DE69737812T2

DE69737812T2 - Diagnose durch Bestimmung von Polymorphismen in der Promoterregion des TGF-Beta 1 Gens

Info

Publication number: DE69737812T2
Application number: DE69737812T
Authority: DE
Inventors: David John Grainger; Timothy David St. Thomas's SPECTOR; Kirsten University o HEATHCOTE
Original assignee: Sequenom Gemini Ltd
Current assignee: Sequenom Gemini Ltd
Priority date: 1996-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2017-01-18
Also published as: DE69737812D1; EP0889972A1; US5998137A; EP0889972B1; AU723751B2; JP2000504226A; CA2243191A1; NZ331041A; ATE364717T1; AU2304697A; WO1997028280A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren und eine Apparatur, die auf einem Polymorphismus in einem TGF-β-Gen basieren. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Veranlagung für verschiedene Krankheitszustände, indem das Vorhandensein dieses Polymorphismus überprüft wird. Die Erfindung betrifft weiterhin TGF-β-Promotoren, die den Polymorphismus enthalten, und eine Sonde dafür.
Eine Anzahl bedeutender Krankheitszustände sind verbunden oder stehen in Beziehung mit einer Konzentration des Transformationswachstumsfaktors-β (TGF-β) im zirkulierenden Plasma. Krankheiten, die auf diesem Weg in Beziehung gebracht worden sind, umfassen Atherosklerose, bestimmte Formen von Krebs, Osteoporose und eine Anzahl von Autoimmunerkrankungen wie etwa rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Lupus erythematodes, später Diabetes und andere.
Für eine Vielzahl von Fällen gibt es eine Therapie für diese Krankheitszustände. Allerdings haben viele dieser Therapien ein Problem gemein. Während die Therapie in der Lage ist, das weitere Voranschreiten der Krankheit aufzuhalten, ist die Therapie aber nicht in der Lage, den Krankheitszustand in signifikanter Weise umzukehren oder zu heilen.
Hormonersatztherapie ist eine etablierte Behandlung für Osteoporose und sie hat sich im Hinblick auf ein Aufhalten einer weiteren Abnahme der Knochendichte, was für Frauen, die an dieser Krankheit leiden, charakteristisch ist, als erfolgreich erwiesen. Hormonersatztherapie ist allerdings im Allgemeinen nicht fähig, eine Umkehr von Osteoporose zu bewirken, das heißt, sie ist nicht fähig, einen Anstieg der Knochendichte von Leidenden herbeizuführen.
Es würde dementsprechend von besonderem Vorteil sein, jene Individuen mit gesteigerter Genauigkeit zu identifizieren, die eine Veranlagung oder eine erhöhte Anfälligkeit für Osteoporose haben. Es könnte somit eine geeignete Therapie durchgeführt werden, bevor die Auswirkungen von Osteoporose einsetzen.
Eine ähnliche Situation ergibt sich im Hinblick auf Atherosklerose und Krebs. Im letzteren Fall umfasst die Krebsbehandlung oft schwere Nebenwirkungen. Falls es möglich wäre, Individuen mit einer Veranlagung oder einer erhöhten Anfälligkeit für Krebs zu identifizieren, dann wäre es von Vorteil, diesen Individuen eine präventive Therapie bereitzustellen, um den Ausbruch von Krebs zu reduzieren oder vorzubeugen oder zu verzögern, als Teil einer Therapie, die verminderte Nebenwirkungen im Vergleich mit jenen hat, die die zur Verfügung stehende Standardkrebsbehandlung erhalten.
Es ist ein Ziel dieser Erfindung ein Verfahren zur Erkennung von Individuen zu liefern, die eine Veranlagung oder eine Anfälligkeit für bestimmte Krankheitszustände haben. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Individuen zu identifizieren, die solch eine Veranlagung oder Anfälligkeit haben, indem jene Individuen mit einem veränderten TGF-β-Gen identifiziert werden. Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, eine Therapie für diejenigen Individuen zu liefern, die eine Veranlagung oder Anfälligkeit für bestimmte Krankheitszustände haben. Ein noch weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine Therapie für jene Individuen zu liefern, die eine Veranlagung oder Anfälligkeit für bestimmte Krankheitszustände haben, die mit der Konzentration von TGF-β im Kreislauf in Beziehung stehen.
Dementsprechend liefert ein erster Aspekt der Erfindung, wie in Anspruch 1 definiert, ein Diagnoseverfahren, das eine Bestimmung des Genotyps eines TGF-β1-Promotors umfasst.
Das Verfahren der Erfindung umfasst typischerweise die Bestimmung, ob ein Individuum im Hinblick auf einen TGF-β1-Promotor homozygot oder heterozygot ist und einen besonderen Polymorphismus darin hat. Dieses Verfahren wird gewöhnlich verwendet, um auf ein Individuum im Hinblick auf das Risiko eines Zustandes oder einer Krankheit zu screenen, die mit TGF-β-Mangel, wie etwa Osteoporose, oder die mit erhöhten TBG-β-Spiegeln, wie etwa einigen Krebsarten, in Beziehung steht.
Die DNA-Sequenz der TGF-β1-Promotorregion ist bekannt und von Kim, S. J. et al., im J. Biol. Chem. 264 (1989) Seiten 402–408, siehe 5, veröffentlicht worden. Diese Sequenz wird nachstehend als die Wildtyp-Sequenz oder die veröffentlichte Sequenz bezeichnet. Das Verfahren der Erfindung bestimmt, ob das getestete Individuum einen TGF-β1-Promotor hat, welcher mit der veröffentlichten Sequenz identisch ist oder ob jenes Individuum einen TGF-β1-Promotor hat, der sich von der veröffentlichten Sequenz unterscheidet, d.h. ein Polymorphismus der veröffentlichten Sequenz ist. In der Ausführung der Erfindung, wird der Genotyp des TGF-β1-Promotors eines Individuums im Allgemeinen durch die Analyse eines Abschnitts des TGF-β1-Promotors bestimmt, und eben nicht durch Analyse des gesamten Gens. Wenn sich herausstellt, dass die Sequenz jenes Abschnitts die gleiche ist wie der entsprechende Abschnitt der Wildtyp-Sequenz, dann wird jenes Individuum dahingehend klassifiziert, dass es das Gen für den Wildtyp-TGF-β1-Promotor hat.
Unter Verwendung einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die nachstehend in weiteren Einzelheiten zu beschreiben ist, wird ein Individuum gescreent, um zu bestimmen, ob er oder sie einen TGF-β1-Promotor besitzt, welcher die veröffentlichte Sequenz oder ein Polymorphismus davon ist, in dem ein Guanin-Nucleotid an Position –800bp durch ein Adenin-Nucleotid ersetzt worden ist. In dieser speziellen Ausführungsform korreliert die Anwesenheit des Polymorphismus, bei dem Guanin an Position –800bp durch Adenin ersetzt ist, mit einem erniedrigten Spiegel an TGF-β im Kreislauf und mit einer Veranlagung für bestimmte Krankheitsstadien. Als Beispiele dieser Krankheitsstadien werden ein oder mehrere von Atherosklerose, Krebs, Osteoporose, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Lupus erythematodes und anderen Autoimmunerkrankungen eingeschlossen.
