DE10109012A1

DE10109012A1 - Verfahren und Vorrichtung für eine Früherkennung und Verlaufskontrolle von Karies mittels eines Nachweises von Markerbakterien

Info

Publication number: DE10109012A1
Application number: DE10109012A
Authority: DE
Inventors: Georg Conrads
Original assignee: LCL BIOKEY GES fur BIOLOG MED
Current assignee: LCL BIOKEY GES fur BIOLOG MED
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2021-02-24
Also published as: DE10109012B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Probenentnahme-Vorrichtung für eine Früherkennung und Verlaufskontrolle von Karies mittels eines Nachweises von kariogenen Keimen, wobei der Nachweis mittels molekulargenetischer Verfahren, insbesondere unter Verwendung von Gensonden und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ohne eine Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt wird und eine Detektion kariogener Markerbakterien, insbesondere spektrokokkaler Karieserreger der Streptococcus mutans-Gruppe, umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Früherkennung und Verlaufskontrolle von Karies mittels eines Nachweises von kariogenen Markerbakterien gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Probenentnahmekit für die Entnahme von Bakterienproben gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 22.

Die Zahnkaries ist ein schleichender Abbau von Zahnhartsubstanz durch den Verlust von Hydroxylapatitkristallen, der auf die Einwirkung organi scher Säuren und insbesondere der bakteriellen Milchsäure zurückzuführen ist. Durch den Abbau der Mineralmatrix wird die strukturelle Integrität des Zahnes geschädigt. Darüber hinaus entsteht aufgrund der bakteriellen Na tur dieses Prozesses eine chronische "Infektion des Zahnes", die gegebe nenfalls einen Verlust von Zähnen sowie einen Rückgang von, den Zahn unterstützenden, Knochenanteilen (Alveolarknochen) nach sich zieht.

Trotz einer in den Industrieländern rückläufigen Inzidenz von Karies bleibt deshalb der Wunsch nach Früherkennung eines gegebenenfalls erhöhten individuellen Kariesrisikos, insbesondere im Kindesalter, aber auch bei Schwangeren, Müttern von (Klein-)Kindern, bei kieferorthopädischen Patienten, nach restaurativen Maßnahmen an der Zahnmatrix, sowie ganz all gemein bei Patienten mit einem hohen Anspruch im Bereich der Dental- Vorsorge und -Sicherheit, bestehen. Speziell bei Schulkindern wird es für notwendig erachtet, die Bestimmung des Kariesrisikos vorzunehmen, um möglichst frühzeitig Gegenmaßnahmen zur Ausbreitung kariöser Läsionen in der Mundhöhle der Kinder einleiten zu können (z. B. Edelstein B. et al., Policy issues in early childhood caries. Community Dent. Oral Epidemiol. 1998, 26, 96-103). Analog gilt dies selbstverständlich auch für die bereits oben genannten Personengruppen.

Nach dem heutigen Stand der Karies-Theorie sind vier wesentliche Fakto ren an der Entstehung der Karies beteiligt. Diese sind:

1. die Bakterienarten mit ätiologischer Bedeutung,
2. das Wirtsabwehrsystem,
3. Ernährungsfaktoren sowie
4. die Zeit.

Die Karies kann sich entwickeln, wenn diese vier Faktoren zusammentref fen. Der Hauptfaktor bei der Ausprägung einer Zahnkaries sind insbeson dere spezielle Milchsäure-bildende Bakterienarten, die in der Mundhöhle auftreten.

Beim Menschen lassen sich hinsichtlich einer Initiation bzw. Progression einer Karies neben verschiedenen Arten von Laktobazillen hauptsächlich Bakterien der "Streptococcus mutans-Gruppe" isolieren. Hierbei sind ins besondere die Arten Streptococcus (im folgenden abgekürzt als S.) mutans, S. sobrinus, S. cricetus und S. rattus zu nennen.

Diese Bakterienarten fermentieren, speziell spalten, Zuckerarten, insbe sondere Saccharose (Sucrose), ein Dimer aus Fructose und Glucose, mit Hilfe des Enzyms Glucosyltransferase und verstoffwechseln den Fructose- Anteil zu aggressiver Milchsäure mit einem pK_S-Wert von 3,08. Sie nutzen ferner den Glucoseanteil zum Aufbau von schwerlöslichem Dextran, das in dieser besonders adhärenten Form auch als Mutan bezeichnet wird, und das einen Hauptbestandteil der Plaquematrix bildet, die im wesentlichen aus wasserunlöslichen extrazellulären Polysacchariden besteht, die an der Zahnoberfläche fest anhaften. In diese Plaquematrix können sich Bakterien gut einlagern (Marsh P., Martin M., Oral Microbiol. 1992, Chapman and Hall, London).

Die Glucosyltransferase der Mutans-Streptokokken kann daher auch als die hauptsächliche Säure- und Plaquematrix-"Fabrik" der Mundhöhle be zeichnet werden.

Hinsichtlich der Einschätzung des Kariesrisikos wird heutzutage die An zahl der Milchsäure-produzierenden Bakterienarten pro ml Speichel als ein entscheidendes Kriterium angesehen.

Bislang wird die Anzahl der Mutans-Streptokokken und Laktobazillen konventionell mit Kulturverfahren bestimmt. Hierzu sind mehrere kom merziell erhältliche Testsysteme evaluiert, wobei beispielsweise der Den tocult-SM®-Test zu nennen ist, bei dem die Anzahl der Mutans- Streptokokkenkolonien auf der Kunststoffoberfläche eines in Mitis- Salivarius-Bouillon (+Bacitracin) inkubierten und mit Speichel inokulier ten Spatels bestimmt wird. Die Anzahl der "typischen" Kolonien wird durch Vergleich mit einer Referenztabelle bestimmt, womit anschließend auf die Anzahl der Mutans-Streptokokken pro ml Speichel rückgeschlos sen wird (Jalil RA., Correlating Streptococcus mutans counts in saliva with plaque amount, gingival inflammation and caries experience in school children. Singapore Dent. J. 1995, 20, 16-20; Richardson L. et al., Salivary count of Streptococcus mutans in elementary school children, NDA J. 1995, 46, 8-11; Schlagenhauf U., Pommerencke K., Weiger R., Influence of toothbrushing, eating and smoking on Dentocult SM Strip mutans test scores, Oral Microbiol. Immunol. 1995, 10, 98-101; Pienihakkinen K., Jokela J., A simple method for monitoring mutans streptococci in young children, Eur. J. Oral Sci. 1995, 103, 61-62). Weitere, auf Kulturmedien basierende Tests sind beispielsweise der Dentocult-LB®-Test, bei dem azidogene und azidophile Laktobazillen auf einem Rogosa-Agar-beschichteten Objektträger über Inokulation mit frisch sezerniertem Spei chel aufgebracht und nach kultureller Anzüchtung bei 37°C über zwei Ta ge ausgewertet werden. Der CRT-Caries Risk Test® quantifiziert die Mu tans-Streptokokken und Laktobazillen über Selektivmedien (Kneist S. et al., A modified mitis salivarius medium for a caries diagnostic test, J. Dent. Res. 1998, 77, 970, abstract 2712). Ein weiteres Verfahren zur Quantifizie rung der kariogenen Bakterien unter Verwendung ihrer Reduktionswir kung umfaßt die Züchtung der Bakterien bei 37°C in einem Selektivmedi um und die Messung der Farbänderung des Oxidations- Reduktionsindikators Resarzurin. Ferner berichtet eine Arbeitsgruppe der Tokyo Dental University über ein einfaches Verfahren zum Zählen der S. mutans Zellen im Speichel unter Verwendung eines Selektivmediums (Matsukubo, T., Shikagakuhou, Bd. 84 Nr. 1 (1984), 115-117). Ferner wurde ein einfaches Verfahren zur Entnahme der Proben, beispielsweise durch Mikropipettieren (J. Clin. Microbiology 7, S. 82-83) oder mit einem Spatel (J. Clin. Microbiology 9, S. 584-588), entwickelt, um die Zahl von S. mutans im Speichel auf der Basis der Kolonienzahl, die sich nach der direkten Inokulation von Speichel auf eine Mitis-salivarius-Bacitracin- Platte bilden, zu bestimmen.

