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[Arbeitsgebiet der Erfindung]
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Sonde, die zur Detektion und Identifizierung von Streptococcus pyogenes
verwendbar ist, das das verursachende Bakterium von Infektionskrankheiten
wie z. B. Pharyngitis, Rheumatischem Fieber, Nephritis, Erysipel,
Scharlach, Sepsis und ähnlichem
ist.
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[Stand der Technik]
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Generell werden die Krankheiten,
die durch Infektion von pathogenen Mikroorganismen verursacht werden,
Infektionskrankheiten genannt. In der Pathologie wird "Infektion" als eine Invasion
von pathogenen Mikroorganismen (hier weiterhin als "Bakterien" bezeichnet) und
als eine Bildung von Voraussetzungen für das Wachstum im Wirtsorganismus
durch die pathogenen Mikroorganismen definiert. Danach hängt der
Ausbruch des Krankheitsbildes, das durch die Vermehrung der pathogenen
Mikroorganismen in vivo verursacht wird, von der Beziehung zwischen
dem Widerstand des Wirts und der Virulenz der Bakterien ab.
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Streptococcus ist eine Gattung von
gram-positiven fakultativen oder obligaten Anaerobiern, die eine kettenähnliche
Anordnung zeigen. Nach der charakteristischen Erscheinung von hämolytischen
Ringen, die sich um die Kolonien bilden, die auf Blutagarmedium
wachsen, werden die Vertreter dieser Gattung in drei Typen klassifiziert: α, β und γ. Außerdem werden
die Vertreter dieser Gattung weiterhin in 20 Gruppen von A bis V
(außer
I und J) in Abhängigkeit
ihrer Antigenizität
von C-Polysaccharid
klassifiziert, das in den Bakterien enthalten ist (Lancefield-Klassifizierung).
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Streptococcus pyogenes ist ein Vertreter
der Streptococcus-Gruppe A der Lancefield-Klassifizierung, der β-Typ-Hämolyse zeigt
(d. h. vollständige
Hämolyse),
und ist als verursachendes Bakterium menschlicher Pharyngitis, Tonsillitis, Scharlach,
Erysipel, Kindbettfieber, Sepsis und ähnlichem von klinischen Bedeutung. Es
ist ebenso als das verursachende Bakterium für die allergischen Krankheiten
bekannt, die als poststreptococcale Krankheiten, wie z. B. Rheumatisches
Fieber und Nephritis, bezeichnet werden, die der initialen Infektion
nachfolgen. Weiterhin wurde in den vergangenen Jahren ebenso über Fälle berichtet,
die einen schweren septischen Schock mit Myositis aufgrund einer
Infektion mit Streptococcus pyogenes zeigen (Streptococcus Gruppe
A-Infektion vom fulminanten Typ).
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Der Patient, der an Pharyngitis aufgrund
von Streptococcus pyogenes-Infektion
leidet, klagt generell über
trockene Kehle mit signifikantem erythrogenem Pharynx und Schwellung
der Lymphgefäße des Halses als
auch pharyngealem Schmerz, daher können diese klinischen Symptome
die Infektion mit den Bakterien nahelegen und führen zu einer möglichen
Diagnose. Jedoch ist es wünschenswert,
die unnötige
Verabreichung von antibakteriellen Mitteln zu vermeiden, während die
optimale chemische Therapie extrem wichtig ist, um die Komplikationen
nach der Infektion zu vermeiden, und bei Betrachtung einiger Fälle, die
nicht von klaren klinischen Symptomen begleitet sind, ist die Entwicklung
einer schnellen und genauen bakteriologischen Diagnose wünschenswert.
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Zusätzlich wurde berichtet, dass
im Falle einer Streptococcus-Gruppe A-Infektion vom fulminanten Typ mehr als
50% der Fälle
zu Komplikationen mit schwerer nekrotisierender Tasciitis führen, die
daher leicht zu multiplem Organversagen und sogar zum Tode fortschreiten
können.