Das Screenen wird beispielsweise unter Verwendung von PCR-Primern ausgeführt, die angepasst sind, einen Abschnitt des TGF-β1-Gens, das das Nucleotid an Position –800bp einschließt, zu amplifizieren. Es wird bevorzugt, dass die PCR-Primer hinsichtlich der Amplifizierung eines Genabschnittes ausgewählt werden, der die Position –800bp umfasst und mindestens sechs Nucleotide auf jeder Seite dieser Position einschließt. PCR-Techniken sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und es würde im Bereich einer Fachperson liegen, Primer zur Amplifizierung eines geeigneten TGF-β1-Genabschnitts, die Position –800bp einschließend, zu identifizieren. PCR-Techniken sind zum Beispiel in EP-A-0200362 und EP-A-0201184 beschrieben.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die nachstehend in weiteren Einzelheiten beschrieben wird, haben die PCR-Primer die Nucleotidsequenzen:
CCCGGCTCCATTTCCAGGTG (SEQ ID NO: 1) und
TGCTCTTGACCACTGTGCCA (SEQ ID NO: 2).
Das Screenen wird in geeigneter Weise durch Amplifizierung eines DNA-Fragments, dass die Position –800bp des TGF-β1-Gens einschließt, und durch Bestimmung, ob der amplifizierte Abschnitt von der Restriktionsendonuclease maeIII zu schneiden ist, ausgeführt. Das Schneiden mit maeIII weist darauf hin, dass das Gen ein Wildtyp ist, während der Verlust an Schneidbarkeit durch maeIII darauf hinweist, dass es eine genetische Variante, das heißt ein Polymorphismus, ist. Es wird bevorzugt, dass die PCR-Primer entsprechend einer Homologie mit einem Bereich des Genoms innerhalb 1 kB der Position –800bp auf dem TGF-β1-Gens ausgewählt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das diagnostische Verfahren eine Analyse des TGF-β1-Promotors, indem es eine Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP) verwendet. Es wird bevorzugt, dass die Primer entsprechend einer Homologie mit einem Bereich des Genoms innerhalb 200bp der Position –800bp auf dem TGF-β1-Gen ausgewählt werden. Es wird weiterhin bevorzugt, dass die PCR-Primer so ausgewählt werden, dass die Position –800bp im Wesentlichen in Richtung Mitte des amplifizierten DNA-Segments liegt.
Unter Verwendung einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung, die nachstehend in weiteren Einzelheiten beschrieben wird, wird ein Individuum gescreent, ob er oder sie einen TGF-β1-Promotor besitzt, welcher die veröffentliche Sequenz oder ein Polymorphismus davon ist, in dem ein Cytosin-Nucleotid an Position –509bp durch ein Thymin-Nucleotid ersetzt worden ist. In dieser besonderen Ausführungsform korreliert die Anwesenheit des Polymorphismus mit einem erhöhten Spiegel an TGF-β im Kreislauf und einer Veranlagung für bestimmte Krankheitsstadien, die mit erhöhten zirkulierenden TGF-β, wie einige Krebsarten, verbunden sind.
Das Screenen kann unter Verwendung von PCR-Primern ausgeführt werden, um einen TGF-β1-Genabschnitt nahe Position –509 zu amplifizieren. Beispiele von geeigneten Primern sind:
CAGACTCTAGAGACTGTCAG (SEQ ID NO: 3) und
GGTCACCAGAGAAAGAGGAC (SEQ ID NO: 4).
Der -509-Polymorphismus kann durch Verwendung von Bsu 361 nachgewiesen werden, wobei der Verlust der Schneidbarkeit die Anwesenheit des Polymorphismus anzeigt.
Alternativ wird der -509-Polymorphismus unter Verwendung von SSCP-Techniken nachgewiesen.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung liefert Diagnosemittel, umfassend PCR-Primer, die angepasst sind, einen Abschnitt eines TGF-ß1-Promotors zu amplifizieren, wobei der DNA-Bereich vorzugsweise ein Nucleotid an Position –800bp, oder einen Bereich, umfassend Position –509bp, auf dem TGF-β1-Gen umfasst.
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung, die nachstehend beschrieben sind, sind PCR-Primer:

(i) CCCGGCTCCATTTCCAGGTG (SEQ ID NO: 1) und TGCTCTTGACCACTGTGCCA (SEQ ID NO: 2), oder
(ii) CAGACTCTAGAGACTGTCAG (SEQ ID NO: 3) und GGTCACCAGAGAAAGAGGAC (SEQ ID NO: 4).

Gegebenenfalls umfassen die Diagnosemittel Mittel zur Bestimmung, welches Nucleotid an Position (a) –800bp oder (b) –509bp auf dem TGF-β1-Gen gefunden wird. Beispiele sind die Restriktionsendonuclease maeIII für (a), und die Restriktionsendonuclease Bsu 341 für (b). Wie eine Fachperson anerkennen wird, ist eine alternative Restriktionsendonuclease, die zum Beispiel fähig ist, den DNA-Abschnitt zu schneiden, wenn an Position –800bp ein Guanin-Nucleotid ist, und die nicht fähig ist, den Abschnitt zu schneiden, wenn ein Adenin-Nucleotid an Position –800bp ist, auch geeignet. Alternativ würde ein geeignetes Agens den Abschnitt schneiden, wenn das Nucleotid an Position –800bp Adenin ist, und den Abschnitt nicht schneiden, wenn dies Nucleotid Guanin ist, und ebenso den Cytosin/Thymin-Polymorphismus an Position –509bp. Die Erfindung liefert weiterhin ein Diagnosekit, das dem zweiten Aspekt gemäß Diagnosemittel der Erfindung gegebenenfalls mit einem Behälter umfasst.
Ein dritter Aspekt der Erfindung liefert einen TGF-β1-Promotor, in dem ein Guanin-Nucleotid an Position –800bp durch ein Adenin-Nucleotid ersetzt ist.
Ein vierter Aspekt der Erfindung liefert einen TGF-β1-Promotor, in dem ein Cytosin-Nucleotid an Position –509bp durch ein Thymin-Nucleotid ersetzt ist.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines Einzelbasen-Polymorphismus in dem TGF-β1-Promotor. Es ist ein Aspekt dieser Erfindung, dass der Polymorphismus mit einer Veranlagung für eine Anzahl an Krankheitszuständen korreliert, die im einzelnen Artherosklerose, Krebs, Osteoporose, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Lupus erythematodes und andere Immunerkrankungen umfassen. Die Erfindung ist dahingegen von Vorteil, dass bei dem Screenen nach der Anwesenheit des Polymorphismus, es möglich ist, Individuen zu identifizieren, die wahrscheinlich eine genetische Veranlagung für einen oder mehrere dieser Krankheitszustände haben.
