DE19747748A1 - Testverfahren zur Identifizierung von Personen mit defektem Mismatch-Reparatursystem - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Feststellung des Vorliegens von erblich beding­ ten Defekten im Mismatch-Reparatursystem, insbesondere von erblich bedingtem nicht­ polypösem Colonkarzinom bzw. der Prädisposition zur Entwicklung dieser Erkrankung.

Etwa 3-6% aller Patienten mit Colonkarzinom leiden an einer autosomal-dominant vererbten Erkrankung (erblich bedingtes nicht-polypöses Colonkarzinom; hereditary non-polyposis colo­ rectal cancer; HNPCC). Die genetische Basis hierfür sind Keimbahnmutationen in Mismatch- Reparaturgenen (MMR-Genen), die zu einem Defect im Mismatch-Reparatursystem (MMR- System) führen, das durch die Genprodukte der MMR-Gene gebildet wird. In einer normalen Körperzelle werden durch das MMR-System Fehler korrigiert, die während der im Rahmen der Zellteilung ablaufenden DNA-Replikation auftreten. Ein Defekt im MMR-System infolge von Mutationen innerhalb der MMR-Gene führt zu einer Akkumulierung von Mutationen in anderen Genen bzw. DNA-Abschnitten der betroffenen Zelle mit einer gegenüber normalen Zellen erhöh­ ten Rate, da Replikationsfehler nicht korrigiert werden können. Infolgedessen besteht bei Trägern einer solchen Mutation in einem MMR-Gen ein stark erhöhtes Risiko, Krebs zu entwickeln (etwa 80%). Entsprechend besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß es zur Entwicklung entweder nur von Colonkarzinomen (Lynch I-Syndrom) kommt, oder von anderen Karzinomen, etwa der Brust, des Endometriums, des Harntraktes, des Magens, der Leber oder des Pankreas (Lynch H-Syndrom); Lynch und Smyrk, Cancer 78 (1996), S. 1149-1167.

Die Identifizierung von Patienten mit erblich bedingten Defekten im MMR-System ist in diesem Zusammenhang unter anderem aus zweierlei Gründen von größter Bedeutung:

• 1. Die Patienten mit HNPCC haben ein sehr hohes Risiko, Zweit-Colonkarzinome zu entwickeln, oder an einer anderen Krebsart des Lynch II-Syndroms zu erkranken. Sie bedürfen daher einer besonders intensiven Überwachung und können möglicherweise von einer vergleichsweise ra­ dikaleren chirurgischen Behandlung profitieren, wie einer subtotalen Colektomie anstelle einer Hemicolektomie.
• 2. Die Verwandten ersten Grades des Patienten, wie Geschwister und Kinder, haben ein 50%iges Risiko, Träger der Mutation zu sein. Ist dies der Fall, so beträgt ihr Risiko, ein Colonkar­ zinom oder ein Karzinom des Lynch II-Syndroms zu entwickeln, etwa 80%.

Bisher basiert die Identifizierung eines HNPCC-Patienten entweder auf der Familiengeschichte (Amsterdam- und Kopenhagen-Kriterien) oder auf molekulargenetischen Befunden. Mit Abnah­ me der durchschnittlichen Größe von Familien in den westlichen Ländern ist die Auswertung der Familiengeschichte jedoch nicht mehr hinreichend empfindlich, um die Mehrzahl der tatsächlich betroffenen Patienten eindeutig als HNPCC-Patienten zu identifizieren. Ein weiteres Problem besteht darin, daß selbst eine Häufung von Krebsfallen in einer Familie keinen Beweis für eine genetisch bedingte Erkrankung darstellt. Es kann sich dabei vielmehr auch um eine Häufung sporadischer Falle von Krebs handeln, die entweder zufällig aufgetreten ist oder durch Umwelt­ faktoren hervorgerufen wurde, die die Entstehung von Krebs begünstigen. Neben diesem Pro­ blem kann die Familiengeschichte auch keinen Hinweis darüber geben, ob ein gesundes Famili­ enmitglied Träger eines Gendefektes ist oder nicht.

Auf der anderen Seite können auch molekulargenetische Befunde diese Fragen häufig nicht be­ antworten. Sie geben nur bei einem geringen Anteil aller Patienten Auskunft darüber, ob sie an einer Krebserkrankung leiden, deren Ursache in einem erblich bedingten Defekt des MMR-Systems liegt. Ein Ansatz ist die Analyse der Instabilität der Mikrosatelliten in den Tumorzellen eines Patienten. Mikrosatelliten sind repetitive DNA-Sequenzen wie etwa Folgen von Mono-, Di- oder Trinukleotiden. Bei HNPCC-Patienten zeigt der Tumor in etwa 92% der Fälle Mikrosatelli­ ten-Instabilität, was sich in einem Längenunterschied amplifizierter Mikrosatelliten-DNA von normalen Körperzellen gegenüber denen von Tumorzellen äußert. Dieses Phänomen ist das Re­ sultat eines Defektes im MMR-System dieser Patienten. Mikrosatelliten-Instabilität wird jedoch auch in 10-16% der sporadischen Fälle von Colonkarzinom gefunden. Auf der anderen Seite weisen fast 10% der Colonkarzinome von Patienten, bei denen HNPCC vorliegt, keine Mikrosa­ telliten-Instabilität auf. Entsprechend liefert der Nachweis von Mikrosatelliten-Instabilität in ei­ nem Colonkarzinom keinen Beweis dafür, daß der betroffene Patient an HNPCC leidet, und umgekehrt schließt der Befund, daß keine Mikrosatelliten-Instabilität vorliegt, das Bestehen von HNPCC nicht aus.

Darüber hinaus hilft die Analyse der Mikrosatelliten-Instabilität im Tumorgewebe eines Patienten in keiner Weise bei der Beantwortung der Frage, ob und welche Familienmitglieder defekte MMR-Gene tragen. Der Grund dafür liegt darin, daß Mikrosatelliten-Instabilität nur im Tumor­ gewebe eines betroffenen Patienten bestimmt wird, nicht jedoch im Gewebe einer gesunden Per­ son.

