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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Gen, das Sarkoidose zugerechnet wird, wobei
gefunden wurde, dass das Gen mutiert ist. Insbesondere betrifft
die Erfindung die kodierende Sequenz des BTNL2-Gens des Menschen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Sarkoidose
ist eine multi-systemische Immunkrankheit, charakterisiert durch
nicht-käsende
Granulome und einer übertriebenen
zellulären
Immunantwort aufgrund einer erhöhten
inflammatorischen Aktivität
von Makrophagen und CD4 Helfer T-Zellen (Newman et al. 1997, Ziegenhagen
et al. 2003). Typische Orte der Krankheitsanzeichen schließen Lunge,
Lymphknoten, Augen und Haut ein. Die klinische Darstellung der Krankheit
variiert zwischen leichter Entzündung
mit langsam progressiver pulmonarer Fibrose und einem akuten inflammatorischen
Syndrom (Löfgren
Syndrom). Obwohl eine spontane Auflösung in mehr als 50% der Fälle beobachtet
wird, kann die Krankheit ebenso einen hartnäckigen Verlauf mit einem chronischen
respiratorischen Versagen im Endstadium nehmen. Die Prävalenz der
Sarkoidose rangiert von 10–14
pro 100.000 in Zentral-Europa und unter US-Kaukasiern bis zu 64
pro 100.000 in Schweden. Familiäre
Gruppenbildung der Krankheit wurde in mehreren Populationen beobachtet,
obwohl die Schätzungen
eines relativen Risikos bei Verwandten ersten Grades zwischen 2,8
und 18 variieren (Rybicki et al. 2001).
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In
einer jüngsten
Genom-Analyse von 63 Sarkoidose-Familien (Schurmann et al. 2001),
identifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Verbindung
der Krankheit zu Chromosom 6p21. Verschiedene HLA-Marker wurden
auf eine Verbindung zur Krankheit hin untersucht (Sato et al. 2002,
Foley et al. 2001, Tybicki et al. 2003, Rossman et al. 2003) und
ersten widersprüchlichen
Ergebnissen folgend wurde neulich das DRB1-Gen als ein Risikofaktor
für Sarkoidose
identifiziert (Foley et al. 2001, Rossman et al. 2003). Nichtsdestotrotz
ist das der Population zuzuschreibende Risiko von Mutationen in
diesem Gen nur gering (~10% für
Kaukasier) und im Hinblick auf das für 6p21 erhaltene starke Verbindungssignal
erscheint es wahrscheinlich, dass zusätzliche Risikofaktoren in dieser
Region existieren. Diese Hypothese wurde bereits für einige
Kandidatengene untersucht (Grutters et al. 2002, Abdallah et al.
2003).
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung beruht auf der Isolierung einer codierenden Sequenz des
in Menschen gefundenen BTNL2-Gens. Es ist eine Aufgabe der Erfindung,
ein Verfahren bereitzustellen, mit dem BTNL2 oder Teile davon mit
einem oder mehreren Oligonukleotid-Primern amplifiziert wird. Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu identifizieren
von Individuen, die keine Mutation der codierenden Sequenz von BTNL2 tragen
und daher keine erhöhte
genetische Anfälligkeit
gegen Sarkoidose basierend auf ihren BTNL2-Genen haben, bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Identifizieren
einer Mutation, die zu einer erhöhten
Anfälligkeit
gegen Sarkoidose führt,
bereitzustellen.
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Ein
Fachmann im Bereich der Gentests wird die vorliegende Erfindung
nützlich
finden zum:
- a) Identifizieren von Individuen
mit einem BTNL2-Gen ohne codierende Mutationen, von denen daher
nicht gesagt werden kann, eine erhöhte Anfälligkeit gegen Sarkoidose aufgrund
ihrer BTNL2-Gene zu besitzen;
- b) Vermeiden von Missinterpretationen von im BTNL2-Gen gefundenen
Polymorphismen;
- c) Bestimmen der Anwesenheit einer bisher unbekannten Mutation
im BTNL2-Gen;
- d) Identifizieren einer Mutation, die die genetische Anfälligkeit
gegenüber
Sarkoidose erhöht;
- e) Entnehmen einer Humanprobe des BTNL2-Gens;
- f) Durchführen
einer Gen-Therapie;
- g) Herstellen eines funktionierenden Proteins, für das die
BTNL2-Gene codieren, zur Therapie von Sarkoidose.
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Im
Hinblick auf das für
6p21 erhaltene starke Verbindungssignal und die damit verbundene
Wahrscheinlichkeit eines zusätzlichen
Risikofaktors in dieser Region haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung ein umfassendes Drei-Stufen SNP Feinkartierungsexperiment
bei 6p21 durchgeführt,
um zusätzliche
Krankheitsanfälligkeitsgene
zu suchen. Um die vorangegangenen Missinterpretationen zu überwinden,
ist es ein Gesichtspunkt der Erfindung, eine Kombination von ausgedehnten
Familien, Trios und Singleton Patienten rekrutiert zu haben, die
es ermöglichen,
sowohl eine familienbasierte (TDT) und eine populationsbasierte
(Fallkontrolle) Assoziationsanalyse parallel durchzuführen. Die
Idee hinter diesem Verfahren ist die, dass die Übereinstimmung der TDT und
der Fall-Kontrolle eine pragmatische Anleitung zur Vertrauenswürdigkeit
einzelner Assoziationssignale liefern würde.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
eine graphische Darstellung des Stufe 1 SNP-Screens auf Chromosom
6p21.
