EP1664349A2 - Verfahren zur nichtinvasiven früherkennung von dickdarmkrebs und/oder darmkrebsvorläuferzellen - Google Patents

Verfahren zur nichtinvasiven früherkennung von dickdarmkrebs und/oder darmkrebsvorläuferzellen

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Publication number
EP1664349A2
EP1664349A2 EP04786873A EP04786873A EP1664349A2 EP 1664349 A2 EP1664349 A2 EP 1664349A2 EP 04786873 A EP04786873 A EP 04786873A EP 04786873 A EP04786873 A EP 04786873A EP 1664349 A2 EP1664349 A2 EP 1664349A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ras
catenin
primers
apc
raf
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04786873A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Pablo Steinberg
Bettina Scholtka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Postdam
Original Assignee
Universitaet Postdam
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Postdam filed Critical Universitaet Postdam
Publication of EP1664349A2 publication Critical patent/EP1664349A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the non-invasive early detection of colon cancer and / or colon cancer precursor cells, it also relates to primers with which mutation analyzes in selected regions of the genes APC, K-ras, ⁇ -catenin and B-raf can be carried out in combination, and a kit comprising these primers and also the use of the primers and the kit for mutation analysis, in particular for the early detection of colon cancer and / or
  • colon cancer Various methods are known in the prior art for detecting colon cancer.
  • the most common methods used in medicine to diagnose colon cancer are the haemocult test, sigmoidoscopy and colonoscopy.
  • the haemocult test which is based on the detection of blood in the stool, is not sufficiently specific for the diagnosis of colon cancer due to a variety of possible causes of intestinal bleeding.
  • the blood loss from small colorectal tumors ( ⁇ 2 cm) with 1 to 2 ml per day is so small that it is not always recorded with this test.
  • Sigmoidoscopy a reflection of the rectum, cannot detect tumors of the proximal colon. It is estimated that 25 to 34% of colon cancers are overlooked using this method.
  • Colonoscopy in which the entire colon is mirrored, recognizes approximately 80% of tumors> 1 cm in size, but is an invasive procedure and due to the resulting low level of patient acceptance regular check-ups are hardly suitable. Therefore, several working groups are currently working on the development of methods for diagnosing colorectal cancer in stool samples.
  • CCA carcinoembryonic antigen
  • US Pat. No. 005741650 A The detection of carcinoembryonic antigen (CEA) in faeces (US Pat. No. 005741650 A) is not a reliable test for predicting the onset of a colon tumor, but is rather suitable as an indicator of the occurrence of recurrences.
  • Ahlquist and Shuber were able to use the method based on the polymerase chain reaction (PCR) to demonstrate agreement of K-ras mutations in stool and tissue samples from patients with cancer or large adenomas.
  • K-ras mutations occur in less than 50% of all clone tumors and can also be found in non-neoplastic tissue, which is why this marker alone is not sufficient for a detection method for the early detection of colorectal cancer.
  • the prior art also describes a test system for the detection of cancer, in which the detection of an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family is used in combination with a member of the Raf family.
  • both markers must be present in the same sample.
  • Samples are transgenic non-human mammals or isolated human or non-human cells. It is not possible to use these test systems with the human stool sample material.
  • B-raf genes and their use for the detection of tumors is disclosed in the prior art.
  • the mutants are isolated from a human primary tumor that has to be removed by an invasive procedure. A polypeptide is then isolated from this. Healthy patient control tissue must also be removed. This method cannot detect early mutations. An examination of stool samples is also not possible with this method, but only on detected and isolated complete tumor cells, from which polypeptides are preferably isolated. Furthermore, this method is limited to defined point mutations, so that mutations such as insertions, deletions or others cannot be detected within a limited sequence range. Possible combinations with other genes are not disclosed or suggested.
  • the object of the invention was therefore to provide a method with which colon cancer or colon cancer precursor cells can be detected simply, safely and effectively in a stool sample, the disadvantages of the prior art being avoided, in particular the undesired interaction of the primers with one another and with the stool sample.
  • the invention solves this problem by providing a method for the non-invasive early detection of colon cancer and / or colorectal cancer precursor cells by mutation analysis of the genes for APC, K-ras, ⁇ -catenin and B-raf in a sample, the method comprising the following steps: taking a Stool and / or tissue sample, - homogenizing the sample, obtaining DNA from the sample, Carrying out an amplification reaction, preferably a PCR reaction, in the genes for APC, K-ras, ß-catenin and B- raf, wherein for APC primers Sl TTGCAGTTATGGTCAATACCC asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG s2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC 53 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC 54 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACA
  • the method or in a kit can also use as primer pair for human APC s2 / as2: S2: GAATCAGCTCCATCCAAGT as2: TTTCTGCTATTTGCAGGGT.
  • the small number of work stages advantageously makes it possible to automate or miniaturize the method if necessary.
  • the method according to the invention further combines the advantages of simple sample collection and the possibility of diagnosing developing colon cancer or colon cancer precursor cells at an early stage. Since it is a non-invasive procedure, in which, for example, the delivery of a stool sample or a tissue sample, if necessary, is sufficient, the procedure has a high level of acceptance among the test subjects, who can be, for example, humans or animals. Therefore, the procedure can be used for routine tests, but also for preventive examinations.
  • the method according to the invention is not limited to a few defined point mutations, but rather with the method it is possible to detect previously unknown mutations within the regions in which mutations occur frequently in the genes examined.
  • the combination of the detection by means of defined primers enables a non-invasive early detection of colon cancer and / or colon cancer precursor cells.
  • amplification reactions are carried out in four genes with selected markers.
  • the individual amplification reactions as well as the individual five steps of the method interact to achieve the overall technical success of the non-invasive early detection of colon cancer and / or colon cancer precursor cells in the examined sample.
  • the technical success of early cancer detection is possible due to the functional dependence of the individual process steps and the amplification reactions. In the sense of a combination invention, it is not necessary that the individual process steps are mutually dependent or that they are carried out simultaneously.
  • the tumor markers are combined in the method in such a way that each patient sample is analyzed with a total of four markers, namely with two markers mutated alternatively in cancer from at least two different biochemical signaling pathways associated with cell proliferation or tumor growth.
  • the genes examined are markers. If necessary, several sections can be analyzed from one marker gene.
  • the signal paths that are covered with the markers integrated in the method are the wnt signal path and the MAPK signal path.
  • Components of the method are the markers APC on the one hand and ⁇ -catenin on the other hand from the wnt signal path, together with the markers k-ras on the one hand and B-raf on the other hand from the MAPK signal path.
  • colon carcinomas can be diagnosed safely. This combination can even achieve sensitivity comparable to colonoscopy in non-invasive colon carcinoma diagnosis.
  • these are advantageously markers that mutate at an early stage during colon carcinogenesis.
