JP3520172B2 - クレブシェラ・ニューモニエ菌に起因する感染症の診断用プローブ - Google Patents
クレブシェラ・ニューモニエ菌に起因する感染症の診断用プローブInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、感染症疾患の原因
菌、特に敗血症の代表的起因菌であり、また、クレブシ
ェラ肺炎の起因菌であるクレブシェラ・ニューモニエ(K
lebsiella pneumoniae)菌の検出および同定に有用なプ
ローブに関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】病理
学的に、感染とは病原性の微生物（以下、「菌」と称す
る）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立すること
を指し、生体内での菌の増殖に起因する発症は、宿主の
抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するものである。 【０００３】病原微生物の感染によって起こる疾患を総
称して感染症というが、一般に、細胞の食菌力が病原菌
の繁殖力に及ばず、菌が全身の血流中に拡がる場合を広
義の菌血症と定義し、その中でも、体内の一定の病巣
（感染巣）から持続的あるいは間欠的に病原菌が血液中
に送り出され、それが原因となって、さらに他の部位に
新たな感染巣を作り、重篤な全身症状を呈する状態を敗
血症と称する。特に悪性腫瘍、白血病、膠原病などで原
疾患およびそれらに対する治療のために生体の感染防衛
機構が低下していると、敗血症へ進展し、さらにショッ
クやＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群)、ＡＲＤＳ（成
人呼吸促進症候群）などを合併し、死に至る場合も多
い。 【０００４】このように、感染症については、特に、的
確な早期診断のもとに、適切な早期治療を実施すること
が必要であることから、迅速な治療方法の改善が待望さ
れている。 【０００５】さらに、感染症に羅病すると、生体組織内
では第一義的には好中球、単球及びマクロファージ系の
食細胞がその防御機能を果たし、また、優勢になった菌
が食細胞組織から血液中に侵出したことにより、血液中
に菌が出現するものと考えられている。 【０００６】敗血症の診断の確立および治療において
は、臨床症状の検討、検体から病原菌の培養、検
体から分離された病原菌の同定、およびショック状態
の確認が必須であり、これらの項目が確認されて初めて
治療方針が決定される。確定診断のためには、血液など
の検体から起因菌を検索・確定した上で、菌の種類に応
じた適切な抗生物質などを投与し、治療しなければなら
ない。とくに、耐性菌の存在や難治性の菌交代症を誘発
させる可能性を考慮し、病原体の分離・同定ならびに薬
剤感受性試験に基づいた適切な薬剤の選択を早期に実施
することが重要である。 【０００７】敗血症の原因菌の多くはグラム陰性桿菌で
あるが、なかでも、緑膿菌、クレブシェラ、大腸菌など
の好気性グラム陰性桿菌が全体の６０〜７０％を占めて
いる。なかでも、クレブシェラ・ニューモニエ(Klebsi e
lla pneumoniae)菌は、代表的な敗血症の起炎菌であ
る。 【０００８】一方、クレブシェラ肺炎は、このクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌を起炎菌とする肺炎で、粘稠な莢
膜物質が大量に産生されることと起炎菌が薬剤耐性を獲
得することのために、予後は不良であり、敗血症性ショ
ックを併発して死に至る場合も多い。 【０００９】また、菌血症(敗血症を含む)は、菌が血液
中に侵出した状態であり、治療においては、起因菌に感
受性のある抗生物質を大量に投与する。ところが、抗生
物質は一般に肝臓などの臓器の機能を低下させるため、
有効でない抗菌剤を危険な状態にある患者に投与するこ
とは極力避けなければならない。したがって、臨床現場
においては、迅速かつ確実な菌の同定が望まれているの
である。 【００１０】このように、菌血症(敗血症)の治療の基本
は、早期に適切な抗生物質を投与することにある。その
ためには、第一に起因菌を知ることが必要である。一般
的には、菌血症が疑われる患者の血液をカルチャー・ボ
トル法で培養し、この検査で陽性を示した検体につい
て、選択培地を用いて菌を培養することで、起因菌種の
同定が行われる。ところが、この方法によると、好気性
菌用と嫌気性菌用の培地の入った少なくとも２種類のカ
ルチャー・ボトルを必要とする上に、菌の培養に長期間
を要し、また、皮膚常在菌等の混入のおそれもあり、さ
らに、菌血症が疑われた時点で大量に抗生物質を投与さ
れている場合には、たとえ検体中に菌が含まれていて
も、増菌・増殖できない場合が多く、実際には、検体か
らの菌の培養の成功率は極めて低いものとなっている。 【００１１】さらに、サブルーチンとしての方法に、菌
体成分や菌の代謝産物の機器分析法（辨野義己、「ガス
クロマトグラフィーによる細菌同定の迅速化」、臨床検
査、vol.29, No.12, pp.1618-1623 、1985年11月、医学
書院参照）、特異抗体を利用した方法（特開昭60−2240
68号参照) 、さらには、ＤＮＡの特異性を利用したハイ
ブリダイゼーションによる方法（特表昭61−502376号)
等があるが、いずれも、菌の分離及び増菌培養が必須と
されている。 【００１２】一方、感染症における食細胞の機能に着目
したものとして、血液試料中の白血球成分が集中してい
るバフィーコート（Buffy coat）の塗抹染色標本を検鏡
する方法がある。一般にバフィーコート標本で菌が検出
される頻度は、成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に30
％程度にとどまるが、新生児の場合、10例中７例（70
％）で菌を検出している報告もあり、塗抹標本の検鏡に
より末梢血中菌の有無に関する情報は治療における大き
な指針となっている。 【００１３】上記従来技術においては、その前処理操作
として、少なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２
日、増菌に１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日
は十分かかり、現実にはこの培養を菌が発育するまで続
けることになるので、前処理操作に一週間以上要する場
合が多く、さらに、菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌
が混入しても区別できない場合もある。 【００１４】そして重要なことは、前述した事情から、
培養すべき検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれ、抗
生物質投与のため死んでいるか静止状態にあるため、培
養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用
いた培養による実際の菌の検出率は10％前後と、非常に
低い。換言すれば、臨床的に感染症の可能性が疑われた
患者の血液をさらに一昼夜以上培養して検査しても結
局、その90％は菌の存在すら判明しないのが現状であ
る。 【００１５】このような状況から、現在は起因菌の確定
と、それに即した抗生物質の選択が要求されているにも
かかわらず、臨床的に感染症の可能性が疑われた段階
で、検出結果が出るのを待たずに治療、すなわち、起因
菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質
を投与し、１、２日間様子を見て、効果が現れないと別
の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼って
いるのである。 【００１６】また、検体中の菌を染色により検出する方
法では、生体成分も菌と同様に染色されるため、検鏡し
て認められる形態によってのみ迅速に菌を判別するの
は、熟練が必要であり、判定が困難な場合もある。 【００１７】このように、感染症は迅速・確実な診断が
求められる疾患であるにもかかわらず、従来の診断方法
では十分対応できていなかったのが実情である。 【００１８】 【課題を解決するための手段】本発明は上記当該技術分
野が抱えている課題に鑑みて完成されたものであり、そ
の要旨とするところは、感染症原因菌、特に敗血症の代
表的起因菌であるクレブシェラ・ニューモニエ菌が保有
するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的な反応性を有するプロ
ーブ、および、当該プローブに含まれるクレブシェラ・
ニューモニエ菌が本質的に保有している遺伝子部分の塩
基配列を解明することにある。 【００１９】すなわち、本発明のプローブにより、例え
ば、食細胞に取り込まれて破壊されつつある菌において
なお維持されている菌のＤＮＡを、ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いてその特異性に基づいて有為に検出でき、
これにより、菌を培養・増殖せずに、感染症疾患の原因
菌が迅速かつ確実に検出できる。また、これらのプロー
ブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれ
ば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法
によるＤＮＡの増幅により、感染症原因菌を同定するこ
とができる。 【００２０】また、ハイブリダイゼーションに用いるプ
ローブを非放射性のもの、例えば、ビオチン化したプロ
ーブを用いれば、放射性同位元素使用施設のない一般検
査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、検出作業が迅
速、簡便に行える。 【００２１】以下に、感染症疾患起因菌であるクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌に由来するプローブの実施例を示
す。 【００２２】 【実施例】 実施例１：クレブシェラ・ニューモニエ菌由来ＤＮＡプ
ローブ (1) クレブシェラ・ニューモニエ菌由来ＤＮＡプロー ブ
の調製 臨床菌株クレブシェラ・ニューモニエをBHI (Brain Hea
rt Infusion)培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、
溶菌ステップでN-Acetylmuramidase SG を加えた、 Sai
to-Miura変法("Preparation of transforming deoxyrib
onucleicacid by phenol treatment", Biochem. Biophy
s. Acta vol. 72, pp.619-629 (1963))に準じて、Genom
ic ＤＮＡを抽出した。 【００２３】抽出したＤＮＡを、制限酵素HindIIIで完
全消化し、ベクターpGEM-3Zにランダムクローニング
し、得られたクローンからクレブシェラ・ニューモニエ
菌特有の、すなわち、天然のクレブシェラ・ニューモニ
エ菌が保有するＤＮＡとの特異反応性を示したＤＮＡ断
片を含む５種のプローブを選抜した。 【００２４】そして選抜された各プローブを、プローブ
KP-77-46、プローブKP-85-43、プローブKP-98-22、プロ
ーブKP-98-33、およびプローブKP-110-32と命名した。 【００２５】(2) クレブシェラ・ニューモニエ菌由来Ｄ
ＮＡプ ローブの種特異性の検討 各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性
を、以下の方法により検討した。 【００２６】まず、検討対象菌株として、下記表１に列
挙した臨床単離株および寄託菌株を準備した。なお、表
１中の、ヒト・ゲノミックＤＮＡおよび対照試料の入手
源として、４名の健康な成人男子から採取した白血球、
ならびにプラスミド pGEM-3Zを含んだ Escherichia col
