DE602004003903T2

DE602004003903T2 - Diagnositische Verwendung von Polymorphismen im für BTNL2 codierten Gen assoziert mit Sarkoidose

Info

Publication number: DE602004003903T2
Application number: DE602004003903T
Authority: DE
Inventors: Jochen Hampe; Philip Rosenstiel; Stefan Schreiber; Manfred Schümann; Ruta Valentolyte
Original assignee: Schleswiger Tauwerkfabrik Oellerking GmbH and Co KG; Universitatsklinikum Schleswig Holstein UKSH
Current assignee: Schleswiger Tauwerkfabrik Oellerking GmbH and Co KG; Universitatsklinikum Schleswig Holstein UKSH
Priority date: 2004-04-02
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2024-04-03
Also published as: DE602004003903D1; DK1582530T3; EP1582530B1; EP1582530A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Gen, das Sarkoidose zugerechnet wird, wobei gefunden wurde, dass das Gen mutiert ist. Insbesondere betrifft die Erfindung die kodierende Sequenz des BTNL2-Gens des Menschen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Sarkoidose ist eine multi-systemische Immunkrankheit, charakterisiert durch nicht-käsende Granulome und einer übertriebenen zellulären Immunantwort aufgrund einer erhöhten inflammatorischen Aktivität von Makrophagen und CD4 Helfer T-Zellen (Newman et al. 1997, Ziegenhagen et al. 2003). Typische Orte der Krankheitsanzeichen schließen Lunge, Lymphknoten, Augen und Haut ein. Die klinische Darstellung der Krankheit variiert zwischen leichter Entzündung mit langsam progressiver pulmonarer Fibrose und einem akuten inflammatorischen Syndrom (Löfgren Syndrom). Obwohl eine spontane Auflösung in mehr als 50% der Fälle beobachtet wird, kann die Krankheit ebenso einen hartnäckigen Verlauf mit einem chronischen respiratorischen Versagen im Endstadium nehmen. Die Prävalenz der Sarkoidose rangiert von 10–14 pro 100.000 in Zentral-Europa und unter US-Kaukasiern bis zu 64 pro 100.000 in Schweden. Familiäre Gruppenbildung der Krankheit wurde in mehreren Populationen beobachtet, obwohl die Schätzungen eines relativen Risikos bei Verwandten ersten Grades zwischen 2,8 und 18 variieren (Rybicki et al. 2001).
In einer jüngsten Genom-Analyse von 63 Sarkoidose-Familien (Schurmann et al. 2001), identifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Verbindung der Krankheit zu Chromosom 6p21. Verschiedene HLA-Marker wurden auf eine Verbindung zur Krankheit hin untersucht (Sato et al. 2002, Foley et al. 2001, Tybicki et al. 2003, Rossman et al. 2003) und ersten widersprüchlichen Ergebnissen folgend wurde neulich das DRB1-Gen als ein Risikofaktor für Sarkoidose identifiziert (Foley et al. 2001, Rossman et al. 2003). Nichtsdestotrotz ist das der Population zuzuschreibende Risiko von Mutationen in diesem Gen nur gering (~10% für Kaukasier) und im Hinblick auf das für 6p21 erhaltene starke Verbindungssignal erscheint es wahrscheinlich, dass zusätzliche Risikofaktoren in dieser Region existieren. Diese Hypothese wurde bereits für einige Kandidatengene untersucht (Grutters et al. 2002, Abdallah et al. 2003).
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung beruht auf der Isolierung einer codierenden Sequenz des in Menschen gefundenen BTNL2-Gens. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem BTNL2 oder Teile davon mit einem oder mehreren Oligonukleotid-Primern amplifiziert wird. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu identifizieren von Individuen, die keine Mutation der codierenden Sequenz von BTNL2 tragen und daher keine erhöhte genetische Anfälligkeit gegen Sarkoidose basierend auf ihren BTNL2-Genen haben, bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Identifizieren einer Mutation, die zu einer erhöhten Anfälligkeit gegen Sarkoidose führt, bereitzustellen.
Ein Fachmann im Bereich der Gentests wird die vorliegende Erfindung nützlich finden zum:

a) Identifizieren von Individuen mit einem BTNL2-Gen ohne codierende Mutationen, von denen daher nicht gesagt werden kann, eine erhöhte Anfälligkeit gegen Sarkoidose aufgrund ihrer BTNL2-Gene zu besitzen;
b) Vermeiden von Missinterpretationen von im BTNL2-Gen gefundenen Polymorphismen;
c) Bestimmen der Anwesenheit einer bisher unbekannten Mutation im BTNL2-Gen;
d) Identifizieren einer Mutation, die die genetische Anfälligkeit gegenüber Sarkoidose erhöht;
e) Entnehmen einer Humanprobe des BTNL2-Gens;
f) Durchführen einer Gen-Therapie;
g) Herstellen eines funktionierenden Proteins, für das die BTNL2-Gene codieren, zur Therapie von Sarkoidose.

Im Hinblick auf das für 6p21 erhaltene starke Verbindungssignal und die damit verbundene Wahrscheinlichkeit eines zusätzlichen Risikofaktors in dieser Region haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein umfassendes Drei-Stufen SNP Feinkartierungsexperiment bei 6p21 durchgeführt, um zusätzliche Krankheitsanfälligkeitsgene zu suchen. Um die vorangegangenen Missinterpretationen zu überwinden, ist es ein Gesichtspunkt der Erfindung, eine Kombination von ausgedehnten Familien, Trios und Singleton Patienten rekrutiert zu haben, die es ermöglichen, sowohl eine familienbasierte (TDT) und eine populationsbasierte (Fallkontrolle) Assoziationsanalyse parallel durchzuführen. Die Idee hinter diesem Verfahren ist die, dass die Übereinstimmung der TDT und der Fall-Kontrolle eine pragmatische Anleitung zur Vertrauenswürdigkeit einzelner Assoziationssignale liefern würde.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine graphische Darstellung des Stufe 1 SNP-Screens auf Chromosom 6p21.
