CN102471800A - 阿尔茨海默病的诊断和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与阿尔茨海默病AD相关的新变体和其作为诊断AD的工具在试剂盒中的应用；以及它们在用于识别新的治疗工具、识别工具的标记的核酸分子或细胞/细胞系中的应用。

Description

阿尔茨海默病的诊断和治疗
本发明涉及在CLU/APOJ、PICALM、ABCA7、CR1或BIN1基因座或MS4A基因簇中的变体以及与其处于连锁不平衡的任何单核苷酸多态性(SNP)的识别，所述CLU/APOJ、PICALM、ABCA7、CR1或BIN1基因座或MS4A基因簇是发生阿尔茨海默病的新的风险标识物；本发明还涉及用于诊断发生阿尔茨海默病的风险或者阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括检测前述的CLU/APOJ、PICALM、ABCA7、CR1或BIN1基因座或MS4A基因簇中的变体；并且本发明还涉及包含前述的座位(locus)或簇的新的筛选工具。
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的最常见形式，其是高度可遗传的(高达76％的遗传率)，但是遗传上复杂的。在神经病理学上，该疾病的特征在于：含有β-淀粉样蛋白(Aβ)的细胞外老年斑和含有高磷酸化τ蛋白的细胞内神经原纤维缠结。其病因确定地涉及四个基因。淀粉样前体蛋白(APP)基因和早老蛋白1和2基因(PSEN1，PSEN2)的突变引起罕见的、孟德尔形式的此疾病，该疾病通常具有早发性。然而，在更常见形式的AD中，仅载脂蛋白E(APOE)被明确地确定为易感基因。为了识别新的AD的座位，在本研究之前进行了少量的全基因组关联研究(GWAS)。所有这些研究均得出了与APOE关联的强有力的证据，但涉及其他基因的有说服力的证据较少1-8。该结果与来自其他普通表型的GWAS的大多数发现一致。
实际上，前面的GWAS的成功的缺乏在本领域中产生了偏见，作为识别任何APOE之外的新的AD座的方式，其教导远离GWAS。尽管存在这样的想法，我们在欧洲和美国之间建立了协作联合，从其中我们能够利用多达19000个受试者(在质量控制之前)的联合样本，并且进行了两个阶段研究。在第1阶段，在Illumina平台上对14639个受试者进行基因分型。使用Illumina 610-quadchip，对当前研究的5715个样本进行基因分型9；我们由群体控制数据集或者通过协作得到其余受试者的基因型，以及所述的基因型在Illumina HumanHap550或HumanHap300BeadChip上进行基因分型的。在关联分析之前，所有样本和基因型经过严格的质量控制，其导致53,383个常染色体SNP和2850个受试者的排除。因此，在第1阶段，我们在高达11789个受试者中测试了529205个常染色体SNP的关联(3941个AD病例，7848个对照，所述的对照中有2078个为老年人中筛选的对照，见表S1)。
除了已知的与APOE座位关联外，GWA分析以全基因组水平的显著性识别了两个新的座位(见图1)。
新的SNP中的一个，rs11136000位于8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)的内含子内(p＝1.4×10-9，OR＝0.840)；另一个SNP，rs3851179是11号染色体上88.5kb的5’到磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装体(PICALM)(p＝1.9×10-8，OR＝0.849)。显著地，因此两个SNP中没有哪个作图于编码位点并因此负责识别的蛋白质中的变化。它们可以因此在基因表达水平，在时间或空间上发挥它们的作用，其反过来可以影响转录水平。
以上的统计数据提供了有力的证据，说明本文识别的两个新的座位和它们相应的SNP以极端高水平的可能性与阿尔茨海默病相关。这意味着，这些SNP可以用作诊断阿尔茨海默病发生的可能性的，或者在疾病的早期阶段诊断阿尔茨海默病存在的强有力的可预测工具。
第2阶段样本(2023个AD病例，2340个对照)进一步为这些新的座位的关联提供了支持(CLU组合的p＝8.5×10-10，OR＝0.86；PICALM组合的p＝1.3×10-9，OR＝0.86)。
在将关联的来源归因于有功能的变体的初步尝试中，我们使用了公众可得到的数据来识别在每个座位上通过连锁不平衡(LD)与前述新的SNP中任一个关联的，或者可以似乎合理地具有功能效应的另外的SNP。通过第2阶段的样本对这些标记物进行基因分型。CLU基因中的同义SNP(rs7982)处于与全基因组显著性(GWS)SNP强烈的LD(r2＝0.95)，并在全部样本中，其显示就与AD的关联，显示出类似水平的证据(meta-p＝8×10-10；估算了第1阶段基因型)。该SNP位于CLU基因的外显子5内，所述外显子5编码此蛋白质的部分β链，并可以影响预测中的的外显子剪接增强子。在PICALM座位识别了几个潜在地功能性的SNP。在这些SNP中，有两个显示了关联的良好证据；即rs561655，其位于假定的转录因子结合位点内和rs592297，其是基因的外显子5中的同义SNP，该SNP可以影响预测的外显子剪接增强子。
簇蛋白的主要形式是75-80kDa的分泌性异质二聚体糖蛋白。单拷贝基因在染色体8p21-p12上涵盖长约16kb，并编码大约2kb的mRNA，该mRNA翻译为449个氨基酸的一级多肽链。簇蛋白在所有的哺乳动物组织中表达并且有很强的证据证明，在涉及脑的损伤或慢性炎症的多种病理状态下，簇蛋白水平升高。在阿尔茨海默病脑中，簇蛋白表达据报道在受影响的皮质区增加并且存在于淀粉样斑块中并且位于AD病例的脑脊液中。
簇蛋白是多功能分子。其在患病的动物模型中与可溶形式的Aβ相互作用并以特异和可逆的方式结合可溶性Aβ，形成复合物，所述复合物已显示穿过血脑屏障。有趣地，ApoE也似乎作为Aβ的分子伴侣起作用，并在其聚集和沉积时有影响，并且其影响Aβ的构型和毒性。按同样地方式，簇蛋白似乎调节Aβ的毒性和将Aβ转化为不溶性形式。此外，ApoE和簇蛋白已显示在抑制Aβ沉积中有协同，并且在血脑屏障处，ApoE和簇蛋白可以关键地修饰Aβ清除，暗示了簇蛋白在促淀粉样变途径中的作用。ApoE蛋白的水平似乎与APOE-ε4等位基因剂量水平成正比，即与杂合子相比，ε4纯合子中表达水平降低。相反，簇蛋白水平以与APOE-ε4等位基因剂量成比例地增加，暗示在低ApoE水平的个体中簇蛋白的诱导。因此，该基因涉及到AD的有力的统计学证据在生物功能性方面具有额外的支持。
显示与AD关联的有说服力的证据的第二个基因座是PICALM(磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装体蛋白，也称为CALM：网格蛋白组装体淋巴-髓性白血病基因)。PICALM普遍在所有组织类型中表达，在神经元中的表达显著，神经元PICALM非选择性地分布在突触前和突触后结构处。已经表明，PICALM涉及到网格蛋白介导的内吞途径(CME)，该途径是蛋白质和脂质，例如营养物、生长因子和神经递质的胞内运输中的关键步骤。在与AD相关方面，PICALM似乎涉及到控制VAMP2的运输。VAMP2是在神经递质释放中，突触小泡与突触前膜融合时起突触作用的SNARE蛋白，所述的神经递质释放是对于神经元功能而言至关重要的过程。AD脑显示出突触的数量减少，并且体视学和生物化学分析表明，突触密度中的这种减少与斑块的积累相比，与认知缺损的关联更大。最近的分析表明，AD脑内的突触甚至在其可见地退化之前可以是功能障碍的。因此，我们可以假设遗传控制的PICALM功能的变化可能通过突触小泡循环在突触处产生扰动，从而增加AD的风险。或者，PICALM可以通过APP加工影响AD的风险，所述的APP加工是通过导致Aβ水平变化的内吞途径进行的。细胞培养实验表明，全长APP通过CME从细胞表面恢复，而内吞作用的抑制减少了APP内化并减少了Aβ的产生和释放。已知增加的突触活性导致突触小泡蛋白的内吞作用升高，并且Cirrito等人就此提供了体内证据，即由于突触活性的增加引起的CME的增加驱使更多的APP进入内吞室(endocytotic compartments)中，导致Aβ产生和释放的增加。因此，对于簇蛋白，PICALM涉及AD中的有力的统计证据在生物功能性方面有支持。
我们还测试了在GWAS中观察到的显著关联的数量是否超过按照偶然性所预期的。排除了APOE、CLU和PICALM座位内的SNP后(见方法)，我们集中在就关联显示出最多证据的那些(p＜1×10-5)。观察到大约13个独立信号；按照偶然性能够预期少于4个(p＝7.5×10-6)。表2显示了包含的座位并提供了与补体受体1(CR1)基因关联的有力证据。还值得注意的是桥连整合1(BIN1)基因，该基因产生了牵涉到在突触小泡胞吞中的蛋白质。因此这些数据提供了这些基因与AD关联的有力证据。
