JP2002510975A - アルツハイマー病の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アポリポプロテインＥ遺伝子の発現を制御するゲノムＤＮＡ域にあって、コントロール集団に比してアポリポプロテインＥ遺伝子に変化を誘導し、またはアポリポプロテインＥ遺伝子の対立遺伝子に関する発現を変更する１つまたは複数の変異を実証することを含む、アルツハイマー病の診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー病の診断方法 本発明は、アルツハイマー病の診断方法に関する。 アルツハイマー病は、神経細線維混乱（neurohibrillary tanyle）及びほとん どの場合、アミロイド血管障害（amyloid anyiopathy）の、β−アミロイドプラ ークに関連する皮質ニューロン(cortical neuron)の損失により特徴づけられる 神経変性痴呆である。アルツハイマー病の病因に遺伝学的影響が存在することは 強く推測される(WO94／01772)。 この遺伝学的成分は、アルツハイマー病のある種のファミリー形を説明するた めに年齢−依存性侵透度（penetrance）を伴う常染色体優性態様で疾病が遺伝さ れることを示唆する間接的な観察により長年にわたって有力な役割を演じて来た 。最近の分子遺伝学的研究は、染色体−特異的多型性遺伝子マーカーを見出すこ とによって、アルツハイマー病についての推定上の遺伝子の単離を可能にした(B irdなど、1989，Neurobiology of Aging 10，432-434)。 次の４種の染色体位置付けが関与されるものとして記載されている：早期開始 ファミリー形（６０才以下の開始年齢）における染色体１，１４及び２１上に３ 点及び後期開始家族形及び散在性形における染色体１９上の１点。２つの連鎖(l inkaye)研究は、染色体領域19ｑ13.2がアルツハイマー病の後期開始家族形に関 連していることを示唆している（Pericak-Vanceなど、Am．J．Hum．Genet．(199 1)，48，1034-1050）。この染色体領域内で、アポリポタンパク質（ＡＰＯ）の ための遺伝子のグループＥ−ＣＩ−ＣＩ’−ＣIIが候補領域である。それらの遺 伝子の生成物の中で、アポリポタンパク 質Ｅ（APOE）が特に、神経系において関与している。APOEは老人プラークに存在 し、そしてペプチドＡβについての結合親和性を有する。APOEは３種の主要対立 遺伝子ε２，ε３，ε４により特徴づけられる。Stritlmatterなど、（Proc．Na tl．Acad．Sci．（1993）90，177-181）は、アルツハイマー病の後期開始ファミ リー形におけるAPOE遺伝子のε４対立遺伝子の高頻度の存在を記載している。こ の観察は、アルツハイマー病のファミリー形（Corderなど、Science(1993)，261 ，921-923）及び散在性性(Corderなど、Science(1993)，261，921-923；Saunder sなど、Neurology(1993)，13，1467-1472)に関して確認されている。 フランス特許第2716894号は、一般的集団に関して、アルツハイマー病を進行 せしめる危険性の予知を可能にする方法を記載している。この方法は、APOE遺伝 子のε４対立遺伝子、マーカーＤ19Ｓ178の短い対立遺伝子及びＡＰＯ ＣII遺 伝子の長い対立遺伝子（すべては、染色体１９上に位置する）の検出に基づかれ ている。 いくつかの仮説が、この現象の説明を可能にしている。 本発明者による最近の研究は、今や、19ｑ13.2領域における少なくとも１つの 他の機能的突然変異の存在の仮説を確認する。 実際、アポリポタンパク質Ｅの多型性に対して特異的な機能的効果の他に、本 発明者による研究は、健康な対照に比較して、疾病患者において有意である発現 のレベルの差異を示しており、これは、APOE遺伝子の調節領域における１又は複 数の突然変異がアルツハイマー病の開始に関与していることを示唆している。さ らに、発現における相対的差異が対照に見出されている。 本発明者は特に、Th１／Ｅ47cs転写因子のための可能性ある結合部位に見出さ れるアポリポタンパク質Ｅタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの領域 に新規な多型性を同定している。 この多型性の決定に関しては、Paikなど、（1985，Proc．Natl．Acad．Sci.， vol．82，p.3447）により記載される配列が参照として取られるであろう。 この多型性は、それがTh１／Ｅ47cs転写因子の結合のためのコンセンサス配列 に位置しているので、Th１／Ｅ47csコンセンサスのためのTh１／Ｅ47csとして発 明者により呼ばれて来た。 同定される突然変異は、下記配列におけるチミンとグアニンとの置換（Ｇ→Ｔ ）により特徴づけられる： GGGTGTCTGT（又はG）ATTACTGGG， ここで、Ｇは、正常な集団における最とも頻度の高い対立遺伝子である。 この多型性に対応する対立遺伝子は、この後、Ｔ（塩基がチミンである場合） 又はＧ（塩基がグアニンである場合）として呼ばれる。 対立遺伝子の決定は、この多型性を含んで成るＤＮＡ領域のＰＣＲ増幅の後、 −対立遺伝子の１つを担持する個人に存在しない制限酵素のための切断部位を 、ＰＣＲプライマーの１つに創造することによって、又は −対立遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブ リダイゼーション技法により実施され得る。 本発明者は、APOE遺伝子の対立遺伝子の発現に対するTh１／Ｅ47cs多型性の影 響について研究し、そしてこの対立遺伝子に対して特異的な、Th１／Ｅ47csのＴ 対立遺伝子に関連し、そしてε４対立遺伝子には関連しない進行性アルツハイマ ー病の危険性の上昇を示している。 さらに、Th１／Ｅ47cs多型性は、ε３／ε４遺伝子型を有する個 人におけるε４対立遺伝子に関連する危険性を調整し、ここでＧＴ遺伝子型を有 する個人は、Th１／Ｅ47cs多型性に対してホモ接合性個人に比較して、進行性ア ルツハイマー病の高い危険性を有する。この観察を補強して、本発明者は、同じ 染色体上のε４対立遺伝子とTh１／Ｅ47csのＴ対立遺伝子との組合せが最とも好 ましくない組合せに相当すると見なしている。 従って、本発明の対象は、対照集団に関するアポリポタンパク質Ｅ遺伝子の発 現の変更、又はアポリポタンパク質Ｅ遺伝子の対立遺伝子の相対的発現の変更を 誘発する、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子の発現を調節するためのゲノムＤＮＡ領 域における１又は複数の突然変異の同定を含んで成る、アルツハイマー病の診断 方法である。 本発明の目的のため、診断とは、臨床像が、アルツハイマー病に寄与する症候 学、又はそれに代って、全体としての集団に対しての進行性アルツハイマー病の 対象における高められた確率（確率の上昇は統計学的有意性を示す）を表示する 、患者におけるAPOE遺伝子の調節領域における突然変異の確認を意味することが 理解される。 