DE69825888T2

DE69825888T2 - Diagnostisches verfahren der alzheimer-erkrankung

Info

Publication number: DE69825888T2
Application number: DE69825888T
Authority: DE
Inventors: Marie-Christine Chartier-Harlin; Jean-Charles Lambert; Philippe Amouyel
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: DE69825888D1; WO1999001574A1; EP0983391A1; CA2295865C; CA2295865A1; JP2002510975A; FR2765591B1; FR2765591A1; AU8346498A; JP4358311B2; US6391553B1; EP0983391B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit.
Die Alzheimer Krankheit ist eine neurogenerative Krankheit die durch einen Verlust der Rückemnarkneuronen gekennzeichnet ist und die mit β-amiloiden Plaques, der Verflechtung von Neurofibrillen und, in den meisten Fällen, der Amiloid-Angiopathie, verbunden ist. Es existieren starke Anzeichen für einen genetischen Einfluss in der Etiologie der Alzheimer Krankheit (WO 94/01772).
Diese genetische Komponente ist seit mehreren Jahren durch indirekte Beobachtungen nachgewiesen worden, die eine Vererbbarkeit bei dem dominanten autosomen Modus und eine vom Alter abhängige Durchdringung nahe legen um gewisse familiäre Formen der Alzheimer Krankheit zu erklären. Neuere molekulargenetische Studien haben es ermöglicht, putative Gene der Alzheimer Krankheit mit Hilfe der Suche spezifischer polymorpher genetischer Marker von Chromosomen zu isolieren (Bird et al., 1989, Neurobiology of Aging 10, 432–434).
Es wurden vier implizierte Chromosomenplätze beschrieben: drei auf den Chromosomen 1, 14 und 21 in den familiären Formen mit vorzeitigem Auftreten (Alter des Auftretens unter 60 Jahre), und einer auf dem Chromosom 19 in den familiären und sporadischen Formen mit verspäteten Auftreten. Drei Verbindungsstudien haben empfohlen, dass die Chromosomenregion 19q13.2 mit familiären Formen der Alzheimer Krankheit mit verspätetem Auftreten in Verbindung stehen (Pericak-Vance et al., Am. J. Hum. Genet. (1991) 48, 1034–1050). Bei dieser Chromosomenregion ist die Gruppe von Genen der Alipoproteine (APO) E-Cl-Cl'-Cll eine Kandidatenregion. Von den Produkten dieser Gene ist das Alipoprotein E (APOE) stark beim Nervensystem impliziert. APOE ist in den senilen Plaques vorhanden und besitzt eine Bindungsaffinität mit dem Peptid Aβ. APOE ist durch zwei Hauptallele ε2, ε3 und ε4 gekennzeichnet. Strittmatter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1993), 90, 177–181) haben ein erhöhtes Auftreten des Allels ε4 des Gens APOE in den familiären Formen der Alzheimer Krankheit mit späten Auftreten beschrieben.
Diese Beobachtung wurde für die Familiären Formen (Corder et al. Science, (1993), 261, 921–923) und die sporadischen Formen der Alzheimer Krankheit (Corder et al. Science, (1993), 261, 921–923; Saunders et al. Neurology (1993, 13, 1467–1472) bestätigt.
FR-2 716 894 beschreibt ein Verfahren, welches es ermöglicht, für einen bestimmten Kranken die Risiken vorherzusagen, die Alzheimer Krankheit in Bezug auf eine Gesamtpopulation zu entwickeln. Dieses Verfahren beruht auf dem Nachweis der Allele ε4 des Gens APOE, der kurzen Allele des Markers D19S178 und der langen Allele des Gens APO Cll, wobei alle auf dem Chromosom 19 legen.
Mehrere Hypothesen erlauben es, dieses Phänomen zu erklären.
Neuere Arbeiten der Erfinder und Autoren der vorliegenden Erfindung kommen dazu, die Hypothese der Existenz mindestens einer anderen funktionellen Mutation in der Region 19q13.2 zu bestätigen.
Außer einer funktionellen Wirkung die dem Polymorphismus des Alipoproteins E eigen ist, zeigen die Studien der Erfinder signifikative Unterschiede im Expressionsniveau bei den kranken Personen in Bezug auf gesunde Vergleichspersonen, was anzeigt, dass eine oder mehrere Mutationen in der Regulierungsregion des Gens APOE mit dem Auftreten der Alzheimer Krankheit impliziert sind. Außerdem findet man relative Expressionsunterschiede bei den Vergleichspersonen.
Die Erfinder haben insbesondere einen neuen Polymorphismus in der Region des Promoters des kodierenden Gens für das Protein Alipoprotein E nachgewiesen, das sich an einem Ort der potentiellen Fixierung der Transkriptionsfaktoren Th1/E47cs befindet.
Für die Bestimmung dieses Polymorphismus wird als eferenz die Sequenz genommen, die von Paik et al. (1985, Proc. Naztl. Aca. Sci, vol. 82, p 3447) beschrieben worden ist.
Dieser Polymorphismus wurde von den Erfindern Th1/E47cs für Th1/E47cs für Consensus genannt, in dem Masse indem er in einer Fixierungskonsensussequenz des Transkriptionsfaktors Th1/E47cs befindet.
Die nachgewiesene Mutation ist gekennzeichnet durch die Substitution eines Thymins in Guanin (G→T) in der Sequenz
GGGTGTCTGT(oder G) ATTACTGGG,
wobei G das häufigste Allel in der normalen Bevölkerung ist (normale Pompulation) Die Allele die diesem Polymorphismus entsprechen werden nachfolgend als T (die Basis ist also das Thymin) oder als G bezeichnet (wenn die Basis das Guanin ist).
Die Bestimmung des Allels kann nach Amplifikation durch PCR der ADN-Region der diesen Polymorphismus aufweist, auf folgende Weise durchgeführt werden:

– entweder Erzeugung einer Spaltstelle in einer der Starter des PCR für ein Restriktionsenzym, das nicht bei Individuen vorkommt, die eines der Allele tragen,
– oder durch eine Hybridierungstechnik, die spezifische Oligonucleotidsonden der Allele benutzt.

Die Erfinder haben den Einfluss des Polymorphismus Th1/E47cs auf die Expression der Allele des Gens des APOE studiert und eine Erhöhung des Risikos die Alzheimer Krankheit in Verbindung mit dem Allel T von Th1/E47cs, das diesem Allel eigen ist und nicht wegen des Allels ε4 zu entwickeln festgestellt.
Außerdem moduliert der Polymorphismus Th1/E47cs das bei den Individuen mit dem Genotyp ε3/ε4 mit dem Allel ε4 verbundene Risiko, wobei die Individuen mit dem Genotyp GT ein in Bezug auf die homozygoten Individuen für den Polymorphismus Th1/E47cs erhöhtes Risiko aufweisen, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln. Während sie diese Beobachtung bestärken, haben die Autoren glauben, dass die Verbindung des Allels T von TH1/E47cs mit dem Allel ε4 auf demselben Chromosom der ungünstigsten Kombination entspricht.
Die Erfindung hat also ein Diagnoseverfahren der Alzheimer Krankheit zum Ziel, wobei der Nachweis einer oder mehrerer Mutationen in der Region des genomischen ADN der Regulierung der Genexpression des Alipoproteins E eingeschlossen ist und wobei eine Expressionsmodifikation des Gens des Alipoproteins E in Bezug auf eine Referenzbevölkerung oder eine relativen Expressionsmodifikation der Allele des Gens des Alipoproteins E induziert wird.
Man versteht unter Diagnose im Sinne der vorliegenden Erfindung die Bestätigung einer Mutation in der Region der Regulierung des Gens APOE bei einem Patienten dessen klinischer Aspekt eine Symptome aufweist, die der Alzheimer Krankheit zugeschrieben werden können oder auch eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Individuen in Bezug auf die Gesamtheit einer Bevölkerung, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, wobei die Zunahme der Wahrscheinlichkeit statistisch signifikativ ist.