我们试图测试那些在独立样本中关于与AD的关联显示出最有希望证据的SNP，所述的独立样本包含3262个AD病例和5064个对照，其包括之前讨论的第2阶段样本9。将在四个GWAS数据集(多达6978例病例，13903个对照的组合样本)的meta-分析的中显示出P＜1×10-5的SNP选择进行基因分型(见方法)。对于在独立样本中显示关联的SNP(P＜0.05)，进行了额外的使额外的结合(consortia)接近从而将所有可用的AD GWAS数据在倒方差加权的meta-分析中进行联合(见方法)。四个SNP显示了表示与AD关联的GWS证据(见表3)；ABCA7内的rs3764650(P＝7.3×10-10，OR＝1.22)、在MS4A基因簇处的rs670139(P＝1.2×10-9，OR＝1.12)、在BIN1座位的rs744373(P＝2.1×10-12，OR＝1.14)和在CR1座位的rs3818361(P＝1.9×10-12，OR＝1.17)10。
变体rs3764650位于ATP-结合盒亚家族A成员7(ABCA7)基因的内含子13内(图6)。ABCA7编码三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运蛋白：ABC转运蛋白超家族在将大范围的底物转运穿过细胞膜中发挥作用。ABCA7在脑中，尤其是在海马CA1神经元和小胶质细胞中高度表达。ABCA7牵涉到脂质从细胞到脂蛋白颗粒的流出中：脑中主要的脂蛋白是APOE，其次是CLU，因此ABCA7可以在调节它们的效应方面发挥作用，尽管这里没有观察到遗传上相互作用的证据(见表S13)。此外，ABCA7已被证实在培养的过表达AP的细胞中调节APP加工和抑制β淀粉样蛋白分泌。
在11号染色体上的MS4A簇中的基因(chr11：59,570,863-59,863,681(Build GRCh37/hg19))(图6)与该家族的所有其它成员具有共同的基因组结构，其包括跨膜结构域，表明它们可能是细胞表面蛋白家族的部分。MS4A2编码高度亲和力的IgE受体的β亚基。LD段中剩余的基因，包括PLAC1L在内无已知的特异性功能。
BIN1(也称为AMPH2，双载蛋白同种型2)与PICALM一起在受体介导的胞吞作用(RME)中起作用。BIN1表达不具有脑特异性，但有几个同种型在脑中表达丰富。哺乳动物BIN1的减少延迟了内体再循环，并且线虫(Amph-1)中单个双载蛋白同种型(AMPH1/AMPH2)orthologue的缺失突变体显示缺损的内体再循环。
CR1显著地与获得性免疫有关，并且于红血球中，尤其是血管内红细胞中大量地表达，并在神经元上检测到。CR1介导与颗粒和免疫复合物的细胞结合，此时其识别已经激活的补体。CR1可以作为补体级联的负调控因子，介导免疫粘连和吞噬作用并抑制经典补体途径和替代补体途径。之前已将炎症标记物与AD关联起来并将炎症性过程提议作为病原贡献者(pathogenic contributors.)。这些显示了几个假定炎症性基因(CLU、CR1、ABCA7以及可能地在MS4A簇中的基因)包含在AD中的数据支持了在疾病发展中炎症性过程的主要作用。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因；
(b)检查所述的座位以便识别是否存在SNP rs11136000；和
(c)如果存在SNP rs11136000，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
根据本发明的第二个方面，提供了筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有11号染色体上的PICALM基因；
(b)检查所述的座位以便识别是否存在SNP rs3851179；和
(c)如果存在SNP rs3851179，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
另外或替代地，上述两种方法中的任一种可以通过以下方式实行：用参考8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因或11号染色体上的PICALM基因替代或者1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体跨膜4A(MS4A)基因簇；以及检查所述的座位以观察是否存在以下SNP中的任一个：rs1408077、rs6701713或rs3818361(对于CR1)；rs7561528或rs744373(对于BIN1)；rs3764650(对于ABCA7)；和MS4A基因簇的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990；并且其中如果存在所述的SNP，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
根据本发明的第三个方面，提供了筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因或11号染色体上的PICALM基因；
(b)检查所述的座位以便识别是否存在SNP rs11136000或rs3851179；和
(c)如果存在SNP rs11136000或rs3851179，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs11136000是指在chr8：27520436-27520436(Build NCBI36/hg18)位，在簇蛋白基因(转录物变体(transcript variant)1NM_001831.2、转录物变体2NM_203339.1、转录物变体3NM_001171138.1)的内含子3中T到C的碱基变化(见表S16)。该SNP的作图显示于图2中。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs3851179是指在chr11：85546288-85546288(Build NCBI36/hg18)位，在PICALM基因(转录物变体1NM_007166.2、转录物变体2NM_001008660.1)的上游85.5kb处T到C的碱基变化(见表S16)。该SNP的作图显示于图3中。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs1408077是指在chr1：205870764-205870764(Build NCBI36/hg18)位，在CR1基因(转录物变体F；NM_000573.3)的内含子38中C到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs6701713是指在chr1：205852912-205852912(Build NCBI36/hg18)位，在CR1基因(转录物变体F；NM_000573.3)的内含子31中G到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs3818361是指在chr1：205851591-205851591(Build NCBI36/hg18)位，在CR1基因(转录物变体F；NM_000573.3)的内含子28中G到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs7561528是指在chr2：127606107-127606107(Build NCBI36/hg18)位，在BIN1基因(转录物变体1，NM_139343.1，转录物变体6，NM_139348.1，转录物变体10，NM_139351.1，转录物变体2，NM_139344.1，转录物变体3，NM_139345.1，转录物变体8，NM_004305.2，转录物变体9，NM_139350.1，转录物变体7，NM_139349.1，转录物变体5，NM_139347.1，转录物变体4，NM_139346.1)的上游24.8kb处G到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs744373是指在chr2：127611085-127611085(Build NCBI36/hg18)位，在BIN1基因(转录物变体1，NM_139343.1，转录物变体6，NM_139348.1，转录物变体10，NM_139351.1，转录物变体2，NM_139344.1，转录物变体3，NM_139345.1，转录物变体8，NM_004305.2，转录物变体9，NM_139350.1，转录物变体7，NM_139349.1，转录物变体5，NM_139347.1，转录物变体4，NM_139346.1)的上游29.8kb处A到G的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs3764650是指在chr19：1046520-1046520(Build GRCh37/hg19)位，在ABCA7基因(NM_019112.3)的内含子13中T到G的碱基变化(见表S16)。该SNP的作图显示于图6中。