2 zeigt eine graphische Darstellung des Stufe 2 SNP-Screens der kombinierten „Basis" und „erweiterten" Patienten-Proben.
3 zeigt die Splicing-Alternative bei SNP rs2076530 in Exon 5 des BTNL2-Gens.
4 zeigt die durch Berechnung abgeleitete Architektur der Domäne des BTNL2-Genprodukts.
5 zeigt das durch Berechnung abgeleitete 3D-Struktur Modell der zweiten IgV Domäne und der nachfolgenden IgC Domäne des BTNL2 Homodimers.
6 zeigt das Expressionsmuster des BTNL2-Gens, analysiert mit verschachtelter rt-PCR und nachfolgender Agarose-Gelelektrophorese der rt-PCR Produkte.
7 zeigt Fluoreszenzbilder des allelischen BTNL2-GFP-Fusionsproteins, das transient in HeLa-Zellen transfiziert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Identifizierung eines Assoziationssignals – Stufe 1 SNP Scan
Im ersten „Stufe I" SNP Scan, wurden Individuen der sogenannten Basis-Proben für 69 SNPs von einem Interval um die maximale LOD-Position des ursprünglichen Genom-Screens (Schurmann et al. 2001), wie in 1 (NCBI Ausgabe 32 Kartenkoordinaten 27,8 Mb–44,1 Mb) genotypisiert. Durch einen Abfall im LOD-Wert von 1,5 Einheiten oder weniger definiert, repräsentiert dieses Inverval eine ungefähr 99%ige Vertrauensregion für einen Zusammenhang. Um genügend Kraft für eine Assoziationssignal-Identifizierung zu erreichen, wurde ein P-Wert von 0,001 als eine Schwelle für die Signifikanz in sowohl der TDT und der Fall-Kontrollanalyse der drei-Ort SNP Haplotypen gewählt. Dieses Kriterium anwendend, ergab nur die BTNL2 Sub-Region ein konsistentes Assoziationssignal. Ein zweites Signal in der MICB-Subregion erbrachte ein P-Wert geringer als 0,001 im Fall-Kontroll-Bereich, aber nicht in der TDT-Analyse (p = 0,3). Diese zweite mögliche Signalregion wurde nichtsdestoweniger weiterhin durch die Genotypmarker rs1063635, rs3134900, rs3130062, rs1041981 und rs1799964 (für die Details: s. Tabelle 4a und Tabelle 4b) in der „erweiterten" Probe (Tabelle 1) zusammen mit den BTNL2-Signalmarkern rs2076523, hCV2455668, hCV2455646 und rs7192 untersucht. Genotyp logistische Regressionsanalyse mit Wahrscheinlichkeitsverhältnis basierter Vorwärtsinklusion bei einem p < 0,05 Niveau resultierten in einem Modell, das nur zwei Marker von BTNL2-Region (rs2076523, rs7192), aber keinen der MICB-Marker beinhaltete. Weiterhin wurde ein substantieller weiter Abstand LD zwischen den Markern in der BTNL2-Region und in der MICB-Region mit D'-Werten bis zu 0,94 beobachtet. Daher wurden alle folgenden Kartierungsanstrengungen auf die BTNL2-Region beschränkt.
Untersuchung der BTNL2-Gen-Region – Stufe II SNP Scan
In „Stufe II" wurde eine Gesamtheit von 48 SNPs von der 440 kb Assoziationsregion um das BTNL2-Gen (NCBI Ausgabe 32 Kartenkoordinaten 32,177–32,616 Mb) in den kombinierten „Basis" und „erweiterten" Proben, wie in Tabelle 1 gezeigt, genotypisiert. SNPs wurden entweder in der ABI „Assay on Demand"-Datenbank (www.store-appliedbiosystems.com), in dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov) oder durch direktes genomisches Sequenzieren von 47 Sarkoidose-Patienten identifiziert. Mutationsscreening dieser Individuen deckte alle Exons und angrenzenden Intronsequenzen des überarbeiteten BTNL2-Gen-Modells ab (s. nächster Abschnitt). Weitere SNPs wurden im TSBP-Gen, dem DRA-Gen (mit dem Promotor, der hier nicht auf SNPs analysiert wurde) und in einigen nicht codierenden telomerischen Sequenzen des BTNL2-Gens, wie in den 2 und Tab. 5 gezeigt, nachgewiesen. Einzelpunkt TDT und Fallkontrolldaten wurden unter Berücksichtigung der Haplotyp-Struktur der Region interpretiert (2B). Übereinstimmende Ergebnisse wurden durch die zwei Versuche für eine 15 kb-Region am 3-Strich Ende des BTNL2-Gens erhalten (marker hCV2488476 bis rs2294878). Hier waren die P-Werte zwei oder drei Größenordnungen kleiner als für die anderen Regionen (2C).
