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Es
wird ein Krankheits-Suszeptibilitätsgen für rheumatoide Arthritis beschrieben
und die vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendung eines derartigen
Krankheits-Suszeptibilitätsgens.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Evaluationsverfahren
zur Evaluation des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs
rheumatoider Arthritis bereit. Das Evaluationsverfahren detektiert,
ob eine Mutation des Gens oder einer Mutation des Proteins, das
ein Translationsprodukt dieses Gens ist, vorhanden oder nicht vorhanden
ist. Weiterhin wird ein Heilmittel und ein kurierendes Arzneimittel
für Rheuma
beschrieben.
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Rheumatoide
Arthritis (die hier auch als „RA" bezeichnet wird)
weist als Hauptsymptom multiple erosive Arthritis auf und stellt
eine systemische inflammatorische Erkrankung dar, deren Ursache
unbekannt ist und die mehrere Organe gleichzeitig in Mitleidenschaft
ziehen kann. RA entwickelt sich chronisch, wobei wechselweise Phasen
der Remission und Phasen der Verschlimmerung auftretenund im Falle
ausbleibender Behandlung eine Schädigung und Deformation von
Gelenken und letztlich die Dysfunktion der motorischen Organe verursacht.
In einigen Fällen
ist RA lebensbedrohlich. Daher leiden RA Patienten während ihres
gesamten Lebens sowohl in physischer als auch in mentaler Hinsicht.
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RA
zeigt eine breite Symptomenvielfalt. Für die Diagnose von RA sind
die diagnostischen Kriterien des „American College of Rheumatology" verwendet worden.
Allerdings ist der Beginn bzw. der Ausbruch der Erkrankung RA langsam
und nimmt gewöhnlicherweise
mehrere Wochen bis mehrere Monate in Anspruch. Der Anteil der Patienten,
der für
einen rheumatoiden Faktor positiv getestet wird, der vom „American
College of Rheumatology" als
objektiver Index innerhalb der diagnostischen Kriterien verwendet
wird, beträgt
etwa 33% innerhalb von 3 Monaten und ungefähr 88% in 12 Monaten oder mehr
(Treatment, 73, No. 3, Seiten 23–27, in 1991) und eine definitive
Diagnose für
RA ist nicht etabliert worden. Dementsprechend sind Ansätze zur
Diagnose rheumatoider Arthritis unternommen worden, die auf der
Detektion von mit rheumatoider Arthritis in Verbindung gebrachten
IgM-Antikörper
in Seren von Patienten beruhen, die mit einem rekombinanten Antigen
reagieren (siehe
japanische
Patentschrift No. 513257/1998 , Tokukaihei 10-513257, veröffentlich
am 15. Dezember 1998).
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Weiterhin
variieren die zu ergreifenden therapeutischen Maßnahmen im Rahmen der Therapie
von RA in Abhängigkeit
vom Verlauf des Zustands des RA Pathema. Grundsätzlich werden nicht-steroidale
antiinflammatorische Arzneimittel (NSAID) in einem frühen Stadium
der Erkrankung verabreicht, zu dem eine definitive Diagnose nicht
gestellt werden kann. Sofern eine definitive Diagnose gestellt werden
kann, werden krankheitsmodifizierende, antirheumatische Arzneimittel
(DMARD) zusätzlich
zu NSAID verabreicht. Besonders im frühen Stadium des Ausbruchs von
RA ist es schwierig eine definitive Diagnose zu stellen. Derzeit
erfolgt die Differenzierung gegenüber anderen rheumatoiden Erkrankungen
einschließlich
einer Kollagenerkrankung im Zusammenhang mit einer sorgfältigen Überwachung
des Fortschreitens der Erkrankung, währen NSAID verabreicht wird.
Sofern die Symptome weiter fortschreiten, können steroide Arzneimittel
verabreicht werden und es kann eine medizinische Therapie zur Schmerzlinderung
zusammen mit einer physikalischen Therapie und einer orthetischen
Therapie zum Erhalt und zur Verbesserung der Gelenkfunktion durchgeführt werden.
Weiterhin kann eine operative Therapie durchgeführt werden sofern die Gelenkbeeinträchtigung
im täglichen
Leben Schwierigkeiten bereitet.
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Durch
verschiedene wissenschaftliche Untersuchungen konnten RA verursachende
Aspekte der Arthritis und Gelenksveränderungen, und insbesondere
deren pathologischer Verlauf allmählich aufgeklärt werden.
RA wird durch die gleichzeitige Beteiligung zahlreicher verursachender
Faktoren, einschließlich
des Lebensumfelds verursacht und verschlimmert sich dann progressiv
bis in ein Stadium der manifesten Erkrankung. Daher sollte der interaktive
Mechanismus per se derartiger zahlreicher Faktoren für eine sorgfältige Charakterisierung
und ein angemessenes therapeutisches Management der Erkrankung aufgeklärt werden.
Die Prävalenz
von RA beträgt
global nicht mehr als 1% (New England Journal of Medicine, 322,
S. 1277–1289,
in 1990) aber die Häufigkeit
der Erkrankung bei Blutsverwandten der an der Erkrankung leidenden
Patienten ist ungefähr
achtmal größer (Cell,
85, S. 311–318,
in 1996). Davon ausgehend kann vorhergesagt werden, dass ein bestimmter
genetischer Faktor einen der verursachenden Faktoren darstellen
könnte.
Da das Lebensumfeld als einer der verursachenden Faktoren betrachtet
worden ist, ermöglich
die Kenntnis vom Ausbruch von RA eine Verzögerung und Vermeidung des RA-Ausbruchs
durch besondere Beachtung der Ernährung, von Virusinfektionen,
Stress, etc. im täglichen
Leben. Weiterhin kann eine frühe
Diagnose und eine sachgerechte Behandlung in frühen Stadien den Verlauf von
RA verzögern
und zu einer Verbesserung der Prognose führen.
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In
der internationalen Patentveröffentlichung
WO98/51791 , die am 19.
November 1998 veröffentlicht worden
ist, beschreiben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Durchführung einer
Verbindungsanalyse („linkage
analysis") unter
Verwendung eines Mikrosatellitenmarkers zwischen RA Patienten und
ihren Blutsverwandten und spezifizierten drei Loci, in denen drei
die rheumtoide Arthritis verursachende Gene lokalisiert sind. Die
folgenden Verursachenden Gene sind identifiziert worden:
- (1) Ein rheumatoide Arthritis verursachendes
Gen, wobei dieses Gen innerhalb von ± 1 Centimorgan einer DNA
Sequenz auf dem menschlichen Chromosom 1 lokalisiert ist, zu dem
der Mikrosatellitenmarker D1S214 und/oder D1S253 hybridisieren.
- (2) Ein rheumatoide Arthritis verursachendes Gen, wobei dieses
Gen innerhalb von ± 1
Centimorgan einer DNA Sequenz auf dem menschlichen Chromosom 8 lokalisiert
ist, zu dem der Mikrosatellitenmarker D8S556 hybridisiert.