Alle diese Verfahren erfordern jedoch in den Nachweisschritten eine Inku bation bei einer konstanten Temperatur (im allgemeinen 37°C) und kön nen bis zu einigen Tagen dauern, bis Ergebnisse erhalten werden können. Oft werden die Kolonien noch in der Zahnarzt-Praxis angezüchtet und ausgewertet, was nicht zum normalen Tätigkeitsfeld zahnärztlichen Perso nals gehört und Fehler impliziert. Zudem stellt sich die Frage der Keimbe lastung einer zahnärztlichen Praxis und die Entsorgung von höchst keimbelasteten Materialien vor Ort. Wenn die klinischen Proben aber nicht sofort angezüchtet werden, benötigen die bisher verwendeten Test- Verfahren ein Transportmedium für die Probe, beispielsweise ein VMG II- Transportmedium, da für eine Quantifizierung der relevanten Bakterien eine möglichst große Zahl an kariogenen Bakterien in der Probe bis zur Züchtung in einem externen Labor überleben muss, wobei dies quantitativ nie zu 100% möglich sein wird.

Ein Grundproblem bei der selektiven Anzüchtung, wie sie bei der Kultivie rung von Proben aus Speichel und Plaque mit bis zu 300 darin beschriebe nen Mikroorganismen-Arten unumgänglich erscheint, ist die unterschiedli che Empfindlichkeit der "Individuen" auf selektiven Druck; im weiteren Sinne beispielsweise einem Antibiotikum. Es ist nahezu unmöglich, bei einer großen und gemischten Bakterienpopulation eine selektive Bedin gung so einzustellen, dass alle Individuen einer Art, insbesondere der zu testenden Art, nicht inhibiert, aber alle Individuen der Begleitarten inhi biert werden. Ein in diesen Nachweisverfahren verwendetes Selektivmedi um kann dem gemäß keine vollständige Selektivität für S. mutans als den Haupterreger bei Zahnkaries gewährleisten. Weiterhin ist es möglich, dass in den Kulturmedien enthaltene Substanzen das Wachstum und/oder die Bildung von Kolonien von S. mutans verhindern bzw. verringern oder hemmen. An dieser Stelle seien Substanzen wie Trypan-Blau, die "Chap man-Terullit"-Lösung sowie Zusätze wie Sulfonamid, Bacitracin, Polymi xin oder dergleichen Substanzen genannt.

Von den oben genannten Einschränkungen sind im wesentlichen alle auf dem Markt befindlichen Kulturtests betroffen, so dass aufgrund mangeln der Sensitivität zum einen falsch-positive, als auch bei beispielsweise ü beralterten Medien, falsch-negative Ergebnisse erzielt werden.

In der Vergangenheit wurde versucht, die vorgenannten Nachteile mittels Tests zu umgehen, die auf der Verwendung monoklonaler und/oder po lyklonaler Antikörper zur Erkennung spezifischer Bakterienbereiche beru hen. Hiermit befasst sich beispielsweise das 1992 angemeldete Patent DE 692 13 036. Es ist jedoch aufgrund der komplexen Antigen-Vielfalt im Be reich der Mutans-Streptokokken und der hohen Vielfalt der Begleitbakteri en, multipliziert mit der Vielfalt an Variabilität, die für Oberflächen- Antigene als Adaptation an Wirts- und Umweltbedingungen bekannt sind, bislang nicht gelungen einen in effektiver wie auch effizienter Weise hoch spezifischen und quantitativen Test auf der Basis von S. mutans gerichteten-Antikörpern bis zur Marktreife zu entwickeln.

Im Zuge der vorgenannten Patentschrift wurden daher neue, molekularge netische Verfahren unter Verwendung von DNA-Sonden und Polymerase- Kettenreaktion (PCR) evaluiert, um allgemein pathogene Keime der Mundhöhle nachzuweisen und ein Inzidenzrisiko beurteilen zu können.

So offenbart die EP 0 854 195 A1 ein Verfahren zur Amplifikation eines im Speichel vorkommenden eukaryontischen (beta-Globulin-)Gens. Das dort vorgestellte Verfahren ist jedoch nicht für bakterielle, prokaryontische Gene, wie das die Glucosyltransferase kodierende S. mutans-Gen geeignet.

Die EP 0 957 175 A1 ist zwar prinzipiell auf die Detektion von Bakterien gerichtet, wobei dort als essentielle Vorbehandlung eine Gram-Färbung notwendig ist. Anschließend werden zum Nachweis DNA-Sonden einge setzt. Das dortige Verfahren ist aber nicht zur Detektion von S. mutans e valuiert und darüber hinaus aufgrund der Notwendigkeit einer Gram- Färbung aufwendig.

Weitere Patentschriften befassen sich zwar im wesentlichen mit der Be stimmung von Parodontitis-Erregern. Eine Übertragbarkeit auf Karies- Erreger ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Markergene nicht möglich. Zu nennen sind hier beispielsweise die WO 89 06704 oder die EP 550 610, wobei bei letzterer für eine Gensondendetektion zunächst ein Amplifikat hergestellt wird, und nicht ein originäres "Template" einer Bakterien-DNA nachgewiesen wird. Diese Methode ist dementsprechend aufwendig und entspricht nicht heutigen Anforderungen einer möglichst exakten Keim- Quantifizierung.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dem gemäß darin, ein Verfahren aufzuzeigen, mit dem es möglich ist, Bakterien der S. mutans- Gruppe einfach, kostengünstig und sicher zu diagnostizieren und eine Vor richtung hierfür zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren nach dem Patentanspruch 1 bzw. durch ein Probenentnahmekit nach Patentanspruch 22 gelöst.