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2 zeigt
eine graphische Darstellung des Stufe 2 SNP-Screens der kombinierten „Basis" und „erweiterten" Patienten-Proben.
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3 zeigt
die Splicing-Alternative bei SNP rs2076530 in Exon 5 des BTNL2-Gens.
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4 zeigt
die durch Berechnung abgeleitete Architektur der Domäne des BTNL2-Genprodukts.
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5 zeigt
das durch Berechnung abgeleitete 3D-Struktur Modell der zweiten
IgV Domäne
und der nachfolgenden IgC Domäne
des BTNL2 Homodimers.
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6 zeigt
das Expressionsmuster des BTNL2-Gens, analysiert mit verschachtelter
rt-PCR und nachfolgender Agarose-Gelelektrophorese der rt-PCR Produkte.
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7 zeigt
Fluoreszenzbilder des allelischen BTNL2-GFP-Fusionsproteins, das
transient in HeLa-Zellen transfiziert wurde.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Identifizierung eines
Assoziationssignals – Stufe
1 SNP Scan
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Im
ersten „Stufe
I" SNP Scan, wurden
Individuen der sogenannten Basis-Proben für 69 SNPs von einem Interval
um die maximale LOD-Position des ursprünglichen Genom-Screens (Schurmann
et al. 2001), wie in 1 (NCBI Ausgabe 32 Kartenkoordinaten
27,8 Mb–44,1
Mb) genotypisiert. Durch einen Abfall im LOD-Wert von 1,5 Einheiten
oder weniger definiert, repräsentiert
dieses Inverval eine ungefähr
99%ige Vertrauensregion für
einen Zusammenhang. Um genügend
Kraft für
eine Assoziationssignal-Identifizierung zu erreichen, wurde ein
P-Wert von 0,001 als eine Schwelle für die Signifikanz in sowohl
der TDT und der Fall-Kontrollanalyse
der drei-Ort SNP Haplotypen gewählt.
Dieses Kriterium anwendend, ergab nur die BTNL2 Sub-Region ein konsistentes
Assoziationssignal. Ein zweites Signal in der MICB-Subregion erbrachte
ein P-Wert geringer als 0,001 im Fall-Kontroll-Bereich, aber nicht
in der TDT-Analyse (p = 0,3). Diese zweite mögliche Signalregion wurde nichtsdestoweniger
weiterhin durch die Genotypmarker rs1063635, rs3134900, rs3130062, rs1041981
und rs1799964 (für
die Details: s. Tabelle 4a und Tabelle 4b) in der „erweiterten" Probe (Tabelle 1) zusammen
mit den BTNL2-Signalmarkern rs2076523, hCV2455668, hCV2455646 und
rs7192 untersucht. Genotyp logistische Regressionsanalyse mit Wahrscheinlichkeitsverhältnis basierter
Vorwärtsinklusion
bei einem p < 0,05
Niveau resultierten in einem Modell, das nur zwei Marker von BTNL2-Region
(rs2076523, rs7192), aber keinen der MICB-Marker beinhaltete. Weiterhin
wurde ein substantieller weiter Abstand LD zwischen den Markern
in der BTNL2-Region und in der MICB-Region mit D'-Werten bis zu 0,94 beobachtet. Daher
wurden alle folgenden Kartierungsanstrengungen auf die BTNL2-Region
beschränkt.
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Untersuchung der BTNL2-Gen-Region – Stufe
II SNP Scan
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In „Stufe
II" wurde eine Gesamtheit
von 48 SNPs von der 440 kb Assoziationsregion um das BTNL2-Gen (NCBI
Ausgabe 32 Kartenkoordinaten 32,177–32,616 Mb) in den kombinierten „Basis" und „erweiterten" Proben, wie in Tabelle
1 gezeigt, genotypisiert. SNPs wurden entweder in der ABI „Assay
on Demand"-Datenbank
(www.store-appliedbiosystems.com), in dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov)
oder durch direktes genomisches Sequenzieren von 47 Sarkoidose-Patienten
identifiziert. Mutationsscreening dieser Individuen deckte alle
Exons und angrenzenden Intronsequenzen des überarbeiteten BTNL2-Gen-Modells
ab (s. nächster
Abschnitt). Weitere SNPs wurden im TSBP-Gen, dem DRA-Gen (mit dem
Promotor, der hier nicht auf SNPs analysiert wurde) und in einigen
nicht codierenden telomerischen Sequenzen des BTNL2-Gens, wie in
den 2 und Tab. 5 gezeigt, nachgewiesen. Einzelpunkt
TDT und Fallkontrolldaten wurden unter Berücksichtigung der Haplotyp-Struktur
der Region interpretiert (2B). Übereinstimmende
Ergebnisse wurden durch die zwei Versuche für eine 15 kb-Region am 3-Strich
Ende des BTNL2-Gens erhalten (marker hCV2488476 bis rs2294878).