- (3) Ein rheumatoide Arthritis verursachendes Gen, wobei dieses
Gen innerhalb von ± 1
Centimorgan einer DNA Sequenz auf dem menschlichen Chromosom X lokalisiert
ist, zu dem der Mikrosatellitenmarker DXS1001, DXS1047, DXS1205,
DXS1237 und/oder DXS1232 hybridisert.
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Wie
oben beschrieben wurde dabei gefunden, dass die Loci der Krankheits-Suszeptibilitätsgene der rheumatoiden
Arthritis auf den Chromosomen 1, 8 und X lokalisiert sind. Die Krankheits-Suszeptibilitätsgene von
RA wurden für
die Chromosomen 1 und X identifiziert, nichts jedoch für das Chromosom
B.
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Angesichts
dessen besteht die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende
Aufgabe in der Identifizierung der Krankheits-Suszeptibilitätsgene für rheumatoide
Arthritis, die auf dem menschlichen Chromosom 8 lokalisiert sind
und in der Bereitstellung eines Evaluations-(Diagnose-)verfahrens
zur Evaluation des Ausbruchs oder der Ausbruchwahrscheinlichkeit
von RA von hoher Genauigkeit durch Detektion, ob eine Mutation des
Gens oder eine Mutation das Translationsprodukt dieses Gens darstellenden
Proteins anwesend oder abwesend ist. Ein Evaluations-(Diagnose-)Kit
diesbezüglich
ist ebenso beschrieben wie ein Heilmittel und ein kurierenden Arzneimittel,
das für
RA Patienten mit einer Mutation im Krankheits-Suszeptibilitätsgen für rheumatoide Arthritis wirksam
ist.
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Gemäß der oben
genannten Aufgabe führte
der Erfinder der vorliegenden Erfindung ein detailliertes Gen-Mapping
des menschlichen Chromosoms 8 durch, wobei eine Mehrzahl von Mikrosatellitenmarkern
verwendet wurde, wodurch der Lokus eines RA-betreffenden Gens identifiziert
wurde. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchte weiterhin,
ob das im Bereich des Lokus befindliche Angiopoietin-1 Gen ein Krankheits-Suszeptibilitätsgen für RA darstellt.
Durch Experimente konnte der Erfinder der vorliegenden Erfindung das
folgende herausfinden: dieses Gen tritt in zwei Typen auf: einem
3-Basen-Insertionstyp und einem 3-Basen-Deletionstyp. Dabei bestand ein
signifikanter Unterschied zwischen einem gesunden Subjekt und einem RA
Patienten, weshalb eine Homozygotie des 3-Basen-Deletionstyps als
keine Mutation und eine Heterozygotie und Homozygotie des 3-Basen-Insertionstyps
als Mutation angesehen wurde; und die mRNA-Expression ist in RA
Patienten signifikant geringer als in gesunden Subjekten.
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Auf
der Grundlage dieser Befunde fand der Erfinder der vorliegenden
Erfindung die Effektivität
eines Evaluierungs-(Diagnose-)verfahrens und eines Evaluierungs-(Diagnose-)Kits
zur Evaluation des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs
von RA und gelang damit zur vorliegenden Erfindung. Die vorliegenden
Erfindung ist auch als neues Heilmittel und als kurierendes Arzneimittel
für rheumatoide
Arthritis wirksam.
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In
der vorliegenden Beschreibung repräsentieren A, C, G und T die
Basen Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin, sofern nicht anders angegeben.
Weiterhin werden Aminosäuren
und Aminosäurereste
mittels eines Einbuchstabencodes oder eines Dreibuchstabencodes
beschrieben, wie er von der IUPAC und IUB definiert ist.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein in Anspruch 1
beschriebenes Verfahren zur Evaluation des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit
des Ausbruchs rheumatoider Arthritis in einen Probanden auf der
Grundlage einer von dieser Probanden erhaltenen Probe. Das Verfahren
umfasst dabei den Schritt des Ausführens der Detektion entweder
eines Gens (a) oder eines Gens (b) oder eines Proteins (c) oder
der Messung einer Menge einer exprimierten mRNA (d).
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Das
Gen gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein Krankheits-Suszeptibilitätsgen für rheumatoide Arthritis, wobei
das Gen für
ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO 1 aufweist und eine Mutation derart umfasst, dass Glycin als
269. Aminosäure
in die Sequenz insertiert ist. Insbesondere kann das gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendete Gen (b) beispielsweise ein Angiopoietin-1 Gen
mit einer Rasensequenz gemäß SEQ ID
NO 2 sein, wobei drei Basen „GGC" als 805. bis 807.
Base als Mutation in die Sequenz insertiert sind. Die 805. bis 807.
Base korrespondiert mit der 1114. bis 1116. Base in der Rasensequenz
(Zugangsnummer U83508), die als cDNA des Angiopoietin-1 Gens in
der Gen-Datenbank
registriert ist.
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Der
Begriff „Gen" schließt Polynukleotide
wie zumindest genomische DNAs, cDNAs, mRNAs und ähnliche Moleküle ein.
Demzufolge kann das gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendete Gen neben einer cDNA des Aniopoietin-1 Gens
(i) eine mRNA mit einer Basensequenz sein, die zu einer Rasensequenz
der cDNA korrespondiert, (ii) eine genomische DNA, von der die mRNA
transkribiert wird, sein oder (iii) ein ähnliches Moleküle sein.
Weiterhin umfasst der Begriff „Gen" nicht nur doppelsträngige DNA-Moleküle, sondern auch
einzelsträngige
(Strang oder Gegenstrang) DNA-Moleküle, die die doppelsträngigen DNA-Moleküle bilden,
oder RNA-Moleküle.
Weiterhin kann das „Gen" eine Sequenz einer
untranslatierten Region (UTR), eine Promotorsequenz, eine Vektorsequenz
(einschließlich
einer Expressionsvektorsequenz) und eine ähnliche Sequenz enthalten,
nebst einer Translationsregion.
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Die
mRNA (d) ist vorliegend von einem Krankheits-Suszeptibilitätsgen für rheumatoide
Arthritis abgeleitet, wobei das Gen die Rasensequenz gemäß SEQ ID
NO 2 aufweist, die eine Deletion der drei Basen „GGT" aufweist, die die 805. bis 807. Base
in der Sequenz darstellen.
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Das
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendete Protein (c) ist ein Protein mit der Aminosäuresequenz,
die unter SEQ ID NO 1 gezeigt ist und eine Mutation aufweist, die
durch Insertion eines Glycins als die 269. Aminosäure in der
Sequenz gekennzeichnet ist. Das Protein ist ein Translationsprodukt
des oben genannten Angiopoietin-1 Gens und kann weiterhin ein zusätzliches
Polypeptid enthalten. Ein derartiges zusätzliches Polypeptid ist beispielsweise
in dem Fall vorhanden, dass das Protein mit einem Epitop markiert
wird, wie einer His-Markierung
oder ähnlichem.
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Das
oben erwähnte
Angiopoietin-1 ist ein Faktor, der zur Angiopoietinfamilie gehört und wahrscheinlich
eine bedeutende Rolle bei der Bildung von Blutgefäßen spielt.