  • Mutations in genes which relate to two signal paths are advantageously detected by the teaching according to the invention: In order that each cell of the human body can react to external signals or to signals from other cells, these signals have to be recognized, processed and forwarded. This happens via intracellular signaling pathways.
  • a signal path begins with the arrival of the signal, for example a hormone or a neurotransmitter on the cell surface.
  • the signaling molecule binds to the cell's own proteins, the receptors, which are activated thereby and initiate a cascade inside the cell, in the course of which further proteins are activated. It will triggering signal amplified at the same time.
  • At the end of the cascade or signal path there are either enzymes that have an important function in metabolism or transcription factors that regulate gene expression.
  • ß-Catenin then starts the gene expression of target genes in the complex with the transcription factor TCF with the consequence of an uncontrolled cell proliferation.
  • the ⁇ -catenin gene can be constitutively activated by mutation.
  • APC or ⁇ -catenin is mutated in tumor cells, not both at the same time. This makes sense because these two alternative mutations have the same effect because the gene products in question occur in the same intracellular signaling pathway, the wnt signaling pathway.
  • the situation with the MAPK signal path is comparable.
  • the components k-ras and B-raf are also mutated alternatively in colorectal carcinoma and are therefore constitutively activated.
  • the consequence is uncontrolled cell division and thus tumor development.
  • composition of the range of tumor markers which is used in the test method according to the invention, and which takes into account the signal pathways important for tumor development in the cell by two mutually exclusive mutations as markers, differs from other previous tests which simply use as many markers as possible. that often mutate in colorectal cancer, integrate into a test.
  • Previously unknown mutations can advantageously also be detected in the selected sequence sections.
  • the method according to the invention can be carried out, for example, in such a way that a pea-sized portion of the stool removed is removed from human stool and is subsequently snap-frozen in liquid nitrogen.
  • human tumor tissue or its precursors such as aberrant crypts, adenomas or adenocarcinomas, which in the biopsy z. B. removed during the course of colonoscopy or during an operation can be used.
  • the stool sample or the tissue sample can then be homogenized, this being possible, for example, in buffer systems using the kits known to the person skilled in the art. Then they are homogenized in this way Centrifuged samples so that DNA can be isolated from the supernatant of the sample homogenate.
  • the DNA isolating the DNA.
  • This can be done, for example, in such a way that the target genes from the total DNA by hybridizing sequence-specific biotinylated oligonucleotides with the target genes APC, K-ras, ⁇ -catenin and B-raf and the coupling of the biotin residue to streptavidin and further separation by means of magnetic particles kits known to those skilled in the art can be obtained.
  • the oligonucleotide sequences are to be selected such that they hybridize with regions which are delimited by the primers used below or are located close to the amplified section.
  • the primers are positioned on both sides of the MCR located in exon 3 and for K-ras the primers are on both sides known MCR positioned in exon 1. All primers are selected so that they have PCR products with a size of 180 to 350 bp. The following primer sequences are used, each in the 5 '-> 3' direction:
  • the PCR products obtained with the primers can be examined using an agarose gel.
  • the PCR products can also be cleaned in an agarose gel using a kit known to the person skilled in the art, without checking the PCR products.
  • electrophoresis technology preferably single-stranded conformation polymorphism analysis (SSCP).
  • the conformation of the individual strands of the samples can be detected in comparison with the wild type standard. It may make sense to carry out a DNA extraction from the SSCP gel and a sequencing from the DNA extracted in this way or from the corresponding PCR products in order to specifically detect certain mutations. Other methods of mutation analysis are DHPLC and DNA chip technology.
  • the detection of mutations in this way in which the APC, K-ras, ⁇ -catenin and B-raf genes are used as markers, is advantageous because all types of spontaneous colon carcinomas can be detected at a particularly early stage in this way, since there is a high percentage of K-ras or ß-catenin mutated in the tumor precursors, the aberrant crypts and adenomas, and either APC or ß-catenin is mutated in the adenomas and early adenocarcinomas.
  • the detection of mutations in selected sections of the genes for APC, Kras, ⁇ -catenin and B-raf takes place by means of a DNA chip, with the DNA chip contains probes for APC, K-ras, ⁇ -catenin and B-ras from those regions of the genes mentioned which are flanked by the primer sequences mentioned.
  • flanking by the primer sequences it is meant that the conventional PCR primers are not necessarily used in DNA chip technology, which amplify a DNA strand of the length which is determined by the position of the two primers (sense and antisense). is determined. In the case of conventional PCR, the primers limit or flank the PCR product.
  • oligonucleotides are often used as probes in DNA chips, which hybridize with the sample DNA.
  • the probe can then e.g. B. contain a defined point mutation.
  • the above-mentioned primers can be contained as probes in the chip, but also other probes that hybridize with other sections of the products from the PCR reactions with the above-mentioned primers.
  • the invention also relates to primer sequences selected from the group comprising:
  • sequences s CTGGTGGAGTATTTGATAGTG are used for K-ras
  • sequences S CTGATTTGATGGAGTTGGAC are used for ß-catenin and the sequences
  • the primers can advantageously be used for the diagnosis of colon cancer and / or colon cancer precursor cells.
  • primer sequences are used which are sufficiently homologous to the regions indicated below on the genes for APC, ⁇ -catenin, k-ras and B-raf in order to form an amplification product by the polymerase chain reaction:
  • the invention also relates to a kit comprising the primers and the use of the kit for the non-invasive early detection of colon cancer and / or colorectal cancer precursor cells.
  • the kit may include information for combining the contents of the kit, if necessary.
  • the kit can also include other chemical reagents required for the detection of colon cancer.
  • the kit may further comprise auxiliaries or carriers, enzymes, marker substances, but also storage containers, slides, optical instruments or other device parts which enable or support a biological, chemical and or physical determination of colon cancer or colon cancer precursor cells.
  • TE buffer eg 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA
  • the target genes from total DNA by hybridizing sequence-specific biotinylated oligonucleotides with the target genes APC, K-ras, ß-catenin and B-raf, coupling the biotin residue to streptavidin and separation via magnetic particles using commercial kits.
  • the oligonucleotide sequences are to be selected such that they hybridize with regions which are limited by the PCR primers used below or close to the amplified section or b. the neoplastic "long" DNA by excluding fragmented DNA with a size of ⁇ 200 bp, which is characteristic of DNA from apoptical cells
  • APC primer pairs enable amplification of partially overlapping sequences in exon 15 within the region of mutations which occur frequently (mutational cluster region; MCR ), ß-catenin: primer on both sides of the MCR located in exon 3, K-ras: primer on both sides of the frequently mutated codons 12 and 13 located in exon 1, B-raf: primer localized in exon 15, codons 593, 599 and 600 flanking. All primers are selected so that the PCR products have a size of 180 to 350 bp.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen, Primer, mit denen Mutationsanalysen in ausgewählten Regionen der Gene APC, K-ras, β-Catenin und B-raf durchgeführt werden können, sowie einen Kit, der diese Primer umfasst und außerdem die Verwendung der Primer und des Kits zur Mutationsanalyse, insbesondere zur Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen.