Die Analyse der Mikrosatelliten-Instabilität bei einem Patienten kann daher bestenfalls einen Hinweis auf eine gegenüber anderen Personen erhöhte Wahrscheinlichkeit liefern, an HNPCC erkrankt zu sein, und darauf, daß der betreffende Patient in bezug auf HNPCC genauer unter­ sucht werden sollte. Sie kann jedoch nicht als Basis für die Diagnose von HNPCC dienen. Zudem wird bei den derzeit verwendeten Analysen eine Tumorprobe benötigt. Falls kein Tumorgewebe verfügbar ist, kann das Verfahren somit nicht angewandt werden.

Derzeit basiert sowohl die Bestätigung der Diagnose von HNPCC bei einem Patienten als auch die Identifizierung von Familienmitgliedern mit genetisch bedingter Prädisposition für HNPCC aufgrund einer Keimbahn-Mutation in einem oder mehreren MMR-Genen auf der Identifizierung der Mutationen in den MMR-Genen selbst. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig und kostenintensiv. Mindestens vier Gene, deren Beteiligung am MMR-System derzeit bekannt ist, müssen auf mole­ kulargenetischer Ebene im Hinblick auf vorliegende Mutationen studiert werden. Zudem gibt es wahrscheinlich noch mehr Gene, die in die Entstehung von HNPCC involviert sind. Selbst mit den ausgereiftesten Verfahren wird jedoch nur in der Hälfte der Familien, bei denen das Vorliegen von HNPCC angenommen wird, eine Mutation nachgewiesen; Liu et al., Nature Med 2 (1996), S. 169-174. Wenn eine Mutation gefunden wird, ist es häufig schwierig oder oft sogar unmöglich festzustellen, ob es sich dabei um eine für die Erkrankung ursächliche Mutation oder um einen harmlosen Polymorphismus handelt. Falls keine Mutation aufgefunden wird, bleibt unklar, ob tatsächlich keine Mutation vorliegt (in welchem Falle in der untersuchten Familie kein Fall von HNPCC vorliegt bzw. diesbezüglich keine genetische Prädisposition besteht), ob eine Mutation vorhanden ist, jedoch durch das verwendete Verfahren nicht nachgewiesen wurde, oder ob eine Mutation in einem weiteren Gen vorliegt, das nicht untersucht wurde bzw. zum Zeitpunkt der Untersuchung nicht bekannt ist. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß es sehr wahr­ scheinlich weitere MMR-Gene gibt, die in die Pathogenese von HNPCC involviert sind, jedoch zum heutigen Zeitpunkt noch nicht bekannt sind.

Vor diesem Hintergrund kann mit den derzeitigen Untersuchungsverfahren das Vorliegen von HNPCC bei Patienten mit Colonkarzinom und damit deren Risiko, weitere Tumore des Lynch I- oder Lynch II-Syndroms zu entwickeln, oder das Risiko von Familienmitgliedern der Patienten, ebenfalls HNPCC oder Tumore des Lynch II-Syndroms zu entwickeln, nicht mit der gewünschten Genauigkeit bestimmt werden.

In früheren experimentellen Untersuchungen, an denen auch die Autoren von Liu et al., a.a.O., beteiligt waren, wurde bei einem Teil von HNPCC-Patienten mit genau charakterisierten Muta­ tionen in bestimmten MMR-Genen erhöhte Anzahlen von Mutationen auch in den Mikrosatelliten von nicht-neoplastischen Zellen, d. h. von Zellen, die nicht aus Tumorgewebe stammen, gefunden; Parsons et al., Science 268 (1995), S. 738-740. Gleichzeitig wurde in in vitro-Tests mit Zellex­ trakten von nicht-neoplastischen Zeilen dieser Patienten verringerte MMR-Aktivität bezüglich eines künstlichen DNA-Substrates festgestellt. Bei den anderen untersuchten HNPCC-Patienten wurde trotz der bei ihnen zuvor festgestellten Mutationen in MMR-Genen keine Mikrosatelliten- Instabilität in den nicht-neoplastischen Zellen gefunden. Ferner zeigten diese Zellen substantielle MMR-Aktivität in in vitro-Tests. Als mögliche Erklärungen für die beobachtete Mikrosatelliten- Instabilität in den phänotypisch normalen (d. h. nicht-neoplastischen) Zellen bestimmter HNPCC- Patienten wurden eventuell bestehende weitere Defekte in bisher unbekannten MMR-Genen oder ein dominant-negativer Effekt der bei diesen Patienten bereits festgestellten speziellen MMR- Genmutationen in bezug auf das jeweils intakte Allel angeführt. Die Autoren stellten fest, es sei überraschend, daß sich bei diesem Teil der untersuchten HNPCC-Patienten nicht mehr Colon­ karzinome entwickelt hatten und stellten daran anschließend Überlegungen bezüglich des Zu­ sammenhangs zwischen Mutagenese und Karzinogenese an. Patienten, bei denen lediglich ein Verdacht auf das Bestehen eines erblich bedingten Defektes im MMR-System bzw. auf HNPCC bestand, waren nicht in die Untersuchungen von Parsons et al. einbezogen.

Entsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Testverfahren zur Feststellung des Vorliegens erblich bedingter Defekte im MMR-System bzw. zur Feststellung des Vorliegens von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition bei einer zu untersuchenden Person bereitzustellen, das die Nachteile der vorstehend genannten Untersuchungs- und Analyse­ verfahren vermeidet, einfach zu handhaben ist und als Basis für die Diagnose von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition dienen kann.