Insbesondere wird die Aufgabe durch ein Verfahren für eine Früherken nung und Verlaufskontrolle von Karies mittels eines Nachweises von kari ogenen Keimen gelöst, wobei der Nachweis mittels molekulargenetischer Verfahren ohne eine Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt wird, und eine Detektion kariogener Markerbakterien, insbesondere streptokok kaler Karieserreger, umfasst.

Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens werden erfindungsgemäß Bakterien der S. mutans-Gruppe, insbesondere S. mutans, S. sobrinus, S. rattus sowie S. cricetus detektiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird der Nach weis in zwei, sich vorzugsweise ergänzenden, Stufen durchgeführt, wobei gemäß einer ersten Stufe kariogene Markerbakterien, insbesondere der S. mutans-Gruppe, selektiv mittels der Hybridisierung mit Gensonden detek tiert werden.

Die hierbei verwendeten Gensonden sind gemäß einer Ausführungsform der Erfindung komplementär zu zumindest einer RNA-Sequenz der kario genen Markerbakterien. Die hierfür erforderliche RNA entstammt hierbei vorzugsweise aus im Speichel enthaltenen Bakterien, die beispielsweise lysiert sind und/oder werden. Die RNA-Fraktion dieses Materials wird im Labor isoliert und auf einer Trägerfolie immobilisiert. Erfindungsgemäß kann die RNA auch aus Plaqueproben isoliert werden.

Gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Gensonden komplementär zu zumindest einer 16S rRNA-Sequenz und/oder der vollständigen 16S rRNA der kariogenen Bakterien.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird weiterhin DNase zur Zerstörung eventuell vorhandener DNA verwendet, um eine Beeinflussung des Tests durch vorhandene DNA auszuschließen.

Gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die verwendeten Gensonden gruppenspezifisch, insbesondere spezifisch für die S. mutans-Gruppe, die S. mutans, S. sobrinus, S. rattus und S. cricetus umfaßt. Somit ist mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nur die Detektion einer Art der S. mutans-Gruppe, sondern die simultane Erfas sung der vier, oben genannten, Arten der S. mutans-Gruppe möglich, da diese vorteilhafterweise, wie hier erfindungsgemäß offenbart wird, auf 16S rRNA-Ebene eine nahe verwandte Gruppe ("Cluster") bilden. Dies ist ins besondere deshalb besonders vorteilhaft, da diese vier Arten wesentlich an der Initiation bzw. Progression von Karies beteiligt sind und taxonomisch interessante Markermoleküle, wie beispielsweise die genannte 16S rRNA in hoher Zahl pro Zelle aufweisen.

Die Bindungsspezifität der erfindungsgemäßen Gensonden an die 16S rRNA ist hierbei besonders vorteilhaft, da diese 16S rRNA aufgrund ihrer Beteiligung an der ribosomalen Proteinbildung in jeder Zelle, d. h. jedem Markerbakterium in einer erhöhten Konzentration vorliegt und deshalb leicht detektierbar ist.

Wesentlich an den bezüglich ihrer Basensequenz nachfolgend genannten Gensonden ist, dass sie mindestens zwei Fehlbindungen ("mismatches") zu den entsprechenden Zielsequenzen des nächsten verwandten Bakteriums hinsichtlich dessen 16S rRNA aufweisen.

Gemäß einem Ausführungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden für das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Gensonden, die insbe sondere als Seq.-Nr. 1a und Seq.-Nr. 1b sowie als Seq.-Nr. 2a und Seq.-Nr. 2b bezeichnet werden, verwendet, die die folgenden Basensequenzen auf weisen:

- Seq.-Nr. 1a: GAGCTGTCTC CGATGTAC
- Seq.-Nr. 1b: GAGCTGTCTC CGATGTTC
- Seq.-Nr. 2a: GAGATCGGCTTT CAGAGA
- Seq.-Nr. 2b: GAGATTGGCTTT CAGAGA,

wobei sich die Basensequenzen der im wesentlichen zwei verschiedenen Gensonden SO1 und MU2 zum Nachweis von Karies-Streptokokken in den DNA-Sondentyp SO1 mit der Sequenz

- Seq.-Nr. 1: 5' GAGCTGTCTC CGATGT(A/T)C 3'

und den DNA-Sondentyp MU2 mit der Sequenz

- Seq.-Nr. 2: 5' GAGAT(C/T)GGCTTT CAGAGA 3'

unterteilen lassen.

Diese Gensequenzen der DNA-Sonden weisen, wie bereits erwähnt, zu der entsprechenden Zielsequenz des nächst verwandten Bakteriums auf 16S rRNA-Ebene mindestens zwei Fehlbindungen auf und gewährleisten so mit, dass eine Fehlhybridisierung und somit Fehlinterpretation bzw. Feh lerkennung eines nicht zu der S. mutans-Gruppe gehörenden Bakteriums unterbleibt.

Die Selektivität für diese Gruppe ist somit gewährleistet. Gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Hybridisie rung der gesuchten RNA-Sequenzen markierte, insbesondere radioaktiv und/oder lumineszenzfähig und/oder komplexbildungsfähig markierte Gensonden eingesetzt.

Der hierin begründete Vorteil liegt in der leichteren Nachweis- und Quan tifizierbarkeit der hybridisierten RNA-Sequenzen, wobei die Empfindlich keit der Detektion in der Reihenfolge radioaktiv markiert → lumineszenz fähig → komplexbildungsfähig abnimmt.

Da erfindungsgemäß nicht die die 16S rRNA kodierenden DNA- Sequenzen, sondern die 16S rRNA-Sequenz selbst detektiert wird, ist es im Allgemeinen nicht erforderlich, auf radioaktive Markierung zurückzugrei fen, da die Konzentration der gesuchten RNA deutlich höher als die der kodierenden DNA-Sequenz ist. Der Fachmann kann dies jedoch dennoch tun.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen Hybridisie rungstemperaturen für die Gensonden im Bereich von 36°C bis 56°C, wobei die Hybridisierungstemperatur für den mit Seq.-Nr. 1 bezeichneten Gensondentyp vorzugsweise im Bereich von 49°C bis 55°C und beson ders bevorzugt im Bereich von 51°C bis 53°C liegt, während die Hybridisierungstemperatur für die mit Seq.-Nr. 2 bezeichneten Gensondentypen vor zugsweise im Bereich von 37°C bis 42°C und besonders bevorzugt im Bereich von 39,5°C bis 40,5°C liegt, da die genannten Basensequenzen in diesen Temperaturbereichen eine optimierte "Erkennung" der ihnen kor respondierenden RNA-Sequenz gewährleisten und somit die spezifische Erkennung dieser taxonomisch relevanten Markermoleküle sichergestellt ist.

Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfah rens wird in einer zweiten Stufe ein S. mutans-gruppentypisches Gluco syltransferase-Gen mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) detek tiert.