Hier waren die P-Werte zwei oder drei Größenordnungen kleiner als für die anderen
Regionen (2C).
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Funktionelle und strukturelle
Effekte von BTNL2-Genmutationen
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Die
Gen-Struktur von BTNL2, wie in den öffentlichen Datenbanken eingetragen,
wurde mittels cDNA-Klonierung genau geprüft. In dem ursprünglichen
Bericht (Stammers et al. 2000) wurde keine durchgehende cDNA Amplifizierung
für die
Exons 1–4
und 5–6
erreicht, wodurch die Möglichkeit
aufkommt, dass zwei Gene an diesem Ort vorkommen. Wir haben drei
zusätzliche
Exons (15' und 23') identifiziert und
das ursprüngliche
Exon 3 aus dem Gen-Modell
ausgeschlossen. Überlappende
rt-PCR bestätigte
erfolgreich das Vorhandensein eines einzelnen Transkripts und bekräftigte die
Gültigkeit
des überarbeiteten
Gen-Modells.
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Das
15 kb-Segment, das am stärksten
mit Sarkoidose assoziiert ist, enthält vier funktionale SNPs (P299Q,
M2861I, P285L, rs2076530), die zusammen einen P-Wert von 1,9·10,7–7 in
einem Viermarker Haplotyp TDT und von 6,2·10–7 in
einer entsprechenden Fallkontrollanalyse (für Einzelpunktergebnisse siehe 2C) ergaben. Der Großteil der Assoziierung ergab
sich aufgrund rs2076530 mit einem verbleibenden p = 0,03 für die Einbeziehung
der anderen drei Marker in einem Fallkontroll Haplotyp-Regressionsmodel.
Die starke Assoziierung zwischen Sarkoidose und rs2076530 wurde
in einer unabhängigen „Wiederholungs"-Probe bestätigt („Stufe
III", Tabelle 1;
TDT χ2 = 9,7, p = 0,0018; Fallkontrolle χ2 = 21,0, p = 2,7·10–5).
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Dem
berichteten Genmodel entsprechend (Stammers et al. 2000), würde vorausgesagt
worden sein, dass ein rs2076530 einen Aminosäurenaustausch verursacht. Aber
als ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung wurde angenommen und
konnte tatsächlich
gezeigt werden, dass sich der SNP an einer Position –1 einer Donor
Splice Site, wie in 3 gezeigt, befindet. Eine in
den klonierten rt-PCR-Produkten beobachtete vier Basen cDNA-Deletion
der Genmo delverifikation ist dadurch erklärbar, dass rs2076530 die Anatomie
der Splice Site verändert.
Guanin befindet sich an der Position –1 von 77% der donor sites
(Krawczak et al. 1992, Long et al. 1999), so dass es wahrscheinlich
ist, das der Übergang
von A nach G von rs2076530 in einer alternativen Splice Site, die
sich 4 bp upstream wie in 3 gezeigt
befindet, resultiert. Genotypspezifisches Splicen wurde durch rt-PCT
von DNA/cDNA Paaren von Lymphoblastoidzelllinien und peripheren
Blutproben bestätigt
(Tabelle 2). Der Verlust von vier Basen von der vom A Allel transkribierten
cDNA verursacht einen Leserasterverschiebung und einen frühzeitigen
Stop im nächsten
Exon. In dem entsprechenden Proteinprodukt würden die 118 C-terminalen Reste
in dem ungekürzten
Protein durch fünf
verschiedene Aminosäuren
ersetzt werden.
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Die
Auswirkungen der krankheitsassoziierten Varianten auf die Struktur
des BTNL2 Proteins wurden in silico untersucht. Die BTN (butyrophilin-ähnlichen)
Gene sind Angehörige
der Immunoglobulin-Superfamilie (IgSF). Die allgemeine Domänenarchitektur
der BTN Gene umfasst eine kleine aber variable Anzahl von aufeinander
folgenden immunoglobulin-ähnlichen
(Ig-ähnlichen)
Ektodomänen
mit einem N-terminalen Peptid und einer C-terminalen Transmembranhelix, die das
Protein auf der Membran von antigenpräsentierenden Zellen verankert
(Rhodes et al. 2001, Sharpe et al. 2002). Das in 4 gezeigte
Proteinprodukt des überarbeiteten
BTNL2 Gens enthält
zwei N-terminale homologe IgV (Ig-ähnliche variable) Domänen mit
einer Sequenzidentität
von 46% und einer C-terminale
IgC (Ig-ähnliche
konstante) Domäne.
Die Schnittstelle des angenommenen N-terminalen Signalpeptids (Rhodes et
al. 2001, Sharpe et al. 2002, Stammers et al. 2000) wird zwischen
den Resten 26 und 27 vorhergesagt und ein Hydropathie-Indexplot,
wie in 5A gezeigt, zusammen mit den
Ergebnissen des Transmembran Vorhersageservers (Albrecht et al.
