Verfahren zum Nachweis einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponierendem Gen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Mutation an einem für hereditäre kolorektale Tumoren prädisponierendem Gen.
Hereditäre kolorektale Karzinome machen etwa 10% aller jährlich neu entdeckten kolorektalen Karzinome aus. Die Diagnose eines solchen hereditären kolorektalen Karzinomes hat weitreichende Konsequenzen nicht nur für den Betroffenen, dessen Zweitkarzinom-Risiko signifikant höher ist als in der Gesamtpopulation. Auch Angehörige ersten Grades sind bei diesen autosomal dominant vererbten Erkrankungen zu 50% betroffen. Der Nachweis einer Mutation bei dem Erkrankten ermöglicht das Screening seiner Angehörigen.
Aufwendige und von der Deutschen Gesellschaft für Verdau- ungs- und Stoffwechsel empfohlene, engmaschige Überwachungsmaßnahmen wie die zunächst 2-jährliche, ab dem 40.
Lebensjahr jährliche Koloskopie sind für die Früherkennung von Karzinomen bei Genträgern unter den Nachkommen essentiell. Kann eine Mutation in diesen Nachkommen jedoch ausgeschlossen werden, so erübrigt sich auch eine den Angehörigen belastende und sehr teure Diagnostik. Ein solcher Ausschluß einer Mutation bei Angehörigen erfordert jedoch den Mutationsnachweis bei der an einem HNPCC-erkrankten Person. Mit den bislang verwendeten konventionellen Sequenzierungstechniken kann aufgrund des hohen Aufwandes und der Dauer der Prozedur nur ein kleiner Teil der Patienten erfasst werden.
Hereditäre kolorektale Karzinome
Hereditäre Syndrome machen etwa 10% aller diagnostizierten kolorektalen Karzinome aus. Von diesen vererbbaren kolorektalen Karzinomen ist die Mehrzahl auf autosomal dominante Defekte von Mismatch-Repair-Genen zurückzuführen. Mismatch- Repair-Gene kodieren für Enzyme, die Fehler bei der DNA Re- plikation erkennen und beheben. Diese Gendefekte führen durchschnittlich mit dem 48. Lebensjahr bei etwa 80% der Gendefekt-Träger zu hereditären, nichtpolypösen Karzinomen (HNPCC) des Kolon und Rektum. Das Manifestationsalter liegt damit um 10 - 15 Jahre vor dem Auftreten sporadischer kolo- rektaler Karzinome. Neben dem Auftreten von kolorektalen Karzinomen (nach dem Erstbeschreiber Lynch-I Syndrom) mit synchronen (15%) und metachronen Läsionen (70% nach 15 Jahren) sind auch Patienten mit extrakolisehen Karzinom- Manifestationen beschrieben worden. Diese Patienten mit einem Defekt des DNA Mismatch-Repair-Systems werden dem Lynch-II Syndrom zugeordnet. Zu diesen Tumorentitäten zählen das Endometrium- , Ovarialkarzinome, Magen- und Dünndarm-Karzinom, das cholangiozelluläre Karzinom, Harnwegskarzinome, Malignome des zentralen Nervensystems sowie andere seltenere Tumoren.
Auch bei der selteneren familiären Polyposis coli (FAP) liegt ein autosomal dominanter Erbgang vor. Mutationen des APC-Genes führen dann mit einer nahezu 100% Wahrscheinlichkeit zu kolorektalen Karzinomen bereits vor dem 40. Lebensjahr. Ab dem 20. Lebensjahr finden sich bei nahezu 100% der Gendefekt-Träger bereits hunderte von Polypen im gesamten Kolorektum, noch vor dem 40. Lebensjahr beträgt die Inzi- denz kolorektaler Karzinome 100%. Diese Erkrankung macht etwa 1-3% aller hereditären kolorektalen Karzinome aus. Neben dem Kolon und Rektum kann auch der obere Gastrointesti- naltrakt betroffen sein. Darüber hinaus sind follikuläre und papilläre Schilddrüsenkarzinome sowie Hepatoblastome beschrieben worden. Beim Gardnerschen Syndrom ist diese FAP mit periampulären Karzinomen, Osteomen, Desmoidtumoren, Epidermoidzysten und Angiofibromen assoziiert. Gleichzeitiges Auftreten von Medulloblastomen spricht für ein Turcot- Syndrom.