Diese und weitere Aufgaben werden durch das in Anspruch 1 und den nachfolgenden Ansprü­ chen beanspruchte Verfahren gelöst. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Testver­ fahren zur Feststellung des Vorliegens eines erblich bedingten Defekts im MMR-System bzw. zur Feststellung des Vorliegens von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition bei einer zu untersuchenden Person, das die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Kultivierung von nicht-neoplastischen Zellen der zu untersuchenden Person unter Bedin­ gungen, die Zellteilung erlauben, wobei vor und/oder während der Kultivierung ein mutagener Stimulus gegeben wird;
• b) Herstellung mehrerer DNA-Proben aus den kultivierten Zellen, die jeweils in ihrer DNA-Menge oder bezüglich der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation der genomischen DNA etwa einer oder einiger weniger dieser Zellen entsprechen;
• c) Amplifikation bestimmter Abschnitte der DNA-Proben mittels der Polymerase- Kettenreaktion ("polymerase chain reaction"; PCR) unter Einsatz sequenzspezifischer Primer, insbesondere Mikrosatelliten-DNA-spezifischer Primer; und
• d) Analyse der Amplifikationsprodukte hinsichtlich des erhöhten Auftretens von Mutationen innerhalb der amplifizierten Sequenzen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des erhöhten Auftretens von Mutationen in der genomischen DNA, etwa in der Mikrosatelliten-DNA, der nicht-neoplastischen Zellen einer zu untersu­ chenden Person zur Feststellung des Vorliegens erblich bedingter Defekte im MMR-System bzw. zur Feststellung des Vorliegens von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition bei einer zu untersuchenden Person.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Mikrosatelliten-DNA- spezifischen Primern in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig von der Analyse von Tumorgewebe bzw. dessen Verfügbarkeit. Entsprechend kann es auch in bezug auf Personen angewandt werden, die bisher keinen Krebs entwickelt haben. Es ist zudem in der Lage, funktionelle Defekte im MMR-System nachzuweisen, die durch Mutationen in bisher unbekannten Genen hervorgerufen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner im Hinblick auf Einzelpersonen durchgeführt werden, ohne daß es erforderlich wäre, andere Mitglieder der Familie dieser Personen in die Untersuchung einzubeziehen. Für die Anwendung des Verfahrens ist es auch nicht erforderlich, das Vorliegen einer Keimbahn-Mutation in einem MMR-Gen nachzuweisen, wozu die Sequenzierung mehrerer MMR-Gene erforderlich wäre. Das erfindungsgemäße Verfahren kann schließlich in den folgen­ den Situationen verwendet bzw. angewandt werden, in denen keiner der bisherigen Ansätze, wie die Analyse der Mikrosatelliten-Instabilität in einem Tumor oder die Sequenzierung von einzelnen MMR-Genen, in der Lage ist, die Diagnose von HNPCC zu bestätigen:

• - Wenn ein phänotypisch gesundes Familienmitglied wissen möchte, ob er oder sie Träger eines genetischen Defektes in einem MMR-Gen ist, eine entsprechende Keimbahn-Mutation in der betreffenden Familie jedoch nicht festgestellt wurde;
• - wenn ein Krebspatient wissen möchte, ob er oder sie Träger eines Defektes im MMR-System ist, eine Tumorprobe zur Analyse jedoch nicht verfügbar ist (beispielsweise wenn der Patient vor vielen Jahren an einem Colonkarzinom operiert wurde und aufbewahrte Gewebeproben nicht mehr verfügbar sind);
• - wenn ein Mitglied einer Familie (Patient oder phänotypisch gesunde Person), bei der eine Häufung von Krebsfallen vorliegt, wissen möchte, ob er oder sie an einem erblich bedingten Krebs-Syndrom leidet;
• - wenn ein Mitglied einer Familie (Patient oder phänotypisch gesunde Person), bei der eine Häutung von Krebsfallen vorliegt und bei der eine Mutation in einem MMR-Gen vorliegt, wissen möchte, ob diese Mutation zu einem Defekt im MMR-System führt.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst nicht-neoplastische Zellen einer zu untersuchenden Person in Kultur genommen und unter Bedingungen kultiviert, die Zellteilung erlauben. Bei der zu untersuchenden Person kann es sich etwa um einen Patienten mit Colonkar­ zinom handeln oder um eine Person, bei der der Verdacht auf Vorliegen von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition besteht.

Um Zellen für die Kultivierung zu gewinnen, werden von der zu untersuchenden Person nicht­ neoplastische Zellen erhalten. Es kann sich dabei um verschiedene Zelltypen handeln. Geeignet sind insbesondere Zellen, die sich leicht in Kultur nehmen lassen, und die in der Lage sind, sich unter den gewählten Kulturbedingungen zu teilen. Bevorzugt sind beispielsweise Fibroblasten oder epitheliale Zellen der Colonschleimhaut sowie Lymphozyten.

Lymphozyten sind aufgrund ihrer einfachen Zugänglichkeit und Kultivierbarkeit besonders bevor­ zugt. Sie können z. B. in einfacher Weise aus abgenommenem Vollblut der zu untersuchenden Person gewonnen werden. Falls das Blut nach der Abnahme nicht unverzüglich weiterverarbeitet werden kann, wird ein Gerinnungshemmer zugegeben (EDTA, Heparin oder Citrat). Die Lym­ phozyten werden dann aus dem abgenommenen Vollblut nach bekannten Verfahren durch Über­ schichten auf ein Ficoll-Kissen und Zentrifugation gewonnen. Die Lymphozyten werden dabei aus dem so entstandenen sogenannten Lymphozytenring abgenommen, gewaschen und in Kultur genommen, wobei man eine Kultur erhält, die überwiegend Lymphozyten enthält.

Es ist auch möglich, die Zellen im Rahmen der Kultivierung zu immortalisieren. Beispielsweise können von der zu untersuchenden Person gewonnene Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus transformiert werden. Die Immortalisierung durch Transformation ist insbesondere bei nicht- neoplastischen Zellen vorteilhaft, die schwierig in Kultur zu nehmen sind bzw. die sich in Kultur nicht oder nur in geringem Maße teilen. In Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren können auch Einzelzellen von einer zu untersuchenden Person gewonnen und anschlie­ ßend daraus Zellklone kultiviert werden, wobei sowohl die Einzelzellen als auch die daraus kulti­ vierten Zellklone gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden können.

Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung der Zellen unter Gabe bzw. Anwesenheit eines mutagenen Stimulus. Geeignet als mutagene Stimuli sind insbesondere Substanzen, die die Mutationsrate der Zellen erhöhen, z. B. Substanzen, die zu einem intrazellulären Ungleichgewicht der Nukleotid­ bausteine führen. Bevorzugte mutagene Substanzen, die zu der Kultur nicht-neoplastischer Zellen gegeben werden, sind in diesem Zusammenhang z. B. Methotrexat, Azathioprin, 6-Mercaptopurin oder 5-Fluorouracil, wobei letzteres besonders bevorzugt ist. Andere Substanzen, deren mutage­ ne Wirkung bei Zusatz zu Kulturen prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen oder in vivo dem Fachmann bekannt sind, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Geeignete Konzentra­ tionen zur Anwendung der vorstehend genannten mutagenen Substanzen liegen beispielsweise im Bereich von 0,001 µM bis 0,5 mM oder 0,001 µM bis 100 µM, vorzugsweise im Bereich von 0,01 µM bis 10 µM und besonders bevorzugt von 0,1 µM bis 1 µM in der Kulturflüssigkeit. Eine der genannten mutagenen Substanzen kann auch in Kombination mit einer anderen der genannten mutagenen Substanzen eingesetzt werden, z. B. 5-Fluorouracil zusammen mit Methotrexat, oder 5-Fluorouracil zusammen mit 6-Mercaptopurin, oder in Kombination mit zwei oder mehreren der genannten mutagenen Substanzen, wobei die Zugabe der verschiedenen Substanzen zur Kultur nicht notwendigerweise gleichzeitig erfolgen muß.

Der mutagene Stimulus gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch physikalischer Art sein. Die Zellen werden in diesem Falle vorzugsweise γ-Strahlen, Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen, besonders bevorzugt Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen, in einer Dosis ausgesetzt, die ausreicht, Mutationen in der genomischen DNA der Zellen zu induzieren. Bei Verwendung phy­ sikalischer Stimuli kann die Exposition der Zellen vor oder während der Kultivierung erfolgen.

Vorteilhaft für die Zwecke der Erfindung ist auch eine Behandlung mit einer Kombination aus chemischen und physikalischen mutagenen Stimuli, beispielsweise eine Behandlung der Kultur mit 5-Fluorouracil und gleichzeitig, anschließend oder im Vorfeld dazu, z. B. vor Kultivierung oder vor 5-Fluorouracilgabe zur Kultur, eine Behandlung der Zellen mit einem physikalischen Stimu­ lus, beispielsweise Bestrahlung der Zellen mit Röntgenstrahlung.

Generell wird die Dauer bzw. die Intensität des mutagenen Stimulus oder der in Kombination gegebenen mutagenen Stimuli so eingestellt, daß es nicht zu substantiellen toxischen Wirkungen bzw. zu massivem Zelltod in der Kultur kommt, wobei Dauer bzw. Intensität im Hinblick auf den jeweiligen Zelltyp variieren kann. Insbesondere werden Applikationsdauer und Intensität so ein­ gestellt, daß die Fähigkeit der Zellen, Zellteilungen zu durchlaufen, nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Zellteilungsaktivität und Zelltod in der Kultur lassen sich beispielsweise durch Aufnehmen einer Wachstumskinetik durch wiederholte Probenentnahme und Auszählung der Zellen in einem Zell-Counter oder durch Messung des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin nach bekannten Verfahren überwachen.

Gegebenenfalls können die Zellen nach einer Exposition gegenüber dem mutagenen Stimulus beispielsweise durch Verdünnungsreihen vereinzelt und anschließend zu Zellklonen kultiviert werden, deren genomische DNA anschließend, wie nachfolgend erläutert, extrahiert wird. Im Sinne der Erfindung entspricht eine aus einem Zellklon erhaltene DNA-Probe bezüglich der in ihr enthaltenen Sequenzinformation der genomischen DNA der Ausgangszelle des Zellklons.

Die Dauer der Kultivierung ist ebenfalls abhängig vom kultivierten Zelltyp, vom verwendeten mutagenen Stimulus und davon, ob die kultivierten Zellen iminortalisiert wurden. Allgemein sollte die Kultivierungsdauer für den jeweiligen Zelltyp so angesetzt werden, daß die Zellen die Möglichkeit haben, wenigstens 1 oder 2, vorzugsweise 10 bis 15, besonders bevorzugt bis zu 20, und insbesondere bevorzugt mehr als 20 Zellteilungen zu durchlaufen, wobei die Zellteilungsrate vom jeweiligen Zelltyp und den jeweiligen Kulturbedingungen abhängt. Das Auftreten von Zell­ teilungen in der Kultur und die Zellteilungsrate können anhand der vorstehend genannten bekann­ ten Verfahren überwacht werden. Generell erhöht sich die Sensitivität des Testverfahrens, d. h. die Nachweisempfindlichkeit gegenüber Defekten im MMR-System der kultivierten Zellen und damit der zu untersuchenden Person, mit der Dauer der Kultivierung bzw. mit der Anzahl der Zelltei­ lungen, die die kultivierten Zellen durchlaufen. Die Kultivierungsdauer wird bei nicht­ immortalisierten Zellen durch das Auftreten von massivem Zelltod der Zellen in der Kultur be­ grenzt, der wiederum anhand der genannten bekannten Verfahren überwacht werden kann. Die Kultivierungsdauer beträgt üblicherweise 2 bis 15 Tagen, vorzugsweise 3 bis 10 Tage. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 3 bis 5 Tagen, wobei eine Kultivierung für 3 Tage ebenfalls besonders bevorzugt ist und sich insbesondere für aus Patientenblut isolierte Lympho­ zyten eignet.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden anschließend ausgehend von den kultivierten nicht-neoplastischen Zellen DNA-Präparationen gewonnen. Die Gewinnung erfolgt durch Extraktion der genomischen DNA aus den Zellen nach an sich bekannten Verfahren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Extraktion so durchgeführt, daß die erhaltene genomische DNA-Präparation geeignet ist, direkt als solche als DNA-Probe gemäß der Erfindung in einer anschließend durchgeführten PCR-Reaktion mit sequenzspezifischen Primern eingesetzt zu werden. Dieses Verfahren beruht auf der Extraktion einzelner Zellen ("single-cell PCR"; Einzelzell-PCR) und ist beispielsweise in Kupper et al., Ann. Oncol 7, Beil. 4 (1996), S. 35-39 beschrieben. Bei Anwendung dieses Extraktionsverfahrens werden beispielsweise durch Verdünnungsreihen einzelne oder einige wenige Zellen, z. B. etwa 1-5 Zellen, vorzugsweise etwa 3-5 Zellen, und besonders bevorzugt etwa 3 Zellen vereinzelt und anschließend extrahiert und der PCR unterworfen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die kultivierten nicht- neoplastischen Zellen insgesamt einer DNA-Extraktion unterzogen, um DNA-Präparationen zu gewinnen. Bekannte Verfahren zur DNA-Extraktion kultivierter Zellen sind beispiels­ weise in Molecular Cloning; A Laboratory Handhook, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Aufl. (1989) beschrieben. Für die DNA-Extraktion gemäß der Erfindung stehen zahlreiche weitere, z. T. kommerziell vertriebene Verfahren zur Verfügung, die statt der beschriebenen Technik eingesetzt werden können.