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Streptococcus pyogenes ist generell
als hochempfindlich gegenüber β-Lactammitteln, wie
z. B. Ampicillin oder Cefaclor, bekannt. Jedoch sind ungefähr 30 der
Bakterienstämme
hochresistent gegenüber
Erythromycin, und das Erscheinen von Ofloxacin-resistenten Stämmen wurde
ebenso berichtet, daher wurde die meiste Aufmerksamkeit auf die
Verabreichung von Makrolidderivaten oder neuen Chinolonderivaten
gerichtet.
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Daher ist es außerordentlich wichtig, eine
genaue Diagnose in einem frühen
Stadium der Infektion durchzuführen
und die optimalen antibakteriellen Mittel in den Fällen der
oben beschriebenen Infektionskrankheiten auszuwählen, die durch Streptococcus
pyogenes verursacht werden.
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Im allgemeinen biologischen Verfahren
ist es vorgeschrieben: (1) die klinischen Symptome zu analysieren;
(2) die Probe zu kultivieren; und (3) Streptococcus pyogenes aus
den Kulturen zu isolieren und zu identifizieren, und dann wird die
therapeutische Strategie bestimmt, nachdem diese Punkte hinreichend
untersucht wurden.
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Das Verfahren, Streptococcus pyogenes
zu identifizieren, umfasst direktes Schmierkultivieren der Probe
auf einer Blutagarplatte, die mit 5% defibriniertem Blut von Schaf
oder Pferd supplementiert wurde, und Aufzeichnen des charakteristischen
Erscheinens der hämolytischen
Ringe um die Kolonien, die auf der Platte gewachsen sind.
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Jedoch ist die Identifizierung der
verursachenden Bakterien immer von Schwierigkeiten begleitet. Die tatsächliche
Identifizierung der verursachenden Bakterien ist aufgrund der Vielfalt
von Formen der Kolonien recht schwierig, die abhängig von den Kulturbedingungen
geformt sind, daher wird die Identifizierung vermieden. Außerdem müssen die
Bakterien aus der Probe für
eine lange Zeit in dem passenden Medium vermehrt werden, damit die
Anzahl groß genug
ist, um den Wirkstoffsensitivitätstest
anzuwenden, und dann werden wenigstens 3 bis 4 Tage Inkubationszeit
benötigt,
um die Ergebnisse des Tests zu erhalten. Daher kann mit dem obigen
Verfahren eine schnelle Diagnose nicht erzielt werden. Außerdem könnte in
Fällen
der Diagnose der Patienten, die schon bei Verdacht einer möglichen
Infektion mit einer hohen Antibiotikadosis behandelt wurden, das
Wachstum und die Vermehrung der Bakterien verhindert werden, auch
wenn die Bakterien in der Probe vorhanden sind. Entsprechend kann
die Durchführbarkeit
einer erfolgreichen Kultur der Bakterien aus diesen Proben extrem
niedrig werden.
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Weiterhin können alternative Teilroutine-Verfahren,
die für
diesen Zweck entwickelt wurden, einschließen: ein instrumentelles Analyseverfahren
von wesentlichen Bestandteilen von Bakterien und Stoffwechselprodukten
von Bakterien (siehe Yoshimi Benno, "Quick identification of bacteria with
gas chromatography", Rinsho
Kensa, Band 29, Nr. 12, Seiten 1618–1623, November 1985, Igaku
Shoin.); ein Verfahren, das einen spezifischen Antikörper verwendet
(siehe provisorische japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-224068)
und ein Hybridisierungsverfahren, das eine Spezifität von DNA
verwendet (provisorische japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-502376),
die jedoch alle Schritte zur Isolierung der Bakterien als auch Schritte
zum Kultivieren und Wachsenlassen der Bakterien benötigen.
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Auf der anderen Seite wurde ein etabliertes
Verfahren basierend auf der Funktion der Phagozyten in den Infektionskrankheiten
vorgeschlagen, worin eine gefärbte
Schmiere von Buffy Coat, in der wesentliche Bestandteile von Leukozyten
aus der Blutprobe konzentriert sind, unter einem optischen Mikroskop
untersucht wird. Allgemein gesprochen ist die Detektionsrate von
Bakterien in Proben von Buffy Coat aus erwachsenen bakteriämischen
Patienten maximal 30%, was ähnlich
zu derjenigen in Blutproben aus Ohrläppchen ist, jedoch wurde berichtet,
dass die Bakterien in sieben von zehn Fällen (70%) detektiert wurden,
wenn die Patienten neugeborene Kinder waren. Daher können Informationen
betreffend die Anwesenheit von Bakterien in peripherem Blut, die
durch mikroskopische Untersuchung einer Schmiere erhalten wurden,
ein wichtiges Leitprinzip für
die therapeutische Behandlung bereitstellen.
