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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die Erfindung betrifft Verfahren
zum frühen
Nachweis von Kolonkrebs bei Patienten und insbesondere Verfahren
zur Herstellung von Stuhlproben zum Nachweis von Kolonkrebs, so
dass die Wahrscheinlichkeit sichergestellt oder vergrößert ist,
dass die Probe die diagnostisch relevante Informationen enthält, wenn
der Patient eine kanzeröse
oder präkanzeröse Läsion aufweist,
und Verfahren zur Stuhlprobenanalyse.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Stuhlproben müssen häufig zur medizinischen diagnostischen
Analyse hergestellt werden. Stuhlproben können zur Unterstützung der
Diagnose medizinischer Zustände,
die von parasitären,
bakteriellen oder viralen Infektionen bis zu entzündlicher
Darmerkrankung und Kolorektalkrebs reichen, analysiert werden.
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Kolorektalkrebs ist eine Haupt-Todesursache
in der westlichen Gesellschaft. Allerdings kann er bei früher Diagnose
durch operative Entfernung des kanzerösen Gewebes wirksam behandelt
werden. Kolorektalkarzinome nehmen ihren Ursprung im Kolorektalepithel
und sind während
der frühen
Entwicklungsstadien typischerweise nicht extensiv vaskularisiert
(und darum nicht invasiv). Es wird angenommen, dass Kolorektalkrebs
der klonalen Expansion einer einzelnen mutierten Zelle in der Epithelauskleidung
von Kolon oder Rektum entspringt. Der Übergang zu einem stark vaskularisierten,
invasiven und schließlich metastatischen
Krebs, der sich im gesamten Körper
ausbreitet, dauert in der Regel 10 Jahre oder länger. Wenn der Krebs vor der Invasion
nachgewiesen wird, bedeutet die operative Entfernung des kanzerösen Gewebes
eine wirksame Heilung. Allerdings wird Kolorektalkrebs oft nur bei
Manifestation klinischer Symptome, wie Schmerz und schwarzer, teeriger
Stuhl, nachgewiesen. In der Regel sind solche Symptome nur vorhanden,
wenn sich die Krankheit bereits gut etabliert hat, oft nach Auftreten
von Metastasen; und die Prognose für den Patienten ist schlecht, auch
nach operativer Resektion des kanzerösen Gewebes. Der frühe Nachweis
von Kolorektalkrebs ist darum in sofern wichtig, als dieser Nachweis
seine Morbidität
wesentlich vermindern kann.
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Invasive Diagnoseverfahren, wie endoskopische
Untersuchung, gestatten die direkte visuelle Identifizierung, Entfernung
und Biopsie von potentiell kanzerösen Wucherungen, wie Polypen.
Die Endoskopie ist kostenintensiv, unbequem, von Natur aus Risiko-behaftet
und darum kein praktisches Werkzeug zum Screening von Populationen
zur Identifizierung der Population mit Kolorektalkrebs. Die nicht
invasive Analyse von Stuhlproben auf Merkmale, die das Vorliegen
von Kolorektalkrebs oder einer Präkanzerose anzeigen, ist eine bevorzugte
Alternative für
die Frühdiagnose,
allerdings ist kein bekanntes Diagnoseverfahren verfügbar, das dieses
Ziel zuverlässig
erfüllt.
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Die derzeitigen nicht invasiven Diagnoseverfahren
umfassen das Testen von Stuhlproben auf das Vorliegen von fäkalem okkultem
Blut oder auf erhöhte
Spiegel von karzinoembryonalem Antigen, die beide das Vorliegen
von Kolorektalkrebs nahe legen. Zusätzlich stellen neue Entwicklungen
in der Molekularbiologie Verfahren von großem Potential zum Nachweis
des Vorliegens einer Reihe von DNA-Mutationen oder -Änderungen
be reit, die mit dem Vorliegen von Kolorektalkrebs zusammenhängen und
dafür hinweisend
sind. In den Frühstadien
von Kolorektalkrebs kann das Vorliegen solcher Mutationen theoretisch
in DNA, die in Stuhlproben gefunden wird, nachgewiesen werden. Allerdings
umfasst der Stuhl Zellen und Zellabfall vom Patienten, von Mikroorganismen
und aus der Nahrung, was eine heterogene Population von Zellen ergibt.
Dies macht den zuverlässigen
Nachweis einer kleinen spezifischen Subpopulation unmöglich.
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Stuhldiagnosetests auf Kolorektalkrebs,
die in der Technik beschrieben sind, werden typischerweise mit Proben
durchgeführt,
die aus statistisch entnommenen Proben von ausgeschiedenem Stuhl
hergestellt werden. Allerdings ergeben nach solchen Verfahren hergestellte
Proben keine reproduzierbaren Merkmale, die das Vorliegen von Kolorektalkrebs
oder Präkanzerose
anzeigen, auch bei Herstellung aus Stuhl, der von einem Patienten
mit Kolorektalkrebs oder Präkanzerose
ausgeschieden worden ist. Darum bedarf es in der Technik Verfahren
zur Frühdiagnose
von Kolorektalkrebs oder Präkanzerose,
die reproduzierbare Merkmale nachweisen, die das Vorliegen von kanzerösem oder
präkanzerösem Material
in Proben anzeigen, die aus Stuhl hergestellt worden sind, der von
einem Patienten mit Kolorektalkrebs oder Präkanzerose ausgeschieden wurde.
Solche Verfahren sind hier bereit gestellt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es wurde nun erkannt, dass Zellen
und Zellabfall von Kolon-Epithelzellen
auf den sich bildenden Stuhl in einem Längs"Streifen" von Material entlang der Länge des
Stuhls abgestoßen
werden. Das abgestoßene Material
ist auf diesen Längsstreifen
beschränkt,
wie in 1 gezeigt (bezeichnet
als "C"). Auf der Grundlage dieser
Erkenntnis lehren die "C"). Auf der Grundlage
dieser Erkenntnis lehren die Anmelder, dass Stuhlproben-Präparate zum
diagnostischen Testen das Entnehmen einer repräsentativen Probe einschließen müssen, um
zu gewährleisten,
dass die Probe sämtliche
Zellen oder Zellabfall enthält,
der in den Stuhl bei seinem Durchgang durch den Kolon abgestoßen wurde.
Demnach umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren die Entnahme
eines Querschnittsteils von Stuhl, der von einem Patienten ausgeschieden
wurde, und die Durchführung
eines Tests zum Nachweis in der Probe des Vorliegens von Zellen
oder Zellabfall, die von den Epithelzellen, die den Kolon auskleiden,
abgestoßen
wurden, die Krebs oder Präkanzerose
anzeigen können.
Am häufigsten
stammen solche Zellen von einem Polypen oder einer kanzerösen oder
präkanzerösen Läsion an einer
diskreten Stelle entlang des Kolons. Für die Zwecke der Erfindung
umfasst eine präkanzeröse Läsion präkanzeröse Zellen,
und präkanzeröse Zellen
sind Zellen, die eine Mutation aufweisen, die mit Krebs im Zusammenhang
steht und die solche Zellen empfindlich dafür macht, kanzerös zu werden.
Wie in 1 gezeigt, ist
eine Querschnittsprobe eine Probe, die mindestens einen Gesamtumfang
des Stuhls (oder Teil eines Stuhls, der einen Gesamtquerschnittsteil
umfasst) enthält,
wie beispielsweise in einem koronalen Abschnitt oder einem sagittalen
Abschnitt.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren
die Schritte des Erhaltens eines Querschnittsteils von Stuhl, der
von einem Patienten ausgeschiedenen wurde, und das Durchführen eines
Tests zum Nachweis von Zellabfall aus einer Klonpopulation von transformierten
Zellen. Die transformierten Zellen umfassen beispielsweise eine
Klon-Subpopulation von Zellen mit einer oder mehreren Mutationen
(für die
Zwecke des Anmelders ist eine Mutation eine Deletion, Substitution,
Addition, Modifikation, Interkalation oder Umlagerung von DNA).
Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren
umfassen den Nachweis von Merkmalen von solchen transformierten
Zellen, einschließlich
beispielsweise Mutationen, von Proteinen, die einzigartig sind oder
in veränderten
Mengen in transformierten Zellen exprimiert worden sind, und von
Blut. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren umfassen das Erhalten
eines Querschnittsteils einer Stuhlprobe und das Durchführen eines
Tests zum Nachweis von DNA-Merkmalen, die das Vorliegen einer Klon-Subpopulation
von Zellen in der Probe anzeigen. Die Klon-Subpopulation kann beispielsweise
eine Subpopulation von kanzerösen
oder präkanzerösen Zellen
mit einer Mutation beispielsweise in einem p53-Tumorsuppressor-Gen sein. Klon-Subpopulationen
von Zellen, die durch erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden,
sind oft durch einen massiven Verlust an DNA gekennzeichnet, was
zu einem Verlust an Heterozygotie führt, der das Gen oder die Gene,
die von der Deletion betroffen sind, unwirksam macht.
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Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch
das Erhalten einer repräsentativen
(d. h. quergeschnittenen) Probe von Stuhl und das Homogenisieren
des Stuhls in einem Puffer, wie einen Puffer, der ein Detergens
und eine Proteinnase und gegebenenfalls einen DNase-Inhibitor umfasst.
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Bei den erfindungsgemäßen Verfahren
kann ein mit dem Querschnittsteils des Stuhls durchgeführter Test
ein Test zum Nachweis des Vorliegen erhöhter Spiegel an karzinoembryonalem
Antigen sein, das von den Zellen, die das Kolon auskleiden, ausgeschüttet wird.