Erfindungsgemäß wird hierfür die Basensequenz mit der Seq.-Nr. 3, näm lich CATGATGATG GCGACAA als Forward-Primer und die Basense quenz Seq.-Nr. 4 mit der Basenfolge GAGAAACCTT CAAACATGAC GC als Reversed-Primer verwendet.

Um die Anlagerung eines Primers an die jeweilige Basensequenz des Glu colyltransferase-Gens zu ermöglichen, wird dieses zunächst bei einer für die PCR üblichen Denaturierungstemperatur von im wesentlichen 94°C in die Einzelstränge getrennt.

Die erfindungsgemäßen Annealing-Temperaturen für die Anlagerung eines Primers an eine Matrize auf den einsträngigen DNA-Strängen liegen ge mäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion im Bereich von 42°C bis 60°C, bevorzugt im Bereich von 47°C bis 55°C und besonders bevorzugt im Bereich von 49°C bis 50,5°C. Die Elongation der Komplementärstränge erfolgt wiederum bei einer für die PCR charakteristischen Temperatur von maximal 72°C.

Des weiteren wird erfindungsgemäß eine Magnesiumkonzentration ver wendet, die im Bereich von 1,5 mM bis 4,5 mM, bevorzugt im Bereich von 2,5 mM bis 3,5 mM und besonders bevorzugt im Bereich von 2,8 mM bis 3,2 mM liegt. Unter Einhaltung der oben genannten Parameter, insbeson dere im Hinblick auf Annealing-Temperatur und Magnesiumkonzentration wird eine optimale Spezifität der PCR für eine Vervielfältigung des Gluco syltransferase-Gens, das typisch für die S. mutans-Gruppe ist, gewährleis tet. Fehlerkennungen der Primer und eine darin begründete fehlerhafte Amplifikation ist praktisch ausgeschlossen. Gemäß der Spezifität der PCR ist auch eine Amplifikation von DNA von Streptokokken ausgeschlossen, die nicht der S. mutans-Gruppe angehören.

Der letztendliche Nachweis der in der ersten Stufe mittels Gensonden hybridisierten RNA sowie des in der zweiten Stufe mittels der Polymerase- Kettenreaktion vervielfachten Glucosyltransferase-Gens erfolgt mit gängi gen Verfahren, beispielsweise mit Gelelektrophorese in einem Agarose- Gel.

Die Sichtbarmachung erfolgt wie bereits oben genannt ebenfalls über gän gige Verfahren, wie beispielsweise radioaktive Markierung, Lumineszenz- Markierung oder über Komplexierungs- oder enzymatische Reaktionen.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens werden Bakterien der S. mutans-Gruppe zum einen aus dem Speichel gewonnen, während zum anderen auch Abstriche von auffäl ligen Schmelzbereichen der Zahnoberfläche genommen werden. Somit wird mit dem erfindungsgemäßen Testsystem der Tatsache Rechnung ge tragen, dass nicht der sezernierte Speichel, sondern die Zahnoberfläche selbst den primären Standort der Karieserreger darstellt, wobei über eine Korrelation von zumindest einem Testergebnis von zumindest je einer Ab strich- und Speichelprobe auch eine vorliegende Gleichgewichtsverteilung hinsichtlich der Konzentration der Bakterien im Speichel und an der Zahn oberfläche selbst berücksichtigt wird. Das zweistufige System der Detekti on der kariogenen S. mutans-Gruppe garantiert hierbei für eine optimale Sicherheit hinsichtlich der Detektion. Somit ist eine zuverlässige Abschät zung eines Kariesgefährdungspotentials unter Verwendung des vorgestell ten erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, so dass, beispielsweise bei einem erhöhten Kariesrisiko, besondere Maßnahmen, wie beispielsweise eine verbesserte Mineralstoff-, insbesondere Fluoridversorgung, ergriffen werden können.

Ein weiterer wesentlicher Punkt der Erfindung liegt in der Zurverfü gungstellung eines Probenentnahmekits für die sterile Entnahme von Pla que- und/oder Speichelproben, wobei dieses außer einem, insbesondere sterilen und/oder sterilisierbaren und/oder robusten Transportgefäß außer dem einen Abstrich-Pinsel, insbesondere für einen Abstrich eines karies verdächtigen Bereichs sowie Watte, insbesondere ein Watteröllchen zur Aufnahme von Speichel und eine getrennte Aufbewahrungsmöglichkeit für den Abstrich-Pinsel und die Watte in dem Transportgefäß aufweist.

Vorzugsweise ist hierbei ein Abstrich-Pinsel fest mit einer, beispielsweise Kappe und/oder Gehäuse verbunden, so dass es möglich ist, durch ein Er greifen der Kappe den Pinsel über kariesgefährdete Bereiche auf der Zahn oberfläche zu führen und anschließend ohne ein Berühren des Pinsels mit der Hand oder sonstigen nicht sterilen Bereichen diesen in eine Ausspa rung des erfindungsgemäßen Transportgefäßes zurückzustecken.

Des weiteren weist das Probenentnahmekit gemäß einer weiteren Ausfüh rungsform der Erfindung eine sterile und/oder sterilisierbare Pinzette zum Aufnehmen der Watte auf. Im Einsatz wird dem gemäß zunächst eine Ab strichkammer geöffnet und es werden mit dem vorzugsweise Mini-Pinsel Fissuren bzw. Kreideflecken oder fragliche Läsionen abgestreift. An schließend wird der Pinsel, der den Abstrich enthält, in das Gefäß zurück gesteckt. Sodann wird eine Röllchenkammer geöffnet und eine Watteröllchen mit einer sterilen Pinzette herausgenommen und auf die Zunge des Patienten überführt. Nachdem der Patient das Röllchen im wesentlichen 60 Sekunden gekaut und dieses mit Speichel durchtränkt hat, wird dieses, wiederum mit der sterilen Pinzette, in die Röllchenkammer zurückgesteckt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Probenent nahmekit ein steriles Einweg-Kit. Dies bietet den Vorteil, dass eine Reini gung sowie eine Sterilisation des Probenentnahmekits, respektive dessen Abstrichkammer, dessen Abstrich-Pinsels und dessen Röllchenkammer nicht nötig ist, wobei ein neues, steriles Watteröllchen in jedem Fall ersetzt werden muss.

Somit ist anhand der Kombination einer DNA-Sonden-basierten RNA- Hybridisierung mittels den erfindungsgemäßen synthetischen Oligonukleo tid-Sonden mit Speichel als Probenmatrix sowie einer PCR-basierten De tektion des Glucosyltransferase-Gens, insbesondere aus Abstrichproben von auffälligen Zahnbereichen und der Verwendung des erfindungsgemä ßen Probenentnahmekits die Abschätzung eines individuellen Kariogene se-Risikos möglich, mittels der die Notwendigkeit von besonderer Zahn pflege, die Notwendigkeit zur Einschränkung des Zuckerkonsums, die Notwendigkeit von Zahn-Zusatzversicherungen und dergleichen Maßnah men sowie auch das Übertragungspotential von Risikofaktoren von Eltern, insbesondere Müttern auf ihr Kind abgeschätzt werden kann.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteran sprüchen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und einer Abbildung näher erläutert. Hierbei zeigt

Fig. 1 eine Ausführungsform eines Transportgefäßes eines erfin dungsgemäßen Probenentnahmekits.

