DE10214788A1 - Verfahren zum Nachweis einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponieredem Gen - Google Patents

Verfahren zum Nachweis einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponieredem Gen

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Abstract

Das Verfahren dient zum Nachweis einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponierendem Gen. Markierte DNA wird unter Verwendung von stationären Oligonukleotiden hybridisiert. Anschließend wird eine Analyse auf spezifische Nukleinsäuresequenzen durchgeführt.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponierendem Gen.
  • Hereditäre kolorektale Karzinome machen etwa 10% aller jährlich neu entdeckten kolorektalen Karzinome aus. Die Diagnose eines solchen hereditären kolorektalen Karzinomes hat weitreichende Konsequenzen nicht nur für den Betroffenen, dessen Zweitkarzinom-Risiko signifikant höher ist als in der Gesamtpopulation. Auch Angehörige ersten Grades sind bei diesen autosomal dominant vererbten Erkrankungen zu 50% betroffen. Der Nachweis einer Mutation bei dem Erkrankten ermöglicht das Screening seiner Angehörigen.
  • Aufwendige und von der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechsel empfohlene, engmaschige Überwachungsmaßnahmen wie die zunächst 2-jährliche, ab dem 40. Lebensjahr jährliche Koloskopie sind für die Früherkennung von Karzinomen bei Genträgern unter den Nachkommen essentiell. Kann eine Mutation in diesen Nachkommen jedoch ausgeschlossen werden, so erübrigt sich auch eine den Angehörigen belastende und sehr teure Diagnostik. Ein solcher Ausschluß einer Mutation bei Angehörigen erfordert jedoch den Mutationsnachweis bei der an einem HNPCC-erkrankten Person. Mit den bislang verwendeten konventionellen Sequenzierungstechniken kann aufgrund des hohen Aufwandes und der Dauer der Prozedur nur ein kleiner Teil der Patienten erfasst werden.
    • Hereditäre kolorektale Karzinome
  • Hereditäre Syndrome machen etwa 10% aller diagnostizierten kolorektalen Karzinome aus. Von diesen vererbbaren kolorektalen Karzinomen ist die Mehrzahl auf autosomal dominante Defekte von Mismatch-Repair-Genen zurückzuführen. Mismatch-Repair-Gene kodieren für Enzyme, die Fehler bei der DNA Replikation erkennen und beheben. Diese Gendefekte führen durchschnittlich mit dem 48. Lebensjahr bei etwa 80% der Gendefekt-Träger zu hereditären, nichtpolypösen Karzinomen (HNPCC) des Kolon und Rektum. Das Manifestationsalter liegt damit um 10-15 Jahre vor dem Auftreten sporadischer kolorektalen Karzinome. Neben dem Auftreten von kolorektalen Karzinomen (nach dem Erstbeschreiber Lynch-I Syndrom) mit synchronen (15%) und metachronen Läsionen (70% nach 15 Jahren) sind auch Patienten mit extrakolischen Karzinom-Manifestationen beschrieben worden. Diese Patienten mit einem Defekt des DNA Mismatch-Repair-Systems werden dem Lynch-II Syndrom zugeordnet. Zu diesen Tumorentitäten zählen das Endometrium-, Ovarialkarzinome, Magen- und Dünndarm-Karzinom, das cholangiozelluläre Karzinom, Harnwegskarzinome, Malignome des zentralen Nervensystems sowie andere seltenere Tumoren.
  • Auch bei der selteneren familiären Polyposis coli (FAP) liegt ein autosomal dominanter Erbgang vor. Mutationen des APC-Genes führen dann mit einer nahezu 100% Wahrscheinlichkeit zu kolorektalen Karzinomen bereits vor dem 40. Lebensjahr. Ab dem 20. Lebensjahr finden sich bei nahezu 100% der Gendefekt-Träger bereits hunderte von Polypen im gesamten Kolorektum, noch vor dem 40. Lebensjahr beträgt die Inzidenz kolorektaler Karzinome 100%. Diese Erkrankung macht etwa 1-3% aller hereditären kolorektalen Karzinome aus. Neben dem Kolon und Rektum kann auch der obere Gastrointestinaltrakt betroffen sein. Darüber hinaus sind follikuläre und papilläre Schilddrüsenkarzinome sowie Hepatoblastome beschrieben worden. Beim Gardnerschen Syndrom ist diese FAP mit periampulären Karzinomen, Osteomen, Desmoidtumoren, Epidermoidzysten und Angiofibromen assoziiert. Gleichzeitiges Auftreten von Medulloblastomen spricht für ein Turcot-Syndrom.