Ein solcher Test kann auch das Nachweisen von vorliegendem okkultem
Blut umfassen. Die erfindungsgemäßen Verfahren
umfassen vorzugsweise jedoch einen Test, wobei die Probe gegenüber einem
spezifisch an ein Molekül
bindenden Antikörper
exponiert wird, was charakteristisch ist für Zell abfall, der von Zellen
abgestoßen
wurde, die eine Subpopulation von Zellen mit einer Mutation, die
potentiell mit Krebs zusammenhängt,
umfassen.
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Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders
und am meisten bevorzugt zum Nachweis von DNA-Merkmalen brauchbar,
die eine Subpopulation von transformierten Zellen in einer repräsentativen
Stuhlprobe anzeigen. Die DNA-Merkmale können beispielsweise Mutationen,
einschließlich
Verlust von Heterozygotie, Mikrosatelliten-Instabilität, und andere
sein. Ein Test auf die DNA-Merkmale bei einem erfindungsgemäßen Verfahren
kann den Schritt des Bestimmens umfassen, ob ein Unterschied existiert
in einer Anzahl X eines ersten Allels, von dem bekannt ist oder
vermutet wird, dass es in einer Subpopulation von Zellen in einer
repräsentativen
Stuhlprobe mutiert ist, und einer Anzahl Y eines Allels, von dem
bekannt ist oder vermutet wird, dass es in der Probe nicht mutiert
ist, wobei ein statistisch signifikanter Unterschied eine Mutation
und das mögliche
Vorliegen von Krebs in einer Subpopulation von Zellen in der Probe
anzeigt. Bei einer Ausführungsform
der Erfindung wird der Unterschied zwischen einer Anzahl eines Tumorsuppressorgens
und einer Anzahl eines nicht mit Krebs zusammenhängenden Gens verglichen, wobei
ein statistisch signifikanter Unterschied in den Anzahlen eine Mutation
im Tumorsuppressorgen anzeigt.
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Tests, die in der Praxis der erfindungsgemäßen Verfahren
brauchbar sind, umfassen auch einen Test zum Nachweis des Vorliegens
einer Deletion oder einer anderen Mutation in einer Region, die
ein polymorphes Nucleotid umfasst. Bei einem solchen Test wird eine
Anzahl eines bei maternellen und paternellen Allelen vorhandenen
polymorphen Nucleotids bestimmt, wobei der Patient für das polymorphe
Nucleotid hete rozygot ist. Ein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen einer Anzahl eines polymorphen Nucleotids in einem maternellen
Allel und einem paternellen Allel zeigt das Vorliegen einer Deletion
in einem der beiden Allele an.
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Demnach stellen die erfindungsgemäßen Verfahren
Mittel zum Screening auf das Vorliegen einer kanzerösen oder
präkanzerösen Subpopulation
von Zellen in einer heterogenen Probe, wie einer Stuhlprobe, bereit.
Die erfindungsgemäßen Verfahren
vermindern die mit Läsionen
des Kolonepithels einhergehende Morbidität und Mortalität. Ferner
umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren
genauere Screeningverfahren als die derzeit in der Technik verfügbaren,
da sich die derzeitigen Verfahren die Feststellung zu Nutze machen,
dass kanzeröse
oder präkanzeröse Zellen
den Zellabfall nur an oder in einen Teil der Oberfläche des
sich bildenden Stuhls abstoßen.
Die vorliegenden Verfahren prüfen
zuverlässig über den
gesamten Umfang des Stuhls und erhöhen dadurch, falls eine Abnormität vorkommt,
die Wahrscheinlichkeit ihres Nachweises. Weitere Aspekte und Vorteile
der Erfindung sind in der folgenden ausführlichen Beschreibung hiervon
enthalten.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm eines Zylinders, der einen geformten Stuhl darstellt
und verschiedene Querschnitte zeigt, die aus den gesamten Umfang
eines Stuhls Material enthalten. Der mit "A" bezeichnete
Abschnitt ist ein typischer koronaler Abschnitt und der mit "B" bezeichnete Abschnitt ist ein typischer
sagittaler Abschnitt. Der mit "C" bezeichnete Streifen
stellt Material dar, das von kanzerösem Gewebe abgestoßen wurde und
das in einem Längsstreifen
abgelagert ist.
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2 ist
ein schematisches Diagramm eines Behälters zum Enthalten einer Stuhlprobe.
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3 ist
ein schematisches Diagramm eines Impedanzzählers mit mehreren Öffnungen;
wobei die Bezugsziffer 1 die Richtung des Flusses durch
die Säule
bezeichnet; die Bezugsziffer 2 eine Plungervorrichtung
zum Pressen des Materials in der Säule nach unten bezeichnet;
die Bezugsziffern 3 und 4 verschieden groß bemessene
Hybridisierungsperlen bezeichnen; die Bezugsziffer 5 ein
fakultatives Filter zur Extraktion unerwünschter Teilchen bezeichnet;
die Bezugsziffer 6 eine Reihe von Öffnungen zum Messen von Impedanz-Differenzen
bezeichnet; und die Bezugsziffer 7 eine Sammelkammer bezeichnet.
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4 ist
ein Diagramm und zeigt Primer, die zum Nachweis von Einbasen-Polymorphismen
geeignet sind.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur Herstellung
von Stuhlproben geeignet, die reproduzierbar Zellen oder Zellabfall
enthalten, der aus einer Klon-Population kanzeröser oder präkanzeröser Zellen abgestoßen wurde,
wenn eine solche Population an einer beliebigen Stelle entlang des
Kolons eines Patienten vorhanden ist. Sodann werden diese Proben
zum Durchführen
von Tests zum äußerst reproduzierbaren
und exakten Nachweisen von Merkmalen, die Krebs anzeigen, verwendet.
Solche Verfahren stellen insofern eine Verbesserung gegenüber der
Technik bereit, als sie das Entnehmen einer Querschnittsprobe aus
einem vom Patienten ausgeschieden Stuhl lehren. Ohne die Erkenntnis,
dass eine Querschnittsprobe erhalten werden muss, existiert kein
Mittel zum reproduzierbaren Erhalten einer Probe, die eine kanzeröse oder
präkanzeröse Subpopulation
von Zellen, sofern diese existiert, enthält.
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Die in der Technik beschriebenen
Verfahren erkennen nicht, dass anders als bei einer Infektion durch Parasiten,
Bakterien und Viren, die Merkmale, die das Vorliegen von Kolonkrebs,
insbesondere Kolonkrebs im Frühstadium,
anzeigen, nur in einem bestimmten Teil des ausgeschiedenen Stuhls
gefunden werden. Wenn die entnommenen Teile des Stuhls nicht den
Teil einschließen,
der zufällig
von Krebszellen im Frühstadium
abgestoßene
Zellen und Zellabfall enthält,
versagt der Diagnosetest, auch bei Homogenisierung, notwendigerweise
beim Nachweis der Merkmale, die das Vorliegen von Kolorektalkrebs
zuverlässig
anzeigen, d. h. es wird ein falsch-negatives Ergebnis erzeugt.
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Abgestoßene Zellen, beispielsweise
von einem Polypen, der sich in der Epithel-Auskleidung des Kolons
oder auf kanzerösen
Läsionen
im Frühstadium
bildet, werden nur an den Teil des sich bildenden Stuhls abgestoßen, der
mit den Polypen oder der Läsion
in Kontakt kommt. Im Frühstadium
der Krankheit enthält demnach
nur ein kleiner Teil der oberflächlichen
Schicht des sich bildenden Stuhls abgestoßene Zellen, und wenn dieser
Teil zufällig
nicht als Teil der Probe entnommen wird, erzeugt ein Test auf Indizien
für Darmkrebs notwendigerweise
ein falsch-negatives Ergebnis. Eine kurze Übersicht über die Anatomie und Physiologie
des Kolons trägt
zum Verständnis
dieses Phänomens
bei.
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Ein typisches Kolon eines Erwachsenen
ist etwa sechs Fuß lang,
mit einem Durchmesser von etwa 2 bis 3 in. Über seine gesamte Länge sind
zahlreiche Krümmungen
und Falten vorhanden. Der Kolon entfernt Wasser aus flüssigem oder
halbflüssi gem
Abfallmaterial, das in den Kolon eintritt, und im proximalen Drittel des
Kolons beginnt sich ein relativ fester Stuhl zu bilden. Epithelzellen
kleiden das Lumen des Kolons aus, und die Lumenoberfläche ist
in mikroskopischen Krypten organisiert. Die kolorektalen Epithelzellen
werden alle 4 bis 5 Tage ersetzt. Die Epithelzellen teilen sich
schnell am Fuße
der Krypten und wandern zu den Apices, wo die Zellen anscheinend
die Apoptose (programmierter Zelltod) erfahren, und der Zellabfall
wird in das Lumen abgestoßen.
Die Auskleidung des kolorektalen Lumens ist elastisch, und der Durchmesser
des Lumens wird durch das Volumen des Stuhls, der den Kolon zu einer
gegebenen Zeit passiert, bestimmt. Als Ergebnis ist die Oberfläche des
sich bildenden Stuhls, der den Kolon passiert, in direktem Kontakt
mit der Epithel-Auskleidung des Lumens. Abgestoßene Epithelzellen (die eine
Apoptose erfahren haben können
oder nicht) und Zellabfall werden darum in die Oberfläche des
Stuhls, wenn er das Kolon passiert, eingeschlossen.
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Zellen und Zellabfall von epithelialen
Kolorektalkarzinomen werden darum auch auf den sich bildenden Stuhl
abgestoßen.