Molekulare Grundlagen von HNPCC und FAP
Das hereditäre nichtpolypöse kolorektale Karzinom ist wie bereits beschrieben mit der Mutation eines der Mismatch- Repair-Enzym-Gene assoziiert. Defekte im Bereich der DNA, die auf eine fehlerhafte Mismatch Repair zurückzuführen sind, lassen sich indirekt über eine sogenannte Mikrosatel- liteninstabilität nachweisen. Mikrosatelliten sind sich wiederholende Basensequenzen, die über die gesamte genomische DNA des Menschen vorkommen. Diese Mikrosatelliten zeigen für alle Körperzellen des Individuums eine charakteristische Anzahl an Wiederholungen, die interindividuell variieren. Bei Vorliegen eines HNPCC finden sich bei 90% dieser Patienten Längendifferenzen der Mikrosatelliten zwischen Tumor und gesundem Kolongewebe . Diese Längendifferenzen werden als Mikrosatelliteninstabilität (MSI)
bezeichnet und finden sich bei den sporadischen kolorektalen Karzinomen in nur 20% der Patienten. Eine Untersuchung auf MSI wird daher bislang als Screeningverfahren bei Verdacht auf Vorliegen eines HNPCC durchgeführt . Auch wenn das Vorliegen einer MSI den Verdacht auf ein HNPCC verstärkt, so ermöglicht erst der Nachweis der Mutation eines der beteiligten Mismatch-Repair-Gene ein Screening der Angehörigen und die Klärung der Frage, ob dieser autosomal dominante Gendefekt vererbt wurde. Dabei kann dieser Keimbahndefekt nicht nur im Tumorgewebe sondern beliebigen, kernhal- tigen Zellen des Körpers nachgewiesen werden.
Nach Charakterisierung von Mismatch-Repair-Systemen in E. coli und S. cerivisiae konnten auch im Menschen bislang 6 Gene charakterisiert werden, die in dem Mismatch-Repair- System involviert sind:
Unterschieden werden MutS Homologe wie hMSH2, hMSH3 und das GT bindende Protein GTBP/pl60 (hMSH6) sowie MutL Homologe wie hMLHl, hPMSl und hPMS2. Mutationen in hMSH2 und hMLHl machen dabei 65% aller Mutationen bei HNPCC aus.
Das hMSH2 und das GTBP (hMSH6) erkennen eine Vielzahl einzelner Nukleotid-Fehler sowie Loops in der Intermediärphase nach DNA-Replikation. Die Erkennung des inkorrekten Stranges erfolgt entweder durch die vorübergehende Hypomethylie- rung oder transiente Nicks im Tochterstrang. Anschließend kommt es zur Dimerisierung des hMLHl und des hPMS2, dieses Dimer bindet nachfolgend an den an dem DNA-Strang befindlichen hMSH2/GTBP-Komplex. Dieses Verhalten ist in Fig. 1 dargestellt. Die Exzision des inkorrekten Stranges erfolgt durch DNA-Exonuklease und Helicase. Nachfolgend wird die Reparatur durch eine DNA-Polymerase abgeschlossen. Die besondere Bedeutung von PMS1 und MSH3 ist noch nicht verstanden. Bereits in Bakterien und Hefen konnte gezeigt werden, das Defekte im MMR-System insbesondere zu instabilen (GT)n-
Regionen führen. MSI sind die Folge von ungleichem crossing over in Folge der Defekte bei Replikation der DNA. Es ist anzunehmen, dass weitere Gene oder Systeme bei Entstehung kolorektaler Karzinome bei HNPCC-Familien involviert sind, da ein kleiner Teil dieser HNPCC-Familien keine Mutation in den bekannten MMR-Genen aufweist.