Der Angiogenese-verwandte Tyrosinkinasetyp-Rezeptor hat eine VEGF
Rezeptorfamilie und eine TIE Rezeptorfamilie. Es wurde beschrieben,
dass VEGF in RA Patienten übermäßig hergestellt
wird (siehe Ann Rheum Dis: 59; i65–71, 2000). Es ist bekannt, dass
Angiopoietin-1 ein Ligand für
TIE2 Rezeptoren ist und komplementär zu VEGF Gefäßverletzungen
und Blutungen unterdrückt
(siehe Nature Medicine: 6: 460–463:
2000). Trotz allem ist die Beziehung zwischen Angiopoietin-1 und
Pathema nur schlecht verstanden.
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Der
Erfinder der vorliegenden Erfindung fand bei der Durchführung des
oben beschriebenen detaillierten Gen-Mapping eine Verbindung („linkage") beim Mikrosatellitenmarker
D8S556. Weil dies mit dem Ergebnis einer zuvor durchgeführten Verbindungsanalyse übereinstimmt,
hält der
Erfinder der vorliegenden Erfindung es für möglich, dass dies der Lokus
des RA-Suszeptibilitätsgenes
auf dem menschlichen Chromosom 8 ist.
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Der
oben genannte D8S556 konnte einer Region des langen Armes des menschlichen
Chromosoms 8 zugeordnet werden. Diese Region entspricht einer Region
von Chromosom 15 in Mäusen.
Es ist berichtet worden, dass Arthritis-Suszeptibilitätsgenloci
Paam1 in der Region von Chromosom 15 vorhanden sind (siehe „Ryumachi" 40(5): 833–848, 2000).
Es wurde weiterhin gefunden, dass D8S556 bei 584.52–584. 72cR
lokalisiert ist (siehe „Ryumachi” 39: P445,
1999). Angiopoietin-1 wird bei 589.07cR in der GB4 Karte kartiert.
Aufgrund seiner Lokalisation auf den Chromosomen erscheint es vernünftig, Angiopoietin-1
als Kandidat für
ein Krankheits-Suszeptibilitätsgen
anzusehen.
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Das
Ergebnis einer mit einem aus synovialen Membranen und peripherem
Blut von RA Patienten isolierten Genen durchgeführten Analyse hat gezeigt,
dass zwei Typen von Angiopoietin-1 Genen existieren, nämlich ein
3-Basen-Insertionstyp und ein 3-Basen-Deletionstyp. Nachfolgend
wird die Stelle einer Gensequenz, bei der eine 3-Basen-Insertion
und eine 3-Basen-Deletion
auftritt als „Mutationsstelle" bezeichnet. In ähnlicher
Weise wird die Stelle einer Aminosäuresequenz, an der eine Glycininsertion
und Glycindeletion auftritt, hier als ei ne „Mutationsstelle" bezeichnet. Die
Mutationsstelle der Aminosäuresequenz
korrespondiert mit der Mutationsstelle der Gensequenz.
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Es
ist bereits berichtet worden, dass die 3-Basen-Deletion in der menschlichen
Zelllinie T98G auftritt (siehe Cell, 87: 1161–1169, 1996).
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Angiopoietin-1
fördert
die Bildung eines Netzes von Blutgefäßen, in dem es komplementär zu VEGF wirkt.
Dabei ist VEGF ein wichtiger in der Angiogenese unterstützend wirkender
Faktor und unterstützt
die Migration und Proliferation von endothelialen Zellen. Daraufhin
wird durch Bildung einer neuen vaskulären Basismembran ein reifes
Blutgefäß strukturiert.
Ein in einem Experiment nur unter Vermittlung von VEGF induziertes
Blutgefäß war unreif
und verursachte leicht Blutungen. Es ist berichtet worden, dass
eine erhöhte
Produktion von VEGF in RA Patienten auftritt (siehe Ann Rheum Dis:
59: i65–71,
2000). Es existiert jedoch bezüglich
Angiopoietin-1 kein derartiger Bericht unter den angegebenen Bedingungen.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung verglich RA Patienten und
gesunde Subjekte in Bezug auf die Menge exprimierter Angiopoietin-1 mRNA
und fand, dass die Menge der exprimierten mRNA im peripheren Blut
der RA Patienten signifikant vermindert war. Dies weist darauf hin,
dass die Proliferation unreifer Blutgefäße möglicherweise zur Entwicklung chronischer
Entzündungen
beiträgt,
die durch den Austritt von Immunzellen aus dem Blut verursacht werden. Wie
später
noch im einzelnen beschrieben werden wird, können ein hier beschriebenes
Gen und ein Protein in effektiver Weise in dem Evaluationsverfahren
zur Evaluierung des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs
von RA, wie in den Ansprüchen
1 und 2 detailliert beschrieben, verwendet werden.
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(1) Verfahren zur Evaluation des Ausbruchs
oder der Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs von RA
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung zur Evaluation des Beginns oder der Wahrscheinlichkeit
des Beginns von RA (in anderen Worten ein Verfahren zur Diagnose
von RA) wird nachfolgend beschrieben, wobei in der folgenden Reihenfolge
diskutiert wird (i) ein Fall, bei dem eine genomische DNA als Gen
verwendet, (ii) ein Fall, bei dem eine mRNA (cDNA) als Gen verwendet
wird und dann (iii) ein Fall, bei dem ein Protein verwendet wird.
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(i) Fall, bei dem genomische DNA verwendet
wird
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Ein
vorliegendes Verfahren zur Evaluation unter Verwendung genomischer
DNA kann beispielsweise wie nachfolgend beschrieben ausgeführt werden.
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Das
Genom eines Subjektes kann von jeglicher Zellart eines Menschen
durch im Stand der Technik bekannte Standardmethoden gewonnen werden.
Das Genom kann beispielsweise aus Haaren, jedem Organ, einer peripheren
Lymphozyte, einer synovialen Zelle oder ähnlichem gewonnen werden. Darüber hinaus
kann das Genom aus einer Zelle gewonnen werden, die von dem Subjekt
erhalten wurde und dann zwecks Vermehrung kultiviert wurde. Weiterhin
kann das erhaltene Genom vor der Verwendung amplifiziert werden.
Die Amplifikation kann mittels einer Genamplifikationsmethode ausgeführt werden,
so wie dem PCR-(Polymerasekettenreaktions-)verfahren, dem NASBA-(Nukleinsäuresequenz-basierten
Amplifikations-)verfahren, dem TMA-(Transkriptions-vermittelten
Amplifikations-)verfahren, dem SDA-(Strangersetzungsamplifikations-)verfahren
und ähnlichen.
Es existiert keine bestimmte Einschränkung bezüglich der Evaluation, ob das
Genom eine Mutation aufweist oder nicht. So kann die Evaluation
beispielsweise unter Verwendung des allelspezifischen Oligonukliotidsondenverfahrens,
des Oligonukleotid-Ligationsessayverfahrens, des PCR-SSCP-Verfahrens, des PCR-CFLP-Verfahrens,
des PCR-PHFA-Verfahrens, des „invader"-Verfahrens, des RCA-(Rollender Kreis-Amplifikations-)verfahrens,
des Primer Oligo-basierten
Extensionsverfahrens oder ähnlicher
Methoden durchgeführt
werden.