Es wird angenommen, dass die Anwendung einer Hormonersatztherapie ein erhöhtes Begleitrisiko für Brustkrebs mit sich trägt. Die Erfindung bietet den Vorteil, dass das mit der Hormonersatztherapie verbundene erhöhte Brustkrebsrisiko nur von jenen Frauen akzeptiert werden kann, bei denen bekannt ist, dass eine Veranlagung für Osteoporose wahrscheinlich ist. Die Veranlagung eines Individuums für Osteoporose könnte über die Bestimmung, ob jenes Individuum für das Wildtyp TGFβ1-Gen homozygot ist, für den Wildtyp und den Polymorphismus, bei dem Guanin an Position –800bp durch Adenin ersetzt ist, heterozygot ist oder für den Polymorphismus homozygot ist, abgeschätzt werden.
Ein Individuum, welches für den Polymorphismus homozygot ist, wird als das höchste Risiko besitzend eingestuft. Ein Individuum, das heterozygot ist, wird als ein mäßiges Risiko besitzend eingestuft. Ein Individuum, das für das Wildtyp TGF-β1-Gen homozygot ist, befindet sich im Hinblick auf die Einstufung in der niedrigsten Risikokategorie.
Gegebenenfalls wird die Bestimmung eines individuellen Risikofaktors im Hinblick auf beides, die Anwesenheit eines TGF-β1-Polymorphismus und auch auf andere bekannte genetische oder physiologische oder diätische oder andere Indikationen berechnet. Auf diesem Weg wird weitere Information, auf welcher die Messung des individuellen Risikos basieren kann bereitgestellt.
Die Veranlagung für Atherosklerose wird unter Verwendung derselben Kriterien, die auch für die Messung zur Veranlagung von Osteoporose verwendet werden, bestimmt. Die Methode kann die Bestimmung, ob ein Individuum eine Veranlagung zur Atherosklerose hat, und die Behandlung eines Individuums mit solch einer Veranlagung zur Vorbeugung, Verminderung oder Verzögerung von Atherosklerose umfassen. Zum Bespiel könnte die Behandlung Veränderungen in der Ernährung des jeweiligen Individuums umfassen. Eine andere Behandlung könnte eine pharmazeutische Behandlung sein, als da wären die Verabreichung eines antikoagulanten Agens oder eines fibrinolytischen Agens. Besondere Behandlungen und Methoden werden in den US-Patenten 5242397 und 5171217 offenbart.
Analoge Therapien gegen Krebs und Autoimmunerkrankungen, die auf Erkennung eines TGF-β1-Polymorphismus basieren, der mit einer Veranlagung für diese Krankheiten korreliert, sind vorhersehbar. Im Fall von Krebs, könnte die Krankheit entweder aus zu viel oder zu wenig TGF-β hervorgehen. Dementsprechend ist einer dieser Polymorphismen ein Austausch eines Cytosins an Position –509bp durch ein Thymin; ein anderer ist der Austausch von Guanin an Position –800bp durch ein Adenin. In dem Fall von Autoimmunerkrankungen, bei denen davon ausgegangen wird, dass sie mit einem erniedrigten TGF-β verbunden sind, würde der Polymorphismus bei –800bp, bei dem ein Adenin Guanin ersetzt, mit der Veranlagung für die Krankheit korrelieren; der Polymorphismus bei –509bp, bei dem Thymin Cytosin ersetzt, würde in negativer Weise mit der Krankheit korrelieren.
Die Konzentration des Transformationswachstumsfaktors-β (TGF-β) im zirkulierenden Plasma korreliert mit der Entwicklung einiger wichtiger Krankheiten, Atherosklerose und bestimmte Formen von Krebs eingeschlossen. Allerdings sind die Mechanismen, die die Konzentration von TGF-β im Plasma steuern, wenig verstanden. Die vorliegende Erfindung basiert auf unserer Entdeckung, dass die Konzentration von TGF-β im Plasma (aktiver TGF-β plus latente TGF-β-Formen im Plasma) in 66 von 71 Paaren monozygoter weiblicher Zwillinge in der Postmenopause vorwiegend (79%) unter genetischer Kontrolle ist. Die Konzentration von aktivem TGF-β war auch in signifikanter Weise unter genetischer Kontrolle (57%). Analysen des TGF-ß1-Promotors mittels Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP) haben einen Einzelbasen-Polymophismus (A/G an Position –800bp) identifiziert, welcher in signifikanter Weise (p < 0,01; n=276) mit niedrigen TGF-β-Spiegeln im Plasma verbunden ist. Diese Daten legen nahe, dass eine Veranlagung für Atherosklerose oder verschiedene Krebsformen mit bestimmten Allelen innerhalb des TGFb1-Locus verbunden sein könnten.
TGF-β ist ein multifunktionales Cytokin, welches die Proliferation und Differenzierung einer breiten Vielfalt an Zelltypen in vitro steuert. Kürzlich wurde die Entwicklung von verschiedenen wichtigen Krankheiten, einschließlich verschiedener Krebsformen, Atherosklerose und fibrotischen Erkrankungen mit der pathologischen Fehlsteuerung des TGF-β-Systems in Zusammenhang gebracht. Moses und Kollegen zeigten, dass die lokale Expression eines konstitutiv aktiven TGF-β1-Transgens der Entwicklung von Brustkarzinomen vorbeugt, die entweder durch transgene Überexpression von TGF-a oder durch das chemische Karzinogen DMBA ((1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92) herbeigeführt werden. Auf die gleiche Weise haben Studien der Gruppe von Akhurst und Balmain gezeigt, dass niedrige TGF-β1-Spiegel ein hohes Risiko für die bösartige Umwandlung gutartiger Tumoren in der p53-Knockout-Maus voraussagen ((1994) Cancer Res. 54, 5831–5836). Erst vor kurzem haben Markowitz et al., Science 268, 1336–1338, 1995, somatische Mutationen des Signal-weiterleitenden Rezeptors TGF-β Typ II, welcher es voraussichtlich nicht-funktional machen würde, in menschlichen Darmkrebsbiopsien identifiziert. Diese Daten legen nahe, dass lokale Abnahmen in der TGF-β-Aktivität an Umwandlungen zu dem bösartigen Phänotyp in vivo beteiligt sein könnten. Im Gegensatz dazu haben Arteaga et al., J. Clin. Invest. 92, 2569–2576, 1995, gezeigt, dass die Transfektion einer transformierten Zelllinie mit einem Konstrukt, das aktiven TGF-β exprimiert, die Zellen in vivo kanzerogener macht, möglicherweise weil TGF-β immunsuppressiv ist und die immune Überwachung beeinträchtigt wurde. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung ist von erhöhten Plasma-TGF-β-Spiegeln in Patienten mit bösartigen Prostatatumoren und Leberzellkarzinomen berichtet worden. Während eine örtliche Unterdrückung der TGF-β-Aktivität in einer bösartigen Umwandlung enden könnte, korrelieren erhöhte Plasma-TGF-β-Spiegel mit der Etablierung des Tumors.
