DE69821344T2 - Sonden zum nachweis von durch streptococcus pyogenes hervorgerufenen infektionen - Google Patents

Sonden zum nachweis von durch streptococcus pyogenes hervorgerufenen infektionen Download PDF

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Description

  • [Arbeitsgebiet der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Sonde, die zur Detektion und Identifizierung von Streptococcus pyogenes verwendbar ist, das das verursachende Bakterium von Infektionskrankheiten wie z. B. Pharyngitis, Rheumatischem Fieber, Nephritis, Erysipel, Scharlach, Sepsis und ähnlichem ist.
  • [Stand der Technik]
  • Generell werden die Krankheiten, die durch Infektion von pathogenen Mikroorganismen verursacht werden, Infektionskrankheiten genannt. In der Pathologie wird "Infektion" als eine Invasion von pathogenen Mikroorganismen (hier weiterhin als "Bakterien" bezeichnet) und als eine Bildung von Voraussetzungen für das Wachstum im Wirtsorganismus durch die pathogenen Mikroorganismen definiert. Danach hängt der Ausbruch des Krankheitsbildes, das durch die Vermehrung der pathogenen Mikroorganismen in vivo verursacht wird, von der Beziehung zwischen dem Widerstand des Wirts und der Virulenz der Bakterien ab.
  • Streptococcus ist eine Gattung von gram-positiven fakultativen oder obligaten Anaerobiern, die eine kettenähnliche Anordnung zeigen. Nach der charakteristischen Erscheinung von hämolytischen Ringen, die sich um die Kolonien bilden, die auf Blutagarmedium wachsen, werden die Vertreter dieser Gattung in drei Typen klassifiziert: α, β und γ. Außerdem werden die Vertreter dieser Gattung weiterhin in 20 Gruppen von A bis V (außer I und J) in Abhängigkeit ihrer Antigenizität von C-Polysaccharid klassifiziert, das in den Bakterien enthalten ist (Lancefield-Klassifizierung).
  • Streptococcus pyogenes ist ein Vertreter der Streptococcus-Gruppe A der Lancefield-Klassifizierung, der β-Typ-Hämolyse zeigt (d. h. vollständige Hämolyse), und ist als verursachendes Bakterium menschlicher Pharyngitis, Tonsillitis, Scharlach, Erysipel, Kindbettfieber, Sepsis und ähnlichem von klinischen Bedeutung. Es ist ebenso als das verursachende Bakterium für die allergischen Krankheiten bekannt, die als poststreptococcale Krankheiten, wie z. B. Rheumatisches Fieber und Nephritis, bezeichnet werden, die der initialen Infektion nachfolgen. Weiterhin wurde in den vergangenen Jahren ebenso über Fälle berichtet, die einen schweren septischen Schock mit Myositis aufgrund einer Infektion mit Streptococcus pyogenes zeigen (Streptococcus Gruppe A-Infektion vom fulminanten Typ).
  • Der Patient, der an Pharyngitis aufgrund von Streptococcus pyogenes-Infektion leidet, klagt generell über trockene Kehle mit signifikantem erythrogenem Pharynx und Schwellung der Lymphgefäße des Halses als auch pharyngealem Schmerz, daher können diese klinischen Symptome die Infektion mit den Bakterien nahelegen und führen zu einer möglichen Diagnose. Jedoch ist es wünschenswert, die unnötige Verabreichung von antibakteriellen Mitteln zu vermeiden, während die optimale chemische Therapie extrem wichtig ist, um die Komplikationen nach der Infektion zu vermeiden, und bei Betrachtung einiger Fälle, die nicht von klaren klinischen Symptomen begleitet sind, ist die Entwicklung einer schnellen und genauen bakteriologischen Diagnose wünschenswert.
  • Zusätzlich wurde berichtet, dass im Falle einer Streptococcus-Gruppe A-Infektion vom fulminanten Typ mehr als 50% der Fälle zu Komplikationen mit schwerer nekrotisierender Tasciitis führen, die daher leicht zu multiplem Organversagen und sogar zum Tode fortschreiten können.