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs1562990是指在chr11：60023087-60023087(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A4A基因(转录物变体2NM_148975.1)的上游25kb处C到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs667897是指在chr11：59936979-59936979(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A6A基因(转录物变体1NM_152852.1、转录物变体3、NM_152851.1)的上游2kb处A到G的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs676309是指在chr11：60001573-60001573(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A4A基因的上游4kb处A到G的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs583791是指在chr11：59947252-59847252(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A6A基因(转录物变体1，NM_152852.1，转录物变体2，NM_022349.2，转录物变体3，NM_152851.1)的内含子3中G到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs662196是指在chr11：59942757-59942757(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A6A基因(转录物变体1，NM_152852.1，转录物变体2，NM_022349.2，转录物变体3，NM_152851.1)的内含子5中G到A的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs610932是指在chr11：59939307-59939307(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A6A基因(转录1，NM_152852.1，转录2，NM_022349.2)的3′非翻译区中A到C的碱基变化(见表S16)。该SNP的作图显示于图6中。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs670139是指在chr11：59971795-59971795(Build GRCh37/hg19)位，在MS4A4A基因的上游21kb处C到A的碱基变化(见表S16)。该SNP的作图显示于图6中。
在本发明的前述任意的方面中，所述方法可以使用以下变体中的任何一个或多个进行，包括它们的任何组合：SNP rs1136000、SNP rs3851179、SNP rs1408077、SNP rs6701713、SNP rs3818361、SNP rs7561528、SNPrs744373、SNP rs7982、SNP rs561655、SNP rs592297、SNP rs3764650、SNPrs1562990、SNP rs667897、SNP rs676309、SNP rs583791、SNP rs662196、SNP rs670139和SNP rs610932。
优选地，在本发明的前述任意的方面中，识别所述SNP中的任一个或多个涉及在基因分型领域中的技术人员熟知的常规遗传筛选技术。例如并且不限于，前述的方法可以通过使用适当标记的寡核苷酸来实行，当所述的寡核苷酸与感兴趣的SNP的结合从而检测该感兴趣的SNP时，发出代表所述SNP的存在的可检测信号。此种寡核苷酸的设计的方法对于本领域中的技术人员来说是熟知的并常规地在DNA的识别和标记中实行。此外，表S16中提供的信息使本领域中的技术人员能采用常规方式设计此种寡核苷酸。
在本发明的前述方面中的任一方面中，所述的组织样品可以在进行上述步骤(b)之前扩增。更优选地，所述扩增的组织样品可以在进行上述步骤(b)之前经酶切割为片段。
在本发明的又一个优选的方法中，所述互补寡核苷酸可以连接或结合于固相或基质，并且任选地在进行以上的(b)中提及的检测步骤之前，可以将扩增的和成碎片的组织样品暴露于所述固相中。
根据本发明的再一个方法，提供了实施本发明的前述方法中的任一种或多种的试剂盒，其中所述试剂盒包括与前述座位中的至少一个互补的至少一个寡核苷酸并且其提供有适当的标签，所述的标签当结合于感兴趣的SNP时发出可检测的信号，或者其提供了相关的标记工具，所述的标记工具可以与所述的寡核苷酸联合使用，从而所述寡核苷酸与感兴趣的SNP的结合使得能将所述的标记工具用于检测前述的结合并且因此产生代表所述SNP存在的信号。
在优选的实施方案中，所述寡核苷酸被固定在固体支持物上，例如但不限于珠、阵列或基底。
根据本发明的又一个方面，提供了用于筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有8号染色体上的簇蛋白(CLU)基因或者11号染色体上的PICALM基因，所述簇蛋白也称为APOJ；
(b)检查所述的座位以便识别是否存在与其处于连锁不平衡的SNPrs11136000和/或SNP rs7982，或者是否存在与其处于连锁不平衡的rs3851179和/或SNP rs561655或rs592297；和
(c)如果存在所述SNP中的任一个或多个，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs7982是指在2006年3月人类参考序列的chr2chr8：27518398-27518398(NCBI Build 36.1)位，在簇蛋白基因(转录物变体1、NM_001831.2)的外显子5中A到G的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs561655是指在2006年3月人类参考序列的chr11：85477927-85477927(NCBI Build 36.1)位，在PICALM基因(转录物变体1、NM_007166.2)的上游20.2kb处A到G的碱基变化(见表S16)。
在本发明的前述任意的方面中，参考SNP rs592297是指在2006年3月人类参考序列的chr11：85403585-85403585(NCBI Build 36.1)位，在PICALM基因(转录物变体1、NM_007166.2)的外显子5中C到T的碱基变化(见表S16)。
根据本发明的又一个方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子包含以下座位或簇中的任一个或多个：CLU/APOJ、PICALM、ABCA7、CR1或BIN1，MS4A，所述的座位或簇包括以下变体中的一个或多个，包括它们的任意组合：
SNP rs1136000、SNP rs3851179、SNP rs1408077、SNP rs6701713、SNPrs3818361、SNP rs7561528、SNP rs744373、SNP rs7982、SNP rs561655、SNPrs592297、SNP rs3764650、SNP rs1562990、SNP rs667897、SNP rs676309、SNP rs583791、SNP rs662196、SNP rs670139和SNP rs610932。
根据本发明的又一个方面，提供了用于识别性的疗法、标记识别工具的研究工具，所述研究工具包含：至少一个基因座，其中所述座位包含以上提及的一个或多个座位，即与AD有关的CLU，PICALM，CR1，BIN1，ABCA7，或MS4A座位，并且更优选地包含与其相联系的上述的SNP。
根据本发明的另一个方面，提供了细胞或细胞系，所述的细胞或细胞系包含本发明的基因座中的一个或多个以及关联的SNP中的一个或多个，所述的细胞或者细胞系用于检测潜在的治疗、标记或识别装置是否可以用于治疗AD或者标记或识别与AD有关的标记物。
最适当地，所述细胞或细胞系包含有功能的胞吞途径、细胞凋亡途径、补体途径或先天性免疫应答途径，由受试物质进行的所述途径的调节可以用于确定所述物质的疗效。
在本发明的随后的权利要求书和前述的说明书中，除了由于表达语言或必须的含义上下文中另外需要以外，词语“包含(comprises)”或变化例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”用于包括的含义，即用于指定所指定的特征的存在但不排除本发明的各个实施方案中其他特征的存在或添加。
在本说明书中引用的所有的参考文献，包括任意的专利或专利申请在此通过引用并入。没有承认任何参考文献构成现有技术。此外，没有承认现有技术中的任一个构成本领域中常规的一般知识的部分。
本发明的每个方面的优选的特征可以与结合其他任何方面所述的一致。
通过以下的实施例，本发明的其他特征将变得明显。一般来说，本发明延伸至本说明书中(包括所附的权利要求书和附图)公开的特征的任何新的一个或任何新的组合。因此，与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整体、特性、化合物或化学物质的部分可以理解为适用于本文所描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其矛盾。