In Studien im Hinblick auf die Rolle von TGF-β in der Atherogenese haben wir gezeigt, dass Mäuse, die das Apolipoprotein(a)-Transgen exprimieren, nahrungsinduzierte Lipidläsionen entwickeln, die den frühen menschlichen atherosklerotischen Plaques an Stellen in der Gefäßwand ähneln, wo TGF-β-Aktivität örtlich durch hohe Konzentrationen an Apolipoprotein(a) unterdrückt wird. Es ist auch gezeigt worden, dass Tamoxifen, welches die TGF-β-Aktivität in beidem, Gefäßwand und Mäuseserum, erhöht, die nahrungsinduzierten Lipidläsionen bei beiden, den Apolipoprotein(a)-Mäusen und den durch Inzucht erzeugten C57B16-Mäusen, verhindert. Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen haben wir gezeigt, dass die Konzentration von aktivem TGF-β in Individuen mit schwerer koronarer Herzartherosklerose um das fünffache vermindert ist, verglichen mit Individuen mit normalen koronaren Arterien, was mittels Angiographie bestimmt wurde. Zusammengefasst legen diese Studien nahe, dass verminderte TGF-β-Aktivität, entweder in der Gefäßwand oder in dem Kreislauf, ein wichtigen Schritt in der Entwicklung von Atherosklerose ist. Trotz dieser Übereinstimmungen mit wichtigen Krankheiten, sind die Mechanismen, die die Konzentration von TGF-β im zirkulierenden Plasma steuern, wenig verstanden. In der vorliegenden Erfindung haben wir untersucht, ob es eine genetische Steuerung der Plasma-TGF-β-Konzentrationen gibt.
Das menschliche TGF-β-Protein stammt von drei unverbundenen genetischen Loci, TGFb 1, TGFb 2 und TGFb 3, welche drei Proteinisoformen TGF-β1, -β2 und -β3 exprimieren. Studien, die Isoform-spezifische ELISA-Assays verwenden, haben gezeigt, dass TGF-β2 im menschlichen Blut nicht anwesend ist, und TGF-β3 ist im Plasma mit einem Mangel an Blutplättchen und im Serum von 2 von 22 getesteten Individuen gefunden worden (unveröffentlichte Beobachtungen der Erfinder). Das meiste oder der gesamte im Blut vorliegende TGF-β der meisten Individuen ist deshalb die b1-Isoform. Kürzliche Studien haben gezeigt, dass TGF-β1 im Blut in mehreren verschiedenen Proteinkomplexen anwesend ist. Die höchsten Konzentrationen von TGF-β1 sind in den Blutplättchen enthalten, wo es als zwei verschiedene latente Blutplättchen-Komplexe vorliegt, genannt große und kleine latente Komplexe, welche keine bekannte biologische Aktivität haben. Im Gegensatz dazu enthält Plasma mit einem Mangel an Blutplättchen eine biologisch aktive Form von TGF-β1 und einen latenten Komplex, den wir latenten Plasma-Komplex genannt haben, welcher sich von jedem der beiden latenten Blutplättchen-Komplexe unterscheidet. Die selben Formen von Plasma-TGF-β sind im Serum anwesend, zusammen mit viel größeren Konzentrationen des großen latenten Blutplättchen-Komplexes, welcher ins Serum abgegeben wird, wenn Gerinnung auftritt. Für unsere vorliegenden Studien zur genetischen Kontrolle von Plasma-TGF-β in Zwillingspopulationen, wurde ein ELISA verwendet, welcher nur die zwei Formen des vorstehend beschriebenen Plasma-TGF-β nachweist: die aktive Form gemeinsam mit dem latenten Plasma-Komplex. Der Einfangantikörper (BDA19; R&D Systems) erkennt den großen latenten Blutplättchen-Komplex nicht, welcher ins Serum abgegeben wird, und dementsprechend erkennt der BDA19-ELISA dieselben Konzentrationen an TGF-β im Plasma oder Serum, das von derselben Blutprobe hergestellt wird.
Es folgt nun eine Erläuterung der Erfindung durch die 1–4, in denen:
1 die Kreislaufkonzentration von TGF-β in Zwillingspaaren zeigt. Die Konzentration von aktivem und latentem Plasma-TGF-β (a, b) und aktivem TGF-β (c, d) wurde im Serum von monozygoten (a, c) und dizygoten (b, d) Zwillingen gemessen. Alle Individuen waren weiblich, postmenopausal und erhielten keine Hormonersatztherapie. Für jedes Paar wurde Zwilling 1 willkürlich als die Schwester mit der niedrigsten zirkulierenden Konzentration an TGF-β bestimmt.
2 einen Polymorphismus in dem TGF-β1-Promotor, der mit der zirkulierenden TGF-β-Konzentration verbunden ist, zeigt. (a) Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP)-Acrylamidgel von nicht denaturierter DNA, die durch Polvmerasekettenreaktion zwischen den Primern
5'-CCCGGCTCCATTTCCAGGTG-3' (–1106 to –1125bp) (SEQ ID
NO: 1) und 5'-TGCTCTTGACCACTGTGCCA-3' (–738p to –757b)(SEQ ID NO: 2) erhalten wurde, mit genomischer Lymphocyten-DNA von vier gesunden kaukasischen Spendern als Matrize. Ein Heterozygot (Bahn 1) wird mit der diagnostischen Dublette, markiert durch den Pfeil, gezeigt. (b) Schematische Darstellung der mutmaßlichen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dem TGFb1-Promotor. Schraffierter Kasten: eine oder mehr Konsensus-sp1-Bindungsstelle(n); vertikale Linie: Konsensus-ap2-Bindungsstelle; getüpfeltes Oval: Konsensus-Glucocorticoid-Response-Element; ausgefüllter Kasten: Konsensus-CREB-Halbregion. Ein Bereich der Wildtypsequenz wird gezeigt–
CTCTGCCTCCAACGTCACCACCAT = SEQ ID NO: 5.
Die Sequenz der CREB-Halbregion wird mit dem Einzelbasen-Polymorphismus gezeigt (eingerahmt), der sich in der SSCP-Dublette ergibt, in (a) durch Fettschrift hervorgehoben. Die maeIII-Konsensus-Sequenz, die in dem G-Allel (GTNAC) vorliegt, ist unterstrichen. Alle Nucleotidpositionen werden auf die am meisten 5' liegende transkriptionale Startstelle des TGFb1-Gens bezogen, das im J. Biol. Chem., 264, Seiten 402–408, 1989 beschrieben wird.
(c) Verteilung der zirkulierenden TGF-β-Konzentration in jenen Zwillingspaaren, die in 1 analysiert wurden, die kein A-Allel haben, was durch die Abwesenheit unverdauter DNA bei der maeIII-Verdauung des PCR-Fragments identifiziert wurde, das vorstehend in (a) erhalten wurde. (d) Verteilung der zirkulierenden Konzentration an TGF-β in Individuen mit AG-Genotyp.