Die Region des Chromosomen -ADN zur Regulierung des Gens APOE wird breit definiert, d. h. dass es die Chromosomenregion 19q13.2 ist, die sich von der Region die für das Apolipoprotein E kodiert, unterscheidet (Human Molecular Genetics, 1994, vol. 3, n°4, 569–574).
Vorteilhafterweise liegt die Chromosomenregion in dem eine oder mehrere Mutationen nachgewiesen werden zwischen dem Marker D19S178 und dem Gen APOCII, und umfasst insbesondere die Introns und die angrenzenden Bereiche des Gens APOE, wobei er sich über eine Entfernung von 5 kb oberhalb und unterhalb des Gens APOE erstreckt.
Die Erfindung hat insbesondere zum Gegenstand ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit das den Nachweis mindestens einer Mutation in dem Promotor des Gens APOE umfasst, die 186 Basen von TATA-Box dieses Gens entfernt ist, wobei die Mutation insbesondere aus dem Austausch T → G in der oben definierten Sequenz besteht.
Insbesondere besteht das Verfahren daraus, eine oder mehrere Mutationen in der Region des Promotors des für das Alipoprotein E kodierenden Gens zu suchen, die sich insbesondere in einem potentiellen Fixierungsort der Transkriptionsfaktoren Th1/E47 befindet.
Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit, dass die Bestimmung des Genotyps des Alipoproteins E und die Suche einer Mutation der oben beschriebenen Art in der Region der Regulierung des Gens APOE umfasst.
Entsprechend diesem Diagnoseverfahren orientiert die Anwesenheit mindestens eines Allels ε4 des Alipoproteins E zusammen mit der Existenz einer Mutation in der Region der Regulierung des Gens APOE, insbesondere einer oben definierten Mutation die eine Modifikation der Expression des Gens APOE oder eventuell eine relative Expressionsdifferenz der Allele des Alipoproteins E auf die Diagnose einer Alzheimer Krankheit bei Patienten dessen klinische Erscheinung Symptome aufweist, die einer Alzheimer Krankheit zugeschrieben werden können oder es erlaubt, diese gesunden Individuen in eine Kategorie mit einem erhöhten Risiko eine Alzheimer Krankheit zu entwickeln, einzuordnen.
Man versteht unter einer relativen Expressionsdifferenz eine Expressionsdifferenz eines Allels in Bezug auf ein anderes, und zwar unabhängig vom absoluten Expressionsniveau des Gens;
Die Untersuchung des Allels ε4 wird mit jedem geeigneten Verfahren durchgeführt das auf der Anwesenheit eines Restes ARD in der Position 112 des Alipoproteins E für das Allel ε4, eines Restes CYS in der Position 158 für das Allel ε2, in Bezug auf die Reste CYS und ARG in diesen Positionen für die verbreiteteste Isoform ε3, basiert ist.
Der Nachweis einer zusätzlichen Mutation in den oben definierten Regionen der Regulierung des Gens APOE wird durch jedes geeignete Verfahren durchgeführt, insbesondere ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit, das den Nachweis mindestens einer Mutation im Promotor des kodierenden Gens umfasst, wobei diese Mutation 185 Basen von der TATA-Box dieses Gens entfernt ist.
Die Anwesenheit mindestens eines Allels ε4 des Gens APOE, mindestens eines kurzen Allels des Markers D19S178 und mindestens eines langen Allels des Gens APO CII wie es in FR 2 716 894 beschrieben ist und die Anwesenheit mindestens einer Mutation in der Region der Regulierung des Gens APOE tragen stark dazu bei, die Diagnose der Alzheimer Krankheit bei symptomatischen Patienten zu orientieren oder stellen einen wichtigen Risikofaktor bei unsymptomatischen Patienten dar.
In dem Masse in dem die an der Alzheimer Krankheit beteiligte Mutation bzw. die an der Alzheimer Krankheit beteiligten Mutationen eine Variation der relativen Expression der Allele des Gens APOE im Gehirn hervorrufen, ist es auch möglich, anstatt oder zusätzlich einer Mutation in den Regionen der Regulierung des oben definierten Gens APOE, den Expressionsgrad des Gens APOE zu bestimmen und diesen Expressionsgrad mit dem der Gesamtpopulation zu vergleichen.
Das auf der Bestimmung des Expressionsgrads des Alipoproteins E basierte Diagnoseverfahren ist besonders interessant bei heterozygoten Patienten, die insbesondere Träger des Allels ε4 sind. Bei diesen Patienten weist das Diagnoseverfahren im Sinne der Erfindung vorteilhafterweise die Bestimmung des Expressionsgrads des Allels ε4 in Bezug auf das Allel ε2 oder ε3 auf.
Auf gleiche Weise umfasst das Diagnoseverfahren bei den Individuen des Genotyps ε2/ε3 vorteilhafterweise die Bestimmung des Expressionsgrads des Allels ε2 in Bezug auf das Allel ε3.
Eine signifikative Erhöhung oder Senkung des Expressions-/Transkriptionsgrads des Allels ε4 bei einem heterozygoten Individuum ε4ε2 oder ε4ε3 und des Allels ε2 bei einem heterozygoten Individuum ε2ε3 orientiert die Diagnose auf eine Krankheit vom Typ Alzheimer, wenn der Patient übrigens ein Erscheinungsbild aufweist, das die Symptome der Alzheimer Krankheit nahe legt. Bei einem Patienten, der keine offenkundigen klinischen Anzeichen aufweist, zeigt die Expressionszunahme bzw. -abnahme der Allele ε4 und ε2 eine erhöhte Wahrscheinlichkeit bei diesem Patienten an, später die Alzheimer Krankheit zu entwickeln.
Die Bestimmung des Expressionsgrades des Gens APOE und insbesondere der Allele ε4 und ε2 des Gens APOE wird vorteilhafterweise entweder durch das Messen des relativen Anteils der ARNm des Gens APOE durchgeführt oder dadurch bestimmt, indem das Transkriptionsverhältnis des Allels ε4 in Bezug auf das Allel ε2 oder ε3 für den Fall von genotypen Patienten ε4ε2 und ε4ε3 bestimmt wird oder indem das Transkriptionsverhältnis des Allels ε2 in Bezug auf das Allel ε3 für den Fall von genotypen Patienten ε2ε3 bestimmt wird.
Der Transkriptionsgrad wird nach der Extraktion der ARNm der Gewebe der Biopsie oder der Kulturzellen und der Amplifikation durch RT-PCR (Polymerisierungskettenreaktion durch inverse Transkription) mit Hilfe von spezifisch geeigneten Startern des Allels von dem man den Expressionsgrad messen will gemessen.
Das benutzte Gewebe stammt z. B. aus einer Biopsie von Gehirngewebe, insbesondere der Frontallappen, wodurch es ermöglicht wird, den Expressionsgrad der Allele des APOE im Gehirn zu messen. Es ist ebenfalls möglich, den Expressionsgrad der ARNm des APOE in den Lymphozyten oder Fibroblasten zu bestimmen, die in eine Zellkultur gebracht worden sind. Allgemein ist es möglich, den Transkriptionsgrad der Allele des APOE in jedem beliebigen Gewebe, das eine Änderung des Expressionsprozentsatzes von einem Allel in Bezug auf ein anderes aufweisen kann zwischen den Patienten und den Kranken zu bestimmen. Dieses Verfahren kann ebenfalls für die Entwicklung und Benutzung von Zellmodellen oder Tiermodellen die Allele des APOE benutzen, angewendet werden.