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Die
Detektion dahingehend, ob das Genom eine Mutation oder nicht aufweist,
kann beispielsweise ausgeführt
werden durch (i) Amplifizierung einer Region, die die Mutationsstelle
des Gens aus dem Genom aufweist, wobei ein PCR Produkt erhalten
wird, (ii) Subklonierung des erhaltenen PCR Produktes und dann (iii) Durchführung einer
direkten Sequenzierung des subklonierten PCR Produktes. Weiterhin
ist es durch Verwendung der die Mutationsstelle enthaltenen Region
in einer Oligonukleotidsonde möglich
zu detektieren, ob das Genom die Mutation aufweist oder nicht. Die
Mutationsstelle enthaltende Region wird in einer Oligonukliotidsonde
verwendet. Beispielsweise kann ein DNA Chip durch Fixierung eines
Oligonukleotids auf dem Chip hergestellt werden, der eine Rasensequenz
einschließlich
der Mutationsstelle aufweist, und der DNA Chip wird dann zur Detektion
der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation verwendet. In diesem
Fall hat die Oligonukleotidsonde, einschließ lich der darin enthaltenen
Mutationsstelle, bevorzugt eine Länge von 7 bis 50 Nukleotiden
oder eine Länge
von 10 bis 30 Nukleotiden und am bevorzugtestens eine Länge von
15 bis 25 Nukleotiden.
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Weiterhin
kann die Detektion hinsichtlich der im Genom möglicherweise vorhandenen Mutation
mittels Southern blotting oder ähnlicher
Verfahren durchgeführt
werden, um Größenunterschiede
zwischen Genomfragmenten detektieren zu können, wobei die Genomfragmente
mittels geeigneter Restriktionsenzyme gespalten worden sind.
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Aufgrund
der Durchführung
der Detektion der im Genom möglicherweise
vorhandenen Mutation mittels der genannten Verfahren ist es möglich, das
Subjekt bezüglich
RA mit hoher Genauigkeit zu diagnostizieren (zu Evaluieren, ob das
Subjekt RA entwickelt hat oder wahrscheinlicherweise diese Subjekt
RA entwickeln wird). Wie später
beschrieben wird, wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den
RA Patienten und den gesunden Subjekten gefunden, wobei keine Mutation
in Homozygoten dieses 3-Basen-Deletionstyps, aber eine Mutation
in Heterozygoten und Homozygoten des 3-Basen-Insertionstyps gefunden
wird. Auf dieser Grundlage kann festgestellt werden, dass eine geringe
Wahrscheinlichkeit für
den Ausbruch von RA oder eine geringe Ausbruchswahrscheinlichkeit
für RA
besteht, wenn Homozygotie für
den 3-Basen-Deletionstyps detektiert wird. Im Gegensatz dazu wird
festgestellt, dass eine hohe Wahrscheinlichkeit für den Ausbruch
von RA oder eine hohe RA-Ausbruchswahrscheinlichkeit besteht, wenn
eine Heterozygotie detektiert wird, insbesondere, wenn eine Homozygotie
des 3-Basen-Insertionstyps detektiert wird.
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Ein
Primer und eine Sonde, die im Evaluationsverfahren verwendet werden,
können
mittels einer DNA-Synthesemaschine unter Verwendung im Stand der
Technik bekannter Verfahren synthetisiert werden.
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(ii) Fall, bei dem mRNA (cDNA) verwendet
wird
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In
dem Fall, dass mRNA verwendet wird, kann die Detektion hinsichtlich
der Frage, ob die Mutation vorhanden oder nicht vorhanden ist beispielsweise
wie folgt ausgeführt
werden. Eine cDNA wird aus der mRNA mittels reverser Transkription
hergestellt, wobei die mRNA von einer Zelle eines Subjektes extrahiert worden
ist. Dann wird die Region der cDNA, die die Mutationsstelle enthält, amplifiziert.
Danach wird die Detektion ausgeführt
(i) durch direkte Sequenzierung einer Rasensequenz des so amplifizierten
Fragmentes, (ii) durch Verwendung eines DNA Chips, oder (iii) durch
Verwendung des RFLP-(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-)verfahrens.
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Es
gibt keine bestimmte Einschränkung
bezüglich
eines Primers, der in der Amplifikation der die Mutationsstelle
enthaltenen Region verwendet werden soll. Beispielsweise kann die
Amplifikationsreaktion, in der eine cDNA als Templat verwendet,
wird unter Verwendung der folgenden Primerkombination durchgeführt werden.
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Mittels
einer so durchgeführten
Detektion ist es möglich
zu untersuchen, ob die mRNA (cDNA) die Mutation aufweist oder nicht,
und es ist möglich
das Subjekt hinsichtlich RA mit hoher Genauigkeit zu diagnostizieren
(zu Evaluieren, ob das Subjekt RA entwickelt hat oder ob das Subjekt
mit einiger Wahrscheinlichkeit RA entwickeln wird).
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Ein
alternatives Verfahren zu Evaluation des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit
des Ausbruchs von RA unter Verwendung von mRNA besteht in der Messung
der Menge einer exprimierten mRNA (das heißt, Angiopoietin-1 mRNA des
3-Basen-Deletionstyps), die von einem Krankheits-Suszeptibilitätsgen für RA abgeleitet
ist, wobei das Gen eine Rasensequenz gemäß SEQ ID NO 2 aufweist und
nicht derart mutiert ist, dass drei Basen „GGT", die die Basen Nr. 805 bis 807 in der
Sequenz darstellen, insertiert sind.
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Genauer
ausgedrückt
ist das oben beschriebene Verfahren der Evaluation so gestaltet,
dass ein Paar Schwellenwerte 1 und 2 in Bezug auf die Menge der
exprimierten mRNA bestimmt werden, wobei der Schwellenwert 1 kleiner
ist als der Schwellenwert 2. Sofern die Menge der exprimierten mRNA
gleich ist wie oder kleiner ist als der Schwellenwert 1, so wird
gefolgert, dass ein Subjekt höchstwahrscheinlich
rheumatoide Arthritis entwickelt hat oder dass das Subjekt in der
Zukunft mit hoher Wahrscheinlichkeit rheumatoide Arthritis entwickeln
wird.
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Wenn
die Menge der exprimierten mRNA gleich ist wie oder größer ist
als der Schwellenwert 2, so wird gefolgert, dass ein Subjekt nur
unwahrscheinlich rheumatoide Arthritis entwickelt hat oder dass
eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass das Subjekt
in der Zukunft rheumatoide Arthritis entwickeln wird. Um die Menge
der exprimierten mRNA zur Verwendung gemäß dem Verfahren zur Evaluation
des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs von RA zu
verwenden, ist es möglich,
die RT-PCT Methode oder ähnliche
im Stand der Technik gut bekannte Verfahren zu verwenden.