3 den Ort der Polymorphismen in dem TGFb1-Promotor zeigt, und eine schematische Darstellung der mutmaßlichen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dem TGFb1-Promotor einschließt. Schraffierter Kasten: eine oder mehr Konsensussp1-Bindungsstelle(n); vertikale Linie: Konsensus-ap2-Bindungsstelle; getüpfeltes Oval: Konsensus-nukleäres Hormonbindungselement; ausgefüllter Kasten: Konsensus-CREB-Halbregion. Bereiche der Wildtypsequenz werden gezeigt-CTCTGCCTCCAACGTCACCACCAT = SEQ ID NO:
5, CCCTTCCATCCCTCAGGTGTCCT = SEQ ID NO: 6.
Die Sequenz der CREB-Halbregion wird mit dem Einzelbasen-Polymorphismus bei –800bp gezeigt (eingerahmt), der durch Fettschrift hervorgehoben ist. Die im G-Allel (GTNAC) vorliegende maeIII-Konsensus-Sequenz ist unterstrichen. Die Sequenz, die den Einzelbasen-Polymorphismus bei –509bp umgibt (Fettschrift), wird auch gezeigt. Alle Nucleotidpositionen werden auf die am meisten 5' liegende transkriptionale Startstelle des TGFb1-Gens bezogen.
4 eine Verbindung zwischen Polymorphismen in der TGFb1-Promotor-Region und der zirkulierenden Konzentration von TGF-β zeigt. Boxplots (interquartiler Bereich) von (a + I) (a, c) TGF-β-Konzentrationen und aktive (b, c) TGF-β-Konzentrationen in Gruppen von Individuen, klassifiziert durch Genotyp bei –800bp (a, b) und –509bp (c, d).
Beispiel 1
TGF-β wurde durch einen BDA19-ELISA in Serumproben von 136 Zwillingspaaren (71 monozygote und 65 dizygote Paare) bestimmt, um die genetische Beteiligung an der Variation der TGF-β-Konzentration zu bestimmen. Die Übereinstimmung der Konzentration zwischen den monozygoten Geschwistern war sehr hoch (SN/Mittel = 16,9% +/– 2,3%; n = 66) in 66 von 71 Paaren. Von jedem der fünf verbleibenden Paare hatte ein Geschwister einen erhöhten Spiegel an zirkulierendem TGF-β, der höher war als bei jedem anderen der 66 Zwillingspaare, und er war mehr als fünf Standardabweichungen vom Mittel der Population als Ganzes. Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese Individuen erhöhte Konzentrationen an zirkulierendem TGF-β infolge von Umwelteinflüssen hatten, und diese fünf Zwillingspaare wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Für die verbleibenden monozygoten Zwillingspaare war der Intra-Klassen-Korrelationskoeffizient (r²MZ) 0,79 (1a).
Unter Verwendung derselben Ausschlusskriterien für die dizygoten Zwillinge gab es zwei Zwillingspaare, bei dem ein Geschwister eine TGF-β-Konzentration hatte, die größer als bei allen übereinstimmenden monozygoten Zwillingspaaren und mehr als fünf Standardabweichungen vom Mittel der Gesamtpopulation war. Für die verbleibenden 63 dizygoten Paare war die Korrelation weniger ausgeprägt (Intra-Klassen-Korrelationskoeffizient r²D2 = 0.39; 1b) als für die monozygoten Zwillingspaare. Wenn genetische Variationen an einem einzigen Locus für die Variationen der TGF-β-Konzentrationen verantwortlich waren, würde das Verhältnis r²DZ zu r²MZ mit 0,5 vorausgesagt werden, und wenn die Anzahl unverbundener Allele, die zur Kontrolle von TGF-β Konzentrationen beiträgt, ansteigt, nimmt das Verhältnis r²DZ zu r²MZ ab. In dieser Studie legt der Wert r²MZ/r²DZ = 0,49 nahe, dass die genetische Variabilität an einigen wenigen unverbundenen Loci, oder möglicherweise nur an einem Locus für die genetische Kontrolle des zirkulierenden TGF-β verantwortlich ist.
Die Konzentrationen von aktivem TGF-β in den Serumproben wurden ebenfalls unter Verwendung eines ELISA gemessen, in dem die extrazelluläre Domäne des Typ II-TGF-β-Rezeptors (R2X) das Einfangmittel ist. Die Konzentration von aktivem TGF-β im Kreislauf korrelierte auch in signifikanter Weise für die monozygoten Zwillingspaare (r²MZ = 0,57; 1c), aber weit weniger für die dizygoten Zwillinge (r²DZ = 0,11; 1d). Da das Verhältnis r²DZ zu r²MZ viel niedriger als 0,5 ist, schlussfolgern wir, dass eine Anzahl unverbundener Genloci wahrscheinlich an den Konzentrationsveränderungen von aktivem TGF-β mitwirken. Dies stimmt mit unseren vorhergehenden Beobachtungen überein, dass die Aktivierung von TGF-β invers mit der Konzentration von Lipoprotein(a) korreliert, da die zirkulierende Konzentration von Lp(a) genetisch an einem nicht mit TGFb1 verbundenen Locus bestimmt wird.
Da das meiste des TGF-β im Plasma die b1-Isoform ist, untersuchten wir, ob Mutationen an dem TGFb1-Locus die zirkulierende Konzentration von TGF-β beeinflusst. Unter Verwendung von SSCP-Kartierung wurde ein Polymorphismus in der Promotorregion des TGFb1-Gens, etwa 1kb stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle (2a, b) entfernt, identifiziert. Das Sequenzieren des PCR-Fragments, das durch SSCP-Kartierung analysiert wurde, bestimmte den Polymorphismus als einen Einzelbasenaustausch an Position –800bp, indem A G in der veröffentlichten genomischen Sequenz ((1989) J. Biol. Chem. 264, 402–408) bei etwa 10% der Allele ersetzt. Die Anwesenheit von Adenin an Position –800bp zerstörte eine Schnittstelle für die Endonuclease maeIII, welche daher verwendet wurde, um den Promotor von den 136 Zwillingspaaren nach der Anwesenheit dieses Polymorphismus zu durchsuchen. 52 von 276 Individuen waren heterozygot im Hinblick auf diesen Polymorphismus und ein monozygotes Zwillingspaar (2 Individuen von 276) war homozygot im Hinblick auf A an Position –800bp. Der Polymorphismus war deshalb in dieser Population mit einer Häufigkeit von 9,8% der getesteten Allele anwesend.
Wir testeten, ob die Individuen mit seltenem A-Allel zirkulierende TGF-β-Spiegel hatten, die sich signifikant von denen mit dem üblicheren G-Allel unterschieden. Die mittlere TGF-β-Serumkonzentration, bestimmt durch BDA19-ELISA in Individuen mit GG-Genotyp, war 6,4 +/– 0,6 ng/ml (n = 252; 2c), nicht signifikant verschieden von der mittleren TGF-β-Konzentration von 8,9 +/– 1,5, die für eine Gruppe weiblicher Spender mit ähnlichem Durchschnittsalter genannt wurde. Im Gegensatz dazu war die mittlere TGF-β-Konzentration bei Individuen mit AG-Genotyp 4,2 +/– 1,1 ng/ml (p < 0,01; n = 62; 2d). Die Geschwister des monozygoten Zwillingspaars, die für das A-Allel homozygot waren, hatten TGF-β-Konzentrationen von < 1 ng/ml (unter der Nachweisgrenze des verwendeten Assays) und 2 ng/ml. Der Kruskal-Walis-Test für einen Unterschied zwischen GG- und AG-Genotypen ist P = 0,01, wenn alle Zwillinge in die Berechnung als unabhängige Individuen genommen werden. Wir fassen zusammen, dass das Vorliegen des A-Allels signifikant mit niedrigen zirkulierenden Konzentrationen an TGF-β in Beziehung steht.