Funktionelle und strukturelle Effekte von BTNL2-Genmutationen
Die Gen-Struktur von BTNL2, wie in den öffentlichen Datenbanken eingetragen, wurde mittels cDNA-Klonierung genau geprüft. In dem ursprünglichen Bericht (Stammers et al. 2000) wurde keine durchgehende cDNA Amplifizierung für die Exons 1–4 und 5–6 erreicht, wodurch die Möglichkeit aufkommt, dass zwei Gene an diesem Ort vorkommen. Wir haben drei zusätzliche Exons (15' und 23') identifiziert und das ursprüngliche Exon 3 aus dem Gen-Modell ausgeschlossen. Überlappende rt-PCR bestätigte erfolgreich das Vorhandensein eines einzelnen Transkripts und bekräftigte die Gültigkeit des überarbeiteten Gen-Modells.
Das 15 kb-Segment, das am stärksten mit Sarkoidose assoziiert ist, enthält vier funktionale SNPs (P299Q, M2861I, P285L, rs2076530), die zusammen einen P-Wert von 1,9·10,7^–7 in einem Viermarker Haplotyp TDT und von 6,2·10^–7 in einer entsprechenden Fallkontrollanalyse (für Einzelpunktergebnisse siehe 2C) ergaben. Der Großteil der Assoziierung ergab sich aufgrund rs2076530 mit einem verbleibenden p = 0,03 für die Einbeziehung der anderen drei Marker in einem Fallkontroll Haplotyp-Regressionsmodel. Die starke Assoziierung zwischen Sarkoidose und rs2076530 wurde in einer unabhängigen „Wiederholungs"-Probe bestätigt („Stufe III", Tabelle 1; TDT χ² = 9,7, p = 0,0018; Fallkontrolle χ² = 21,0, p = 2,7·10^–5).
Dem berichteten Genmodel entsprechend (Stammers et al. 2000), würde vorausgesagt worden sein, dass ein rs2076530 einen Aminosäurenaustausch verursacht. Aber als ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung wurde angenommen und konnte tatsächlich gezeigt werden, dass sich der SNP an einer Position –1 einer Donor Splice Site, wie in 3 gezeigt, befindet. Eine in den klonierten rt-PCR-Produkten beobachtete vier Basen cDNA-Deletion der Genmo delverifikation ist dadurch erklärbar, dass rs2076530 die Anatomie der Splice Site verändert. Guanin befindet sich an der Position –1 von 77% der donor sites (Krawczak et al. 1992, Long et al. 1999), so dass es wahrscheinlich ist, das der Übergang von A nach G von rs2076530 in einer alternativen Splice Site, die sich 4 bp upstream wie in 3 gezeigt befindet, resultiert. Genotypspezifisches Splicen wurde durch rt-PCT von DNA/cDNA Paaren von Lymphoblastoidzelllinien und peripheren Blutproben bestätigt (Tabelle 2). Der Verlust von vier Basen von der vom A Allel transkribierten cDNA verursacht einen Leserasterverschiebung und einen frühzeitigen Stop im nächsten Exon. In dem entsprechenden Proteinprodukt würden die 118 C-terminalen Reste in dem ungekürzten Protein durch fünf verschiedene Aminosäuren ersetzt werden.
Die Auswirkungen der krankheitsassoziierten Varianten auf die Struktur des BTNL2 Proteins wurden in silico untersucht. Die BTN (butyrophilin-ähnlichen) Gene sind Angehörige der Immunoglobulin-Superfamilie (IgSF). Die allgemeine Domänenarchitektur der BTN Gene umfasst eine kleine aber variable Anzahl von aufeinander folgenden immunoglobulin-ähnlichen (Ig-ähnlichen) Ektodomänen mit einem N-terminalen Peptid und einer C-terminalen Transmembranhelix, die das Protein auf der Membran von antigenpräsentierenden Zellen verankert (Rhodes et al. 2001, Sharpe et al. 2002). Das in 4 gezeigte Proteinprodukt des überarbeiteten BTNL2 Gens enthält zwei N-terminale homologe IgV (Ig-ähnliche variable) Domänen mit einer Sequenzidentität von 46% und einer C-terminale IgC (Ig-ähnliche konstante) Domäne. Die Schnittstelle des angenommenen N-terminalen Signalpeptids (Rhodes et al. 2001, Sharpe et al. 2002, Stammers et al. 2000) wird zwischen den Resten 26 und 27 vorhergesagt und ein Hydropathie-Indexplot, wie in 5A gezeigt, zusammen mit den Ergebnissen des Transmembran Vorhersageservers (Albrecht et al. 2003) legen eine einzelne C-terminale Transmembranhelix nahe, die der IgC Domäne folgt. Solch eine Membran verankernde Helix kann auch an den C-Termini von IgC Domänen von MHC Antigenen und anderen co-stimulatorischen Rezeptoren gefunden werden. Tatsächlich wurde von einer entfernten Homologie zwischen butyrophilin-ähnlichen Proteinen zu MHC Antigenen und B7-1/-2 (CD80/CD86) co-stimulatorischen Rezeptoren (Ikemizu et al. 2000, Schwartz et al. 2001, Stamper et al. 2001, Zhang et al. 2003) berichtet (Rhodes et al. 2001, Stammers et al. 2000). Die IgV und IgC Domänsequenzen der Kristallstrukturen des B7-1 homodimers (Ikemizu et al. 2000, Stamper et al. 2000, Bajorath et al. 2001) wurde gefunden mit einem signifikanten E-Wert von 3·10^–7 durch eine BLAST Recherche von PDB unter Verwendung der Zeiten IfV und der benachbarten IgC Domäne von BTNL2. Folglich haben wir die 3D-Struktur bei der BTNL2 Domänen basierend auf einem manuell behandelten Sequenzstruktur Alignment von BTNL2 zum B7-1 template, mit einer gemeinsamen Aminosäuresequenzidentität von 24%, moduliert. Das resultierende, in 5 dargestellte 3D Modell von BTNL2 zeigt eine Beschneidung der Proteinstruktur an dem Ort des durch rs2076530 eingefügten frühzeitigen Stops, kurz vor dem Start der IgC Domäne und der sich anschließenden Transmembran helix. Die Varianten P285L, M2861 und P299Q befinden sich im β-Strang auf der Proteinoberfläche der IgC Domäne (Bajorath et al. 2001) und sind von den Resten I126, I127 und 5140 von B7-1 erfaßt. Interessanter Weise verändern sich alle Varianten zu Aminosäuren, deren Seitenketten den entsprechenden Wild-Typ Bz-1 Resten in ihrer IgC Domäne physiko-chemisch ähnlicher sind. Mehrere an der Bindung der IgV Domäne von B7-1 an seinen Rezeptor CTLA-4 beteiligte Reste (Stamper et al. 2000) sind in BTNL2 konserviert (4, 5). Diese Beobachtung legt nahe, dass BTNL2 einen ähnlichen Rezeptorbindungsort wie B7-1 besitzt (s. 5).