  • Streptococcus pyogenes ist generell als hochempfindlich gegenüber β-Lactammitteln, wie z. B. Ampicillin oder Cefaclor, bekannt. Jedoch sind ungefähr 30 der Bakterienstämme hochresistent gegenüber Erythromycin, und das Erscheinen von Ofloxacin-resistenten Stämmen wurde ebenso berichtet, daher wurde die meiste Aufmerksamkeit auf die Verabreichung von Makrolidderivaten oder neuen Chinolonderivaten gerichtet.
  • Daher ist es außerordentlich wichtig, eine genaue Diagnose in einem frühen Stadium der Infektion durchzuführen und die optimalen antibakteriellen Mittel in den Fällen der oben beschriebenen Infektionskrankheiten auszuwählen, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden.
  • Im allgemeinen biologischen Verfahren ist es vorgeschrieben: (1) die klinischen Symptome zu analysieren; (2) die Probe zu kultivieren; und (3) Streptococcus pyogenes aus den Kulturen zu isolieren und zu identifizieren, und dann wird die therapeutische Strategie bestimmt, nachdem diese Punkte hinreichend untersucht wurden.
  • Das Verfahren, Streptococcus pyogenes zu identifizieren, umfasst direktes Schmierkultivieren der Probe auf einer Blutagarplatte, die mit 5% defibriniertem Blut von Schaf oder Pferd supplementiert wurde, und Aufzeichnen des charakteristischen Erscheinens der hämolytischen Ringe um die Kolonien, die auf der Platte gewachsen sind.
  • Jedoch ist die Identifizierung der verursachenden Bakterien immer von Schwierigkeiten begleitet. Die tatsächliche Identifizierung der verursachenden Bakterien ist aufgrund der Vielfalt von Formen der Kolonien recht schwierig, die abhängig von den Kulturbedingungen geformt sind, daher wird die Identifizierung vermieden. Außerdem müssen die Bakterien aus der Probe für eine lange Zeit in dem passenden Medium vermehrt werden, damit die Anzahl groß genug ist, um den Wirkstoffsensitivitätstest anzuwenden, und dann werden wenigstens 3 bis 4 Tage Inkubationszeit benötigt, um die Ergebnisse des Tests zu erhalten. Daher kann mit dem obigen Verfahren eine schnelle Diagnose nicht erzielt werden. Außerdem könnte in Fällen der Diagnose der Patienten, die schon bei Verdacht einer möglichen Infektion mit einer hohen Antibiotikadosis behandelt wurden, das Wachstum und die Vermehrung der Bakterien verhindert werden, auch wenn die Bakterien in der Probe vorhanden sind. Entsprechend kann die Durchführbarkeit einer erfolgreichen Kultur der Bakterien aus diesen Proben extrem niedrig werden.
  • Weiterhin können alternative Teilroutine-Verfahren, die für diesen Zweck entwickelt wurden, einschließen: ein instrumentelles Analyseverfahren von wesentlichen Bestandteilen von Bakterien und Stoffwechselprodukten von Bakterien (siehe Yoshimi Benno, "Quick identification of bacteria with gas chromatography", Rinsho Kensa, Band 29, Nr. 12, Seiten 1618–1623, November 1985, Igaku Shoin.); ein Verfahren, das einen spezifischen Antikörper verwendet (siehe provisorische japanische Patentveröffentlichung Nr. 60-224068) und ein Hybridisierungsverfahren, das eine Spezifität von DNA verwendet (provisorische japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-502376), die jedoch alle Schritte zur Isolierung der Bakterien als auch Schritte zum Kultivieren und Wachsenlassen der Bakterien benötigen.