APOE遺伝子を調節するための染色体ＤＮＡ領域は、アポリポタンパク質Ｅをコ ードする領域以外の染色体領域19ｑ13.2であるとして広く定義されている（Huma n Molecular Genetics，1994，Vol.3，No.4，569-574）。 好都合には、１又は複数の突然変異が同定されている染色体ＤＮＡ領域は、マ ーカーＤ19Ｓ178とＡＰＯ ＣII遺伝子との間に位置し、そしてより具体的には 、イントロン、及びAPOE遺伝子の５Kb上流及び下流の距離にわたって伸びる、AP OE遺伝子のフランキング領域を含んで成る。 本発明の目的は、より具体的には、APOE遺伝子のTATAボックスから１８６個の 塩基に位置する、APOE遺伝子のプロモーターにおける 、前記で定義された配列における置換Ｔ→Ｇから成る少なくとも１つの突然変異 の同定を含んで成る、アルツハイマー病の診断方法である。 より具体的には、本発明の方法は、Th１／Ｅ47転写因子のための可能性ある結 合部位に特に存在する、アポリポタンパク質Ｅをコードする遺伝子のプロモータ ーの領域における１又は複数の突然変異について試験することを含んで成る。 本発明の目的はまた、アポリポタンパク質の遺伝子型の決定、及びAPOE遺伝子 の調節領域における上記の型の突然変異についての試験を含んで成る、アルツハ イマー病の診断方法である。 本発明の診断方法によれば、APOE遺伝子の調節領域における突然変異、特にAP OE遺伝子の発現の変更、又は適切な場合、アポリポタンパク質Ｅの対立遺伝子の 発現の相対的差異を誘発する、上記で定義された突然変異の存在と共に、アポリ ポタンパク質Ｅの少なくとも１つのε４対立遺伝子の存在が、臨床像がアルツハ イマー病に寄与する徴候を表示する患者におけるアルツハイマー病の診断に対す る範囲であり、又は進行性アルツハイマー病の高められた危険性を有する、カテ ゴリー上、良好な健康の対象の分類を可能にするであろう。 対立遺伝子の発現の相対的差異は、遺伝子の発現の絶対的レベルに関係なく、 他の対立遺伝子に対する１つの対立遺伝子の発現の差異を意味することが理解さ れる。 ε４対立遺伝子についての試験は、最とも広く行きわたっている、ε３イソフ ォームのためのそれらの位置における残基ＣＹＳ及びＡＲＧに関して、ε４のた めのアポリポタンパク質Ｅの位置１１２でのＡＲＧ残基及びε２対立遺伝子のた めの位置１５８でのＣＹＳ残基の存在に基づいてのいづれかの適切な方法により 実施される。 上記で定義されたようなAPOE遺伝子の調節領域における追加の突然変異の同定 は、いづれかの適切な方法、特に、この遺伝子のTATAボックスから１８６個の塩 基に位置する、APOEをコードする遺伝子のプロモーターにおける少なくとも１つ の突然変異の同定を含んで成る、アルツハイマー病の診断方法により実施される 。 フランス特許第2,716,894号に記載されるような、APOE遺伝子の少なくとも１ つのε４対立遺伝子、マーカーＤ19Ｓ178の少なくとも１つの短い対立遺伝子及 びＡＰＯ ＣII遺伝子の少なくとも１つの長い対立遺伝子の存在、並びにAPOE遺 伝子の調節領域における少なくとも１つの突然変異の存在が、症候性対象におけ るアルツハイマー病の診断の判断に強く寄与し、又は症候性対象における実質的 な危険因子に寄与するであろう。 アルツハイマー病に関与する突然変異は、脳におけるAPOE遺伝子の対立遺伝子 の相対的発現の変動を担当しているので、上記で定義されたAPOE遺伝子の調節領 域の代わりに、又はそれに代って、APOE遺伝子の発現のレベルを決定し、そして 一般的集団の発現レベルに対してこの発現レベルを比較することがまた可能であ る。 アポリポタンパク質Ｅの発現のレベルの決定に基づく診断方法は、特に、ε４ 対立遺伝子を担持するヘテロ接合性対象において特に好都合である。それらの対 象においては、本発明のための診断方法は好都合には、ε２又はε３対立遺伝子 に対してのε４対立遺伝子の発現レベルの決定を含んで成る。 同じ態様においては、ε２／ε３遺伝子型を有する個人における診断方法は好 都合には、ε３対立遺伝子に対してのε２対立遺伝子の発現レベルの決定を含ん で成る。 ヘテロ接合性対象ε４ε２又はε４ε３におけるε４対立遺伝子、及びヘテロ 接合性対象ε２ε３におけるε２対立遺伝子の発現／ 転写のレベルにおけるそれぞれの上昇又は有意な低下は、さらに対象がアルツハ イマー病の症候を引き起こす臨床像を表わす場合、アルツハイマー型の痴呆に対 する診断を正しく判断するであろう。明らかな臨床像を表わさない対象において は、それぞれ、ε４及びε２対立遺伝子の発現の上昇又は低下は、続く進行性ア ルツハイマー病の対象における高められた確率の表示であろう。 APOE遺伝子、そしてさらに具体的には、APOE遺伝子のε４及びε２対立遺伝子 の発現レベルの決定は、ε４ε２及びε４ε３遺伝子型を有する個人の場合、ε ２又はε３対立遺伝子に対するε４対立遺伝子の転写の割合を確立することによ り、又はε２ε３対立遺伝子を有する個人の場合、ε３対立遺伝子に対するε２ 対立遺伝子の転写の割合を確立することにより、APOE遺伝子のためのmRNAの相対 レベルを測定することによって好都合には実施される。 転写レベルの測定は、発現のレベルを測定することが所望される対立遺伝子に 対して特異的な適切なプライマーの助けを伴って、生検組織からの又は培養物に おける細胞からのmRNAの抽出、及びRT−PCR(逆転写ポリメラーゼ鎖反応)による 増幅に従って実施される。 使用される組織は、大脳組織、特に前頭葉の生検に由来し、従って、脳におけ るAPOEの対立遺伝子の発現レベルの測定を可能にする。それはまた、細胞培養物 におけるリンパ球又は線維芽細胞におけるAPOEのためのmRNAの転写レベルの決定 も可能にする。一般的に、それは、患者と病気である者との間で、他の対立遺伝 子に対する１つの対立遺伝子の発現の百分率の変動を示すことができるいづれか の組織におけるAPOEの対立遺伝子の転写レベルの決定を可能にする。同様に、こ の方法はまた、APOEの対立遺伝子を用いての細胞又は動物モデルの開発及び使用 のためにも適用され得る。 APOE遺伝子の対立遺伝子の発現の割合は次の様にして決定される ： ａ）cDNAが対立遺伝子の少なくとも１つの多型性配列の特異的増幅を可能にす るプライマーの存在下でＰＣＲ増幅にかけられ； ｂ）増幅されたＤＮＡが、対立遺伝子の分別を可能にする、少なくとも１つの 制限酵素の作用にかけられ； ｃ）ＤＮＡフラグメントが分離され； ｄ）得られるフラグメントの量が検出できるシグナルを発するマーカーにより 評価され； ｅ）異なった対立遺伝子における初期割合が次の式により決定される： ここで、Ｎ_oはＤＮＡ分子の初期数であり、 Ａは、異なった制限フラグメント間のサイズ差異の訂正を可能にする比例係数 であり、そして個々の対立遺伝子の特徴を示す制限フラグメントの長さの割合に 等しく、 そしてα’が、 ・次の式： 〔ここで、ＯＤ_maxは、測定され得る最大の光学密度であり、 Ｋ’は定数であり、 ＯＤ_max及びＫ’は次の関数ｆにより決定され： ここで、Ｖは段階ｃ）にかけられたＰＣＲにより得られるサンプル の体積であり、そしてＯＤは測定される光学密度である〕；又は ・次の関数ｇ： 〔ここで、ＯＤは測定される光学密度であり、Ｖは段階ｃ）にかけられたＰＣＲ により得られるサンプルの体積であり、そしてＯＤ_maxは測定され得る最大光学 密度である〕のいづれかにより決定され； APOEの異なった対立遺伝子に関しては、対立遺伝子１を含むＤＮＡの増幅Ｅ₁ の係数は、対立遺伝子２を含むＤＮＡの増幅Ｅ₂の係数に等しい。 