Um die Expression des BTNL2-Gens in relevanten Zielzellen auszuwerten, wurde in einem Gewebsfeld in THP1-Zellen und in Bronchoalveolar Lavage Zellen (BAL) von Patienten und Kontrollen eine rt-PCR durchgeführt. Da die BTNL2-Expression generell gering war, musste eine verschachtelte rt-PCR eingesetzt werden, um ausreichende Mengen des Transkripts nachzuweisen. 6a zeigt die beobachtete Expression in einer Reihe von Geweben, inkl. Leukozyten und Thymus. Transkripte wurden ebenso in allen 8 BAL-Zellproben von Sarkoidose-Patienten nachgewiesen, aber nicht in BAL-Zellen von Kontroll-Individuen oder in normalen Lungenzellen, wie in 6B gezeigt. Die Expression des BTNL-Gens konnte ebenso durch TNFα-Stimulation in der myelomonocytischen Zelllinie THP1 induziert werden (6B).
Die zwei Allele des BTNL2-Transkripts (4 bp Deletion gegen vollständige Länge) wurden in einem Säugetierexpressionsvektor mit C-terminalem Fusions-GFP kloniert. In Transfektionsversuchen mit HeLa und HEK-Zellen (Daten nicht gezeigt) zeigten diese allelischen Konstrukte eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation. Im Gegensatz zu dem vollständigen Transkript mit einem klaren Membranmuster, war das Delitionsallele des BTNL2-GFP Fusionsproteins in zytoplasmatischen vesikulären Strukturen, wie in 7 gezeigt, enthalten. Die hohen Expressionsraten in den Transfektionsversuchen spiegeln nicht das physiologische Vorkommen des Proteins in immunoregulatorischen Zellen wieder, bei denen eine verschachtelte PCR notwendig war, um das Transkript nachzuweisen. Daher stellt die Vesiclebildung und das hohe Vorkommen von BTNL2 in allen Membranen wahrscheinlich eine Auswirkung dieser Überexpression dar.
Differenzierung von BTNL2 und DRB1-Effekten
Das trunkierende A Allel von rs2076530 stellt einen starken Predispositionsfaktor für Sarkoidose dar (Tabelle 3A). Jedoch wurde das DRB1-Gen, das in enger Nähe (~200 kb) des BTNL2-Gens liegt, mit zur Ätiologie der Krankheit hinzugezogen (Foley et al. 2001, Rossman et al. 2003). Gruppentypisierung des DRB1-Alleles in allen drei Proben der vorliegenden Studie (Hampe et al. 2004) bestätigte tatsächlich, dass die Amplifikationsgruppe 3 (Allele DRB1*3, *08, *11 (nicht *1122/30), *12, *13, *14 (nicht *1410/39)) (Hampe et al. 2004) ein erhöhtes Krankheitsrisiko trägt. Es war daher möglich, dass die Allele in Amplifikationsgruppe 3 sich als ein Mitbegründer der Assoziierung zwischen rs2076530 und Sarkoidose verhielten. Jedoch war eine vielschichtige Analyse der DRB1 und BTNL2-Genotypen (Tabelle 3B) durchgehend insignifikant (Breslow-Day Test für Homogenität von sonderbaren Verhältnissen: χ² = 0,12, 1 d.f., p > 0,5 für beide Schichten). Daher stellen die DRB1-Amplifikationsgruppe 3 und das rs2076530 Allele A unabhängige Risikofaktoren für Sarkoidose dar. Da bislang keine wichtigen protektiven Allele innerhalb der DRB1-Amplifikationsgruppe 3 identifiziert worden sind, wurde eine weitere Subtypisierung von DRB1 als unnötig erachtet. Interessanterweise folgen die ungeraden Verhältnisse, erhalten für Heterozygote (OR-1,55) und Homozygote (OR = 2,56) Träger des rs2076530 Alleles A einem multiplikativen Modell, hingegen hat die Anwesenheit der DRB1-Gruppe 3 einen nahezu dominanten Effekt (Ors = 1,90 und 2,02). Die der Population zuschreibbaren Risiken von rs2076530 waren 34% für Genotyp AA und 22% für AG, aufgrund der hohen Frequenz der Risikoallele.