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(iii) Fall, bei dem ein Protein verwendet
wird
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In
dem Fall, dass ein aus der Zelle des Subjektes gewonnenes Protein
verwendet wird, kann das Verfahren zur Evaluation, ob Glycin in
der Mutationsstelle der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO 1 insertiert ist, angepasst werden. Die Detektion hinsichtlich
des möglicherweise
insertierten Glycins kann mittels eines allgemeinen Sequenzierungsverfahrens
für Proteine
erfolgen. Zum Beispiel kann die Detektion von Glycin wie folgt ausgeführt werden:
Ein Antikörper,
der nur das Protein mit der Glycin-Insertion erkennt wird hergestellt und
die Detektion des Glycins wird unter Verwendung des ELISA-Verfahrens
durchgeführt;
ein Protein wird isoliert. Dann wird mittels einer Proteinsequenzierungsmaschine
die Mutation im isolierten Protein detektiert das, sofern es nötig ist,
unter Verwendung von Enzymen oder ähnlichem fragmentiert wird.
Die Mutation wird mittels der Bestimmung des isoelektrischen Punktes
einer Aminosäure
detektiert. Eine Massendifferenz wird durch Massenspektrometrie
detektiert. Bevorzugterweise wird das Verfahren nach dem die Detektion
von Glycin durchgeführt
wird, durch Herstellung eines nur das Protein mit einer Glycininsertion
erkennenden Antikörpers angepasst
und dann in einem ELISA-Verfahren verwendet.
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Durch
eine derartige Detektion eines möglicherweise
in der Mutationsstelle insertierten Glycins ist es möglich, das
Subjekt bezüglich
RA mit hoher Genauigkeit zu diagnostizieren (zu evaluieren, ob das
Subjekt RA entwickelt hat oder ob das Subjekt wahrscheinlich RA
entwickeln wird). Wie später
beschrieben wird, wurde insbesondere ein signifikanter Unterschied
zwischen den RA Patienten, bei denen eine Mutation in Form einer Heterozygotie
und einer Homozygotie des 3-Basen-Insertionstyps gefunden worden
ist, und den gesunden Subjekten, bei denen keine Mutation in Form
einer Homozygotie des 3-Basen-Deletionstyps gefunden worden ist,
beobachtet. Daraus wird gefolgert, dass eine geringe Wahrscheinlichkeit
für den Ausbruch
von RA oder für die
Wahrscheinlichkeit des Ausbruchs von RA besteht, wenn das Protein
mit insertiertem Glycin nicht detektiert wird (in anderen Worten,
nur ein Protein mit deletiertem Glycin kann detektiert werden).
Im Gegenteil dazu wird gefolgert, dass eine hohe Wahrscheinlichkeit
für den
Ausbruch von RA oder eine Wahrscheinlichkeit für den Ausbruch von RA besteht,
wenn beide Proteintypen detektiert werden und insbesondere, wenn
nur der Glycin-Insertionstyp des Proteins detektiert wird.
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(2) Evaluationskit für den Ausbruch oder die Ausbruchwahrscheinlichkeit
von RA
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Ein
Evaluationskit für
den Ausbruch oder die Ausbruchwahrscheinlichkeit von RA (in anderen
Worten, eine Diagnosekit für
RA) ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, vorausgesetzt, dass der
Kit das Reagenz zur Detektion der Mutation, beispielsweise den Primer,
die Sonde, den Antikörper
oder ähnliches
enthält.
Der Kit kann derart ausgeformt sein, dass er weitere Reagenzien
in Kombination mit dem Reagenz enthält.
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Beispielsweise
kann ein Kit zur Detektion, ob das Genom oder die mRNA (cDNA) die
Mutation aufweist oder nicht einen Primer einschließen, der
derart gestaltet ist, dass der Primer zur Amplifikation einer der die
Mutationsstelle umfassenden Region geeignet ist und weiterhin ein
Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien, die zur Detektion
der Mutation nötig
sind, enthält.
Das Reagenz kann eine Sonde sein, ein Restriktionsenzym, ein Reagenz
zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung einer Rasensequenz
(so wie das Maxam-Gilbert-Verfahren,
das Sanger-Verfahren und ähnlichen)
oder ein ähnliches
Reagenz, das derart ausgestaltet ist, dass es zur Durchführung der
Detektion der Mutation in der Lage ist. Dabei ist zu beachten, dass
das Reagenz frei gewählt
werden kann, um das Verfahren zur Detektion anzupassen. Das Reagenz
kann beispielsweise dATP, dUTP, dTTP, dGTP, ein DNA synthetisierendes
Enzym, ein RNA synthetisierenden Enzym oder ähnliches sein. Weiterhin kann
der Kit einen geeigneten Puffer, eine Waschlösung oder ähnliches enthalten, das die
Detektion der Mutation nicht behindert.
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In
dem Fall, dass der Kit einen Primer einschließt, ist dieser Primer nicht
in irgendeiner Weise eingeschränkt,
solange der Primer zur Amplifikation der die Mutationsstelle umfassenden
Region in der Lage ist. Beispielsweise kann der Primer ein Satz
von Primer gemäß SEQ ID
NOs 3 und 4 sein.
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Der
Kit zur Detektion, ob das Protein die Mutation aufweist oder nicht,
kann beispielsweise ein Kit einschließlich des Antikörpers sein,
der nur das Protein mit der Glycininsertion erkennt.
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Wie
oben beschrieben ist es möglich,
die Diagnose von RA (zur Evaluation des Ausbruchs oder der Ausbruchwahrscheinlichkeit
von RA) unter Verwendung derartiger Evaluationskits mit hoher Genauigkeit durchzuführen.
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(3) Verwendung von Protein des normalen
Typs oder ähnlichem
als Heilmittel und als kurierendes Arzneimittel für RA
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Wie
oben beschrieben wird die Mutation, bei der drei Basen in das Angiopoietin-1
Gen insertiert sind (und die korrespondierende Mutation, bei der
Glycin in die Aminosäuresequenz
insertiert ist) für
die Ursache des Ausbruchs von RA gehalten. Deshalb sollte die Verabreichung
des Proteins des normalen Typs (das heißt des Proteins mit der Glycindeletion)
an einen Patienten mit der Mutation, bei der Glycin in Angiopoietin-1
insertiert ist, wirksam sein. Daher kann die vorliegende Erfindung
für ein
im folgenden beschriebenes Heilmittel und ein kurierendes Arzneimittel
für RA
nützlich
sein.
- – Ein
Heilmittel für
rheumatoide Arthritis, enthaltend die Schritte der ergänzenden
Gabe an einen an rheumatoider Arthritis leidenden Patienten mit
einem mutiertem Protein, (a) eines Proteins normalen Typs ohne Mutation,
(b) von DNA, die für
ein Protein normalen Typs kodiert oder (c) von einer niedermolekularen
Verbindung, das als Agonist für
ein Rezeptorprotein wirkt, für
das das normale Protein einen Liganden darstellt.