Das Expressionsverhältnis von Allelen des Gens APOE wird auf folgende Weise bestimmt:

a) ADNc wird einer Amplifikation durch PCR unter Gegenwart von Startern unterzogen, wodurch eine spezifische Amplifikation mindestens einer polymorphen Sequenz der Allele ermöglicht wird;
b) Das amplifizierte ADN wird der Einwirkung mindestens eines Restriktionsenzyms unterzogen, wodurch die Differenzierung der Allele ermöglicht wird;
c) Die ADN-Fragmente werden getrennt;
d) Die erhaltene Fragmentmenge wird mit Hilfe eines ein detektierbaren Signal abgebenden Markers evaluiert;
e) Das Anfangsverhältnis der verschiedenen Allele wird durch folgende Formel bestimmt:

A ist der Proportionalitätskoeffizient, der es ermöglicht, den Größenunterschied zwischen den verschiedenen Restriktionsfragmenten zu korrigieren und ist gleich dem Längenverhältnis der kennzeichnenden Restriktionsfragmente jedes Allels, und α' wird folgendermaßen bestimmt:

– entweder durch folgende Formel α' = DOmax/K'in der DOmax die maximale optische Dichte, die gemessen werden kann, ist.

K' ist eine Konstante, wobei DOmax und K' durch folgende Funktion f bestimmt werden: DO = f(V) = (DOmax/(K' + V)) × V
Worin V das durch PCR erhaltene Probenvolumen ist, das dem Schritt c) unterzogen wird und DO die gemessene optische Dichte ist:

– entwerder durch die folgende Funktion g: 1/DO = g(1/V) = (1/α') × (1/V) + 1/DOmaxworin DO die gemessene optische Dichte, V das durch PCR erhaltene dem Schritt c) unterzogene Probenvolumen und DOmax die maximal messbare optische Dichte ist; wobei der Amplifikationskoeffizient E1 des das Allel 1 enthaltenen ADN für die verschiedenen Allele des APOE gleich dem Ampflifikationskoeffizienten E2 des das Allel 2 enthaltenen ADN ist.

Das im Schritt a) amplifizierte ADN ist erfindungsgemäss ein ADN c das die Allelsequenzen aufweist, die von Interesse sind, die aus einem ARNm durch die gebräuchliche Technik des RT-PCR erhalten worden sind. Die Allele wurden gemäss den oben beschriebenen Schritten b) und c) differenziert, mit deren Hilfe die Restriktionspolymorphisemen nachgewieden werden (RFLP).
Die Trennung der ADN-Fragmente nach dem Schritt c) kann insbesondere durch Gel-Elektrophorese, bevorzugt durch eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese durchgeführt werden.
Im Falle des Gens APOE können die Allele ε3, ε2 und ε4 durch die jeweiligen Restriktionsfragmente 91 pb, 83 pb und 72 pb gekennzeichnet werden.
Der Proportionalitätskoeffizient A kann also mit folgenden Ergebnissen berechnet werden: : A = 91 : 72 für die Individuen ε3/ε4, A = 83/72 für die Individuen ε2/ε und A = 91/83 für die Individuen ε2/ε3. Es ergibt sich für diesen letzten Genotyp, da die zwei Allele ε2 und ε3 eine Restriktionsfragmentlänge von 91 pb ergeben, ein Verhältnis ADO_Allel1 + ADO_Allel2 = DO_91pb.
Dieses Verfahren ist außerdem ausgesprochen einfach. Es genügt in der Tat, entweder den Wert der optischen Dichte (DO) in Abhängigkeit vom Probenvolumen V zu übertragen, wobei die für die Funktion f repräsentative Kurve wie DO = f(V) gezeichnet werden kann, indem die Methode der kleinsten Quadrate benutzt wird und DOmax und K' erden mit Hilfe dieser Kurve bestimmt; oder den Wert A1/D in Abhängigkeit von dem umgekehrten Wert des Probenvolumens zu übertragen, d. h. 1/V, wobei die repräsentative Kurve der Funktion g wie 1/DO = g(1/V) mit Hilfe der linearen Regression gezeichnet werden kann, wobei die Neigung der erhaltenen Geraden gleich dem umgekehrten Wert von α' ist.
Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer Krankheit, das die Bestimmungen der Phase der verschiedenen Polymorphismen ε Th1/E47cs und eventuell –491 und 1E1 umfasst, wodurch ein erhöhtes Risiko entsteht, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln.
Für die Genotyp-Population ε3ε4 ist as mit dem Genotyp GT verbundene Risiko höher als das, das mit dem Genotyp GG verbunden ist. Diese Beobachtung könnte, indem die Phase der Polymorphismen Th1/E47cs und ε2, ε3 und ε4 des APOE berücksichtigt wird, erklärt werden. Für die Heterozygoten GT und ε3ε4 hängt das Risiko, die Krankheit zu entwickeln von der Verbindung des Allels G und des Allels ε4 auf demselben Chromosom ab, wodurch so die Phase der Polymorphismen ε und Th1/E47cs des APOE bestimmt wird. Nach dieser Phase bestehen zwei Möglichkeiten (i) ein größerer Expressionsgrad von ε4, (ii) ein größerer Expressionsgrad des Allels ε3. Die erste Möglichkeit würde ein physiologische Antwort zugunsten der Eigenschaften des Isomorphs APOε4 nach sich ziehen und würde in der Tat eine markierte Wirkung bei Individuen erklären, die Träger der Genotypen ε3ε4 und GT sind. Dieser mit der Phase verbundene Unterschied des Expressionsgrads stimmt für alle heterozygoten Genotypen. Das mit dem Allel G verbundene Risiko wird möglicherweise wegen der verschiedenen möglichen Kombinationen zwischen den Polymorphismen ε und Th1/E47cs des APOE gedämpft.
Erfindungsgemäß wird die Phase der Polymorphismen des APOE und des Th1/E47cs auf folgende Weise untersucht:
Ein die Polymorphismen ε von APOE und TH1/E47cs enthaltenes Fragment mit 4600 pb wird durch PCR amplifiziert. Diese Amplifikation wird durchgeführt indem das „Extend long template System" (Boehringer) mit dem sens-Oligonukleotid benutzt wird
und für das antisens-Oligonucleid:
Das Amplifikationsprodukt wird anschließend von dem Restriktionsenzym Afl/// verdaut, von dem die einzige Spaltstelle auf dem amplifizierten Fragment es erlaubt, das Allel ε4 vom Allel ε3 zu unterscheiden. Nach der Migration des Verdauungsprodukts auf dem 0,8%-Agarosegel wird das ADN auf die Nitrozellulosemembran transferiert und unter UV fixiert. Die Unterscheidung zwischen dem Allel T und dem Allel G wird durch ein Protokoll durchgeführt, das dem ähnlich ist, das für die Genotypbestimmung dieses Polymorphismus durch ASO benutzt wird.
In Abhängigkeit von den Phasen der Polymorphismen APOE und Th1/E47cs, ist es möglich, Untergruppen von kranken Individuen zu definieren und für jede Gruppe die optimale Therapie zu bestimmen. Ebenso könnte sich die Bestimmung der Phase mit anderen Polymorphismen von Regulierungsregionen des Gens APOE, die seine Expression beeinflussen können (oder nicht), wie z. B. –491 AT, das von Bullide et al. beschrieben worden ist, 1E1, APO CI, APO CII und D19S178, als nützlich für die Bestimmung von Risikountergruppen von Individuen mit einem erhöhten Risiko die Krankheit zu entwickeln, erweisen.
So weiß man, dass die Individuen, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind, für gewisse Therapien, insbesondere für die cholinomimetischen Therapien, in Abhängigkeit vom Typ und der Anzahl der Kopien der Allele des Gens APOE disponiert sind.
Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand ein Identifizierungsverfahren von Individuen, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind und die auf eine gegebene Therapie, z. B. cholinomimetisch, ansprechbar sind, die folgendes umfasst:

a) Bestimmung des Genotyps des Alipoproteins E;
b) Bestimmung des Genotyps des Polymorphismus Th1/E47cs;
c) Eventuell die Bestimmung der Phase der Polymorphismen des Alipoproteins.

