abschluss der Übernacht-Hybridisierung wurden die Proben zwei Mal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C für 20 min gemäß dem Handbuch gewaschen, gefolgt von einer Farbentwicklung und Nachweis unter Verwendung von Anti-Dig-ALP-Konjugaten (BRL). So wurde die Ergebnisse der Hybridisierung sichtbar gemacht. Diese Ergebnisse sind in 1 dargestellt, wobei 1(a) die Positionen der Ursprungsbakterienstämme der DNAs auf jedem der Filter der Dot-Blot-Hybridisierung zeigt, und 1(b) die Ergebnisse zeigt, die durch die Farbentwicklung nach dem Hybridisierungsverfahren unter Verwendung jeder der oben erwähnten Sonden KP-77-46, KP-85-43, KP-98-22, KP-98-33 und KP-110-32 erhalten wurden. Die experimentellen Ergebnisse im Hinblick auf die Reaktivitäten zwischen den Sonden und den DNAs aus jedem der klinischen Bakterienstämme sind in Tabelle 2 unten dargestellt.
Tabelle 2
[Bemerkungen]

+: Hybridisierungssignal nachgewiesen
–: Hybridisierungssignal nicht nachgewiesen

Wie aus Tabellen 1 und 2 oben ersichtlich ist, zeigen alle vorliegenden Sonden Reaktivitäten nur bezüglich der DNA, die aus Klebsiella pneumoniae stammt, während keine Reaktivität (z. B. Hybridbildung) gegenüber DNAs aus allen anderen Bakterienspezies im Genus Klebsiella sowie den DNAs aus den von dem Genus Klebsiella verschiedenen bakteriellen Spezies beobachtet wurde. Somit wurde die Spezifität der Sonden gezeigt.
Beispiel 2: Analyse der Basenseguenz
Jede der Basensequenzen der DNA-Sonden (5 Sonden insgesamt), für die in Beispiel 1 oben Speziesspezifität gezeigt wurde, wurde gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt.
(1) Herstellung von Plasmid-DNA
Die Escherichia coli K-12, JM109-Transformante, bei der das (zu sequenzierende) subklonierte Insertionsfragment in pGEM-3Z (Promega) enthalten ist, wurde in 5 ml Luria-Bactani-Medium geimpft (bacto-Trypton, 10 g/1 l; bacto-Nefenextrakt, 5 g/1 l; NaCl, 10 g/1 l, pH-Wert auf 7,0 eingestellt mit 5 N NaOH) und über Nacht kultiviert.
Das flüssige Kulturgemisch wurde zentrifugiert (5000 rpm, 5 min) um die Bakterien zu sammeln. 100 μl einer Lösung aus 50 mM Glucose/50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA enthaltend 2,5 mg/ml Lysozym (Sigma) wurden zu den Präzipitat hinzu gegeben und bei Raumtemperatur für 5 min stehen gelassen. Zu der Suspension wurden 0,2 M NaOH-Lösung enthaltend 1% Natrium-Dodecyl-Sulfat (Sigma) hinzugefügt und gemischt. 150 μl 5 M wässrige Kaliumacetat-Lösung (pH 4,8) wurde weiterhin hinzugefügt und gemischt, anschließend wurde für 15 min auf Eis gekühlt.
Der bei der Zentrifugierung (15.000 rpm, 15 min) des Gemisches gesammelte Überstand wurde mit Phenol/CHCl₃ behandelt und es wurde das zweifache Volumen Ethanol hinzugefügt. Anschließend wurde das Präzipitat wiederum durch Zentrifugieren erhalten (12.000 rpm, 5 min). Das Präzipitat wurde in 100 μl einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, gefolgt von Hinzufügen von 10 mg/ml RNase-A-Lösung (Sigma), anschließend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 15 min stehen gelassen.
300 μl 0,1 M wässrige Natriumacetat-Lösung (pH 4,8) wurde zu diesem Gemisch hinzu gegeben und mit Phenol/CHCl₃ behandelt. Anschließend wurde daraus durch Hinzufügen von Ethanol zum Überstand das Präzipitat erhalten. Dieses Präzipitat wurde getrocknet und in 10 μl destilliertem Wasser gelöst, um die DNA-Probe zu ergeben.
(2) Vorbehandlung für das Seguenzieren
Die Vorbehandlung für das Sequenzieren wurde mit dem AutoRead^TM Sequenzierungskit (Pharmacia) durchgeführt.