- – Ein
kurierendes Arzneimittel zur Verwendung in der Behandlung eines
Patienten mit rheumatoider Arthritis, wobei das Protein die Mutation
aufweist und das kurierende Arzneimittel als Hauptkomponente aufweist,
(a) ein Protein normalen Typs ohne Mutation, (b) DNA, die für ein Protein
normalen Typs kodiert oder (c) eine niedermolekulare Verbindung,
die als Agonist für
ein Rezeptorprotein fungiert, für
das das normale Protein einen Liganden darstellt.
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Die
Art der Ergänzung
des Proteins normalen Typs ist in keiner Weise eingeschränkt. Beispielsweise kann
ein bekanntes Proteinexpressionssystem oder ein Gen-Einführungsverfahren
verwendet werden. Im besonderen kann ein Expressionsvektor, ein
Virusvektor o. ä.,
der zur Expression eines Proteins in einer Säugerzelle dient, verwendet
werden. Darüber
hinaus ist Angiopoietin-1, wie oben bereits beschrieben worden ist,
ein Ligand für
den TIE2-Rezeptor. Daher wird es für ein effektives Heilmittel
für RA
gehalten, um eine niedermolekulare Verbindung oral oder mittels
intravenöser
Injektion in den Körper
zu verabreichen, wobei die niedermolekulare Verbindung als Agonist
für den
TIE2 Rezeptor fungiert. Dabei ist zu beachten, dass die niedermolekulare
Verbindung, die hier beschrieben ist, ein Protein wie ein Peptid
oder ähnliches
sein kann.
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Darüber hinaus
können
das normale Protein oder die DNA, die für das normale Protein kodiert,
und die niedermolekulare Verbindung als Agonist für den TIE2
Rezeptor sowohl einzeln als auch in Kombination als kurierendes
Arzneimittel verwendet werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1 ist
eine Tabelle, die eine genetische Analyse zeigt, die unter Verwendung
von sechs verschiedenen Mikrosatellitenmarkern in einem Beispiel
durchgeführt
wurde.
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2 ist
ein schematisches Diagramm, das ein RA-verwandtes Gen der vorliegenden
Erfindung schematisch illustriert. In 2 zeigen
A und B, wo ein Primer und eine Sonde, die im Rahmen eines Beispiels
verwendet wurden, binden.
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3(a) und 3(b) sind
Ansichten, die das Ergebnis einer Sequenzanalyse einer eine 3-Basen-Insertions-Mutationsstelle
enthaltenden Region des RA-verwandten Gens enthalten. 3(a) zeigt das Ergebnis einer Sequenzanalyse eines
Gens des 3-Basen-Insertionstyps, wo hingegen 3(b) das
Ergebnis einer Sequenzanalyse eines Gens des 3-Basen-Deletionstyps zeigt.
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4 ist
eine Tabelle, die die Ergebnisse einer Deletion zeigt, die im vorliegenden
Beispiel durchgeführt
wurde, um herauszufinden, ob die 3-Basen-Insertionsmutation in RA
Patienten und gesunden Subjekten vorhanden ist oder nicht.
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5 ist
ein Graph, der eine quantitative Analyse der mRNA-Expression im
vorliegenden Beispiel zeigt.
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6 ist
ein Graph, der ein Ergebnis der Messung der Migrationsfähigkeit
von HUVEC Zellen des 3-Basen-Insertionstyps (Ang1) und des 3-Basen-Deletionstyps
(Ang1(del3)) zeigt.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird unten unter Verweis auf die 1 bis 6 beschrieben.
Dabei ist die vorliegende Erfindung nicht auf die untenstehende
Beschreibung beschränkt.
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(1) Genetische Analyse mittels Mikrosatellitenmarkern
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Eine
Kettenlängenanalyse
wurde für
33 Familien durchgeführt,
wobei jede 2 Patienten und ein gesundes Subjekt einschloss. Von
der aus peripherem Blut extrahierten DNA wurden Mikrosatellitenmarker, D8S176,
D8S521, D8S1738, D8S556, D8S1830 und D8S539 auf Chromosom 8 mittels
des PCR Verfahrens unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten
Primers amplifiziert. D8S176, D8S521, D8S1738, D8S556, D8S1830 und
D8S539 zeigen eine Heterozygotie von 0,7 oder größer und sind innerhalb von
10,8 cM von den oben genannten Mikrosatellitenmarker D8S556 lokalisiert.
Dann wurden die amplifizierten Mikrosatellitenmarker einer Elektrophorese
bei 3000 V für
2 Stunden unter Verwendung eines ABI377 Sequenzierers unterworfen.
Danach wurde die Größe der Marker
mittels Gene Scan (Version 2.0.2) ermittelt. Unter Verwendung von MAPMAKER/SIBS
(Version 2.1) (siehe Complete multipoint sib-pair analysis of quantitative
and qualitative traits. Am J. Hum. Genet. 57: 439, 1995) wurden
nachfolgend die Maximum Lod-Werte davon berechnet und zwar mittels
einer Zweipunktanalyse, die auf einer Nachkommenspar-Methode (sib-pair
method) beruht.
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Die
Ergebnisse sind in der in 1 dargestellten
Tabelle gezeigt. Wie in 1 gezeigt wurde der höchste Lod
Wert 1,35 nur bei D8S556 gefunden. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen,
dass ein RA verwandtes Gen gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Verbindung (linkage) mit dem Mikrosatelliten Marker D8S556
aufweist. Darüber
hinaus wurde aus der Tatsache, dass Angiopoietin-1 in der Nachbarschaft
von D8S556 liegt und aus ähnlichen
Tat sachen geschlossen, dass das oben genannte Angiopoietin-1 ein
Kandidatengen für
das RA-Suszeptibilitätsgen ist.
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(2) Sequenzanalyse der Angiopoietin-1
cDNA
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Mittels
eines Oligo-dT-Primers (GeneAmp RNA PCR Kit)(Applied Biosystems),
wurde cDNA in einer Reaktion mit reverser Transkriptase aus Gesamt-RNA
hergestellt, wobei die Gesamt-RNA aus einer Monozytenfraktion des
peripheren Blutes des RA Patienten und aus einer synovialen Zelle
des RA Patienten hergestellt worden war. Nach der Amplifikation
einer Genregion von Angiopoietin-1 von 1508 bp, wurde eine Sequenzanalyse
gem. dem Farbstoff-Terminationsverfahren
durchgeführt.
Die in der Reaktion verwendeten Primer sind nachfolgend aufgelistet:
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Der
Strangprimer AngF1.5 und der Gegenstrangprimer AngR1.5 waren wie
in 2A gezeigt positioniert. Das Molekül Angeopoietin-1
wies eine gespulte Spule („coiled-coil")-Domäne und eine
Fibrinogen-ähnliche
Domäne
auf.
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Die
durch Sequenzierung bestimmte cDNA Sequenz wurde mit einer bereits
publizierten Sequenz (Zugangsnummer U83508) des Angiopoietin-1 Gens
verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass zwei Typen des oben beschriebenen
Angiopoietin-1 Gens existieren, nämlich ein 3-Basen-Insertionstyp
und ein 3-Basen-Deletionstyp. Von diesen Typen wurde eine Gensequenz
des 3-Basen-Insertionstyps als SEQ ID No. 2 gezeigt. Wie in SEQ.