Ein Drei-Stufen-SNP-Kartierungsexperiment wurde an Chromosom 6p21 durchgeführt, um die genetischen Varianten zu lokalisieren, die für Sarkoidose prädisponieren. Ein großer krankheitsassoziierter SNP (rs2076530) wurde in der 3'-Region des BTNL2-Genes identifiziert. Diese Variante ist üblich (geringe Allele-Frequenz 0,42) und trägt ein Risiko vollständig unabhängig von (bekannten) krankheitsassoziierten Mutationen im DRB1-Gen. Das Anfälligkeitsallel von rs2076530 ist charakterisiert durch ungleiche Verhältnisse von 1,55 in Heterozygoten und von 2,56 in Homozygoten. Verglichen mit Assoziierungen in anderen komplexen Krankheiten, wie z. B. die CARD15-Gen Mutationen und Morbus Crohn, ist rs2076530 von gemäßigtem Einfluss auf das individuelle Krankheitsrisiko, hat aber einen grundlegenden Beitrag zur Populationshöhe (PARs 22% für Heterozygote und 34% für Homozygote). Dies ist insbesondere mit Hinblick auf den starken Einfluss von SNP auf die BTNL2-Proteinstruktur und Funktion faszinierend. Diese offensichtliche Diskrepanz kann als Ausdruck eines stark redundanten Systems von co-stimulatorischen Molekülen, einschließlich der Produkte des Butyrophilin Gen-Clusters B7-1 und anderen, noch unbekannten Mitgliedern derselben funktionellen Klasse von Proteinen erklärbar sein. Das Human-BTN-Gen-Cluster wurde neulich auf Chromosom 6p22 (Rhodes et al. 2001) ungefähr 6 Mb telomerisch von BTNL2 lokalisiert. Zur Vollständigkeit wurden 6 Marker des BTNL2-Clusters auch in den kombinierten „Basis" und „erweiterten" Proben der vorliegenden Studie genotypisiert, jedoch ohne einen Beweis für eine Krankheitsassoziierung zu liefern (Daten nicht gezeigt).
Einer der prinzipiellen co-stimulatorischen Wege für naive T-Zellen wird eingeleitet, wenn CTLA-4 und CD28 B7 Klasse Moleküle in dem Zusammenhang eines primären Signals, übergeben durch den TCR (Walunas et al. 1996), mit einbeziehen. Das B7-1 Protein (CD80) ist ein co-stimulatorisches Molekül mit bekannter anti-inflammatorischer Aktivität, die durch eine Interaktion CTLA-4 vermittelt ist (Borriello et al. 1997, Collings et al. 2002). Deletion der IgC-Domäne im CD80-Gen hat einen substantiellen proinflammatorischen Effekt in einem Maus-Plasmid-Vaccinations-Modell (Agadjanyan et al. 2003). Auf der Aminosäurehomologie und der Domänenstruktur basierend wurde BTNL2 entlang des B7-1-Proteins modelliert (4). Es kann daher die Hypothese aufgestellt werden, dass eine potentielle T-Zellen herunterregulierende Funktion von BTNL2 durch die frankierende Mutation rs2076530 und den zeitgleichen Verlust der IgC-Domäne und der Transmembran Helix, möglicherweise aufgrund des Fehlens der Membranlokalisation (7) beeinträchtigt wird. Eine ungeeignete T-Zell-Aktivierung wäre also mit der klinischen Immunologie von Sarkoidose kompatibel, gekennzeichnet durch eine disregulierte T-Helfer-Zell-Aktivierung (Zissel et al. 2000).
Die Bedeutung der Co-Stimulation und ihrer Dysfunktion werden zunehmend für viele Autoimmunkrankheiten wahrgenommen (Ueda et al. 2003). Die Ergebnisse der Erfinder der vorliegenden Erfindung unterstreichen ebenso die Bedeutung dieses Wegs, da CTLA4, ein Prototyp eines mutmaßlichen BTNL2-Rezeptors, ein Risikofaktor für einen weiten Bereichung Autoimmunkrankheiten, einschließlich Typ I Diabetis, autoimmuner Schilddrüsenunterfunk tion und Morbus Basedow (Ueda et al. 2003). Die exakte funktionelle Rolle von BTNL2 in diesem co-stimulatorischen System bleibt aufzuklären.
Jedoch konnte gezeigt werden, dass Varianten von BTNL2 Anfälligkeit gegenüber Sarkoidose tragen, eine Krankheit, die durch eine gestörte T-Zell-Funktion charakterisiert ist. Da das BTNL2-Protein als ein co-stimulatorisches Molekül dient, beeinflussen die Krankheitsanfälligkeitsvarianten wahrscheinlich die T-Zell-Aktivierung. Daher ist die Diagnose auf Basis der genetischen oder der Proteinvarianten nützlich für die Auswahl einer Therapie. Besonders der Eingriff in oder die Verstärkung der BTNL2-Funktion bietet einen Angriffspunkt für die therapeutische Behandlung der T-Zell-Funktion und der immunoregulatorischen Balance.
Eine Verstärkung der BTNL2-Funktion kann durch die Gabe der langen Proteinform (SEQ ID NO: 456) entweder durch parenterale (intravenös, subkutan) oder orale Gabe erreicht werden. Ebenso können die natürlich vorkommenden Varianten, wie in der SEQ ID NO: 457 und SEQ ID NO: 458 dargestellt, die sich nur in ihren Aminosäuren an den Positionen 285, 286 und 299 unterscheiden, verwendet werden.
Ein Eingriff in die BTNL2-Funktion kann durch den Entwurf eines kleinen Moleküls oder Antikörper (oder Antikörper-Fragment) Inhibitors der BTNL2-Bindung an seinen natürlichen Liganden auf der T-Zelle erreicht werden.