此外，除非另外指明，本文所公开的任何特征可以由用于相同或类似目的的替代特征来替代。
现将参考以下的登录号和附图对本发明进行示例说明，其中：
登录号
GenBank：CLU同种型1mRNA，NM_001831.2；CLU同种型2mRNA，NM_203339.1；CLU同种型3mRNA，NM_001171138.1；PICALM同种型1mRNA，NM_007166.2；PICALM同种型2mRNA，NM_001008660.1.CR1同种型S mRNA，NM_000651.4；CR1同种型F mRNA，NM_000573.3；BIN1同种型6mRNA，NM_139348.1；BIN1同种型10mRNA，NM_139351.1；BIN1同种型2mRNA，NM_139344.1；BIN1同种型3mRNA，NM_139345.1；BIN1同种型8mRNA，NM_004305.2；BIN1同种型1mRNA，NM_139343.1；BIN1同种型9mRNA，NM_139350.1；BIN1同种型7mRNA，NM_139349.1；BIN1同种型5mRNA，NM_139347.1；BIN1同种型4mRNA，NM_139346.1；ABCA7 mRNA，NM_019112.3；PLAC1L mRNA，NM_173801.3；MS4A6EmRNA NM_139249.2；MS4A3同种型2mRNA，NM_001031809.1；MS4A3同种型1mRNA，NM_006138.4；MS4A3同种型3mRNA，NM_001031666.1；MS4A2同种型2mRNA，NM_001142303.1；MS4A2同种型1mRNA，NM_000139.3；MS4A6A同种型1mRNA，NM_152852.1；MS4A6A同种型3mRNA，NM_152851.1；MS4A6A同种型2mRNA，NM_022349.2；MS4A4A同种型2mRNA，NM_148975.1；MS4A4A同种型1mRNA，NM_024021.2。
图1.染色体位置(x-轴)对-log10GWAS P-值(y-轴)的散点图。y轴比例限于9.25(p＝5.6x10-10)，尽管在APOE座位的附近观察到与SNP高度显著性相关(例如rs2075650，p＝1.8x10-157)。全基因组显著性的阈值(p≤9.4x10-8)通过红色水平线显示。p≤1x10-3的761个SNP位于蓝色水平线以上。使用Haploview v4.0.(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)生成该图；
图2是CLU基因的示意图，所述的CLU基因基于CLU转录物变体1。用Mb(兆碱基对)表示的染色体位置显示于图的顶部。基因示意图；水平箭头表明转录的方向，黑色框表明基因外显子，灰色框表明UTR，浅灰色框表明转录物变体2特异性UTR。在GWA研究中经基因分型的SNP的-log10(P)显示于图中，指出了GWS SNP rs11136000。GWS SNP rs11136000和rs7982的Meta p值通过点线显示。根据CEU HapMap数据，CLU基因和周围区域(chr8：27,502,817-27,535,944)的D’LD块结构提供于图的底部，其用线表示各个经基因分型的SNP表示于何处。注意：CLU转录物变体2不含转录物变体1的外显子或者5’UTR，而且在转录物变体2中，外显子2的一半是UTR；
图3是PICALM基因的示意图，所述的PICALM基因基于PICALM转录物变体1。用Mb(兆碱基对)表示的染色体位置显示于图的顶部。基因示意图；水平箭头表明转录的方向，黑色框表明基因外显子，灰色框表明UTR，浅灰色框表明转录物变体2特异性的外显子。在GWA研究中经基因分型的SNP的-log10(P)显示于图中，其指明了GWS SNP rs3851179。GWSSNPs rs3851179和接近基因组显著性的假定的功能变体(rs592297和rs561655)的Meta p值通过点线显示。根据CEU HapMap数据，将PICALM基因和周围区域(chr11：85,326,133-85,605,600)的D’LD块结构提供于图的底部；
图4显示了当比较不同组的对照时的分位数-分位数图(quantile-quantile plot)的实例。在该实例中，将在Illumina 610-quadchip上基因分型的来自UK和爱尔兰的经筛选的对照与在Illumina HumanHap550上基因分型的来自1958英国出生队列的对照进行了比较。将观察到的关联χ2检验统计值(y-轴)对那些在零预期下所预期的(x-轴)进行作图。尽管观察到更高的值，但y-轴限于30。显示了实线(unbroken line)的等值线。使用了11作为排除χ2的阈值(通过虚的水平线显示)；
图5显示了全基因组中观察到的529205个的关联的χ2检验统计值(y-轴)对在零预期下(x-轴)那些预期分位数-分位数(Q-Q)作图。显示了实线的等值线。λ＝1.037。B)在去除了APOE座位的170个SNP之后的Q-Q图。剩余529035个SNP(λ＝1.037)；和
图6显示了在参照(a)ABCA7基因和(b)携带MS4A基因簇成员的染色体区chr11：59.81Mb-60.1Mb处报告的相关变体的示意图。染色体位置显示于示意图的顶部(Build GRCh37/hg19)。基因示意图：水平箭头表明转录的方向，黑色框表明基因外显子/UTR。在第1阶段中分析的SNP的-log10(P)显示于框图中。显示了SNP rs3764650(ABCA7)、rs610932(MS4A6A)和rs670139(MS4A4E)的第3阶段倒方差加权的meta-分析p-值。还指明了位于GERAD2样本中基因分型的ABCA7座位的非同义SNP rs3752246。(对于rs3764650，D’＝0.89，r2＝0.36)。按照CEPH HapMap数据的ABCA7基因和周围区域以及chr11：59.81Mb-60.1Mb的D’LD块结构提供于每个示意图的底部，并描绘了指示在Illumina 610-quadchip上基因分型的每个SNP的线。
材料和方法
样品确定和诊断标准
本研究包含第1阶段‘发现样品’的4957个AD病例和9682个对照，以及第2阶段‘随访样品’的2023个AD病例和2340个对照。包括在本研究中的个体得自欧洲和美国。所有个体均具有白种人血统。所有的AD病例均符合可能性的(NINCDS-ADRDA，DSM-IV)或确定性的(CERAD)标准。
AD.该研究使用‘老年人筛选的对照’和‘群体对照’。针对AD的认知减退或神经病理学体征筛选老年人对照。‘群体对照’得自具有可用的全基因组关联数据的大量现有的队列。
第1阶段发现样本：发现样本包括在Sanger Institute在Illumina610-quadchip上基因分型的4113例病例和1602个老年人中筛选的对照，下文共同称为610组。这些样本由以下机构招募：Medical Research Council(MRC)Genetic Resource for AD(Cardiff University；Institute of Psychiatry，London、Cambridge  University；Trinity College Dublin)、Alzheimer’sResearch Trust(ART)Collaboration(University of Nottingham、University ofManchester；University of Southampton、University of Bristol、Queen’sUniversity Belfast、the Oxford Project to Investigate Memory and Ageing(OPTIMA)，Oxford University)、Washington University，St Louis，UnitedStates、MRC PRION Unit，University College London、London and the SouthEast Region AD project(LASER-AD)，University College London；Universityof Bonn，Germany和National Institute of Mental Health(NIMH)AD GeneticsInitiative。这些数据与来自844个AD病例和1255个老年人中筛选的对照合并，所述的病例和对照通过Mayo Clinic，Jacksonville，Florida、MayoClinic，Rochester，Minnesota和Mayo Brain Bank使用IlluminaHumanHap300 BeadChip进行基因分型来确定。这些样本用于之前的AD的GWAS中4。在第1阶段中包括总计为6825个群体对照。这些对照得自具有可用的GWAS的大量现有队列，包括1958B ritish Birth Cohort(1958BC)(http://www.b58cgene.sgul.ac.uk)，位于Coriell Cell Repositories(Coriell)的NINDS资助的neurogenetics collection(见http://ccr.coriell.org/)、KORA研究11、Heinz Nixdorf Recall研究12，13和ALS对照。所述的ALS对照使用Illumina HumanHap300 BeadChip进行基因分型。所有其他群体对照使用Illumina HumanHap550 BeadChip进行基因分型。发现样本的临床特征见表S1。