ID No. 2 ersichtlich, sind die drei Basen „GGT" als Basen Nr. 805 bis 807 in der Sequenz
des 3-Basen-Insertionstyps
eingefügt.
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Die 3(a) und 3(b) zeigen
die Ergebnisse einer Sequenzanalyse der die Mutationsstelle enthaltenden
Region. 3(a) zeigt das Ergebnis der
Analyse des 3-Basen-Insertionstyps, wo hingegen 3(b) das Ergebnis der Analyse des 3-Basen-Deletionstyps
(3-Basen- Depletionstyps)
zeigt. Die 3(a) und 3(b) zeigen
das Ergebnis der Sequenzanalyse komplementärer Sequenzen der Gensequenz.
Ausgehend von 3(a) wurde bestätigt, dass
die Insertion der drei Basen „GGT" im 3-Basen-Insertionstyp
(Insertion von 3 Basen „ACC" in der komplementären Sequenz)
auftritt. Ausgehend von 3(b) wurde
bestätigt, dass
diese drei Basen im 3-Basen-Deletionstyp nicht auftauchen.
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Wie
in SEQ ID NO 1 gezeigt, ist Glycin als 269. Aminosäure in der
Aminosäuresequenz
des mittels Translation des 3-Basen-Insertionstyps des Gens hergestellten
Proteins insertiert. Auf der anderen Seite ist dieses Glycin als
269. Aminosäure
in einem Protein deletiert, das durch Translation des 3-Basen-Deletionstyps des
Gens hergestellt wird.
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(3) Detektion der Mutation in RA Patienten
und gesunden Subjekten (einem Probanden, der nicht an RA erkrankt
ist)
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Es
wurde eine Detektion durchgeführt,
um zu untersuchen, ob die Mutation der 3-Basen-Insertion in (a) RA Patienten aus Familien
(hier als RA Familien bezeichnet), die einen weiteren verwandten
RA Patienten neben dem genannten RA Patienten selbst aufwiesen (b)
gesunden Subjekten aus den RA Familien, (c) RA Patienten aus Familien
(hier als sporadische Familien bezeichnet), die keinen weiteren
RA Patienten als den genannten RA Patienten selbst aufwiesen und
(d) gesunden Subjekten aus den sporadischen Familien, vorhanden
waren oder nicht.
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Diese
Detektion wurde ausgeführt
durch (1) Extrahieren genomischer DNA von den zu testenden Probanden,
(2) Amplifizieren der die Mutationsstelle enthaltenden Region mittels
einer PCR Reaktion, in der ein geeigneter Primer verwendet wurde,
(3) Durchführen
einer Sequenzanalyse der erhaltenen PCR Produkte. Als geeigneter
Primer kann ein Strangprimer und ein Gegenstrangprimer willkürlich verwendet
werden, mit dem die Amplifikation der die Mutation in Form einer
3-Basen-Insertion enthaltenen Region durchgeführt werden kann. Darüber hinaus
besteht keine besondere Einschränkung
bezüglich
des geeigneten Primers, solange die Amplifikation ungewünschter
Regionen infolge einer fehlerhaften Bindung des Primers („mismatching") unterbleibt. Dabei
kann ein Primer mit einer Länge
von 15–25
Nukleotiden verwendet werden. Die folgenden Oligonukleotide sind
Beispiele für
einen Strangprimer und einen Gegenstrangprimer:
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Die
Ergebnisse der Detektion der Mutation gemäß diesem Verfahren sind in 4 gezeigt.
In 4 bedeutet „Familien
RA" die RA Patienten
aus den RA Familien, „Familien
nicht RA" bezeichnet
die gesunden Subjekte aus den RA Familien, „Sporadische RA" bezeichnet die RA
Patienten aus den sporadischen Familien und „Sporadisch nicht RA" bezeichnet die gesunden
Subjekte aus den sporadischen Familien. Darüber hinaus bezeichnet „n" die Gesamtanzahl
der für
jeden Typ getesteten Probanden. Die jeweiligen Spalten zeigen die Anzahl
von Probanden mit dem homozygoten normalen Gen (in 4 bezeichnet
als „nt805(del3)
homo"), die Anzahl
von Probanden mit dem heterozygoten mutierten Gen (in 4 bezeichnet
als „nt805(del3)
hetero") und der
Anzahl von Probanden mit dem homozygoten mutierten Gen (in 4 bezeichnet
als „nt805
homo"). Weiterhin
wurde der Quotient der Probanden geteilt durch die Anzahl der getesteten
Probanden in Klammern dargestellt.
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Wie
in 4 gezeigt, tragen sowohl in den RA Familien und
den sporadischen Familien nur die RA Patienten das homozygote Gen
des 3-Basen-Insertionstyps. Wenn davon ausgegangen wird, dass für den 3-Basen-Deletionstyp
Homozygote nicht mutiert sind und für den 3-Basen-Insertionstyp Heterozygote
mutiert sind, ist ein signifikanter Unterschied zwischen den RA
Patienten aus den sporadischen Familien und den gesunden Subjekten
aus den sporadischen Familien und zwischen den RA Patienten aus
den sporadischen Familien und den gesunden Subjekten aus den RA
Familien vorhanden. Dieser Befund bestätigt, dass der Ausbruch von
RA davon abhängt,
ob die Mutation vorhanden ist oder nicht.
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Unter
Verwendung des oben genannten Verfahrens ist es daher möglich, durch
Detektion des Vorhandenseins der 3-Basen-Insertionsmutation im RA-verwandten
Gen zu evaluieren, ob der Ausbruch von RA in einer Person stattgefunden
hat, oder ob eine Person wahrscheinlich an RA erkranken wird. Insbesondere
kann beispielsweise ein Subjekt bezüglich des Vorhandenseins der
3-Basen-Insertionsmutation gemäß dem beschriebenen
Verfahren getestet werden. Wenn nur das mutierte Gen detektiert
wird (d. h. das Subjekt ist homozygot für das mu tierte Gen) oder sowohl
das mutierte Gen als auch das normale Gen werden detektiert, wird
evaluiert, dass eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass das Subjekt
an RA erkrankt ist. In den Fällen,
in denen kein mutiertes Gen detektiert wird (d. h. der getestete
Proband für
das normale Gen homozygot ist) kann gefolgert werden, dass nur eine
geringe Wahrscheinlichkeit dafür
besteht, dass das Subjekt an RA erkrankt ist oder in der Zukunft
an RA erkranken wird. Die Evaluation gemäß der vorliegenden Erfindung ist
nicht auf den oben beschriebenen Weg beschränkt und die Evaluation gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auch mittels anderer Wege in Übereinstimmung mit den Detektionsdaten
durchgeführt
werden.
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(4) Quantitative Analyse von mRNA des
RA-verwandten Gens
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Für 21 RA
Patienten und 18 gesunde Subjekte wurde die Menge der exprimierten
Angiopoeitin-1 mRNA in peripherem Blut gemessen. Dazu wurde eine
quantitative RT-PCR mit ABI7700 unter Verwendung des TaqMan EZ RT-PCR
Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Die folgenden Primer und
Sonden wurden verwendet. GAPDH wurde als interner Standard verwendet.