2003) legen eine einzelne C-terminale Transmembranhelix nahe, die
der IgC Domäne
folgt. Solch eine Membran verankernde Helix kann auch an den C-Termini
von IgC Domänen
von MHC Antigenen und anderen co-stimulatorischen Rezeptoren gefunden
werden. Tatsächlich
wurde von einer entfernten Homologie zwischen butyrophilin-ähnlichen
Proteinen zu MHC Antigenen und B7-1/-2 (CD80/CD86) co-stimulatorischen
Rezeptoren (Ikemizu et al. 2000, Schwartz et al. 2001, Stamper et
al. 2001, Zhang et al. 2003) berichtet (Rhodes et al. 2001, Stammers
et al. 2000). Die IgV und IgC Domänsequenzen der Kristallstrukturen
des B7-1 homodimers (Ikemizu et al. 2000, Stamper et al. 2000, Bajorath
et al. 2001) wurde gefunden mit einem signifikanten E-Wert von 3·10–7 durch
eine BLAST Recherche von PDB unter Verwendung der Zeiten IfV und
der benachbarten IgC Domäne
von BTNL2. Folglich haben wir die 3D-Struktur bei der BTNL2 Domänen basierend
auf einem manuell behandelten Sequenzstruktur Alignment von BTNL2
zum B7-1 template, mit einer gemeinsamen Aminosäuresequenzidentität von 24%, moduliert.
Das resultierende, in 5 dargestellte 3D Modell von
BTNL2 zeigt eine Beschneidung der Proteinstruktur an dem Ort des
durch rs2076530 eingefügten
frühzeitigen
Stops, kurz vor dem Start der IgC Domäne und der sich anschließenden Transmembran
helix. Die Varianten P285L, M2861 und P299Q befinden sich im β-Strang auf
der Proteinoberfläche
der IgC Domäne
(Bajorath et al. 2001) und sind von den Resten I126, I127 und 5140
von B7-1 erfaßt.
Interessanter Weise verändern
sich alle Varianten zu Aminosäuren,
deren Seitenketten den entsprechenden Wild-Typ Bz-1 Resten in ihrer
IgC Domäne
physiko-chemisch ähnlicher
sind. Mehrere an der Bindung der IgV Domäne von B7-1 an seinen Rezeptor
CTLA-4 beteiligte Reste (Stamper et al. 2000) sind in BTNL2 konserviert
(4, 5). Diese Beobachtung legt
nahe, dass BTNL2 einen ähnlichen Rezeptorbindungsort
wie B7-1 besitzt (s. 5).
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Um
die Expression des BTNL2-Gens in relevanten Zielzellen auszuwerten,
wurde in einem Gewebsfeld in THP1-Zellen und in Bronchoalveolar
Lavage Zellen (BAL) von Patienten und Kontrollen eine rt-PCR durchgeführt. Da
die BTNL2-Expression generell gering war, musste eine verschachtelte
rt-PCR eingesetzt werden, um ausreichende Mengen des Transkripts
nachzuweisen. 6a zeigt die beobachtete
Expression in einer Reihe von Geweben, inkl. Leukozyten und Thymus.
Transkripte wurden ebenso in allen 8 BAL-Zellproben von Sarkoidose-Patienten
nachgewiesen, aber nicht in BAL-Zellen von Kontroll-Individuen oder
in normalen Lungenzellen, wie in 6B gezeigt.
Die Expression des BTNL-Gens konnte ebenso durch TNFα-Stimulation
in der myelomonocytischen Zelllinie THP1 induziert werden (6B).
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Die
zwei Allele des BTNL2-Transkripts (4 bp Deletion gegen vollständige Länge) wurden
in einem Säugetierexpressionsvektor
mit C-terminalem Fusions-GFP kloniert. In Transfektionsversuchen
mit HeLa und HEK-Zellen (Daten nicht gezeigt) zeigten diese allelischen
Konstrukte eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation. Im Gegensatz
zu dem vollständigen
Transkript mit einem klaren Membranmuster, war das Delitionsallele
des BTNL2-GFP Fusionsproteins in zytoplasmatischen vesikulären Strukturen,
wie in 7 gezeigt, enthalten. Die hohen
Expressionsraten in den Transfektionsversuchen spiegeln nicht das
physiologische Vorkommen des Proteins in immunoregulatorischen Zellen
wieder, bei denen eine verschachtelte PCR notwendig war, um das
Transkript nachzuweisen. Daher stellt die Vesiclebildung und das
hohe Vorkommen von BTNL2 in allen Membranen wahrscheinlich eine
Auswirkung dieser Überexpression
dar.
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Differenzierung von BTNL2
und DRB1-Effekten
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Das
trunkierende A Allel von rs2076530 stellt einen starken Predispositionsfaktor
für Sarkoidose
dar (Tabelle 3A). Jedoch wurde das DRB1-Gen, das in enger Nähe (~200
kb) des BTNL2-Gens liegt, mit zur Ätiologie der Krankheit hinzugezogen
(Foley et al. 2001, Rossman et al. 2003). Gruppentypisierung des
DRB1-Alleles in allen drei Proben der vorliegenden Studie (Hampe
et al. 2004) bestätigte
tatsächlich,
dass die Amplifikationsgruppe 3 (Allele DRB1*3, *08, *11 (nicht
*1122/30), *12, *13, *14 (nicht *1410/39)) (Hampe et al. 2004) ein
erhöhtes
Krankheitsrisiko trägt.