  • Auf der anderen Seite wurde ein etabliertes Verfahren basierend auf der Funktion der Phagozyten in den Infektionskrankheiten vorgeschlagen, worin eine gefärbte Schmiere von Buffy Coat, in der wesentliche Bestandteile von Leukozyten aus der Blutprobe konzentriert sind, unter einem optischen Mikroskop untersucht wird. Allgemein gesprochen ist die Detektionsrate von Bakterien in Proben von Buffy Coat aus erwachsenen bakteriämischen Patienten maximal 30%, was ähnlich zu derjenigen in Blutproben aus Ohrläppchen ist, jedoch wurde berichtet, dass die Bakterien in sieben von zehn Fällen (70%) detektiert wurden, wenn die Patienten neugeborene Kinder waren. Daher können Informationen betreffend die Anwesenheit von Bakterien in peripherem Blut, die durch mikroskopische Untersuchung einer Schmiere erhalten wurden, ein wichtiges Leitprinzip für die therapeutische Behandlung bereitstellen.
  • Die oben erwähnten konventionellen Verfahren machen die Vorbehandlung notwendig, die insgesamt wenigstens drei bis vier Tage benötigt, darin sind ein bis zwei Tage für die selektive Isolierung von Bakterien aus einer Probe enthalten, ein Tag zur Vermehrung durch Kultivieren und ein oder mehrere Tage zur Durchführung der Fixierung, und die Kulturen daraus sollten tatsächlich fortgesetzt werden, bis die Bakterien ausreichend wachsen, daher kann die Vorbehandlung eine Woche oder länger benötigen. Zusätzlich können in einigen Fällen beliebige andere Bakterien als die verursachenden Bakterien während des Kulturschrittes kontaminieren, und derartige Kontaminanten können nicht von den verursachenden Bakterien unterschieden werden.
  • Wie oben erwähnt, ist es wichtiger, dass die Zahl der Bakterien, die auch unter angemessenen Bedingungen für die Kultur der verursachenden Bakterien wachsen können, klein sein kann, weil viele der verursachenden Bakterien in der Probe, die vermehrt und detektiert werden soll, in Phagozyten aufgenommen wurden und bereits tot oder in einem bakteriostatischem Stadium aufgrund der verabreichten Antibiotika sind, daher ist die tatsächliche Detektionsrate von Bakterien so niedrig wie ungefähr 10%, wenn die klinische Kulturprobe verwendet wird. Mit anderen Worten kann gegenwärtig in 90% des untersuchten Blutes von den Patienten mit klinischem Verdacht auf die Infektion mit Streptococcus pyogenes die Anwesenheit der Bakterien überhaupt nicht identifiziert werden, obwohl die Kultur für weitere ein oder mehrere Tage fortgesetzt wird.
  • Obwohl die Bestimmung der verursachenden Bakterien und die Selektion der Antibiotika, die zum schnellstmöglichen Töten der Bakterien geeignet sind, im Lichte der gegenwärtigen obigen Situation eminent wünschenswert ist, hängt die gegenwärtig angewendete Praxis von der therapeutischen Behandlung ab, die initiiert wird, wenn die Infektion mit Streptococcus pyogenes klinisch auffällig ist, ohne die Ergebnisse der Detektion der verursachenden Bakterien abzuwarten. Es wird sozusagen ein Versuchs- und Irrtumsverfahren angewendet, wobei ein Antibiotikum mit einem weitesten Wirkungsspektrum gegen viele Arten von Bakterien zuerst verabreicht wird, und als nächstes, wenn sich das Antibiotikum nach ein oder zwei Tagen nicht als wirksam zeigt, wird ein anderes Antibiotikum getestet.
  • Kürzlich wurden schnelle Verfahren zur Diagnose von den Infektionen von Sfreptococcus pyogenes entwickelt, um die Bakterien immunologisch unter Verwendung von Verfahren zu detektieren, wie z. B. Latex-Agglutinationstest, Ko-Agglutinationstest, Enzymimmuntest, Goldpartikeltest und Liposomenimmuntest. Alle diese Verfahren werden ausgeführt, indem C-Polysaccharid von den Oberflächen der Bakterienkörper von Streptococcus pyogenes mit Salpetersäure oder Enzymen extrahiert wird und die Anwesenheit der Bakterien unter Verwendung des Polysaccharids als Antigen detektiert wird.