  • Molekulare Grundlagen von HNPCC und FAP
  • Das hereditäre nichtpolypöse kolorektale Karzinom ist wie bereits beschrieben mit der Mutation eines der Mismatch- Repair-Enzym-Gene assoziiert. Defekte im Bereich der DNA, die auf eine fehlerhafte Mismatch Repair zurückzuführen sind, lassen sich indirekt über eine sogenannte Mikrosatelliteninstabilität nachweisen. Mikrosatelliten sind sich wiederholende Basensequenzen, die über die gesamte genomische DNA des Menschen vorkommen. Diese Mikrosatelliten zeigen für alle Körperzellen des Individuums eine charakteristische Anzahl an Wiederholungen, die interindividuell variieren. Bei Vorliegen eines HNPCC finden sich bei 90% dieser Patienten Längendifferenzen der Mikrosatelliten zwischen Tumor und gesundem Kolongewebe. Diese Längendifferenzen werden als Mikrosatelliteninstabilität (MSI) bezeichnet und finden sich bei den sporadischen kolorektalen Karzinomen in nur 20% der Patienten. Eine Untersuchung auf MSI wird daher bislang als Screeningverfahren bei Verdacht auf Vorliegen eines HNPCC durchgeführt. Auch wenn das Vorliegen einer MSI den Verdacht auf ein HNPCC verstärkt, so ermöglicht erst der Nachweis der Mutation eines der beteiligten Mismatch- Repair-Gene ein Screening der Angehörigen und die Klärung der Frage, ob dieser autosomal dominante Gendefekt vererbt wurde. Dabei kann dieser Keimbahndefekt nicht nur im Tumorgewebe sondern beliebigen, kernhaltigen Zellen des Körpers nachgewiesen werden.
  • Nach Charakterisierung von Mismatch-Repair-Systemen in E. coli und S. cerivisiae konnten auch im Menschen bislang 6 Gene charakterisiert werden, die in dem Mismatch-Repair- System involviert sind:
    Unterschieden werden MutS Homologe wie hMSH2, hMSH3 und das GT bindende Protein GTBP/p160 (hMSH6) sowie MutL Homologe wie hMLH1, hPMS1 und hPMS2. Mutationen in hMSH2 und hMLH1 machen dabei 65% aller Mutationen bei HNPCC aus.
  • Das hMSH2 und das GTBP (hMSH6) erkennen eine Vielzahl einzelner Nukleotid-Fehler sowie Loops in der Intermediärphase nach DNA-Replikation. Die Erkennung des inkorrekten Stranges erfolgt entweder durch die vorübergehende Hypomethylierung oder transiente Nicks im Tochterstrang. Anschließend kommt es zur Dimerisierung des hMLH1 und des hPMS2, dieses Dimer bindet nachfolgend an den an dem DNA-Strang befindlichen hMSH2/GTBP-Komplex. Dieses Verhalten ist in Fig. 1 dargestellt. Die Exzision des inkorrekten Stranges erfolgt durch DNA-Exonuklease und Helicase. Nachfolgend wird die Reparatur durch eine DNA- Polymerase abgeschlossen. Die besondere Bedeutung von PMS1 und MSH3 ist noch nicht verstanden. Bereits in Bakterien und Hefen konnte gezeigt werden, das Defekte im MMR-System insbesondere zu instabilen (GT)n-Regionen führen. MSI sind die Folge von ungleichem crossing over in Folge der Defekte bei Replikation der DNA. Es ist anzunehmen, dass weitere Gene oder Systeme bei Entstehung kolorektaler Karzinome bei HNPCC-Familien involviert sind, da ein kleiner Teil dieser HNPCC-Familien keine Mutation in den bekannten MMR-Genen aufweist.