i K-12, JM109形質転換体をそれぞれ準備した。 【００２７】 【表１】【００２８】そして、各臨床菌株を実施例１(1)に記載
の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、こ
の抽出したＤＮＡの一定量（例えば、10〜100 ng）をナ
イロンフィルターにスポットし、アルカリ変性したもの
をドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料と
した。なお、ヒト・ゲノミックＤＮＡ試料は、前出のSa
ito-Miura変法に、先に入手した白血球を適用すること
で調製した。一方、対照試料は、後述する実施例２(1)
に記載のプラスミドＤＮＡの調製方法に、先に入手した
プラスミド pGEM-3Zを含んだ Es cherichia coli K-12,
JM109 形質転換体を適用することで調製した。次いで、
Digoxigenin-11-dUTP (BRL社製) でラベルしたクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌由来のＤＮＡプローブで、マニア
ティスのマニュアル（T. Maniatis,et al., "Molecular
Cloning (A Laboratory ManualSecond Edition)",Cold
Spring Harbour Laboratory (1989))に従い、45％ホル
ムアミド、５×SSC、42℃の条件下で、終夜ハイブリダ
イゼーションを実施した。 【００２９】終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料
を、マニュアルに従い、55℃にて 0.1×SSC 、0.1%SDS
による20分間の洗浄を２回行った後に、 Anti-Dig-ALP
conjugates(BRL社製) で検出・発色させ、ハイブリダイ
ゼーションの状況を確認した。得られた結果は図１に示
すとおりである。図１(a)は、ドット・ブロット・ハイ
ブリダイゼーションを行った各フィルターにスポットし
ておいたＤＮＡの菌株の配置を示し、図１(b)は上記の
それぞれのプローブKP-77-46、KP-85-43、KP-98-22、KP
-98-33およびKP-110-32を用いてハイブリダイゼーショ
ンを行ない発色させた後の結果を示す。 【００３０】各プローブと各臨床菌株のＤＮＡとの反応
性に関する実験結果を、下記表２に示した。 【００３１】 【表２】【００３２】上記図１および表２から明らかなように、
いずれのプローブもクレブシェラ・ニューモニエ菌に由
来するＤＮＡに対してのみ反応性（ハイブリッドの形
成）を示し、それ以外の菌種に対しては反応性が認めら
れず、その種特異性が確認された。 【００３３】実施例２：塩基配列の 解析 実施例１にて種特異性が確認されたＤＮＡプローブ（計
５本）の塩基配列を下記の方法に従って決定した。 【００３４】(1) プラスミドＤＮＡの調製 サブクローン化された（塩基配列を決定すべき）挿入断
片を pGEM-3Z（Promega)に含んだEscheri chia coli K-1
2, JM109形質転換体を、５mlの Luria-BactaniMedium
(bacto-tryptone, 10g/1L; bacto-yeast extract, 5g/1
L; NaCl, 10g/1L; ５Ｎ NaOH でpH 7.0に調整）に植菌
し、一晩培養した。 【００３５】培養液を遠心分離(5,000rpm,５min.）して
集菌した。沈澱物に2.5mg/mlの濃度でリゾチーム(Sigm
a) を含む 50mM グルコース/50mM Tris-HCl(pH8.0)/10m
M EDTA溶液を 100μl 加え、室温で５分間放置した。得
られた懸濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム(S
igma）を含む 0.2Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて混
合した。５Ｍ酢酸カリウム水溶液(pH4.8） 150μl をさ
らに加えて混合し、15分間氷冷した。 【００３６】そして、遠心分離（15,000rpm, 15min.)し
て得た上清を、フェノール/CHCl3処理し、上清に２倍量
のエタノールを加え、さらに遠心分離(12,000rpm, ５mi
n.）して沈澱を得た。この沈澱物を、10mM Tris-HCl (p
H7.5)/0.1mM EDTA溶液 100μl に溶解し、10mg/ml RNas
eA（Sigma)溶液を加え、室温で15分間放置した。 【００３７】この調製物に 0.1M 酢酸ナトリウム水溶液
（pH4.8）を 300μl 加え、フェノール/CHCl3処理し、
上清にエタノールを加えて沈澱を得た。この沈澱物を乾
燥し、10μl の蒸留水に溶解したものをＤＮＡ試料とし
た。 【００３８】(2) 塩基配列決定の前処理 塩基配列決定の前処理を AutoRead(登録商標) Sequenci
ng Kit (Pharmacia)を用いて行った。 【００３９】すなわち、鋳型となるＤＮＡが32μl 溶液
中に５〜10μg の濃度になるように調整した。 1.5mlの
ミニチューブ（エッペンドルフ）に、鋳型DNA 32μl を
移し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μl 加えて穏や
かに混合した。そして、軽く遠心した後、室温で10分間
放置した。 【００４０】３Ｍ酢酸ナトリウム(pH4.8) ７μl と蒸留
水４μl を加え、さらにエタノールを 120μl 加えて混
合し、エタノール・ドライアイス上で15分間放置した。
そして、15分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを集め、注
意しながら上清を除去した。得られた沈澱物を70％エタ
ノールで洗浄し、10分間遠心分離した。そして、注意し
ながら再度上清を除去し、減圧条件下で沈澱物を乾燥し
た。 【００４１】沈澱物を蒸留水10μl に溶解し、螢光性の
プライマー〔Fluorescent Primer,Universal Primer;
5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3'(1.6p
mol/μl; 0.42 A260 unit/ml); Reverse Primer, 5'-Fl
uorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC]-3'(2.1pmol/μl; 0.4
2 A260 unit/ml) 〕２μl (0.42 A260 unit/ml, ４〜６
pmol）とアニーリング用緩衝液２μl を加え穏やかに混
合した。 【００４２】そして、軽く遠心した後、65℃で５分間熱
処理を行い、素早く37℃条件下に置き、そこで10分間保
温した。保温後10分以上室温で放置し、軽く遠心した。 【００４３】そして、延長用緩衝液１μl とジメチルス
ルホキシド３μl を加えたものを試料とした。 【００４４】４本のミニチューブにＡ、Ｃ、ＧおよびＴ
と記入し、それぞれのチューブにＡMix (ddATPをdATP、
dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの) 、Ｃ Mix
(ddCTP をdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解し
たもの) 、Ｇ Mix (ddGTP をdATP、dCTP、c7dGTPおよび
dTTPと共に溶解したもの) およびＴ Mix(ddTTPをdATP、
dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの) を 2.5μ
l ずつ分注した。なお、それぞれの溶液は使用時までは
氷中で保存し、使用時には37℃で１分間以上保温してか
ら使用した。 【００４５】希釈したT7DNA ポリメラーゼ（Pharmacia;
６〜８units/２μl)２μl をＤＮＡ試料に加え、ピペッ
ティングもしくは穏やかな混合により、完全に混合し
た。 【００４６】混合後すぐに、この混合液を 4.5μl ずつ
保温しておいた４種の溶液に分注した。なお、分注に際
しては新しいチップを用いた。 【００４７】37℃で５分間保温し、停止溶液を５μl ず
つそれぞれの反応液に加えた。 【００４８】この分注においても、新しいチップを用い
た。90℃で２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。
電気泳動には１レーンあたり４〜６μl を泳動した。 【００４９】(3) 塩基配列の決定 実施例１および２に開示した、クレブシェラ・ニューモ
ニエ菌が保有するＤＮＡに対して特異性を有するプロー
ブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温度45℃、泳動時
間６時間として、A.L.F.DNA Sequencer システム(Pharm
acia) を用いて行った。各上流と下流から明らかになっ
た配列から順次プライマーをデザインし、上記の操作を
繰り返した。 【００５０】その結果、プローブKP-77-46（配列番号
１）、プローブKP-85-43（配列番号２）、プローブKP-9
8-22（配列番号３）、プローブKP-98-33（配列番号４）
およびプローブKP-110-32（配列番号５）それぞれの塩
基配列の全容が明らかになった。 【００５１】 【発明の効果】本発明のプローブを用いれば、例えば、
食細胞に取り込まれた感染症原因菌をハイブリダイゼー
ション法を用いて、増殖することなく直接検出し、かつ
菌を迅速にしかも正確に同定できる。すなわち、本発明
のプローブを用いた診断では、１回分の検体で菌の同定
まで行え、診断に要する時間も従来法の３〜４日（検出
される率は低い) から、約１〜２日と飛躍的に短縮で
き、しかもその検出率は格段と高い。それ故、細菌性肺
炎の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、
感染症患者に早期の内に有効な治療が実施でき、ひいて
は死亡率の低減も期待される。 【００５２】また、感染症疾患起因菌の中でも、特にク
レブシェラ・ニューモニエ菌が保有するＤＮＡに特異的
に反応するプローブの塩基配列を明らかにしたことによ
り、これらプローブを人工的に調製することを可能とし
た。さらに、解析した塩基配列の情報の一部を利用して
作製したプライマーを用いて、臨床検体に含まれる感染
症原因菌のＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅して、原因菌
の迅速な診断に役立てることができる。 【００５３】さらに、臨床検体に含まれるGenomic ＤＮ
Ａの塩基配列と本発明によって解析された塩基配列とを
比較参照することにより、感染症や肺炎の起因菌種の迅
速な同定が行える。 【００５４】上記したように、本発明は、所期の目的で
あった感染症診断用プローブを提供するのみならず、Ｐ
ＣＲ用プライマー作製の指針として、また臨床検体に含
まれるGenomic ＤＮＡとの比較参照用に適した標準配列
として優れた有用性が期待され、さらには感染症疾患起
因菌が保有するＤＮＡに特異的に反応するプローブの今
後の探究・開発における貴重な手がかりをもたらすなど
の優れた効果を奏するものである。 【００５５】また、本願出願にて開示した塩基配列は、
臨床分離株のGenomic ＤＮＡをランダムにクローニング
して得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の
有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。 【００５６】さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部
分が存在することは当然考えられるが、上記実施例の開
示から明らかなように、当該ＤＮＡ変異部分が、感染症