Generell sind die DNA-Proben, die aus den extrahierten DNA-Präparationen aus den kulti­ vierten Zellen hergestellt werden, bezüglich ihrer DNA-Menge bzw. der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation (bzw. der Komplexität der in ihnen enthaltenen DNA-Moleküle) so eingestellt bzw. beschaffen, daß im anschließend durchgeführten Nachweisverfahren einzelne mutierte DNA-Sequenzen zuverlässig nachgewiesen werden können, was wiederum von der Sensitivität des verwendeten Nachweisverfahrens abhängt. Vorzugsweise entsprechen die erfindungsgemäßen DNA-Proben bezüglich DNA-Menge bzw. der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation der genomischen DNA etwa einer oder einiger weniger kultivierter nicht-neoplastischer Zellen, vorzugsweise 3-15 Zellen, besonders bevorzugt 3-5 Zellen und insbesondere bevorzugt 3 Zellen. Dies schließt DNA-Proben mit ein, die bezüglich ihrer DNA-Menge bzw. der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation einem einzelnen Allel einer kultivierten nicht-neoplastischen Zelle entsprechen.

Wenn die DNA-Präparation durch Extraktion der kultivierten nicht-neoplastischen Zellen insgesamt gewonnen wird, wird sie zur Herstellung von DNA-Proben für eine anschließende PCR-Amplifikation so verdünnt, daß die DNA-Menge in der zu amplifizierenden Probe der DNA-Menge etwa einer oder einiger weniger Ausgangszellen entspricht. Bei Anwendung von Einzelzell-PCR wird die Zahl der Ausgangszellen pro Ansatz so gewählt, daß die erhal­ tenen DNA-Proben den vorstehend genannten Anforderungen hinsichtlich der DNA-Menge bzw. der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation entsprechen.

Die DNA-Proben aus den kultivierten Zellen werden anschließend einer PCR unterworfen. Es werden mehrere parallele Ansätze vorbereitet, in denen einzelne DNA-Proben, die von den kulti­ vierten Zellen der zu untersuchenden Person stammen und gemäß dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren gewonnen wurden, mit jeweils gleicher DNA-Menge und unter Verwendung gleicher Reaktionsbedingungen amplifiziert werden. Vorzugsweise werden 5-20 parallele DNA-Proben in der PCR amplifiziert, besonders bevorzugt 5-10 parallele Proben.

Gleichzeitig zu den DNA-Proben, die sich von der zu untersuchenden Person ableiten, können als Kontrolle DNA-Proben amplifiziert werden, die von einer Person stammen, die nicht an einem Defekt im MMR-System leidet. Als Kontroll-DNA-Proben werden vorzugsweise Proben ver­ wendet, die nach dem gleichen Verfahren wie die zu untersuchenden Proben gewonnen wurden. Dabei kann für die Amplifikation auch auf DNA-Proben aus standardisierten Kontroll-DNA- Präparationen zurückgegriffen werden, die nicht parallel zu den konkret zu untersuchenden Prä­ parationen bzw. Proben hergestellt wurden. Solche standardisierten Präparationen können z. B. für verschiedene Zelltypen und für verschiedene definierte Kulturbedingungen und mutagene Stimuli hergestellt und aufbewahrt werden, um dann bei der Durchführung des erfindungsgemä­ ßen Testverfahrens zur Herstellung von Kontroll-DNA-Proben zu dienen. Die Kontroll-DNA- Proben enthalten vorzugsweise die gleiche DNA-Menge bzw. die Sequenzinformation entspre­ chend der gleichen Anzahl von Zellen wie die zu untersuchenden DNA-Proben und werden unter den gleichen Bedingungen in der PCR amplifiziert.

Für jedes Gen oder jeden Abschnitt in der DNA-Probe können sequenzspezifische Primer einge­ setzt werden, vorausgesetzt, das Primerpaar eignet sich zur Amplifikation und zum anschließen­ den Nachweis von Mutationen. Besonders geeignet sind Mikrosatelliten-DNA-spezifische Pri­ mer, da bei HNPCC-Patienten Mutationen dieser DNA-Sequenzen gefunden werden, und da Mutationen in den Mikrosatelliten durch die veränderten Längen der mutierten DNA-Abschnitte leicht nachgewiesen werden können. Das erfindungsgemäße Testverfahren ist jedoch nicht auf die Untersuchung von Mikrosatelliten beschränkt, sondern kann auch zur Analyse anderer Abschnitte des Genoms und zum Nachweis anderer Arten von Mutationen (z. B. Mismatch-Mutationen) eingesetzt werden. Es können auch mehrere Primerpaare, die z. B. für verschiedene Mikrosatelli­ ten-DNA-Sequenzen spezifisch sind, in parallelen Ansätzen verwendet werden. Die Primer kön­ nen zudem mit einer radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierung versehen sein, um den Nachweis des Amplifikationsproduktes zu erleichtern, z. B. ³²P-markierte Primer oder Digoxi­ genin- oder Fluoreszenz-markierte Primer. Alternativ kann die PCR auch in Anwesenheit radio­ aktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotidbausteine durchgeführt werden.