本発明の段階ａ）において増幅されるＤＮＡは、RT−PCRの通常の技法によりm RNAから得られる注目の対立遺伝子配列を含んで成るcDNAである。その対立遺伝 子は、上記段階ｂ）及びｃ）に従って分別され、制限多型現象（RFLP）を示す。 段階ｃ）に従ってのＤＮＡフラグメントの分離は、ゲル電気泳動、好ましくは ポリアクリルアミドゲル電気泳動により実施され得る。 APOE遺伝子の場合、ε３，ε２及びε４対立遺伝子は、それぞれ、９１bp、８ ３bp及び７２bpの制限フラグメントにより特徴づけられ得る。 従って、比例係数Ａは、ε３／ε４対立遺伝子に関してＡは９１／７２であり 、ε２／ε４個人に関してＡは８３／７２であり、そしてε２／ε３個人に関し てＡは９１／８３である。後者の遺伝子型に関しては、２種のε２及びε３対立 遺伝子は９１bpの長さの制限フラグメントを提供するので、ＡＯＤ_allele1＋Ｏ Ｄ_allele2＝ ＯＤ_91bpの関係が生成される。 さらに、この方法は特に単純である。実際、サンプルの体積Ｖの関数として光 学密度（ＯＤ）の値を示すのみで十分であり、それは、最小二乗法を用いて、Ｏ Ｄ＝ｆ（Ｖ）がプロットされるよう関数ｆの代表的曲線を可能にし；又はサンプ ルの体積の逆数の関数として値１／ＯＤ、すなわち１／Ｖを示すのみで十分であ り、それは、 線の傾斜がα’の逆数に等しい）、関数ｇの代表的曲線を可能にする。 本発明の目的はまた、異なった多型現象ε及びTh１／Ｅ47csの相、及び任意に は、進行性アルツハイマー病の高められた危険性を引き起こすことができる−49 1AT及び１Ｅ１の決定を含んで成る、アルツハイマー病の診断方法である。 ε３ε４遺伝子型を有する集団のレベルで、ＧＴ遺伝子型に関連する危険性は 、ＧＧ遺伝子型に関連する危険性よりも高い。この観察は、APOEの多型現象Th１ ／Ｅ47cs及びε２，ε３又はε４の相を考慮することによって説明され得る。実 際、ヘテロ接合性ＧＴ及びε３ε４のレベルで、疾病の進行する危険性は、同じ 染色体上のＧ対立遺伝子及びε４対立遺伝子の組合せに依存し、従って、APOEの 多型現象ε及びTh１／Ｅ47csの相を決定する。この相に続いて、次の２種の可能 性が存在する：（ｉ）ε４の高レベル発現、及びε３対立遺伝子の高レベル発現 。最初の可能性は、同型体ＡＰＯε４の性質のための生理学的応答を引き起こし 、そしてε３ε４及びＧＴ遺伝子型を担持する個人のレベルで、より著しい効果 を説明するであろう。前記相に連鎖される発現のレベルのこの差異は、すべての ヘテロ接合性遺伝子型のために真実であろう。しかしながら、Ｇ対立遺伝子に関 連する危険性はたぶん、APOEのε多型現象とTh１／Ｅ 47cs多型現象との間で可能である異なった組合せのために、弱められる。 本発明によれば、APOE及びTh１／Ｅ47csの多型現象の相が、次の態様で研究さ れる： APOE及びTh１／Ｅ47csのε多型現象を含む4600bpのフラグメントが、ＰＣＲに より増幅される。この増幅が、キット、すなわちセンスオリゴヌクレオチドとし て、5'-GGGGGAGGTGCTGGAATCT-3'及びアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、5 '-CAGATGCGTGAAACTTGGTGA-3'を用いての延長された長い鋳型ＰＣＲシステム（Bo ehringer）を用いて実施される。 次に、増幅生成物が、制限酵素Ａｆ１IIIにより消化され、増幅されたフラグ メント上のその単独の切断部位はε３対立遺伝子からのε４対立遺伝子の分化を 可能にする。０．８％アガロースゲル上での消化生成物の移動の後、ＤＮＡはニ トロセルロース膜上に移され、そしてＵＶ下で固定される。Ｔ対立遺伝子とＧ対 立遺伝子との間の識別は、この多型現象のＡＳＯ遺伝子型分類のために使用され るプロトコールに類似するプロトコールにより実施される。 APOE及びTh１／Ｅ47cs多型現象の相に依存して、疾病対象のサブグループを定 義し、そして個々のサブグループについての最適な治療法を決定することが可能 であろう。同様に、その発現に影響を及ぼすことができるAPOE遺伝子の調節領域 の他の多型現象、たとえばBullidoなど、により記載される−491AT,１Ｅ１，Ａ ＰＯ ＣＩ，ＡＰＯ ＣII及びＤ19Ｓ178を有する相の決定はまた、その進行性 疾病の高い危険性での対象のサブグループの決定のために有用であることがわか っている。 従って、アルツハイマー病を有する対象は、一定の治療、特にAPOE遺伝子の対 立遺伝子の型及びコピー数に依存して、コリン様作用 型の治療に応答する素因を有することが知られている。 従って、本発明の目的はまた、たとえばコリン様作用性型の一定の治療に応答 できる、アルツハイマー病を有する対象を同定するための方法にも関し、ここで 前記方法は、 ａ）アポリポタンパク質Ｅの遺伝子型の決定； ｂ）Th１／Ｅ47cs多型現象の遺伝子型の決定；及び ｃ）任意には、アポリポタンパク質Ｅ及びTh１／Ｅ47csの多型現象の相の決定 を包含する。 APOE及びTh１／Ｅ47csの異なった多型現象は、多かれ少なかれ、APOEを十分に 発現する動物又は細胞モデルを創造するために開発され、そして単独で、又は病 理学の開発に影響を及ぼすことができる遺伝子因子、たとえばＡＰＰ，ＰＳ１， ＰＳ２及び同様のもの、又はアルツハイマー病の他のマーカー、たとえばタンパ ク質Ｔａｕの異常リン酸化と組合して使用され得る。 従ってまた、本発明は、正常な集団に比較して、進行性アルツハイマー病の危 険性を変えることができる、APOE遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、及びTh ｌ／Ｅ47cs多型現象の１つの対立遺伝子、並びに任意には、他の遺伝子又はこの 遺伝子に隣接するマーカーの１又は複数の他の対立遺伝子を含んで成る、真核細 胞のためのトランスフェクションベクターにも関する。 それらのベクターは、トランスフェクトされた真核細胞、又はトランスジェニ ック動物の生成のために使用され得る。 従って、本発明のもう１つの目的は、上記のようなベクターによりトランスフ ェクトされた真核細胞、又はそのようなベクターにより生成されるトランスジェ ニック動物から成る。 脳におけるAPOE遺伝子のためのmRNAの発現レベルの研究の結果が、下記に与え られるであろう。例１：健康な対照に比較して、アルツハイマー病を有する患者におけるAPOE遺 伝子の脳における発現 １）ＲＮＡの抽出及び転写体の増幅 組織を、年齢６５又はそれ以上の対照、及びアルツハイマー病の後期開始を有 する患者（この診断は、ヘテロ接合性APOE遺伝子型を有することが、神経病理学 的試験により確認されている）から選択した。 ＲＮＡの抽出を、J．Biol．Chem．