診断のためのハイブリダイゼーションへ利用する際の本
発明プローブの特異性、あるいは本願出願にて開示した
塩基配列情報を感染症の迅速診断を目的としたＰＣＲ法
のプライマーをデザインするために利用できる等の、本
発明が奏する有用性には何ら影響を与えるものではな
い。 【００５７】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ： 1941 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-77-46 配列 AAGCTTATCC CGCATCACCT GCCAGAGTGT TTCCGCATCC TCGTGCAGCC GCTCGCACAT 60 GTCGGCCGGG GTATCCATAT CCAGCTCGTT CAGTTTCTCG AGCAACAGCA GCGACTGGTC 120 CTTAATGAAT TTAGCCATAT TGAGGGCGGT TTTTTCCTGC TTCGTCATGT TCTCCATTCC 180 CTTCGGTAAG TTCTCAGCTA AACCAGCCGG ACCAGAAGCG TTTTTTCTTC TGTGTCAGTT 240 CTGTTGTCAA TCTGTCCACT TCGGCCTGGA GTTTCCGGCG CTCATCATCG TGCTGGCGGC 300 GTTCTTCTTC CCGGGATGTT TTATCTTCCA GCATCAGGGT GACAGCCTGC CGGAGATCGG 360 CCAGTTCCTT TTGCATTGCC AGAAGCTGTT CCTGTGGGAA ATTTTTTTGT GTATTTTCAC 420 GGTGTGAAAT GCCGGGAATT TGTTTCTCAG GGATATTCAC ATTTCCGTAT ACACGGATCA 480 GTTCTGACAC ATCCACGACA GGGTTGTTTT TCCCGTCACG TGACACGGTA ACCTTTCCCT 540 GTTTTACATG ATTGTATAGC GTTCTTCTGG TAATGCCCGC GGCTTGTGCT GCCTGTGAAA 600 GGTTGAGCAA TGTTTTCGCC ACTGTATACC CCTGATTTTA TCGGGTGTGA AAGGTGTGTA 660 ATTTCTCACG GTAAATGTAT CGCTGAATTT TACCCGTTTT TCCGTTCAGG ATGTGGTTTT 720 CTGACGCGCT GTGCTTGTCA AACCGGCGAC GGCCACGCAA TGAATTGCGC CCCCGTCATC 780 GGTTATTAGA GGCTGTCTGC CCCCGGATAC CCGGATTCTT TCTGATGCCT GACGGTGACG 840 ATCACAATCC GGTCCATTTC CCGGTCGTGG CGGTAGAGCA TCACATAGCC ACTGTCGCCA 900 AACCCGATCA CCAGTTCCTG ATATTCCAGC GGCAGAAATG GCACCGGGCG GCCAATGTCT 960 GGCAATGTTT TCAGTTGCTG GATAGCCCGG ACGATCACCT CACCGGCTTT TCTGGCTGCC 1020 AGCCGATTTT TGGTTTTGAG AAAGTCCTGG AGGCGTTGTA AATCCTCCTG TGCCAGCGCG 1080 GAAATCGTTA CCTGTGGCAT GGCGGAGCAT CCTGCTCGTT CTCAGTTCCC CAGGTACTTA 1140 TCCAGGCTTC TGCTTCTTCC GCAGTAAGGT GCAGACCCGT TTCCTGATAG TGCTGCCATG 1200 CGGCTTGTCC GTCCCGCAGG TACTGGTGCG CTTCTCTTCC CGGTCGATGT ATTCGGTGAT 1260 TGCCTCCAGC ATTAGCGCGT GCGCTGAGCG GTGCCGGTCA TCGGCCAGCG TTTTCAGCCG 1320 GTCCTTAAGT TCTTCATCGA GCCTGATGGA TGTTGCTGAT GACATAAAAG CCCCTTTGTA 1380 GTCATGTGTA ATACATATGA CTACTTTAAT CCGTGGCGGC GCTATTTGCC AGAAATACGG 1440 CTTTTGCTGC CCATTTTTTC ANTTCGCTTC CCCATTTTTT CACTTCGCTT CCCCATTTTT 1500 TCACTTCGCT TCCACTAATC AGGGCTGCTA CAGGCTCACT CATCATCCAG GACTATTGCA 1560 GCCTGCGGGT TAAAGGACCT GTTACTGGCG GCAACCATCA TCATTGAACT TTTTGGTGGT 1620 GGCTGGTCGC GGATCCTGTA AGCCGTCATT TTTCAGACTG AATTCAAAAT TTATAACCTG 1680 TCGCATTGCC GGGTGCCTGC GGGATATAGC CAGTGCCTCA TTGCCGTCAG CGTTTCCCGA 1740 AAAAAAAGTG ACAGCCGGTA AGCGACACGT TGTCCACTCG TCCATCGTCC AGAATATCAA 1800 ACGTGGCGGT CACCTGACCT TCGATGCGTT TTGCTGCGGC CTGTACCGGG TAGGTTGGCT 1860 GCAGTGTGGT TACGGGTTTT AGTGGTATCG CATGTACCGG AGTGAGGAAC ATGGCCGCCA 1920 GCACTGTCAG AGTAAAAGCT T 1941 配列番号：２ 配列の長さ： １７４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-85-43 配列 AAGCTTTTCT TTCAACCCTG GACAAGATGG CTGAAAAGCA GAAGAACACA GGTAAAGAAA 60 TGTTCGTGGG TGTCAACCGG GTACTGAGCG ATGCAGAATC AAAATCATTT TTCGAAGAAA 120 ACAGAACGCA GTACCCAAAG ATGGACATTA AAATACCGTT TCTTACGGTG CGCGAAACTC 180 TTCTGTACAA ACCCGCATTG AATGCCTCAC AGGTGATGTG CCCGACCCTG ATCGTTATTG 240 CTGGTCAGGA TACGGTTAAT CCACCGGAGC AGGGACGGGC CTTATTTGAC GCGGTGGGGG 300 CCAAAGAAAA AAGGCTATAT GAGGAAAGCA GTGCCCGCCA TTACGACATT TATGCAGGAG 360 AGCACTTTAA GCAGGTTATC AGCATTCAGA CAGAATGGTT TAAAACGCAC TTGTAATTTT 420 AGATAACGAC TTACGGTGGG TTCAACAGAG CCCGCCGTTA TGATAGACGT CAAATGTCGC 480 ATTTTGTAGC TTCGCTTCCG CTGGGCCCTG TAAGGCGCTA CGTTCTCAGG AAGTCTCAGT 540 ATGCTCAGGA ATACTATCCC GATGTCTGTT GGTTACAGGC ACTCGCCGTG AGAAAAGAGT 600 AAGAAATATC CCGGTAACTA ACGGTATAAT AAACAGCATT GATTGAGTTG AAAGTGCATA 660 TCCATATATA TAGCTCTCCA GGCTTACCGC AATCAGAGGA AAAATAAGGA AAACAAGTGA 720 AGCCTGAAAG CACTGGCCTT TTGCTGAAGT GCAAAGTAGC ATAATATTCC AAAAACTCCG 780 GCAAAAGCAC CGAGATACAG GGTGGCCAGT ATTGAGTGCG CTGAGAAGGC TGACACCTGT 840 GGTCTTTCGA AGAGCCATCC TGCCGCAGAA AGTATCAATC CTGCCAGAAA ACACGGTAGC 900 GCGTTAAACG TTATAACAGA GACAGTACAG CTTCTTTTCT TGCATTGGGT GTATATTATG 960 GCATGGATGA TTACGGCTGA AACAAGCGCA AGGATCCCCT GCCAGTGGCT CTCTGTACTT 1020 GTTTTCGTTT CTTCGAGAAG AATACCCGCC AGTGCAACTA TTGCAACAGT TAATCCCGCA 1080 ATCTGCATTG AGTTCGTTTT TTCATTCAAA AATATCACAG AAGCTATCAA AACAGCCACA 1140 GGCATATTCG CAAATATAAT GGAGGCAAGT CCGGAACTGA CATAGGTTTC ACCATAAATC 1200 ATTAATGAAA AAGGAATGGC GAAATAAAAA ATACAGATTC CAAACTGAAA TAATCGTTGT 1260 CCAGGTGGAA ATAAAAGTGG TGTTTTTCTT AACCATGCAA TGCCCATTAA TAATGGTGCC 1320 GCGAACATAA ATCTCATTCC GGTTGCAAAC ACCGGAGGGA TCGTTTCAGC GGCTATCCGC 1380 ATAGCCAGCC ATGTGGTTCC CCAGGTCATT GCAACCAGCA GGAATAATAT CAATATTGTC 1440 ACTCTGCGCA TAAGACGCTC CCAGTAAAAG GAATTAATTT AACTTTTTAG CTGGAGAAAA 1500 ATATTTTTTT CTTTACTGTT TTTTCATACT TTTAGAGAAA ATATTTCTCT TTCAGAAGGG 1560 TGAGATTATG CTGGAAAAAA AAGATAAAGA GCTACTCAGG CTGTTATAGC GCGACTGTAC 1620 CCTGTGTTTG CAGGATCTGG CTGCGGCTGT CGATTTAACG CCTAATCCCT GCTGGAAGCG 1680 CATAAAACGG CTTGAAGATG AGGGGATCAT CACTGGTCGG GTCGCCCTGT TGAGCAAGGA 1740 CAAGCTT 1747 配列番号：３ 配列の長さ： 1988 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-98-22 配列 AAGCTTAGAA TAAAAAGATT TTTCTTCTTC ATAACTTTCT CCATTTTGTA TGTTTATTTG 60 TTTCGTATCC TTATTATTTT TATTTGGCTT ACATATAAAT AAATACAACA ATAATTAATA 120 TAGTCAAGAT GTGTATAATA TTATTGACAA ATATATTTTA ATTAGCTAAT TAATAAATGA 180 ACAGAAAACA AAGGAGAATA AAATGAAATA TTATATGCTA AAACCATTTC GAATAGGAAT 240 CTTAGAGAAC GATATAACTG TTAAAGAATC AGAACAATAT GTGATTATTG ATATAATTAG 300 CGGAGAGGAA ATACTTTATT GTGATGATAA TTGTTATTTA ATTACTCCAA CTTTATTGAA 360 ATCTCTTAAA GATAGCAATC TTACAGGTGT TAATGTTGTA AAGCCTAAAA ATATGAAATT 420 CAGTATTGAA CACAACATGA AACATCCTAA TAAAAGTTTA AGGGAATGGT ATAGACTAAT 480 ACCATTTAAG TATGATAGCG GTAAGAATCA GGAAATATTT CTTGATCAAT