第2阶段随访样本：随访样本包括2023个AD病例和2340个对照。样本得自MRC genetic resource for AD、ART Collaboration、University ofBonn、Aristotle University of Thessaloniki，得自位于Memory Clinic andDepartment of Neurology的比利时样本、ZNA Middelheim、Antwerpen14以及University of Munich的预期的临床研究。随访样本的临床特征可见表S2。
附加的第2阶段样本：附加的第2阶段样本包括1239个AD病例和2724个对照，其用于ABCA7和MS4A座位的基因分型。样本得自MRCgenetic resource for AD、University of Bonn和Aristotle University ofThessaloniki。全部的第2阶段随访样本的临床特征可见表S3。
DNA提取和实验室质量控制
DNA从每位参与者的血液样品中获得，其通过苯酚/氯仿提取，接着在乙醇中沉淀并储存在TE缓冲液中(某些DNA使用Qiagen试剂盒提取)。通过紫外分光光度法(μQuant微孔板分光光度计，
Figure BDA0000126457880000141
Beds，UK)或NanoDropTM(Thermo Scientific，DE，USA)测定最初的DNA浓度。然后使用dsDNA定量试剂(Molecular 
Figure BDA0000126457880000143
Eugene，Ore.)，在Labsystems Ascent
Figure BDA0000126457880000144
(LifeSciences Int.，Basingstoke，UK)中测定每个样品的浓度。然后将每个样品稀释至50ng/ul并使其在4℃下平衡48小时。DNA质量在标准条件下通过琼脂糖凝胶电泳进行评估。随后，使用
Figure BDA0000126457880000145
和
Figure BDA0000126457880000146
systems(
Figure BDA0000126457880000147
San Diego，CA)按照制造商的规程，在具有30个SNP的板中对未显示降解迹象的样品进行基因分型。在针对GWAS重新排列样品之后，该操作允许检查性别并许可样品鉴别检查。
第1阶段基因分型(610组)
在Sanger Institute，UK进行基因分型。针对GWAS，使用
Figure BDA0000126457880000151
FXLaboratory Automation Workstation(Beckman Inc.，Fullerton，CA)将通过质量控制(QC)的所有标准化样品重新排列为96孔板格式。每个样品使用200ng的输入DNA并其使用Illumina InfiniumTM system(
Figure BDA0000126457880000153
Inc.，San Diego，CA，USA)制备用于基因分型。自始至终遵守制造商的规程。简单地说，将DNA进行等温扩增过夜，然后酶切为片段，乙醇沉淀并重悬浮。在该研究中，我们使用了制备用于在毛细流通室中杂交的Illumina Human610-Quad BeadChips(
Figure BDA0000126457880000154
Inc.，San Diego，CA，USA)。使用Tecan机器人将经扩增和切割为片段的DNA样品与微珠芯片(bead chip)杂交，并且使用酶碱基延伸给予其等位基因特异性。然后对芯片进行染色并使用iSCAN阅读器(
Figure BDA0000126457880000155
Inc.，San Diego，CA，USA)扫描以检测每个珠子处的荧光。将数据加载到Beadstudio上并且输出的含有X，Y，X-Raw和Y-Raw的最终鉴定报告(final call report)中。使用聚类分析的Illuminus算法进行基因型鉴定(genotype calling)15。
第1阶段：个体质量控制
作为本研究的部分，在Illumina 610-quadchip上对4113个AD病例和1602个对照进行基因分型(610组)。此外，之前使用Illumina HumanHap550或Illumina HumanHap300基因分型的844个AD病例和8080个对照包括在该分析中。这些基因型作为7个不同研究的部分生成，总共得到8个独立的组：1)610、2)Mayo、3)1958年出生的队列(Sanger)、4)1958年出生的队列(T1DGC)、5)ALS对照、6)Coriell对照、7)Heinz NixdorfRecall(HNR)研究、8)Kora。由于我们使用了来自多种来源的基因型数据，重要的是应用严格的QC筛选，因为当合并数据时，组间基因分型误差比率的差异可以导致假关联16，17。使用PLINK v1.05(http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink)18中提供的工具，将这些筛选分别地用于8个组中的每个组中以排除进行差的样品。应用的具体的QC阈值和按分组排除的样本分析分别提供于表S4和S5中。我们排除了缺失基因型率＞0.01的1469名个体。我们还应用了基因平均常染色体杂合性的筛选，排除其数值大于或低于按经验确定的阈值的578名个体。排除了报告的性别和基因型测定的性别之间不一致的71名个体和基因分型测定的性别不明确的22名个体。通过计算PLINK中个体所有可能的对的血源同一(IBD)估计值来检查那些通过QC过滤的所有个体潜在的遗传相关性，并从各个IBD估计值≥0.125(对一级表亲的预期的水平)的对中去除一个。将Illumina 610、550和300芯片所共有的，基因型丢失数据比率≤0.01，Hardy-WeinbergP≥1x10-5以及次等位基因频率≥0.01的SNP用于计算IBD估计值。结果506名个体被排除(注意：其包括在Coriell和ALS对照组中包括的311名个体)。
我们还试图检测非欧洲血统。为此，将在所有队列中分类的SNP的基因型数据与来自HapMap项目的210个不相关的欧洲(CEU)、亚洲(CHB和JPT)和Yoruban(YRI)样本的相同SNP处的基因型进行合并。在连锁不平衡的广泛区域中(chr5：44-51.5Mb；chr6：25-33.5Mb；chr8：8-12Mb；chr11：45-57Mb)19去除SNP之后，如果在50-SNP窗口的任何对具有r2＞0.2则将该SNP去除。基于57966个SNP(所有基因型丢失数据比率≤0.01，Hardy-WeinbergP≥1x10-5和次等位基因频率≥0.01)，在生成的数据集中用PLINK计算个体中的每个对之间的全基因组平均状态同一(IBS)距离。将得到的IBS距离矩阵用于输入到R v2.7.1(http://www.r-project.org)中经的典多维量表(MDS)。当提取前两个维度并使其对彼此作图时，观察到对应于欧洲、亚洲和Yoruban样本的3个聚类。16个样品表现为来自欧洲聚类的种族离群值(outlier)并从进一步分析中排除。
我们使用如EIGENSTRAT20中使用的主成分分析(PCA)评估了数据内的群体结构，从而推断遗传变异的连续轴线(axes)。基于之前描述的、所有阵列共有的LD剪除的亚组的57966个SNP计算特征向量。EIGENSTRAT程序还识别了遗传离群值，所述的遗传离群值被定义为在变异的前10个轴线中的一个上，其血统为相对于平均值至少6个标准偏差的个体。结果，识别了188个离群值并将其排除。在样本QC之后，3941例AD病例和7848个对照包括在分析中。
第1阶段：SNP质量控制
本分析中仅包括常染色体SNP。将个体在作为本项目的部分的610-quad上，或者在之前的Illumina HumanHap550或者IlluminaHumanHap300阵列上进行基因分型，并且我们可得到所述的基因型。注意，在纳入本研究之前，SNP已经从一些组中过滤出。此外，如果使用相同阵列的不同版本(例如HumanHap550v1，用于基因分型1958年出生的队列(Sanger)，与HumanHap550v3阵列进行对比，所述的HumanHap550v3阵列用于基因分型1958年出生的队列(T1DGC))，仅认为两种版本共有的SNP存在于该阵列上。为此，包括在我们的分析中的SNP落入了4个不同的分类中；1)所有3个阵列所共有的并在所有个体中进行基因分型的266714个SNP；2)610和550阵列共有，但在300阵列上分型的个体中不存在或者无基因型的202516个SNP；3)610和300阵列共有，但在550阵列上分型的个体中不存在或者无基因型的7,744个SNP；4)105614个SNP，其基因型仅见于610数据中(见表S6)。