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Die oben erwähnten konventionellen Verfahren
machen die Vorbehandlung notwendig, die insgesamt wenigstens drei
bis vier Tage benötigt,
darin sind ein bis zwei Tage für
die selektive Isolierung von Bakterien aus einer Probe enthalten,
ein Tag zur Vermehrung durch Kultivieren und ein oder mehrere Tage
zur Durchführung
der Fixierung, und die Kulturen daraus sollten tatsächlich fortgesetzt
werden, bis die Bakterien ausreichend wachsen, daher kann die Vorbehandlung
eine Woche oder länger
benötigen.
Zusätzlich
können
in einigen Fällen
beliebige andere Bakterien als die verursachenden Bakterien während des
Kulturschrittes kontaminieren, und derartige Kontaminanten können nicht
von den verursachenden Bakterien unterschieden werden.
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Wie oben erwähnt, ist es wichtiger, dass
die Zahl der Bakterien, die auch unter angemessenen Bedingungen
für die
Kultur der verursachenden Bakterien wachsen können, klein sein kann, weil
viele der verursachenden Bakterien in der Probe, die vermehrt und
detektiert werden soll, in Phagozyten aufgenommen wurden und bereits
tot oder in einem bakteriostatischem Stadium aufgrund der verabreichten
Antibiotika sind, daher ist die tatsächliche Detektionsrate von
Bakterien so niedrig wie ungefähr
10%, wenn die klinische Kulturprobe verwendet wird. Mit anderen
Worten kann gegenwärtig
in 90% des untersuchten Blutes von den Patienten mit klinischem
Verdacht auf die Infektion mit Streptococcus pyogenes die Anwesenheit
der Bakterien überhaupt nicht
identifiziert werden, obwohl die Kultur für weitere ein oder mehrere
Tage fortgesetzt wird.
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Obwohl die Bestimmung der verursachenden
Bakterien und die Selektion der Antibiotika, die zum schnellstmöglichen
Töten der
Bakterien geeignet sind, im Lichte der gegenwärtigen obigen Situation eminent wünschenswert
ist, hängt
die gegenwärtig
angewendete Praxis von der therapeutischen Behandlung ab, die initiiert
wird, wenn die Infektion mit Streptococcus pyogenes klinisch auffällig ist,
ohne die Ergebnisse der Detektion der verursachenden Bakterien abzuwarten.
Es wird sozusagen ein Versuchs- und Irrtumsverfahren angewendet,
wobei ein Antibiotikum mit einem weitesten Wirkungsspektrum gegen
viele Arten von Bakterien zuerst verabreicht wird, und als nächstes,
wenn sich das Antibiotikum nach ein oder zwei Tagen nicht als wirksam zeigt,
wird ein anderes Antibiotikum getestet.
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Kürzlich
wurden schnelle Verfahren zur Diagnose von den Infektionen von Sfreptococcus
pyogenes entwickelt, um die Bakterien immunologisch unter Verwendung
von Verfahren zu detektieren, wie z. B. Latex-Agglutinationstest,
Ko-Agglutinationstest,
Enzymimmuntest, Goldpartikeltest und Liposomenimmuntest. Alle diese
Verfahren werden ausgeführt,
indem C-Polysaccharid von den Oberflächen der Bakterienkörper von Streptococcus
pyogenes mit Salpetersäure
oder Enzymen extrahiert wird und die Anwesenheit der Bakterien unter
Verwendung des Polysaccharids als Antigen detektiert wird.
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Jedoch sind die obigen immunologischen
Verfahren problematisch, weil die Ergebnisse davon oft inkonsistent
mit den Ergebnissen sind, die durch Kulturverfahren erhalten werden
(nämlich
zeigen sie falsch positive oder falsch negative Ergebnisse an),
und weil die Tätigkeiten
zur Ausführung
der Verfahren schwierig sind.