Die verschiedenen Polymorphismen von APOE und von Th1/E47cs können benutzt werden, um Tier- bzw. Zellmodelle zu erzeugen, die mehr oder weniger gut APOE exprimieren, die alleine oder kombiniert mit den genetischen Faktoren benutzt werden, die in der Lage sind, die Entwicklung der Krankheit, wie APP, PS1, PS2, usw. oder die anderen Marker der Alzheimer Krankheit, wie die anormale Phosphorylierung des Proteins Tau zu beeinflussen.
Die Erfindung hat ebenfalls zum Gegenstand einen Transfektionsvektor für eukaryotische Zellen, der mindestens ein Allel des Gens APOE und ein Allel des Polymorphismus Th1/E47cs und eventuell ein oder mehrere andere Allele anderer Gene oder Marker, die diesem Gen nahe sind, und die in der Lage sind, das Risiko zu verändern, eine Alzheimer Krankheit in Bezug auf eine normale Population zu entwickeln, umfasst.
Diese Vektoren können für die Produktion von transfizierten eukaryotischen Zellen oder von nicht menschlichen transgenen Tieren benutzt werden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht also aus mit Hilfe eines oben definierten Vektors transfizierten eukaryotischen Zellen oder mit Hilfe eines solchen Vektors produzierter transgener nicht menschlicher Tiere.
Im folgenden werden die Ergebnisse einer Studie der Expressionsgrade der ARNm des Gens APOE im Gehirn angegeben.
BEISPIEL 1
Expression des Gens APOE im Gehirn bei Kranken die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind in Bezug auf gesunde Vergleichspersonen
1) Extraktion der ARN und Amplifikation der Transkripte
Die Gewebe wurden unter Vergleichspersonen, die 65 Jahre oder älter waren und bei Patienten mit einem heterocygoten APOE-Genotyp, die an der Alzheimer Krankheit mit verspätetem Auftreten, bei denen die Diagnose durch eine neuropathologische Untersuchung bestätigt worden war, ausgewählt.
Die Extraktion der ARN ist bei Proben der Frontallappen, wie sie im J. Biol. Chem. 247, 4621–4627 (1972) beschrieben worden sind, durchgeführt worden oder indem ein Extraktionsset (Quiagen) benutzt und das ARN anschließend durch DNase (Eurogentec) verdaut wurde. RT-PCR ist mit Hilfe von Startern durchgeführt worden, die in J. Lipid. Res. 31, 546–548 (1990) beschrieben worden sind. Die inverse Transkriptionsreaktion wurde mit Hilfe des Starters F4 (5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3') bei 50 pmolar mit 1 μg totales ARN als Matrix für die inverse Transkriptase M-MLV., entsprechend den Anweisungen des Herstellers Gibco/BRL) durchgeführt. PCR wurde bei 94°C während 10 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 58°C während 1 Minute, 72°C während 1 Minute und 94°C während 1 Minute durchgeführt.
Das Reaktionsvolumen von PCR mit 25 μl enthielt den Starter F6 (5'-TAA GCT TGC CAC GGC TGT CCA AGG-3') mit 50 pmolar dNTP mit 0,5 mM, MgCl₂ bei 0,1 mM, Triton X-100 bei 0,1%, Glyzerin bei 15% und Taq-Polymerase mit 0,05 Einheiten (Eurogentec).
Die Berechnungsmethode der differentiellen Expression der ARNm ist die oben beschriebene.
DO wurde durch die Software^® Imagemaster (Pharmacia) bestimmt.
Die Länge der Restriktionsfragmente wurde mit 91 pb für das Allel ε3, 83 pb für das Allel ε2 und 72 pb für das Allel ε4 bestimmt.
Der Wert des Koeffizienten A entspricht für die Genotypen ε3ε4 und ε2ε3 jeweils den Werten A = 91/72 und A = 83/72. Der Genotyp ε2ε3 wird durch die Bänder bei 94 und 83 pb gekennzeichnet. Da die beiden Allele ε2 und ε die Restriktionsfragmente mit 91 pb ergeben, erhält man in diesem Fall AODε2 = ODε3 = OD91 pb.
2) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind auf die 1 bis 4 übertragen worden:
Die 1 stellt die durch RT-PCR amplifizierten Produkte nach der Kolorierung dar.
Die 2 stellt die Expression von ARNm von heterocygoten Individuen ε2ε3, ε3ε4 und ε2ε4, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind und von Vergleichspersonen, dar. Die schwarzen Striche stellen die Mittelwerte dar. Die Pfeile stellen die erwarteten Werte des Expressionsgrads des Allels ε4 bei den genotypischen Individuen ε2/ε4 dar. Diese Werte sind aus den Prozentwerten, die für die Allele ε2 und ε4 jeweils bei den genotypischen Individuen ε2/ε4 und ε3/ε4 beobachtet worden sind, bestimmt worden.
Die 4 stellt das Maß des Expressionsgrads des Allels ε4 bei gesunden jungen Individuen dar, die keine kognitiven Störungen im Augenblick der Entnahme und bei geistesgestörten Individuen dar, die eine wahrscheinliche Diagnose für die Alzheimer Krankheit aufweisen.
Die 3 stellt den Extraktionsgrad des Allels 4 bei den Patienten und Vergleichspersonen in Abhängigkeit von Th1/E47cs und –491 AT dar. Die Vergleichsindividuen werden durch die Kreise und die Kranken durch die Dreiecke dargestellt. Die schwarzen Muster entsprechen entsprechen den heterocygoten genotypischen Individuen für den Polymorphismus –491 AT. Die mittleren Expressionen werden durch die schwarzen Balken dargestellt.
Die Anzahl der Individuen belief sich auf 49 für die Patienten, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind und auf 46 für die Vergleichspersonen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression der ARNm des Allels ε3 in allen Fällen höher war als die vom ARNm des Allels ε4 und das in allen möglichen Fällen. Dieses Ergebnis stimmt mit allen bekannten Messungen der Pegel der Proteine APOE überein, die in den Gehirnen von Individuen gefunden wurden, bei denen der Genotyp bestimmt worden war. In dieser Studie ist gezeigt worden, dass das Niveau des APOE bei den Homocygoten ε3 höher war als das der Heterocygoten ε3ε4, das seinerseits höher war als das der Homocygoten ε4. Indem man de einen zu den anderen hinzufügt, so können diese Ergebnisse nahe legen, entweder dass ein Stabilitätsunterschied der verschiedenen ARNm-Spezies existiert oder dass eine genetische Veränderlichkeit der Expression der beiden Allele existiert, die im Ungleichgewicht bedeutender Unterschied in dem Expressionsverhältnis der Allele zwischen den Patienten und den Vergleichspersonen besteht, ist die zweite Hypothese wahrscheinlich die richtige. Die an der Alzheimer Krankheit erkrankten Patienten weisen eine höhere relative Expression des ε4 der ARNm als die Vergleichspersonen auf (34,9 +/– 2,7% gegenüber 22,9 +/– 2,4; p < 0,0001 durch einen nicht parametrischen Test von Mann und Whitney) (1). Es wurde auch eine Erhöhung der Expression des Allels < 4 bei den genotypischen Patienten ε2ε4 im Vergleich zu den Vergleichspersonen des gleichen Genotyps (46,0 +/– 5,4% gegenüber 28,0 +/– 2,8%, p < 0,01) detektiert. Es wurde hingegen eine signifikative Verringerung der relativen Expression des Allels ε3 im Gehirn von genotypischen Patienten ε2ε3 in Bezug auf Vergleichspersonen des gleichen Genotyps (32,8 +/– 4,5% gegenüber 47,8 +/– 3,9%; p < 0,002) (1) nachgewiesen. Da die gemessenen Werte bei den kranken Individuen oder den genotypischen Vergleichspersonen ε2ε4 den aus anderen Genotypen (1) geschätzten Werten entsprechen, werden die erhaltenen Daten bestätigt.