  • Die familiäre adenomatöse Polyposis ist auf eine Mutation im APC-Gen zurückzuführen. Die Sequenzierung dieses Genes ist sowohl bei der FAP als auch der attenuierten Form (über 20 Adenome) dieser Erkrankung indiziert. Das APC-Gen ist charakterisiert und abhängig von der Art der Mutation (Frameshift, Trunkierung, Basenaustausch) kommt es zu unterschiedlicher Ausprägung des Phänotyps dieser Erkrankung. Die FAP macht etwa 1%-2% aller kolorektalen Karzinome aus. Das APC-Gen kodiert für ein Enzym zur Phosphorylierung und Degradation von β-Cathenin. Durch eine Mutation des APC-Genes kommt es dann zur Akkumulation von β-Cathenin und subsequenter Aktivierung des Transkriptionsfaktors Tcf-4. In 80% liegen trunkierende Mutationen vor. Häufig findet sich eine Mutation des einen- und Deletion des anderen Alleles.
  • Der Nachweis von Mutationen in einem der Mismatch-Repair- Gene, dem APC- oder anderer für hereditäre Erkrankungen prädisponierende Gene mit konventionellen Sequenzierungsmethoden gestaltet sich bislang als sehr zeitaufwendig und arbeitsintensiv und teuer. Der Nachweis einer solchen Mutation ist hingegen für die Stellung der Diagnose und das Screening der Nachkommen sehr wertvoll, da mit dem Fehlen der in dem Familienmitglied vorbeschriebenen Mutation ein erhöhtes Risiko, an einem HNPCC oder einer FAP zu erkranken ausgeschlossen werden kann. Dies würde auch die für den Patienten belastende endoskopische Diagnostik erübrigen, Kosten einsparen und Ressourcen für die von dem Gendefekt betroffenen Familienangehörigen schaffen. Darüber hinaus würde ein sehr viel schnellerer Mutationsnachweis zu einer größeren Bereitschaft bei den Familienangehörigen führen, im Falle einer nachgewiesenen Mutation eines entsprechende Diagnostik durchführen zu lassen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren der einleitend genannten Art derart anzugeben, daß übliche den Patienten belastende und aufwendige Diagnostik- Verfahren vermieden und durch ein laborartiges gentechnisches Analyseverfahren ersetzt werden, das reproduzierbare Analysedaten für eine anschließende medizinische Interpretation bereitstellt.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß markierte DNA unter Verwendung von stationären Oligonukleotiden hybridisiert wird und daß anschließend eine Analyse auf spezifische Nukleinsäuresequenzen durchgeführt wird.
  • Vom Patienten spezifisch amplifizierte DNA wird mit Oligonukleotiden hybridisiert, die mindestens eine aller denkbaren Punktmutationen, Deletionen und Insertionen aller bei hereditären nichtpolypösen kolorektalen Karzinomen betroffenen Gene repräsentieren. Das Hybidisierungsverhalten der markierten, beispielsweise Fluoreszenzmarkierten, amplifizierten DNA gibt dann Aufschluss über die vorliegende Mutation. Dieses Sequenzierungsverfahren ist dabei nicht nur wesentlich schneller als die konventionelle Sequenzierung, es können in einem Ansatz auch sämtliche bekannte Mismatch-Repair-Gene überprüft werden und die Mutationsanalyse wird kostengünstiger. Darüber hinaus wird das im folgenden beschriebene System die Untersuchung eines signifikant höheren Patientenkollektivs ermöglichen und zur Senkung der Mortalität bei betroffenen Angehörigen von Erkrankten mit hereditären kolorektalen Karzinomen beitragen.
  • Durch die Erfindung wird ein Verfahren zum schnellen und kostengünstigen Nachweis von Mutationen bei Verdacht auf ein hereditäres nichtpolypöses kolorektales Karzinom oder eine familiäre Polyposis coli unter Zuhilfenahme der DNA- Chip Technologie bereitgestellt. Nach spezifischer Amplifikation von DNA aus peripheren Leukozyten derjenigen Patienten, bei denen ein hochgradiger Verdacht auf ein HNPCC oder eine FAP besteht, führt die Hybridisierung entsprechend markierter DNA mit stationären Oligonukleotiden, die alle möglichen Punktmutationen, Insertionen und Deletionen einzelner Basen der bekannten Mismatch-Repair-Gene sowie des APC-Genes repräsentieren, zur Ermittlung der spezifischen Mutation. Größere Deletionen und Insertionen beliebiger Länge werden durch Oligonukleotide mit terminal modifizierten Basen detektiert. Diese innerhalb von 1-2 Tagen durchzuführende Mutationsanalyse stellt die Grundlage für das Screening der in 50% betroffenen Familienangehörigen dar.