  • Jedoch sind die obigen immunologischen Verfahren problematisch, weil die Ergebnisse davon oft inkonsistent mit den Ergebnissen sind, die durch Kulturverfahren erhalten werden (nämlich zeigen sie falsch positive oder falsch negative Ergebnisse an), und weil die Tätigkeiten zur Ausführung der Verfahren schwierig sind.
  • Weiterhin ist die Speziesspezifität dieses immunologischen Verfahrens aufgrund der Eigenschaften dieses diagnostischen Verfahrens nicht zufriedenstellend, in dem Antigen-Antikörperreaktionen verwendet werden, nämlich wird die Detektion von den Bakterien außer Streptococcus pyogenes gefordert, die das Gruppe A-Antigen tragen (z. B. Streptococcus anginosus und ähnliches).
  • Mittlerweile wurde ebenso eine diagnostische Leitlinie für die klinische Diagnose der Infektionen vorgeschlagen, die durch Streptococcus der fulminanten Gruppe A verursacht werden (JAMA, Band 269, 390–391, 1993), jedoch ist sie nicht bei der frühen Diagnose anwendbar.
  • Obwohl die Infektionskrankheiten, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden, Krankheiten sind, für die eine schnelle und saubere Diagnose notwendig ist, konnte das konventionelle Diagnoseverfahren solchen Anforderungen nicht entsprechen.
  • [Offenbarung der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung wurde im Lichte der oben beschriebenen Probleme dieses Arbeitsgebietes gemacht und ist auf Sonden zur Diagnose von Infektionskrankheiten gerichtet, die ein DNA-Fragment umfassen, das durch Behandeln von DNA der verursachenden Bakterien Sfreptococcus pyogenes mit dem Restriktionsenzym HindIII erhältlich ist, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz besteht, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 ausgewählt wird, und wobei die Sonde spezifisch mit der DNA von Streptococcus pyogenes hybridisiert.
  • Entsprechend kann bakterielle DNA, die zwar noch in den Bakterien enthalten aber im Abbauprozess durch Phagozytose durch Phagozyten begriffen ist, basierend auf ihrer Spezifität durch das Hybridisierungsverfahren signifikant detektiert werden. Daher kann eine schnelle und saubere Detektion der verursachenden Bakterien von Infektionskrankheiten ohne Kultur und Vermehrung der Bakterien erreicht werden. Überdies kann die Identifizierung der verursachenden Bakterien durch DNA-Amplifizierung unter Verwendung eines PCR-Verfahrens ohne das Hybridisierungsverfahren erreicht werden, wenn ein Primer mit Bezug auf die Nukleotidsequenzinformation der erfindungsgemäßen Sonden konstruiert wird.
  • Desweiteren kann die Sonde, die zur Hybridisierung verwendet wird, mit nichtradioaktiven Mitteln markiert werden. Wenn z. B. eine biotinylierte Sonde verwendet wird, kann die Detektion in einem allgemeinen Untersuchungslabor durchgeführt werden, das keine Einrichtungen zum Umgang mit Radioisotopen hat. Daher können die Tätigkeiten für die Detektion auf schnelle und einfache Weise durchgeführt werden.
  • [Kurze Beschreibung der Zeichnungen]
  • 1(a) ist eine Zeichnung, die die Lage der ursprünglichen Bakterienstämme der DNAs auf allen Filtern durch Dot-Blot-Hybridisierung zeigt, und 1(b) zeigt die Ergebnisse aller Sonden, die durch Farbentwicklung nach dem Hybridisierungsprozess erhalten wurden.
  • [Beste Ausführungsform der Efindung]
  • Um die vorliegende Erfindung detaillierter zu erläutern, werden unten nichtbeschränkende Beispiele in Bezug auf die Sonden gezeigt, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurden, dem verursachenden Bakterium von Infektionskrankheiten.
  • Beispiel 1: DNA-Sonden, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
  • (1) Herstellen von DNA-Sonden, die aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
  • Ein klinisches Isolat von Streptococcus pyogenes wurde über Nacht in BHI-Medium (Brain Heart Infusion, Gehirn-Herz-Infusion) kultiviert, dann wurden die kultivierten Zellen geerntet, und genomische DNA wurde daraus entsprechend dem modifizierten Saito-Miura-Verfahren ("Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta, Band 72, Seiten 619–629 (1963)) extrahiert, wobei der Zelllyseschritt durch Hinzufügen von N-Acetylmuramidase SG zum Lysepuffer durchgeführt wurde.