为了去除表现差的SNP，同时不排除可以显示与AD真正关联的标记，我们评估了不同的缺失数据率和Hardy-Weinberg筛选的效果。对于4个SNP分类中的每个来说，在病例或对照中，标记物如果它们的较小的等位基因频率(MAF)＜0.01或者Hardy-WeinbergP≤1x10-5，则被排除。在病例或对照中，如果MAF≥0.05的SNP具有＞0.03的基因型缺失率，则被排除；对于MAF在0.01至0.05的SNP来说，使用了0.01的更加严格的基因型缺失率阈值。该基础性SNP QC的结果是排除了43542个SNP。
如前所述，使用EIGENSTRAT提取了10个主成分(PC)。为了确定所述的PC是否能满足我们样本内的任何群体结构，我们进行了与AD关联的logistic回归检验，所述的检验按顺序地包括作为协变量的前0到10个PC。包括PC的影响通过计算基因组控制膨胀因子λ21来评估。我们发现，将前4个PC作为协变量包括对λ具有最大影响(见表S7)。
为了使可以导致1型错误率扩大的芯片内和队列间的差异最小化，用logistic回归分析在不同的组中比较了对照组之间的次等位基因频率，所述的logistic回归分析如前所述将前4个PC作为协变量并入。仅在来自相同地理区域(即不列颠群岛、德国或USA)的个体间进行了比较，所述的比较包括：1)1958年出生的队列(Sanger)与1958年出生的队列(T1DGC)；2)1958年出生的队列(合并的Sanger和T1DGC)与610UK对照；3)1958年出生的队列(合并的Sanger和T1DGC)与ALS UK对照比较；4)610UK对照与ALS 610UK对照；5)HNR队列与Kora队列；6)610德国人对照与合并的HNR队列和Kora队列；7)Mayo对照与ALS美国对照；8)Coriell队列与合并的Mayo和ALS美国对照；9)610 US对照与合并的Mayo和ALS US对照；10)610 US对照与Coriell队列。此外，比较2、4、6、7、9和10的结果是将老年人中筛选的对照与未筛选的/群体对照进行比较。
对于4个类型的SNP中的每类来说，产生了每个队列对照比较的分位数-分位数(Q-Q)图，并且用于排除SNP的显著性阈值基于观察到的χ2统计值与零期望偏离时的情况(见表S8和图4)。由于这些比较，排除了进一步的9828个SNP。因此，在本研究中分析了总计529218个SNP与AD的关联。
第1阶段统计分析
使用logistic回归，假设加性模型，来检测SNP与AD的关联。将协变量包括在logistic回归分析中从而使得地理区域和芯片能区分1)来自不列颠群岛的个体；2)来自德国的个体；3)在610或550芯片上分型的来自美国的个体；4)在300芯片上分型的来自美国个体之间的差异。每个芯片不可能包括协变量，因为仅对照组在550芯片上进行基因分型。类似地，8组中不可能每个组都包括协变量，因为仅两组既包括病例又包括对照(610和Mayo组)。如前所述，从EIGENSTRAT中抽取的前4个PC也包括作为协变量。在分析之后，目测检查了p值≤1x10-4的SNP的130个聚类图。排除了显示未良好形成聚类的13个SNP。因此，我们的分析是基于529205个SNP，并使用了0.05/529205＝9.4x10-8的保持性全基因组显著性阈值。检测结果的Q-Q图显示于图5中。全部的基因组对照膨胀因子λ计算为1.037。p-值≤1x10-4的SNP的结果显示于表S9中。对于全基因组显著性SNP的病例和对照组中的次等位基因频率的分析显示于表S10中。
第2阶段基因分型和统计分析
我们对来自5个欧洲队列的病例和对照基因分型SNP(在表S2和S3中描述)。使用MassARRAY和iPlexGOLD系统(Sequenom，San Diego，CA)，按照生产商的推荐，在Cardiff进行基因分型。在使用之前，基于在30个Centred’Etude du Polymorphisme Humain(CEPH)亲代-后代trios中的优化来验证所有的检测。样品板包含病例、对照和空白样品。质量控制测定包括对样本身份设盲并对其他评分者设盲的独立的两次基因分型，并且如果可以得到的话，还包括我们的CEPH基因型与那些HapMap(www.hapmap.org)的比较。此外，也在Sequenom平台上对包括在GWAS中的231名个体进行基因分型。我们计算的在两个平台上分型的7个SNP的平均一致率为99％。在随访样本中，所有基因分型的SNP均具有基因分型成功频率的比率(genotype callfrequency rates)＞90％，并且在病例和对照组中没有SNP的HWE P值≤0.05。使用logistic回归，假设加性模型，来检测SNP与AD的关联。将协变量包括在logistic回归分析中以考虑每个队列，所述各个队列即1)比利时、2)MRC、3)ART、4)Bonn、5)希腊。
CLU和PICALM meta-分析
在CLU和PICALM座位处用于SNP的在meta-分析中，我们纳入了来自第1和2阶段的基因型数据，用于在CLU和PICALM座位的SNP。此外，我们利用了来自TGEN研究的基因型数据，所述的数据为公开可以公开得到的AD GWAS数据集。该样本由在Affymetrix 500K芯片上进行基因分型的861个AD病例和550个对照组成。如果感兴趣的SNP未在我们的GWAS或TGEN数据集中进行基因分型，则使用60 HapMap CEUFounders作为参照平板尝试将基因型填补(impute)于PLINK中。仅将信息含量折合公制大于0.8的填补的SNP包括在分析中(见PLINK网址)。使用logistic回归，假设加性模型，从而检测SNP与AD的关联。将协变量包括在logistic回归分析中以考虑第1阶段中和第2阶段中队列的地理区域和芯片。对于TGEN样本包括的协变量区分来自Netherlands Brain Bank的样本和来自USA的样本间的差异。Meta-分析的结果显示与表1和表S11中。
ABCA7和MS4A meta-分析
发现meta-分析
在ABCA7和MS4A座位中对SNP的meta-分析中，我们纳入了来自第1阶段和全部的第2阶段样本的基因型数据。此外，我们利用了来自TGEN(Translational Genomics Research Institute)22和ADNI(Alzheimer；s DiseaseNeuroimaging Initiative)23研究的基因型数据，所述的数据均为公开可得到的AD GWAS数据集，我们利用logistic回归，假设了加性模型并包括了TGEN研究的来源国家的原始协变量，自行分析了与AD的关联10。我们首次对GERAD1、ADNI和TGEN进行了倒方差加权的固定效应的meta-分析。利用Fisher的组合合并的概率检验，将来自该meta-分析的P-值与来自EADI1(欧洲阿尔茨海默病行动计划第1阶段)的公开可得到的p值合并(注意，在EADI1研究中分型的所有的SNP的优势比和方差公开不可获得，因此阻止了所有4个GWAS的倒方差加权的meta-分析)。组合合并的分析检测了496763个常染色体SNP。这些SNP通过了我们的第1阶段样本和ADNI和EADI1 GWA研究中每个的QC；这些SNP中的52391个也进行了基因分型并通过了TGEN GWAS(其与其他研究不同地使用了Affymetrix 500K阵列)中的QC。在合并分析中，61个SNP在P≤1x10-5时与AD相关(见表S14)。
所有可利用数据的倒方差加权的meta-分析
对于显示关联的证据(P＜0.05)的在我们的第2阶段样本中的5个SNP来说，汇总数据(包括优势比和方差)得自CHARGE(心脏和衰老队列的基因组流行病学研究)25和EADI1研究，使得所有的数据(即，我们的第1和2阶段、EADI1、ADNI、TGEN和CHARGE)在倒方差加权的固定效应的meta-分析(总样本多达11607例病例和31871个对照)中合并。进行了Cochran’s Q检验并计算I2用于评估异质性。尽管在分析CR1 SNPrs3818361的所有研究中观察到了相同方向的效应，但仍有一些异质性的证据(Cochran’s Q检验，P＝0.02，I2＝65％)。还对该SNP进行了随机效应meta-分析作为比较(见表S15)。
次级分析
我们还检测了GWS SNP与发病年龄(AAO)的关系。为此，在线性回归分析中将发病年龄(以年为单位)用作独立变量，并假设了加性模型。在2856例AD病例中AOO数据是可以得到的。将协变量包括在logistic回归分析中从而考虑地理区域和芯片，即用于区分1)来自大不列颠群岛的病例；2)来自德国的病例；3)来自在610芯片上分型的US的病例；4)来自在300芯片上分型的US的病例。结果显示于表S12中。
基于至少1个APOE ε4等位基因的存在/缺失，我们对我们的样本进行了分层。我们拥有6054名个体的APOE基因型数据，我们的ε4-阳性样本由2203个AD病例和632个对照组成；我们的ε4-阴性样本由1446个病例和1764个对照组成。我们在每个子样本中对与AD的关联性进行了全基因组检测，但没有SNP达到全基因组显著性(数据未显示)。