Die meisten Kolorektalkarzinome entwickeln sich in Bereichen des
Kolons, in denen der Stuhl relativ fest ist, tatsächlich entwickeln
sich etwa ein Drittel solcher Krebsarten im Rektum. Marker, die das
Vorliegen von Krebs, einschließlich
von Zellen, Zellabfall, DNA, Blut und karzinoembryonalem Antigen,
anzeigen, werden auf den Teil des sich bildenden Stuhls abgestoßen, der
das kanzeröse
Gewebe kontaktiert, wenn der Stuhl das Kolon passiert. Da der Stuhl
relativ fest ist, verbleiben diese Marker auf oder nahe an der Oberfläche des
Stuhls, wo sie abgelagert wurden, und sie werden nicht im gesamten
Stuhl homogen dispergiert. Wenn der Stuhl ein kanzeröses oder
präkanzeröses Geschwür passiert,
lagert sich Material von dem Geschwür entlang des Stuhls ab, allerdings
nur an dem Teil des Stuhlumfangs, der mit dem kanzerösen oder
präkanzerösen Gewebe,
das die Läsion
umfasst, in einen direkten Kontakt kommt. Stuhl, der von einem Patienten mit
Kolorektalkrebs oder Präkanzerose
ausgeschieden wird, ist darum durch einen Längs-"Streifen" von diagnostisch relevantem Material,
das dem kanzerösen
oder präkanzerösen Gewebe
entstammt, gekennzeichnet.
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Eine Probe, die kein Material vom
Gesamtumfang eines von einem Patienten mit Kolorektalkrebs oder Präkanzerose
ausgeschiedenen Stuhls einschließt, enthält das von dem kanzerösen oder
präkanzerösen Gewebe
stammende Material nicht in einer reproduzierbaren Weise. Derzeit
werden statistische, nicht quergeschnittene Proben ("Abstriche") des ausgeschiedenen
Stuhls in klinischen Vorrichtungen analysiert. In diesen besteht
für abgestoßene, kanzeröse oder
präkanzeröse Zellen
und Zellabfall keine Möglichkeit
des Nachweises, wenn die Probe nicht zufällig den Teil des Stuhls enthält, der
mit dem Bereich des Kolons Kontakt hatte, aus dem die Zellen abgestoßen wurden.
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Außerdem entwickelt sich Krebs
typischerweise durch klonale Expansion einer einzelnen mutierten Zelle,
und in den Frühstadien
der Krankheit, d. h. wenn die operative Entfernung eine wirksame
Heilung darstellt, ist die kanzeröse Läsion sehr klein und kann auf
einem kleinen Bogen des Umfangs des Kolons liegen. Material, das
aus einem solchen Frühstadium
von Krebs stammt, wird darum in einem sehr schmalen Streifen (in 1 mit C bezeichnet) auf
oder in den Stuhl abgestoßen.
Folglich enthält
eine Probe, die nicht den gesamten Umfang eines Stuhls enthält, der
von einem Patienten mit Kolorektalkrebs im Frühstadium oder mit Präkanzerose
ausgeschieden wurde, nur zufällig
Material, das das Vorliegen des kanzerösen Frühstadium-Zustands oder des
präkanzerösen Zustands
anzeigt. Der frühe
Nachweis von Kolorektalkrebs ist jedoch für einen wirksamen operativen
Eingriff sehr wichtig. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren
zum reproduzierbaren frühen
Nachweis von Merkmalen bereit, die das Vorliegen von Krebs oder
Präkanzerose
bei einem Patienten anzeigen.
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Die Analyse einer Querschnittsprobe
von Stuhl, wie in 1 gezeigt,
gewährleistet,
dass mindestens ein Teil von Zellen und Zellabfall, der von jeglichen
existierenden kanzerösen
oder präkanzerösen Zellen
abgestoßen
wird (auch bei Abstoßung
im Frühstadium
von einem kleinen kanzerösen
Gewebe oder von präkanzerösem Gewebe,
z. B. kleinen Polypen), in dem Teil der zu analysierenden Stuhlprobe
vorhanden ist. Tatsächlich
vermeidet die Entnahme eines Querschnitts der Stuhlprobe die mögliche Analyse
von Stuhlteilen, die keine abgestoßenen kanzerösen oder
präkanzerösen Zellen
enthalten, auch wenn der Patient Kolorektalkrebs oder Präkanzerose
hat.
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Nach Erhalt einer Querschnittsstuhlprobe
kann sie durch bekannte Verfahren zur Verteilung der Zellen und
des Zellabfalls in der gesamten Probe homogenisiert werden. Anschließend wird
mit dem Homogenat oder mit einem Extrakt des Homogenats ein Test
zum Nachweis des Vorliegens von Zellen und/oder Zellabfall in der Probe
durchgeführt.
Der Test kann ein beliebiger Test oder eine Kombination von histologischen
Zelltests, Antikörper-basierenden
Immuntests (oder anderen Formaten), die zum Nachweis des Vorliegens
eines Moleküls ausgelegt
sind, das für
die Transformation charakteristisch ist, wie ein Protein, oder ein
DNA-basierender Test zum Nachweis von Mutationen oder genetischen
Merkmalen, die Kolorektalkrebs anzeigen, sein. Bekannte Testprotokolle,
die hier im Folgenden offenbarten, oder Tests, die im Nachhinein
entwickelt werden können, können in
der Praxis der Erfindung angewandt werden. Nicht einschränkende Beispiele
von brauchbaren bekannten Testprotokollen umfassen diejenigen, die
in den U.S.-Patentschriften Nrn. 5 137 806 (Nachweis von Sequenzen
in ausgewählten
DNA-Molekülen),
5 348 855 (Test auf Nucleinsäuresequenzen),
5 512 441 (Nachweis von mutierten Allelen), 5 272 057 und 5 380
645 (RFLP-Analyse), 5 527 676 (Nachweis von p53-Gensequenzen), 5
330 892 (Nachweis von MCC-Gensequenzen), 5 352 775 (Nachweis von
APC-Gensequenzen), 5 532 108 (Nachweis von DCC-Gensequenzen) und
in der WO96/08514 (monoklonale Antikörper gegen humane Kolonkarzinom-assoziierte
Antigene) offenbart sind. Alternativ oder zusätzlich kann ein Test auf fäkales okkultes
Blut konzipiert sein, wie in den U.S.-Patentschriften Nrn. 4 333
734 und 5 196 167 berichtet. Ein Test, der im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung brauchbar ist, umfasst auch einen Test auf
karzinoembryonales Antigen, wie in der U.S.-Patentschrift Nr. 5
380 647 angegeben. Schließlich
kann die Probe, wie in der U.S.-Patentschrift Nr. 4 857 300 berichtet,
zur histologischen Untersuchung zum Nachweis von Merkmalen, die
das Vorliegen von kanzerösen
oder präkanzerösen Zellen
anzeigen, hergestellt werden.
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Der Zweck eines Testprotokolls, der
im Zusammenhang mit dem Erhalt von mindestens einer Querschnittsprobe
angewandt wird, besteht in der Identifizierung von Kandidaten für das anschließende invasive Diagnoseverfahren,
wie Kolonoskopie oder Sigmoidoskopie. Demnach muss der Test nicht
definitiv das Vorliegen einer kanzerösen oder präkanzerösen Läsion nachweisen, obwohl falsch-negative
Ergebnisse offenbar zu vermeiden sind. Das Ziel des Testprotokolls
besteht nicht darin zu bestimmen, ob in der breiten Menge an Zellabfall
in der Probe einige Zellen vorhanden sind, die eine Mutation tragen,
die im allgemeinen mit einer Frühstadium-Transformation
assoziiert ist, sondern stattdessen darin, ob die Probe Zellabfall
enthält,
der eine klonale Expansion einer mutierten Subpopulation anzeigt.
Ein größtmöglicher
Vorteil entstammt einem Test, der zum Nachweis des wahrscheinlichen
Vorliegens einer klonal expandierten Zellpopulation, d. h. von transformierten
Kolonepithelzellen, die die kanzerösen oder präkanzerösen Läsionen umfassen, ausgelegt
ist. Tests mit der Fähigkeit
zum Nachweis von Krebs oder Präkanzerose
im Frühstadium
sind bei den erfindungsgemäßen Verfahren
bevorzugt. Tests unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR),
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
(RFLP) oder andere Verfahren zur Nucleinsäureanalyse können zum
Nachweis bekannter DNA-Merkmale, die das Vorliegen von Kolorektalkrebs
oder Präkanzerose
anzeigen, eingesetzt werden. Exaktere Verfahren zum quantitativen
Nachweis von Zellabfall, wie DNA-Fragmente oder -Segmente, können nach
den hier beschriebenen Verfahren zur Analyse von Querschnittsproben
eingesetzt werden.
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Ein bevorzugter Test durchmustert
die Probe nach DNA-Merkmalen, die die Entwicklung von Krebs oder
Präkanzerose
anzeigen. Allerdings können
Tests zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Verfahren jeden abnormen
Zellabfall nachweisen, der von klinisch relevantem, transformiertem
Gewebe abgestoßen wird.
Somit wird nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ein Test
zum Nachweis des Vorliegens von Merkmalen von Zellen angewandt,
die einen Verlust an Heterozygotie, Mikrosatelliten-Instabilität oder eine
andere Mutation erfahren haben.
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Die folgenden Beispiele stellen ausführliche
Angaben für
die erfindungsgemäßen Verfahren
bereit. Allerdings werden unter Berücksichtigung der folgenden
ausführlichen
Beschreibung hiervon zahlreiche zusätzliche Aspekte der Erfindung,
insbesondere hinsichtlich der durchzuführenden Tests, offensichtlich.
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Beispiel 1
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Herstellung
einer Stuhlprobe
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Eine Probe wird so hergestellt, dass
sie mindestens einen Querschnittsteil eines von einem Patienten ausgeschiedenen
Stuhls enthält.
Der Querschnittsteil wird dem ausgeschiedenen Stuhl entnommen, indem
ein oder mehrere sagittale oder koronale Schnitte durch den Stuhl
vorgenommen werden, wie in 1 gezeigt. Der
entfernte Teil umfasst Material aus dem gesamten Umfang des Stuhls.