Ein weiterer therapeutischer Ansatz ist das Durchführen von Gentherapie mit einem mit einer Nukleotidsequenz der Typ BTNL2-Sequenz (SEQ ID NO: 455) transformierten Vektor, mit Transfizieren von Sarkoidose betroffenen Zellen in vivo mit einer effektiven Menge des Vektors, die den Zellen ermöglicht, den Vektor aufzunehmen, und Messen einer Verringerung der Sarkoidose.
BEISPIEL
METHODEN
Beprobung
Index-Patienten wurden zwischen 2000 und 2003 entweder durch spezialisierte Krankenhäuser und Allgemeinärzte oder durch die Deutsche Sarkoidosevereinigung e.V. (http://www.sarkoidose.de) kontaktiert. Alle Diagnosen wurden auf der Basis des internationalen Consensus Statements über Sarkoidose angefertigt (Costable and Hunninghake 1999, Statement on Sarkoidoses 1999). Patienten von Sarkoidose-Familien wurden über ihre individuelle und familiäre Sarkoidose-Historie telefonisch befragt. Alle Patienten (Familien und Einzelpersonen) füllten einen Fragebogen über den Verlauf Ihrer Krankheit aus. Ärzte wurden angesprochen, um die Diagnose zu bestätigen und das Vorhandensein von Sarkoidose wurde zusätzlich durch Biopsie in 78% der Fälle der „Basis"-Probe, 90% der Patienten der „Erweiterten" Probe und in 88% von Patienten der „Wiederholungs"-Probe bestätigt. Für die übrigen wurden der klinische Verlauf und die radiologischen und die Labordaten als ausreichend konsistent mit der Diagnose von Sarkoidose betrachtet (Costable and Hunninghake 1999, Statement on Sarkoidose 1999). Alle Patienten waren deutschen Ursprungs. Eine Gruppe von 517 alters- und geschlechtszugeordneten gesunden deutschen Kontrollen wurde ebenso in die Studie mit einbezogen. Alle Teilnehmer gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie. Die Protokolle wurden durch Schreiben der institutionellen Ethik und Datenschutzbehörden genehmigt. Ein Überblick über die Patientenproben ist in Tabelle 1 dargestellt.
Zusätzliche Details über die Herstellung von biologischem Material
Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Zellproben wurden von acht Sarkoidose-Patienten mit offener Krankheit (Durchschnittsalter: 44,8 ± 3,6 Jahre) und vier Kontrollen (Durchschnittsalter 32,7 ± 8,2 Jahre) genommen. Die Diagnose von chronischer Sarkoidose wurde wie im Text berichtet durchgeführt (Costable und Hunninghake 1999). Alle Sarkoidose-Patienten zeigten klinische Anzeichen einer aktiven Krankheit. Vier Patienten, die eine Bronchoskopie zur Bewertung eines chronischen Hustens durchliefen und anschließend gefunden wurde, dass diese frei von inflammatorischen oder krankhaften Störungen sind, dienten als zusätzliche Kontrollen. Alle Patienten und Kontrollen gaben ihre schriftliche Zustimmung zu der Studie. Das Protokoll wurde von der institutseigenen Prüfungsbehörde der Institution genehmigt. BAL wurde, wie beschrieben, durchgeführt (Hunninghake et al. 1979). Die durchschnittliche Erholung betrug 62,5% und die durchschnittliche Zellanzahl/100 ml von BAL-Zellen betrug 12,9 ± 3,3 × 10⁶. Die Zellen wurden bei 500 g zentrifugiert und dreimal mit phospatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4°C gewaschen. Die in dieser Studie verwendeten Zellsuspensionen enthielten 85,4 ± 5,3% alveoläre Makrophagen. Die gesamt zelluläre RNA wurde entsprechend den Empfehlungen des Herstellers aus den BAL-Zellen unter Verwendung von TRIzol Reagenz^® (Invitrogen, Paisley, UK) extrahiert. Um die kontaminierende genomische DNA zu entfernen, wurde die Gesamt-RNA-Proben mit Deoxyribonuclease I behandelt (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). Reverse Transkription (RT) wurde an gleichen Mengen von Gesamt-RNA-Proben durchgeführt, unter Verwendung von 1 × First Strand Buffer (Invitrogen, Paisley, UK), 2'-Deoxynucleotide 5'Triphosphate (Invitrogen Paisley, UK), Dithiothreitol, oligo (dD)12–18 primer (Invitrogen, Paisley, UK), RNasin, und Superscript RT (Invitrogen, Paisley, UK). Vor der Zugabe zur RT wurde das RT-Gemisch für 5 Minuten bei 65°C inkubiert, gefolgt von einer Inkubationsperiode von 5 Minuten bei 37°C. Nach Zugabe des Enzyms wurde die Inkubation für eine weitere Stunde bei 37°C fortgesetzt. Zu Qualitätskontrolle wurde jede RNA-Probe einer RT-PCR unterworfen, bei der die RT ausgelassen wurde.