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Weiterhin ist die Speziesspezifität dieses
immunologischen Verfahrens aufgrund der Eigenschaften dieses diagnostischen
Verfahrens nicht zufriedenstellend, in dem Antigen-Antikörperreaktionen
verwendet werden, nämlich
wird die Detektion von den Bakterien außer Streptococcus pyogenes
gefordert, die das Gruppe A-Antigen tragen (z. B. Streptococcus
anginosus und ähnliches).
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Mittlerweile wurde ebenso eine diagnostische
Leitlinie für
die klinische Diagnose der Infektionen vorgeschlagen, die durch
Streptococcus der fulminanten Gruppe A verursacht werden (JAMA,
Band 269, 390–391,
1993), jedoch ist sie nicht bei der frühen Diagnose anwendbar.
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Obwohl die Infektionskrankheiten,
die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden, Krankheiten sind,
für die
eine schnelle und saubere Diagnose notwendig ist, konnte das konventionelle
Diagnoseverfahren solchen Anforderungen nicht entsprechen.
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[Offenbarung der Erfindung]
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Die vorliegende Erfindung wurde im
Lichte der oben beschriebenen Probleme dieses Arbeitsgebietes gemacht
und ist auf Sonden zur Diagnose von Infektionskrankheiten gerichtet,
die ein DNA-Fragment umfassen, das durch Behandeln von DNA der verursachenden
Bakterien Sfreptococcus pyogenes mit dem Restriktionsenzym HindIII
erhältlich
ist, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz besteht, die aus
der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 ausgewählt wird,
und wobei die Sonde spezifisch mit der DNA von Streptococcus pyogenes
hybridisiert.
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Entsprechend kann bakterielle DNA,
die zwar noch in den Bakterien enthalten aber im Abbauprozess durch
Phagozytose durch Phagozyten begriffen ist, basierend auf ihrer
Spezifität
durch das Hybridisierungsverfahren signifikant detektiert werden.
Daher kann eine schnelle und saubere Detektion der verursachenden Bakterien
von Infektionskrankheiten ohne Kultur und Vermehrung der Bakterien
erreicht werden. Überdies kann
die Identifizierung der verursachenden Bakterien durch DNA-Amplifizierung unter
Verwendung eines PCR-Verfahrens ohne das Hybridisierungsverfahren
erreicht werden, wenn ein Primer mit Bezug auf die Nukleotidsequenzinformation
der erfindungsgemäßen Sonden
konstruiert wird.
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Desweiteren kann die Sonde, die zur
Hybridisierung verwendet wird, mit nichtradioaktiven Mitteln markiert
werden. Wenn z. B. eine biotinylierte Sonde verwendet wird, kann
die Detektion in einem allgemeinen Untersuchungslabor durchgeführt werden,
das keine Einrichtungen zum Umgang mit Radioisotopen hat. Daher können die
Tätigkeiten
für die
Detektion auf schnelle und einfache Weise durchgeführt werden.
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[Kurze Beschreibung der
Zeichnungen]
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1(a) ist
eine Zeichnung, die die Lage der ursprünglichen Bakterienstämme der
DNAs auf allen Filtern durch Dot-Blot-Hybridisierung zeigt, und 1(b) zeigt die Ergebnisse
aller Sonden, die durch Farbentwicklung nach dem Hybridisierungsprozess
erhalten wurden.
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[Beste Ausführungsform
der Efindung]
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Um die vorliegende Erfindung detaillierter
zu erläutern,
werden unten nichtbeschränkende
Beispiele in Bezug auf die Sonden gezeigt, die aus Streptococcus
pyogenes gewonnen wurden, dem verursachenden Bakterium von Infektionskrankheiten.