Alternativ kann ein Gesamt-Stuhl verwendet werden. Der Teil enthält ausreichend
Material, damit die Durchführung
von anschließenden
diagnostischen Tests möglich
ist. Der Stuhl wird in einen Behälter
ausgeschieden, der vorzugsweise klein genug ist, um auf eine Testeinrichtung übergeführt zu werden.
Der Behälter
kann für
eine herkömmliche
Toilette eingerichtet sein, derart, dass der Behälter den auf die übliche Weise
ausgeschiedenen Stuhl aufnimmt. Der Behälter kann ein Sieb oder Gitter
von ausreichender Größe und eine
Anordnung umfassen, derart, dass der Stuhl zurückgehalten wird, während Urin
durch das Gitter oder Sieb in die Toilette hindurchgelassen wird.
Zusätzlich
kann der Behälter
Mittel zur Entfernung eines Querschnittsteils aus dem Stuhl umfassen.
Ferner kann der Behälter
Mittel zum Einbringen von Homogenisierungspuffer oder von einem
oder mehreren Konservierungsstoffen, wie Alkohol, einer Lösung von
hoher Salzkonzentration, Antibiotika und chaotropen Salzen zur Neutralisierung
von in der Stuhlprobe vorhandenen Bakterien umfassen. Der Homogenisierungspuffer
kann ein physiologisch kompatibler Puffer sein, wie phosphatgepufferte
Salzlösung
und kann Salz, wie 20–100
mM NaCl oder KCl, umfassen. Der Homogenisierungspuffer kann auch
ein Detergens, wie 1–10%
SDS oder Triton, und/oder eine Proteinase, wie Proteinase K, umfassen.
Der Puffer kann auch Inhibitoren von DNA- und RNA-Abbauenzymen enthalten.
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Der Behälter sollte, gleich ob er an
eine Toilette oder einfach an die Aufnahme der ausgeschiedenen Stuhlprobe
angepasst ist, Verschlussmittel umfassen, die ausreichen, um die
ausgeschiedene Stuhlprobe und eine beliebige ihr zugesetzte Lösung zu
enthalten, um das Ausströmen
von Gerüchen
u verhindern. Ein beispielhafter Behälter ist in 2 gezeigt. Wie in dieser Figur gezeigt,
besitzt der Behälter
einen Trägerrahmen 1,
der direkt auf der Toilettenschüssel 2 platziert
wird. Der Trägerrahmen 1 weist
einen daran angebrachten Betätigungsdeckel 3 auf,
der, wie in 2 gezeigt,
zur Abgabe einer Probe in einer nach oben geklappten Position oder
zum Einschließen
von ausgeschiedenem Stuhl in den Behälter in einer geschlossenen
Position (nicht gezeigt) angeordnet werden kann. Zusätzlich weist
der Trägerrahmen 1 eine
zentrale Öffnung 4 auf,
die von einer oberen Fläche 5 durch
eine untere Fläche 6 des
Trägerrahmens 1 verläuft. Die
untere Fläche 6 befindet
sich in direktem Kontakt mit einer oberen Fläche 7 der Toilette 2.
Ausgehend von der unteren Fläche 6 des
Trägerrahmens 1 befindet
sich ein Mittel 8 zur Aufnahme von ausgeschiedenem Stuhl.
Mittel 8 kann an dem Trägerrahmen 1 feststehend
oder zur Entfernung im Anschluss an die Abgabe von Stuhl entfernbar
angebracht sein. Mittel 8 kann ein weiteres Mittel zur
Entnahme von mindestens einem Querschnittsteil aus dem ausgeschiedenen
Stuhl umfassen. Eine bevorzugte Probengröße beträgt mindestens 5–10 g oder
mindestens 5–10
ml. Ein Mittel zur Beurteilung des Vorliegens einer minimalen Proben größe kann
ein physikalisches Diagramm umfassen, das die minimale Probengröße anzeigt.
Alternativ kann ein Mittel zur Beurteilung des Vorliegens einer
minimalen Probengröße die Verschiebung
einer Flüssigkeit
oder einer mechanischen Vorrichtung auf ein Minimalniveau bei Abscheidung
der Stuhlprobe umfassen.
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Nach Erhalt wird die Querschnittsstuhlprobe
in einem geeigneten Puffer, wie phosphatgepufferter Salzlösung, homogenisiert.
Homogenisierungsmittel und Materialien zur Homogenisierung sind
allgemein aus der Technik bekannt. Somit können vom Fachmann bestimmte
Homogenisierungsverfahren ausgewählt
werden, und sie können
von dem einzusetzenden Test abhängen.
Der Puffer kann Detergens, Salz, Proteinase, DNA-Inhibitoren und
RNA-Abbauenzyme enthalten. Die Zusammensetzung des Puffers hängt von
dem durchzuführenden
Testtyp ab. Soll ein fäkaler
Hämokkulttest
durchgeführt
werden, kann der Puffer chemische Verbindungen enthalten, die mit
Blut unter Erzeugung einer Farbe reagieren, deren Intensität gemessen
werden kann. Puffer, die zum Nachweis des Vorliegen von fäkalem, okkultem
Blut geeignet sind, sind aus der Technik bekannt. Wenn ein Test
auf das Vorliegen eines bestimmten Proteins durchgeführt werden
soll, sollte der Puffer keine Proteinase enthalten, die solche Tumor-markierenden
Antigene abzubauen vermag.
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Aus dem Homogenat können DNA
oder RNA unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren
isoliert werden. Mit der isolierten DNA und RNA können anschließende Tests
durchgeführt
werden.
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Beispiel 2
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Beispielhaft genannte Verfahren zum
Nachweis von Kolorektalkrebs oder Präkanzerose in Stuhlproben DNA-Merkmale,
die mit dem Vorliegen von Kolorektalkrebs oder einer präkanzerösen Läsion assoziiert sind,
können
in erfindungsgemäß hergestellte
Stuhlproben beispielsweise unter Einsatz der in den folgenden Abschnitten
beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden. An positiven Individuen
wird vorzugsweise eine sorgfältige
endoskopische Untersuchung durchgeführt, worauf eine frühzeitige
operative Exzision von jeglichem abgestorbenem Gewebe erfolgt.
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A. Referenz – Ziel
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Zur Herstellung einer Stuhlprobe
mit anschließendem
Nachweis einer Deletion oder einer anderen Mutation in dem p53-Tumorsuppressorgen
werden erfindungsgemäße Verfahren
angewandt. Das p53-Gen ist eine gute Wahl, da ein Verlust an Heterozygotie
in p53 oft mit Kolorektalkrebs assoziiert ist. Eine mRNA-Sequenz,
entsprechend der DNA-kodierenden Region für p53, wird als GenBank mit
der Zugangsnummer M92424 bezeichnet. Durch die erfindungsgemäßen Verfahren
wird mindestens ein Querschnitt einer ausgeschiedenen Stuhlprobe
erhalten und hergestellt, wie unmittelbar vorstehend beschrieben.
Die Probe braucht nicht weiter zur Analyse aufgearbeitet zu werden.
Allerdings können
DNA oder RNA gegebenenfalls durch aus der Technik bekannten Verfahren
aus der Probe isoliert werden. Siehe Smith-Ravin et al., Gut, 36:
81–86 (1995).
-
Nucleinsäuren können zu schmalen Fragmenten
geschert oder geschnitten werden, beispielsweise durch Restriktionsabbau.
Die Größe der erzeugten
Nucleinsäurefragmente
ist kein kritischer Gegenstand der nachstehend beschriebenen Einschränkungen.
Ein Ziel-Allel, das vermutlich mutiert ist (in diesem Beispiel p53),
und ein Referenz-Allel werden gewählt. Ein Referenz- Allel kann ein beliebiges
Allel sein, das bei Kolonkrebs bekanntlich nicht mutiert ist.
-
Beide Teile eines kodierenden Strangs
oder sein Komplement können
nachgewiesen werden. Zur beispielhaften Erläuterung sind hier der Nachweis
des kodierenden Strangs von p53 und des Referenz-Allels beschrieben.
Das Komplement sowohl zu p53 als auch zu dem Referenz-Allel wird
durch Hybridisierung an Anti-Komplement-Oligonucleotidsonden (Isolierungssonden)
und anschließende
Entfernung des dadurch gebildeten Doppelstrangs entfernt. Verfahren
zur Entfernung von Komplementsträngen
aus einem Gemisch von einzelsträngigen
Nucleotiden sind bekannt und umfassen Techniken, wie die Affinitätschromatographie.
Bei der Umwandlung von doppelsträngiger
DNA in einzelsträngige
DNA [siehe, z. B. Sambrock, et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (1989)] wird die Probe über
eine Affinitätssäule gegeben,
die mit einer gebundenen Isolierungssonde, die zu der aus der Probe
zu isolierenden Sequenz komplementär ist, gepackt ist. Zur Isolierung
von Komplement ist die herkömmliche
Säulenchromatographie
geeignet. Eine mit Sepharose oder anderen geeigneten Materialien
gepackte Affinitätssäule mit
angeknüpften
komplementären
Nucleotiden kann zur Isolierung von Komplement-DNA in der Säule verwendet
werden, während
das Hindurchlaufen von zu analysierender DNA durch die Säule möglich ist.
Siehe Sambrook, Supra. Als Alternative können zum Ausschluss von Komplement
Isolierungsperlen verwendet werden, wie nachstehend ausführlich erläutert.
-
Nach der Entfernung von Komplementsträngen werden
erste Oligonucleotidsonden, die an mindestens einen Teil des p53-Allels hybridisieren,
und zweite Oligonucleotidsonden, die an mindestens einen Teil des
Referenz-Allels hybridisieren, erhalten. Die Sonden sind mit einem
nachweisbaren Marker, wie Fluorescein, oder mit nachweisbaren Teilchen
markiert. Distinkte Marker für
die Sonden sind bevorzugt. Allerdings können identische Marker verwendet
werden, wenn die Probe beispielsweise in zwei getrennten Aliquoten
getestet wird. Die Sonden können
mit identischen oder distinkten Markern markiert werden. Allerdings
sind distinkte Marker bevorzugt.