247，4621-4627(1972)に記載のようにして 、又は抽出キット（QIAGEN）を用いて、前頭葉のサンプルに対して実施し、そし て次に、ＲＮＡをＤＮアーゼ（Eurogentec）により消化した。RT−PCRを、J．Li pid．res．31，545-548（1990）に記載されるプライマーの助けにより実施した 。逆転写反応を、製造業者の説明書(Gibco／BRL)に従って、Ｍ−MLV逆転写酵素 のための鋳型として全ＲＮＡ １μｇを用いて、５０ｐモルでのプライマーＦ４ (5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3')の助けにより、３７℃で１．５時間、実施し た。ＰＣＲを、９４℃で１０分、続いて、５８℃で１分、７２℃で１分、及び９ ４℃で１分、３０サイクル実施した。 ＰＣＲのための２５μｌの反応体積は、５０ｐモルでのプライマーＦ６(5'-TA A GCT TGC CAC GGC TGT CCA AGG A-3')、０．５mMでのdNTP，０．１mMでのMgCl₂ ，０．１％でのTriton Ｘ−100,１５％でのグリセロール及び0.05単位でのTaq −Polymerase（Engentec）を含んだ。 mRNAの差別的な発現を計算する方法は、上記の通りである。 れた。 制限フラグメントの長さを、対立遺伝子ε３のために９１bpで、 対立遺伝子ε２のために８３bpで、及び対立遺伝子ε４のために７２bpで決定し た。 係数Ａの値は、それぞれ、遺伝子型ε３ε４及びε２ε４に関しては、Ａ＝９ １／７２及びＡ＝８３／７２に対応する。係数Ａの値は、遺伝子型ε２ε３に関 しては、Ａ＝９１／８３に対応する。遺伝子型ε２ε３を、９４及び８３bpでの バンドにより特徴づける。この場合、２種の対立遺伝子ε２及びε３が９１bpの 制限フラグメントを与えると、ＡＯＤε２＝ＯＤε３＝ＯＤ９１ｂｐである。 ２）結果 結果は、図１〜４に示されている： 図１は、染色後、RT−PCRによる増幅の生成物を表わし； 図２は、アルツハイマー病を有するヘテロ接合性個人ε２ε３、ε３ε４、及 びε２ε４、及び対照のmRNAの発現を表わす。黒の線は、平均値を表わす。矢印 は、ε２／ε４遺伝子型を有する個人におけるε４対立遺伝子の発現レベルの予 測される値を表わす。それらの値は、それぞれ、ε２／ε４、及びε３／ε４遺 伝子型を有する個人における対立遺伝子ε２及びε４について観察される百分率 から推定される。 図３は、サンプリングの時点で認識できる障害を示さない若い健康な対象、及 びアルツハイマー病の可能性ある診断を示す痴呆対象における対立遺伝子の発現 レベルの測定値を表わす。 図４は、Th１／Ｅ47cs及び−491AT遺伝子型の関数としての患者及び対照にお けるε４対立遺伝子の発現の百分率を表わす。対照個人は、円により表わされ、 そして疾病個人は、三角により表わされる。黒の図柄は、−491AT多型現象のた めのヘテロ接合性遺伝子型個人に対応する。発現のための平均値は、黒の棒によ り表わされる。 対象の数は、アルツハイマー病を有する患者に関しては、４９人であり、そし て対照に関しては、４５人であった。 結果は、ε３対立遺伝子のためのmRNAの発現が、すべての場合、ε４対立遺伝 子のためのmRNAの発現よりも高かったことを示す。この結果は、遺伝子型が決定 された個人の脳に見出されたAPOEタンパク質のレベルの既知測定値と一致する。 この研究においては、ε３ホモ接合体におけるAPOEのレベルは、ε４ホモ接合体 についてのそのレベルよりもそれ自体、高い、ε３ε４ヘテロ接合体についての そのレベルよりも高かったことが示されている。お互いに付加されると、その結 果は、異なったmRNA種の安定性に差異が存在するか、又は遺伝子多型現象と不均 衡に２種の対立遺伝子の発現に遺伝子変動性が存在することを示唆することがで きる。しかしながら、明確且つ一定した差異がさらに、患者と対照との間の対立 遺伝子発現の割合に存在する場合、第２の仮説がたぶん、正しい仮説である。ア ルツハイマー病を有する患者は、対照よりも高いε４mRNAの相対的発現を表わす （それぞれ、22.9±２．４％に対して34.9±２；Mann and Whitney非母数試験に よれば、Ｐ＜0.0001）。ε４対立遺伝子の発現の上昇がまた、同じ遺伝子型の対 照と比較して、ε２ε４遺伝子型を有する患者において検出される（28.0±２． ８％に対して46.0±５．４％，Ｐ＜0.01）。他方では、ε２対立遺伝子の相対的 発現の有意な低下が、同じ遺伝子型の対照に比較して、ε２ε３遺伝子型を有す る患者の脳に示される（47.8±３．９％に対して32.8±４．５％，Ｐ＜0.002）( 図１)。得られるデータを確かめると、ε２ε４遺伝子型を有する、疾病又は対 照個人において測定された値は、他の遺伝子型から推定される値に対応する（図 １）。 APOEの対立遺伝子の発現の差異が脳に対して特異的であるか、又は生存する患 者から得るために容易である他の組織（リンパ球、線 維芽細胞及び同様のもの）に見出され得るかどうかを知るために、本発明者は、 リンパ球におけるAPOEの対立遺伝子の差別的発現を研究して来た。この研究に関 する結果は下記に与えられるであろう。 例２：アルツハイマー病を有する個人、及び研究の時点で、認識できる障害を 示さない若い個人のリンパ球におけるAPOE遺伝子の発現 １）リンパ球及び培養物の分離 血液サンプルを、アルツハイマー病をたぶん有する個人、及び研究の時点で、 認識できる障害を有さない若い個人から集める。すべてのそれらの個人は、ε３ ε４遺伝子型を有する特異的な特徴を有する。 リンパ球の分離を、Ficollグラジエントを含むLeucosep管上で実施した。RPMI によるリンパ球の数回の洗浄の後、それらを、RPMI，１０％のＦＣＳ，２mMのグ ルタミン酸塩、１００μＭのストレプトペニシリン及び１％の植物凝集系から構 成される培養培地(Gibco／Brl)に再懸濁した。次に、細胞濃度は、１×１０⁶個 の細胞／mlである。懸濁液における細胞を、４８時間、培養する。 ２）ＲＮＡの抽出及び転写体の増幅 使用される方法は、上記例１に記載される通りである。 ３）結果 本発明者は、研究されたすべての個人（疾病又は対照の個人のいづれにせよ） において、ε４対立遺伝子と比較して、ε３対立遺伝子の高レベルの発現を観察 し、従って、大脳組織において行なわれた観察に一致する。リンパ球においては 、患者はε３ε４遺伝子型を有する患者の脳のレベルで観察されるレベルに近い レベルでε４対立遺伝子を発現する。７人の潜在的に疾病の個人のうち、すべて は、アルツハイマー病の診断が確かである個人からの大脳サンプル から得られたレベルに類似するε４対立遺伝子の発現レベルを示す。 本発明者は、ε３ε４遺伝子形を有し、そしてサンプリングの時点で、認識で きる障害を有さない２３〜５５才の５人の個人におけるε４対立遺伝子の相対的 発現を研究した。これは、ε４対立遺伝子の発現レベルの変性が、アルツハイマ ー病の臨床学的徴候を示さない個人に認識できるかどうかを決定することを意図 される。従って、進行性アルツハイマー病の高い危険性での個人を早期に決定す る可能性が存在する。研究された５人の個人のうち、すべては、対照の脳におい て観察される発現レベルに近い発現レベルを示した。