Genotypisierung und Sequenzierung
SNP Genotypisierung wurde wie beschreiben durchgeführt, unter Verwendung der TaqMan Technologie auf einem automatisierten Gerät (Hampe et al. 2002, Hampe et al. 2001). Die Primer und Sondensequenzen aller Versuche sind in der Tabelle 4a und 4b aufgeführt. Die Sequenzierung der genomischen DNA wurde mit Applied Biosystems (Foster City, Ca, USA) BigDye^TM Chemie entsprechend den Empfehlungen des Lieferanten durchgeführt (für die Primer Sequenzen siehe Tabelle 5). DRB1 Genotypisierung wurde durchgeführt unter Verwendung gruppenspezifischer Primer in PCR-s von 2,5 ng genomischer DNA wie beschrieben (Hampe et al. 2004). Alle Marker wurden vor der Aufnahme in die Assoziierungsstatistiken auf das Hardy-Weinberg Gleichgewicht in Kontrollen untersucht.
cDNA Klonierung und rt-PCR
Um das publizierte BTNL2 Gen-Modell zu verifizieren, wurde nach konservierten Exons in maus- und humangenomischen Sequenzen (Twinscan gene predictions, genome.ucsc.edu) und Verwandten gesucht, um die Splice Sites vorherzusagen (www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). Die vorhergesagten Exons wurden durch rt-PCR in einem Pool von cDNA Gewebsproben bestätigt (Human Multiple Tissue cDNA Panels I and II, Clontech) und durch anschließende Klonierung und Sequenzierung der PCR Produkte.
Details der Primer sind in den Tabellen 4a, 4b, 5 und 6 wiedergegeben. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Zell cDNA Proben wurden Sarkoidose-Patienten mit offener Krankheit und von Kontrollen entnommen, entsprechend den den normalen klinischen und molekularen Prozeduren (Hunninghake et al. 1979). Zur Expressionsanalyse wurde verschachtelte PCR mit den Primern TTAGAGTCATTGGCCCTGGT (SEQ ID NO: 439) und GCCCATAGAGCAGATACTCAG (SEQ ID NO: 450) für eine erste und AGTACCGCTGCCTTTTTGAA (SEQ ID ID NO: 444) und TGGATCACACGCTTGTTCTG (SEQ ID NO: 449) für eine zweite Runde der Amplifizierung (Tabelle 6) verwendet.
Statistische Analyse
Einzelpunkt und erweiterter Haplotyptransmissionsungleichgewichttest wurden unter Verwendung von TRANSMIT (Clayton et al. 1999) und GENEHUNTER (Kruglyak et al. 1996) Programmen durchgeführt. Die Haplotypfrequenzschätzungen unter Einzelpersonen wurden unter Verwendung einer Einbeziehung eines EM-Algoritmus (HAPMAX, www.uwcm.ac.uk\uwcm\mg\download) (Krawczak et al. 1988) erhalten. Das Überprüfen auf Signifikanz von Haplotypfrequenzunterschieden wurde auch mit HAPMAX durchgeführt, unter Ausnutzung des Umstandes, dass das zweifache log-Wahrscheinlichkeitsverhältnis zwischen zwei verschachtelten Datenmotiven ungefähr einer χ² Verteilung mit k Freiheitsgraden folgt, wobei k die Differenz in der Parameteranzahl zwischen den zwei Modellen ist. Die Signifikanzabschätzungen von Assoziierungen mit oder zwischen Einzelortgenotypen wurde unter Verwendung von χ² oder Fisher's exaktem Text für 2 × 3 Zufallstabellen durchgeführt. Genotypische Regressionsanalyse wurde mit SPSS durchgeführt, wobei individuelle SNP-Genotypen für kategorische Variable kodieren.
In silico Protein Analyse
Protein-Domän-Architekturen wurden in der Pfam Datenbank (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) durchsucht und über die NCBI konservierte Domänen-Such-Website (www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/cdd/wrpsb.cgi) untersucht. Um die Struktur des BTNL2 Gen Produkts vorherzusagen, untersuchten wir alle faltungserkennenden Server, die über den Metaserver BioInfo.PL erreichbar waren. Auf den Vorhersageergebnissen basierend, wurde ein Sequenz-Struktur-Alignment von BTNL2 zu B7-1 (4) für den 3D- Modell-Server WHAT IF (www.cmbi.kun.nl/gv/servers/WIWWWI/) konstruiert, der ein vollständiges Atomstrukturmodell der zweiten IgV und der sich anschließenden IgC Domäne von BTNL2 lieferte.
Fluoreszenzfusionsproteine
Allelische Varianten des BTNL2 Transkripts wurden von Klonen, die während der Genmodellverifikation (s. oben) hergestellt wurden, konstruiert. Die letzte längen-vollständige Amplifizierung wurde durchgeführt mit den Primern GTC TCG AGA TGG TGG ATT TTC CAG GC (SEQ ID NO: 451) und CAC CCC GGG CTC CTC TTC CTG (SEQ ID NO: 452), für das nicht abgeschnittene Transkript und GTC TCG AGA TCC TGG ATT TTC CAG GC (SEQ ID NO: 453) und AAC CCG GGG TGG GGA AGA ACC (SEQ ID NO: 454) für die 4 pb Delitionsvariante. Fragmente wurden in den Expressionsvektor pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Ca/USA) kloniert. Helazellen wurden mit 1 μg des jeweiligen Konstrukts entsprechend dem Protokoll des Herstellers transfiziert (Fugene 6, Roche, Base/Schweiz). Leere pEGFP-N2 Vektoren dienten als Positivkontrolle. Zellen wurden in 4% PFA in PBS (pH 7,6) nach 24 Stunden fixiert und auf Objekträgern in 1:1 Glyzerol in PBS aufgebracht. Fluoreszenz wurde mit einem Epifluorenszenzmikroskop dargestellt (Axiophot, Zeiss, Jena/Deutschland).
Tabelle 1: Proben von Sarkoidose-Patienten, die zur Krankheitsassoziierungsanalyse verwendet wurden. Oberer Teil: nicht-überlappende Kategorien von Probeneinheiten (Familien, Trios, Einzelpersonfälle); mittlerer Teil: Zusammenfassung der Fälle/Patientenzahlen. Die Gesamtanzahl von unabhängigen Fällen entspricht der Summe der Probeneinheiten in dem oberen Teil; unterer Teil: Darstellung der in verschiedenen Kombinationen mit Patientenproben durchgeführten Versuche.