显著的SNP的预期数量
我们评估了我们的结果以确定我们在第1阶段是否观察到了比偶然预期更多的显著的SNP。我们首先在风险SNP的任一侧去除了500kb内的SNP，所述的风险SNP即rs429358(APOE ε4 SNP)、rs11136000(CLU)和rs3851179(PIC4LM)。我们因此排除了170个“APOE”SNP、290个“CLU”SNP和257个“PICALM”SNP。在528448个剩余的SNP中，我们使用我们在(15)中描述的算法估计了397,224.7个“独立”试验。在显著的显著性水平为α＝10-5的16个SNP(不包括APOE、CLU和PICALM SNP)中，我们评估了12.6“独立”试验。我们使用二项式分布法计算了预期数量的显著性试验在α＝10-5水平的平均值(N*α＝397224.7*10-5≈4.0)和方差(N*α*(1-α)＝3.97)。因此，观察的12.6显著性试验的概率为P＝7.5x10-6。
连锁不平衡检验
新的GWS座位的初步分析：为了进一步探索两个相关的基因区域(CLU和PICALM)之内的关系，我们从每个区域中选择了另外的SNP，其中每种SNP在第1阶段显示了关联(p≤0.001)的一些证据，或者为与新的GWS命中处于连锁不平衡(D’＞0.3)中的假定的功能性SNP(见表S11)。预测的功能性SNP使用PupaSuite(http://bioinf.ocipf.es/pupasuite/www/index.jsp)26识别。检测这些SNP在独立样本中与AD的关联性，而且还检查这些SNP在TGEN GWAS中的关联性。从CLU座位中选择4个另外的SNP，其中一个在第1阶段显示一些证据(rs7012010；p＝8x10-4)，另三个具有假定的功能显著性但未在第1阶段中进行分型(rs3087554、rs9331888和rs7982，见表S11)。rs7012010在原始的第2阶段样本中未显示关联的证据，在TGEN数据集(p＝0.033)中显示一些证据但未达到meta-分析中GWS的显著水平(p＝1x10-4)。其余SNP中的2个未显示关联的证据，而第三rs7982则显示了在原始的第2阶段样本中的关联，并具有类似量级的效应(meta p＝8x10-10；填补的第1阶段基因型)，所述的第三rs7982是在簇蛋白中与GWS SNP处于强的LD(在HapMap CEU个体中r2＝1，在扩大样本中r2＝0.95)的同义SNP。
我们从PICALM座位选择了8个额外的SNP进行随访：一半在第1阶段中显示关联的显著证据而另一半是由于其假定的功能选择的(见表S11)。前4个SNP中的三个显示了在原始的第2阶段和TGEN样本中均关联的证据，第4个显示了单独在TGEN数据集中的关联。生成的合并的p-值为：rs677909，p＝3x10-8；rs541458，p＝5x10-9；rs543293，p＝1x10-8；以及rs7941541，p＝3x10-9，其均没有超过原始GWS SNP的p-值。仅有的显示关联的良好证据的潜在地有功能性的SNP为rs561655以及rs592297，所述rs561655在假定的转录因子结合位点之内，所述rs592297为可以影响假定的外显子剪接增强子的基因的外显子5中的同义SNP。然而，这两个SNP均未显示对rs3851179，GWS SNP所观察到的关联的强力证据，分别产生了meta p＝1x10-7和p＝2x10-7。
结论
我们的结果为本文描述的基因是AD的真正易感基因提供了强力证据。然而，我们的发现中进一步引人注目的后果是支持了Aβ累积之外的疾病机制。三个并且可能地四个最近识别的AD易感座位(CLU、CR1、ABCA7和MS4A基因簇)在免疫系统，具体是经典补体途径中具有已知功能。此外，PICALM和BIN1均涉及网格蛋白介导的胞吞作用中而APOE、CLU和ABCA7涉及脂质处理中。
Figure BDA0000126457880000231
表2.P≤1x10-5下显示与AD关联的SNP(不包括APOE、CLU和PICALM座位的SNP)。
Figure BDA0000126457880000241
Chr＝染色体；MB＝以兆碱基计的位置；OR＝次等位基因的优势比；95％CI＝95％置信区间；UTR＝非翻译区。
表3.选自第1阶段、ADNI、TGEN和EADI1数据集的meta-分析并在完整的第2阶段样本中进行基因分型的SNP的汇总统计。
Figure BDA0000126457880000251
Chr，染色体；95％CI，95％置信区间。a.通过进行第1阶段、ADNI和TGEN的倒方差加权的meta-分析并利用Fisher的合并概率检验，将产生的P-值与来自EADI1研究的组合得到P值。b.倒方差加权的meta-分析。c.rs11894266未优化，rs13010581作为代表(proxy)进行基因分型(r2＝1，D′＝1)。d.基于SNP rs3764650、rs670139、rs744373、rs610932和rs3818361的第1和第2阶段、ADNI、TGEN和EADI1的倒方差加权的meta-分析的P-值分别为2.8x10-7、2.9x10-6、3.6x10-9、3.8x10-7和2.5x10-12。
表S2.第2阶段样本的样本量和描述性统计。
Figure BDA0000126457880000271
*仅对神经病理学样本是可得的
Figure BDA0000126457880000272
171个年龄匹配的筛选的对照，212个群体对照。
Figure BDA0000126457880000273
发病年龄仅对一部分的样本而言是可得的
Figure BDA0000126457880000281
Figure BDA0000126457880000301
表S6.在质量控制前后SNP的数量汇总。
Figure BDA0000126457880000311
表S7.从EIGENSTRAT中提取的包括的主成分(PC)对基因组控制膨胀因子λ上的影响。这些值基于Illumina 610-quad、HumanHap550和HumanHap300芯片共同的SNP的分析(SNP第1类)。
表S8.采用显著性阈值(χ2值)来排除显示出芯片间或队列间差异的SNP。将χ2值超过这些阈值的SNP排除。
Figure BDA0000126457880000321
N/A＝不适用。
表S9.在GWAS中显示与AD关联(P≤1x10-4)的SNP。
Figure BDA0000126457880000341
Figure BDA0000126457880000351
Figure BDA0000126457880000361
Figure BDA0000126457880000371
Figure BDA0000126457880000381
Figure BDA0000126457880000391
Figure BDA0000126457880000401
Figure BDA0000126457880000411
Figure BDA0000126457880000421
Figure BDA0000126457880000431
Figure BDA0000126457880000441
表S16.每个感兴趣SNP的侧翼序列(±20个碱基)
Figure BDA0000126457880000451
NB：侧翼序列内感兴趣的SNP的位置以方括号表示。在该SNP处的核苷酸变化显示于方括号内。
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Figure IDA0000126457930000011
Figure IDA0000126457930000021
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Figure IDA0000126457930000061

Claims (18)

1.一种筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或者阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有8号染色体上的簇蛋白(CLU)基因或11号染色体上的PICALM基因，所述簇蛋白也称为APOJ；
(b)检查所述的座位以便识别是否存在SNP rs11136000或rs3851179；和
(c)如果存在SNP rs11136000或rs3851179，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
在步骤(a)中，用参考簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因或PICALM基因替代或者1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；
在步骤(b)中，检查所述的替代的座位或簇以观察是否存在以下SNP中的任一个或多个：CR1中的rs1408077、rs6701713或rs3818361；BIN1中的rs7561528或rs744373；ABCA7中的rs3764650；以及MS4A基因簇中的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990；和