Die Analyse der Amplifikationsprodukte ist mittels zahlreicher bekannter Techniken möglich. Vorzugsweise erfolgt die Analyse durch Auftrennung der Amplifikationsprodukte in den Ansät­ zen auf einem Gel, etwa einem herkömmlichen Sequenziergel, oder in einem automatischen DNA-Sequencer. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist z. B. die Analyse von SSCP ("single strand conformation polymorphism"; Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse), etwa nach dem von Teschauer et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 43 (1996), S. 125-131 beschriebenen Verfahren. Bevorzugt sind auch denaturierende Gradientengele, z. B. im Rahmen von TGGE (Temperaturgradienten-Gelelektrophorese) oder DGGE (Denaturierungsgradienten- Geleleklrophorese). Es ist auch möglich, die Produkte der Amplifikation zu sequenzieren, um detailliertere Informationen über die Art der gefundenen Mutationen zu erhalten.

Wenn bei Verwendung von Mikrosatelliten-DNA-spezifischen Primern die einzelnen PCR- Produkte in den Ansätzen nach Auftrennung auf einem Gel oder nach einem anderen Nachweis­ verfahren unterschiedliche Längen zeigen, so ist das ein Beleg für Mikrosatelliteninstabilität in den nicht-neoplastischen Zellen der zu untersuchenden Person. Die Anzahl der Längenunter­ schiede kann auch, wie vorstehend erwähnt, mit der bei gegebenenfalls parallel analysierten Kon­ troll-Ansätzen auftretenden Anzahl von Längenunterschieden verglichen werden, um die Diagno­ se eines MMR-Defektes bzw. von HNPCC oder einer diesbezüglichen Prädisposition zu erhärten. Es ist auch möglich, durch Standardisierung des Verfahrens den Grad bzw. das Ausmaß des funktionellen Defekts im MMR-System für eine bestimmte Mutation in einem MMR-Gen zu bestimmen.

Wie vorstehend erwähnt kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet werden, bei Personen mit nachgewiesenen Mutationen in MMR-Genen die Frage zu klären, ob es sich dabei um Mutationen handelt, die zu einem funktionellen Defekt im MMR-System führen. Es ist auch möglich, bei Personen mit nachgewiesenen Mutationen in bestimmten Genen, für die eine Bedeu­ tung für das MMR-System vermutet wird, den Einfluß der Mutation auf die Funktion des MMR- Systems zu untersuchen und somit die Frage der Beteiligung des mutierten Gens am MMR- System zu klären.

Die Figur zeigt in schematischer Übersicht eine bevorzugte Vorgehensweise gemäß der Erfin­ dung. Aus einer Blutprobe eines Patienten werden Lymphozyten gewonnen und in Kultur ge­ nommen. Im Verlauf der Kultivierung werden die Zellen durch Zugabe einer mutagenen Substanz mutagenem Streß ausgesetzt. Bei Vorliegen eines Defektes im MMR-System der kultivierten Lymphozyten führt diese Behandlung zur Akkumulation von Mutationen in der genomischen DNA sich teilender Zellen. Insbesondere treten im Rahmen solcher Mutationen Längenverände­ rungen in den Mikrosatelliten-DNA-Sequenzen der Zellen auf. Nach Beendigung der Kultivie­ rungsphase wird zur Herstellung von DNA-Proben die genomische DNA aus den Zellen extra­ hiert. Die DNA-Menge der Proben wird dabei so eingestellt, daß sie der Menge an genomischer DNA von 0,5-3 Zellen aus der Kultur entspricht. Mehrere der so gewonnenen DNA-Proben werden dann parallel in der PCR mit Mikrosatelliten-DNA-spezifischen Primern amplifiziert (wie für einen Ansatz in der Figur dargestellt). Die durch Mutation induzierten Längenunterschiede in den beiden Allelen (in der Figur idealisiert als Balken unterschiedlicher Länge dargestellt) spiegeln sich auch in den amplifizierten DNA-Produkten wieder und können nach Auftrennung auf einem Sequenziergel nachgewiesen werden (in der Darstellung des Gels der Figur für 2 unterschiedliche Mikrosatelliten-DNA-Sequenzen mit je 5 Parallelansätzen dargestellt).

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testverfahrens im Detail und dienen zudem der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Blutabnahme und Ansetzen einer Lymphozytenkultur

Dem zu untersuchenden Patienten wird Vollblut abgenommen, wobei die Abnahme in ein Röhrchen mit einer vorgelegten Menge an Citratpuffer erfolgt, die ausreicht, während der Wei­ terverarbeitung des Patientenblutes die Gerinnung zu hemmen. Zur Abtrennung der Lymphozyten werden 10 ml des abgenommenen Blutes auf 3 ml Ficoll-Lösung (Dichte 1,077 g/l) in einem 15 ml-Teströhrchen geschichtet. Anschließend erfolgt Zentrifugation bei Raumtemperatur für 15 Minuten bei 400 g in einer Mischzentrifuge. Die Zentrifuge wird langsam abgebremst, und der Überstand (Plasma) wird abgenommen und verworfen. Der erhaltene Lymphozytenring wird mit möglichst wenig Plasma und Ficoll in ein neues 15 ml-Teströhrchen überführt. Die darin enthalte­ nen Zellen werden mit 5 ml RPMI-1640-Medium (Rosswell Park Memorial Inst.) mit 10% föta­ lem Kälberserum (fetal calf serum; FCS) gewaschen. Anschließend erfolgt eine weitere Zentrifu­ gation für 5 Minuten bei 400 g. Der Überstand wird abdekantiert und dieser Waschschritt wieder­ holt. Anschließend werden die pelletierten Zellen in 5 ml RPMI-1640-Medium mit 10% FCS und 50 µg/ml PHA (Phytohämagglutinin, Leukagglutinin) resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt, um eine Lymphozytenkultur herzustellen. Die Lymphozytenkultur wird dann bei 36°C unter CO₂-Begasung für 3 Tage im Brutschrank inkubiert.