Die Konzentration der als Templat zu verwendenden DNA wurde auf 5–10 μg in 32 μl einer Lösung eingestellt. 32 μl der Templat-DNA-Lösung wurden in ein Miniröhrchen (1,5 ml, Eppendorf) gegeben, und es wurden hierzu 8 μl 2 mM wässrige NaOH-Lösung hinzugefügt und anschließend sanft gemischt. Nach kurzem Zentrifugieren wurde es für 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen.
7 μl 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und 4 μl destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, gefolgt 120 μl Ethanol. Nach dem Mischen wurde das Gemisch für 15 min auf Ethanol/Trockeneis stehen gelassen. Die DNA wurde durch Zentrifugieren für 15 min präzipitiert und gesammelt, und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Das so erhaltene Präzipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen und für 10 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand wieder vorsichtig entfernt, und das Präzipitat wurde unter vermindertem Druck getrocknet.
Das Präzipitat wurde in 10 μl destilliertem Wasser gelöst, anschließend wurden 2 μl Fluoreszenz-Primer (0,42 A₂₆₀ Einheiten/ml, 4–6 pmol [Fluoreszenz-Primer; Universal Primer: 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 6)]-3' (1,6 pmol/μl, 0,42 A₂₆₀ Einheiten/ml); Rückwärts-Primer: 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 7)]-3' (2,1 pmol/μl, 0,42 A₂₆₀ Einheiten/ml), sowie 2 μl Annealing-Puffer hinzugefügt und sanft gemischt.
Nach sofortigem Zentrifugieren wurde das Gemisch wieder auf 65°C für 5 min erwärmt und schnell in eine Umgebung von 37°C überführt und bei dieser Temperatur für 10 min stehen gelassen. Nach dem Beibehalten der Temperatur wurde es bei Raumtemperatur für mehr als 10 min stehen gelassen und sofort zentrifugiert.
Anschließend wurde die Probe durch Hinzufügen von 1 μl Elongierungspuffer und 3 μl Dimethylsulfoxid hergestellt.
Es wurden 4 Miniröhrchen identifiziert mit einer der Markierungen „A", „C", „G" und „T", und je nach der jeweiligen Markierung wurden 2,5 μl A-Mix (gelöstes ddATP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP), C-Mix (gelöstes ddCTP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP), G-Mix (gelöstes ddGTP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP) oder T-Mix (gelöstes ddTTP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP) in das so identifizierte Röhrchen hinzugegeben. Jede Lösung wurde bis zur Verwendung auf Eis gelagert und eine Minute oder mehr vor der Verwendung bei 37°C inkubiert.
2 μl verdünnte T7 DNA-Polymerase (Pharmacia; 6–8 Einheiten/2 μl) wurde zu der DNA-Probe hinzu gegeben und durch Pipettieren oder sanftes Mischen vollständig gemischt. Direkt nach dem Abschluss des Mischens wurde die gemischte Lösung zu 4,5 μl auf die 4 Arten der jeweiligen Lösungen, die bei derselben Temperatur inkubiert worden waren, verteilt. Für jede Verteilung wurden frische Spitzen verwendet. Die Lösungen wurden für 5 min bei 37°C gehalten, anschließend wurde zu jedem Reaktionsgemisch 5 μl Terminierungslösung hinzu gegeben. Für diesen Schritt wurden ebenfalls frische Spitzen verwendet. Sofort nach dem Inkubieren der Lösung für 2–3 min bei 90°C wurde sie auf Eis gekühlt. 4–6 μl der Lösung wurden für die Elektrophorese pro Spur verwendet.
(3) Seguenzieren auf Basensequenzen
Das Sequenzieren auf die Basensequenzen der in den Beispielen 1 und 2 offenbarten Sonden mit der Spezifität gegenüber DNA aus Klebsiella pneumoniae wurde unter Verwendung eines A.L.F.-DNA-Sequenzierersystems (Pharmacia) unter Bedingungen für das Elektrophoreseverfahren von 45°C 6 h durchgeführt. Primer wurden serienmäßig auf der Basis der Sequenzen, die von jeder der Upstream- und Downstream-Sequenzen erhalten wurden, entworfen, und die oben beschriebenen Verfahren wurden wiederholt.