  • Neben einer effizienten und kostengünstigen Sequenzierung der möglicherweise betroffenen Mismatch-Repair-Gene oder des APC-Genes kann durch dieses gegenüber der konventionellen Sequenzierung sehr zeitsparende Verfahren eine erhöhte Bereitschaft bei den erstgradigen Familienangehörigen zur genetischen Beratung und Untersuchung bezüglich des in der Familie vorbeschriebenen genetischen Defektes erreicht werden. Ein solches Screening der Verwandten kann erheblich zur Reallokation diagnostischer Ressourcen und zur signifikanten Senkung der Mortalität bei diesen Erkrankungen führen.
  • In den Zeichnungen sind Ausführungsbeispiele der Erfindung schematisch dargestellt. Es zeigen:
  • Fig. 1 ein funktionelles und zeitliches Modell des Mismatch-Repair-Systems und
  • Fig. 2 eine schematische Darstellung der spezifischen Amplifikation und Markierung von DNA vor einer Hybridisierung mit Oligonukleotiden des DNA-Chips.
    • DNA-Chip Technologie
  • Mit Hilfe der Gen-Chip-Technologie die beispielsweise in den Veröffentlichungen US 5445934, US 5744305, US 5700637, US 5945334, EP 0619321 und EP 0373203 beschrieben wird, können spezifische Nukleinsäure-Sequenzen analysiert und Punktmutationen sowie singuläre Deletionen detektiert werden. Zu diesem Zwecke sind arrays von Oligonukleotid- Proben auf einem Glas-Träger synthetisiert. Die Herstellung dieser Chips erfolgt durch photolithographische Oligonukleotidsynthese. Auf einem Silikon-Träger können mittlerweile über 800.000 verschiedene Oligonukleotid- Proben untergebracht werden. Jede einzelne Probe ist in einer etwa 18 µm durchmessenden Zelle untergebracht und beinhaltet etwa 107 Kopien der entsprechenden Oligonukleotid-Probe.
  • Diese nach vorgegebenen Spezifikationen herzustellenden DNA-Arrays werden dann mit markierten PCR-Produkten aus spezifisch amplifizierter DNA des Patienten hybridisiert.
  • Der so hybridisierte Array wird mit Hilfe eines Lasers in einem dafür konstruierten Scanner analysiert, indem durch den Laser angeregte Fluoreszenz der hybridisierten DNA an den Oligonukleotid-Proben quantifiziert wird. Dies ermöglicht die Bestimmung gebundener DNA an den verschiedenen Oligonukleotid-Proben und damit die Sequenz der zu untersuchenden DNA. Die gesamte Prozedur erfordert 2 Tage.
  • Strategie zur Mutationsanalyse
  • Als Ausgangsmaterial für die Mutationsanalyse dient genomische DNA aus Leukozyten, die nach Standardverfahren aus Zellen oder Geweben isoliert wird. Die Mutationsanalyse wird für alle Exons (E) der Mismatch-Repair-Gene MLH1 (19E), PMS1 (12E), PMS2 (15E), MSH2 (16E), MSH3 (24E) und MSH6 (10E) sowie für das APC-Gen (15E) durchgeführt. Hierzu sind voraussichtlich 111 unterschiedliche PCR-Reaktionen erforderlich. Die PCR-Amplifikation erfolgt entsprechend der Erläuterung in Fig. 2 für alle Exons mit Exon- übergreifenden Primern, die in den flankierenden Intronregionen lokalisiert sind, so dass neben potentiellen Mutationen in den kodierenden Genregionen auch sämtliche splice-site Mutationen erfasst werden.