In der nachfolgenden Beschreibung werden für gleiche oder gleichwirken de Teile dieselben Bezugsziffern verwendet.

Im folgenden wird zunächst die Isolierung einer Nukleinsäure-Fraktion anhand von tiefgefrorenen Referenzbakterien sowie anhand von klini schem Material beschrieben, wobei die Aufarbeitung und Isolation der Nukleinsäure im wesentlichen - bis auf den ersten Schritt - identisch ab läuft.

Nukleinsäure-Isolation

Eine 10 µl Impföse der tiefgefrorenen Referenzbakterien, suspendiert in 250 µl von z. B. Micrognost-Medium bzw. 160 bis 250 µl der suspendier ten Proben klinischen Materials aus Speichel und/oder Plaque werden 10 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert und für 3 Minuten bei 4.500 × g abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wird in 100 µl Aqua bidest/ DEPC (Diethyl-Pyrocarbonat) aufgenommen und suspendiert. Die Suspen sion und das Suspendieren wird noch zweimal wiederholt und anschlie ßend wird das Pellet in 50 µl Aqua bidest/DEPC aufgenommen und re suspendiert. Die Suspension wird für 10 Minuten auf 94°C erwärmt, für 5 Minuten auf Eis gestellt und anschließend 3 Minuten mit 14.926 × g ab zentrifugiert. Der Überstand mit der Gesamt-Nukleinsäure wird zum weite ren Gebrauch in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt. Hierbei wird eine Konzentrationsbestimmung der Lösung durch eine spektrophotometri sche Messung einer 1 : 20-Verdünnung bei λ = 260 nm vorgenommen.

Dieses Verfahren stellt sich als ebenbürtig zu dem sonst häufig verwende ten Lysozym/Phenolextraktionsverfahren heraus, wobei Störungen bei der Hybridisierung durch vermehrte Proteinreste durch die verbesserte Aus beute aufgrund der Kürze des Verfahrens kompensiert werden.

Zur Präparation einer Kationen-freien Nukleinsäure für eine PCR- Anwendung in der zweiten Stufe mit verbesserter Sensitivität wird vor dem Aufkochen eine Behandlung mit einem Kationen-Chelatbildner (z. B. Chelex 100) durchgeführt.

Für die Gensonden-Hybridisierung wird die Nukleinsäure mittels DNase- Behandlung auf die RNA-Fraktion reduziert.

Im weiteren folgt die Beschreibung der Synthese und Markierung der Gen sonde bzw. eines PCR-Primers anhand eines Beispiels.

Synthese und Markierung der Gensonde bzw. des PCR-Primers

Die Synthese der Oligonukleotide erfolgte mit einem DNA-Synthesizer, beispielsweise dem OLIGO 1000 DNA-Synthesizer von Beckman nach dem Cyanoethyl-Phosphoramidit Protokoll und der Festphasenmethodik auf Säulen. Die Oligonukleotide werden mit 32%-iger Ammoniaklösung von der Säule eluiert. Die Schutzgruppen werden durch Inkubation für 90 Minuten bei 70°C abgespalten. Nach dem Eindampfen werden die Sedi mente in 500 µl Aqua bidest aufgenommen und über Sephadex G50 Säulen entsalzt. Abschließend wird die Konzentration des gereinigten Oligo nukleotides bestimmt und Stammlösungen wie folgt hergestellt: 3,6 µg in 50 µl Aqua bidest/DEPC (für die DNA-Sonden) und 13 µg in 100 µl A qua bidest (für die PCR-Primer).

Die zum Nachweis von Bakterien verwendeten Oligonukleotide werden mit Digoxigenin nach dem folgenden Beispiel-Protokoll (hier Boehringer- Mannheim) mit 3' Tailing DIG-11-dUTP wie folgt markiert:

Zu 9 µl einer 3,6 µg pro 50 µl Oligonukleotid-Lösung, die auf Eis gestellt ist, werden 4 µl 5 × Reaktions-Puffer, 4 µl CoCl₂-Lösung, 1 µl DIG-dUTP, 1 µl dATP und 1 µl Terminale Transferase zugegeben. Der Ansatz wird für 15 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend wird 1 µl 200 mM EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 zugegeben. Die Sonden in Stammkon zentrationen zwischen 1 µmol/µl und 5 µmol/µl werden bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.

Gensonden-Detektion

Das Verfahren wurde zum routinemäßigen Nachweis von Nukleinsäuren der Karies-Erreger, die nach der Aufkochmethode isoliert wurden, evalu iert.

Denaturierung der Probennukleinsäuren

Zu einer 10 µl RNA-Lösung werden 20 µl 100%iges Formamid, 7 µl 35%iges Formaldehyd und 2 µl 20 × SSC zugegeben. Das Denaturieren er folgt bei 68°C für 5 Minuten. Die Lösung wird anschließend für 5 Minu ten auf Eis abgekühlt.

Dot-Blot

Die Blot-Kammer wird mit 0,1 M NaOH-Lösung gewaschen und eine pas sende Nylonfolie (z. B. Biodyne B Transfermembran) wird erst mit Aqua bidest, anschließend mit 10 × SSC getränkt und luftblasenfrei auf die Kammerunterseite gelegt. Anschließend wird ein Wasserstrahlpumpen- Vakuum angelegt und alle Probenkanäle (Dots) werden mit ca. 100 µl 20 × SSC durchgespült. Nach dem Entfernen des Vakuums werden die denatu rierten Nukleinsäurelösungen in die Dots in absteigender Menge aufgetra gen (im allgemeinen: 5 ng, 500 pg, 50 pg bei den Kontrollen bzw. z. B. 60 µl der Nukleinsäurefraktion der zu untersuchenden Probe).

Die Nukleinsäuren verbleiben 30 Minuten ohne Vakuum in der Kammer. Während dieser Zeit erfolgt eine Bindung der Nukleinsäure an die Ober fläche der Membran. Anschließend wird die Lösung unter Vakuum abge saugt und jeder Dot mit ca. 100 µl 20 × SSC durchgespült. Die Nukleinsäu ren werden auf der Folie unter UV-Licht (UV-Crosslinker-Technologie) fixiert und, falls sie nicht sofort in der Hybridisierungsreaktion eingesetzt werden können, was jedoch nicht zu empfehlen ist, bei -20°C aufbewahrt.