Die familiäre adenomatose Polyposis ist auf eine Mutation im APC-Gen zurückzuführen. Die Sequenzierung dieses Genes ist sowohl bei der FAP als auch der attenuierten Form (über 20 Adenome) dieser Erkrankung indiziert. Das APC-Gen ist charakterisiert und abhängig von der Art der Mutation (Fra- meshift, Trunkierung, Basenaustausch) kommt es zu unterschiedlicher Ausprägung des Phänotyps dieser Erkrankung. Die FAP macht etwa 1% - 2% aller kolorektalen Karzinome aus. Das APC-Gen kodiert für ein Enzym zur Phosphorylierung und Degradation von ß-Cathenin. Durch eine Mutation des APC-Genes kommt es dann zur Akkumulation von ß-Cathenin und subsequenter Aktivierung des Transkriptionsfaktors Tcf-4. In 80% liegen trunkierende Mutationen vor. Häufig findet sich eine Mutation des einen- und Deletion des anderen Al- leles.
Der Nachweis von Mutationen in einem der Mismatch-Repair- Gene, dem APC- oder anderer für hereditäre Erkrankungen prädisponierende Gene mit konventionellen Sequenzierungs- ethoden gestaltet sich bislang als sehr zeitaufwendig und arbeitsintensiv und teuer. Der Nachweis einer solchen Mutation ist hingegen für die Stellung der Diagnose und das Screening der Nachkommen sehr wertvoll, da mit dem Fehlen der in dem Familienmitglied vorbeschriebenen Mutation ein erhöhtes Risiko, an einem HNPCC oder einer FAP zu erkranken ausgeschlossen werden kann. Dies würde auch die für den Pa-
tienten belastende endoskopische Diagnostik erübrigen, Kosten einsparen und Ressourcen für die von dem Gendefekt betroffenen Familienangehörigen schaffen. Darüber hinaus würde ein sehr viel schnellerer Mutationsnachweis zu einer größeren Bereitschaft bei den Familienangehörigen führen, im Falle einer nachgewiesenen Mutation eines entsprechende Diagnostik durchführen zu lassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren der einleitend genannten Art derart anzugeben, daß übliche den Patienten belastende und aufwendige Diagnostik- Verfahren vermieden und durch ein laborartiges gentechnisches Analyseverfahren ersetzt werden, das reproduzierbare Analysedaten für eine anschließende medizinische Interpretation bereitstellt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß markierte DNA unter Verwendung von stationären Oligonukleoti- den hybridisiert wird und daß anschließend eine Analyse auf spezifische Nukleinsäuresequenzen durchgeführt wird.
Vom Patienten spezifisch amplifizierte DNA wird mit Oligo- nukleotiden hybridisiert, die mindestens eine aller denkbaren Punktmutationen, Deletionen und Insertionen aller bei hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinomen betroffenen Gene repräsentieren. Das Hybidisierungsverhalten der markierten, beispielsweise Fluoreszenz-markierten, amplifi- zierten DNA gibt dann Aufschluss über die vorliegende Mutation. Dieses Sequenzierungsverfahren ist dabei nicht nur wesentlich schneller als die konventionelle Sequenzierung, es können in einem Ansatz auch sämtliche bekannte Mismatch- Repair-Gene überprüft werden und die Mutationsanalyse wird kostengünstiger. Darüber hinaus wird das im folgenden beschriebene System die Untersuchung eines signifikant höheren Patientenkollektivs ermöglichen und zur Senkung der
Mortalität bei betroffenen Angehörigen von Erkrankten mit hereditären kolorektalen Karzinomen beitragen.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zum schnellen und kostengünstigen Nachweis von Mutationen bei Verdacht auf ein hereditäres nichtpolypöses kolorektales Karzinom oder eine familiäre Polyposis coli unter Zuhilfenahme der DNA- Chip Technologie bereitgestellt. Nach spezifischer Amplifi- kation von DNA aus peripheren Leukozyten derjenigen Patienten, bei denen ein hochgradiger Verdacht auf ein HNPCC oder eine FAP besteht, führt die Hybridisierung entsprechend markierter DNA mit stationären Oligonukleotiden, die alle möglichen Punktmutationen, Insertionen und Deletionen einzelner Basen der bekannten Mismatch-Repair-Gene sowie des APC-Genes repräsentieren, zur Ermittlung der spezifischen Mutation. Größere Deletionen und Insertionen beliebiger Länge werden durch Oligonukleotide mit terminal modifizierten Basen detektiert. Diese innerhalb von 1-2 Tagen durchzuführende Mutationsanalyse stellt die Grundlage für das Screening der in 50% betroffenen Familienangehörigen dar.