Beispiel 2 Zugabe eines mutagenen Stimulus zur Lymphozytenkultur

Der gemäß Beispiel 1 angesetzten Lymphozytenkultur wird zu Beginn der Kultivierung 5-Fluorouracil in einer Endkonzentration von 1 µM zugesetzt. Nach 24 Stunden Kultivierung wird PHA aus dem Kulturmedium entfernt und die 5-Fluorouracilkonzentration auf 0,1 µM reduziert. Hierzu wird die Kulturflüssigkeit mit weiteren 7,5 ml RPMI-1640-Medium mit 10% FCS ge­ mischt. Anschließend werden die Zellen schonend pelletiert (350 g, 5 Minuten, schnelles Abbrem­ sen). Die Zellen werden dann in 5 ml RPMI-1640-Medium mit 10% FCS und 0,1 µM 5-Fluorouracil ohne PHA resuspendiert und für weitere 48 Stunden unter den vorstehend genann­ ten Inkubationsbedingungen im Brutschrank inkubiert.

Beispiel 3 Gewinnung der Zellen nach Kultivierung

Nach Ende der Kultivierung werden 7,5 ml Medium zu der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Lym­ phozytenkultur gegeben. Es folgt sanftes Suspendieren der Zellen in der Kulturflüssigkeit von Hand ohne Einsatz eines Vortex. Vor Durchführung der DNA-Extraktion wird die Gesamtzahl der kultivierten Zellen mittels Durchflußzytometrie in einem laborüblichen Zell-Counter be­ stimmt. Hierzu wird ein Aliquot der Kulturflüssigkeit im Zell-Counter ausgezählt. Die Gesamt­ zahl kultivierter Zellen wird anschließend aus dem Gesamtvolumen des Kulturmediums und der im Zell-Counter bestimmten Zelldichte in der Kultur berechnet. Die Kulturflüssigkeit wird dann zu gleichen Teilen auf zwei Teströhrchen aufgeteilt und die Zellen werden für 5 Minuten bei 350 g pelletiert. Die Zellen eines der so erhaltenen Lymphozytenpellets werden tiefgefroren, um die Möglichkeit nachfolgender Analysen z. B. bezüglich weiterer Mikrosatelliten-DNA-Sequenzen offenzuhalten. Hierzu werden die Zellen des Pellets in I ml kaltem Einfriermedium (50% FCS, 10% DMSO, 40% RPMI-1640-Medium) resuspendiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Beispiel 4 Herstellung von DNA-Proben für die PCR

Zur Extraktion der genomischen DNA aus den gemäß Beispiel 3 erhaltenen Zellen (d. h. entweder direkt von der Kultur gewonnene oder nach Zwischenlagerung in Einfriermedium erhaltene Zel­ len) werden die Zellen nach einem oder mehreren Waschschritten mit kaltem PBS abzentrifugiert. Bei Anwendung mehrerer Waschschritte die zu einem Verlust von Zellen führen können, wird die Gesamtzellzahl vor dem letzten Waschschritt erneut mittels Durchflußzytometrie gemäß den Angaben in Beispiel 3 bestimmt. Das nach dem letzten Waschschritt erhaltene Zellpellet wird in einem Verdauungspuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl pH 8, 25 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K) resuspendiert (10⁸ Zellen/ml Puffer). Die Zellen werden dann für mind. 3 Stunden bei 37°C unter regelmäßigem Schütteln (in einem Schüttelwasserbad oder auf einer Schüttelplattform in einem Brutraum oder einem Inkubator) inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, und 30% des Ausgangsvolumens an gesättigter NaCl-Lösung (Raumtemperatur) werden hinzugefügt gefolgt von kräftigem Durchmi­ schen (15 Sekunden Vortex). Es folgt Zentrifugation für 10 Minuten bei 12 000 g und Überführen des Überstands in ein frisches Reaktionsgefäß. Nach Abkühlung auf 4°C wird das doppelte Vo­ lumen 100% Ethanol (-20°C) hinzugegeben und die DNA durch Schütteln der Mischung gefällt. Die DNA wird dann durch Zentrifugation (12 000 g) pelletiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Über die Extinktion bei 260 nm wird die Konzentrati­ on an DNA im TE-Puffer bestimmt. Zur Herstellung von DNA-Proben für die PCR wird die DNA mit TE anschließend soweit verdünnt, daß sich in 5 µl erhaltener DNA-Probe die DNA- Menge befindet, die rechnerisch der Menge an genomischer DNA von 3 Zellen entspricht (wobei als Menge genomischer DNA pro Zelle von einem Wert von 6,4 pg DNA ausgegangen wird; siehe z. B. Molecular Cell Biology, Lodish et al., Scientific American Books, W.H. Freeman and Company, New York, 3. Aufl. (1995), S. 312).

Beispiel 5 Amplifikation von Mikrosatelliten-DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR)

Ausgehend von den gemäß Beispiel 4 erhaltenen DNA-Proben werden mittels PCR zwei ver­ schiedene Mikrosatelliten-DNA-Sequenzen amplifiziert: D2S123, ein CA-Dinukleotidrepeat auf Chromosom 2, und BAT 40, ein A-Mononukleotidrepeat (HSD3B-Gen, chromosomale Lokali­ sation 1p13.1). Hierzu werden Primer mit den folgenden Sequenzen verwendet:

• a) D2S123 (CA-Dinukleotidrepeat):
  5'-ACA TTG CTG GAA GTT CTG GC-3' (upper primer; SEQ ID-NO:1)
  5'-CCT TTC TGA CTT GGA TAC CA-3' (lower primer; SEQ ID-NO:2)
  Zu erwartende Länge des PCR-Produktes gemäß Sequenz embl:hs093xh3 aus der EMBL- Datenbank: 140bp.
• b) BAT 40 (A-Mononukleotidrepeat):
  5'-ATT AAC TTC CTA CAC CAC AAC-3' (upper primer; SEQ ID-NO:3)
  5'-GTA GAG CAA GAC CAC CTT G-3' (lower primer; SEQ ID-NO:4)
  Zu erwartende Länge des PCR-Produktes gemäß Sequenz emhum1:hsbhsd aus der EMBL- Datenbank: 126bp.