Nach dem Blotting der denaturierten Nukleinsäure wird die Folie in Hybridisierungslösung eine Stunde bei 50°C mittels einer denaturierten Lachsspermien-DNA-Lösung prähybridisiert. Die eigentliche Hybridisie rung verläuft wie folgt:
Die Blots werden in Kunststoffbeutel von geeigneter Größe eingelegt; 75 µl Hybridisierungslösung pro cm² Blot und Gensonde werden zugegeben und die Kunststoffbeutel werden verschweißt sowie auf Dichtigkeit über prüft und bei, in Abhängigkeit von der eingesetzten Sonde, stringenter Temperatur, die im weiteren genannt ist, im Hybridisierungsofen unter Rotation mindestens für 6 Stunden, besser jedoch über Nacht, inkubiert.

Bei der Dot-Blot Hybridisierung werden 0,5 µl einer 5 µmol/µl Sonden- Stammlösung pro 2,5 ml Hybridisierungslösung zugegeben. Die Endkon zentration beträgt 1 µmol Sonde pro ml.

Nach der Hybridisierung schließt sich ein Waschvorgang an, der nach dem folgenden Protokoll erfolgt:
5 min 2 × SSC/0,5% SDS bei Raumtemperatur; 10-15 min 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur; 20-45 min 0,1 × SSC/0,1% SDS bei stringenter Temperatur, die ebenfalls in Abhängigkeit von der eingesetzten Sonde im weiteren angegeben ist.

Um eine unspezifische Protein-Bindung zu blockieren, wird der Blot 30 Minuten mit z. B. Boehringer Puffer 2 auf dem Schüttler inkubiert; an schließend wird 1 µl/10 ml Lösung Anti-Digoxigenin, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, zugegeben und weitere 30 Minuten inkubiert.

Nach zweimaligem 15-minütigem Waschen in z. B. Boehringer Waschpuf fer und 3-minütigem Äquilibrieren in z. B. Boehringer Puffer 3 werden die Blots mit Chemilumineszenz-Substrat (z. B. CSPD) bedeckt und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die feuchten Blots werden in Folie eingelegt und der Beutel wird für 15 Minuten bei 37°C inkubiert.

Anschließend werden Röntgenfilme für 1, 2, 4 bzw. 15 Minuten exponiert.

Die Hybridisierungsbedingungen sind in nachfolgender Tabelle aufge führt:

Im weiteren wird die PCR-Diagnostik anhand eines Beispiels beschrieben.

Zum spezifischen Nachweis von Mutans-Streptokokken (humane Isolate von S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus) werden verschiedene PCR-Formate ausgetestet. Es werden dabei vier Magnesium- Endkonzentrationen von 1,5 mM bis 4,5 mM und verschiedene Primer/ Matrize-Anlagerungs("Annealing")-Temperaturen im Bereich von 42°C bis 60°C getestet, um die PCR-Reaktionen in ihrer Spezifität zu optimie ren. Bei einer Verwendung der Kombination von Glucosyltransferase- Forward-Primer und -Primer wird mit einer Mg-Konzentration im Bereich von 2,8 mM bis 3,2 mM und einer Annealing-Temperatur im Bereich von 49°C bis 50,5°C das beste Ergebnis erzielt und neben den drei S. mutans sensu stricto-Stämmen (ATCC 25175, GH 354, GH 355) auch S. cricetus (ATCC 19642^T), S. rattus (ATCC 19645^T) und die S. sobrinus-Stämme (ATCC 33478^T, GH 357) amplifiziert. Die nicht-Mutans-Streptokokken führen nicht zu einer Amplifikation.

Gemäß einem Beispiel werden für die Amplifikation 5 µl Nukleinsäure aus Proben, 2,5 µl Glucosyltransferase-Forward-Primer, 2,5 µl Glucosyltrans ferase-Reversed-Primer, 2,5 µl dNTP's, 5 µl 10 × PCR Puffer 3 (35 mM MgCl₂) und 32,5 µl Aqua bidest/DEPC eingesetzt.

Unter diesen Bedingungen erfaßt die Mutans-PCR die bedeutsamsten de signierten Zahnschmelz-Karieserreger.

Im weiteren werden die zur Evaluation eingesetzten Bakterienstämme, die klinischen Materialien, das Entnahmeverfahren, Voruntersuchungen sowie die eingesetzten Substanzen angegeben.

Materialien

Bakterienstämme, die zur Evaluation eingesetzt wurden:
Streptococcus cricetus ATCC 19642^T; S. mutans ATCC 25175^T, GH 354 (Serotyp C), GH 355 (Serotyp E); S. rattus ATCC 19645^T; S. sobrinus ATCC 33478^T, GH 357 (Serotyp G); S. dysgalactiae ATCC 27957; S. sali varius DSM 20067; S. sanguis (klinisches Isolat); S. constellatus AC 1263; S. intermedius DSM 20573; S. salivarius GH 994; S. anginosus AC 2760; S. mitis AC 790, S. agalactiae AC 475.

Klinische Materialien, die zur Evaluation eingesetzt wurden:
117 Speichel- sowie 117 Plaque-Abstrichtupfer von Kindern und Jugendli chen im Alter von 10-16 Jahren. Die Probanden wurden klinisch- anamnetisch untersucht. Es wurden speziell auch die Ernährungsgewohn heiten (z. B. Zuckerkonsum), der DMF-T-Index, die Speichelflußrate, die Pufferkapazität des Speichels und die optische Erscheinung der Zähne (Verfärbung der Fissuren, Kreideflecken, kariöse Läsionen, Schmelzstö rungen, Retentionsstellen für Plaque) zur Ermittlung von aktiver Karies und von Karies-Risikofaktoren, erhoben.

Entnahmeverfahren und Voruntersuchungen

Folgende Voruntersuchung bzw. Befragungen wurden am bzw. mit dem Patienten mit Einwilligung der Eltern vorgenommen:

- Überprüfung von Fissuren und ggf. von Füllungen, ggf. röntgenolo gische Befunderhebung, Prüfung auf Kreideflecken, Erhebung von Hygiene-Indizes

Testrelevante Informationen vom Patienten

- Abstand zwischen Test und der letzten Mahlzeit: 2 h
- Auswählen von 2-3 relevanten Zahnflächen (Fissurenbereich, Krei defleckenbereiche, fragliche Verfärbungsbereiche).

Probenentnahme (vgl. Fig. 1)

- Abstrichkammer 1 öffnen und
- mit Mini-Pinsel 2 Fissuren bzw. Kreideflecken oder fragliche Läsio nen abstreifen;
- Abstrich in Gefäß 3 zurückstecken.
- Röllchenkammer 4 öffnen und
- Watte-Röllchen 5 mit steriler Pinzette (nicht gezeigt) auf die Zunge des Patienten überführen;
- Patient das Röllchen 5 für 30 Sekunden bis 90 Sekunden, insbesonde re für 60 Sekunden kauen, und mit Speichel durchtränken lassen,
- Watteröllchen 5 in die Röllchenkammer 4 zurückstecken.