Neben einer effizienten und kostengünstigen Sequenzierung der möglicherweise betroffenen Mismatch-Repair-Gene oder des APC-Genes kann durch dieses gegenüber der konventionellen Sequenzierung sehr zeitsparende Verfahren eine erhöhte Bereitschaft bei den erstgradigen Familienangehörigen zur genetischen Beratung und Untersuchung bezüglich des in der Familie vorbeschriebenen genetischen Defektes erreicht werden. Ein solches Screening der Verwandten kann erheblich zur Reallokation diagnostischer Ressourcen und zur signifikanten Senkung der Mortalität bei diesen Erkrankungen führen.
In den Zeichnungen sind Ausführungsbeispiele der Erfindung schematisch dargestellt. Es zeigen:
Fig. 1 Ein funktionelles und zeitliches Modell des Mismatch-Repair-Systems und
Fig. 2 eine schematische Darstellung der spezifischen Am- plifikation und Markierung von DNA vor einer Hybridisierung mit Oligonukleotiden des DNA-Chips.
DNA-Chip Technologie
Mit Hilfe der Gen-Chip-Technologie die beispielsweise in den Veröffentlichungen US 5445934, US 5744305, US 5700637, US 5945334, EP 0619321 und EP 0373203 beschrieben wird, können spezifische Nukleinsäure-Sequenzen analysiert und Punktmutationen sowie singuläre Deletionen detektiert werden. Zu diesem Zwecke sind arrays von Oligonukleotid-Proben auf einem Glas-Träger synthetisiert. Die Herstellung dieser Chips erfolgt durch photolithographische Oligonukleotid- synthese. Auf einem Silikon-Träger können mittlerweile über 800 . 000 verschiedene Oligonukleotid-Proben untergebracht werden. Jede einzelne Probe ist in einer etwa 18μm durchmessenden Zelle untergebracht und beinhaltet etwa 107 Kopien der entsprechenden Oligonukleotid-Probe.
Diese nach vorgegebenen Spezifikationen herzustellenden DNA-Arrays werden dann mit markierten PCR-Produkten aus spezifisch amplifizierter DNA des Patienten hybridisiert. Der so hybridisierte Array wird mit Hilfe eines Lasers in einem dafür konstruierten Scanner analysiert, indem durch den Laser angeregte Fluoreszenz der hybridisierten DNA an den Oligonukleotid-Proben quantifiziert wird. Dies ermöglicht die Bestimmung gebundener DNA an den verschiedenen Oligonukleotid-Proben und damit die Sequenz der zu untersuchenden DNA. Die gesamte Prozedur erfordert 2 Tage.