在步骤(c)中，如果在所述的替代的座位存在所述的一个或多个SNP，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
3.根据权利要求1的方法，所述方法包括：
在步骤(a)中，另外提供包含至少一个座位的组织样品，所述座位选自以下的组：1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)和11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；
在步骤(b)中，另外检查所述的另外的座位以观察是否存在以下SNP中的任一个或多个：CR1中的rs1408077、rs6701713或rs3818361；BIN1中的rs7561528或rs744373；ABCA7中的rs3764650；以及MS4A基因簇中的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990；和
在步骤(c)中，如果存在所述的一个或多个SNP，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
4.根据权利要求1的方法，其中：
在步骤(b)中，另外或替代地，检查所述座位以识别是否存在rs7982、rs561655或rs592297；和
在步骤(c)中，如果存在rs7982、rs561655或rs592297，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用与待检查的基因座或基因簇互补的至少一个标记的寡核苷酸以检测所述的SNP，其中所述的寡核苷酸与所述SNP结合从而检测所述的SNP时，发出代表所述SNP存在的可检测信号。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在进行步骤(b)之前，将所述的组织样品进行PCR扩增。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在进行步骤(b)之前，将所述的组织经酶切割为片段。
8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中在进行步骤(b)之前，将所述互补的寡核苷酸连接或结合于固相或基底上并将所述的组织样品暴露于所述的固相中。
9.一种筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或者阿尔茨海默病的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：
至少一个寡核苷酸，所述寡核苷酸与座位或基因簇中的至少一个互补，所述的座位或基因簇选自：8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因、11号染色体上的PICALM基因、1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；其中所述的寡核苷酸能够检测以下SNP中的一个或多个：CLU中的rs11136000；PICALM中的rs3851179；CR1中的rs1408077、rs6701713或rs3818361；BIN1中的rs7561528或rs744373；ABCA7中的rs3764650；以及MS4A基因簇中的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990；
并且进一步其中所述寡核苷酸提供有标签，所述标签当结合于所述的SNP时发出可检测的信号。
10.一种筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或者阿尔茨海默病的存在的试剂盒，所述试剂盒包含：
至少一个寡核苷酸，所述寡核苷酸与座位或基因簇中的至少一个互补，所述座位或基因簇选自：8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因、11号染色体上的PICALM基因、1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；其中所述的寡核苷酸能够检测以下SNP中的一个或多个：CLU中的rs11136000；PICALM中的rs3851179；CR1中的rs1408077、rs6701713或rs3818361；BIN1中的rs7561528或rs744373；ABCA7中的rs3764650；以及MS4A基因簇中的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990；
并且进一步，其中所述的试剂盒包括标记工具，所述的标记工具与所述的寡核苷酸联合使用，由此，寡核苷酸与所述的SNP的结合使得所述的标记工具检测前述的结合成为可能并且因此产生代表所述SNP存在的信号。
11.根据权利要求9或10的试剂盒，其中将所述的寡核苷酸固定在固体支持物上。
12.一种筛选或诊断发生阿尔茨海默病的可能性或阿尔茨海默病的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供从待试验的个体的人体中提取的组织样品，其中所述的组织样品包含至少一个座位，所述座位含有8号染色体上的簇蛋白(CLU)基因或者11号染色体上的PICALM基因，所述簇蛋白也称为APOJ；
(b)检查所述的座位以便识别在CLU中是否存在与其处于连锁不平衡的SNP rs11136000和/或SNP rs7982；或者在PICALM中是否存在与其处于连锁不平衡的SNP rs3851179和/或SNP rs561655或rs592297；和
(c)如果存在所述的SNP中的任一个或多个，得出结论：从其中提取样品的个体可能发生阿尔茨海默病或者正在患阿尔茨海默病。
13.一种核酸分子，所述核酸分子包含基因座或基因簇中的一个或多个，所述的基因座或基因簇选自8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因、11号染色体上的PICALM基因、1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；并且所述核酸分子还包括以下变体中的一个或多个，包括它们的任意组合：
SNP rs1136000、SNP rs3851179、SNP rs1408077、SNP rs6701713、SNPrs3818361、SNP rs7561528、SNP rs744373、SNP rs7982、SNP rs561655、SNP rs592297、SNP rs3764650、SNP rs670139、SNP rs1562990、SNPrs667897、SNP rs676309、SNP rs583791、SNP rs662196和SNP rs610932。
14.一种细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包含基因座或基因簇中的一个或多个，所述的基因座或基因簇选自8号染色体上的簇蛋白(CLU，也称为APOJ)基因、11号染色体上的PICALM基因、1号染色体上的补体受体1基因(CR1)、2号染色体上的桥连整合1基因(BIN1)、19号染色体上的三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员7(ABCA7)或者11号染色体上的跨膜4A(MS4A)基因簇；并且所述的细胞或细胞系还包括以下SNP中的一个或多个：CLU中的rs11136000；PICALM中的rs3851179；CR1中的rs1408077、rs6701713或rs3818361；BIN1中的rs7561528或rs744373；ABCA7中的rs3764650；以及MS4A基因簇中的rs670139、rs610932、rs676309、rs667897、rs662196、rs583791或rs1562990。
15.根据权利要求14的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系还包含SNPrs7982、SNP rs561655、SNP rs592297。
16.根据权利要求14或15的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包含功能胞吞途径、细胞凋亡途径、补体途径或先天性免疫应答途径。
17.根据权利要求14-16的细胞或细胞系用于检测治疗工具、标记工具或识别工具是否可以分别用于治疗AD、标记或识别AD的用途。
18.根据权利要求17的用途，其包括将所述的细胞暴露于受试物质并观察所述物质对所述细胞的胞吞途径、细胞凋亡途径、补体途径或先天性免疫应答途径的效应或者所述的受试物质通过标记或识别所述的SNP从而标记或识别所述细胞的能力。
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