DNA-Sonden (Beispiel)

SO1 zum Nachweis von Karies-Streptokokken:
Seq.-Nr. 1: 5' GAGCTGTCTC CGATGT(A/T)C 3'
entspricht: Seq.-Nr. 1a: 5' GAGCTGTCTC CGATGTAC 3'
bzw.: Seq.-Nr. 1b: 5' GAGCTGTCTC CGATGTTC 3'

MU2 zum Nachweis von Karies-Streptokokken:
Seq.-Nr. 2: 5' GAGAT(C/T)GGCTTT CAGAGA 3'
entspricht: Seq.-Nr. 2a: 5' GAGATCGGCTTT CAGAGA 3'
bzw.: Seq.-Nr. 2b: 5' GAGATTGGCTTT CAGAGA 3'

PCR-Primer (Beispiel)

GluFor: Forward Primer zum spezifischen Nachweis von Karies- Streptokokken über das Glucosyltransferase-Gen:
Seq.-Nr. 3: 5' CATGATGATG GCGACAA 3'.

GluRev: Reversed Primer zum spezifischen Nachweis von Karies- Streptokokken über das Glucosyltransferase-Gen:
Seq.-Nr. 4: 5' GAGAAACCTT CAAACATGACG C 3'.

Pufferlösungen

Aqua bidest/DEPC: Doppelt destilliertes Wasser ("Aqua bidest") zur Eliminierung von RNasen auf 0,07% DEPC einstellen; 2 h bei 37°C inkubieren und autoklavieren;
Blockierungs-Vorratslösung: Blockierungs-Reagenz 10%ig in z. B. Boehrin ger Puffer 1 ansetzen; Zugabe von 0,07% DEPC; inkubieren und autoklavieren
Boehringer Puffer 1: 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl; mit kon zentrierter NaOH-Lösung auf pH 7,5 (bei 20°C einstellen), Zugabe von 0,07% DEPC; inkubieren und autoklavieren;
Boehringer Puffer 2: Blockierungs-Vorratslösung 1 : 10 in Boehrin ger Puffer 1 verdünnen;
Boehringer Puffer 3: 0,1 M Tris HCl; 0,1 M NaCl; 0,05 M MgCl₂

; auf pH 9,5 einstellen; sterilfiltrieren;
Boehringer Waschpuffer: Boehringer Puffer 1 mit 0,3% Tween 20;
dNTP's-Gebrauchslösung: Jeweils 12,5 µl der z. B. Boehringer dNTP's- Stammlösungen entnehmen und auf 1 ml mit Aqua bidest auffüllen, Endkonzentration der dNTP's: 2 mM;
Lysozymlösung: 25% Sucrose, 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM EDTA; 10 mg/ml Lysozym frisch zusetzen;
NaOH/SDS-Lösung: 0,2 N NaOH, 1% SDS;
Hybridisierungslösung: 6 × SSC, 5 × Denhardt; 0,5% SDS, 2% denatu rierte Lachsspermien-DNA-Lösung;
PCR-Puffer (10 ×): 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8,3);
0,01% (Gew./Vol.) Gelantine;
15 mM MgCl₂

(10 × PCR-Puffer 1) oder
25 mM MgCl₂

(10 × PCR-Puffer 2) oder
35 mM MgCl₂

(10 × PCR-Puffer 3) oder
45 mM MgCl₂

(10 × PCR-Puffer 4);
SDS-Lösung (10% bzw. 20%): 10 bzw. 20 g SDS in 100 ml Aqua bidest sus pendieren und autoklavieren;
SSC (20 ×): 3 M NaCl; 0,3 M Tri-Natriumcitrat; 0,07% DEPC; inkubieren und autoklavieren;
2 × SSC/0,5% SDS: 2 × SSC, 0,5% SDS; 0,07% DEPC; inkubieren und autoklavieren;
2 × SSC/0,1% SDS: 2 × SSC; 0,1% SDS; 0,07% DEPC; inkubieren und autoklavieren;
0,1 SSC/0,1% SDS: 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 0,07% DEPC; inkubie ren und autoklavieren.

Im weiteren folgt ein Vergleich zwischen kommerziellen Kulturtests und den molekulargenetischen Ergebnissen von 117 Patienten (getestet wurde jeweils eine Speichel- und eine Abstrichprobe):

Die 6 Kultur-positiven, aber Gentest-negativen Proben verteilen sich wie folgt:

Die 21 Gentest-positiven, aber Kultur-Test-negativen Proben verteilen sich wie folgt:

Von den 117 getesteten Proben (Speichel kombiniert mit korrespondieren den Plaque-Abstrichen) gab es zwischen Kultur und molekulargenetischen Verfahren 90 (77%) Übereinstimmungen, Die Gentest-Verfahren ergaben zusätzliche 21 Treffer (18%) mit unterschiedlicher Zellzahl. Demgegen über waren nur sechs Kulturpositive Proben in der kombinierten PCR/DNA-Sondentestung negativ.

Unter der Annahme, dass eine Zellzahl von über 100.000 für die Karieser reger als "hochrelevant" anzusehen ist, so war bei keinem solchen Kultur ergebnis die PCR/DNA-Sondentestung negativ; umgekehrt gab es aber un ter den 117 Proben zwei Fälle, in denen die Gensonde eine Zellzahl von größer 100.000 anzeigte bzw. die PCR hoch-positiv war, die Kultur je doch zu keinem Nachweis führte.

Somit ist die molekulargenetische Methode den bisher eingesetzten Kul turverfahren überlegen.

Im weiteren folgt ein Vergleich zwischen kommerziellen Kulturtests, mo lekulargenetischen Test-Ergebnissen und der klinischen Einschätzung ei nes unabhängigen Schul-Zahnarztes von 117 Patienten (getestet wurde je weils eine Speichel- und eine Abstrichprobe):

Hier zeigte sich zwischen den Ergebnissen aus den molekularen Techniken und der klinischen Einschätzung des Zahnarztes eine Übereinstimmung in 95 Fällen (82%). Im Vergleich stimmten kulturelle, selektive Anzüchtung und klinische Einschätzung in 87 Fällen (74%) überein. Abweichungen zwischen der klinischen Einschätzung und (jeglichen) Laboranalysen sind natürlich prinzipiell noch nicht negativ, sondern sogar - in gewissem Maße und mit gewisser Quantität - erwünscht und stets wertvoll für die Ge samt-Prognoseerhebung. Dies sind nämlich die für den Zahnarzt und Pati enten interessanten Fälle einer mikrobiologischen Aktivität bei "klinischer Unauffälligkeit". Das solche Fälle existieren und solche Testverfahren da mit sehr sinnvoll zur Einschätzung eines Kariesrisikos sind, zeigt die hohe Rate an Übereinstimmung in Sensitivität" zwischen den beiden (Kultur, genetische Verfahren) Testverfahren in Fällen klinischer Unauffälligkeit. In 11 Fällen waren genetische Verfahren und Kulturverfahren positiv bei fehlenden klinischen Symptomen, Schließlich haben die hier erfindungs gemäß entwickelten genetischen Verfahren noch zusätzliche 7, die Kultur verfahren davon abweichende 3 Fälle (Probanden) ausfindig gemacht, die klinisch unauffällig, aber in der mikrobiologischen Einschätzung aktiv wa ren.