Um zu wissen, ob der Expressionsunterschied der Allele des APOE hirnspezifisch ist bzw. in anderen, leichter zu erhaltenden Geweben an lebenden Patienten (Lymphozyten, Fibroblasten, ...) erhalten werden kann, haben die Autoren die differentielle Expression der Allele des APOE in den Lymphozyten untersucht. Nachfolgend werden die Ergebnisse dieser Studie angegeben.
BEISPIEL 2: Expression in den Lymphozyten des Gens APOPE bei Individuen, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind und jungen Individuen die im Augenblick der Studie keine kognitiven Störungen aufgewiesen haben
1) Trennung der Lymphozyten und Einbringung in eine Kultur
Es wird eine Blutentnahme an Individuen, die wahrscheinlich an einer Alzheimer Krankheit erkrankt sind und Individuen die keine kognitiven Störungen im Augenblick der Studie aufwiesen, vorgenommen. Alle diese Individuen weisen die Besonderheit auf, vom Genotyp ε3ε4 zu sein.
Die Trennung der Lymphozyten wird auf einer Leucosep-Röhre mit einem Fcoll-Gradienten durchgeführt. Nach mehreren Waschungen der Lymphozyten mit RPMI, werden diese in Suspension in eine RMPI 10% SVF, 2 mM Glutamat, 100 μM Streptopenizillin und 1% Phytohemaaglutinin (Gibco/Brl) umfassende Kultur gegeben. Die Zellkonzentration beläuft sich also auf 1 Million Zellen pro ml. Die Zellen werden z. B. während 48 Stunden in Suspension in Kultur gegeben.
2) Extraktion von ARNm und Amplifikation der Transkripte
Die benutzten Methoden sind die, die vorher im Beispiel 1 beschrieben worden sind.
3) Ergebnisse
Die Autoren beobachten bei allen untersuchten Individuen (Kranke oder Vergleichspersonen) ein höheres Expressionsniveau des Allels ε3 in Bezug auf das Allel ε4, wodurch die im Hirngewebe gemachten Beobachtungen gekreuzt wurden. In den Lymphozyten exprimieren die Kranken das Allel ε4 auf einem Niveau, das dem nahe ist, das bei den Hirnen des genotypischen Kranken ε3ε4 beobachtet worden ist. Bei den 7 potentiell kranken Individuen weisen alle einen Expressionsgrad des Allels ε4 auf, der dem ähnlich ist, der aus Hirnproben von Individuen erhalten worden ist, für die die Diagnose der Alzheimer Krankheit sicher ist.
Die Autoren haben die relative Expression des Allels ε4 bei 5 Individuen mit dem Genotyp ε3ε4 und die zwischen 23 und 55 Jahre alt waren und die im Augenblick der Entnahme keine kognitiven Störungen aufwiesen, untersucht. Dies hatte zum Ziel, zu bestimmen, ob eine Veränderung des Expressionsgrades des Allels ε4 bei Individuen die keine klinischen Anzeichen der Alzheimer Krankheit aufweisen, sichtbar sein kann. Es könnte also die Möglichkeit bestehen, die Individuen mit einem erhöhten Risiko, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, frühzeitig zu erkennen. Bei 5 untersuchten Individuen weisen alle einen Expressionsgrad auf, der nahe dem ist, der im Hirn der Vergleichspersonen beobachtet worden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Empfindlichkeit und die Spezifizität dieses Test also ausgezeichnet ist.
Als Schlussfolgerung ist es interessant, festzustellen, das der relative Expressionsgrad des Allels ε4 ähnlich ist im Hirngewebe von gesicherten Kranken vom Typ Alzheimer und den Lymphozyten von möglichen Kranken vom Typ Alzheimer. Ebenso scheint dieser Expressionsgrad ähnlich zu sein bei diesen beiden Zelltypen für die Personen, die keine kognitive Störungen aufweisen. Bis jetzt waren alle Hypothesen, die es darauf abzielten, die Rolle von APOE in die Alzheimer Krankheit zu implizieren, auf der Tatsache beruht, dass die verschiedenen Allee des APOE auf äquivalente Weise und mit identischer Konzentration im Hirn exprimiert waren. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen für das erste Mal, dass das nicht der Fall ist und dass die Allele auf unterschiedliche Weise exprimiert werden und dass dieser Unterschied deutlich markierter bei den Kranken ist, die an der Alzheimer Krankheit erkrankt sind in Bezug auf die Vergleichspopulation. Es wird im Augenblick dieselbe Art von Untersuchung für die anderen heterozygoten Genotypen von APOE und ebenso für eine absolute Quantifizierung von APOE für jeden beliebigen Genotyp vorgenommen.
Folglich stimmen die bis jetzt erhaltenen Ergebnisse überein mit der Existenz der Mutation in den Regulierungsregionen des APOE.
Im folgenden werden die Ergebnisse angegeben, die zum Nachweis des Polymorphismus Th1/E48cs geführt haben.
BEISPIEL 3
Kennzeichnung des Polymorphismus Th1/E47cs und sein Einfluss auf die Alzheimer Krankheit
1. APOE-Sequenzierung
Ein Fragment mit 375 Basenpaaren ist durch PCR mit den Startern für den Strang in der Richtung 5'ACTTTCTTTCTGGGATCCAGG3' und den Strang in der Gegenrichtung 5'ACTCAAGGATCCCAGACTTG3' amplifiziert worden. Die Amplifikation ist mit 35 Zyklen (Hybridisierungs-Temperatur der Oligonukleotide 53°C) in einem 1 mM MgCl₂ FINAL enthaltenden Puffer durchgeführt worden. Das erhaltene Fragment ist sequenziert worden, indem die in den Vorverarbeitungskits (USB-Amersham-T7 PCR-Produkt-Sequenzierungs-Kit) beschrieben Konditionen befolgt worden.
2. Detektion des Polymorphismus poly LBP1 durch ein Restriktionsenzym
Die Amplifikation eines Fragments von 228 Basenpaaren das den Polymorphismus poly LBP1 umfasst ist während 40 Zyklen bei Gegenwart von 0,5 mM MgCl2 und 0,5%DMSO durchgeführt worden. Die Hybridierungstemperatur der Oligonukleotide beläuft sich auf 53°C. Das antisens-Oligonukleotid ist mit dem identisch, das für die Sequenzierung benutzt wird. Das sens-Oligonukleotid ist folgendes: 5'AGAATGGAGGAGGGTGCCTG3'. In dicken Buchstaben ist das modifizierte Nukleotid dargestellt, das die Erzeugung einer Spaltstelle mit dem Allel 6 für das Restriktionsenzym Bstn erlaubt. Die Verdauunung wird während der ganzen Nacht bei 60°C durcheführt. Die Verdauungsprdukte werden werden auf einem 12%-Polyacrylamid-Gel getrennt (Acrylamid : bisacrylamid 19 : 1) und Ethidiumbromid-Bad gefärbt. Das Allel T ist gekennzeichnet durch ein Restriktionsfragment von 49 pb und das Allel G ist durch ein Restriktionsfragment von 31 pb gekennzeichnet.
3. Detektion des Polymorphismus durch Hybridisierung der spezifischen
Oligonukleotide jedes Allels (Ennealing Specific Oligonucleotide oder ASO)
Die zur Detektion des Polymorphismus poly LBP1 benutzte ASO-Technik basiert auf dem von Tiret et al. (1994, Lancet, vol. 344, 910–913) beschriebene Protokoll. Die für die Detektion des Polymorphismus ply LBP1 die Polygonukleotide betreffenden spezifischen Veränderungen und die Waschtemperaturen sind die folgenden: das spezifische Oligonukleotid des Allels G hat als Sequenz 5'GCCCAGTAATCCAGACACCC3' mit einer Waschtemperatur von 61°C, das spezifische Oligonukleotid des Allels T hat als Sequenz 5'GCCAGTAATACAGACACCC3' mit einer Waschtemperatur von 62°C.