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Beispiel 1: DNA-Sonden,
die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
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(1) Herstellen von DNA-Sonden,
die aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
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Ein klinisches Isolat von Streptococcus
pyogenes wurde über
Nacht in BHI-Medium
(Brain Heart Infusion, Gehirn-Herz-Infusion) kultiviert, dann wurden
die kultivierten Zellen geerntet, und genomische DNA wurde daraus
entsprechend dem modifizierten Saito-Miura-Verfahren ("Preparation of transforming
deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta, Band 72, Seiten
619–629
(1963)) extrahiert, wobei der Zelllyseschritt durch Hinzufügen von
N-Acetylmuramidase SG zum Lysepuffer durchgeführt wurde.
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Die extrahierte DNA wurde vollständig durch
das Restriktionsenzym HindIII verdaut, dann in den Vektor pGEM-3Z
zufällig
kloniert. Sechs Sonden, die spezifisch für Streptococcus pyogenes waren,
d. h. die Sonden, die DNA-Fragmente umfaßten, die spezifische Reaktivitäten gegenüber DNA
zeigten, die in natürlichen Streptococcus
pyogenes enthalten ist, wurden aus den dadurch erhaltenen Klonen
selektiert.
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Danach wurden die selektierten Sonden
bezeichnet: Sonde SP-6-28, Sonde SP-7-44, Sonde SP-14-1, Sonde SP-26-36,
Sonde SP-26-46 und Sonde SP-55-3.
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(2) Studien der Speziesspezifität der DNA-Sonden,
die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
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Wechselwirkungen zwischen jeder Sonde
und DNA von verschiedenen Arten infektionsverursachender Bakterienstämme wurden
wie folgt studiert.
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Zuerst wurden klinische Isolate und
hinterlegte Bakterienstämme
hergestellt wie in Tabelle 1 unten aufgelistet. Um die Quellen von
menschlicher genomischer DNA in Tabelle 1 und eine Kontrollprobe
zu erhalten, wurden Leukozyten, die von vier gesunden erwachsenen
Männern
gesammelt wurden, bzw. Escherichia coli K-12, JM109-Transformanten hergestellt,
die das Plasmid pGEM-3Z enthalten.
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[Abkürzung]
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- NYSDH
- New York State Department
of Health (Gesundheitsministerium des Staates New York, Albany, New
York, USA)
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Danach wurde die DNA, die in jeder
der klinischen Isolate enthalten war, entsprechend dem Verfahren beschrieben
in Beispiel 1(1) extrahiert, dann wurde ein Aliquot der extrahierten
DNA (z. B. 10–100
ng) auf ein Nylonfilter gespottet. Nach Denaturieren mit Alkali
wurde das Filter einer Dot-Blot-Hybridisierung unterworfen. Die
menschliche genomische DNA-Probe wurde aus den Leukozyten, die wie
früher
erwähnt
erhalten wurden, unter Verwendung des modifizierten Saito-Miura-Verfahrens (supra)
hergestellt. Eine Kontrollprobe wurde aus Escherichia coli K-12,
JM109-Transformanten, die das Plasmid pGEM-3Z enthielten, unter
Verwendung des Herstellungsverfahrens für Plasmid-DNA hergestellt,
das im folgenden Beispiel 2(1) beschrieben ist. Dann wurde eine
Hybridisierung über
Nacht unter Verwendung einer Digoxigenin-11-dUTP (BRL)-markierten DNA-Sonde
durchgeführt,
die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurde, wobei die Hybridisierungsbedingungen
45% Formamid, 5 × SSC
bei 42°C
entsprechend dem Handbuch Maniatis (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning
(A Laboratory Manual)",
2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory (1989)) waren.
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Nach der Hybridisierung über Nacht
wurden die Proben zweimal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C für 20 min
entsprechend dem Handbuch gewaschen, gefolgt von einer Farbentwicklung
und Detektion unter Verwendung von Anti-Dig-ALP-Konjugaten (BRL), dadurch wurden
Hybridisierungsergebnisse erhalten. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, wobei 1(a) die Lage der ursprünglichen
Bakterienstämme
der DNAs auf allen Filtern durch Dot-Blot-Hybridisierung zeigt,
und 1(b) zeigt die Ergebnisse
aller erwähnten
Sonden SP-6-28, SP-7-44, SP- 14-1,
SP-26-36, SP-26-46 und SP-55-3, die durch Farbentwicklung nach dem
Hybridisierungsprozess erhalten wurden.