Description

Verfahren zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Darmkrebsvorläuferzellen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebs- vorläuferzellen, sie betrifft weiterhin Primer, mit denen Mutationsanalysen in ausgewählten Regionen der Gene APC, K-ras, ß- Catenin und B-raf in Kombination durchgeführt werden können, sowie einen Kit, der diese Primer umfasst und außerdem die Verwendung der Primer und des Kits zur Mutationsanalyse, insbesondere zur Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder
Dickdarmkrebsvorläuferzellen.
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, um Dickdarmkrebs zu detektieren. Die gängigsten in der Medizin angewandten Verfahren zur Diagnose von Dickdarmkrebs sind der Haemokkulttest , die Sigmoidoskopie und die Kolonoskopie .
Der Haemokkulttest, der auf dem Nachweis von Blut im Stuhl beruht, ist aufgrund vielfältiger möglicher Ursachen von Darmblutungen nicht ausreichend spezifisch für die Diagnose von Dickdarmkrebs. Außerdem ist der Blutverlust aus kleinen kolorektalen Tumoren (< 2 cm) mit 1 bis 2 ml pro Tag so gering, dass er mit diesem Test nicht immer erfasst wird. Die Sigmoidoskopie, eine Spiegelung des Enddarms, kann Tumore des proximalen Kolons nicht erkennen. Geschätzt wird, dass 25 bis 34 % der Kolonkarzinome mit dieser Methode übersehen werden. Die Kolonoskopie, bei der der gesamte Dickdarm gespiegelt wird, erkennt etwa 80 % der Tumore einer Größe von > 1 cm, ist jedoch ein invasives Verfahren und aufgrund der daraus resultierenden geringen Akzeptanz bei den Patienten als regelmäßige Vorsorgeuntersuchung kaum geeignet. Derzeit arbeiten daher mehrere Arbeitsgruppen an der Entwicklung von Verfahren zur Diagnose von Darmkrebs in Stuhlproben.
Der Nachweis des carcinoembryonalen Antigens (CEA) in Fäces (US Pat. No. 005741650 A) ist kein zuverlässiger Test zur Vorhersage eines beginnenden Dickdarmtumors, sondern er ist vielmehr als Indikator für das Auftreten von Rezidiven geeignet. Ahlquist und Shuber konnten mit der auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierenden Methode eine Übereinstimmung von K-ras-Mutationen in Stuhl- und Gewebeproben von Patienten mit Krebs oder großen Adenomen nachweisen. K-ras-Mutationen treten allerdings in weniger als 50 % aller Kσlontumore auf und sind auch in nicht neoplastischem Gewebe zu finden, weshalb dieser Marker allein nicht ausreichend für ein Nachweisverfahren zur Früherkennung von Darmkrebs ist. Die gleiche Arbeitsgruppe hat einen Test entwickelt, der 15 definierte Punktmutationen in den Genen für K- ras, APC, p53 sowie Bat-26 detektiert und „long" DNA in Stuhlproben nachweist. Dieser Test soll derzeit präklinischen Studien unterzogen werden. Aufgrund der großen Anzahl der in diesem Test untersuchten Mutationsstellen sind die zu erwartende Sensitivität und Spezifität sehr hoch, jedoch handelt es sich hierbei auch um einen extrem kostenintensiven Test.
Bisherige Tests zur Bestimmung von Darmkrebs-auslösenden Mutationen erlauben keinen sicheren Nachweis nur mittels nicht- invasiv gewonnener Proben, insbesondere Stuhlproben. Im Stand der Technik sind Primersequenzen offenbart, die einzelnen Mutationsnachweisen dienen. Sofern diese in Kombination im Stuhl eingesetzt werden, ist aufgrund von unerwünschten Interaktionen mit dem Stuhl und untereinander kein sicherer Nachweis von mehreren Mutationen möglich. Vor allem die zahlreichen Bestandteile der Darmflora „maskieren" die Primer so, dass diese nicht mehr an ihr Target binden. Bekannte Verfahren verwenden daher bei einer Kombination von Primern isolierte Zellen aus dem Stuhl und nicht diesen direkt. Da Stuhlproben weiterhin ildtyp- und mutierte DNA umfassen, ist eine direkte Sequenzierung von PCR- Produkten nicht möglich. Im Stand der Technik ist auch ein Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen beschrieben, bei dem die Detektion eines antiapoptotischen Mitglieds der Bcl-2 Familie in Kombination mit einem Mitglied der Raf Familie verwendet wird. Hierbei müssen jedoch beide Marker in der gleichen Probe vorhanden sein. Proben sind hierbei transgene nicht menschliche Säugetiere oder isolierte menschliche oder nicht-menschliche Zellen. Eine Anwendung dieser Testsysteme bei dem Probenmaterial humaner Stuhl ist nicht möglich.
Weiterhin ist im Stand der Technik die Verbindung von B-raf Genen und ihre Verwendung zum Nachweis von Tumoren offenbart. Hierbei werden die Mutanten aus einem humanen Primärtumor isoliert, der durch einen invasiven Eingriff entnommen werden muss. Aus diesem wird dann ein Polypeptid isoliert. Gesundes Kontrollgewebe des Patienten muss ebenfalls entnommen werden. Mit diesem Verfahren können frühe Mutationen nicht nachgewiesen werden. Auch mit diesem Verfahren ist eine Untersuchung von Stuhlproben nicht möglich, sondern nur an detektierten und isolierten vollständigen Tumorzellen, aus denen bevorzugt Polypeptide isoliert werden. Weiterhin beschränkt sich dieses Verfahren auf definierte Punktmutationen, so dass innerhalb eines eingegrenzten Sequenzbereiches Mutationen wie Insertionen, Deletionen oder andere nicht erfasst werden können. Mögliche Kombinationen mit anderen Genen werden nicht offenbart oder nahegelegt.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, mit denen zirkulierende Krebszellen in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden können. Alle diese Verfahren sind ohne Isolierung und Detektion von vollständigen Tumorzellen nicht als Diagnoseverfahren einsetzbar.