ACGACAATCT 540 AATCATAAAT GAACGCATAA AAAATATAAT ATATAATAAG GATGTTCATA GGGTAAAGAG 600 AGCTTTTATA ACAGAATATG AGATTGATAA AGTAGAGCAT CATGATGAAG AAATAATCGA 660 GCAACCTGTT TTTAAGAAGG AAAATAAAAC CACTTTTAAA GATTGGTGTG TTTTCATGTT 720 TATTCTTATA ACTATCATTT ATTTGTTTTT TAAATAAGAG GCTGAAAGAT GAATATCAAA 780 ATCAATGATG GTATTACAGG CGAGATCTTA GTGTTAAATC AAACAACGTT TAACAATGAT 840 GTGGATACTA TACAGTTAAG AATGACACCA GAGTTTTTAG CCCTTATCAA AAGACATTGT 900 TCCGGTGCTA TTGATGTGTC TATATCAGCT TTATTAGATT ATGGAATCAA AAAAATATTA 960 GATGAAAACA TTTCAATCTC AATACAACAA GTTGAGAAAG AAATCGTAAT TGAATCAGTA 1020 AAGCGTGATA GTAGCATTAT TCCATTTACT ACAGTTAACT ATAGAGCATC AAGAAAAGAC 1080 ACACGCCCCG TATTCGTGAG ATTGTGTAAA GATCTAAAAT ATAGGTTAAA AGAAATATCT 1140 CCGACTAAAT ATACACTTTC CGCAATTGGT ATAATAAAGT ATTCGATTGA TACCTTGCTT 1200 AAAAACAATC AGTGCCTGAT AATAAAAAGT GAGGTTATTT ATGAAAAATA AAAACATTGA 1260 ATTTATGCTT AATGCTATTC TTTTTGCTAA GTTTCTTTTA TATCAGGATG AGTTCACAAA 1320 TGAAGAGCTT GAACGTGGTG AAGATGTTCG AAACATAAAA GAGCTTTTCG TATTAAAAAA 1380 TAAAGAATGG ATTAATGATA TTAATACAAT AAGATTAAAG GATATTAACC AAGATATTCA 1440 TATATCATCA ACATACATCA TGTCATTAGA TGGAGTGGGT TATTATGCTT TTTCTAATAA 1500 GTCAGAAGAT GAGTTATACC AATATTTAGT TAATGACCTT TGCGATCATT ATATCGCTGT 1560 AAGTGAAATG TCATTGGAAG ACATAGAGGG AGCTTTAGAG GCAATCGAAG AAGATTTGTT 1620 TGATATATAC CGAAGTAATC TATCTTTAGC CAACAAAATG ATTTTAGATG TTTCAAACAG 1680 ATTTAAAATA AAACCTGATT TGAAAAGACC ATTACTCACC ATCGTTTAAA AAGGGCTGTT 1740 AAGCCCCTTT TATATTGTTC ACTGTTTTAT GATGTGCTAT GTTTACCTTC TAACTTAAAT 1800 GTTGAAAAGG ATAAAACATG AGCGCATTAG GGCATTTTAA TAACATTCGC ACTATCAGAA 1860 AAGAAGCCCA TGAGATGGGC TATGACACCT TCCTTGAGTT CGCTGAAAAG GTTCAAACCG 1920 TTAAGGATGN GTTCCTAAAA GAAGCAGAAG AGGAAAAAGC GAAACAGGCA CTGGTAGAAG 1980 AAAAGCTT 1988 配列番号：４ 配列の長さ： 1484 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-98-33 配列 AAGCTTTTAA TGGAATGAGC GTATTTTTAA ACTAAAAAAA GGATTACATT ATGAATATAT 60 TATCAATAGC ATCAGGCGAA ATAGTGTTTT GTTTATTTAT AGCGTTTTTT ATTTATACAG 120 GCATTAAAAT CAAAAGCAGT AAGAAATTAA CAAAGATATA TAAAAATATA GGATGGGTAG 180 GAGTTGCTTT ATTAGCCTCT TTATTTATAT CAGTTCATTT ATCAAGAGAG GTTCACATTG 240 TTCTATCTCT TATCTTTGTT CACTATTTAA AACTTACTTA TTCAATGACT TTTATTTTGG 300 GTGTTTTCTT CTTAGTAAAG AAAATTTATT CAAAAATAAA AGGTTTTTTC AAGCCAAAGT 360 TTGCGGCATA AGGAGGTTTC AATGAAAGGA CGTAGAAAAG GATTTATCCT GATTGAGTTG 420 TTATTAGTGC TGGTAGTTGC TACTGGCATC GCCGGAGCAA CGTTTTACGG GTATAGCAAG 480 CTGCAGGAAG GGTTCAGAAC AAGCAACGCT ATACGCGATC TGGCTACTAT CAGTAAAGCC 540 ATGAACGCTA TAACAGCTTC TAAGCCCACT ATAGCCGAAG CTAATAGTAT GCTCATCAGT 600 TCAAAGAGTC TTCCTTCTAC GCTGGTAGAC ACCAGAACTA ACACGCTTGT GAATGCCTAT 660 GGCGGTAAGC TCACTATAAC GGCTCACAAC GGCTTGGACG ACTCTTATGA TGTGTCTTTC 720 TACAATGTTC CACTAAGCGC CTGTTCTACG CTTGTAAGCA GCGGTAGGGT GGTTTATAGA 780 AACATAAGCA ACACCACATC AGGATCTAAG ATTGCGGCCA CACCCAGCAT GGCAGACATA 840 ACTGCTTTCT GTTCCAGCTT TAACACCAGT TCAGTGCTTG TTTTTACCAA CGCCGACTAA 900 CCAAAAGCCC CGACCGGGGC TTGTCTTACC TACCTAATAA AAGCCTAATT AACAAATTGA 960 TTTAGCTAGG TTTTATTGGT ACTATCACGC CGATCTGGTG CATAACTGAC CACTTTTATA 1020 ATGAATGAGG GTTGAGTATG AAAAAGTTTA TGGCGGTTGC GGTTATCGGT ATGGCTTCAC 1080 TTCTGGCAGG TTGTAATGAC GGTATTTATG GCGAATACAT CAGTAAGCAG TATGGGGTAA 1140 GGCTTGATAT TCAAAAGGAC GTAATCAAGT TTAAAGACAG CACCTTTAAT GTTAAGTCAT 1200 GGGATGAAAG CCAAAAACCT GTATACATTG CTAAAACACA AAACAAAGAC ATTGGATCTT 1260 TTACTTTCAA AATTGAGAAA GTAAAACAAG GTGTAGTTTA TCAAGGCGTA GTTTTTGAGA 1320 AGGATTAATC AAATGGAAAA GAAAACTGTT CGCTGTCCTT TTTGTGATCA CGAAACAAAA 1380 CACGGCTTAG GTGTGTGTTT ACCTTGCGGA GCAAACATAA CATACGGTAA AGCACCGTTA 1440 TGGTTTGGTC AAATTGGCGC TTTATTATCT GTCGTATTAA GCTT 1484 配列番号：５ 配列の長さ： 1248 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-110-32 配列 AAGCTTAAAT GATTTCTTGG ATGATAAAAA ACGCAAAGAA CAGCACAGGA AACGTCTTGC 60 TGATAAGTTG TTTCACACTG TTCGTTCTGG TAGTGATACA GAGATTCAAT CTGTTATAAA 120 AGAATGTTCA GAAAGTGGCT TAGATTTTAA AGATGTAAAA CATGATTACC TGTTAGAATA 180 TTTTGATTCC TTCCATAACC GCTTTACCCC TCCTTCTATT CCCATTATTA AATTACTTAT 240 TAGCTATCAA AATAACATAT CTCATAAAGC CAAGTTAGCA TTTTGCCGCA ATATATATTA 300 TCGTGGGTTT TTAAACGAAG AAGAGTTATA TGAAATATCC GAATTAATTA TAAAATAAAG 360 TCTCAATATA GATTGACTTA TATTTAAAAT CCCTTATAAA TAATAATATA CACAAATAAA 420 TATAAGAGGG TTTTAAATAT GAATGCTATA AAAGAGATTA AAACAATAGC TTTAGCTCAT 480 GGAATATTAA ACGATATAAG AAAAGGTAGG AACCATAACG AAGTTTTCGC AAGTTCAGAA 540 AGAATAGATG TTGATTATTT AACTAACTAT TTAAGTGGTA AACTTGGAAA GAAAATAACA 600 ACTTTCAAAA GACTTGATGG AATCCTTTCT TACAGCAAAA GAAAAGATCA AATAGTATCA 660 GGTTCTGTTT TCTTCTACGC TCCTGAAAAA AATCAGGACA GTGAGAAAGA GGCTCAGTTC 720 CTTAAGTTGT TAACGTTCAA GTTAGCTCAA AACAATTCAT TTTTCATACA TTTTAAAGAC 780 CAAAGAGAAG GAGGATTATA ATGATATTGG ATTCAATCAG TTTTAATGAA CACGATTACC 840 ACTTGGTTTC TAATACAACA GCGACATACG AAATAAAACT AAAAATAGTC AAAGTTTTAC 900 GTGGGCGTAA GTTTGAAAGA TTCAGGGTAG ATAGTCCGTT TGTAGAAATA CTCAAAGTGG 960 CATATGCCCC GGCAGGTAAG AAAAGAGCAA ATGAAACAAC GAGTATTATT GAGCAAATGA 1020 AAGAGGACTT AACAAACATA GTTCTTGAAG AGGCGGTAAA AACACAGGAT AAGGCAATGA 1080 GTTTTATAAA AGGTGATTCA GATGGAGATG ATAAATGATT TATTGGTGTT AGTAAAAACA 1140 AGTGCGTTTG TGATGGGGTT GTATTTTTCA TGTGTTTATA CAGAAAGAAC ACGAAGAAAC 1200 ATTATAAGGG CGTGGTTTAA AAGGAATATA ATAGTTGTTG AAAAGCTT 1248
菌、特に敗血症の代表的起因菌であり、また、クレブシ
ェラ肺炎の起因菌であるクレブシェラ・ニューモニエ(K
lebsiella pneumoniae)菌の検出および同定に有用なプ
ローブに関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】病理
学的に、感染とは病原性の微生物（以下、「菌」と称す
る）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立すること
を指し、生体内での菌の増殖に起因する発症は、宿主の
抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するものである。 【０００３】病原微生物の感染によって起こる疾患を総
称して感染症というが、一般に、細胞の食菌力が病原菌
の繁殖力に及ばず、菌が全身の血流中に拡がる場合を広
義の菌血症と定義し、その中でも、体内の一定の病巣
（感染巣）から持続的あるいは間欠的に病原菌が血液中
に送り出され、それが原因となって、さらに他の部位に
新たな感染巣を作り、重篤な全身症状を呈する状態を敗
血症と称する。特に悪性腫瘍、白血病、膠原病などで原
疾患およびそれらに対する治療のために生体の感染防衛
機構が低下していると、敗血症へ進展し、さらにショッ
クやＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群)、ＡＲＤＳ（成
人呼吸促進症候群）などを合併し、死に至る場合も多
い。 【０００４】このように、感染症については、特に、的
確な早期診断のもとに、適切な早期治療を実施すること
が必要であることから、迅速な治療方法の改善が待望さ
れている。 【０００５】さらに、感染症に羅病すると、生体組織内
では第一義的には好中球、単球及びマクロファージ系の
食細胞がその防御機能を果たし、また、優勢になった菌
が食細胞組織から血液中に侵出したことにより、血液中
に菌が出現するものと考えられている。 【０００６】敗血症の診断の確立および治療において
は、臨床症状の検討、検体から病原菌の培養、検
体から分離された病原菌の同定、およびショック状態
の確認が必須であり、これらの項目が確認されて初めて
治療方針が決定される。確定診断のためには、血液など
の検体から起因菌を検索・確定した上で、菌の種類に応
じた適切な抗生物質などを投与し、治療しなければなら
ない。とくに、耐性菌の存在や難治性の菌交代症を誘発
させる可能性を考慮し、病原体の分離・同定ならびに薬
剤感受性試験に基づいた適切な薬剤の選択を早期に実施
することが重要である。 【０００７】敗血症の原因菌の多くはグラム陰性桿菌で
あるが、なかでも、緑膿菌、クレブシェラ、大腸菌など
の好気性グラム陰性桿菌が全体の６０〜７０％を占めて
いる。なかでも、クレブシェラ・ニューモニエ(Klebsi e
lla pneumoniae)菌は、代表的な敗血症の起炎菌であ
る。 【０００８】一方、クレブシェラ肺炎は、このクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌を起炎菌とする肺炎で、粘稠な莢
膜物質が大量に産生されることと起炎菌が薬剤耐性を獲
得することのために、予後は不良であり、敗血症性ショ
ックを併発して死に至る場合も多い。 【０００９】また、菌血症(敗血症を含む)は、菌が血液
中に侵出した状態であり、治療においては、起因菌に感
受性のある抗生物質を大量に投与する。ところが、抗生
物質は一般に肝臓などの臓器の機能を低下させるため、
有効でない抗菌剤を危険な状態にある患者に投与するこ
とは極力避けなければならない。したがって、臨床現場
においては、迅速かつ確実な菌の同定が望まれているの
である。 【００１０】このように、菌血症(敗血症)の治療の基本
は、早期に適切な抗生物質を投与することにある。その
ためには、第一に起因菌を知ることが必要である。一般
的には、菌血症が疑われる患者の血液をカルチャー・ボ
トル法で培養し、この検査で陽性を示した検体につい
て、選択培地を用いて菌を培養することで、起因菌種の
同定が行われる。ところが、この方法によると、好気性
菌用と嫌気性菌用の培地の入った少なくとも２種類のカ
ルチャー・ボトルを必要とする上に、菌の培養に長期間
を要し、また、皮膚常在菌等の混入のおそれもあり、さ
らに、菌血症が疑われた時点で大量に抗生物質を投与さ
れている場合には、たとえ検体中に菌が含まれていて
も、増菌・増殖できない場合が多く、実際には、検体か
らの菌の培養の成功率は極めて低いものとなっている。 【００１１】さらに、サブルーチンとしての方法に、菌
体成分や菌の代謝産物の機器分析法（辨野義己、「ガス
クロマトグラフィーによる細菌同定の迅速化」、臨床検
査、vol.29, No.12, pp.1618-1623 、1985年11月、医学
書院参照）、特異抗体を利用した方法（特開昭60−2240
68号参照) 、さらには、ＤＮＡの特異性を利用したハイ
ブリダイゼーションによる方法（特表昭61−502376号)
等があるが、いずれも、菌の分離及び増菌培養が必須と
されている。 【００１２】一方、感染症における食細胞の機能に着目
したものとして、血液試料中の白血球成分が集中してい
るバフィーコート（Buffy coat）の塗抹染色標本を検鏡
する方法がある。一般にバフィーコート標本で菌が検出
される頻度は、成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に30
％程度にとどまるが、新生児の場合、10例中７例（70
％）で菌を検出している報告もあり、塗抹標本の検鏡に
より末梢血中菌の有無に関する情報は治療における大き
な指針となっている。 【００１３】上記従来技術においては、その前処理操作
として、少なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２
日、増菌に１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日
は十分かかり、現実にはこの培養を菌が発育するまで続
けることになるので、前処理操作に一週間以上要する場
合が多く、さらに、菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌
が混入しても区別できない場合もある。 【００１４】そして重要なことは、前述した事情から、
培養すべき検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれ、抗
生物質投与のため死んでいるか静止状態にあるため、培
養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用
いた培養による実際の菌の検出率は10％前後と、非常に
低い。換言すれば、臨床的に感染症の可能性が疑われた
患者の血液をさらに一昼夜以上培養して検査しても結
局、その90％は菌の存在すら判明しないのが現状であ
る。 【００１５】このような状況から、現在は起因菌の確定
と、それに即した抗生物質の選択が要求されているにも
かかわらず、臨床的に感染症の可能性が疑われた段階
で、検出結果が出るのを待たずに治療、すなわち、起因
菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質
を投与し、１、２日間様子を見て、効果が現れないと別
の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼って
いるのである。 【００１６】また、検体中の菌を染色により検出する方
法では、生体成分も菌と同様に染色されるため、検鏡し
て認められる形態によってのみ迅速に菌を判別するの
は、熟練が必要であり、判定が困難な場合もある。 【００１７】このように、感染症は迅速・確実な診断が
求められる疾患であるにもかかわらず、従来の診断方法
では十分対応できていなかったのが実情である。 【００１８】 【課題を解決するための手段】本発明は上記当該技術分
野が抱えている課題に鑑みて完成されたものであり、そ
の要旨とするところは、感染症原因菌、特に敗血症の代
表的起因菌であるクレブシェラ・ニューモニエ菌が保有
するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的な反応性を有するプロ
ーブ、および、当該プローブに含まれるクレブシェラ・
ニューモニエ菌が本質的に保有している遺伝子部分の塩
基配列を解明することにある。 【００１９】すなわち、本発明のプローブにより、例え
ば、食細胞に取り込まれて破壊されつつある菌において
なお維持されている菌のＤＮＡを、ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いてその特異性に基づいて有為に検出でき、
これにより、菌を培養・増殖せずに、感染症疾患の原因
菌が迅速かつ確実に検出できる。また、これらのプロー
ブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれ
ば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法
によるＤＮＡの増幅により、感染症原因菌を同定するこ
とができる。 【００２０】また、ハイブリダイゼーションに用いるプ
ローブを非放射性のもの、例えば、ビオチン化したプロ
ーブを用いれば、放射性同位元素使用施設のない一般検
査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、検出作業が迅
速、簡便に行える。 【００２１】以下に、感染症疾患起因菌であるクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌に由来するプローブの実施例を示
す。 【００２２】 【実施例】 実施例１：クレブシェラ・ニューモニエ菌由来ＤＮＡプ
ローブ (1) クレブシェラ・ニューモニエ菌由来ＤＮＡプロー ブ
の調製 臨床菌株クレブシェラ・ニューモニエをBHI (Brain Hea
rt Infusion)培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、
溶菌ステップでN-Acetylmuramidase SG を加えた、 Sai
to-Miura変法("Preparation of transforming deoxyrib
onucleicacid by phenol treatment", Biochem. Biophy
s. Acta vol. 72, pp.619-629 (1963))に準じて、Genom
ic ＤＮＡを抽出した。 【００２３】抽出したＤＮＡを、制限酵素HindIIIで完
全消化し、ベクターpGEM-3Zにランダムクローニング
し、得られたクローンからクレブシェラ・ニューモニエ
菌特有の、すなわち、天然のクレブシェラ・ニューモニ
エ菌が保有するＤＮＡとの特異反応性を示したＤＮＡ断
片を含む５種のプローブを選抜した。 【００２４】そして選抜された各プローブを、プローブ
KP-77-46、プローブKP-85-43、プローブKP-98-22、プロ
ーブKP-98-33、およびプローブKP-110-32と命名した。 【００２５】(2) クレブシェラ・ニューモニエ菌由来Ｄ
ＮＡプ ローブの種特異性の検討 各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性
を、以下の方法により検討した。 【００２６】まず、検討対象菌株として、下記表１に列
挙した臨床単離株および寄託菌株を準備した。なお、表
１中の、ヒト・ゲノミックＤＮＡおよび対照試料の入手
源として、４名の健康な成人男子から採取した白血球、
ならびにプラスミド pGEM-3Zを含んだ Escherichia col
i K-12, JM109形質転換体をそれぞれ準備した。 【００２７】 【表１】【００２８】そして、各臨床菌株を実施例１(1)に記載
の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、こ
の抽出したＤＮＡの一定量（例えば、10〜100 ng）をナ
イロンフィルターにスポットし、アルカリ変性したもの
をドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料と
した。なお、ヒト・ゲノミックＤＮＡ試料は、前出のSa
ito-Miura変法に、先に入手した白血球を適用すること
で調製した。一方、対照試料は、後述する実施例２(1)
に記載のプラスミドＤＮＡの調製方法に、先に入手した
プラスミド pGEM-3Zを含んだ Es cherichia coli K-12,
JM109 形質転換体を適用することで調製した。次いで、
Digoxigenin-11-dUTP (BRL社製) でラベルしたクレブシ