Die Positionen der Primer und der Sonde sind in 2B dargestellt.
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Die
Ergebnisse der quantitativen Analyse wurden als relative Mengen
angegeben, nämlich
als Quotient bezogen auf den internen Standard, und dann mittels
des Welch t-test statistisch berechnet.
5 zeigt einen
Graphen, der einen Durchschnittswert und die Standardabweichung
der quantitativ analysierten Menge der aus dem peripheren Blut des
gesunden Subjektes (Controller) und von RA Patienten gewonnen mRNA dargestellt.
Diese Ergebnisse werden unten als Durchschnittswerte ± Standardabweichungen
dargestellt.
| Gesunde
Subjekte: | 0.3372 ± 0.2421 |
| RA
Patienten: | 0.0986 ± 0.0937 |
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Die
oben gezeigten Ergebnisse bestätigen,
dass die RA Patienten im Vergleich zu den gesunden Subjekten einen
signifikant geringere Menge Angiopoietin-1 mRNA exprimieren.
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Durch
Messung der Menge der exprimierten mRNA mittels des Verfahrens ist
es daher möglich
zu evaluieren, ob ein getesteter Proband an RA erkrankt ist oder
nicht. Insbesondere werden beispielsweise zwei Schwellenwerte (Schwellenwert
1 und 2) bestimmt, die in Bezug auf die Menge der exprimierten mRNA
bestimmt werden. Sofern die Menge der exprimierten mRNA gleich groß ist wie
oder kleiner ist als der Schwellenwert 1 wird gefolgert, dass der
getestete Proband höchstwahrscheinlich
an RA erkrankt ist oder eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür hat, in
der Zukunft an RA zu erkranken. Sofern die Menge der exprimierten
mRNA gleich groß ist
wie oder größer ist
als der Schwellenwert 2 wird gefolgert, dass der getestete Proband
wahrscheinlich nicht an RA erkrankt ist oder nur mit geringer Wahrscheinlichkeit
an RA erkranken wird. Es ist bevorzugt, dass der Schwellenwert 1
so groß ist
wie oder kleiner ist als der Durchschnittswert (d. h. 0,0986 oder kleiner)
der RA Patienten. Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Schwellenwert
2 gleich groß ist
wie oder größer ist
als der Durchschnittswert der gesunden Subjekte (d. h. 0,3372 oder
größer).
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(5) Vergleich zwischen dem 3-Basen-Insertionstyp
(Mutationsstyp) und dem 3-Basen Deletionstyp (Wildtyp) des Angiopoietin-1
Gens bezüglich
seiner physiologischen Funktion
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Als
nächstes
wurde der 3-Basen-Instertionstyp mit dem 3-Basen-Deletionstyp des
Angiopoietin-1 Gens (Ang1) bezüglich
seiner physiologischen Funktion verglichen. Dem 3-Basen-Insertionstyp des
Angiopoietin-1 Gens (Ang1) waren die genannten drei Basen insertiert,
wohingegen die drei Basen im 3-Basen-Deletionstyp des Angiopoietin-1
Gens (Ang1) deletiert waren. Der Vergleich bezüglich der physiologischen Funktion wurde
durch Messung der Migrationsfähigkeit
von HUVEC Zellen unter Verwendung des unten geschriebenen Verfahrens
untersucht.
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Humanes
Fibronectin (Becton, Dickinson and Company: #354008) in einer Endkonzentration
von 50 μg/ml
wird auf eine Membran (Porengröße: 8,0
[g) mit „Transwell-24" (Coster Inc.: #3422)
aufgetragen. Der Transwell weist zwei Schichten auf, um so die Migrationsfähigkeit
der Zellen messen zu können.
Als Migrationszellzahl wird die Anzahl von Zellen gemessen, die
von der oberen Schicht, auf der die Zellen aufgebracht werden, zur
unteren Schicht migrieren. 25.000 HUVEC Zellen, die in 100 μg M199 mit
1% BSA suspendiert waren, wurden pro Transwell aufgetragen. In jedes
Transwell wurden 600 μl
eines Überstandes
von SVS Zellen (J. Mol Cell. Cardiol., 29(8), 1997, 2177–2186) hinzugefügt, in die
Ang1 vom 3-Basen-Insertionstyp
oder vom 3-Basen-Deletionstyp eingebracht worden waren, wobei die
Kultur durch zweitägige
Inkubation in M199 mit 1% BSA vorbereitet worden war.
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Nach
einer sechsstündigen
Inkubation der Transwells wurden die Zellen mittels im Stand der
Technik bekannter Verfahren fixiert und gefärbt. Dann wurde für den 3-Basen-Insertionstyp
und den 3-Basen-Deletionstyp die jeweilige Anzahl der zur unteren
Oberfläche
der Membran migrierten Zellen bestimmt. Dazu wurde ein Inversionsmikroskop
verwendet und die Zählung
wurde durchgeführt,
indem sechs Sichtfelder Ansichten pro Vertiefung mit 40facher Vergrößerung gezählt wurden.
Dabei wurde eine Gesamtanzahl (A) und eine Durchschnittsanzahl (B)
bestimmt. Diese Zählung
wurde für
sechs Vertiefungen durchgeführt
und es wurden Durchschnittswerte und Standardabweichungen für die sechs
Vertiefungen berechnet. Die Ergebnisse der Zählung sind unten dargestellt.
Darüber
hinaus zeigt
6 die Durchschnittswerte der
migrierten Zellen sowohl für
den 3-Basen-Insertionstyp (Ang1) als auch für den 3-Basen-Deletionstyp (Ang18del3)). Ergebnisse:
| | Durchschnittswert | Standardabweichung |
| (A/B) | (A/B) |
| 3-Basen-Deletionstyp | 260/43 | 41/7 |
| 3-Basen-Insertionstyp | 520/87 | 81/14 |
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Wie
in den oben gezeigten Ergebnissen und in 6 gezeigt
konnte bestätigt
werden, dass die Migrationsfähigkeit
von HUVEC Zellen dem Mutationstyp, bei dem 3 Basen in Ang1 insertiert
sind, signifikant höher
ist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Ang1 vom 3-Basen-Insertionstyp einen
Faktor für
synoviales Wachstum darstellt, der die Angiogenese stärker fördert als
bei einem Gesunden.
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Wie
oben beschrieben ermöglicht
die Verwendung eines mutierten Gens oder eines mutierten Proteins gemäß der vorliegenden
Erfindung die genaue Evaluation des Ausbruchs oder der Wahrscheinlichkeit
des Ausbruchs rheumatoider Arthritis auf der Grundlage der Detektion,
ob die Mutation vorhanden oder nicht vorhanden ist. Daher ist die
vorliegende Erfindung wirksam. Weiterhin ist die vorliegende Erfindung
als neues präventives
Verfahren, als neues Heilmittel und als neues kurierendes Arzneimittel
für rheumatoide
Arthritis wirksam. SEQUENZPROTOKOLL