Beschrieben sind auch Screeningverfahren für Therapeutika, die den ß-Catenin-Signalweg modifizieren. Hierzu werden Sonden benutzt, die sogenannten Cadherin-„Perturbagen" . Die offenbarten Sequenzen hybridisieren mit Cadherin, einem ß-Catenin-bindenden Protein, nicht jedoch mit ß-Catenin selbst. Im Stand der Technik sind weiterhin Verfahren bekannt, bei denen die DNA-Integrität und die DNA-Menge für ausgewählte Gene, wie z. B. K-ras und APC bestimmt und in Relation zu Standards bzw. Schwellenwerten gesetzt werden. Derartige Verfahren offenbaren jedoch keine Mutationsanalyse und es werden auch keine Primersequenzen offenbart, die besonders vorteilhaft sind. Diesen Verfahren ist gemeinsam, dass keine Mutationsanalyse, beispielsweise mit einem automatisierbaren, elektrophoretischen Verfahren, wie z. B. SSCP, durchgeführt wird.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen mit Azoxymethan behandelten Ratten mittels asermikrodissektion Gewebe aus intramukosalen Läsionen oder Kolon-Tumoren isoliert werden. Aus diesen Läsionen und Tumoren wird DNA isoliert, Teile des Exons 3 des ß-Catenin-Gens und des Exons 1 des K-ras-Gens amplifiziert und mittels einer Mutationsanalyse direkt sequenziert. Derartige Verfahren können jedoch nicht bei Stuhlproben angewendet werden, da Stuhlproben ein Gemisch aus Wildtyp- und mutierter DNA enthalten. Somit ist eine direkte Sequenzierung der PCR-Produkte bei diesem Verfahren nicht möglich.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Dickdarmkrebs bzw. Dickdarmkrebsvorläuferzellen einfach, sicher und effektiv in einer Stuhlprobe detektiert werden können, wobei die Nachteile des Standes der Technik vermieden werden, insbesondere die nicht erwünschte Interaktion der Primer untereinander und mit der Stuhlprobe.
Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Darmkrebsvorläuferzellen durch Mutationsanalyse der Gene für APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst : Entnahme einer Stuhl- und/oder Gewebeprobe, - Homogenisieren der Probe, Gewinnung von DNA aus der Probe, Durchführung einer Amplifizierungsreaktion, bevorzugt einer PCR-Reaktion, in den Genen für APC, K-ras, ß-Catenin und B- raf , wobei für APC die Primer Sl TTGCAGTTATGGTCAATACCC asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG s2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC 53 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC 54 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG 55 TTCCAGATGCTGATACTTTA as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC, für K-ras die Primer s CTGGTGGAGTATTTGATAGTG as TCTATTGTTGGATCATATTCG und für ß-Catenin die Primer s CTGATTTGATGGAGTTGGAC as CTTGAGTGAAGGACTGAGAA und/oder für B-raf die Primer S TGTATCACCATCTCCATATC as GCATTCTGATGACTTCTGGT verwendet werden, wobei Amplifikationsprodukte entstehen und Durchführung einer Mutationsanalyse in den Amplifikations- produkten .
Alternativ können in dem Verfahren oder in einem Kit als Primerpaar für humanes APC s2/as2 auch eingesetzt werden: S2 : GAATCAGCTCCATCCAAGT as2: TTTCTGCTATTTGCAGGGT .
Überraschenderweise ist es mit diesem Kombinationsverfahren möglich, nichtinvasiv, billig und einfach und mit einer Ersparnis an Zeit, Material und Arbeitsstufen sowie mit einer Ersparnis an Kosten, schwer zu beschaffender Feinchemikalien sowie mit einer erhöhten Zuverlässigkeit und größeren Effektivität Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläufer-zellen sehr früh zu erkennen. Die erfindungsgemäße Kombination der Ver ahrensschritte vermehrt weiterhin die technischen Möglichkeiten der Krebsdiagnostik und stellt somit eine weitere Möglichkeit zur Früherkennung von Dickdarmkrebs zur Verfügung.
Die geringe Anzahl an Arbeitsstufen ermöglicht es vorteilhafterweise, das Verfahren gegebenenfalls zu automatisieren oder zu miniaturisieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren vereint weiterhin die Vorteile der einfachen Probengewinnung und die Möglichkeit, entstehenden Dickdarmkrebs bzw. Dickdarmkrebsvorläuferzellen in einem frühen Stadium zu diagnostizieren. Da es sich um ein nichtinvasives Verfahren handelt, bei dem beispielsweise die Abgabe einer Stuhlprobe oder gegebenenfalls einer Gewebeprobe ausreichend ist, erreicht das Verfahren eine hohe Akzeptanz bei den Probanden, bei denen es sich beispielweise um Menschen oder Tiere handeln kann. Daher kann das Verfahren für Routinetests, aber auch für Vorsorgeuntersuchungen Anwendung finden. Aufgrund der verwendeten Kombination der drei untersuchten Gene, APC, K-ras und ß-Catenin und/oder B-raf, die so mit frühen Mutationsergebnissen während der Kolonkanzerogenese in Verbindung gebracht werden, kann eine höhere Sensitivität und Spezifität erreicht werden als bei den bekannten Tests, die sich insbesondere nur auf die Mutation eines Gens beschränken. Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf einige wenige definierte Punktmutationen festgelegt, sondern mit dem Verfahren ist es möglich, innerhalb der Bereiche, in den bei den untersuchten Genen gehäuft Mutationen auftreten, gegebenenfalls auch bisher unbekannte Mutationen zu erfassen.
Da unterschiedliche Arten von Dickdarmkrebs unterschiedliche Wege bei der Kanzerogenese beschreiten, bestand eine Schwierigkeit für die Entwicklung eines diagnostischen Kits darin, geeignete Marker zu kombinieren, die möglichst umfassend alle Arten bzw. viele Arten von Kolonkarzinomen erfassen, wie beispielsweise auch spontane Kolonkarzinome mit und ohne Mikrosatelliten-Instabilität, die durch unterschiedlichste Stimuli ausgelöst werden können, wie zum Beispiel Ernährung, häufiger Alkohol- oder Tabakkonsum, Expositionen gegenüber physikalischen oder chemischen Einflüssen usw.
Die gewählte Kombination der vier genannten Gene in Kombination mit den beanspruchten Primern ermöglicht eine einfache, sichere und effektive Diagnose von Dickdarmkrebs.