  • Die extrahierte DNA wurde vollständig durch das Restriktionsenzym HindIII verdaut, dann in den Vektor pGEM-3Z zufällig kloniert. Sechs Sonden, die spezifisch für Streptococcus pyogenes waren, d. h. die Sonden, die DNA-Fragmente umfaßten, die spezifische Reaktivitäten gegenüber DNA zeigten, die in natürlichen Streptococcus pyogenes enthalten ist, wurden aus den dadurch erhaltenen Klonen selektiert.
  • Danach wurden die selektierten Sonden bezeichnet: Sonde SP-6-28, Sonde SP-7-44, Sonde SP-14-1, Sonde SP-26-36, Sonde SP-26-46 und Sonde SP-55-3.
  • (2) Studien der Speziesspezifität der DNA-Sonden, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurden
  • Wechselwirkungen zwischen jeder Sonde und DNA von verschiedenen Arten infektionsverursachender Bakterienstämme wurden wie folgt studiert.
  • Zuerst wurden klinische Isolate und hinterlegte Bakterienstämme hergestellt wie in Tabelle 1 unten aufgelistet. Um die Quellen von menschlicher genomischer DNA in Tabelle 1 und eine Kontrollprobe zu erhalten, wurden Leukozyten, die von vier gesunden erwachsenen Männern gesammelt wurden, bzw. Escherichia coli K-12, JM109-Transformanten hergestellt, die das Plasmid pGEM-3Z enthalten.
  • Tabelle 1
    Figure 00080001
  • Figure 00090001
  • [Abkürzung]
    • NYSDH
    New York State Department of Health (Gesundheitsministerium des Staates New York, Albany, New York, USA)
  • Danach wurde die DNA, die in jeder der klinischen Isolate enthalten war, entsprechend dem Verfahren beschrieben in Beispiel 1(1) extrahiert, dann wurde ein Aliquot der extrahierten DNA (z. B. 10–100 ng) auf ein Nylonfilter gespottet. Nach Denaturieren mit Alkali wurde das Filter einer Dot-Blot-Hybridisierung unterworfen. Die menschliche genomische DNA-Probe wurde aus den Leukozyten, die wie früher erwähnt erhalten wurden, unter Verwendung des modifizierten Saito-Miura-Verfahrens (supra) hergestellt. Eine Kontrollprobe wurde aus Escherichia coli K-12, JM109-Transformanten, die das Plasmid pGEM-3Z enthielten, unter Verwendung des Herstellungsverfahrens für Plasmid-DNA hergestellt, das im folgenden Beispiel 2(1) beschrieben ist. Dann wurde eine Hybridisierung über Nacht unter Verwendung einer Digoxigenin-11-dUTP (BRL)-markierten DNA-Sonde durchgeführt, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurde, wobei die Hybridisierungsbedingungen 45% Formamid, 5 × SSC bei 42°C entsprechend dem Handbuch Maniatis (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory (1989)) waren.
  • Nach der Hybridisierung über Nacht wurden die Proben zweimal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C für 20 min entsprechend dem Handbuch gewaschen, gefolgt von einer Farbentwicklung und Detektion unter Verwendung von Anti-Dig-ALP-Konjugaten (BRL), dadurch wurden Hybridisierungsergebnisse erhalten. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, wobei 1(a) die Lage der ursprünglichen Bakterienstämme der DNAs auf allen Filtern durch Dot-Blot-Hybridisierung zeigt, und 1(b) zeigt die Ergebnisse aller erwähnten Sonden SP-6-28, SP-7-44, SP- 14-1, SP-26-36, SP-26-46 und SP-55-3, die durch Farbentwicklung nach dem Hybridisierungsprozess erhalten wurden.