  • Für die nachfolgende Chip-Analytik werden die PCR- Reaktionen mit Fluoreszenz-markierten Primern in einem entsprechenden Mikrotiterplattenformat auf "Multi-Cyclern" durchgeführt. Für die Mismatch-Repair-Gene MLH1 und MSH2 sind die optimalen PCR-Bedingungen bereits etabliert. Zur Vermeidung aufwendiger gelektrophoretischer Amplifikations- Kontrollen, wird die Effizienz der PCR-Amplifikation für jedes Exon durch Hybridisierung des PCR-Produkts mit Exon- spezifischen Sonden basiert, überprüft und quantifiziert. Nach Aufreinigung der PCR-Produkte nach Standardverfahren (Mikrotiterplattenformat), erfolgt anschliessend die Mutations-Analytik auf dem kommerziell gefertigten und bereits beschriebenen DNA-Chip. Hierzu werden sämtliche aufgereinigten PCR-Produkte einer DNA-Probe gepoolt, mit den auf der Chip-Oberfläche immobilisierten wildtyp- bzw. mutationsspezifischen Oligonukleotiden hybridisiert und nach stringentem Waschen mittels Laser-induzierter Fluoreszenz detektiert. Die Detektion von Punktmutationen, Einzelbasendeletionen und -insertionen erfolgt dabei durch Hybridisierung mit den entsprechenden Oligonukleotiden, welche diese Mutationen repräsentieren. Größere Deletionen oder Insertionen werden durch Hybridisierung mit terminal modifizierten Oligonukleotiden detektiert.
  • Potentielle Mutationen werden durch ein verstärktes Fluoreszenzsignal im Vergleich zum Hintergrund erkannt; zusätzlich dient das für jede Basenposition gemessene Wildtypsignal als interne Positivkontrolle für die Hybridisierungs- und Detektionseffizienz der Analytik. Die in der Chip-Analytik identifizierten Mutationen werden anschließend zur Überprüfung der Analytik und zum Ausschluß funktionell irrelevanter Polymorphismen mittels konventioneller, nicht-radioaktiver DNA-Sequenzierung überprüft.
  • Die wesentlichen Vorteile des vorstehend erläuterten Verfahrens liegen neben der erheblichen Zeitersparnis bei der Sequenzierung (beispielsweise 2 Tage gegenüber mindestens 4 Wochen) in einer höheren Sensitivität bei dem Nachweis von MMR-Gen-Mutanten, da neben den MLH1, MSH2 und MSH6 Genen bei der konventionellen Sequenzierung zusätzlich die PMS1, PMS2 und MSH3-Gene sequenziert werden.
  • Bei einer anzunehmenden Sensitivität von 95% werden mit einem derartigen DNA-Chip 80% aller Mutationen bei Betroffenen mit einem HNPCC charakterisiert. Die Kostenersparnis gegenüber der konventionellen Sequenzierung wird sich auf etwa 60% belaufen und könnte zu jährlichen Einsparungen in Höhe von EUR 1.000.000,00 führen, wenn nur 3000 der über 5000 jedes Jahr neu auftretenden HNPCC untersucht werden. Mit einer konventionelle Sequenzierung wären darüber hinaus die jährlich 3000 neu diagnostizierten Patienten mit einem HNPCC kaum zu charakterisieren, solche Kapazitäten ermöglicht erst die Anwendung der DNA-Chip- Technologie.

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponierendem Gen, dadurch gekennzeichnet, daß markierte DNA unter Verwendung von stationären Oligionukleotiden hybridisiert wird und daß anschließend eine Analyse auf spezifische Nukleinsäuresequenzen durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Punktmutation durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Deletion eines Mismatch-Repair-Gens durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Insertion eines Mismatch-Repair-Gens durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des MLH1 (19E) Gens durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des PMS1 (12E) Gens durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des PMS2 (15E) Gens durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des MSH2 (16E) Gens durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des MSH3 (24E) Gens durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des MSH6 (10E) Gens durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutationsanalyse im Hinblick auf eine Mutation des APC Gens durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Analyse die DNA-Chip-Technologie angewendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Synthetisierung von Oligonukleotid-Proben durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide auf Glas-Trägern aufgebracht werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hybridisierung unter Verwendung von markierten PCR-Produkten durchgeführt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hybridisierung unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten PCR-Produkten durchgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Analyse eines hybridisierten Arrays unter Verwendung eines Lasers in einem Scanner durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß für die Analyse genomische DNA aus Zellen verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß für die Analyse genomische DNA aus Geweben verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion von Deletionen beliebiger Größe terminal modifizierte Oligonukleotide verwendet werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion von Insertionen beliebiger Größe terminal modifizierte Oligonukleotide verwendet werden.
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