Überraschend konnte also gezeigt werden, dass durch die Kombination des Nachweises mittels definiert ausgewählter Primer eine nicht-invasive Früherekennung von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen möglich ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem fünf Verfahrensschritte zusammenwirken, werden Amplifizierungsreaktionen in vier Genen mit ausgewählten Markern durchgeführt. Die einzelnen Amplifizierungsreaktionen wie auch die einzelnen fünf Schritte des Verfahrens wirken zur Erreichung des technischen Gesamterfolges der nicht-invasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder von Dickdarmkrebsvorläuferzellen in der untersuchten Probe zusammen. Durch die funktioneile Abhängigkeit der einzelnen Verfahrensschritte und der Amplifizierungsreaktionen ist der technische Gesamterfolg der Krebsfruherkennung möglich. Hierbei ist es im Sinne einer Kombinationserfindung nicht erforderlich, dass die einzelnen Verfahrensschritte sich in gegenseitiger Abhängigkeit befinden oder dass diese gleichzeitig getätigt werden. Denn die einzelnen Verfahrensschritte, insbesondere die einzelnen Amplifizierungsreaktionen bringen kein isoliertes Einzelergebnis hervor, sondern die einzelnen Verfahrens-schritte werden durch den Kombinationsgedanken der anmeldungsgemäßen Lehre zu dem einheitlichen Ziel der sicheren nicht-invasiven Früherkennung in einer Stuhlprobe zusammengefasst . Eine solche sichere technische Aussage wäre durch die einzelnen nicht- kombinierten Verfahrensschritte nicht möglich. Die Einzelbestimmung der einzelnen Mutationsanalysen lässt keine sichere Aussage in einer Stuhlprobe darüber zu, ob sich in dieser Dickdarmkrebs- oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen im Frühstadium befinden. Die Ergebnisse der einzelnen Verfahrensschritte und insbesondere der einzelnen Amplifizierungsreaktionen können beispielsweise mit Hilfe eines Algorithmus ausgewertet und kombiniert werden, so dass Aussagen zur nicht-invasiven Früherkennung möglich sind. Nur durch diese Kombination ist es möglich, eine sichere und schnelle Aussage zu Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen in einer Probe, insbesondere in einer Stuhlprobe zu treffen.
Die Tumormarker sind in dem Verfahren so kombiniert, dass jede Patientenprobe mit insgesamt vier Markern analysiert wird, nämlich mit jeweils zwei bei einer Krebserkrankung alternativ mutierten Markern aus mindestens zwei verschiedenen - mit Zellproliferation bzw. Tumorwachstum assoziierten - biochemischen Signalwegen. Marker sind hierbei die untersuchten Gene. Aus einem Markergen können so gegebenenfalls mehrere Abschnitte analysiert werden. Die Signalwege, die mit den in dem Verfahren integrierten Markern abgedeckt werden, sind der wnt-Signalweg und der MAPK-Signalweg. Bestandteile des Verfahrens sind aus dem wnt-Signalweg die Marker APC einerseits und ß-Catenin andererseits, gemeinsam mit den Markern k-ras einerseits und B-raf andererseits aus dem MAPK- Signalweg. Mit der Kombination der beiden Marker aus dem wnt- Signalweg zusammen mit den beiden Markern aus dem MAPK-Signalweg können Kolonkarzinome sicher diagnostiziert werden. Mit dieser Kombination kann sogar eine der Koloskopie vergleichbare Sensitivität in der nichtinvasiven Kolonkarzinomdiagnostik erzielt werden. Darüber hinaus sind dies vorteilhafterweise Marker, die zu einem frühen Zeitpunkt während der Kolonkanzerogenese mutieren.
Mit Vorteil werden durch die erfindungsgemäße Lehre Mutationen in Genen, die zwei Signalwege betreffen, detektiert: Damit jede Zelle des menschlichen Körpers auf äußere Signale bzw. auf Signale von anderen Zellen reagieren kann, müssen diese Signale erkannt, verarbeitet und weitergeleitet werden. Dies geschieht über intrazelluläre Signalwege. Ein Signalweg beginnt mit dem Eintreffen des Signals, beispielsweise eines Hormons oder eines Neurotransmitters an der Zelloberfläche. Das Signalmolekül bindet an zelleigene Proteine, die Rezeptoren, die dadurch aktiviert werden und im Zellinneren eine Kaskade in Gang setzen, in deren Verlauf weitere Proteine aktiviert werden. Dabei wird das auslösende Signal zugleich verstärkt. Am Ende der Kaskade bzw. des Signalwegs stehen entweder Enzyme, die eine wichtige Funktion im Stoffwechsel haben oder Transkriptionsfaktoren, die die Genexpression regulieren. Diese Signalwege regulieren zum Beispiel den Stoffwechsel, das Wachstum und die Zellteilung. Es ist das Verdienst der Erfinder, erkannt zu haben, dass durch die Analyse des wnt-Signalweges, der die Zelladhäsion und Zellwanderung reguliert, und des MAPK-Signalweges, der die Zellteilung und Zellentwicklung steuert, die Tumorwahrscheinlichkeit nichtinvasiv sicher bestimmt werden kann. Durch Mutationen in den beteiligten Genen kommt es zu Fehlregulationen dieser intrazellulären Signalwege, beispielsweise zu einem vollständigen Funktionsverlust einer Komponente eines Signalweges oder auch zu einer permanenten Aktivierung und somit zur Tumorentstehung. Es ist bekannt, daß beim kolorektalen Karzinom häufig das APC-Gen mutiert vorliegt. Das Genprodukt ist dann ein verkürztes Protein, daß die Menge des in der Zelle vorhandenen ß-Catenin-Proteins nicht mehr regulieren kann. ß-Catenin setzt daraufhin im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor TCF die Genexpression von Zielgenen mit der Konsequenz einer unkontrollierten Zeilproliferation in Gang. Alternativ kann das ß-Catenin-Gen durch Mutation konstitutiv aktiviert sein. Jedoch ist in Tumorzellen immer nur entweder APC oder ß-Catenin mutiert, nicht beide gleichzeitig. Das ist sinnvoll, da diese beiden alternativen Mutationen den gleichen Effekt haben, weil die betreffenden Genprodukte im gleichen intrazellulären Signalweg, dem wnt-Signalweg vorkommen. Vergleichbar ist die Situation beim MAPK-Signalweg. Die Komponenten k-ras und B-raf sind beim kolorektalen Karzinom ebenfalls alternativ mutiert und dadurch konstitutiv aktiviert. Auch hier ist die Folge die unkontrollierte Zellteilung und somit die Tumorentstehung.
Mit der Kombination der alternativ mutierten Marker APC, ß- Catenin, k-ras und B-raf werden zwei Signalwege, die zur Tumorentstehung beitragen, diagnostisch abgedeckt und mit dieser Markerkombination können Tumore mit einer sehr hohen Sensitivität und zu einem sehr frühen Zeitpunkt nichtinvasiv nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Kombination der beiden Signalwege bzw. der sich gegenseitig ausschließenden Genmutationen aus den beiden genannten Signalwegen in einem Test ist es mit Vorteil möglich, dass die meisten Tumore sicher erfasst werden können, da während ihrer Entstehung mindestens einer der beiden o. g. Signalwege betroffen ist mit der Folge einer gestörten Zell-Zell-Adhäsion oder einer vermehrten Transkription von Genen, die das Zellwachstum oder die Zellteilung in Gang setzen. Diese Zusammensetzung der Palette an Tumormarkern, die in dem erfindungsgemäßen Testverfahren verwendet wird, und die die für die Tumorentstehung wichtigen Signalwege in der Zelle durch jeweils zwei sich gegenseitig ausschließende Mutationen als Marker berücksichtigt, unterscheidet sich von anderen bisherigen Tests, die einfach möglichst viele Marker, die beim kolorektalen Karzinom häufig mutieren, in einen Test integrieren.