Dabei ist jeweils ein Primer der beiden vorstehend genannten Primerpaare an seinem 5'-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Für jede zu amplifizierende Mikrosatelliten-DNA werden 5 parallele PCR-Ansätze vorbereitet. Jeder dieser Ansätze enthält als DNA-Probe bzw. Template 5 µl der gemäß Beispiel 4 verdünnten genomischen DNA. Zusätzlich zu den Ansätzen mit Patien­ ten-DNA werden für jede zu amplifizierende Mikrosatelliten-DNA-Sequenz als Kontrolle 5 parallele Ansätze vorbereitet, die als Probe bzw. Template eine den Ansätzen mit Patienten-DNA entsprechende Menge an genomischer DNA von Lymphozyten einer gesunden Person enthält, wobei von der gesunden Person bekannt ist, daß sie nicht an einem Defekt im Mismatch- Reparatursystem leidet. Die Kontroll-DNA-Präparation wurde nach dem gleichen Verfahren von der gesunden Person gewonnen wie die Patienten-DNA-Präparation vom zu untersuchenden Patienten. Die vorbereiteten Ansätze werden anschließend einer PCR mit 35 Zyklen mit einer Annealing-Temperatur von 55°C für den Mikrosatelliten D2S123 bzw. von 51°C für den Mikro­ satelliten BAT 40 unterzogen. Die PCR wird entsprechend üblicher Vorgehensweisen durchge­ führt (2,5 U Taq-Polymerase pro Ansatz von 100 µl Volumen, Denaturierung bei 94°C, Polyme­ rase-Reaktion bei 72°C, je eine Minute pro Zyklusschritt).

Beispiel 6 Nachweis der amplifizierten Mikrosatelliten-DNA

Nach Beendigung der PCR gemäß Beispiel 5 werden die Amplifikationsprodukte der einzelnen Ansätze gemäß bekannter Verfahren in einem automatischen DNA-Sequencer aufgetrennt und mittels der Fluoreszenzmarkierung der Primer nachgewiesen. Parallel zu den PCR-Produkten werden geeignete markierte Größenmarker aufgetrennt, die zusätzlich direkte Informationen bezüglich der Längen der PCR-Produkte liefern.

Beispiel 7 Auswertung der Nachweisergebnisse

Die Ergebnisse der Auftrennung gemäß Beispiel 6 werden dahingehend analysiert, ob bzw. wie oft die Amplifikationsprodukte sowohl der Patienten-DNA-Proben als auch der Kontroll-DNA- Proben jeweils untereinander Längenunterschiede aufweisen. Finden sich unter den Amplifikati­ onsprodukten der Patienten-DNA-Proben signifikant mehr Längenunterschiede als bei der Kon­ trolle (d. h. eine gegenüber der Kontrolle signifikant erhöhte Längenheterogenität), so belegt dies eine vorliegende Mikrosatelliteninstabilität und somit einen MMR-Defekt in den kultivierten Zellen des untersuchten Patienten.

Claims (10)

1. Testverfahren zur Feststellung des Vorliegens eines erblich bedingten Defekts im Mis­ match-Reparatursystem bei einer zu untersuchenden Person, umfassend

• a) Kultivierung von nicht-neoplastischen Zellen der zu untersuchenden Person unter Bedingungen, die Zellteilung erlauben, wobei vor und/oder während der Kultivierung ein mutagener Stimulus gegeben wird;
• b) Herstellung mehrerer DNA-Proben aus den kultivierten Zellen, die jeweils in ihrer DNA-Menge oder bezüglich der in ihnen enthaltenen Sequenzinformation der ge­ nomischen DNA etwa einer oder einiger weniger dieser Zellen entsprechen,
• c) Amplifikation bestimmter Abschnitte der DNA-Proben mittels der Polymerase- Kettenreaktion unter Einsatz sequenzspezifischer Primer; und
• d) Analyse der Amplifikationsprodukte hinsichtlich des erhöhten Auftretens von Muta­ tionen innerhalb der amplifizierten Sequenzen.

2. Testverfahren gemäß Anspruch 1, das auf die Feststellung des Vorliegens eines erblich bedingten nicht-polypösen Colonkarzinoms (hereditary non-polyposis colorectal cancer; HNPCC) oder einer diesbezüglichen Prädisposition bei einer zu untersuchenden Person gerichtet ist.

3. Testverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Amplifikation der DNA-Proben unter Einsatz von Mikrosatelliten-DNA-spezifischen Primern erfolgt.

4. Testverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei es sich bei den nicht-neoplastischen Zellen um Lymphozyten handelt.

5. Testverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei der mutagene Stimulus in der Zugabe von mutagenen Substanzen zu der Kultur besteht.

6. Testverfahren gemäß Anspruch 5, bei dem es sich bei der mutagenen Substanz um Me­ thotrexat, Azathioprin, 6-Mercaptopurin oder 5-Fluorouracil handelt.

7. Testverfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei der mutagene Stimulus ein physikali­ scher Stimulus ist.

8. Testverfahren gemäß Anspruch 7, wobei der physikalische Stimulus in einer Bestrahlung mit γ-Strahlen, Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen besteht.

9. Verwendung von Mikrosatelliten-DNA-spezifischen Primern in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei den Primern um ein Primerpaar mit jeweils der Sequenz SEQ ID-NO:1 und SEQ ID-NO:2 oder der Sequenz SEQ ID-NO:3 und SEQ ID-NO:4 handelt.