ェラ・ニューモニエ菌由来のＤＮＡプローブで、マニア
ティスのマニュアル（T. Maniatis,et al., "Molecular
Cloning (A Laboratory ManualSecond Edition)",Cold
Spring Harbour Laboratory (1989))に従い、45％ホル
ムアミド、５×SSC、42℃の条件下で、終夜ハイブリダ
イゼーションを実施した。 【００２９】終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料
を、マニュアルに従い、55℃にて 0.1×SSC 、0.1%SDS
による20分間の洗浄を２回行った後に、 Anti-Dig-ALP
conjugates(BRL社製) で検出・発色させ、ハイブリダイ
ゼーションの状況を確認した。得られた結果は図１に示
すとおりである。図１(a)は、ドット・ブロット・ハイ
ブリダイゼーションを行った各フィルターにスポットし
ておいたＤＮＡの菌株の配置を示し、図１(b)は上記の
それぞれのプローブKP-77-46、KP-85-43、KP-98-22、KP
-98-33およびKP-110-32を用いてハイブリダイゼーショ
ンを行ない発色させた後の結果を示す。 【００３０】各プローブと各臨床菌株のＤＮＡとの反応
性に関する実験結果を、下記表２に示した。 【００３１】 【表２】【００３２】上記図１および表２から明らかなように、
いずれのプローブもクレブシェラ・ニューモニエ菌に由
来するＤＮＡに対してのみ反応性（ハイブリッドの形
成）を示し、それ以外の菌種に対しては反応性が認めら
れず、その種特異性が確認された。 【００３３】実施例２：塩基配列の 解析 実施例１にて種特異性が確認されたＤＮＡプローブ（計
５本）の塩基配列を下記の方法に従って決定した。 【００３４】(1) プラスミドＤＮＡの調製 サブクローン化された（塩基配列を決定すべき）挿入断
片を pGEM-3Z（Promega)に含んだEscheri chia coli K-1
2, JM109形質転換体を、５mlの Luria-BactaniMedium
(bacto-tryptone, 10g/1L; bacto-yeast extract, 5g/1
L; NaCl, 10g/1L; ５Ｎ NaOH でpH 7.0に調整）に植菌
し、一晩培養した。 【００３５】培養液を遠心分離(5,000rpm,５min.）して
集菌した。沈澱物に2.5mg/mlの濃度でリゾチーム(Sigm
a) を含む 50mM グルコース/50mM Tris-HCl(pH8.0)/10m
M EDTA溶液を 100μl 加え、室温で５分間放置した。得
られた懸濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム(S
igma）を含む 0.2Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて混
合した。５Ｍ酢酸カリウム水溶液(pH4.8） 150μl をさ
らに加えて混合し、15分間氷冷した。 【００３６】そして、遠心分離（15,000rpm, 15min.)し
て得た上清を、フェノール/CHCl3処理し、上清に２倍量
のエタノールを加え、さらに遠心分離(12,000rpm, ５mi
n.）して沈澱を得た。この沈澱物を、10mM Tris-HCl (p
H7.5)/0.1mM EDTA溶液 100μl に溶解し、10mg/ml RNas
eA（Sigma)溶液を加え、室温で15分間放置した。 【００３７】この調製物に 0.1M 酢酸ナトリウム水溶液
（pH4.8）を 300μl 加え、フェノール/CHCl3処理し、
上清にエタノールを加えて沈澱を得た。この沈澱物を乾
燥し、10μl の蒸留水に溶解したものをＤＮＡ試料とし
た。 【００３８】(2) 塩基配列決定の前処理 塩基配列決定の前処理を AutoRead(登録商標) Sequenci
ng Kit (Pharmacia)を用いて行った。 【００３９】すなわち、鋳型となるＤＮＡが32μl 溶液
中に５〜10μg の濃度になるように調整した。 1.5mlの
ミニチューブ（エッペンドルフ）に、鋳型DNA 32μl を
移し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μl 加えて穏や
かに混合した。そして、軽く遠心した後、室温で10分間
放置した。 【００４０】３Ｍ酢酸ナトリウム(pH4.8) ７μl と蒸留
水４μl を加え、さらにエタノールを 120μl 加えて混
合し、エタノール・ドライアイス上で15分間放置した。
そして、15分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを集め、注
意しながら上清を除去した。得られた沈澱物を70％エタ
ノールで洗浄し、10分間遠心分離した。そして、注意し
ながら再度上清を除去し、減圧条件下で沈澱物を乾燥し
た。 【００４１】沈澱物を蒸留水10μl に溶解し、螢光性の
プライマー〔Fluorescent Primer,Universal Primer;
5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3'(1.6p
mol/μl; 0.42 A260 unit/ml); Reverse Primer, 5'-Fl
uorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC]-3'(2.1pmol/μl; 0.4
2 A260 unit/ml) 〕２μl (0.42 A260 unit/ml, ４〜６
pmol）とアニーリング用緩衝液２μl を加え穏やかに混
合した。 【００４２】そして、軽く遠心した後、65℃で５分間熱
処理を行い、素早く37℃条件下に置き、そこで10分間保
温した。保温後10分以上室温で放置し、軽く遠心した。 【００４３】そして、延長用緩衝液１μl とジメチルス
ルホキシド３μl を加えたものを試料とした。 【００４４】４本のミニチューブにＡ、Ｃ、ＧおよびＴ
と記入し、それぞれのチューブにＡMix (ddATPをdATP、
dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの) 、Ｃ Mix
(ddCTP をdATP、dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解し
たもの) 、Ｇ Mix (ddGTP をdATP、dCTP、c7dGTPおよび
dTTPと共に溶解したもの) およびＴ Mix(ddTTPをdATP、
dCTP、c7dGTPおよびdTTPと共に溶解したもの) を 2.5μ
l ずつ分注した。なお、それぞれの溶液は使用時までは
氷中で保存し、使用時には37℃で１分間以上保温してか
ら使用した。 【００４５】希釈したT7DNA ポリメラーゼ（Pharmacia;
６〜８units/２μl)２μl をＤＮＡ試料に加え、ピペッ
ティングもしくは穏やかな混合により、完全に混合し
た。 【００４６】混合後すぐに、この混合液を 4.5μl ずつ
保温しておいた４種の溶液に分注した。なお、分注に際
しては新しいチップを用いた。 【００４７】37℃で５分間保温し、停止溶液を５μl ず
つそれぞれの反応液に加えた。 【００４８】この分注においても、新しいチップを用い
た。90℃で２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。
電気泳動には１レーンあたり４〜６μl を泳動した。 【００４９】(3) 塩基配列の決定 実施例１および２に開示した、クレブシェラ・ニューモ
ニエ菌が保有するＤＮＡに対して特異性を有するプロー
ブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温度45℃、泳動時
間６時間として、A.L.F.DNA Sequencer システム(Pharm
acia) を用いて行った。各上流と下流から明らかになっ
た配列から順次プライマーをデザインし、上記の操作を
繰り返した。 【００５０】その結果、プローブKP-77-46（配列番号
１）、プローブKP-85-43（配列番号２）、プローブKP-9
8-22（配列番号３）、プローブKP-98-33（配列番号４）
およびプローブKP-110-32（配列番号５）それぞれの塩
基配列の全容が明らかになった。 【００５１】 【発明の効果】本発明のプローブを用いれば、例えば、
食細胞に取り込まれた感染症原因菌をハイブリダイゼー
ション法を用いて、増殖することなく直接検出し、かつ
菌を迅速にしかも正確に同定できる。すなわち、本発明
のプローブを用いた診断では、１回分の検体で菌の同定
まで行え、診断に要する時間も従来法の３〜４日（検出
される率は低い) から、約１〜２日と飛躍的に短縮で
き、しかもその検出率は格段と高い。それ故、細菌性肺
炎の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、
感染症患者に早期の内に有効な治療が実施でき、ひいて
は死亡率の低減も期待される。 【００５２】また、感染症疾患起因菌の中でも、特にク
レブシェラ・ニューモニエ菌が保有するＤＮＡに特異的
に反応するプローブの塩基配列を明らかにしたことによ
り、これらプローブを人工的に調製することを可能とし
た。さらに、解析した塩基配列の情報の一部を利用して
作製したプライマーを用いて、臨床検体に含まれる感染
症原因菌のＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅して、原因菌
の迅速な診断に役立てることができる。 【００５３】さらに、臨床検体に含まれるGenomic ＤＮ
Ａの塩基配列と本発明によって解析された塩基配列とを
比較参照することにより、感染症や肺炎の起因菌種の迅
速な同定が行える。 【００５４】上記したように、本発明は、所期の目的で
あった感染症診断用プローブを提供するのみならず、Ｐ
ＣＲ用プライマー作製の指針として、また臨床検体に含
まれるGenomic ＤＮＡとの比較参照用に適した標準配列
として優れた有用性が期待され、さらには感染症疾患起
因菌が保有するＤＮＡに特異的に反応するプローブの今
後の探究・開発における貴重な手がかりをもたらすなど
の優れた効果を奏するものである。 【００５５】また、本願出願にて開示した塩基配列は、
臨床分離株のGenomic ＤＮＡをランダムにクローニング
して得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の
有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。 【００５６】さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部
分が存在することは当然考えられるが、上記実施例の開
示から明らかなように、当該ＤＮＡ変異部分が、感染症
診断のためのハイブリダイゼーションへ利用する際の本
発明プローブの特異性、あるいは本願出願にて開示した
塩基配列情報を感染症の迅速診断を目的としたＰＣＲ法
のプライマーをデザインするために利用できる等の、本
発明が奏する有用性には何ら影響を与えるものではな