Selbstverständlich ist es möglich, weitere Paare von Genmutationen, die sich gegenseitig ausschließen bzw. die in kolorektalen Karzinomen alternativ auftreten und die in weiteren gemeinsamen Signalwegen vorkommen, als Marker in das Verfahren oder einen Test, mit dem dies durchgeführt werden kann, zu integrieren.
Mit Vorteil können auch bisher unbekannte Mutationen in den gewählten Sequenzabschnitten detektiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise so erfolgen, dass aus humanem Stuhl eine erbsengroße Portion des abgesetzten Stuhls entnommen und folgend in flüssigem Stickstoff schockgefroren wird. Weiterhin ist es selbstverständlich auch möglich, dass humanes Tumorgewebe oder deren Vorläufer wie beispielsweise aberrante Crypten, Adenome bzw. Adenokarzinome, die in der Biopsie z. B. im Verlauf der Koloskopie oder bei einer OP entnommen wurden, verwendet werden. Anschließend kann die Stuhlprobe bzw. die Gewebeprobe homogenisiert werden, wobei dies beispielsweise in Puffersystemen mit den dem Fachmann bekannten Kits erfolgen kann. Anschließend werden die so homogenisierten Proben zentrifugiert, so dass aus dem Überstand des Probenhomogenats DNA isoliert werden kann. Gegebenenfalls ist es möglich, vor diesem Schritt der Isolierung der DNA eine Anreicherung derselben vorzunehmen. Dies kann beispielsweise so erfolgen, dass die Zielgene aus der Gesamt-DNA durch Hybridisierung sequenzspezifischer biotinylierter Oligonukleotide mit den Zielgenen APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf und der Kopplung des Biotinrestes an Streptavidin und weiterhin der Separation über magnetische Partikel mittels dem Fachmann bekannter Kits gewonnen werden. Hierbei sind die Oligonukleotidsequenzen so zu wählen, dass sie mit Bereichen hybridisieren, die von den nachfolgend verwendeten Primern begrenzt werden oder dicht neben dem amplifizierten Abschnitt liegen.
Weiterhin ist es bevorzugt möglich, eine Anreicherung vorzunehmen durch den Ausschluss von fragmentierter DNA mit einer Größe von < 200 bp, die charakteristisch für DNA aus apoptotischen Zellen ist. Hierdurch wird neoplastische „long"-DNA separiert. Anschließend kann beispielsweise eine andere Amplifikationsreaktion mit sequenzspezifischen Primern gegen ausgewählte Bereiche in den Genen APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf durchgeführt werden. Hierbei sind für APC die Primerpaare so gewählt, dass sie eine Amplifizierung überlappender Frequenzen in Exon 15 innerhalb des bekannten Bereichs gehäuft auftretender Mutationen (mutational cluster region; MCR) ermöglichen. Für ß- Catenin sind die Primer beiderseits der in Exon 3 lokalisierten MCR positioniert und für K-ras sind die Primer beiderseits der bekannten in Exon 1 lokalisierten, MCR positioniert. Alle Primer werden so gewählt, dass sie PCR-Produkte einer Größe von 180 bis 350 bp haben. Eingesetzt werden hierbei die folgenden Primersequenzen; jeweils in 5'—>3'-Richtung:
K-ras s CTGGTGGAGTATTTGATAGTG as TCTATTGTTGGATCATATTCG
ß-Catenin
S CTGATTTGATGGAGTTGGAC as CTTGAGTGAAGGACTGAGAA
APC
Sl TTGCAGTTATGGTCAATACCC asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG s2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC
S3 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC S4 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG s5 TTCCAGATGCTGATACTTTA as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC oder alternativ: S2 GAATCAGCTCCATCCAAGT as2 TTTCTGCTATTTGCAGGGT
B-raf
S TGTATCACCATCTCCATATC as GCATTCTGATGACTTCTGGT
Im weiteren Verfahrensverlauf ist es bevorzugt möglich, dass die mit den Primern gewonnenen PCR-Produkte mittels eines Agarosegels untersucht werden. Die Reinigung der PCR-Produkte kann aber auch ohne die Kontrolle der PCR-Produkte in einem Agarosegel mit einem dem Fachmann bekannten Kit vorgenommen werden. Für die Mutationsanalyse der PCR-Produkte stehen dem Fachmann mehrere bekannte Verfahren zur Verfügung, wie beispielsweise die Elektrophoresetechnik, bevorzugt Single-Stranded-Conformation Polymorphism Analysis (SSCP) .
Mit Hilfe der SSCP-Analyse ist es bevorzugt möglich, Polymorphismen und Mutationen in DNA-Einzelsträngen schnell und einfach nachzuweisen. Dabei macht man sich zu Nutze, dass die Einzelstränge unter nicht-denaturierenden Gelbedingungen nicht linear, sondern durch intramolekulare Basenpaarungen im gefalteten Zustand vorliegen. Bereits ein Basenaustausch pro Strang reicht dabei für ein unterschiedliches Laufverhalten aus. Die Spezifität soll bei Fragmenten mit einer Länge vom 200 bp annähernd 100 % betragen. Laufzeit, Leistung, Vernetzung und Acrylamidkonzentration können für verschiedene DNA-Abschnitte jeweils einzeln durch Routineversuche optimiert werden. Um die Auftrennung der Einzelstränge zu verbessern, kann Glycerin beigemischt werden.
Hierbei kann eine Detektion der Konformation der Einzelstränge der Proben im Vergleich zum Wildtypstandard vorgenommen werden. Gegebenenfalls kann es sinnvoll sein, eine DNA-Extraktion aus dem SSCP-Gel und eine Sequenzierung aus der so extrahierten DNA oder der korrespondierenden PCR-Produkte vorzunehmen, um bestimmte Mutationen spezifisch zu detektieren. Weitere Methoden der Mutationsanalyse sind DHPLC und die DNA-Chip-Technologie .
Der so vorgenommene Nachweis von Mutationen, bei denen als Marker die Gene APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf eingesetzt werden, ist vorteilhaft, weil auf diese Weise alle Typen von spontanen Kolonkarzinomen zu einem besonders frühen Zeitpunkt erfasst werden können, da in den Tumorvorstufen, den aberranten Crypten und Adenomen, zu einem hohen Prozentsatz K-ras oder ß-Catenin mutiert vorliegt, sowie in den Adenomen und frühen Adenokarzinomen entweder APC oder ß-Catenin mutiert ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich daher nicht nur einige genau bekannte Mutationen erfassen, sondern es werden innerhalb derjenigen Genabschnitte, für die bekannt ist, dass dort besonders häufig Mutationen auftreten, alle gegebenenfalls auch unbekannte Punktmutationen detektiert. Dieses Verfahren ist beispielsweise den immunologischen Nachweisen eines aufgrund einer Mutation trunkierten Proteins überlegen. Vor allem durch die Paarung K-ras/B-raf innerhalb der erfindungsgemäßen Kombination ist eine besonders sichere Diagnose möglich, da mit diesen Markern der MAPK-Signalweg diagnostisch abgedeckt wird.