4. Ergebnisse
Die erste in dieser Untersuchung benutzte europäische Polulation umfasst 310 Vergleichspersonen (Alter = 73,5 +/– 10,9; 37,3% Männer) und 293 Individuen die an sporadischen vorzeitigen und verspäteten Formen der Alzheimer Krankheit erkrankt sind (Alter = 74,6 +/– 9,3; Alter bei Beginn der Krankheit = 71, 0 +/– 8,9; 32,2% Männer). Bei dieser Population sind drei Polymorphismen des LOCUS von APOE getestet worden: der Polymorphismus Th1/E47cs der die vorher beschriebenen Methoden benutzt, der Polymorphismus 1E1 nach der von Mui und seinen Mitarbeitern benutzten Technik (Neurology, 1996, vol. 47, 196–201), der Polymorphismus von APOE nach der Technik von Hixon und Vernier (J. Lipid. Res. Vol. 31, 545–548). Die Anzahl der Individuen ändert sich in Abhängigkeit vom untersuchten Polymorphismus: Untersuchung von Th1/E47cs, 279 Kranke und 310 Vergleichspersonen, Untersuchung von 1E1, 293 Kranke und 307 Vergleichspersonen.
Um die statistische Aussagekraft der Untersuchung für die Analyse der heterozygoten Individuen für den Genotyp von APOE zu verbessern, haben die Autoren die Anzahl der Individuen des Genotyps ε3/ε4 verbessert, indem Individuen dieses Genotyps aus unabhängigen Populationen hinzugefügt wurden, um schließlich eine Gesamtsumme von 182 Kranken und 91 Vergleichspersonen zu erreichen (jeweils 73,3 +/– 8,5 und 70,3 +/– 8,5 Jahre).
Die Verteilung der drei untersuchten Polymorphismen wird in der Tabelle 1 dargestellt. Es ist für keinen dieser Polymorphismen eine Abweichung in Bezug auf das Gleichgewicht von Hardy-Weinberg beobachtet worden.
Die Tendenz, die Krankheit zu entwickeln, wird durch einen Annäherungsfaktor des relativen Risikos OR (für „Odd Ratio") ausgedrückt.
IC stellt das Vertrauensintervall bei 95% dar.
Die Ergebnisse sind in die Tabellen 1 bis 5 übertragen worden.
Erwartungsgemäß ist das Allel ε4 stark mit der Alzheimer Krankheit verbunden (O = 4,67, IC 95% [3,8–6,67]), während das Allel ε2 einen Schutzeffekt aufweist (OR = 0,27, IC 95% [0,14–0,52]). In der Vergleichspopulation ist das Allel G von Th1/E47cs am meisten repräsentiert (0,531), im Gegensatz zu dem was in der kranken Population (0,468) beobachtet worden ist. Die Allel- und Genotyp-Verteilungen sind signifikativ verschieden bei den Kranken in Bezug auf die Vergleichspersonen (jeweils p = 0,003 und p = 0,007). Das Allel T von Th1/47cs ist mit einem größeren Risiko verbunden, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln (OR = 1,29 IC 95% [1,02–1,63]) und das OR ist 1,79 (IC 95%) [1,21–12,53] p = 0,002) für die Individuen, die mindestens ein Allel T tragen. Für den Polymorphismus 1E1 sind die Allel- und Genotyp-Verteilungen signifikativ verschieden zwischen den beiden Populationen (jeweils p = 0,002 und p = 0,0005). Das Allel C von 1E1 ist mit einer Senkung des Risikos, die Krankheit zu entwickeln, verbunden (OR = 0,56 IC 95% [0,40–0,78] p = 0,0003.
Die Autoren haben das Verbindungsungleichgewicht zu zweit der verschiedenen untersuchten Polymorphismen untersucht (Tabelle 2). Ein signifikatives Verbindungsungleichgewicht existiert zwischen den Polymorphismen Th1/E47cs, 1E1 und des APOE. Anschließend haben die Autoren die durch diese drei Polymorphismen erzeugten Haplotypen abgeschätzt indem der Algorithmus von Myrid Haplotype (Tabelle 3) benutzt wurde. Die abgeschätzte Verteilung der Haplotypen ist signifikativ verschieden zwischen den Populationen der Kranken und der Vergleichspersonen. Um der starken Assoziierung des Allels ε4 mit der Alzheimer Krankheit Rechnung zu tragen, haben die Autoren außerdem die abgeschätzte Verteilung der Haplotypen in den Untergruppen mit dem Genotyp ε3/ε3 und ε3/ε4 verglichen, wobei diese Verteilung signifikativ verschieden zwischen Patienten und den Vergleichspersonen war (Tabelle 3). Diese Ergebnisse legen nahe, das die Polymorphismen Th1/E47cs und 1E1 eine eigene Wirkung in Bezug auf die Polymorphismen ε von APOE haben.
In der Gesamtpopulation (Kranke = 261 und Vergleichspersonen = 253) haben die Autoren das Risiko für die Individuen, die mindestens ein Allel von jedem der Polymorphismen besitzen, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, abgeschätzt, wobei diese Abschätzung in einem ersten Schritt unabhängig zwischen den Polymorphismen durchgeführt worden ist. Es wird also eine signifikative Wirkung für die Polymorphismen beobachtet (Tabelle 4). Sobald alle diese Polymorphismen simultan in einer logischen Regression berücksichtigt werden, bleiben die Wirkungen von Th1/E47cs und 1E1 bestehen und werden sogar größer, wodurch die Hypothese unterstützt wird, dass mehrere Polymorphismen im Locus von APOE existieren.
Wenn das Expressionsniveau der Allele von APOE durch die Existenz von Mutationen in cis in der Promoterregion des Gens APOE erhöht wird, müssen drei Implikationen überprüft werden: (1) die im Promoter gelegene Mutation muss die Expression der Allele von APOE modulieren, wodurch also die schädliche Wirkung des Allels 4 gezeigt wird oder wodurch die Schutzwirkung des Allels ε2 akzentuiert wird. (2) Unter der Vorraussetzung, dass das was das Risiko bestimmt, das relative Niveau der Expression der beiden Allele von APOE beiden heterozygoten Individuen ist, so darf diese Mutation nicht dieselbe Wirkung in der Population des homozygoten Genotyps haben. (3) Die Wirkung einer Mutation in cis bei den heterozygoten Individuen muss von der Phase dieses Polymorphismus mit den Allelen von APOE (d. h. haplotyp) abhängen. Bei den Individuen, die eine Kopie des heterozygoten Allels ε4 für den Genotyp von Th1/E47cs tragen, kann das Allel ε4 entweder mit dem Allel T oder mit dem Allel G von Th1/E47cs assoziiert werden. Eine diese Kombinationen dürfte das relative Expressionsniveau des Allels ε4 erhöhen und das des Allels ε3 verringern, wobei die andere Kombination die entgegengesetzte Wirkung hat.
So ist das Risiko die Alzheimer Krankheit zu entwickeln bei den Individuen des Genotyps ε3/ε4 verschieden zwischen heterozygoten und den homozygoten Individuen für Th1/E47. Um diese Hypothesen zu testen, haben die Autoren das Risiko, die Krankheit zu entwickeln (auf das Geschlecht und das Alter ajustiert) der heterozygoten Individuen für Th1/E47cs verglichen mit den homozygoten Individuen für diesen gleichen Polymorphismus verglichen. Nur die heterozygoten Individuen für den Genotyp Th1/E47cs und für den von APOE weisen eine Erhöhung des Risikos auf, die Krankheit zu entwickeln (OR = 2,40 IC 95% [140–4,12]; p = 0,001), wobei man diese Wirkung nicht für die homozygoten Individuen für den Genotyp von APOE (OR = 1,02 IC 95% [0,67–1,57] p = 0,91) findet. Diese Wirkung ist insbesondere in der Unterpopulation des Genotyps ε3/ε4 nachgewiesen worden, da das Risiko, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, für die heterozygoten Individuen für den Genotyp Th1/E47cs in Bezug auf die homozygoten Individuen für diesen Genotyp erhöht ist (OR = 1,90 IC 95% [0,97–3,70], p = 0,06; Kranke = 107 und Vergleichspersonen = 54). Diese Erhöhung des Risikos wird signifikativ, indem die Population des Genotyps ε3/ε4 vergrößert wird (OR = 2,07 IC 95% [1,21–3,54], p = 0,008; Kranke = 152 und Vergleichspersonen = 91) (Tabelle 5) Die Autoren haben unter Benutzung einer logischen Regression PAS A PAS gezeigt, dass das Risiko die Krankheit zu entwickeln, nur bei den heterozygoten Individuen für den Genotyp Th1/E47cs (OR = 1,89 IC 95% [1,07–3,35], p = 0,027) und nicht bei den heterozygoten Individuen für den Genotyp von 1E1 verändert ist. Diese Ergebnisse legen es also nahe, dass von den beiden Polymorphismen Th1/E47cs und 1E1, Th1/E7cs ein besserer Kandidat ist, den relativen Expressionsgrad der Allele von APOE zu verändern.