  • Die experimentellen Ergebnisse in Bezug auf die Reaktivitäten zwischen jeder Sonde und DNAs jeder der klinischen Bakterienstämme sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00100001
  • [Anmerkungen]
    • +
    Hybridisierungsignal detektiert
    –
    kein Hybridisierungssignal detektiert
  • Wie aus den obigen Tabellen 1 und 2 offensichtlich ist, zeigten alle vorliegenden Sonden Reaktivitäten nur zu der DNA, die aus Streptococcus pyogenes gewonnen wurde, während keine Reaktivität (z. B. Hybridbildung) gegenüber DNAs aller anderen Bakterienspezies der Gattung Streptococcus als auch gegenüber DNAs der zu der Gattung Streptococcus unterschiedlichen Bakterienspezies beobachtet wurde. Daher wurde die Spezifität der Sonden gezeigt.
  • Beispiel 2: Analyse der Basensequenz
  • Alle Basensequenzen der DNA-Sonden (insgesamt sechs Sonden), deren Speziesspezifität im obigen Beispiel 1 gezeigt wurde, wurden entsprechend dem folgenden Verfahren bestimmt.
  • (1) Herstellung von Plasmid-DNA
  • Escherichia coli K-12, JM109-Transformanten, worin das subklonierte Insertfragment (das sequenziert werden soll) in pGEM-3Z (Promega) enthalten ist, wurden in 5 ml Luria-Bactani-Medium geimpft (Bakto-Trypton, 10 g/1 l; Bakto-Hefeextrakt, 5 g/1 l; NaCl 10 g/1 l; pH 7,0 mit 5N NaOH eingestellt) und über Nacht kultiviert.
  • Die flüssige Kulturmischung wurde zentrifugiert (5.000 rpm, 5 min), um die Bakterien zu sammeln. 100 μl einer Lösung von 50 mM Glukose/50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA, die 2,5 mg/ml Lysozym (Sigma) enthielt, wurde dem Präzipitat hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehengelassen. 0,2 M NaOH-Lösung, die 1% Natriumdodekylsulfat enthielt (Sigma), wurde der Suspension hinzugefügt und gemischt. 150 μl wässerige 5 M Kaliumazetatlösung (pH 4,8) wurde weiterhin hinzugefügt und gemischt, dann wurde für 15 Minuten auf Eis gekühlt.
  • Der Überstand der Mischung, die durch Zentrifugieren (15.000 rpm, 15 min) gesammelt wurde, wurde mit Phenol/CHCl3 behandelt, und das zweifache Volumen Ethanol wurde hinzugefügt, dann wurde das Präzipitat nochmals durch Zentrifugieren (12.000 rpm, 5 min) erhalten. Dies Präzipitat wurde in 100 μl einer Lösung von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, gefolgt von Hinzufügen von 10 mg/ml Lösung von RNAse A (Sigma), dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen.
  • 300 μl einer wässerigen 0,1 M Natriumazetatlösung (pH 4,8) wurden dieser Mischung hinzugefügt und mit Phenol/CHCl3 behandelt, dann wurde das Präzipitat davon erhalten, indem Ethanol dem Überstand hinzugefügt wurde. Dies Präzipitat wurde getrocknet und in 10 μl destilliertem Wasser gelöst, um eine DNA-Probe zu erhalten.
  • (2) Vorbehandlung zum Sequenzieren
  • Eine Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit einem AutoReadTM Sequenzierungskit (Pharmacia) durchgeführt.
  • Die Konzentration der als Template verwendeten DNA wurde auf 5–10 μg in 32 μl Lösung eingestellt. 32 μl der DNA-Lösung des Templates wurden in ein Minigefäß gebracht (1,5 ml, Eppendorf), und 8 μl einer wässerigen 2 M NaOH-Lösung wurden hinzugefügt und dann leicht gemischt. Nach sofortigem Zentrifugieren wurde sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen.
  • 7 μl 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und 4 μl destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, gefolgt von 120 μl Ethanol, und nach Mischen wurde die Mischung für 15 Minuten auf Ethanol/Trockeneis stehengelassen. DNA, die durch Zentrifugieren für 15 Minuten präzipitiert wurde, wurde gesammelt, und der Überstand wurde sorgfältig entfernt. Das dadurch erhaltene Präzipitat wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und für 10 Minuten zentrifugiert. Dann wurde das Präzipitat unter reduziertem Druck getrocknet, nachdem der Überstand nochmals sorgfältig entfernt wurde.