Selbstverständlich ist es insbesondere möglich, dass die Detektion von Mutationen in ausgewählten Abschnitten der Gene für APC, K- ras, ß-Catenin und B-raf mittels eines DNA-Chips erfolgt, wobei der DNA-Chip Sonden für APC, K-ras, ß-Catenin und B-ras aus denjenigen Bereichen der genannten Gene enthält, die durch die genannten Primersequenzen flankiert werden. Mit durch die Primersequenzen begrenzen oder flankieren ist gemeint, dass bei der DNA-Chip-Technologie nicht notwendigerweise die konventionellen PCR-Primer eingesetzt werden, die einen DNA-Strang von der Länge amplifizieren, die durch die Lage der beiden Primer (sense und antisense) bestimmt wird. In dem Fall der konventionellen PCR begrenzen oder flankieren die Primer das PCR- Produkt . Im Gegensatz dazu werden bei DNA-Chips oft einzelne Oligonukleotide als Sonden verwendet, die mit der Proben-DNA hybridisieren. Die Sonde kann dann z. B. eine definierte Punktmutation enthalten. Einerseits können die genannten Primer als Sonden im Chip enthalten sein, aber auch weitere Sonden, die mit anderen Abschnitten der Produkte aus den PCR-Reaktionen mit den genannten Primern hybridisieren.
Die Erfindung betrifft auch Primersequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
die Primer
SEQ ID-Nr. 1 TTGCAGTTATGGTCAATACCC,
SEQ ID-Nr. 2 GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG,
SEQ ID-Nr. 3 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG,
SEQ ID-Nr. 4 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC,
SEQ ID-Nr. 5 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG,
SEQ ID-Nr. 6 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC,
SEQ ID-Nr. 7 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA,
SEQ ID-Nr. 8 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG,
SEQ ID-Nr. 9 TTCCAGATGCTGATACTTTA,
SEQ ID-Nr. 10 CTGAATCATCTAATAGGTCC,
SEQ ID-Nr. 11 CTGGTGGAGTATTTGATAGTG,
SEQ ID-Nr. 12 TCTATTGTTGGATCATATTCG,
SEQ ID-Nr. 13 CTGATTTGATGGAGTTGGAC,
SEQ ID-Nr. 14 CTTGAGTGAAGGACTGAGAA,
SEQ ID-Nr. 15 GAATCAGCTCCATCCAAGT,
SEQ ID-Nr. 16 TTTCTGCTATTTGCAGGGT,
SEQ ID-Nr. 17 TGTATCACCATCTCCATATC, SEQ ID-Nr. 18 GCATTCTGATGACTTCTGGT,
wobei die Sequenzen s CTGGTGGAGTATTTGATAGTG, as TCTATTGTTGGATCATATTCG, für K-ras verwendet werden, die Sequenzen S CTGATTTGATGGAGTTGGAC, as CTTGAGTGAAGGACTGAGAA, für ß-Catenin verwendet werden und die Sequenzen
51 TTGCAGTTATGGTCAATACCC, asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG,
52 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG, as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC, s3 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG, as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC,
54 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA, as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG,
55 TTCCAGATGCTGATACTTTA, as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC, oder alternativ S2 GAATCAGCTCCATCCAAGT as2 TTTCTGCTATTTGCAGGGT für APC verwendet werden und die Sequenzen s TGTATCACCATCTCCATATC as GCATTCTGATGACTTCTGGT für B-raf verwendet werden.
Die Primer können mit Vorteil zur Diagnose von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmkrebsvorläuferzellen eingesetzt werden.
In dem Verfahren werden Primersequenzen verwendet, die zu den nachfolgend angegebenen Bereichen auf den Genen für APC, ß-Catenin, k-ras und B-raf ausreichend homolog sind, um durch die Polymerasekettenreaktion ein Amplifizierungsprodukt zu bilden:
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der die Primer umfasst, sowie die Verwendung des Kits zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Darmkrebsvorläuferzellen. Der Kit kann gegebenenfalls Informationen zum Kombinieren der Inhalte des Kits umfassen. Der Kit kann auch weitere chemische Reagenzien umfassen, die zur Detektion von Dickdarmkrebs erforderlich sind. Der Kit kann weiterhin Hilfs- oder Trägerstoffe, Enzyme, Markersubstanzen, aber auch Aufbewahrungsbehältnisse, Objektträger, optische Instrumente oder andere Vorrichtungsteile umfassen, die eine biologische, chemische und oder physikalische Bestimmung von Dickdarmkrebs bzw. Dickdarmkrebsvorläuferzellen ermöglichen bzw. unterstützen.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispieles näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.
Beispiel : a) Entnahme der Stuhlprobe oder Gewebeprobe Humaner Stuhl : Entnahme einer erbsengroßen Portion des abgesetzten Stuhls mit Entnahmelöffel, Überführung in ein kommerzielles Stuhlröhrchen, schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, Lagerung bei -80 °C, Nagerstuhl : Ausstrichen eines Stücks geformten Stuhls aus dem Enddarm, schockgefrieren in flüssigem Sticktoff, Lagerung bei - 80°C, Humanes Tumorgewebe oder Vorläufer (aberrante Crypten, Adenome, Adenokarzinome) . Biopsie im Verlauf der Koloskopie oder OP;
b) Homogenisierung der Stuhlprobe in Puffersystemen aus kommerziellen Kits oder in TE-Puffer (z.B. 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA) evtl. unter Einsatz von bis zu 400 mg/ml Proteinase K. Mixen des Homogenats bei 99 °C für 10 bis 30 Minuten, bevorzugt 15 Minuten, alternativ bei 55 C für 30 bis 60 Minuten oder bei 37 °C für 30 bis 60 Minuten; Zentrifugation bei 12000 g für 5 Minuten.