Der beschriebene Polymorphismus ist in einer Konsensus-CREB-Halbregion vorhanden, und es würde von dem A-Allel erwartet, das es eine verminderte Affinität für die CREB-Familie von Transkriptionsfaktoren besitzt. Der beschriebene Polymorphismus könnte dementsprechend direkt für die verschiedenen Konzentrationen an TGF-β verantwortlich sein oder alternativ könnte er in einem Ungleichgewicht mit anderen bisher unbekannten Polymorphismen in dem TGFb1-Locus in Verbindung sein, die die Konzentration von TGF-β beeinflussen. Zusammengefasst legen die Daten nahe, dass ein überwiegender Teil der genetischen Kontrolle über zirkulierende TGF-β-Spiegel in dem TGF-β-Locus liegen könnte, da nur einige wenige unverbundene Loci, oder möglicherweise nur ein einziger Locus im Kontrollmechanismus enthalten sind (ist), und wir haben einen Polymorphismus in dem TGFb1-Locus identifiziert, welcher mit TGF-β-Konzentration korreliert.
Beispiel 2
Das vorliegende Beispiel folgt aus der Arbeit, die in dem vorstehenden ersten Beispiel berichtet wurde.
Versuchspersonen
Alle hier getesteten Versuchspersonen waren weiblich (Alter erstreckt sich von 39 bis 70 Jahren; Mittel 57,7 Jahre) und die Meisten waren postmenopausal. Zwillinge wurden einer nationalen Medienkampagne folgend angeworben und waren weitgehend repräsentativ für die normale Bevölkerung des Vereinigten Königreichs. Keine der Versuchspersonen nahm eine Hormonersatztherapie oder andere hormonell aktive Medikamente. Es wurde Serum hergestellt und für die TGF-β- Analyse gelagert. Lymphocyten-DNA wurde ebenfalls für jede Versuchsperson unter Verwendung der Standard-Phenolextraktion hergestellt, und der Zygotizitätszustand wurde durch Fragebogen und Multiplex-Fingerprinting bestimmt.
TGF-β-Analyse
Aktiver und säure-aktivierbarer latenter (a + l)-TGF-β wurde unter Verwendung des BDA19-Capture-ELISA gemessen. Aktiver TGF-β wurde unter Verwendung des R2X-Capture-ELISA gemessen. Es wurde eine Einzelbestimmung jeder Probe gemacht. Die Intra-Assay-Variationskoeffizienten des verwendeten Assays sind 6,8% beziehungsweise 7,4%. Den Serumproben mit einer TGF-β-Konzentration unter der Nachweisgrenze der verwendeten Assays (< 1 ng/ml; 27 von 334 für (a + l) TGF-β und 37 von 334 für aktiven TGF-β) wurde ein Wert von 0,5 ng/ml zugewiesen.
SSCP
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde zur Amplifizierung von Fragmenten des Promotors verwendet, die in etwa 400bp lang waren. 1,0 mg der genomischen DNA wurde einer Reaktion von 20 ml zugesetzt, die aus 1 × Taq-Polymerase-Puffer (Pharmacia), 50 nmol von jeder dNTP und 6,25 pmol Forward-Primer bestand. Die Reaktion wurde für 30 s auf 95°C erhitzt und dann bei 80°C gehalten, während 5 ml, enthaltend 6,25 pmol Reverse-Primer und 0,5 Einheiten Taq-Polymerase in 1 × Taq-Polymerase-Puffer, zugefügt wurden. Proben wurden für 35 Cyclen von 95 ITCH 1 Minute amplifiziert, 1 Minute 60 ITCH und 1 Minute 72 ITCH, gefolgt von einer 10 minütigen Verlängerungsperiode bei 72 ITCH. Primer waren
5'- CCCGGCTCCATTTCCAGGTG-3' (SEQ ID NO: 1) und
5' -TGCTCTTGACCACTGTGCCA-3' (SEQ ID NO: 2) für den G-800A-Polymorphismus und
5'- CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3' (SEQ ID NO: 3) und
5' -GGTCACCAGAGAAAGAGGAC-3' (SEQ ID NO: 4) für den C-5097-Polymorphismus.
PCR-Produkte wurden mit 0,2 M Natriumhydroxid und 0,5 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure bei Raumtemperatur denaturiert. Einzelstrang-DNA-Banden wurden auf einem 20%igen Acrylamidgel (Phastsystem, Pharmacia oder XCeII II System, R&D Systems) getrennt und durch Silberfärbung sichtbar gemacht.
Gentypisierung
Der G-800A-Polymorphismus beseitigt eine MaeIII-Schnittstelle. Es wurde den PCR-Produkten direkt bis zu einem Endvolumen von 30 ml MaeIII und MaeIII-Puffer (Boehringer) zugesetzt, und sie wurden bei 55 ITCH 5 Stunden inkubiert. Produkte des Verdaus wurden auf einem 1,2%igen Agarosegel aufgetrennt. Der C-509T-Polymorphismus ist in einer Bsu 36 I-Schnittstelle. PCR-Produkte wurden mit drei Volumina 95%igem Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 bei –20 ITCH 1 Stunde präzipitiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 13000 U.p.m. über 10 Minuten. Die DNA wurde in einem 20 ml Bsu 36 I-Extrakt resuspendiert, enthaltend 10 Einheiten Bsu 36 I (New England Biolabs), und bei 37 ITCH für mindestens 12 Stunden inkubiert. Die Extrakte wurden mittels einer 1,5%igen Agarosegelelektrophore aufgetrennt.
TGF-β wurde mit einem BDA19-ELISA in Serumproben von 174 Zwillingspaaren (87 monozygote (MZ) und 87 dizygote (DZ) Paare) bestimmt, um den genetischen Beitrag zur Konzentrationsvariation von TGF-β zu bestimmen. Die grundlegenden Eigenschaften dieser Zwillinge werden in Tabelle 1 gezeigt. Die MZ-Zwillinge waren leicht älter als die DZ-Zwillinge (mittleres Alter 58,9 Jahre gegenüber 56,6 Jahren) und ein signifikant höherer Anteil war postmenopausal (87% gegenüber 75%). Allerdings war keine dieser Variablen signifikant mit der Konzentration von (a + l) oder aktivem TGF-β verbunden. Übereinstimmend mit unseren früheren Studien passten die Plasma-(a + l)-TGF-β-Konzentrationen dieser Population nicht zu einer Normalverteilung. Eine Boxcox-Transformation wurde zur Maximierung von Normalität angewendet, welche in gleichen Mittelwerten und Varianzen zwischen den MZ- und DZ-Gruppen resultiert, aber die Verteilungen blieben signifikant nicht normal. Deshalb behandelten wir die TGF-β-Konzentration als eine kategorische Variable, die jedes Individuum einem angenäherten Terzil zuteilt (für (a + l) TGF-β waren diese ,niedrig', weniger als 4ng/ml; ,mittel' 4–5 ng/ml; ,hoch' mehr als 5 ng/ml). Für (a + l)-TGF-β war die prozentuale Übereinstimmung (das ist der Anteil der Zwillingspaare, bei dem beide Individuen in dasselbe Terzil fallen) für MZ-Paare (57,8%) signifikant höher als für DZ-Paare (40,5%; p = 0,025; Chi-Quadrat-Test; Tabelle 2). Dies zeigt, dass die Konzentration von (a + l)-TGF-β im Plasma durch genetische Faktoren beeinflusst wird.