Strategie zur Mutationsanalyse
Als Ausgangsmaterial für die Mutationsanalyse dient genomische DNA aus Leukozyten, die nach Standardverfahren aus Zellen oder Geweben isoliert wird. Die Mutationsanalyse wird für alle Exons (E) der Mismatch-Repair-Gene MLH1 (19E) , PMS1 (12E) , PMS2 (15E) , MSH2 (16E) , MSH3 (24E) und MSH6 (10E) sowie für das APC-Gen (15E) durchgeführt. Hierzu sind voraussichtlich 111 unterschiedliche PCR-Reaktionen erforderlich. Die PCR-Amplifikation erfolgt entsprechend der Erläuterung in Fig. 2 für alle Exons mit Exon- übergreifenden Primern, die in den flankierenden Intronre- gionen lokalisiert sind, so dass neben potentiellen Mutationen in den kodierenden Genregionen auch sämtliche spli- ce-site Mutationen erfasst werden.
Für die nachfolgende Chip-Analytik werden die PCR- Reaktionen mit Fluoreszenz-markierten Primern in einem entsprechenden Mikrotiterplattenformat auf "Multi-Cyclern" durchgeführt. Für die Mismatch-Repair-Gene MLH1 und MSH2 sind die optimalen PCR-Bedingungen bereits etabliert. Zur Vermeidung aufwendiger gelektrophoretischer Amplifikations- Kontrollen, wird die Effizienz der PCR-Amplifikation für jedes Exon durch Hybridisierung des PCR-Produkts mit Exon- spezifischen Sonden basiert, überprüft und quantifiziert. Nach Aufreinigung der PCR-Produkte nach Standardverfahren (Mikrotiterplattenformat) , erfolgt anschliessend die Muta- tions-Analytik auf dem kommerziell gefertigten und bereits beschriebenen DNA-Chip. Hierzu werden sämtliche aufgereinigten PCR-Produkte einer DNA-Probe gepoolt, mit den auf der Chip-Oberfläche immobilisierten wildtyp- bzw. mutationsspezifischen Oligonukleotiden hybridisiert und nach stringentem Waschen mittels Laser-induzierter Fluoreszenz detektiert. Die Detektion von Punktmutationen, Einzelbasen- deletionen und -insertionen erfolgt dabei durch Hybridisierung mit den entsprechenden Oligonukleotiden, welche diese Mutationen repräsentieren. Größere Deletionen oder Inser-
tionen werden durch Hybridisierung mit terminal modifizierten Oligonukleotiden detektiert.
Potentielle Mutationen werden durch ein verstärktes Fluoreszenzsignal im Vergleich zum Hintergrund erkannt; zusätzlich dient das für jede Basenposition gemessene Wildtypsignal als interne Positivkontrolle für die Hybridisierungsund Detektionseffizienz der Analytik. Die in der Chip- Analytik identifizierten Mutationen werden anschließend zur Überprüfung der Analytik und zum Ausschluß funktionell irrelevanter Polymorphismen mittels konventioneller, nichtradioaktiver DNA-Sequenzierung überprüft.
Die wesentlichen Vorteile des vorstehend erläuterten Verfahrens liegen neben der erheblichen Zeitersparnis bei der Sequenzierung (beispielsweise 2 Tage gegenüber mindestens 4 Wochen) in einer höheren Sensitivitat bei dem Nachweis von MMR-Gen-Mutanten, da neben den MLH1, MSH2 und MSH6 Genen bei der konventionellen Sequenzierung zusätzlich die PMS1, PMS2 und MSH3 -Gene sequenziert werden.
Bei einer anzunehmenden Sensitivitat von 95% werden mit einem derartigen DNA-Chip 80% aller Mutationen bei Betroffenen mit einem HNPCC charakterisiert. Die Kostenersparnis gegenüber der konventionellen Sequenzierung wird sich auf etwa 60% belaufen und könnte zu jährlichen Einsparungen in Höhe von EUR 1.000.000,00 führen, wenn nur 3000 der über 5000 jedes Jahr neu auftretenden HNPCC untersucht werden. Mit einer konventionelle Sequenzierung wären darüber hinaus die jährlich 3000 neu diagnostizierten Patienten mit einem HNPCC kaum zu charakterisieren, solche Kapazitäten ermöglicht erst die Anwendung der DNA-Chip-Technologie.