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Die experimentellen Ergebnisse in
Bezug auf die Reaktivitäten
zwischen jeder Sonde und DNAs jeder der klinischen Bakterienstämme sind
in Tabelle 2 unten gezeigt.
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[Anmerkungen]
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- +
- Hybridisierungsignal
detektiert
- –
- kein Hybridisierungssignal
detektiert
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Wie aus den obigen Tabellen 1 und
2 offensichtlich ist, zeigten alle vorliegenden Sonden Reaktivitäten nur
zu der DNA, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurde, während keine
Reaktivität
(z. B. Hybridbildung) gegenüber
DNAs aller anderen Bakterienspezies der Gattung Streptococcus als
auch gegenüber DNAs
der zu der Gattung Streptococcus unterschiedlichen Bakterienspezies
beobachtet wurde. Daher wurde die Spezifität der Sonden gezeigt.
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Beispiel 2: Analyse der
Basensequenz
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Alle Basensequenzen der DNA-Sonden
(insgesamt sechs Sonden), deren Speziesspezifität im obigen Beispiel 1 gezeigt
wurde, wurden entsprechend dem folgenden Verfahren bestimmt.
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(1) Herstellung von Plasmid-DNA
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Escherichia coli K-12, JM109-Transformanten,
worin das subklonierte Insertfragment (das sequenziert werden soll)
in pGEM-3Z (Promega) enthalten ist, wurden in 5 ml Luria-Bactani-Medium
geimpft (Bakto-Trypton, 10 g/1 l; Bakto-Hefeextrakt, 5 g/1 l; NaCl 10 g/1 l;
pH 7,0 mit 5N NaOH eingestellt) und über Nacht kultiviert.
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Die flüssige Kulturmischung wurde
zentrifugiert (5.000 rpm, 5 min), um die Bakterien zu sammeln. 100 μl einer Lösung von
50 mM Glukose/50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA, die 2,5 mg/ml
Lysozym (Sigma) enthielt, wurde dem Präzipitat hinzugefügt und bei
Raumtemperatur für
5 Minuten stehengelassen. 0,2 M NaOH-Lösung,
die 1% Natriumdodekylsulfat enthielt (Sigma), wurde der Suspension
hinzugefügt
und gemischt. 150 μl
wässerige
5 M Kaliumazetatlösung
(pH 4,8) wurde weiterhin hinzugefügt und gemischt, dann wurde
für 15
Minuten auf Eis gekühlt.
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Der Überstand der Mischung, die
durch Zentrifugieren (15.000 rpm, 15 min) gesammelt wurde, wurde mit
Phenol/CHCl3 behandelt, und das zweifache
Volumen Ethanol wurde hinzugefügt,
dann wurde das Präzipitat
nochmals durch Zentrifugieren (12.000 rpm, 5 min) erhalten. Dies
Präzipitat
wurde in 100 μl
einer Lösung von
10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, gefolgt von Hinzufügen von
10 mg/ml Lösung
von RNAse A (Sigma), dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur
für 15
Minuten stehengelassen.
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300 μl einer wässerigen 0,1 M Natriumazetatlösung (pH
4,8) wurden dieser Mischung hinzugefügt und mit Phenol/CHCl3 behandelt, dann wurde das Präzipitat
davon erhalten, indem Ethanol dem Überstand hinzugefügt wurde.
Dies Präzipitat
wurde getrocknet und in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst,
um eine DNA-Probe zu erhalten.
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(2) Vorbehandlung zum
Sequenzieren
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Eine Vorbehandlung zum Sequenzieren
wurde mit einem AutoReadTM Sequenzierungskit
(Pharmacia) durchgeführt.