Tabelle 2: Verifizierung der splicing Effekte von rs2076530. Sich entsprechende Paare von cDNA und DNA von Lymphoblastoid Zelllinien (oberer Teil) und von peripheren Blut von Normalkontrollen (unterer Teil) wurden genotypisiert und die BTNL2 splice Formen mittels rt PCR, Klonierung und Sequenzierung der PCR-Produkte ausgewertet.
Tabelle 3A: Assoziierung zwischen BTNL2 und DRB1 Risikoallelen und Sarkoidose (basierend auf 947 Fällen und 517 Kontrollen). f_Fall, f_Kontrolle: Allelfrequenz in Fällen und Kontrollen. Genotypen an beiden Orten waren im Hardy-Weinberg Gleichgewicht unter den Kontrollen; p (global): Fehlerwahrscheinlichkeit eines globalen χ² für allelische Assoziierung; tdt (beobachtet/erwartet): Verhältnis der beobachteten gegenüber der erwarteten Zahl von Transmissionen; p (Allel): Allele gruppenspezifische TDT Fehlerwahrscheinlichkeit, wie vom TRANSMIT Programm berichtet.
Tabelle 3B: Unterscheidung zwischen BTNL2 und DRB1 Effekten. x: Andere als die Allele in der Amplifikationsgruppe 3 der DRB1 Allele.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Identifizieren von Individuen mit einem Nukleinsäuremolekül, das nicht mit Sarkoidose im Zusammenhang steht, mit den Schritten: (a) Amplifizieren eines DNA-Fragments mit einer Nukleotidsequenz eines Individuums ausgewählt aus der Gruppe von: (i) Nukleinsäuremolekülen mit der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotidsequenz, (ii) Nukleinsäuremolekülen, die für ein Polypepeptid mit der in der SEQ ID NO: 456 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren, (iii) Nukleinsäuremolekülen, deren Komplementärstrang mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) oder (ii) hybridisiert und die für ein Polypeptid des Butyrophilin-ähnlichen Proteintyps kodieren und (iv) Nukleinsäuremolekülen, deren Sequenz von der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (iii) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht, unter Verwendung eines Oligonukleotid Primers, der spezifisch an Sequenzen innerhalb der Nukleotidsequenz des Individuums hybridisiert; (b) Sequenzieren des amplifizierten DNA-Fragments mit dem Dideoxy-Verfahren; (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) bis die Nukleotidsequenz des Individuums vollständig sequenziert ist; (d) Vergleichen der Nukleotidsequenz des Individuums mit der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotid-Sequenz; (e) Bestimmen der Abwesenheit einer polymorphen Abweichung in der Nukleotidsequenz des Individuums an der Position 16071 von der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotidsequenz.
Ein Verfahren zum Aufdecken einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Sarkoidose, die sich aus der Anwesenheit eines Polymorphismus an der Position 16071 im Exon 5 des in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Gens ergibt, mit den Schritten (a) Amplifizieren eines DNA-Fragments mit einer Nukleotidsequenz eines Individuums ausgewählt aus der Gruppe von: (i) Nukleinsäuremolekülen mit der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotidsequenz, (ii) Nukleinsäuremolekülen, die für ein Polypepeptid mit der in der SEQ ID NO: 456 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren, (iii) Nukleinsäuremolekülen, deren Komplementärstrang mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) oder (ii) hybridisiert und die für ein Polypeptid des Butyrophilin-ähnlichen Proteintyps kodieren und (iv) Nukleinsäuremolekülen, deren Sequenz von der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (iii) aufgrund des degenerierten genetischen Codes abweicht, unter Verwendung eines Oligonukleotid Primers, der spezifisch an Sequenzen innerhalb der Nukleotidsequenz des Individuums hybridisiert; (b) Sequenzieren des amplifizierten DNA-Fragments mit dem Dideoxy-Verfahren; (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) bis die Nukleotidsequenz des Individuums vollständig sequenziert ist; (d) Vergleichen der Nukleotidsequenz des Individuums mit der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotid-Sequenz; (e) Bestimmen einer polymorphen Abweichung in der Nukleotidsequenz des Individuums an Position 16071 der in der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei die polymorphe Abweichung ein Einzelnukleotidpolymorphismus ist, bei dem A durch G substituiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotidprimer mit einem radioaktiven Marker, einem fluoreszierenden Marker, einem biolumineszenten Marken, einem chemilumineszenten Marker oder einem enzymatischen Marker markiert ist.
Verwendung eines Vektors mit der SEQ ID NO: 455 dargestellten Nukleotidsequenz zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Sarkoidose.
Verwendung eines Proteins, ausgewählt aus der in der SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 und SEQ ID NO: 458 dargestellten Gruppe von Proteinen zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Sarkoidose.
Verwendung eines Peptids, das wenigstens eine gemeinsame Sequenz mit einem Protein, das an T-Zellen zu binden fähig ist, gemeinsam hat, ausgewählt aus der in der SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 und SEQ ID NO: 458 dargestellten Gruppe von Proteinen zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Sarkoidose.
Verwendung eines Moleküls, das dem Bindungsmotiv eines Proteins ähnlich sieht, wobei das Bindungsmotiv die Bindung des Proteins an T-Zellen vermittelt, ausgewählt aus der in der SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 und SEQ ID NO: 458 dargestellten Gruppe von Proteinen zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Sarkoidose.