い。 【００５７】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ： 1941 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-77-46 配列 AAGCTTATCC CGCATCACCT GCCAGAGTGT TTCCGCATCC TCGTGCAGCC GCTCGCACAT 60 GTCGGCCGGG GTATCCATAT CCAGCTCGTT CAGTTTCTCG AGCAACAGCA GCGACTGGTC 120 CTTAATGAAT TTAGCCATAT TGAGGGCGGT TTTTTCCTGC TTCGTCATGT TCTCCATTCC 180 CTTCGGTAAG TTCTCAGCTA AACCAGCCGG ACCAGAAGCG TTTTTTCTTC TGTGTCAGTT 240 CTGTTGTCAA TCTGTCCACT TCGGCCTGGA GTTTCCGGCG CTCATCATCG TGCTGGCGGC 300 GTTCTTCTTC CCGGGATGTT TTATCTTCCA GCATCAGGGT GACAGCCTGC CGGAGATCGG 360 CCAGTTCCTT TTGCATTGCC AGAAGCTGTT CCTGTGGGAA ATTTTTTTGT GTATTTTCAC 420 GGTGTGAAAT GCCGGGAATT TGTTTCTCAG GGATATTCAC ATTTCCGTAT ACACGGATCA 480 GTTCTGACAC ATCCACGACA GGGTTGTTTT TCCCGTCACG TGACACGGTA ACCTTTCCCT 540 GTTTTACATG ATTGTATAGC GTTCTTCTGG TAATGCCCGC GGCTTGTGCT GCCTGTGAAA 600 GGTTGAGCAA TGTTTTCGCC ACTGTATACC CCTGATTTTA TCGGGTGTGA AAGGTGTGTA 660 ATTTCTCACG GTAAATGTAT CGCTGAATTT TACCCGTTTT TCCGTTCAGG ATGTGGTTTT 720 CTGACGCGCT GTGCTTGTCA AACCGGCGAC GGCCACGCAA TGAATTGCGC CCCCGTCATC 780 GGTTATTAGA GGCTGTCTGC CCCCGGATAC CCGGATTCTT TCTGATGCCT GACGGTGACG 840 ATCACAATCC GGTCCATTTC CCGGTCGTGG CGGTAGAGCA TCACATAGCC ACTGTCGCCA 900 AACCCGATCA CCAGTTCCTG ATATTCCAGC GGCAGAAATG GCACCGGGCG GCCAATGTCT 960 GGCAATGTTT TCAGTTGCTG GATAGCCCGG ACGATCACCT CACCGGCTTT TCTGGCTGCC 1020 AGCCGATTTT TGGTTTTGAG AAAGTCCTGG AGGCGTTGTA AATCCTCCTG TGCCAGCGCG 1080 GAAATCGTTA CCTGTGGCAT GGCGGAGCAT CCTGCTCGTT CTCAGTTCCC CAGGTACTTA 1140 TCCAGGCTTC TGCTTCTTCC GCAGTAAGGT GCAGACCCGT TTCCTGATAG TGCTGCCATG 1200 CGGCTTGTCC GTCCCGCAGG TACTGGTGCG CTTCTCTTCC CGGTCGATGT ATTCGGTGAT 1260 TGCCTCCAGC ATTAGCGCGT GCGCTGAGCG GTGCCGGTCA TCGGCCAGCG TTTTCAGCCG 1320 GTCCTTAAGT TCTTCATCGA GCCTGATGGA TGTTGCTGAT GACATAAAAG CCCCTTTGTA 1380 GTCATGTGTA ATACATATGA CTACTTTAAT CCGTGGCGGC GCTATTTGCC AGAAATACGG 1440 CTTTTGCTGC CCATTTTTTC ANTTCGCTTC CCCATTTTTT CACTTCGCTT CCCCATTTTT 1500 TCACTTCGCT TCCACTAATC AGGGCTGCTA CAGGCTCACT CATCATCCAG GACTATTGCA 1560 GCCTGCGGGT TAAAGGACCT GTTACTGGCG GCAACCATCA TCATTGAACT TTTTGGTGGT 1620 GGCTGGTCGC GGATCCTGTA AGCCGTCATT TTTCAGACTG AATTCAAAAT TTATAACCTG 1680 TCGCATTGCC GGGTGCCTGC GGGATATAGC CAGTGCCTCA TTGCCGTCAG CGTTTCCCGA 1740 AAAAAAAGTG ACAGCCGGTA AGCGACACGT TGTCCACTCG TCCATCGTCC AGAATATCAA 1800 ACGTGGCGGT CACCTGACCT TCGATGCGTT TTGCTGCGGC CTGTACCGGG TAGGTTGGCT 1860 GCAGTGTGGT TACGGGTTTT AGTGGTATCG CATGTACCGG AGTGAGGAAC ATGGCCGCCA 1920 GCACTGTCAG AGTAAAAGCT T 1941 配列番号：２ 配列の長さ： １７４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-85-43 配列 AAGCTTTTCT TTCAACCCTG GACAAGATGG CTGAAAAGCA GAAGAACACA GGTAAAGAAA 60 TGTTCGTGGG TGTCAACCGG GTACTGAGCG ATGCAGAATC AAAATCATTT TTCGAAGAAA 120 ACAGAACGCA GTACCCAAAG ATGGACATTA AAATACCGTT TCTTACGGTG CGCGAAACTC 180 TTCTGTACAA ACCCGCATTG AATGCCTCAC AGGTGATGTG CCCGACCCTG ATCGTTATTG 240 CTGGTCAGGA TACGGTTAAT CCACCGGAGC AGGGACGGGC CTTATTTGAC GCGGTGGGGG 300 CCAAAGAAAA AAGGCTATAT GAGGAAAGCA GTGCCCGCCA TTACGACATT TATGCAGGAG 360 AGCACTTTAA GCAGGTTATC AGCATTCAGA CAGAATGGTT TAAAACGCAC TTGTAATTTT 420 AGATAACGAC TTACGGTGGG TTCAACAGAG CCCGCCGTTA TGATAGACGT CAAATGTCGC 480 ATTTTGTAGC TTCGCTTCCG CTGGGCCCTG TAAGGCGCTA CGTTCTCAGG AAGTCTCAGT 540 ATGCTCAGGA ATACTATCCC GATGTCTGTT GGTTACAGGC ACTCGCCGTG AGAAAAGAGT 600 AAGAAATATC CCGGTAACTA ACGGTATAAT AAACAGCATT GATTGAGTTG AAAGTGCATA 660 TCCATATATA TAGCTCTCCA GGCTTACCGC AATCAGAGGA AAAATAAGGA AAACAAGTGA 720 AGCCTGAAAG CACTGGCCTT TTGCTGAAGT GCAAAGTAGC ATAATATTCC AAAAACTCCG 780 GCAAAAGCAC CGAGATACAG GGTGGCCAGT ATTGAGTGCG CTGAGAAGGC TGACACCTGT 840 GGTCTTTCGA AGAGCCATCC TGCCGCAGAA AGTATCAATC CTGCCAGAAA ACACGGTAGC 900 GCGTTAAACG TTATAACAGA GACAGTACAG CTTCTTTTCT TGCATTGGGT GTATATTATG 960 GCATGGATGA TTACGGCTGA AACAAGCGCA AGGATCCCCT GCCAGTGGCT CTCTGTACTT 1020 GTTTTCGTTT CTTCGAGAAG AATACCCGCC AGTGCAACTA TTGCAACAGT TAATCCCGCA 1080 ATCTGCATTG AGTTCGTTTT TTCATTCAAA AATATCACAG AAGCTATCAA AACAGCCACA 1140 GGCATATTCG CAAATATAAT GGAGGCAAGT CCGGAACTGA CATAGGTTTC ACCATAAATC 1200 ATTAATGAAA AAGGAATGGC GAAATAAAAA ATACAGATTC CAAACTGAAA TAATCGTTGT 1260 CCAGGTGGAA ATAAAAGTGG TGTTTTTCTT AACCATGCAA TGCCCATTAA TAATGGTGCC 1320 GCGAACATAA ATCTCATTCC GGTTGCAAAC ACCGGAGGGA TCGTTTCAGC GGCTATCCGC 1380 ATAGCCAGCC ATGTGGTTCC CCAGGTCATT GCAACCAGCA GGAATAATAT CAATATTGTC 1440 ACTCTGCGCA TAAGACGCTC CCAGTAAAAG GAATTAATTT AACTTTTTAG CTGGAGAAAA 1500 ATATTTTTTT CTTTACTGTT TTTTCATACT TTTAGAGAAA ATATTTCTCT TTCAGAAGGG 1560 TGAGATTATG CTGGAAAAAA AAGATAAAGA GCTACTCAGG CTGTTATAGC GCGACTGTAC 1620 CCTGTGTTTG CAGGATCTGG CTGCGGCTGT CGATTTAACG CCTAATCCCT GCTGGAAGCG 1680 CATAAAACGG CTTGAAGATG AGGGGATCAT CACTGGTCGG GTCGCCCTGT TGAGCAAGGA 1740 CAAGCTT 1747 配列番号：３ 配列の長さ： 1988 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-98-22 配列 AAGCTTAGAA TAAAAAGATT TTTCTTCTTC ATAACTTTCT CCATTTTGTA TGTTTATTTG 60 TTTCGTATCC TTATTATTTT TATTTGGCTT ACATATAAAT AAATACAACA ATAATTAATA 120 TAGTCAAGAT GTGTATAATA TTATTGACAA ATATATTTTA ATTAGCTAAT TAATAAATGA 180 ACAGAAAACA AAGGAGAATA AAATGAAATA TTATATGCTA AAACCATTTC GAATAGGAAT 240 CTTAGAGAAC GATATAACTG TTAAAGAATC AGAACAATAT GTGATTATTG ATATAATTAG 300 CGGAGAGGAA ATACTTTATT GTGATGATAA TTGTTATTTA ATTACTCCAA CTTTATTGAA 360 ATCTCTTAAA GATAGCAATC TTACAGGTGT TAATGTTGTA AAGCCTAAAA ATATGAAATT 420 CAGTATTGAA CACAACATGA AACATCCTAA TAAAAGTTTA AGGGAATGGT ATAGACTAAT 480 ACCATTTAAG TATGATAGCG GTAAGAATCA GGAAATATTT CTTGATCAAT ACGACAATCT 540 AATCATAAAT GAACGCATAA AAAATATAAT ATATAATAAG GATGTTCATA GGGTAAAGAG 600 AGCTTTTATA ACAGAATATG AGATTGATAA AGTAGAGCAT CATGATGAAG AAATAATCGA 660 GCAACCTGTT TTTAAGAAGG AAAATAAAAC CACTTTTAAA GATTGGTGTG TTTTCATGTT 720 TATTCTTATA ACTATCATTT ATTTGTTTTT TAAATAAGAG GCTGAAAGAT GAATATCAAA 780 ATCAATGATG GTATTACAGG CGAGATCTTA GTGTTAAATC AAACAACGTT TAACAATGAT 840 GTGGATACTA TACAGTTAAG AATGACACCA GAGTTTTTAG CCCTTATCAA AAGACATTGT 900 TCCGGTGCTA TTGATGTGTC TATATCAGCT TTATTAGATT ATGGAATCAA AAAAATATTA 960 GATGAAAACA