Es war daher möglich,
dass die Allele in Amplifikationsgruppe 3 sich als ein Mitbegründer der
Assoziierung zwischen rs2076530 und Sarkoidose verhielten. Jedoch
war eine vielschichtige Analyse der DRB1 und BTNL2-Genotypen (Tabelle
3B) durchgehend insignifikant (Breslow-Day Test für Homogenität von sonderbaren
Verhältnissen: χ2 = 0,12, 1 d.f., p > 0,5 für
beide Schichten). Daher stellen die DRB1-Amplifikationsgruppe 3 und das rs2076530
Allele A unabhängige
Risikofaktoren für
Sarkoidose dar. Da bislang keine wichtigen protektiven Allele innerhalb
der DRB1-Amplifikationsgruppe
3 identifiziert worden sind, wurde eine weitere Subtypisierung von
DRB1 als unnötig
erachtet. Interessanterweise folgen die ungeraden Verhältnisse,
erhalten für
Heterozygote (OR-1,55) und Homozygote (OR = 2,56) Träger des
rs2076530 Alleles A einem multiplikativen Modell, hingegen hat die
Anwesenheit der DRB1-Gruppe 3 einen nahezu dominanten Effekt (Ors
= 1,90 und 2,02). Die der Population zuschreibbaren Risiken von
rs2076530 waren 34% für
Genotyp AA und 22% für
AG, aufgrund der hohen Frequenz der Risikoallele.
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Ein
Drei-Stufen-SNP-Kartierungsexperiment wurde an Chromosom 6p21 durchgeführt, um
die genetischen Varianten zu lokalisieren, die für Sarkoidose prädisponieren.
Ein großer
krankheitsassoziierter SNP (rs2076530) wurde in der 3'-Region des BTNL2-Genes
identifiziert. Diese Variante ist üblich (geringe Allele-Frequenz
0,42) und trägt
ein Risiko vollständig
unabhängig
von (bekannten) krankheitsassoziierten Mutationen im DRB1-Gen. Das
Anfälligkeitsallel
von rs2076530 ist charakterisiert durch ungleiche Verhältnisse
von 1,55 in Heterozygoten und von 2,56 in Homozygoten. Verglichen
mit Assoziierungen in anderen komplexen Krankheiten, wie z. B. die
CARD15-Gen Mutationen und Morbus Crohn, ist rs2076530 von gemäßigtem Einfluss
auf das individuelle Krankheitsrisiko, hat aber einen grundlegenden
Beitrag zur Populationshöhe
(PARs 22% für
Heterozygote und 34% für
Homozygote). Dies ist insbesondere mit Hinblick auf den starken
Einfluss von SNP auf die BTNL2-Proteinstruktur
und Funktion faszinierend. Diese offensichtliche Diskrepanz kann
als Ausdruck eines stark redundanten Systems von co-stimulatorischen
Molekülen,
einschließlich
der Produkte des Butyrophilin Gen-Clusters B7-1 und anderen, noch
unbekannten Mitgliedern derselben funktionellen Klasse von Proteinen
erklärbar
sein. Das Human-BTN-Gen-Cluster wurde neulich auf Chromosom 6p22
(Rhodes et al. 2001) ungefähr
6 Mb telomerisch von BTNL2 lokalisiert. Zur Vollständigkeit
wurden 6 Marker des BTNL2-Clusters auch in den kombinierten „Basis" und „erweiterten" Proben der vorliegenden
Studie genotypisiert, jedoch ohne einen Beweis für eine Krankheitsassoziierung
zu liefern (Daten nicht gezeigt).
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Einer
der prinzipiellen co-stimulatorischen Wege für naive T-Zellen wird eingeleitet,
wenn CTLA-4 und CD28 B7 Klasse Moleküle in dem Zusammenhang eines
primären
Signals, übergeben
durch den TCR (Walunas et al. 1996), mit einbeziehen. Das B7-1 Protein
(CD80) ist ein co-stimulatorisches Molekül mit bekannter anti-inflammatorischer
Aktivität,
die durch eine Interaktion CTLA-4 vermittelt ist (Borriello et al.
1997, Collings et al. 2002). Deletion der IgC-Domäne im CD80-Gen
hat einen substantiellen proinflammatorischen Effekt in einem Maus-Plasmid-Vaccinations-Modell
(Agadjanyan et al. 2003). Auf der Aminosäurehomologie und der Domänenstruktur
basierend wurde BTNL2 entlang des B7-1-Proteins modelliert (4).
Es kann daher die Hypothese aufgestellt werden, dass eine potentielle
T-Zellen herunterregulierende Funktion von BTNL2 durch die frankierende
Mutation rs2076530 und den zeitgleichen Verlust der IgC-Domäne und der
Transmembran Helix, möglicherweise
aufgrund des Fehlens der Membranlokalisation (7)
beeinträchtigt
wird. Eine ungeeignete T-Zell-Aktivierung
wäre also
mit der klinischen Immunologie von Sarkoidose kompatibel, gekennzeichnet
durch eine disregulierte T-Helfer-Zell-Aktivierung (Zissel et al.
2000).