-
Anschließend werden die markierten
Sonden unter Hybridisierungsbedingungen gegenüber den Proben exponiert. Solche
Bedingungen sind aus der Technik gut bekannt. Siehe z. B. Wallace
et al. Nucleic Acids Res., 6: 3543–3557 (1979). Erste und zweiteOligonucleotidsonden,
die distinkt markiert sind (d. h. mit verschiedenen radioaktiven
Isotopen, fluoreszierenden Mitteln oder mit Perlen unterschiedlicher
Größe, siehe
infra), werden auf ein einzelnes Probenaliquot angewandt. Nach Exposition
der Sonden gegenüber
der Probe unter Hybridisierungsbedingungen wird die Probe unter
Entfernung jeder unhybridisierten Sonde gewaschen. Anschließend werden
die hybridisierten Sonden separat auf p53-Hybride und Referenzallelhybride
detektiert. Standards können
zur Erzeugung eines Hintergrunds und zum Ausgleich der Ergebnisse
verwendet werden. Werden differenzielle Fluoreszenzmarker verwendet,
kann die Anzahl der Sonden ferner durch Zählen der differenziellen Fluoreszenzereignisse
in einer Probe, die ausreichend verdünnt worden ist, damit sich
einzelne Fluoreszenzereignisse in der Probe nachweisen lassen, bestimmt
werden. Probenduplikate können
analysiert werden, um die Exaktheit der erhaltenen Ergebnisse zu
bestätigen.
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Beim Vorliegen eines statistisch
signifikanten Unterschieds zwischen der nachgewiesenen Menge an p53
und der nachgewiesenen Menge des Referenzallels kann angenommen
werden, dass in p53 eine Mutation aufgetreten ist, so dass sich
seine Se quenz geändert
hat, die die Hybridisierung der Sonde verhindert, oder dass mindestens
ein Teil der Region des Genoms, die p53 enthält, in einer vom Kolon abgestoßenen Subpopulation
von Zellen verloren gegangen ist. Darum kann für den Patienten ein Risiko
zur Entwicklung von Kolonkrebs bestehen oder er kann bereits Kolonkrebs
entwickelt haben. Die statistische Signifikanz kann durch jedes
beliebige bekannte Verfahren bestimmt werden. Siehe z. B. Steel
et al., Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach
(McGraw, Hill, 1980).
-
Die Bestimmung einer p53-Mutation
gestattet es dem klinischen Arzt, eine weitere Behandlung, wie Endoskopieverfahren,
zur weiteren Diagnose zu empfehlen und falls notwendig den Zustand
des Patienten weiter zu behandeln. Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren,
durch die sich die Hybridisierungsereignisse direkt quantifizieren
lassen.
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1. Verfahren
zur Quantifizierung von Ziel- und Referenz-Polynucleotiden
-
Eine verbesserte Quantifizierung
der Bindungsereignisse zwischen Hybridisierungssonden und Ziel oder
Referenz wird durch Kopplung von Hybridisierungssonden an Teilchen,
wie Perlen (Hybridisierungsperlen), erreicht. Um ein exaktes quantitatives
Maß für die Menge
eines Polynucleotids in einer Probe zu erhalten, sind die Hybridisierungsperlen
so aufgebaut, dass jede Perle daran angeknüpft eine einzelne Oligonucleotidsonde
aufweist.
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a. Verfahren zur Herstellung
einer Sonden-Perlen-Kombination
-
An eine Perle wird eine einzelne
Sonde durch Inkubieren eines großen Überschusses von Hybridisierungsperlen
mit Oligonucleotidsonden eines gegebenen Typs (d. h. entweder erste
oder zweite Oligonucleotidsonde) angeknüpft. Die Kupplung der Sonde
an die Perle wird unter Verwendung eines Affinitätsbindungspaars erreicht. Die
Perlen können
beispielsweise mit Avidin oder Streptavidin beschichtet sein, und
die Sonden können
zur Herbeiführung
einer Verknüpfung
von Sonde und Perle mit Biotin markiert sein. Das Gemisch von Perlen
und Sonden wird so bewegt, dass 100% der Sonden an eine Perle gebunden
werden. Anschließend wird
das Gemisch gegenüber
einer Matrix, wie einer Affinitätssäule oder
einer Membran, die mit Oligonucleotiden, die zu der Sonde komplementär sind,
beschichtet ist, exponiert. Nur Perlen mit einer angeknüpfen Sonde haften
an der Matrix, der Rest wird ausgewaschen. Sodann werden die Perlen
mit gekoppelter Sonde durch Schmelzen der Hybridisierungen zwischen
Sonde und Komplement aus der Matrix freigesetzt. Mehrere Expositionen
gegenüber
der Matrix und Vorspülen
der Säule
vermindern nicht spezifisches Binden. Ferner können zur Bestimmung einer Hintergrundanzahl
von Perlen gegenüber
der Matrix nackte Perlen (d. h. ohne angeknüpfte Sonde), die in Abwesenheit
von Sonde erwartungsgemäß an das
Gemisch binden, exponiert werden.
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Unter Verwendung eines großen Überschusses
von Perlen relativ zur Sonde, wie vorstehend beschrieben, weist
die große
Mehrheit von gewonnenen Perlen nur eine angeknüpfte Sonde auf. Wenn beispielsweise
ein Gemisch ein Verhältnis
von 1 Sonde zu 1000 Perlen aufweist, wird erwartet, dass nur etwa
eine Perle von 1 Millionen Perlen zwei angeknüpfte Sonde aufweist, und sogar
weniger als eine Perle von 1 Million Perlen weist mehr als zwei
angeknüpfte
Sonden auf. Demnach werden Hybridisierungsperlen in einem effektiven
Verhältnis
von 1 : 1 mit der Sonde bereitgestellt, was die exakte Quantifizierung
von Ziel- und Referenz-Polynucleotid gestattet, wie nachstehend
beschrieben.
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Für
jeden nachstehend beschriebenen Test werden zwei distinkte Hybridisierungsperlen
verwendet. Eine erste Hybridisierungsperle weist daran angeknüpft eine
einzelne erste Oligonucleotidsonde auf, die zu mindestens einem
Teil eines Ziel-Polynucleotids
(z. B. ein p53 Allel) komplementär
ist. Eine zweite Hybridisierungsperle einer sich von der ersten
Hybridisierungsperle unterscheidenden Größe weist daran angeknüpft eine
einzelne zweite Oligonucleotidsonde auf, die zu mindestens einem
Teil eines Referenz-Polynucleotids (d. h. eines von dem bekannt
ist oder von dem vermutet wird, dass es in der Probe nicht mutiert
ist) komplementär ist.
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b. Verwendung von Perlen
zur Quantifizierung von Ziel- und Referenz-Polynucleotiden
-
DNA wird durch gut bekannte Verfahren
geschmolzen (unter Bildung einzelsträngiger DNA denaturiert) (siehe
z. B. Gyllensten et al. in: Rekombinant DNA Methodology II, 565–578 (Wu,
Hrsg., 1995). Es kann entweder ein kodierender Strang oder sein
Komplement nachgewiesen werden, um Ziel- und/oder Referenz-Polynucleotid zu
quantifizieren. Zu Erläuterungszwecken
wird bei dem vorliegenden Beispiel der Nachweis des kodierenden
Strangs angenommen.
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2. Entfernung
von Komplement
-
Einzelsträngiges Komplement des Ziel-Polynucleotids
(z. B. p53) und Referenz-Polynucleotids werden durch Binden an Oligonucleotidsonden,
die zu dem Ziel- oder den Referenz-Komplement komplementär sind,
aus der Probe entfernt. Solche Sonden, die hier als Isolierungssonden
bezeichnet werden, werden vor ihrem Einbringen in die Probe an Isolierungsperlen
angeknüpft.
Die Perlen können
magnetisiert sein. Wenn somit magnetisierte Isolierungsperlen [mit
angeknüpften
Isolierungssonde(n)] in die Probe eingebracht werden, hybridisieren
die angeknüpften
Isolierungssonden an das Komplement von Ziel oder Referenz (oder
umgekehrt). Vorzugsweise werden die Isolierungsperlen in einem großen Überschuss
eingebracht, um die Komplementbindung zu sättigen. Nach Abschluss der
Hybridisierung wird an die Probe ein Magnetfeld angelegt, um die
magnetisierten Isolierungsperlen (sowohl mit als auch ohne hybridisiertes
Komplement) aus der Probe anzuziehen. Unter der Annahme, dass in
die Probe eine ausreichende Menge an Isolierungsperlen eingebracht
wird, wird durch Entfernung der Isolierungsperlen wirksam sämtliches
Ziel- und Referenzkomplement aus der Probe entfernt.
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Bei einem alternativen Verfahren
zur Komplemententfernung wird ein Überschuss an Oligonucleotidsonde,
die mit Biotin markiert ist, unter Hybridisierungsbedingungen gegenüber der
geschmolzenen oder dehybridisierten (einzelsträngigen) Probe exponiert. Nach
Abschluss der Hybridisierung wird die Probe einer Säule ausgesetzt,
die immobilisiertes Avidin enthält.
Die Biotin-markierte Sonde, gleich ob frei oder an Komplement hybridisiert,
wird über
das Avidin an die Säule
gebunden. Der Rest der DNA, einschließlich von Ziel- und Referenz-kodieren den
Strängen,
die nachzuweisen sind, passieren die Säule. Im Gegensatz zur den beschriebenen
Hybridisierungsperlen vorstehend können die Perlen zur Entfernung
von Komplement jeweils mehrere komplementäre Oligonucleotidsonden umfassen.