Um den Einfluss der Phase der Polymorphismen Th1/E47cs und APOE auf das Risiko, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, zu untersuchen, haben die Autoren die Frequenzen der Haplotypen die der Assoziierung der Allele T oder G von Th1/E47cs mit dem Allel ε4 bei den Individuen des Genotyps ε3/ε4 sowohl für die Kranken als auch für die Vergleichspersonen entsprechen, abgeschätzt. Für die Individuen, die die Genotypen ε3/ε4 und GT tragen, weisen 57,6% der Vergleichspersonen die Assoziierung der Allele T und ε4 auf demselben Chromosom auf, wobei diese Proportion bei den Kranken auf 69,7% übergeht. OR wird also auf 1,7 für die Individuen abgeschätzt, diesen Haplotyp aufweisen, wobei das Ergebnis von neuem nahe legt, dass der Polymorphismus Th1/E47cs den Expressionsgrad des Allels ε4 verändern kann.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, haben die Autoren die Wirkung des Polymorphismus Th1/E47cs in einer größeren Population von Fällen und Vergleichspersonen untersucht. Außerdem haben sie zu dieser Untersuchung einen neuen Polymorphismus in dem Promoter des Gens APOE, –491 AT (Bulido et al., Nat. Genet. 1998) assoziiert, der auch den Expressionsgrad von APOE verändern kann. Die ausgewählte Population umfasst 573 sporadische Fälle, die eine wahrscheinliche Alzheimer Krankheit aufweisen (Alter = 73,8 +/– 8,1 Jahre, Alter am Anfang der Krankheit = 70,4 +/– 7,9 Jahre, 35,9% Männer) und 509 Vergleichspersonen (Alter = 74,9 +/– 9,9 Jahre; 35,9% Männer).
Wie vorher, wird diese Population angepasst, um den Einfluss des Gens APOE in der Alzheimer Krankheit zu untersuchen, da das Allel ε4 stark mit der Krankheit verbunden ist (OR = 5,40 IC 95% [4,11–7,09], p < 0,0001) während das Allel ε2 einen Schutzeffekt aufweist (OR = 0,47 IC 95% [0,31–0,70] p = 0,0003). Die Frequenz des Auftretens des Allels T des Polymorphismus Th1/E47cs ist bei den Fällen in Bezug auf die Vergleichspersonen erhöht (Tabelle 6) und das Risiko die Alzheimer Krankheit zu entwickeln ist für die Individuen, die mindest ein Allel T tragen, 2,13 (IC 95% [1,61–2,83]).
Was die Untersuchung des Polymorphismus –491 AT angeht, haben die Autoren zuerst eine Verteilung der Auftretensfrequenzen der Allele und Genotypen beobachtet, die ähnlich der der vorher beschrieben der nordamerikanischen Population war. Die Auftretensfrequenz des Allels T des Polymorphismus –491 AT ist bei den Patienten niedriger als die der Vergleichspersonen und das assoziierte OR das mit dem Risiko verbunden ist, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln für die Individuen die mindestens ein Allel T des Polymorphismus –491 AT tragen ist 0,67 (IC 95% [0,52–0,88], p = 0,004) (Tabelle 4).
Um eine durch das Allel ε4 hervorgerufene mögliche Abweichung an der Verbindung der zwei Polymorphismen Th1/E47cs und –491 AT mit der Alzheimer Krankheit zu entfernen, haben die Autoren die Wirkung jedes Allels getestet indem eine logische auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Allels ε4 adjustierte Regression benutzt wurde. Nach der Adjustierung, bleibt das mit mindestens einem Allel T des Polymorphismus Th1/E47cs verbundene Risiko bestehen (OR = 1,58 IC 95% [1,15–2,11], p = 0,004), während das mit der Gegenwart von mindestens einem Allel T des Polymorphismus –491 AT verbundene Risiko verschwindet (OR = 0,82 IC 95% [0,62–1,10], p = 0,19). Diese Beobachtung legt nahe, dass die Wirkung des Allels T von Th1/E47cs nicht durch die Anwesenheit des Allels ε4 erklärt werden kann. Wenn man annimmt, wie es vorher bei der ersten Untersuchung nahe gelegt wurde, dass das Expressionsniveau der Allele des APOE in Abhängigkeit der Mutationen in cis in der Promoterregion zu- bzw. abnimmt, so müssen diese Mutationen eine andere Wirkung haben und hauptsächlich bei den heterozygoten Individuen ε2/ε3/ε4 detektierbar sein. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die mit dem Risiko die Alzheimer Krankheit zu entwickelnden OR bei den hetero- und homozygoten Individuen für den Genotyp von APOE unter Benutzung einer auf das Alter, das Geschlecht und die Anwesenheit mindestens eines Allels des Polymorphismus Th1/E47cs und –491 AT adjustierte logische Regression untersucht; Bei den homozygoten Individuen ε2/ε3/ε4 wurde keine Wirkung nachgewiesen (OR = 1,13 IC 95% [0,77–1,65] und OR = 0,99 IC 95% [0,68–1,44] für die Individuen, die mindestens ein Allel T von Th1/E47cs und –491 AT tragen). Die heterozygoten Individuen ε2/ε3/ε4, die mindestens ein Allel T von Th1/E47cs besitzen, weisen jedoch eine Erhöhung des Risikos auf, die Krankheit zu entwickeln (OR = 3,57 IC 95% [2,22–5,75], p < 0,0001) im Gegensatz zu denen die mindestens ein Allel T von –491 AT und einen. Schutzeffekt aufweisen (OR = 0,57 IC 95% [0,37–0,90] p = 0,014) Diese Beobachtungen stimmen also mit den Anfangshypothesen der Autoren überein.
So zeigen die durch zwei epidemiologische Studien erhaltenen Ergebnisse, dass die Promoterregion von APOE Mutationen aufweist, die die Entwicklung der Alzheimer Krankheit, insbesondere den Polymorphismus Th1/E47cs unabhängig vom Polymorphismus ε des Gens APOE begünstigen. Dieser Polymorphismus verändert den Einfluss des Allels ε4 in der untersuchten Population, wobei bei der Population ε3/ε4 Unterpopulationen die verschiedene Risiken aufweisen, definiert werden, und wobei die Individuen, die für den Polymorphismus Th1/E47cs heterozygot sind, das grösste Risiko aufweisen. Die Abschätzung der Phase erlaubt es, die mit dem grössten Risiko behaftete Untergruppe zu bestimmen, d. h. die, die die Verbindung des Allels ε4 und des Allels T auf demselben Chromosom aufweist.
Der Einfluss dieser Polymorphismen kann durch eine Erhöhung des Expressionsniveaus des Allels ε4 oder eine Verringerung der Expression des Allels ε2 in Bezug auf die anderen Allele erklaert werden, wobei diese Hypothese durch die Analyse de unterschiedlichen Expression der von den Allelen des APOE im Hirn der Patienten und der Vergleichspersonen stammenden ARNm unterstützt wird.