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Die
Bedeutung der Co-Stimulation und ihrer Dysfunktion werden zunehmend
für viele
Autoimmunkrankheiten wahrgenommen (Ueda et al. 2003). Die Ergebnisse
der Erfinder der vorliegenden Erfindung unterstreichen ebenso die
Bedeutung dieses Wegs, da CTLA4, ein Prototyp eines mutmaßlichen
BTNL2-Rezeptors, ein Risikofaktor für einen weiten Bereichung Autoimmunkrankheiten,
einschließlich
Typ I Diabetis, autoimmuner Schilddrüsenunterfunk tion und Morbus
Basedow (Ueda et al. 2003). Die exakte funktionelle Rolle von BTNL2
in diesem co-stimulatorischen System bleibt aufzuklären.
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Jedoch
konnte gezeigt werden, dass Varianten von BTNL2 Anfälligkeit
gegenüber
Sarkoidose tragen, eine Krankheit, die durch eine gestörte T-Zell-Funktion
charakterisiert ist. Da das BTNL2-Protein als ein co-stimulatorisches
Molekül
dient, beeinflussen die Krankheitsanfälligkeitsvarianten wahrscheinlich
die T-Zell-Aktivierung. Daher ist die Diagnose auf Basis der genetischen
oder der Proteinvarianten nützlich
für die
Auswahl einer Therapie. Besonders der Eingriff in oder die Verstärkung der
BTNL2-Funktion bietet einen Angriffspunkt für die therapeutische Behandlung
der T-Zell-Funktion und der immunoregulatorischen Balance.
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Eine
Verstärkung
der BTNL2-Funktion kann durch die Gabe der langen Proteinform (SEQ
ID NO: 456) entweder durch parenterale (intravenös, subkutan) oder orale Gabe
erreicht werden. Ebenso können
die natürlich
vorkommenden Varianten, wie in der SEQ ID NO: 457 und SEQ ID NO:
458 dargestellt, die sich nur in ihren Aminosäuren an den Positionen 285,
286 und 299 unterscheiden, verwendet werden.
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Ein
Eingriff in die BTNL2-Funktion kann durch den Entwurf eines kleinen
Moleküls
oder Antikörper (oder
Antikörper-Fragment)
Inhibitors der BTNL2-Bindung an seinen natürlichen Liganden auf der T-Zelle
erreicht werden.
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Ein
weiterer therapeutischer Ansatz ist das Durchführen von Gentherapie mit einem
mit einer Nukleotidsequenz der Typ BTNL2-Sequenz (SEQ ID NO: 455)
transformierten Vektor, mit Transfizieren von Sarkoidose betroffenen
Zellen in vivo mit einer effektiven Menge des Vektors, die den Zellen
ermöglicht,
den Vektor aufzunehmen, und Messen einer Verringerung der Sarkoidose.
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BEISPIEL
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METHODEN
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Beprobung
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Index-Patienten
wurden zwischen 2000 und 2003 entweder durch spezialisierte Krankenhäuser und Allgemeinärzte oder
durch die Deutsche Sarkoidosevereinigung e.V. (http://www.sarkoidose.de)
kontaktiert. Alle Diagnosen wurden auf der Basis des internationalen
Consensus Statements über
Sarkoidose angefertigt (Costable and Hunninghake 1999, Statement
on Sarkoidoses 1999). Patienten von Sarkoidose-Familien wurden über ihre
individuelle und familiäre
Sarkoidose-Historie telefonisch befragt. Alle Patienten (Familien
und Einzelpersonen) füllten
einen Fragebogen über
den Verlauf Ihrer Krankheit aus. Ärzte wurden angesprochen, um
die Diagnose zu bestätigen
und das Vorhandensein von Sarkoidose wurde zusätzlich durch Biopsie in 78% der
Fälle der „Basis"-Probe, 90% der Patienten
der „Erweiterten" Probe und in 88%
von Patienten der „Wiederholungs"-Probe bestätigt. Für die übrigen wurden
der klinische Verlauf und die radiologischen und die Labordaten
als ausreichend konsistent mit der Diagnose von Sarkoidose betrachtet
(Costable and Hunninghake 1999, Statement on Sarkoidose 1999). Alle
Patienten waren deutschen Ursprungs. Eine Gruppe von 517 alters-
und geschlechtszugeordneten gesunden deutschen Kontrollen wurde
ebenso in die Studie mit einbezogen. Alle Teilnehmer gaben ihre
schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie. Die Protokolle
wurden durch Schreiben der institutionellen Ethik und Datenschutzbehörden genehmigt.
Ein Überblick über die
Patientenproben ist in Tabelle 1 dargestellt.