  • Das Präzipitat wurde in 10 μl destilliertem Wasser gelöst, dann wurden 2 μl fluoreszierender Primen (0,42 A260 Einheiten/ml, 4–6 pmol (fluoreszierender Primen; Universalprimen: 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 7)]-3' (1,6 pmol/μl 0,42 A260 Einheiten/ml); Reverser Primer: 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 8)]-3' (2,1 pmol/μl 0,42 A260 Einheiten/ml) und 2 μl Annealingpuffer hinzugefügt und leicht gemischt.
  • Nach sofortiger Zentrifugation wurde die Mischung bei 65°C für 5 Minuten hitzebehandelt und schnell in eine Umgebung von 37°C gebracht, und die Temperatur wurde für 10 Minuten gehalten. Nachdem die Temperatur gehalten wurde, wurde die Mischung bei Raumtemperatur für mehr als 10 Minuten stehengelassen und sofort zentrifugiert.
  • Dann wurde die Probe durch Hinzufügen von 1 μl Elongationspuffer und 3 μl Dimethylsulfoxid hergestellt.
  • Vier Minigefäße wurden mit einer der Markierungen "A", "C", "G" und "T" gekennzeichnet, und entsprechend der Kennzeichnung wurden 2,5 μl A-Mix (gelöstes ddATP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP), C-Mix (gelöstes ddCTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP), G-Mix (gelöstes ddGTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) oder T-Mix (gelöstes ddTTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) in jedes gekennzeichnete Gefäß gebracht. Alle Lösungen wurden bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt und wurden vor der Verwendung für eine Minute oder mehr bei 37°C inkubiert.
  • 2 μl verdünnter T7-DNA-Polymerase (Pharmacia; 6–8 Einheiten/2 μl) wurden der DNA-Probe hinzugefügt und vollständig durch Pipettieren gemischt oder leicht gemischt.
  • Unmittelbar nach Beenden des Mischens wurde die gemischte Lösung auf 4,5 μl der jeweils vier Lösungsarten verteilt, die bei derselben Temperatur inkubiert wurden. Frische Spitzen wurden für jede Verteilung verwendet.
  • Die Lösungen wurden für 5 Minuten bei 37°C gehalten, dann wurden 5 μl Terminationslösung zur jeder Reaktionsmischung hinzugefügt.
  • Für diesen Schritt wurden ebenso frische Spitzen verwendet. Unmittelbar nach Inkubieren der Lösung für 2–3 Minuten bei 90°C wurde sie auf Eis gekühlt. Pro Spur wurden vier bis sechs μl der Lösung für die Elektrophorese verwendet.
  • (3) Seguenzierung der Basensequenzen
  • Sequenzieren der Basensequenzen der Sonden, die in den Beispielen 1 und 2 offenbart wurden und die die Spezifität für DNA von Strepfococcus pyogenes haben, wurde unter Verwendung des A. L. F.-DNA-Sequenzierungssystems (Pharmacia) unter Elektrophoresebedingungen von 45°C für 6 Stunden durchgeführt. Primer wurden seriell basierend auf den Sequenzen konstruiert, die von jeder der stromaufwärts und stromabwärts liegenden Sequenzen aufgeklärt wurden, und die oben beschriebenen Verfahren wurden wiederholt.
  • Folglich wurden die vollständigen Basensequenzen der Sonde SP-6-28 (SEQ ID NO: 1), der Sonde SP-7-44 (SEQ ID NO: 2), der Sonde SP-14-1 (SEQ ID NO: 3), der Sonde SP-26-36 (SEQ ID NO: 4), der Sonde SP-26-46 (SEQ ID NO: 5) und der Sonde SP-55-3 (SEQ ID NO: 6) aufgeklärt.