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Die Konzentration der als Template
verwendeten DNA wurde auf 5–10 μg in 32 μl Lösung eingestellt. 32 μl der DNA-Lösung des
Templates wurden in ein Minigefäß gebracht
(1,5 ml, Eppendorf), und 8 μl
einer wässerigen
2 M NaOH-Lösung wurden
hinzugefügt
und dann leicht gemischt. Nach sofortigem Zentrifugieren wurde sie
bei Raumtemperatur für
10 Minuten stehengelassen.
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7 μl
3 M Natriumacetat (pH 4,8) und 4 μl
destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, gefolgt von 120 μl Ethanol,
und nach Mischen wurde die Mischung für 15 Minuten auf Ethanol/Trockeneis
stehengelassen. DNA, die durch Zentrifugieren für 15 Minuten präzipitiert
wurde, wurde gesammelt, und der Überstand
wurde sorgfältig
entfernt. Das dadurch erhaltene Präzipitat wurde mit 70%igem Ethanol
gewaschen und für
10 Minuten zentrifugiert. Dann wurde das Präzipitat unter reduziertem Druck
getrocknet, nachdem der Überstand
nochmals sorgfältig
entfernt wurde.
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Das Präzipitat wurde in 10 μl destilliertem
Wasser gelöst,
dann wurden 2 μl
fluoreszierender Primen (0,42 A260 Einheiten/ml,
4–6 pmol
(fluoreszierender Primen; Universalprimen: 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
(SEQ ID NO: 7)]-3' (1,6
pmol/μl
0,42 A260 Einheiten/ml); Reverser Primer:
5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC
(SEQ ID NO: 8)]-3' (2,1
pmol/μl
0,42 A260 Einheiten/ml) und 2 μl Annealingpuffer
hinzugefügt
und leicht gemischt.
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Nach sofortiger Zentrifugation wurde
die Mischung bei 65°C
für 5 Minuten
hitzebehandelt und schnell in eine Umgebung von 37°C gebracht,
und die Temperatur wurde für
10 Minuten gehalten. Nachdem die Temperatur gehalten wurde, wurde
die Mischung bei Raumtemperatur für mehr als 10 Minuten stehengelassen
und sofort zentrifugiert.
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Dann wurde die Probe durch Hinzufügen von
1 μl Elongationspuffer
und 3 μl
Dimethylsulfoxid hergestellt.
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Vier Minigefäße wurden mit einer der Markierungen "A", "C", "G" und "T" gekennzeichnet,
und entsprechend der Kennzeichnung wurden 2,5 μl A-Mix (gelöstes ddATP mit dATP, dCTP,
c7dGTP und dTTP), C-Mix (gelöstes ddCTP
mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP), G-Mix
(gelöstes
ddGTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) oder
T-Mix (gelöstes
ddTTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) in
jedes gekennzeichnete Gefäß gebracht.
Alle Lösungen
wurden bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt und wurden vor der
Verwendung für
eine Minute oder mehr bei 37°C
inkubiert.
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2 μl
verdünnter
T7-DNA-Polymerase (Pharmacia; 6–8
Einheiten/2 μl)
wurden der DNA-Probe hinzugefügt
und vollständig
durch Pipettieren gemischt oder leicht gemischt.
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Unmittelbar nach Beenden des Mischens
wurde die gemischte Lösung
auf 4,5 μl
der jeweils vier Lösungsarten
verteilt, die bei derselben Temperatur inkubiert wurden. Frische
Spitzen wurden für
jede Verteilung verwendet.
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Die Lösungen wurden für 5 Minuten
bei 37°C
gehalten, dann wurden 5 μl
Terminationslösung
zur jeder Reaktionsmischung hinzugefügt.
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Für
diesen Schritt wurden ebenso frische Spitzen verwendet. Unmittelbar
nach Inkubieren der Lösung für 2–3 Minuten
bei 90°C
wurde sie auf Eis gekühlt.
Pro Spur wurden vier bis sechs μl
der Lösung
für die
Elektrophorese verwendet.
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(3) Seguenzierung der
Basensequenzen
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Sequenzieren der Basensequenzen der
Sonden, die in den Beispielen 1 und 2 offenbart wurden und die die
Spezifität
für DNA
von Strepfococcus pyogenes haben, wurde unter Verwendung des A.
L. F.-DNA-Sequenzierungssystems (Pharmacia) unter Elektrophoresebedingungen
von 45°C
für 6 Stunden
durchgeführt. Primer
wurden seriell basierend auf den Sequenzen konstruiert, die von
jeder der stromaufwärts
und stromabwärts
liegenden Sequenzen aufgeklärt
wurden, und die oben beschriebenen Verfahren wurden wiederholt.