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3. Quantifizierung
von Ziel und Referenz
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Zwei Serien von Hybridisierungsperlen
werden wie vorstehend beschrieben hergestellt. Jedes Element einer
ersten Serie von Hybridisierungsperlen (von denen alle miteinander
identisch sind), weist daran angeknüpft eine einzelne Oligonucleotidsonde
auf, die zu mindestens einem Teil des Ziel-Polynucleotids komplementär ist, d.
h. zu dem Teil des Genoms, der in den Zellen eine kanzerösen Läsion verändert ist.
Jedes Element einer zweiten Serie von identischen Hybridisierungsperlen
(von denen alle untereinander, jedoch nicht zu der ersten Serie
identisch sind) weist daran angeknüpft eine einzelne Oligonucleotidsonde
auf, die zu mindestens einem Teil des Referenz-Polynucleotids komplementär ist, d.
h. einem Teil des Genoms, der in malignen Zellen wahrscheinlich
nicht verändert
ist. Die Elemente aus der zweiten Serie von Hybridisierungsperlen sind
von einer Größe oder
Farbe, die sich von derjenigen der Elemente der ersten Serie von
Hybridisierungsperlen unterscheidet. Erste und zweite Hybridisierungsperlen
können
auch auf der Grundlage anderer Merkmale unterschieden werden. Beispielsweise
können
die Perlen fluoreszente Marker aufweisen, die durch ihre Fluoreszenzwellenlänge unterschieden
werden. Auch Perlen mit distinkten elektrochemischen Ladungen können verwendet
werden. Die genaue Modalität,
die zur Unterscheidung der Perlen angewandt wird, ist nicht essentiell,
solange die Unterscheidung zwischen erster und zweiter Sonde auf
der Grundlage von Unterscheidungen zwischen angeknüpften ersten
und zweiten Perlen möglich
ist.
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Beide Serien von Hybridisierungsperlen
werden gegenüber
der Probe unter Hybridisierungsbedingungen exponiert, wodurch die
Hybridisierung an Referenz und Ziel möglich ist. Die Probe wird anschließend zur Entfernung
von unhybridisierten Perlen/Sonden-Kombinationen gewaschen. Unhybridisierte
Perlen/Sonden-Kombinationen werden beispielsweise durch Überleiten
der Probe über
eine Säule
entfernt, die mit immobilisierter, zur Sondensequenz komplementärer DNA
ausgekleidet ist. Somit werden alle unhybridisierten Perlen/Sonden-Kombinationen
auf der Säule
zurückgehalten,
während
der Doppelstrang hindurchläuft.
Anschließend
wird die Probe gegenüber
Mitteln zur differenziellen Zählung
von Hybridisierungsperlen exponiert, um die erste und zweite Hybridisierungssonde
zu quantifizieren, die Doppelstränge
gebildet hat. Die erhaltene Anzahl stellt eine exakte Schätzung der
Anzahl von Kopien von Referenz- und Ziel-Polynucleotid in der Population bereit,
da die differenziellen Zählmittel
einzelne Perlen zählen.
Eine Perle entspricht einer Sonde, die wiederum eine Kopie der Nucleinsäure, die
gemessen wird, bedeutet.
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Ein Beispiel eines differenziellen
Zählmittels
ist eine Impedanzmessvorrichtung, wie ein Coulter-Zähler (Coulter
Electronics, Inc., Miami, Florida). Die Probe wird durch die Vorrichtung
geleitet, die die zwei Typen von Hybridisierungsperlen durch Messen
ihrer differenziellen Impedanz eines elektrischen Stroms differenziell nachweist.
Alternativ kann die Vorrichtung Fluoreszenz, Farbe oder andere Parameter
messen. Um die Geschwindigkeit des Tests zu erhöhen, kann eine Mehröffnungsvorrichtung
verwendet werden. Ein Mehröffnungsimpedanzzähler ist
schematisch in 2 gezeigt.
Eine Mehröffnungsanordnung
wird an einem Ende einer Säule,
die mit einem elektrisch leitenden Fluid, wie Salzlösung, gefüllt ist,
an geordnet. Hybridisierungsperlen mit entweder hybridisiertem Ziel-
oder Referenzsegment werden am gegenüberliegenden Ende der Säule eingebracht.
Jede Öffnung
ist groß genug,
um gleichzeitig nur eine Hybridisierungsperle aufzunehmen, und breit
genug, um zuverlässige
Impedanzmessungen zu ermögliche.
An jede Öffnung
wird eine Spannung angelegt. Jede Hybridisierungsperle (die nicht
leitend ist) verschiebt beim Durchgang durch eine Öffnungen
ein Volumen an Salzlösung
und erzeugt so eine Impedanz, die zu ihrer Größe proportional ist. Dies wiederum
erzeugt eine messbare Abnahme im Strom, die direkt mit der Größe der Perle
in Korrelation steht. Durch Kompilieren der Anzahl von jedem der
beiden distinkten Impedanzereignisse kann eine exakte Schätzung der
Anzahl von Hybridisierungsperlen und darum der Anzahl von Sonden
von jedem Typ in der Population erhalten werden.
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Bei quantitativen Messen der ersten
und zweiten Hybridisierungsperlen können die Daten zur Bestimmung
analysiert werden, ob ein Unterschied zwischen den Mengen von ersten
und zweiten Hybridisierungsperlen statistisch signifikant ist. Eine
Verminderung in der Menge an Ziel relativ zur Referenz zeigt eine
Mutation im Ziel-Allel oder eine Deletion des Ziel-Allels in einer
Subpopulation von Zellen in der Probe an. Wo das p53-Gen das Ziel-Allel
ist, zeigt eine solche Mutation einen kanzerösen oder präkanzerösen Zustand an. Ein klinischer
Arzt kann solche Ergebnisse als Grundlage zum Verschreiben einer
zusätzlichen
Behandlung, wie Endoskopie- und Polypectomieverfahren, anwenden.
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B. Nachweis von Mutationen
in Einbasen-Polymorphismen
-
Die vorstehend beschriebene grundlegende
Methode kann auch zum Nachweis eines Verlusts an Heterozygotie oder
einer ande ren Mutation in einer Einbasen-Polymorphismusstelle zwischen
maternellen und paternellen Allelen angewandt werden. Ein solcher
Nachweis ist typischerweise ein Hinweis auf eine größere Deletion
oder einer anderen Mutation. Allerdings kann eine Mutation an einem
einzelnen polymorphen Nucleotid alles sein, was zur Hemmung der
Genfunktion in einem der beiden Allele notwendig ist. Eine Mutation
in einer Einbasen-Polymorphismusregion kann aufgrund eines unlängst entdeckten
Phänomens,
das komplementäre
Reduplikation genannt wird, schwer nachzuweisen sein. Bei der komplementären Reduplikation
führt der
Verlust von einem der beiden Allele an einem bestimmten Lokus zur "Reduplikation" des überlebenden
Allels. Die Reduplikation erfolgt in der Regel auf dem Chromosom,
das das überlebende
Allel enthält,
und umfasst die Erzeugung einer oder mehrerer Kopien des überlebenden
Allels auf dem Chromosom in enger Nachbarschaft zu der Position
des überlebenden
Allels. Im Falle eines Lokus, der eine oder mehrere Einbasen-Allelpolymorphismen
zeigt (d. h. die Heterozygotie am Lokus wird aufgrund von einem
oder mehreren Einbasen-Unterschieden in einer oder mehreren Regionen
des Lokus bestimmt), bewirkt die komplementäre Reduplikation eine Insertion
auf dem Chromosom, das das überlebende
Allel enthält,
eines Duplikats der Sequenz, die derjenigen entspricht, die auf
dem Chromosom deletiert wurde. Auch unter besonders stringenten
Hybridisierungsbedingungen bindet etwas von einer Sonde, die gegen
die deletierte Sequenz gerichtet ist, an die reduplizierte Sequenz
an einem Lokus eines Einbasen-Polymorphismus. Demnach kann unter
solchen Umständen
die Deletion nicht nachgewiesen werden, da jeder echte Unterschied
in der Anzahl von Sonden, die an die Polymorphismusstelle binden
(d. h. die Allelregion, die den Einbasen-Polymorphismus einschließt), durch
eine Zunahme auf Grund der anderen Reduplikationsregionen des Allels überlagert
wird.
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Die mit der komplementären Reduplikation
und mit nicht spezifischer Sondenbindung verbundenen Probleme, werden
in der Regel durch die Praxis der hier beschriebenen Verfahren erleichtert.
Durch solche Verfahren läßt sich
in einem der zwei Allele, die an einem speziellen Lokus in einer
Subpopulation von Zellen vorhanden sind, die in einer biologischen
Probe enthalten sind, eine Deletion nachweisen. Zahlreiche Allele, einschließlich von
Tumorsuppressorallelen, enthalten einzelne polymorphe Nucleotide
im Zusammenhang mit einer konstanten Nucleinsäureregion. Individuen können im
Hinblick auf das polymorphe Nucleotid normalerweise entweder homozygot
oder heterozygot sein. Da in den meisten Allelen zahlreiche einbasige
polymorphe Nucleotidstellen existieren, ist die Wahrscheinlichkeit,
dass ein gegebenes Individuum heterozygot ist, an mindestens einer
der Einbasen-Polymorphismusstellen hoch. Eine statistisch signifikante
Verminderung eines der beiden Nucleotide an einer Einbasen-Polymorphismusstelle
(an der das Individuum heterozygot ist) kann als Marker zur Deletion
in dem Allel verwendet werden, das diese Stelle umfasst.