  • [Industrielle Anwendbarkeit]
  • Durch Verwenden der erfindungsgemäßen Sonden können verursachende Bakterien, die von Phagozyten aufgenommen wurden, schnell und sauber direkt z. B. durch ein Hybridisierungsverfahren ohne Vermehrung der Bakterien identifiziert werden. Mit anderen Worten ermöglicht die Diagnose unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden das Identifizieren der verursachenden Bakterien durch eine einzige Probe, weiterhin kann die notwendige Zeit zur Diagnose auf ungefähr 1 bis 2 Tage vermindert werden, während das konventionelle Verfahren mit niedriger Detektionsrate 3–4 Tage benötigt, und die resultierende Detektionsrate wird beachtlich verbessert.
  • Daher offenbart die vorliegende Anmeldung Leitprinzipien für die therapeutische Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden, und zusätzlich kann die effektive Behandlung in einem frühen Stadium der Infektion an die Patienten angepaßt werden, was zu einer Verminderung der Mortalität führen kann.
  • Zusätzlich wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, worin die Basensequenzen der Sonden aufgeklärt wurden, die spezifisch mit der DNA reagieren, die aus Streptococcus pyogenes unter mehreren verursachenden Bakterien der Infektionskrankheiten gewonnen wurde, die künstliche Herstellung dieser Sonden möglich. Überdies kann ein Teil der Informationen der Basensequenzen, die hier bereitgestellt werden, zur Herstellung von Primern verwendet werden, die zur schnellen Diagnose durch Amplifizieren durch ein PCR- Verfahren von DNA von verursachenden Bakterien, die in der klinischen Probe enthalten sind, verwendbar sind.
  • Außerdem kann die schnelle Identifizierung der verursachenden Bakterien durch Vergleichen der Basensequenzen genomischer DNA aus der klinischen Probe mit Basensequenzen ausgeführt werden, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
  • Wie oben angegeben stellt die vorliegende Erfindung die gewünschte Sonde zur Diagnose der Infektionen bereit, ferner können hervorragende Mittel wie Leitprinzipien für die Herstellung von Primern zur PCR als auch Standardsequenzen, die zum Vergleich genomischer DNA geeignet sind, die in der klinischen Probe enthalten ist, erwartet werden. Überdies kann die vorliegende Erfindung nützliche Wirkungen durch Bereitstellung wertvoller Anhaltspunkte zur Herstellung und Entwicklung neuer Sonden ausüben, die spezifisch mit der DNA verursachender Bakterien der Infektionskrankheiten reagieren.
  • Weiterhin wurde die Basensequenz, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart wird, durch Zufallsklonieren genomischer DNA klinischer Isolate erhalten, daher sollten die Verwendungen der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung den komplementären Strang davon umfassen.
  • Zusätzlich könnte vermutet werden, dass DNA, die aus wilden Stämmen erhalten wird, einen mutierten Anteil enthalten könnte. Wie aus der Offenbarung der obigen Beispiele ersichtlich ist, würden derartige mutierte DNA-Anteile jedoch nicht die Verwendungen beeinflussen, die aus der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden sollten, die die Spezifität der erfindungsgemäßen Sonde im Hybridisierungsverfahren zur Diagnose von Infektionen und Verwendungen der Informationen der Basensequenzen umfassen, die in der vorliegenden Anmeldung zur Konstruktion der Primer offenbart werden, die für die PCR-Techniken mit dem Ziel einer schnellen Diagnose der Infektionen verwendet werden sollen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (2)

  1. Sonde zur Diagnose von Infektionskrankheiten, umfassend ein DNA-Fragment erhältlich durch Behandeln von DNA der verursachenden Bakterien Streptococcus pyogenes mit dem Restriktionsenzym HindIII, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 und 6 besteht und wobei die Sonde spezifisch mit der DNA von Streptococcus pyogenes hybridisiert.
  2. Verwendung der Sonde nach Anspruch 1 zur in-vitro-Diagnose von Infektionen, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden.
DE69821344T 1997-03-25 1998-03-23 Sonden zum nachweis von durch streptococcus pyogenes hervorgerufenen infektionen Expired - Lifetime DE69821344T2 (de)

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