それらの結果は、従って、 この試験の感度及び特異性が卓越していることを示唆する。 結論においては、ε４対立遺伝子の発現の相対的レベルが明確なアルツハイマ ー型患者の大脳組織、及び可能性あるアルツハイマー型患者のリンパ球において 類似することを示すことが好都合である。同様に、この発現レベルは、認識でき る障害を示さない人々に関して、それらの２種の細胞型において類似することが できた。現在まで、アルツハイマー病におけるAPOEの役割の関連性を要求するす べての仮説は、APOEの異なった対立遺伝子が同等の態様で、及び同一の濃度で脳 において発現される事実に基づかれていた。本発明の結果は、これが問題ではな く、そしてこの差異が対照集団に比較して、アルツハイマー病を有する患者にお いて有意により目立つことを、最初に示している。APOE遺伝子の他のヘテロ接合 性遺伝子型、及び遺伝子型にかかわりなく、APOE遺伝子の絶対的定量化について の同じタイプの研究が進行中である。 結論においては、現在までに得られた結果は、APOE遺伝子の調節領域における 突然変異の存在と一致する。 Th１／Ｅ47cs多型現象を証明した結果が下記に与えられるであろう。 例３：Th１／Ｅ47cs多型現象の特徴化及びアルツハイマー病におけるその影響 力 １．APOE の配列決定 ３７５塩基対のフラグメントを、センス鎖のためのプライマー：5' TACTTTCTT TCTGGGATCCAGG 3'及びアンチセンス鎖のためのプライマー：5' ACTCAAGGATCCCAG ACTTG 3'を用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅は、３５のサイクル（オリゴヌ クレオチドのハイブリダイゼーションのための温度：５３℃）にわたって、最終 的に１mMのMgCl₂を含む緩衝液において実施される。得られるフラグメントを、 前処理（アメリカ特許第70993号−Amersham）及び配列決定(USB−Amersham−Ｔ ７ ＰＣＲ生成物配列決定キット)のためのキットにおいて、記載される条件に 従って配列決定した。 ２．制限酵素による多型現象ポリＬＢＰ１の検出 ポリＬＢＰ１多型現象を含む２２８塩基対のフラグメントの増幅を、０．５mM のMgCl₂,０．５％のDMSOの存在下で、４０サイクルにわたって実施した。オリゴ ヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための温度は、５３℃である。アンチ センスオリゴヌクレオチドは、配列決定のために使用されるものと同一である。 センスオリゴヌクレオチドは次の通りである：5' AGAATGGAGGAGGGTGCCTG 3'。制 限酵素BstnＩのためのＧ対立遺伝子を有する切断部位の創造を可能にする修飾さ れたヌクレオチドは太字で示されている。消化は、６０℃で一晩、実施される。 消化生成物を、１２％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリル アミド、１９：１）上で分離し、そして臭化エチジウム浴において染色する。Ｔ 対立遺伝子を、４９bpでの制限フラグメントにより特徴づけ、そしてＧ対立遺伝 子を３１bpでの制限フラグメントにより特徴づける。 ３．個々の対立遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドのアニーリングに よる多型現象の検出（アニーリング特異的オリゴヌクレオチド又はＡＳＯ） ポリＬＢＰ１多型現象を検出するために使用されるＡＳＯ技法は、Tiretなど 、(1994，Lancet，Vol.344，910-913)により記載されるプロトコールに基づかれ る。オリゴヌクレオチドに関連するポリＬＢＰ１多型現象の検出に対して特異的 な修飾、及び洗浄温度は次の通りである：Ｇ対立遺伝子に対して特異的なオリゴ ヌクレオチドは配列5' GCCCAGTAATCCAGACACCC 3'及び洗浄温度６１℃を有し、Ｔ 対立遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドは、配列5' GCCCAGTAATACAGACA CCC 3'及び洗浄温度６２℃を有する。 ４．結果 本研究で使用した最初のヨーロッパ人集団は、３１０名のコントロール（年齢 ＝７３．５±１０．９；３７．３％男）と初期及び後期の散発型のアルツハイマ ー病にかかっている２９３名の被験者（年齢７４．６±９．３；発病時の年齢＝ ７１．０±８．９歳；３２．２％男）から成る。この集団について、ＡＰＯＥ座 の３種類の遺伝多形を試験した；上記の方法によるＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形、Ｍ ｕｉら、（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９６、４７巻、１９６−２０１）の用いた 方法による１Ｅ１多形、ＨｉｘｏｎとＶｅｒｎｉｅｒ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ ．３１巻、５４５−５４８）の技術によるＡＰＯＥの多形である。被験者の数は 、試験した多形により変動した；Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓの研究では病人２７９名と コントロール３１０名；１Ｅ１の研究では病人２９３名とコントロール３０７名 であった。 ＡＰＯＥ遺伝子型に関する個々のヘテロ接合性のレベル解析にお ける研究の統計力を改善するために、著者らはε３／ε４遺伝子型の被験者を別 集団より加え、該遺伝子型の個体数を増加し、最終的に合計１５２名の病気個体 と９１名のコントロール個体（それぞれ７３．３±８．５歳及び７０．３±８． ５歳）を得た。 調べた３種類の多形の分布を表１に示す。いずれの多形についても、ハーディ ーワインベルク（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡に対する偏差は観察され なかった。 本病気の発症傾向は相対リスクＯＲ（”オッズ比”）を近似する係数により表 される。 ＣＩは９５％の信頼幅を表す。 結果は表１ないし５に示されている。 予想通り、ε４対立遺伝子はアルツハイマー病と密接に関連していた（ＯＲ＝ ４．６７ ＣＩ９５％［３．２８−６．６７］）が、一方ε２対立遺伝子は保護 効果（ＯＲ＝０．２７ ＣＩ９５％［０．１４−０．５２］）を示した。コント ロール集団（０．５３１）において、病気集団（０．４６８）の観察結果と最も 逆の結果を示したものはＴｈ１／Ｅ４７ｃｓのＧ対立遺伝子であった。病気個体 の対立遺伝子および遺伝子型の分布は、コントロールに比べ有意に異なっていた （それぞれＰ＝０．０３およびＰ＝０．００７）。Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓのＴ対立 遺伝子はアルツハイマー病の発病リスクの増加と関連し（ＯＲ＝１．２９ ＣＩ ９５％［１．０２−１．６３］、また少なくともＴ対立遺伝子を１つ有する個人 のＯＲは１．７９（ＣＩ９５％［１．２１−１２．６５］、Ｐ＝０．００２）で あった。１Ｅ１多形に関して、対立遺伝子と遺伝子型の分布は２つの集団で有意 に異なっていた（それぞれｐ＝０．