Es wäre interessant, die Phase zwischen den beiden Polymorphismen unter der Benutzung der spezifischen Allele jedes Polymorphismus zu untersuchen.
So haben die Autoren in einem ersten Schritt durch zwei epidemiologische Studien das den beiden Polymorphismen eigene Risiko, die Alzheimer Krankheit zu entwickeln, nachgewiesen, wobei das Allel T von Th1/E47cs und von –491 AT jeweils eine schädliche und schützende Wirkung hatte. Die Autoren haben in einem zweiten Schritt eine ausgeprägt unterschiedliche Expression der Allele von APOE beobachtet, wobei das Allel ε4 bei den Patienten mit dem Genotyp ε3ε4 und ε2ε4 überexprimiert, während das Allel ε2 bei den Patienten ε2ε3 verglichen mit den Vergleichspersonen mit dem selben Genotyp unterexprimiert waren. Das Expressionsniveau des Allels ε4 im Hirn der Patienten ε3ε4 ist schließlich in Übereinstimmung mit aus den Untersuchungen Fälle-Vergleichspersonen abgeleiteten Daten mit den in der Regulierungregion des Gens APOE anwesenden Mutationen korreliert. Das Allel T von Th1/E47cs erhöht das relative Expressionsniveau des Allels ε4 bei den Patienten während das Allel T von –491 AT es verringert (3 und Tabelle 5). Diese Ergebnisse stimmen mit den neuen Daten überein, wodurch eine Modifikation der Expression des Gens von APOE durch diese beiden Mutationen in der Hepatom-Zelllinie nahe legt.
Es ist interessant festzustellen, dass der Polymorphismus Th1/E47cs in einem Fixierungskonsensusort des Transkriptionsfaktors Th1/E47cs und insbesondere in dem Fixierungsort des Transkriptionsfaktors Helix-Loop-Helix E47 lokalisiert ist. Dieser Faktor gehört zu den Proteinen der Klasse A die auf ubiquitäre Weise exprimiert werden und multiple Kombinationen mit den Proteinen der Klasse B bilden, um die spezifische Gewebe-Expression der Gene zu kontrollieren (Murre und Mitarbeiter, Cell, vol 15, 451–459). E47 wird insbesondere im Hirn exprimiert und ist mit multiplen Proteinen der Klasse B assoziiert und ist an der Entwicklung und Aufrechterhaltung des Nervensystems der Säugetiere beteiligt. Man kennt jedoch wenig von dem Transkriptionsfaktor Th1, der bei einem Durchsieben der ADNc-Datenbank von Mausembryos identifiziert worden war. Ein homologes Protein wurde bei Drosophilis beschrieben, das mit dem Transkriptionsfaktor der Klasse A verbunden ist, daughterless, dessen Expression wesentlich für die Neurogenese ist.
Als Schlussfolgerung lassen alle von den Autoren gesammelten Daten annehmen, dass die Untersuchung der Gens von APOE es erlauben würde eine Diagnose bei den heterozygoten Individuen für den Genotyp von APOE aufzustellen und ebenfalls Risiko-Unterpopulationen besser zu definieren. Diese Informationen sind also wichtig um neue therapeutische Ziele zu definieren und optimale Behandlungen zu verschreiben.
Tabelle 1 Kombinationen der verschiedenen Allele der Polymorphismen APOE Th1/E47cs und 1E1 in den Kontroll- und Krankenpopulationen
Kombinationen der Polymorphismen APOE und 1E1 Kranke
Vergleichspersonen
Kombinationen der Polymorphismen APOE und Th1/E47cs Kranke
Vergleichspersonen
Tabelle 2: Verbindungsungleichgewicht in der Chromosomenregion 19q13.2
Der Polymorphismus APOE wurde als ein bialleler Marker analysiert (d. h. Allel 4 versus Allel 2 oder 3).
Über der Diagonalen der Tafel ist der standardisierte Verbindungsungleichgewichtskoeffizient Δ dargestellt. Unter dieser Diagonalen ist der maximale Verbindungsungleichgewichtsprozentsatz D' für die gegebenen allelen Häufigkeiten angegeben.
Tabelle 3: Abschätzung der möglichen Haplotypen zwischen den verschiedenen untersuchten Polymorphismen in der Chromosomenregion 19q.13.2. der anonyme Marker D19S178 ist in diese Untersuchung integriert worden a) Gesamtpopulation
b) Population mit Genotyp ε3/ε3
c) Population mit Genotyp ε3/ε4
Tabelle 4: Durch multiple logistische Regression abgeschätzte OR
Tabelle 5: Verteilungen der Genotypen 1E1 und Th1/E47cs in der erweiterten Population ε3ε4
Tabelle 6: Verteilung der Allele und Genotypen der Polymorphismen APOE, Th1/E47cs und –491 AT
Es wird die Anzahl (Häufigkeit) der Allele dargestellt.
Die Verteilungen der Genotypen befinden sich im Gleichgewicht nach Hardy-Weinberg in den kontrollierten Populationen.
Tabelle 7: Relative Expression des Allels < 4 bei den Patienten und den Vergleichspersonen in Abhängigkeit von den Polymorphismen Th1/E47cs und – 491 AT
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Diagnose von Alzheimer Krankheit, umfassend Nachweisen einer Mutation in der Region des Promotorgens, das das Apolipoprotein E codiert, wobei die Mutation besteht aus GGGTGTCTG(G→T)ATTACTGGG, wobei G das häufigste Allel in der normalen Population ist.
Verfahren zur Diagnose von Alzheimer Krankheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation nachgewiesen wird: – entweder durch Erzeugen an einer der Amplifikationsstellen durch PCR der polymorphen Region einer Spaltstelle für ein Restriktionsenzym, das nicht bei Individuen vorkommt, die eines der Allele tragen, – oder nach Amplifikation durch PCR der Region, die diesen Polymorphismus umfasst, durch eine Hybridisierungstechnik unter Verwendung von für die Allele spezifischen Oligonucleotidsonden.
Verfahren zur Diagnose von Alzheimer Krankheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: a) Bestimmung des Genotyps des Apolipoproteins E, einschließlich einer Bestimmung des Allels ε4, b) Nachweisen einer Mutation in der Region des Promotorgens des Apolipoproteins E, wobei die Mutation besteht aus GGGTGTCTG(G→T)ATTACTGGG, wobei die Gegenwart des Allels ε4 des Apolipoproteins E und der Mutation Anzeichen für ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Alzheimer Krankheit sind.
Verfahren zur Diagnose von Alzheimer Krankheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ferner der Expressionsgrad der Allele ε2, ε3 und/oder ε4 bei den heterocygoten Individuen für den APOE-Genotyp bestimmt wird.
Verfahren zur Diagnose von Alzheimer Krankheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis einer Mutation, wie in Anspruch 1 definiert, und/oder das Messen des Expressionsgrades der Allele des APOE, wie in Anspruch 4 definiert, mit einer biologischen Probe von durch Biopsie entnommenem Hirngewebe, Lymphozyten oder kultivierten Fibroblasten durchgeführt wird.
Transfektionsvektor für eukaryotische Zellen, umfassend mindestens 1 Allel des Apolipoprotein E(APOE)-Gens und 1 Allel einer Mutation, wie in Anspruch 1 definiert, die, bezüglich einer normalen Population, einer Modifikation des Risikos der Entwicklung von Alzheimer Krankheit zugänglich sind.
Verwendung eines Vektors nach Anspruch 6 zur Produktion von transfizierten eukaryotischen Zellen oder von nicht menschlichen transgenen Tieren.
Eukaryotische Zellen, die mit einem Vektor, wie in Anspruch 6 definiert, transfiziert worden sind.
Transgene, nicht menschliche Tiere, die mit einem Vektor, wie in Anspruch 6 definiert, produziert worden sind.