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Genregionen, die bekannte einbasige
Polymorphismen enthalten, können
unter Bezugnahme auf eine Nucleotid-Datenbasis, wie GenBank, EMBL
oder jede andere bekannte Datenbasis, identifiziert werden. Die Existenz
von Polymorphismen kann durch hier gelehrte Verfahren, Gelelektrophorese
oder durch andere Standardverfahren bestimmt werden. Für die Zwecke
der Erfindung soll ein Einbasen-Polymorphismus ein einzelnes polymorphes
Nucleotid benachbart zu einer nicht polymorphen Region des Allels
sein, ohne Rücksicht
darauf, ob das einzelne polymorphe Nucleotid Teil einer größeren Polymorphismusstelle
bildet (d. h. der Einbasen-Polymorphismus kann das terminale Nucleotid
eines größeren Polynucleotid-Polymorphismus
sein). Für den
Nachweis von Krebs sind die betrachteten Regionen Regionen, in denen
der Verlust an Heterozygotie vorherrscht, wie Regionen, die Tumorsuppressorgene
enthalten. Ein gegebenes Individuum kann in jeder beliebigen identifizierten
Einbasen-Polymorphieregion
für das
polymorphe Nucleotid homozygot oder heterozygot sein. Wenn demnach
eine Anzahl von einbasigen polymorphen Regionen identifiziert wird,
erhöht
sich die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens eine heterozygote einbasige
polymorphe Region in einer Probe gefunden wird.
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Nach Identifizierung von einbasigen
polymorphen Stellen wird eine DNA-Probe aus einem Patienten, z.
B. aus den Blutzellen, erhalten, um zu bestimmen, welche dieser
Stellen in normalen Zellen (d. h. nicht kanzerös oder nicht präkanzerös) für dieses
Individuum heterozygot sind. Anschließend wird eine Stuhlprobe,
wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Doppelsträngige DNA
in der Probe wird in einzelsträngige
DNA übergeführt. Anschließend wird
entweder der kodierende Strang oder der antikodierende Strang für beide
Allele aus der Probe entfernt. Wie aus der folgenden Diskussion
klar wird, unterscheiden sich die hier beschriebenen Verfahren im
Hinblick darauf, ob der kodierende Strang oder der antikodierende
Strang getestet wird.
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EineOligonucleotidsonde wird konstruiert,
die zu einem Teil der Region mit Einbasen-Polymorphismus komplementär ist, wobei
der Teil an dem Nucleotid endet, das sich unmittelbar 3' zu dem polymorphen
Nucleotid befindet, ohne Rücksicht
darauf, ob der 5'-3'(kodierende)-Strang
oder der 3'-5'(antikodierende)
Strang als Templat verwendet wird. 3 zeigt
vier mögliche
Sonden, die sich für
jeden der vier möglichen
Templatstränge
unmittelbar 3' zu
dem polymorphen Nucleotid befinden, wie bevorstehend beschrieben
(die Sequenzen in Fi gur 3 sind hypothetisch und sollen keine tatsächliche
Sequenz darstellen). Die Sequenz mit der Bezeichnung M1 ist die
SEQ-ID-NR. 1; die
Sequenz mit der Bezeichnung M2 ist die SEQ-ID-NR. 2; die Sequenz mit der Bezeichnung
M3 ist die SEQ-ID-NR. 3; die Sequenz mit der Bezeichnung M4 ist
die SEQ-ID-NR. 4; die Sequenz mit der Bezeichnung F1 ist die SEQ-ID-NR.
5; die Sequenz mit der Bezeichnung F2 ist die SEQ-ID-NR. 6; die
Sequenz mit der Bezeichnung F3 ist die SEQ-ID-NR. 7; und die Sequenz
mit der Bezeichnung F4 ist die SEQ-ID-NR. B. Obgleich jeder Strang
als Templat zum Sondenbinden zur Bestimmung der Heterozygotie und/oder
des Verlustes hiervon verwendet werden kann, ist die Sequenz der
Sonde, die an das Templat hybridisiert ist, in Abhängigkeit
von dem verwendeten Strang verschieden. Die Sonden können eine
beliebige Länge
aufweisen, die eine effiziente und spezifische Hybridisierung gestattet. 3 erläutert hauptsächlich vier hypothetische
Sonden, die zur Hybridisierung an die gezeigte hypothetische Sequenz
brauchbar sind. Die Länge
der Sondensequenzen kann bestimmt werden, so wie sie für jede Genomregion,
die analysiert wird, angemessen ist. Eine bevorzugte Länge liegt
zwischen etwa 10 und etwa 100 Nucleotiden. Die Größe der Sonde hängt auch
von der Größe der Region
ab, die den Einbasen-Polymorphismus umgibt (d. h. die Region 5' oder 3' zum nächsten benachbarten
Polymorphismus, falls vorhanden). Ausführliche Angaben bezüglich Aufbau und
Hybridisierung von Oligonucleotidsonden sind aus der Technik bekannt.
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Sonden, die für jede polymorphe Region einzigartig
sind, hybridisieren an Regionen sowohl des maternellen als auch
paternellen Allels, bis zum, jedoch nicht einschließlich, polymorphen
Nucleotid, das in einer Heterozygote im maternellen und paternellen
Allel verschieden ist. 3 zeigt
nur einen kleinen Teil der Region, die das polymorphe Nucleotid
um gibt. Die Allele, die in 3 gezeigt
sind, sind an der polymorphen Stelle heterozygot.
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Die Sonde wird an ihre spezifische
Templat-DNA durch Standardverfahren hybridisiert. Die Probe kann
gegebenenfalls zur Entfernung unhybridisierter Sonde gewaschen werden.
Zur Bestimmung, ob jede Zielregion, die von einer Sonde gebunden
wurde, am polymorphen Nucleotid heterozygot oder homozygot ist, wird
eine Modifikation der Dideoxykettenterminationsmethode, wie von
Sanger beschrieben, Proc. Nat'1
Acad. Sci. (USA), 74: 5463–5467
(1977), angewandt. Das Verfahren umfasst die Verwendung von mindestens
zwei der vier üblichen
2',3'-Dideoxynucleosidtriphosphate (ddATP,
ddCTP, ddGTP und ddTTP). Eine unterschiedliche nachweisbare Markierung
wird durch die aus der Technik bekannten Verfahren an jedes Dideoxynucleosidtriphosphate
(ddNTP)angebracht. Verschieden markierte ddNTPs sind im Handel,
beispielsweise von der Firma Perkin Elmer Corporation (Katalog Nr.
401 456), erhältlich.
Mindestens zwei markierte ddNTPs werden so dann gegenüber jeder
Probe, die eine Sonde hybridisiert und maternelle und paternelle
Allele aufweist, wie vorstehend beschrieben, exponiert. Die Wahl,
welches der beiden ddNTPs verwendet werden, hängt von den Nucleotiden an
der heterozygoten Polymorphismusstelle ab. Jedes 3'-modifizierte Nucleosidtriphosphat
kann bei dem Verfahren verwendet werden, solange die 3'-Modifikation das
Binden an ein zusätzliches
3'-Nucleotid (d.
h. Sondenextension) verhindert und das Binden des modifizierten
Nucleotids an das 3'-Ende
der Sonde nicht hemmt. Eine DNA-Polymerase, wie SequenaseTM (Perkin-Elmer), wird dem Probengemisch
zugesetzt. Unter Verwendung der Allelstränge als Primer addiert die
Polymerase ein ddNTP an das 3'-Ende
der Sonde, das eingebaute ddNTP ist komplementär zu dem Nucleotid, das an
der Einbasen-Polymorphismusstelle
existiert. Da die ddNTPs kein 3'- Hydroxyl aufweisen,
erfolgt keine weitere Verlängerung
der hybridisierten Sonde. Nach Beendigung wird die Probe zur Entfernung
von überschüssigen ddNTPs
gewaschen. Anschließend
wird die Markierung in jeder Probe gezählt. Das Vorliegen von zwei
unterschiedlich markierten ddNTPs in einer Probe ist ein Hinweis
auf die Heterozygotie an der Polymorphismusstelle.
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Die Bestimmung der Menge von jeder
in der Probe vorhandenen Markierung ist zur Erstellung der Heterozygotie
oder Homozygotie nicht notwendig. Beispielsweise können verschieden
markierte Deoxynucleosidtriphosphate zur Bestimmung der Heterozygotie
oder Homozygotie verwendet werden. Die bloße Tatsache, dass zwei verschieden
markierte Dideoxynucleotide in die Sonde eingebaut werden, bedeutet,
dass die Einbasen-Polymorphismusstelle, die analysiert wird, heterozygot
ist. Die Bestimmung der Stellen, an denen ein Patient polymorph
ist, ist jedoch zur Erstellung einer Grundlinie der Polymorphismen
brauchbar, die in zukünftigen
Tests zum Nachweis von Änderungen
in polymorphen Stellen, die Krebs anzeigen können, verwendet werden kann.
Die Existenz von Polymorphismen kann durch hier gelehrte Verfahren,
durch Gelelektrophorese oder durch andere Standardverfahren bestimmt
werden.
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Im Falle, in dem an der Polymorphismusstelle
Heterozygotie vorliegt, lässt
sich durch das Zählen
der Menge jeweils der beiden verschieden markierten ddNTPs bestimmen,
ob ein Verlust an Heterozygotie (d. h. eine Deletion) in einer Subpopulation
von Zellen in der Probe vorliegt. In einer normalen (d. h. nicht
kanzerösen)
Probe, die Zellen enthält,
die an der Einbasen-Polymorphismusstelle heterozygot sind, wird
erwartet, dass die nachgewiesene Menge von jedem der beiden ddNTPs,
die der Sonde zugesetzt worden sind, identisch sind (innerhalb gewählter Grenzen
von statistischer Signifikanz).
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Wenn allerdings eine Deletion in
einem der beiden Allele in einer Subpopulation von Zellen in der
Probe aufgetreten ist, existiert ein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den Mengen von jedem der beiden Allele, die über die
eingebauten (markierten ddNTPs) nachgewiesen wurden. Der Nachweis
eines solchen Unterschiedes ist ein Hinweis auf eine Gen-Instabilität in der
Probe. Eine solche Gen-Instabilität ist ein Hinweis auf mögliche kanzeröse oder
präkanzeröse Zellen
in der Probe.