００２およびｐ＝０．０００５）。１Ｅ１の Ｃ対立遺伝子は病気の発症のリスクの低下と関連していた（ＯＲ＝０．５６ Ｃ Ｉ９５％［０．４０−０． ７８］、Ｐ＝０．０００３）。 著者らは、調べた異なる多形について、対にした連鎖不平衡を計算した（表２ ）。Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ、１Ｅ１およびＡＰＯＥ多形の間に、明瞭な連鎖不平衡 が存在していた。次に、著者らはミリアッド（Ｍｙｒｉａｄ）のハプロタイプア ルゴリズムを利用し、これら３種類の多形より得られるハプロタイプを推定した （表３）。ハプロタイプの推定分布は病気個体とコントロール個体の間で有意に 異なっていた。さらに、ε４対立遺伝子とアルツハイマー病との強い関連性を考 慮にするために、著者らはε３／ε３およびε３／ε４遺伝子型のサブタイプの 推定ハプロタイプ分布を比較したところ、患者とコントロールの間に分布の有意 な違いが存在した（表３）。これらの結果は、ＡＰＯＥのε多形に比べＴｈ１／ Ｅ４７ｃｓ及び１Ｅ１の多形が特異的な効果を有していることを示唆している。 一般集団（患者＝２６１名、及びコントロール＝２５３名）について、著者ら は各多形の対立遺伝子を少なくとも１つ有している個人に関するアルツハイマー 病の発症リスクを見積もり、まず第一段階としてこれら多形間について独立に見 積もった（表４）。全ての多形を同時に算定回帰に加えると、Ｔｈ１／Ｅ４７及 び１Ｅ１の効果が存続し、さらに増加することさえあり、複数の多形がＱＰＯＥ 座内部に存在するという仮説は支持された。 ＡＰＯＥ対立遺伝子の発現のレベルが、ＡＰＯＥ遺伝子のプロモーター域内の シス型変異の存在により増加するのであれば、次の３点について検証しなければ ならない：（１）プロモータ内に存在する変異がＡＰＯＥ対立遺伝子の発現を変 調、すなわちε４対立遺伝子の有害作用を提示するか、あるいはε２対立遺伝子 の保護効果を亢進しなければならない；（２）ヘテロ接合性個体では、ＡＰＯＥ の２対立遺伝子の発現の相対レベルがリスクを決定しているのであ れば、この変異の持つインパクトは、ＡＰＯＥについてヘテロ接合性である遺伝 子型の集団とホモ接合性である遺伝子型集団で同じでないはずであり；（３）ヘ テロ接合型個体内のシス型変異の作用は、ＡＰＯＥの対立遺伝子に関する多形の 相（即ちハプロタイプ）に依存していなければならない。Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓの 遺伝子型がヘテロ接合性であるε４対立遺伝子コピーを有する個体では、ε４対 立遺伝子はＴｈ１／Ｅ４７ｃｓのＴ対立遺伝子、またはＧ対立遺伝子のいずれか に関連しているだろう。これらの組合せの１つがε４対立遺伝子の発現の相対レ ベルを増加し、ε３対立遺伝子の発現相対レベルを減少させ、そして他の組合せ は逆の作用を有するのであろう。 即ち、ε３／ε４遺伝子型の個体に於いては、Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓに関するヘ テロ接合体とホモ接合体でアルツハイマー病の発症リスクが異なるだろう。これ ら仮説を検証するために、著者らはＴｈ１／Ｅ４７ｃｓについてヘテロ接合性で ある個体と、同一多形についてホモ接合体である個体について病気の発症リスク （性別及び年齢で補正した）を比較し、調べた。Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ遺伝子型と ＡＰＯＥ遺伝子型がヘテロ接合性である個体のみが、病気発症リスクの増加を示 し（ＯＲ＝２．４０ ＣＩ９５％［１．４０−４．１２］、Ｐ＝０．００１）、 ＡＰＯＥ遺伝子型がホモ接合性である個体ではこの作用は認められなかった（Ｏ Ｒ＝１．０２ ＣＩ９５％［０．６７−１．５７］、ｐ＝０．９１）。アルツハ イマー病の発症リスクは、Ｅｈ１／Ｅ４７ｃｓ遺伝子型がホモ接合型である個体 に比べて、該遺伝子型がヘテロ接合型である個体の方高いことから（ＯＲ＝１． ９０ ＣＩ９５％［０．９７−３．７０］、Ｐ＝０．０６；患者＝１０７名及び コントロール＝５４名）、このインパクトはε３／ε４遺伝子型の亜集団で特に 顕著であった。このリスク 上昇はε３／ε４遺伝子型集団を拡張することで顕著になった（ＯＲ＝２．０７ ＣＩ９５％［１．２１−３．５４］、Ｐ＝０．００８；患者１５２名およびコ ントロール＝９１名）（表５）。段階理論回帰を利用し、著者らは病気発症リス クがＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ遺伝子型がヘテロ接合性である個体でのみ変化し（ＯＲ ＝１．８９ＣＩ９５％［１．０７−３．３５］、Ｐ＝０．０２７）、そして１Ｅ １遺伝子型についてヘテロ接合型である個体では変化しないことを示した。従っ てこれらの結果は、２つの多形Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓと１Ｅ１を比べた場合では、 ＡＰＯＥ対立遺伝子の発現相対レベルを変調させる候補がＴｈ１／Ｅ４７ｃｓと 考えられることを示唆している。 アルツハイマー病の発症リスクに及ぼすＴｈ１／Ｅ４７ｃｓおよびＡＰＯＥ多 形の相の影響を調べるために、著者らは患者またはコントロールを対象に、遺伝 子型がε３／ε４である個体に於けるＴｈ１／Ｅ４７ｃｓのＴまたはＧ対立遺伝 子とε４対立遺伝子とが連関したハプロタイプの頻度について見積もった。ε３ ／ε４とＧＴの遺伝子型を持つ個体では、コントロールの５７．６％が同一染色 体上にＴおよびε４対立遺伝子が連関していると考えられ、この比率は患者では ６９．７％となった。従ってこのハプロタイプを有する個体の推定ＯＲは１．７ であり、この結果もまたＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形がε４対立遺伝子の発現レベル に影響できることを示唆している。 これらの結果を確認するため、著者らはより大規模の症例及びコントロール集 団に於けるＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形のインパクトについて調べた。さらに彼らは 本研究と、同様にＡＰＯＥの発現レベルを変えることができるＡＰＯＥ遺伝子の プロモーターの新規多形、−４９１ＡＴ（Ｂｕｌｌｉｄｏら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅ ｔ、１９９８ ）を組み合わせた。選択された集団は、５７３名のアルツハイマー病と思われる 症例（年齢＝７３．８±８．１歳、発病時年齢＝７０．４±７．９歳、３５．９ ％男）および５０９名のコントロール（年齢＝７４．９±９．９歳、３５．９％ 男）を含んでいる。 上記の如く、ε４対立遺伝子は強く病気と関連している（ＯＲ＝５．４０ Ｃ Ｉ９５％［４．１１−７．０９］、ｐ＜０．０００１）のに対しε２対立遺伝子 は保護効果を有する（ＯＲ＝０．４７ＣＩ９５％［０．３１−０．７０］、ｐ＝ ０．０００３）ことから、本集団はアルツハイマー病のＡＰＯＥ遺伝子のインパ クトの研究に適している。Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形のＴ対立遺伝子の頻度は、コ ントロールに比べ患者例で増加しており（表６）、また少なくとも１つのＴ対立 遺伝子を有する個体に於けるＡＤ発症のリスクは２．１３である（ＣＩ９５％［ １．６１−２．８３］）。 −４９１ＡＴの多形に関する研究のレベルでは、著者らはまず第一に上記の北 米集団に観察した頻度と同様の頻度分布を対立遺伝子及び遺伝子型について観察 した。コントロールに比べて患者では−４９１ＡＴ多形のＴ対立遺伝子座の頻度 は低下し、−４９１ＡＴ多形のＴ対立遺伝子を少なくとも１つ持つ個体のＡＤ発 症リスクの関連ＯＲは０．６７（ＣＩ９５％［０．５２−０．８８］、ｐ＝０． ００４）であった（表４）。 ２つのＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ及び−４９１ＡＴ体型とＡＤとの関連性に対しε４ 対立遺伝子に拠るバイアスが加わる可能性を除外するために、著者らは理論回帰 補正を用い、各遺伝子座のε４対立遺伝子の有無に及ぼす効果を試験した。補正 後、Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形のＴ対立遺伝子が少なくとも１つ存在することに伴 うリスクは残ったが（ＯＲ＝１．５６ ＣＩ９５％［１．１５−２．１１］、ｐ ＝０．００４）、一方−４９１ＡＴ多形が少なくとも１つ存在する ことに伴うリスクは消失した（ＯＲ＝０．８２０ ＣＩ９５％［０．６２−１． １０］、ｐ＝０．１９）。 この観察は、Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓのＴ対立遺伝子の作用がε４対立遺伝子の存 在から説明されないことを示唆している。最初の研究中に上記示唆された如く、 ＡＰＯＥ対立遺伝子の発現レベルがプロモーター領域のシス型変異の関数として 増減するものであれば、これら変異は主にε２／ε３／ε４のヘテロ接合型個体 に於いて様々な、検出可能な作用を有しているはずである。この仮説を検証する ために、著者らは年齢、性別、及びＴｈ１／Ｅ４７ｃｓならびに−４９１ＡＴ多 形のＴ対立遺伝子が少なくとも１つ存在する事に関し理論回帰補正し、ＡＰＯＥ 遺伝子型がヘテロ接合型及びホモ接合型である個体を対象に、ＡＤ発症リスク関 連するＯＲｓを調べた。ε２／ε３／ε４ホモ接合型個体については、いずれの 効果も検出されなかった（Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ及び−４９１ＡＴのＴ対立遺伝子 を少なくとも１つ持つ個体それぞれに関し、ＯＲ＝１．１３、ＣＩ９５％［０． ７７−１．６５］及びＯＲ＝０．９９ ＣＩ９５％［０．６８−１．４４］、ｐ ＝０．１９）、ｐ＝０．１９）。一方、ε２／ε３／ε４ヘテロ接合型個体の場 合、Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓのＴ対立遺伝子を少なくとも１つ持つ例では病気発症リ スクが高くなった（ＯＲ＝３．５７ ＣＩ９５％［２．２２−５．７５］、ｐ＜ ０．０００１）のに対し、−４９１ＡＴのＴ対立遺伝子を少なくとも１つ持つ例 は保護効果を有していた（ＯＲ＝０．５７ ＣＩ９５％［０．３７−０．９０］ 、ｐ＝０．１９）。従って、これらの観察は著者らの最初の仮説と一致した。 即ち、２つの疫学研究より著者らが得た結果は、ＡＰＯＥ遺伝子のプロモータ ー領域、特にＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形に、ＡＰＯＥ遺伝子のε体型とは無関係に アルツハイマー病の発生を促進できる変 異があることを示している。この多形は研究対象集団に於けるε４対立遺伝子の インパクトを変化せしめ、ε３／ε４集団内に様々なリスクを有する亜集団を定 義し、最も高いリスクを示すＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形がヘテロ接合型である個体 を定義する。相を推定することで、最もリスクの高い亜集団をより理解する事が 可能となり、それは同一染色体上にε４対立遺伝子とＴ対立遺伝子の組合せを有 する例であった。 これら多形の影響は、他の対立遺伝子と比較したε４対立遺伝子の発現レベル の上昇またはε２対立遺伝子の発現低下から説明することができ、この仮説は患 者及びコントロールの脳のＡＰＯＥ対立遺伝子に由来するｍＲＮＡｓの発現の差 に関する分析より支持されている。各多形に特異的な対立遺伝子を用いて、これ ら２種類の多形間の相を研究することが重要であろう。 即ち、まず２つの疫学研究で著者らは２つの多形がＡＤ発症リスクに対し特異 的な効果、Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓと−４９１ＡＴのＴ対立遺伝子それぞれが有害効 果と保護効果を持つことを示した。第２に著者らはＡＰＯＥ対立遺伝子の発現に 顕著な差、即ち同遺伝子型コントロールと比較した場合のε３ε４及びε２ε４ 遺伝子型患者に於けるε４対立遺伝子の過剰発現、及びε２ε３型患者に於ける ε２対立遺伝子の低発現、があることを観察した。最後に、コントロールの研究 より演鐸されたデータと一致し、ε３ε４患者の脳に於けるε４対立遺伝子の発 現レベルは、ＡＯＰＥ遺伝子の調整領域内に存在する変異に相関した。Ｔｈ１／ Ｅ４７ｃｓのＴ対立遺伝子は患者に於けるε４対立遺伝子の発現の相対レベルを 増加し、一方−４９１ＡＴのＴ対立遺伝子はそれを低下した（図３および表５） 。これらの結果は、肝細胞癌樹立株に於いてこれら２種類の変異によりＡＰＯＥ 遺伝子の発現が変化することを示唆している最近のデ ータに合致するものである。 Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形が転写因子Ｔｈ１／Ｅ４７の結合に関するコンセンサ ス部位内、よりさらにヘリクッス−ループ−ヘリクッス転写因子Ｅ４７の結合域 内に存在することを書き留めることは重要である。この因子は広範に発現するク ラスＡ蛋白に属し、クラスＢ蛋白と複数の結合体を形成し遺伝子の組織特異的発 現をコントロールする（Ｍｕｒｒｅら、Ｃｅｌｌ．１５巻、４５１−４５９）。 具体的には、Ｅ４７は、複数のＢクラス蛋白と結合し脳で発現しており、哺乳動 物の神経系の発生と維持に関与している。一方、マウス胚のｃＤＮＡライブラリ ーのスクリーニング中に特定された転写因子Ｔｈ１についてはほとんど分かって いない。相同の蛋白がショウジョウバエで報告されており、その発現が神経形成 に必須であるクラスＡ転写因子、Ｄａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓと結合する。 結論として著者らにより集められた全てのデータは、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を 調べることでＡＰＯＥ遺伝子型に関するヘテロ接合個体での診断が可能になるだ けでなく、リスクの高い亜集団をさらに定義することができるようになることが 示された。従って、この情報は新しい治療目標の設定及び最適治療の処方にとっ て重要になるだろう。