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Zusätzliche
Details über
die Herstellung von biologischem Material
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Bronchoalveoläre Lavage
(BAL) Zellproben wurden von acht Sarkoidose-Patienten mit offener
Krankheit (Durchschnittsalter: 44,8 ± 3,6 Jahre) und vier Kontrollen
(Durchschnittsalter 32,7 ± 8,2
Jahre) genommen. Die Diagnose von chronischer Sarkoidose wurde wie
im Text berichtet durchgeführt
(Costable und Hunninghake 1999). Alle Sarkoidose-Patienten zeigten
klinische Anzeichen einer aktiven Krankheit. Vier Patienten, die eine
Bronchoskopie zur Bewertung eines chronischen Hustens durchliefen
und anschließend
gefunden wurde, dass diese frei von inflammatorischen oder krankhaften
Störungen
sind, dienten als zusätzliche
Kontrollen. Alle Patienten und Kontrollen gaben ihre schriftliche
Zustimmung zu der Studie. Das Protokoll wurde von der institutseigenen
Prüfungsbehörde der
Institution genehmigt. BAL wurde, wie beschrieben, durchgeführt (Hunninghake
et al. 1979). Die durchschnittliche Erholung betrug 62,5% und die
durchschnittliche Zellanzahl/100 ml von BAL-Zellen betrug 12,9 ± 3,3 × 106. Die Zellen wurden bei 500 g zentrifugiert
und dreimal mit phospatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4°C gewaschen.
Die in dieser Studie verwendeten Zellsuspensionen enthielten 85,4 ± 5,3%
alveoläre
Makrophagen. Die gesamt zelluläre
RNA wurde entsprechend den Empfehlungen des Herstellers aus den
BAL-Zellen unter Verwendung von TRIzol Reagenz® (Invitrogen,
Paisley, UK) extrahiert. Um die kontaminierende genomische DNA zu
entfernen, wurde die Gesamt-RNA-Proben mit Deoxyribonuclease I behandelt
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). Reverse Transkription
(RT) wurde an gleichen Mengen von Gesamt-RNA-Proben durchgeführt, unter
Verwendung von 1 × First
Strand Buffer (Invitrogen, Paisley, UK), 2'-Deoxynucleotide 5'Triphosphate (Invitrogen Paisley, UK),
Dithiothreitol, oligo (dD)12–18
primer (Invitrogen, Paisley, UK), RNasin, und Superscript RT (Invitrogen,
Paisley, UK). Vor der Zugabe zur RT wurde das RT-Gemisch für 5 Minuten
bei 65°C
inkubiert, gefolgt von einer Inkubationsperiode von 5 Minuten bei
37°C. Nach
Zugabe des Enzyms wurde die Inkubation für eine weitere Stunde bei 37°C fortgesetzt.
Zu Qualitätskontrolle
wurde jede RNA-Probe einer RT-PCR unterworfen, bei der die RT ausgelassen wurde.
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Genotypisierung
und Sequenzierung
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SNP
Genotypisierung wurde wie beschreiben durchgeführt, unter Verwendung der TaqMan
Technologie auf einem automatisierten Gerät (Hampe et al. 2002, Hampe
et al. 2001). Die Primer und Sondensequenzen aller Versuche sind
in der Tabelle 4a und 4b aufgeführt.
Die Sequenzierung der genomischen DNA wurde mit Applied Biosystems
(Foster City, Ca, USA) BigDyeTM Chemie entsprechend
den Empfehlungen des Lieferanten durchgeführt (für die Primer Sequenzen siehe
Tabelle 5). DRB1 Genotypisierung wurde durchgeführt unter Verwendung gruppenspezifischer
Primer in PCR-s von 2,5 ng genomischer DNA wie beschrieben (Hampe
et al. 2004). Alle Marker wurden vor der Aufnahme in die Assoziierungsstatistiken
auf das Hardy-Weinberg Gleichgewicht in Kontrollen untersucht.
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cDNA Klonierung
und rt-PCR
-
Um
das publizierte BTNL2 Gen-Modell zu verifizieren, wurde nach konservierten
Exons in maus- und humangenomischen Sequenzen (Twinscan gene predictions,
genome.ucsc.edu) und Verwandten gesucht, um die Splice Sites vorherzusagen
(www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). Die vorhergesagten Exons
wurden durch rt-PCR in einem Pool von cDNA Gewebsproben bestätigt (Human
Multiple Tissue cDNA Panels I and II, Clontech) und durch anschließende Klonierung
und Sequenzierung der PCR Produkte.
-
Details
der Primer sind in den Tabellen 4a, 4b, 5 und 6 wiedergegeben. Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Zell cDNA Proben wurden Sarkoidose-Patienten mit offener Krankheit
und von Kontrollen entnommen, entsprechend den den normalen klinischen
und molekularen Prozeduren (Hunninghake et al. 1979). Zur Expressionsanalyse
wurde verschachtelte PCR mit den Primern TTAGAGTCATTGGCCCTGGT (SEQ
ID NO: 439) und GCCCATAGAGCAGATACTCAG (SEQ ID NO: 450) für eine erste
und AGTACCGCTGCCTTTTTGAA (SEQ ID ID NO: 444) und TGGATCACACGCTTGTTCTG
(SEQ ID NO: 449) für
eine zweite Runde der Amplifizierung (Tabelle 6) verwendet.