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Folglich wurden die vollständigen Basensequenzen
der Sonde SP-6-28 (SEQ ID NO: 1), der Sonde SP-7-44 (SEQ ID NO:
2), der Sonde SP-14-1 (SEQ ID NO: 3), der Sonde SP-26-36 (SEQ ID
NO: 4), der Sonde SP-26-46 (SEQ ID NO: 5) und der Sonde SP-55-3
(SEQ ID NO: 6) aufgeklärt.
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[Industrielle Anwendbarkeit]
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Durch Verwenden der erfindungsgemäßen Sonden
können
verursachende Bakterien, die von Phagozyten aufgenommen wurden,
schnell und sauber direkt z. B. durch ein Hybridisierungsverfahren
ohne Vermehrung der Bakterien identifiziert werden. Mit anderen
Worten ermöglicht
die Diagnose unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden das Identifizieren
der verursachenden Bakterien durch eine einzige Probe, weiterhin
kann die notwendige Zeit zur Diagnose auf ungefähr 1 bis 2 Tage vermindert
werden, während
das konventionelle Verfahren mit niedriger Detektionsrate 3–4 Tage
benötigt,
und die resultierende Detektionsrate wird beachtlich verbessert.
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Daher offenbart die vorliegende Anmeldung
Leitprinzipien für
die therapeutische Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch
Streptococcus pyogenes verursacht werden, und zusätzlich kann
die effektive Behandlung in einem frühen Stadium der Infektion an
die Patienten angepaßt
werden, was zu einer Verminderung der Mortalität führen kann.
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Zusätzlich wurde in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung, worin die Basensequenzen der Sonden
aufgeklärt
wurden, die spezifisch mit der DNA reagieren, die aus Streptococcus
pyogenes unter mehreren verursachenden Bakterien der Infektionskrankheiten
gewonnen wurde, die künstliche
Herstellung dieser Sonden möglich. Überdies
kann ein Teil der Informationen der Basensequenzen, die hier bereitgestellt
werden, zur Herstellung von Primern verwendet werden, die zur schnellen
Diagnose durch Amplifizieren durch ein PCR- Verfahren von DNA von verursachenden
Bakterien, die in der klinischen Probe enthalten sind, verwendbar
sind.
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Außerdem kann die schnelle Identifizierung
der verursachenden Bakterien durch Vergleichen der Basensequenzen
genomischer DNA aus der klinischen Probe mit Basensequenzen ausgeführt werden,
die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
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Wie oben angegeben stellt die vorliegende
Erfindung die gewünschte
Sonde zur Diagnose der Infektionen bereit, ferner können hervorragende
Mittel wie Leitprinzipien für
die Herstellung von Primern zur PCR als auch Standardsequenzen,
die zum Vergleich genomischer DNA geeignet sind, die in der klinischen
Probe enthalten ist, erwartet werden. Überdies kann die vorliegende
Erfindung nützliche
Wirkungen durch Bereitstellung wertvoller Anhaltspunkte zur Herstellung
und Entwicklung neuer Sonden ausüben,
die spezifisch mit der DNA verursachender Bakterien der Infektionskrankheiten
reagieren.
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Weiterhin wurde die Basensequenz,
die in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, durch Zufallsklonieren
genomischer DNA klinischer Isolate erhalten, daher sollten die Verwendungen
der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung den komplementären Strang
davon umfassen.
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Zusätzlich könnte vermutet werden, dass
DNA, die aus wilden Stämmen
erhalten wird, einen mutierten Anteil enthalten könnte. Wie
aus der Offenbarung der obigen Beispiele ersichtlich ist, würden derartige
mutierte DNA-Anteile jedoch nicht die Verwendungen beeinflussen,
die aus der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden sollten, die
die Spezifität
der erfindungsgemäßen Sonde
im Hybridisierungsverfahren zur Diagnose von Infektionen und Verwendungen
der Informationen der Basensequenzen umfassen, die in der vorliegenden
Anmeldung zur Konstruktion der Primer offenbart werden, die für die PCR-Techniken
mit dem Ziel einer schnellen Diagnose der Infektionen verwendet
werden sollen.
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