-
Zur Verbesserung der Fähigkeit
zum Zählen
von Allelen, an die sich die ddNTPs exakt angeknüpft haben, werden die ddNTPs
mit Hybridisierungstyp-Perlen unterschiedlicher Größe, wie
vorstehend beschrieben, markiert. Allele mit gebundener Sonde, die
ein markiertes ddNTP umfasst, werden wie vorstehend beschrieben
unter Verwendung einer Zählvorrichtung,
wie eines Coulter-Zählers,
gezählt.
Ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, können verschiedene fluoreszente
Markierungen oder andere Zählmittel
zum getrennten Nachweis eingebauter ddNTP verwendet werden.
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Der Nachweis von Heterozygotie an
Einbasen-Polymorphismusstellen und der Nachweis des Verlustes von
Heterozygotie kann in getrennten Schritten bestimmt werden. Beispielsweise
können
Sonden unmittelbar benachbart zu, jedoch nicht einschließend des
als polymorph bestimmten Nucleotids, wie vorstehend beschrieben,
hybridisiert werden. Anschließend
können
die vier ddNTPs der Probe zugesetzt und gewaschen werden, und das
Vorliegen oder die Abwesenheit jeglicher Markierung kann nachgewiesen
werden. Der Nachweis von nur einer Markierung zeigt an, dass das
Individuum, von wo die Probe erhalten wurde, an der Stelle des potentiellen
polymorphen Nucleotids homozygot ist. Der Nachweis von zwei Markierungen
bedeutet dass das Individuum heterozygot ist. Die heterozygoten
Loci werden aufgezeichnet. Wie vorstehend angegeben, können Grundlinienbestimmungen
der Heterozygotie, unter Verwendung von Standardverfahren, erfolgen. Nach
Erstellung einer Grundlinie werden zukünftige Tests an diesem Individuum
unter Ausnutzung der heterozygoten Loci zum Nachweis eines Verlustes
der Heterozygotie durchgeführt.
Zum Nachweis von Krebs sind die heterozygoten Loci typischerweise
chromosomale Bereiche, die Tumorsuppressorgene, einschließlich p53,
dcc, apc und andere, enthalten. Unter Anwendung der hier beschriebenen
Verfahren kann ein "Fingerabdruck" der heterozygoten
Tumor-Suppressor-Loci
konstruiert werden. Eine künftige
Abweichung vom Fingerabdruck (d. h. Deletionen) liefert wertvolle
Informationen bezüglich
der Entwicklung von Krebs.
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Eine bevorzugte Verwendung der vorgenannten
Verfahren ist der Nachweis von Kolonkrebs. Eine repräsentative
Stuhlprobe wird, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Doppelsträngige DNA
wird in einzelsträngige
DNA umgewandelt, und das Komplement des nachzuweisenden Strangs
wird aus der Probe entfernt. Die verbleibende einzelsträngige DNA
wird mehreren Kopien einer Sonde, die auf der Grundlage bekannter
Einbasen-Polymorphismen in einem Krebs-assoziierten Allel aufgebaut
ist, so exponiert, dass die Sonde mit einer gewünschten Anzahl von Nucleotiden
unmittelbar benachbart zu dem polymorphen Nucleotid, wie vorstehend
beschrieben, hybridisiert. Nach Abschluss der Hybridisierung wird
die Probe gewaschen und gegenüber
verschieden markierten ddNTPs und einer DNA-Polymerase exponiert.
Die Probe wird anschließend zur
Entfernung nicht eingebauter ddNTPs gewaschen. Das Vorliegen jeglicher
markierter ddNTPs wird bestimmt. Wenn zwei Markierungen nachgewiesen
werden, ist das Individuum, von dem die Probe erhalten wird, an
dem polymorphen Nucleotid heterozygot. Die Heterozygotie des Allels
und der Sondensequenz, die mit der Stelle unmittelbar benachbart
zum polymorphen Allel übereinstimmt,
wird als Referenz für
zukünftige
Tests auf den Verlust von Heterozygotie festgehalten. Alternativ
kann, nachdem bestimmt worden ist, dass der Patient an einem Locus
heterozygot ist, ein Test unmittelbar auf die vorstehend beschriebene
Weise durchgeführt
werden, um in einer Subpopulation von Zellen in der Probe einen
existierenden Heterozygotie-Verlust zu bestimmen.
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C. Analyse von Mikrosatelliten-Instabilität
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Mikrosatelliten sind Di- oder Trinucleotid-Wiederholungen,
die überall
im Genom vorkommen. Eine bestimmte Ansammlung von Mikrosatelliten-Wiederholungen
ist oft mit einer bestimmten Genomsequenz assoziiert und wird unter
normalen Bedingungen stabil vererbt. Expansionen der Mikrosatelliten-Kopienzahl,
typischerweise "Mikrosatelliten-Instabilität" genannt, gehen mit
Defekten in der Fehlpaarungsreparatur einher. Demnach zeigen Änderungen
in einer Mikrosatellitenregion an, dass der Patient ein Risiko einer
Mutation in anderen Gen-Regionen trägt.
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Zum Nachweis von Mikrosatelliten-Instabilität als Indikator
für eine
Mutation in einem mit Krebs assoziierten Gen muss zunächst eine
Mikrosatellitenregion identifiziert werden, die mit dem Gen von
Interesse assoziiert ist. Solche Regionen werden typischerweise
mit einer Datenbasis identifiziert, wie GenBank, EMBL und andere.
Nach Identifikation einer Wildtyp-Mikrosatellitenregion, die beispielsweise
mit dem Tumorsuppressorgen p53 assoziiert ist, wird eine Oligonucleotidsonde
konstruiert, die die Mikrosatellitenregion und die Regionen unmittelbar
5' und unmittelbar
3' zu der Mikrosatellitenregion
umspannt. Die exakte Länge
von Sonden kann durch den Experimentator bestimmt werden. Es werden
Sonden konstruiert, die an die Mikrosatellitenregion, einschließlich von
Teilen, die von 5' und
3' ausgehen, sowohl
auf den maternellen als auch paternellen Allelen, mit denen der
Mikrosatellit assoziiert ist, hybridisieren (z. B. p53).
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Eine entsprechende Probe von Körpergewebe
oder -fluid wird erhalten und wie hier beschrieben aufgearbeitet.
Doppelsträngige
DNA wird denaturiert, und ein Überschuss
an maternellen und paternellen Sonden, wie vorstehend beschrieben,
wird unter Hybridisierungsbedingungen in die Probe eingebracht.
Die Sonden sind nachweisbar markiert, wie vorstehend beschrieben.
Das Komplement der nachzuweisenden Stränge kann gegebenenfalls durch
Verfahren, die vorstehend beschrieben sind, entfernt werden. Anschließend wird die
Probe zur Entfernung nicht hybridisierter Sonde gewaschen, und die
Menge an hybridisierter Sonde wird quantitativ nachgewiesen.
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Der quantitative Nachweis kann durch
jedes beliebige hier beschriebene Mittel durchgeführt werden. Beispielsweise
können
die Sonden an Hybridisierungsperlen angeknüpft werden, derart, dass Sonden,
die an das maternelle Allel binden, an Perlen einer Größe angeknüpft sind
und Sonden, die an das paternelle Allel binden, an Perlen einer
zweiten Größe angeknüpft sind,
die von Perlen der erste Größe unterscheidbar
sind. Perlen mit angeknüpfter
Sonde können,
wie vorstehend beschrieben, gezählt
werden.
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Der Nachweis eines statistisch signifikanten
Unterschieds zwischen der Menge an Sonde, die an das maternelle
Allel bindet, und der Menge an Sonde, die an das paternelle Allel
bindet, ist ein Hinweis auf die Mikrosatelliten-Instabilität. Wie vorstehend
erwähnt,
kann die Mikrosatelliten-Instabilität eine Mutation an dem Locus,
an dem sich der Mikrosatellit befindet, anzeigen. Wenn die Mikrosatellitenregion
mit einem Tumorsuppressorgen oder einem Oncogen assoziiert ist,
zeigt eine nachgewiesene Mikrosatelliten-Instabilität in einem
Allel in einer Subpopulation von Zellen in einer biologischen Probe
einen möglichen
Krebs oder Krebs oder Präkanzerose,
die sich bereits entwickelt haben können, an. Weitere Tests, wie
hier beschrieben (entweder durch invasive oder nicht invasive Mittel),
können
anschließend
durchgeführt
werden.
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Bei einer alternativen Ausführungsform
wird ein "Fingerabdruck" der Mikrosatelliten
von Regionen, die mit krebsverursachenden Genen in einer aus einem
Patienten erhaltenen Probe assoziiert sind, entnommen. Ein solcher
Fingerabdruck kann durch Standardverfahren erhalten werden. Der
Fingerabdruck umfasst die Sequenz von Wildtyp-Mikrosatelliten, die
mit dem krebsverursachenden Gen oder Genen assoziiert sind. Nach Erhalt
wird der Fingerabdruck gespeichert und in zukünftigen Tests von Proben aus
dem gleichen Patienten verwendet, um Änderungen in den Mikrosatellitenregionen
(d. h. eine Mikrosatelliten-Instabilität) zu registrieren, die mit
der Entwicklung von Krebs assoziiert sein können. Zeitliche Änderungen
in der Mikrosatellitenlänge und/oder
-sequenz können
zum Verschreiben zusätzlicher
Tests und/oder zur Behandlung zum Nachweis und zur Entfernung von
kanzerösem
Gewebe im Frühstadium
seiner Ethiologie verwendet werden.
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Zusätzliche Ausführungsformen
der Erfindung gehen aus der Berücksichtigung
der folgenden Ansprüche
hervor.
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