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Statistische
Analyse
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Einzelpunkt
und erweiterter Haplotyptransmissionsungleichgewichttest wurden
unter Verwendung von TRANSMIT (Clayton et al. 1999) und GENEHUNTER
(Kruglyak et al. 1996) Programmen durchgeführt. Die Haplotypfrequenzschätzungen
unter Einzelpersonen wurden unter Verwendung einer Einbeziehung
eines EM-Algoritmus (HAPMAX, www.uwcm.ac.uk\uwcm\mg\download) (Krawczak
et al. 1988) erhalten. Das Überprüfen auf
Signifikanz von Haplotypfrequenzunterschieden wurde auch mit HAPMAX
durchgeführt,
unter Ausnutzung des Umstandes, dass das zweifache log-Wahrscheinlichkeitsverhältnis zwischen
zwei verschachtelten Datenmotiven ungefähr einer χ2 Verteilung
mit k Freiheitsgraden folgt, wobei k die Differenz in der Parameteranzahl
zwischen den zwei Modellen ist. Die Signifikanzabschätzungen
von Assoziierungen mit oder zwischen Einzelortgenotypen wurde unter
Verwendung von χ2 oder Fisher's exaktem Text für 2 × 3 Zufallstabellen durchgeführt. Genotypische
Regressionsanalyse wurde mit SPSS durchgeführt, wobei individuelle SNP-Genotypen für kategorische
Variable kodieren.
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In silico
Protein Analyse
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Protein-Domän-Architekturen
wurden in der Pfam Datenbank (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) durchsucht
und über
die NCBI konservierte Domänen-Such-Website (www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
untersucht. Um die Struktur des BTNL2 Gen Produkts vorherzusagen,
untersuchten wir alle faltungserkennenden Server, die über den
Metaserver BioInfo.PL erreichbar waren. Auf den Vorhersageergebnissen
basierend, wurde ein Sequenz-Struktur-Alignment von BTNL2 zu B7-1
(4) für
den 3D- Modell-Server
WHAT IF (www.cmbi.kun.nl/gv/servers/WIWWWI/) konstruiert, der ein
vollständiges
Atomstrukturmodell der zweiten IgV und der sich anschließenden IgC
Domäne
von BTNL2 lieferte.
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Fluoreszenzfusionsproteine
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Allelische
Varianten des BTNL2 Transkripts wurden von Klonen, die während der
Genmodellverifikation (s. oben) hergestellt wurden, konstruiert.
Die letzte längen-vollständige Amplifizierung
wurde durchgeführt mit
den Primern GTC TCG AGA TGG TGG ATT TTC CAG GC (SEQ ID NO: 451)
und CAC CCC GGG CTC CTC TTC CTG (SEQ ID NO: 452), für das nicht
abgeschnittene Transkript und GTC TCG AGA TCC TGG ATT TTC CAG GC
(SEQ ID NO: 453) und AAC CCG GGG TGG GGA AGA ACC (SEQ ID NO: 454)
für die
4 pb Delitionsvariante. Fragmente wurden in den Expressionsvektor
pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Ca/USA) kloniert. Helazellen wurden
mit 1 μg
des jeweiligen Konstrukts entsprechend dem Protokoll des Herstellers
transfiziert (Fugene 6, Roche, Base/Schweiz). Leere pEGFP-N2 Vektoren
dienten als Positivkontrolle. Zellen wurden in 4% PFA in PBS (pH
7,6) nach 24 Stunden fixiert und auf Objekträgern in 1:1 Glyzerol in PBS
aufgebracht. Fluoreszenz wurde mit einem Epifluorenszenzmikroskop
dargestellt (Axiophot, Zeiss, Jena/Deutschland).
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Tabelle
1: Proben von Sarkoidose-Patienten, die zur Krankheitsassoziierungsanalyse
verwendet wurden. Oberer Teil: nicht-überlappende Kategorien von
Probeneinheiten (Familien, Trios, Einzelpersonfälle); mittlerer Teil: Zusammenfassung
der Fälle/Patientenzahlen.
Die Gesamtanzahl von unabhängigen
Fällen
entspricht der Summe der Probeneinheiten in dem oberen Teil; unterer
Teil: Darstellung der in verschiedenen Kombinationen mit Patientenproben
durchgeführten
Versuche.
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Tabelle
2: Verifizierung der splicing Effekte von rs2076530. Sich entsprechende
Paare von cDNA und DNA von Lymphoblastoid Zelllinien (oberer Teil)
und von peripheren Blut von Normalkontrollen (unterer Teil) wurden
genotypisiert und die BTNL2 splice Formen mittels rt PCR, Klonierung
und Sequenzierung der PCR-Produkte ausgewertet.
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Tabelle
3A: Assoziierung zwischen BTNL2 und DRB1 Risikoallelen und Sarkoidose
(basierend auf 947 Fällen und
517 Kontrollen). f
Fall, f
Kontrolle:
Allelfrequenz in Fällen
und Kontrollen. Genotypen an beiden Orten waren im Hardy-Weinberg
Gleichgewicht unter den Kontrollen; p (global): Fehlerwahrscheinlichkeit
eines globalen χ
2 für allelische
Assoziierung; tdt (beobachtet/erwartet): Verhältnis der beobachteten gegenüber der
erwarteten Zahl von Transmissionen; p (Allel): Allele gruppenspezifische
TDT Fehlerwahrscheinlichkeit, wie vom TRANSMIT Programm berichtet.
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Tabelle
3B: Unterscheidung zwischen BTNL2 und DRB1 Effekten. x: Andere als
die Allele in der Amplifikationsgruppe 3 der DRB1 Allele.
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