表１： コントロール及び患者集団に於ける、ＡＰＯＥ Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ及び １Ｅ１多形の各種対立遺伝子の組合せ APOEおよび1E1多形の組合せAPOEおよび1E1多形の組合せ 表２：染色体域１９ｑ１３．２領域の連鎖不平衡 ＡＰＯＥ体型は２対立遺伝子マーカー（即ち対立遺伝子４対対立遺伝子２又は３ ）として分析した。連鎖不平衡の標係数△は表の対角線の上に示す。特定の対立 遺伝子頻度に関する連鎖不平衡の最大％Ｄ’は対角線の下に示す。 表３：染色体域１９ｑ１３．２内にある、試験対象の各種多形間で可能なハプロ タイプの推定。非定型マーカーＤ１９Ｓ１７８を本研究に加えた。ｂ．ε３／ε３遺伝子型集団Ｃ．ε３／ε４遺伝子型集団 表４：多重理論回帰により推定されたＯＲｓ表５：拡大ε３ε４集団に於ける１Ｅ１及びＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ遺伝子型の分布 表６．ＡＰＯＥ Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ及び−４９１ＡＴ多形の、対立遺伝子及び 遺伝子型の分布 表７．Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ及び−４９１ＡＴ多形の関数としての、患者及びコン トロール内のε４対立遺伝子の相対発現

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 シャルティエ−アルラン，マリー−クリス ティーヌ フランス国，59139 ワティグニエ，リュ サディ カルノ，39 (72)発明者 ランベール，ジャン−シャルル フランス国，エフ―59000 リール，アブ ニュ レオ ラグランジュ，76 (72)発明者 アムイエル，フィリップ フランス国，エフ―59700 マルク アン バルール，リュ デュ ケスヌ，75

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アポリポプロテインＥをコードする遺伝子の発現を制御しているゲノムＤ ＮＡ域内にあり、コントロール集団に対しアポリポプロテインＥ遺伝子の発現を 変化、またはアポリポプロテインＥ遺伝子の対立遺伝子の相対発現の変化を誘導 する１つ、またはそれ以上の変異を特定することを含むアルツハイマー病の診断 方法。 ２．染色体領域１９ｑ１３．２内にあって、アポリポプロテインＥをコードす る遺伝子の発現またはアポリポプロテインＥ遺伝子の対立遺伝子の相対発現に差 を誘導する、アポリポプロテインＥをコードする染色体ＤＮＡ域以外にある１つ 、またそれ以上の変異を特定することを含む、請求項１のアルツハイマー病診断 法。 ３．マーカーＤ１９Ｓ１７８とＡＰＯ ＣＩＩ遺伝子の間にあって、アポリポ プロテインＥをコードする染色体ＤＮＡ域以外の染色体ＤＮＡ域内にある１つ、 またはそれ以上の変異を特定することを含む、請求項１または請求項２のアルツ ハイマー病診断法。 ４．ＡＰＯＥ遺伝子の５ｋｂ上流または下流の距離に広げたアポリポプロテイ ンＥ遺伝子のイントロン及びフランキング域にある１つ、またはそれ以上の変異 を特定することを含む、前記請求項のいずれかのアルツハイマー病診断法。 ５．Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ転写因子の潜在結合部位に特に存在するアポリポプロ テインＥをコードする遺伝子のプロモーター域内の１つ、またはそれ以上の変異 を特定することを含む前記請求項いずれかのアルツハイマー病診断法。 ６．アポリポプロテインＥをコードする遺伝子のＴＡＴＡボックスから１８６ 塩基の位置にある、該遺伝子プロモーター内にある１つ、またはそれ以上の変異 を特定することを含むアルツハイマー病 診断法。 ７．正常集団に於いてはＧが最も多い対立遺伝子であり、変異がＧＧＧＴＧＴ ＣＴＧ（Ｇ→Ｔ）ＡＴＴＡＣＴＧＧＧであることを特徴とする、請求項５のアル ツハイマー病診断法。 ８．多形領域のＰＣＲ増幅のためのプライマー内に、対立遺伝子の１つを有す る個体には存在しない制限酵素切断部位を作ること、又は この多形を含む領域をＰＣＲ増幅した後に、対立遺伝子特異的な折り語ヌクレ オチドプローブを用いるハイブリダイゼーション法により、変異を特定すること を特徴とする、前記請求項いずれかのアルツハイマー病診断法。 ９．次の工程を特徴とする前記請求項いずれかのアルツハイマー病診断法： ａ）アポリポプロテインＥ、特にε４対立遺伝子の遺伝子型を決定し、 ｂ）アポリポプロテインＥ遺伝子の発現を制御するゲノムＤＮＡ域にある変異 、特にアポリポプロテインＥ遺伝子の発現の変更またはアポリポプロテインＥ遺 伝子の対立遺伝子の相対発現の変更を誘導するタイプの変異、特に請求項２ない し７に規定される変異を特定する。 １０．ＡＰＯＥ遺伝子型がヘテロ接合性である個体のε２、ε３及び／または ε４対立遺伝子の発現レベルを決定することを特徴とする、アルツハイマー病診 断法。 １１．生検により採取した脳組織、リンパ細胞または培養繊芽細胞、またはＡ ＰＯＥ対立遺伝子の発現に差があるその他の組織の生体サンプルを用い、請求項 １ないし７に規定される変異を特定し、及び／または請求項１０に規定されるＡ ＰＯＥ対立遺伝子の発現レ ベルを測定することを特徴とする、前記請求項いずれかのアルツハイマー病診断 法。 １２．各種εとＴｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形間および、場合によりアルツハイマー 病のリスク増加をもたらす−４９１ＡＴおよび１Ｅ１間の相を決定することを特 徴とする、アルツハイマー病診断法。 １３．εおよびＴｈ１Ｅ４７ｃｓの多形、並びに随意ＡＰＯＥの−４９１ＡＴ 及び１Ｅ１を加えたハプロタイプを、ＡＰＯＥ遺伝子に近接するその他の遺伝子 またはマーカー、特にＡＰＯ、ＣＩ、ＡＰＯ ＣＩＩおよび／またはＤ１９Ｓ１ ７８と組合せ、決定することを特徴とするアルツハイマー病診断法。 １４．ＡＰＯＥ遺伝子の対立遺伝子発現の変動を更に測定することを特徴とす る、請求項１２または１３の診断法。 １５．つぎを含む、特定の治療法、例えば固リン作動性治療薬に対し反応でき るアルツハイマー病患者を特定する方法； ａ）アポリポプロテインＥの遺伝子型を決定し； ｂ）Ｔｈ１／Ｅ４７ｃｓ多形および該対立遺伝子のコピー数を決定し；及び ｃ）随意、アポリポプロテインＥ及びＴｈ１／Ｅ４７ｃｓの多形の相を決定す る。 １６．ＡＰＯＥ遺伝子の対立遺伝子を少なくとも１つ、及びＴｈ１／Ｅ４７ｃ ｓ多形の対立遺伝子を１つ含み、さらに場合により１つまたそれ以上のその他の ＡＰＯＥ多形対立遺伝子及び／または該遺伝子に近接するその他の遺伝子または マーカーを含み、正常集団に比して高いアルツハイマー病の発症リスクを修飾す ることができる真核生物細胞用形質導入ベクター。 １７．形質導入真核生物細胞又はトランスジェニック動物の作成を目的とした 請求項１６のベクターの使用。 １８．請求項１６規定のベクターによりトランスフェクトされた真核動物細胞 。 １９．請求項１６規定のベクターにより作成されたトランスジェニック動物。