Die Konzentrationen von aktivem TGF-β in den Serumproben wurden ebenfalls unter Verwendung eines ELISA gemessen, in dem die extrazelluläre Domäne des Typ II-TGF-β-Rezeptors (R2X) als Einfangmittel agiert. Die Verteilung von aktiven TGF-β-Konzentrationen unterschieden sich für beide Zwillingsgruppen signifikant von einer Normalverteilung, sogar nach einer Boxcox-Transformation, was die Verteilung von (a + l)-TGF-β-Konzentrationen betrifft. Bei Behandlung der aktiven TGF-β-Konzentration als eine kategorische Variable (,niedrig' weniger als 3 ng/ml; ,mittel' 3 oder 4 ng/ml; ,hoch' größer als 4 ng/ml), war die prozentuale Übereinstimmung zwischen Terzilen für die MZ-Zwillinge (62,8%) signifikant höher als für die DZ-Zwillinge (43,6%; p = 0,016; Chi-Quadrat-Test; Tabelle 2). Es scheint deshalb, dass die Konzentration des aktiven TGF-β im Plasma ebenfalls unter genetischer Kontrolle ist.
Da der meiste TGF-β im Plasma die TGF-β-Isoform ist, untersuchten wir, ob Mutationen an dem TGFb1-Locus die zirkulierende Konzentration von TGF-β beeinflusst. Unter Verwendung von SSCP-Analyse wurden zwei Polymorphismen in der Promotorregion des TGFb1-Gens innerhalb 1,5kbp stromaufwärts von der Haupttranskriptionsstartstelle identifiziert. Die Sequenzierung der PCR-Fragmente, die mittels SSCP-Kartierung analysiert wurden, ergab zwei Einzelbasen-Substitutions-Polymorphismen. Der erste Polymorphismus trat bei –800bp auf, indem Adenin Guanin in der veröffentlichen genomischen Sequenz bei etwa 10% der Allele (G-800A; 3) ersetzt. Der zweite Polymorphismus war bei –509bp, indem Thymin Cytosin bei etwa 30% der Allele (C-509T; 3) ersetzt. Der Genotyp an diesen zwei Stellen in der TGFb1-Promotorregion wurde für die Mehrzahl der Individuen in der Zwillingsstudie bestimmt. Für den G-800A-Polymorphismus fanden wir 59 heterozygote Individuen (AG) von 341, und zwei Individuen (ein monozygotes Zwillingspaar) waren homozygot AA, einer A-Allel-Frequenz von 0,092 in dieser Population entsprechend. Für die C-509T waren 160 von 330 Individuen heterozygot (CT), und 24 von 330 Individuen waren homozygot im Hinblick auf Thymin an dieser Position (T-Allel-Frequenz = 0,315). Der G-800A Polymorphismus ist im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht innerhalb der Zwillingsstudie (c2 = 0,345, p = 0,557), allerdings zeigt der C-509T-Polymorphismus kein Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, wenn alle Zwillinge eingeschlossen werden (c2 = 5,012, p = 0,025).
Wir testeten, ob es irgendeine Verbindung zwischen dem TGFb1-Promotor-Genotyp und der Plasmakonzentration von (a + l) TGF-β gab. Die Anwesenheit eines A-Allels ist signifikant mit niedrigen zirkulierenden Konzentrationen von TGF-β verbunden, unabhängig davon, ob alle Individuen eingeschlossen werden (gebundenes p = 0,0005; n = 328; Kruskal-Wallis-Test) oder ob nur ein zufällig ausgewähltes Individuum jedes Zwillingspaars (gebundenes p = 0,02; n = 164; Kruskal-Wallis-Test; 4a) eingeschlossen wird. Das Vorliegen des T-Allels bei –509bp ist signifikant mit höheren Plasmakonzentrationen von TGF-β (verbundenes p = 0,0004; n = 319; Kruskal-Wallis-Test) verbunden, und diese Verbindung ist immer noch signifikant, auch wenn nur ein Zwilling jedes Paars in die Analyse (verbundenes p = 0,016, Kruskal-Wallis-Test; 4c) eingeschlossen wird. Die G-800A- und C-509T- Mutationen werden abgelehnt, weil Genotypen wie AGTT, die eine Verbindung zwischen Adenin und Thymin fordern würden, niemals beobachtet wurden.
Es wurde beobachtet, dass (4b, d) das T-Allel bei –509bp signifikant mit höheren Konzentrationen an aktivem TGF-β (p = 0,023; Kruskal-Wallis-Test, es wird nur ein Zwilling jedes Paars eingeschlossen) verbunden ist, und das A-Allel –800bp ist wahrscheinlich mit niedrigeren Konzentrationen an aktivem TGF-β (p = 0,076; Kruskal-Wallis-Test, es wird nur ein Zwilling jedes Paars eingeschlossen) verbunden.
Die Anwesenheit des Polymorphismus in dem TGFb1-Locus könnte eine Veranlagung für Krankheiten anzeigen, die mit zirkulierenden TGF-β-Spiegeln verbunden sind, einschließlich Atherosklerose (abnehmender zirkulierender TGF-β1) und einige Formen von Krebs (erhöhter zirkulierender TGF-β).