TTTCAATCTC AATACAACAA GTTGAGAAAG AAATCGTAAT TGAATCAGTA 1020 AAGCGTGATA GTAGCATTAT TCCATTTACT ACAGTTAACT ATAGAGCATC AAGAAAAGAC 1080 ACACGCCCCG TATTCGTGAG ATTGTGTAAA GATCTAAAAT ATAGGTTAAA AGAAATATCT 1140 CCGACTAAAT ATACACTTTC CGCAATTGGT ATAATAAAGT ATTCGATTGA TACCTTGCTT 1200 AAAAACAATC AGTGCCTGAT AATAAAAAGT GAGGTTATTT ATGAAAAATA AAAACATTGA 1260 ATTTATGCTT AATGCTATTC TTTTTGCTAA GTTTCTTTTA TATCAGGATG AGTTCACAAA 1320 TGAAGAGCTT GAACGTGGTG AAGATGTTCG AAACATAAAA GAGCTTTTCG TATTAAAAAA 1380 TAAAGAATGG ATTAATGATA TTAATACAAT AAGATTAAAG GATATTAACC AAGATATTCA 1440 TATATCATCA ACATACATCA TGTCATTAGA TGGAGTGGGT TATTATGCTT TTTCTAATAA 1500 GTCAGAAGAT GAGTTATACC AATATTTAGT TAATGACCTT TGCGATCATT ATATCGCTGT 1560 AAGTGAAATG TCATTGGAAG ACATAGAGGG AGCTTTAGAG GCAATCGAAG AAGATTTGTT 1620 TGATATATAC CGAAGTAATC TATCTTTAGC CAACAAAATG ATTTTAGATG TTTCAAACAG 1680 ATTTAAAATA AAACCTGATT TGAAAAGACC ATTACTCACC ATCGTTTAAA AAGGGCTGTT 1740 AAGCCCCTTT TATATTGTTC ACTGTTTTAT GATGTGCTAT GTTTACCTTC TAACTTAAAT 1800 GTTGAAAAGG ATAAAACATG AGCGCATTAG GGCATTTTAA TAACATTCGC ACTATCAGAA 1860 AAGAAGCCCA TGAGATGGGC TATGACACCT TCCTTGAGTT CGCTGAAAAG GTTCAAACCG 1920 TTAAGGATGN GTTCCTAAAA GAAGCAGAAG AGGAAAAAGC GAAACAGGCA CTGGTAGAAG 1980 AAAAGCTT 1988 配列番号：４ 配列の長さ： 1484 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-98-33 配列 AAGCTTTTAA TGGAATGAGC GTATTTTTAA ACTAAAAAAA GGATTACATT ATGAATATAT 60 TATCAATAGC ATCAGGCGAA ATAGTGTTTT GTTTATTTAT AGCGTTTTTT ATTTATACAG 120 GCATTAAAAT CAAAAGCAGT AAGAAATTAA CAAAGATATA TAAAAATATA GGATGGGTAG 180 GAGTTGCTTT ATTAGCCTCT TTATTTATAT CAGTTCATTT ATCAAGAGAG GTTCACATTG 240 TTCTATCTCT TATCTTTGTT CACTATTTAA AACTTACTTA TTCAATGACT TTTATTTTGG 300 GTGTTTTCTT CTTAGTAAAG AAAATTTATT CAAAAATAAA AGGTTTTTTC AAGCCAAAGT 360 TTGCGGCATA AGGAGGTTTC AATGAAAGGA CGTAGAAAAG GATTTATCCT GATTGAGTTG 420 TTATTAGTGC TGGTAGTTGC TACTGGCATC GCCGGAGCAA CGTTTTACGG GTATAGCAAG 480 CTGCAGGAAG GGTTCAGAAC AAGCAACGCT ATACGCGATC TGGCTACTAT CAGTAAAGCC 540 ATGAACGCTA TAACAGCTTC TAAGCCCACT ATAGCCGAAG CTAATAGTAT GCTCATCAGT 600 TCAAAGAGTC TTCCTTCTAC GCTGGTAGAC ACCAGAACTA ACACGCTTGT GAATGCCTAT 660 GGCGGTAAGC TCACTATAAC GGCTCACAAC GGCTTGGACG ACTCTTATGA TGTGTCTTTC 720 TACAATGTTC CACTAAGCGC CTGTTCTACG CTTGTAAGCA GCGGTAGGGT GGTTTATAGA 780 AACATAAGCA ACACCACATC AGGATCTAAG ATTGCGGCCA CACCCAGCAT GGCAGACATA 840 ACTGCTTTCT GTTCCAGCTT TAACACCAGT TCAGTGCTTG TTTTTACCAA CGCCGACTAA 900 CCAAAAGCCC CGACCGGGGC TTGTCTTACC TACCTAATAA AAGCCTAATT AACAAATTGA 960 TTTAGCTAGG TTTTATTGGT ACTATCACGC CGATCTGGTG CATAACTGAC CACTTTTATA 1020 ATGAATGAGG GTTGAGTATG AAAAAGTTTA TGGCGGTTGC GGTTATCGGT ATGGCTTCAC 1080 TTCTGGCAGG TTGTAATGAC GGTATTTATG GCGAATACAT CAGTAAGCAG TATGGGGTAA 1140 GGCTTGATAT TCAAAAGGAC GTAATCAAGT TTAAAGACAG CACCTTTAAT GTTAAGTCAT 1200 GGGATGAAAG CCAAAAACCT GTATACATTG CTAAAACACA AAACAAAGAC ATTGGATCTT 1260 TTACTTTCAA AATTGAGAAA GTAAAACAAG GTGTAGTTTA TCAAGGCGTA GTTTTTGAGA 1320 AGGATTAATC AAATGGAAAA GAAAACTGTT CGCTGTCCTT TTTGTGATCA CGAAACAAAA 1380 CACGGCTTAG GTGTGTGTTT ACCTTGCGGA GCAAACATAA CATACGGTAA AGCACCGTTA 1440 TGGTTTGGTC AAATTGGCGC TTTATTATCT GTCGTATTAA GCTT 1484 配列番号：５ 配列の長さ： 1248 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：クレブシエラ・ニューモニエ (Klebsi ella pne
umon iae) 株名：臨床分離株 KP-110-32 配列 AAGCTTAAAT GATTTCTTGG ATGATAAAAA ACGCAAAGAA CAGCACAGGA AACGTCTTGC 60 TGATAAGTTG TTTCACACTG TTCGTTCTGG TAGTGATACA GAGATTCAAT CTGTTATAAA 120 AGAATGTTCA GAAAGTGGCT TAGATTTTAA AGATGTAAAA CATGATTACC TGTTAGAATA 180 TTTTGATTCC TTCCATAACC GCTTTACCCC TCCTTCTATT CCCATTATTA AATTACTTAT 240 TAGCTATCAA AATAACATAT CTCATAAAGC CAAGTTAGCA TTTTGCCGCA ATATATATTA 300 TCGTGGGTTT TTAAACGAAG AAGAGTTATA TGAAATATCC GAATTAATTA TAAAATAAAG 360 TCTCAATATA GATTGACTTA TATTTAAAAT CCCTTATAAA TAATAATATA CACAAATAAA 420 TATAAGAGGG TTTTAAATAT GAATGCTATA AAAGAGATTA AAACAATAGC TTTAGCTCAT 480 GGAATATTAA ACGATATAAG AAAAGGTAGG AACCATAACG AAGTTTTCGC AAGTTCAGAA 540 AGAATAGATG TTGATTATTT AACTAACTAT TTAAGTGGTA AACTTGGAAA GAAAATAACA 600 ACTTTCAAAA GACTTGATGG AATCCTTTCT TACAGCAAAA GAAAAGATCA AATAGTATCA 660 GGTTCTGTTT TCTTCTACGC TCCTGAAAAA AATCAGGACA GTGAGAAAGA GGCTCAGTTC 720 CTTAAGTTGT TAACGTTCAA GTTAGCTCAA AACAATTCAT TTTTCATACA TTTTAAAGAC 780 CAAAGAGAAG GAGGATTATA ATGATATTGG ATTCAATCAG TTTTAATGAA CACGATTACC 840 ACTTGGTTTC TAATACAACA GCGACATACG AAATAAAACT AAAAATAGTC AAAGTTTTAC 900 GTGGGCGTAA GTTTGAAAGA TTCAGGGTAG ATAGTCCGTT TGTAGAAATA CTCAAAGTGG 960 CATATGCCCC GGCAGGTAAG AAAAGAGCAA ATGAAACAAC GAGTATTATT GAGCAAATGA 1020 AAGAGGACTT AACAAACATA GTTCTTGAAG AGGCGGTAAA AACACAGGAT AAGGCAATGA 1080 GTTTTATAAA AGGTGATTCA GATGGAGATG ATAAATGATT TATTGGTGTT AGTAAAAACA 1140 AGTGCGTTTG TGATGGGGTT GTATTTTTCA TGTGTTTATA CAGAAAGAAC ACGAAGAAAC 1200 ATTATAAGGG CGTGGTTTAA AAGGAATATA ATAGTTGTTG AAAAGCTT 1248
【図面の簡単な説明】
【図１】(a)は、ドット・ブロット・ハイブリダイゼー
ションの各フィルターにおけるＤＮＡの菌株の配置を示
し、(b)は各プローブを用いてハイブリダイゼーション
を行ない発色させた後の結果を示す。
ションの各フィルターにおけるＤＮＡの菌株の配置を示
し、(b)は各プローブを用いてハイブリダイゼーション
を行ない発色させた後の結果を示す。
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フロントページの続き
(72)発明者 芥子 宏行
大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30
扶桑薬品工業株式会社 研究開発センタ
ー内
(72)発明者 松久 明生
大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30
扶桑薬品工業株式会社 研究開発センタ
ー内
(56)参考文献 国際公開94／001583（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 感染症疾患起因菌であるクラブシェラ・
ニューモニエ(Klebsiella neumoniae) 菌が保有するＤ
ＮＡを制限酵素HindIIIで処理して得られる配列番号：
１乃至５に記載の塩基配列のうち、少なくとも１つの塩
基配列からなるＤＮＡ断片を含み、かつクラブシェラ・
ニューモニエ菌が保有するＤＮＡと特異的にハイブリッ
ド形成することを特徴とする感染症診断用プローブ。
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