Somit wurden die gesamten Basensequenzen der Sonde KP-77-46 (SEQ ID NO: 1), Sonde KP-85-43 (SEQ ID NO: 2), Sonde KP-98-22 (SEQ ID NO: 3), Sonde KP-98-33 (SEQ ID NO: 4) und Sonde KP-110-32 (SEQ ID NO: 5) bestimmt.
[Gewerbliche Anwendbarkeit)
Unter Verwendung der Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung können Verursacherbakterien, die in Phagozyten aufgenommen wurden, schnell und genau identifiziert werden, und zwar direkt ohne Vermehrung der Bakterien, beispielsweise durch ein Hybridisierungsverfahren. Mit anderen Worten erlaubt die Diagnose, bei der die Sonden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Identifizierung von Verursacherbakterien mit einer einzigen Probe. Des Weiteren kann die erforderliche Zeit für die Diagnose auf etwa 1–2 Tage verringert werden, während das herkömmliche Verfahren mit einer niedrigen Nachweisrate 3–4 Tage erfordert, und die resultierende Nachweisrate ist merklich verbessert. Daher offenbart die vorliegende Anmeldung Richtlinien für die therapeutische Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch Klebsiella pneumoniae hervorgerufen werden, und zusätzlich kann eine wirksame Behandlung zu einem frühen Stadium der Infektion an den Patienten durchgeführt werden, was zu einer Reduzierung der Mortalität führen kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der die Basensequenzen der Sonden, die spezifisch mit der DNA aus Klebsiella pneumoniae unter weiteren mehreren Verursacherbakterien für Infektionskrankheiten bestimmt wurden, ist es zusätzlich möglich geworden, diese Sonden künstlich herzustellen.
Darüber hinaus kann ein Teil der hierin bereitgestellten Information der Basensequenzen verwendet werden, um Primer herzustellen, die für eine schnelle Diagnose durch Amplifikation der DNA von Verursacherbakterien, die in einer klinischen Probe vorhanden sind, mit Hilfe des PCR-Verfahrens, geeignet sind.
Des Weiteren kann die schnelle Identifikation der Verursacherbakterien durchgeführt werden, indem man die Basensequenzen der von klinischen Proben erhaltenen genomischen DNA mit den in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Basensequenzen vergleicht. Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung die gewünschte Sonde für die Diagnose von Infektionen bereit. Daneben sind hervorragende Anwendungsmöglichkeiten als Richtlinien für die Herstellung von Primern für die PCR, sowie Standardsequenzen, die geeignet sind für den Vergleich der genomischen DNA, die in klinischen Proben enthalten ist, zu erwarteen.
Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung dadurch vorteilhafte Wirkungen haben, dass sie wertvolle Hinweise für die Herstellung und die Entwicklung von neuen Sonden bereitstellt, welche spezifisch mit der DNA aus Verursacherbakterien von Infektionskrankheiten reagieren.
Des Weiteren wurde die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Basensequenz durch Zufallsklonieren der genomischen DNA, die aus den klinischen Isolaten erhalten wurde, erhalten. Daher sollten die Anwendungsmöglichkeiten der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung auch den Komplementärstrang davon umfassen.
Zusätzlich kann davon ausgegangen werden, dass die von Wildtypstämmen erhaltene DNA den mutierten Anteil enthält. Wie jedoch aus der Offenbarung der obigen Beispiele ersichtlich ist, würde ein solcher mutierten DNA-Teil die Verwendungsmöglichkeit nicht beeinträchtigen, die sich aus der vorliegenden Erfindung ergibt, umfassend die Spezifität der Sonde der vorliegenden Erfindung in dem Hybridisierungsverfahren für die Diagnose der Infektionen sowie die Anwendung der Informationen über die Basensequenzen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, für die Entwicklung von Primern, die für PCR-Techniken verwendet werden können, mit dem Ziel einer schnellen Diagnose der Infektionen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Sonde für die Diagnose von Infektionskrankheiten, umfassend ein DNA-Fragment, erhältlich durch Behandeln von DNA aus dem Verursacherbakterium Klebsiella pneumoniae mit dem Restriktionsenzym HindIII, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 1, 2, 3, 4 und 5, und wobei die Sonde mit der DNA von Klebsiella pneumoniae spezifisch hybridisiert.
Verwendung einer Sonde nach Anspruch 1 für die in vitro Diagnose von durch Klebsiella pneumoniae hervorgerufenen Infektionen.