Die genetischen Verfahren zum Nachweis von Karieserregern der Strepto coccus mutans-Gruppe sind somit gegenüber denjenigen mit Kulturverfah ren insgesamt deutlich leistungsfähiger und sowohl hinsichtlich der Detek tionsempfindlichkeit als auch im Hinblick auf die Detektionsselektivität und die erforderliche Zeitdauer, die bis zur Erlangung von Testergebnissen notwendig ist, deutlich überlegen.

Im weiteren folgen beispielhafte Angaben zur Dimensionierung eines Transportgefäßes eines erfindungsgemäßen Probenentnahmekits.

Beispielmerkmale des Transportgefäßes

An dieser Stelle sei darauf verwiesen, dass alle oben beschriebenen Teile für sich alleine gesehen und in jeder Kombination, insbesondere die in der Zeichnung dargestellten Details als erfindungswesentlich beansprucht werden.

Bezugszeichenliste

1

Abstrichkammer

2

(Mini-)Pinsel

3

(Transport-)Gefäß

4

(Watte-)Röllchenkammer

5

Watte-Röllchen

Claims

1. Verfahren für eine Früherkennung und Verlaufskontrolle von Karies mittels eines Nachweises von kariogenen Keimen, dadurch ge kennzeichnet, dass der Nachweis mittels molekulargenetischer Ver fahren ohne eine Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt wird und eine Detektion kariogener Markerbakterien, insbesondere streptokokkaler Karieserreger, umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Bakte rien der Streptococcus mutans-Gruppe, insbesondere Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus rattus sowie Strepto coccus cricetus, detektiert werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass der Nachweis in zwei Stufen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Stufe durchgeführt wird, indem kariogene Markerbakterien, insbesondere der Streptococcus mutans-Gruppe, mittels der Bindung von Gensonden nachgewiesen werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Stufe durchgeführt wird, indem ein Streptococcus mutans- Gruppen-typisches Glucosyltransferase-Gen mittels einer Polymera se-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gensonden komplementär zu zumindest einer RNA-Sequenz der ka riogenen Markerbakterien sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 6, dadurch gekenn zeichnet, dass die Gensonden komplementär zu zumindest einer 16S rRNA-Sequenz und/oder der vollständigen 16S rRNA der karioge nen Markerbakterien sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 oder 7, dadurch gekenn zeichnet, dass DNase verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, dass Gensonden verwendet werden, die gruppenspezifisch sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, dass synthetische Oligonukleotid-Gen-Sonden verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, dass Gensonden, insbesondere als Seq.-Nr. 1a und Seq.-Nr. 1b sowie als Seq.-Nr. 2a und Seq.-Nr. 2b bezeichnet, ver wendet werden, die die folgenden Basensequenzen aufweisen:

- Seq.-Nr. 1a: GAGCTGTCTC CGATGTAC
- Seq.-Nr. 1b: GAGCTGTCTC CGATGTTC
- Seq.-Nr. 2a: GAGATCGGCTTT CAGAGA
- Seq.-Nr. 2b: GAGATTGGCTTT CAGAGA.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, dass synthetische Oligonukleotid-Gen-Sonden verwendet werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, dass markierte, insbesondere radioaktiv und/oder lumines zenzfähig und/oder komplexbildungsfähig markierte, Gensonden eingesetzt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, dass eine Hybridisierungstemperatur für die Gensonden im Bereich von 36°C bis 56°C liegt, wobei die Hybridisierungstem peratur für die mit Seq.-Nr. 1a und Seq.-Nr. 1b bezeichnete Genson de vorzugsweise im Bereich von 49°C bis 55°C und besonders be vorzugt im Bereich von 51°C bis 53°C und die Hybridisierungstem peratur für die mit Seq.-Nr. 2a und Seq.-Nr. 2b bezeichnete Genson de vorzugsweise im Bereich von 37°C bis 42°C und besonders be vorzugt im Bereich von 39,5°C bis 40,5°C liegt.

15. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass für die Polymerase-Kettenreaktion als Forward-Primer die folgende Basen sequenz Seq.-Nr. 3: CATGATGATG GCGACAA und als Rever sed-Primer die folgende Basensequenz Seq.-Nr. 4: GAGAAACCTT CAAACATGAC GC verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 15, dadurch gekenn zeichnet, dass Annealing-Temperaturen für die Anlagerung eines Primers an eine Matrize für die Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion angewendet werden, die im Bereich von 42°C bis 60°C, bevorzugt im Bereich von 47°C bis 55°C und besonders be vorzugt im Bereich von 49°C bis 50,5°C liegen.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 15 oder 16, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Magnesiumkonzentration verwendet wird, die im Bereich von 1,5 mM bis 4,5 mM, bevorzugt im Bereich von 2,5 mM bis 3,5 mM und besonders bevorzugt im Bereich von 2,8 mM bis 3,2 mM liegt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 15 bis 17, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Amplifikation von DNA von Streptokok ken, die nicht der Streptococcus mutans-Gruppe angehören, nicht stattfindet.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 18, da durch gekennzeichnet, dass der Nachweis kariogener Markerbakte rien anhand des Nachweises der 16S rRNA und/oder des Gluco syltransferase-Gens halbquantitativ ist.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass Abstrichproben von der Zahnoberfläche und/oder Speichelproben verwendet werden.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Korrelation von zumindest einem Tester gebnis von zumindest je einer Abstrich- und Speichelproben vorge nommen wird und daraus Rückschlüsse auf eine Verteilung der Bak terien in der Mundhöhle gezogen und hieraus ein Kariesgefähr dungspotential abgeleitet wird.

22. Probenentnahmekit für die sterile Entnahme von Plaque- und/oder Speichelproben, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes auf weist:
ein Gefäß (3), insbesondere ein steriles und/oder sterilisierba res und/oder robustes Transportgefäß (3);
einen Abstrich-Pinsel (2), insbesondere für einen Abstrich ei nes kariesverdächtigen Bereichs;
Watte (5), insbesondere ein Watteröllchen (5), zur Aufnahme von Speichel;
eine getrennte Aufbewahrungsmöglichkeit für den Abstrich- Pinsel (2) und die Watte (5) in dem Transportgefäß (3).

23. Probenentnahmekit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Probenentnahmekit eine sterile Pinzette umfasst.

24. Probenentnahmekit nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Probenentnahmekit ein steriles Einweg- Kit ist.