c) Isolierung von DNA aus Überstand des Stuhlprobenhomogenats oder aus Gewebeproben mittels kommerzieller Kits;
d) (optional:) Gegebenenfalls Anreicherung a. der Zielgene aus Gesamt-DNA durch Hybridisierung seqenzspezifischer biotinylierter Oligonukleotide mit den Zielgenen APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf, Kopplung des Biotin- restes an Streptavidin und Separation über magnetische Partikel mittels kommerzieller Kits. Die Oligonukleotidsequenzen sind so zu wählen, dass sie mit Bereichen hybridisieren, die von den nachfolgend verwendeten PCR-Primern begrenzt werden oder dicht neben dem amplifizierten Abschnitt oder b. der neoplastischen „long"-DNA durch Ausschluss von fragmentierter DNA einer Größe von < 200 bp, die charakteristisch ist für DNA aus apoptischen Zellen
e) PCR mit sequenzspezifischen Primern gegen ausgewählte Bereiche in den Genen für APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf: APC: Primerpaare ermöglichen Amplifizierung teilweise überlappender Sequenzen in Exon 15 innerhalb des Bereichs gehäuft auftretender Mutationen (mutational cluster region; MCR) , ß-Catenin: Primer beiderseits der in Exon 3 lokalisierten MCR, K-ras: Primer beiderseits der in Exon 1 lokalisierten, häufig mutierten Codons 12 und 13 positioniert, B-raf: Primer in Exon 15 lokalisiert, die Codons 593, 599 und 600 flankierend. Alle Primer werden so gewählt, dass die PCR-Produkte eine Größe von 180 bis 350 bp haben.
f) Kontrolle der PCR-Produkte auf 2 bis 3%igem Agarosegel, bevorzugt 2,5 % Agarose; gegebenenfalls Detektion von Deletionen oder Insertionen;
g) Reinigung der PCR-Produkte mit kommerziellem Kit
h) Mutationsanalyse der PCR-Produkte mittels geeigneter Elektrophoresetechnik, bevorzugt SSCP: 5 bis 14%iges Acrylamidgel in 0,5 x oder 1 x TBE-Puffer, bevorzugt 8 % Acrylamid in 1 x TBE, Elektrophorese bei 4 bis 15 0C," 300 mA, 2 bis 4 Stunden oder 4 °C, 100 mA, 16 Stunden Herkömmliche Färbemethoden, bevorzugt Färbung mit Silbernitrat Detektion der Konformation der Einzelstränge der Proben im Vergleich zum Wildtyp-Standard (optional:) DNA-Extraktion aus dem SSCP-Gel und Sequenzierung der aus dem SSCP-Gel extrahierten DNA oder der korrespondierenden PCR-Produkte

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur nichtinvasiven Früherkennung von Dickdarmkrebs und/oder Darmkrebsvorläuferzellen durch Mutationsanalyse der Gene für APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: Entnahme einer Stuhl- und/oder Gewebeprobe, Homogenisieren der Probe, - Gewinnung von DNA aus der Probe, Durchführung einer Amplifizierungsreaktion in den Genen für APC, K-ras, ß-Catenin und B-raf, wobei für APC Primer S1 TTGCAGTTATGGTCAATACCC, asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG, s2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG, as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC , S3 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG, as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC, S4 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA, as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG, S5 TTCCAGATGCTGATACTTTA, as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC, oder alternativ s2 GAATCAGCTCCATCCAAGT, aS2 TTTCTGCTATTTGCAGGGT, für K-ras die Primer S CTGGTGGAGTATTTGATAGTG, as TCTATTGTTGGATCATATTCG, und für ß-Catenin die Primer S CTGATTTGATGGAGTTGGAC, as CTTGAGTGAAGGACTGAGAA, und für B-raf die Primer S TGTATCACCATCTCCATATC as GCATTCTGATGACTTCTGGT verwendet werden, wobei Amplifikations-Produkte entstehen und Durchführung einer Mutationsanalyse in den Amplifi- kations- rodukten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion von Mutationen in ausgewählten Abschnitten der Gene für APC, K-ras, ß-Catenin und B-ras mittels eines DNA- Chips erfolgt, wobei der DNA-Chip Sonden für APC, K-ras, ß- Catenin und B-raf aus denjenigen Bereichen der genannten Gene enthält, die durch die in Anspruch 1 genannten Primersequenzen flankiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass APC-, K-ras-, ß-Catenin-Gene und B-raf aus einer Gesamt-DNA durch Hybridisierung sequenzspezifischer biotinylierter Oligonukleotide mit den Genen APC, K-ras, ß-Catenin und B- raf mittels Kopplung des Biotinrestes an Streptavidin und nachfolgender Trennung über magnetische Partikel angereichert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Amplifizierungs- , insbesondere PCR-Produkte in einem Agarose-Gel vor einer Reinigung für Kontrollzwecke aufgetrennt werden .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutationsanalyse der PCR-Produkte mittels Elektrophoresetechnik erfolgt, bevorzugt SSCP, alternativ mittels eines Chromatographieverfahrens, bevorzugt eines HPLC-basierten Verfahrens.
6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass detektierte mutagene Konformationen eines Einzelstranges isoliert und gegebenenfalls sequenziert werden.
7. Primersequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend: für APC die Primer s1 TTGCAGTTATGGTCAATACCC, asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG, S2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG, as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC, s3 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG, as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC , S4 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA, as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG, S5 TTCCAGATGCTGATACTTTA, as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC , oder alternativ S2 GAATCAGCTCCATCCAAGT, as2 TTTCTGCTATTTGCAGGGT, für K-ras die Primer s CTGGTGGAGTATTTGATAGTG, as TCTATTGTTGGATCATATTCG, und für ß-Catenin die Primer S CTGATTTGATGGAGTTGGAC , aS CTTGAGTGAAGGACTGAGAA, und für B-raf die Primer a TGTATCACCATCTCCATATC, as GCATTCTGATGACTTCTGGT .
8. Verwendung der Primersequenzen nach Anspruch 7 zur Mutationsanalyse, insbesondere zur Analyse der APC, K-ras, ß-Catenin- und B-raf-Gene.
9. Kit, umfassend die Primer ausgewählt aus der Gruppe umfassend: für APC die Primer s1 TTGCAGTTATGGTCAATACCC , asl GTGCTCTCAGTATAAACAGGATAAG, S2 CCTCAAAAGGCTGCCACTTG, as2 CTGTGACACTGCTGGAACTTCGC, S3 AGCACCCTAGAACCAAATCCAGCAG, as3 TGGCATGGTTTGTCCAGGGC, s4 ACAAACCATGCCACCAAGCAGA, as4 GAGCACTCAGGCTGGATGAACAAG, S5 TTCCAGATGCTGATACTTTA, as5 CTGAATCATCTAATAGGTCC, oder alternativ s2 GAATCAGCTCCATCCAAGT, as2 TTTCTGCTATTTGCAGGGT, für K-ras die Primer S CTGGTGGAGTATTTGATAGTG, aS TCTATTGTTGGATCATATTCG, und für ß-Catenin die Primer S CTGATTTGATGGAGTTGGAC, as CTTGAGTGAAGGACTGAGAA, und für B-raf die Primer a TGTATCACCATCTCCATATC, as GCATTCTGATGACTTCTGGT und gegebenenfalls Informationen zum Kombinieren der Inhalte des Kits.
10. Verwendung des Kits nach Anspruch 9 zur Detektion von Dickdarmkrebs und/oder Dickdarmvorläuferkrebszellen.
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