Die Erfindung stellt somit eine Methode und Mittel zur Identifizierung von Individuen bereit, die einen TGF-β-Polymorphismus haben, der mit einer Veranlagung für bestimmte Krankheitszustände korreliert. TABELLE 1

	MZ (n = 174)	DZ (n = 174)	p
Alter (Jahre)	58.9 ± 6.6	56.6 ± 8.3	0.006
Größe (cm)	160.2 ± 6.1	161.3 ± 5.9	0.078
Gewicht (kg)	62.9 ± 9.7	65.0 ± 11.0	0.063

Anteil (%) postmenopausal	131 (87)	112 (75)	0.007
Anteil (%) momentaner Raucher	24 (14)	33 (19)	0.325
Anteil (%) keine Alkoholkonsumenten	23 (13)	15 (9)	0.121
Anteil (%) vorausgehende HET	32 (18)	31 (18)	0.889
Anteil (%) Hysterektomie	35 (20)	37 (21)	0.791

Ausgangscharakteristika einer Population. Die monozygoten (MZ) und dizygoten (DZ) Gruppen (p-Werte in Fettdruck hervorgehoben) unterscheiden sich nur im Hinblick auf Alter und die Anzahl an postmenopausalen Individuen. Keines der untersuchten Individuen befand sich derzeit in einer Hormonersatztherapie oder nahm andere hormonell aktive Medikamente. Abkürzung: HET, Hormonersatztherapie. TABELLE 2
Übereinstimmung innerhalb der Paare der (a + l) und der aktiven TGF-β-Konzentrationen zwischen MZ- und DZ-Zwillingspaaren. Die Konzentration von (a + l) (a) oder aktivem (b) TGF-β wurde als eine kategorische Variable behandelt, und Individuen wurden zu ungefähren Terzilen zugeordnet (für (a + l) TGF-β: 'niedrig', < 4 ng/ml; 'mittel' 4–5 ng/ml; 'hoch' < 5 ng/ml und für aktiven TGF-β: 'niedrig < 3 ng/ml; 'mittel' 3–4 ng/ml; 'hoch' > 4 ng/ml). Der Prozentsatz an Zwillingspaaren in jeder der MZ- und DZ-Gruppen werden einzeln für jede Kombination von TGF-β Konzentrationskategorien gezeigt. Der Prozentsatz paarweiser Übereinstimmung für jede Gruppe ist der Anteil der Zwillingspaare auf der Diagonale jeder Tabelle. Der Prozentsatz paarweiser Übereinstimmung ist von MZ- signifikant höher als von DZ-Zwillingen, dies gilt für beide, (a + l) TGF-β (p = 0,025; Chi-Quadrat-Test) und aktiven TGF-β (p = 0,016; Chi-Quadrat-Test). Wo sich der Anteil an Zwillingen im Feld signifikant zwischen den MZ- und den DZ-Gruppen unterscheidet (p < 0,05; Chi-Quadrat-Test), werden die Prozente in Fettdruck hervorgehoben.

Claims

Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder einer Veranlagung für eine Erkrankung, umfassend das Nachweisen eines Polymorphismus in einem TGF-β1-Promotor im Vergleich zur menschlichen Wildtyp-Sequenz wie in 5 gezeigt, der mit einer Erhöhung oder Erniedrigung von Plasma- TGF-β1-Spiegeln in Beziehung steht, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Osteoporose, Atherosklerose, Krebs und einer Immunerkrankung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Polymorphismus ein Thymin an Position –509bp ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Polymorphismus ein Adenin an Position –800bp ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Amplifizieren eines Abschnitts des TGF-β1-Promotors des Individuums unter Verwendung von PCR-Techniken.
Diagnosemittel, umfassend PCR-Primer, die angepasst sind, einen Bereich eines TGF-β1-Promotors zu amplifizieren, wobei der Bereich ein oder beide von (a) einem Nucleotid an Position –800bp, oder (b) einem Nucleotid an Position –509bp auf einem TGF-β1-Gen umfasst.
Diagnosemittel gemäß Anspruch 5, umfassend PCR-Primer, die angepasst sind, einen DNA-Abschnitt zu amplifizieren, der ein Nucleotid an Position –800bp auf einem TGF-β1-Gen umfasst.
Diagnosemittel gemäß Anspruch 5, umfassend PCR-Primer, die angepasst sind, einen DNA-Abschnitt zu amplifizieren, der ein Nucleotid an Position –509bp auf einem TGF-β1-Gen umfasst.
Diagnosemittel gemäß Anspruch 6, wobei die PCR-Primer SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 sind.
Diagnosemittel gemäß Anspruch 7, wobei die PCR-Primer SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 sind.
Diagnosemittel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, das ferner ein Enzym wie eine Restriktionsendonuclease umfasst, die fähig ist, einen Wildtyp-TGF-β1-Promotor an Position –800bp zu schneiden, und die nicht fähig ist, eine Variante des Wildtyp-Promotors zu schneiden, in der das Nucleotid an Position –800bp Adenin ist.
Diagnosemittel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, das ferner ein Enzym wie eine Restriktionsendonuclease umfasst, die fähig ist, einen Wildtyp-TGF-β1-Promotor an Position –509bp zu schneiden, und die nicht fähig ist, eine Variante des Wildtyp-Promotors zu schneiden, in der das Nucleotid an Position –509bp Thymin ist.
Diagnosekit, der Mittel nach einem der Ansprüche 5 bis 11 umfasst.
DNA, die aus einem TGF-β1-Promotor oder einem Fragment davon mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden besteht, in dem Guanin an Position –800bp durch Adenin ersetzt ist, oder DNA, die dazu komplementär ist.
DNA, die aus einem TGF-β1-Promotor oder einem Fragment davon mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden besteht, in dem Cytosin an Position –509bp durch Thymin ersetzt ist, oder DNA, die dazu komplementär ist.
In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Osteoporose oder einer Veranlagung für Osteoporose, wobei eine Veranlagung für Osteoporose mit einem TGF-β1- Promotorgen in Beziehung steht, das sich von der Wildtyp-Promotorsequenz, wie in 5 gezeigt, unterscheidet.
Verfahren gemäß Anspruch 15, in dem eine Veranlagung für Osteoporose mit einem TGF-β1-Promotor in Beziehung steht, in dem an Position –800bp ein Guanin-Nucleotid durch ein Adenin-Nucleotid ersetzt ist.
In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Atherosklerose, wobei eine Veranlagung für Atherosklerose mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, das sich von der Wildtyp-Promotersequenz, wie in 5 gezeigt, unterscheidet.
In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs, wobei eine Veranlagung für Krebs mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, das sich von der Wildtyp-Promotersequenz, wie in 5 gezeigt, unterscheidet.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei eine Veranlagung für Krebs mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, in dem Cytosin an Position –509bp durch Thymin ersetzt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, in dem eine Veranlagung für Krebs mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, in dem an Position –800bp ein Guanin-Nucleotid durch ein Adenin-Nucleotid ersetzt ist.
In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer Immunerkrankung, wobei eine Veranlagung für Immunerkrankung mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, das sich von der Wildtyp-Promotorsequenz, wie in 5 gezeigt, unterscheidet.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Veranlagung für Immunerkrankung mit einem TGF-β1-Promotorgen in Beziehung steht, in dem Cytosin an Position –509bp durch Thymin ersetzt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, in dem eine Veranlagung für eine Immunerkrankung mit einem TGF-β1-Promotor in Beziehung steht, in dem an Position –800bp ein Guanin-Nucleotid durch ein Adenin-Nucleotid ersetzt ist.
Sonde zur Identifizierung eines Polymorphismus eines TGF-β1-Promotors, die einen Abschnitt der DNA des Promotors umfasst, in dem Guanin an Position –800bp durch Adenin ersetzt wurde, oder Cytosin an Position –509bp durch Thymin ersetzt wurde, oder einen DNA-Abschnitt, der dazu komplementär ist.
Sonde gemäß Anspruch 24, mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden.