DE69734986T2

DE69734986T2 - Mutationen innerhalb der diabetes-suszeptibilitätsgene für die hepatozyten kernfaktoren (hnf) hnf-1alpha, hnf-1beta und hnf-4alpha

Info

Publication number: DE69734986T2
Application number: DE69734986T
Authority: DE
Inventors: I. Graeme BELL; Kazuya Suita-city YAMAGATA; Naohisa Oda; J. Pamela KAISAKI; Hiroto 27 Nanaban-cho FURUTA; Stephan Menzel; Yukio Horikawa
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1996-09-10
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: CA2698393A1; EP0920534B1; CA2265480C; ES2257780T3; ATE314487T1; EP0920534A1; US20030224355A1; CA2265480A1; US6187533B1; DE69734986D1; WO1998011254A1; AU4340297A

Description

1. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Feld der Diabetes. Genauer gesagt, betrifft sie die Identifikation von Genen, welche verantwortlich für die Diabetes sind, zur Anwendung in Diagnostik und Therapie.
2. BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Diabetes ist ein Hauptgrund der Gesundheitsprobleme in den Vereinigten Staaten. Nicht-Insulin-Abhängige Diabetes melitus (NIDDM, auch als Typ 2-Diabetes bezeichnet) ist eine der bedeutenden öffentlichen Gesundheits-Störungen der Glukose-Homeostase, welche ungefähr 5% der allgemeinen Bevölkerung in den Vereinigten Staaten betrifft. Die Ursachen der beschleunigten Hyperglykämie und/oder Glukose-Intoleranz assoziiert mit dieser Form von Diabetes sind nicht wohlverstanden.
Klinisch ist NIDDM eine heterogene Erkrankung, charakterisiert durch chronische Hyperglykämie, was zu progressiven mikro- und makrovaskulären Läsionen in den kardiovaskulären, renalen und visuellen Systemen, wie auch zu diabetischer Neuropathie führt. Aus diesen Gründen kann die Krankheit assoziiert sein mit früher Morbidität und Mortalität.
Subtypen von NIDDM können identifiziert werden, basierend zumindest in gewissem Maße auf dem Zeitpunkt des Ausbrechens der Symptome. Der prinzipielle Typ von NIDDM hat einen Zeitpunkt des Ausbrechens im mittleren Lebensalter oder später. Früh ausbrechende NIDDM oder pubertäres Ausbrechen von Diabetes bei jungen Menschen (MODY) teilt viele Merkmale mit der (den) üblicheren Form(en) von NIDDM, deren Ausbrechen im mittleren Lebensalter auftritt. In der Pubertät ausbrechende Diabetes der jungen Leute (MODY, maturity onset diabetes of the young) ist eine Form der Nicht-Insulin-Abhängigen (Typ 2) Diabetes mellitus (NIDDM), welche charakterisiert ist durch ein frühes Alter des Ausbrechens, üblicherweise vor dem 25. Lebensjahr und einem autosomal dominanten Modus der Vererbung (Fajans 1989). Außer diesen Charakteristika sind die klinischen Charakteristika von Patienten mit MODY ähnlich zu denjenigen mit den üblicheren später ausbrechenden Formen von NIDDM.
Obwohl die meisten Formen von NIDDM keine einfache Mendel'sche Vererbung zeigen, wurde der Beitrag der Vererbung für die Entwicklung von NIDDM seit vielen Jahren in Erwägung gezogen (Cammkidge 1928) und der hohe Grad der Konkordanz von NIDDM in Monozygoten Zwillingspaaren (Barnett et al. 1981) zeigt, dass genetische Faktoren eine wichtige Rolle in ihrer Entwicklung spielen.
MODY ist charakterisiert durch ein frühes Alter des Ausbrechens, welches während der Kindheit, der Pubertät oder des jungen erwachsenen Alters liegt, und üblicherweise vor dem 25. Lebensjahr liegt. Sie weist einen klaren Modus der Vererbung auf, welcher autosomal dominant ist. Weitere Charakteristika schließen hohe Durchdringung (oder Symptomologie) und Verfügbarkeit von multigenerationalen Stammbäumen für genetische Untersuchungen von NIDDM ein. MODY tritt weltweit auf und wurde als eine phänotypisch und genetisch heterogene Erkrankung identifiziert.
Eine Vielzahl von genetisch unterschiedlichen Formen von MODY wurde identifiziert. Genetische Untersuchungen haben eine starke Verknüpfung zwischen MODY und DNA Markern auf dem Chromosom 20 gezeigt, wobei dies die Stelle des MODY1 Gens ist (Bell et al., 1991; Cox et al., 1992). MODY2 ist assoziiert mit Mutationen des Glukokinase-Gens (GCK) lokalisiert auf dem Chromosom 7 (Froguel et al., 1992 und 1993). Jüngste Verknüpfungsanalyse-Untersuchungen haben die Existenz einer weiteren Form von MODY gezeigt, welche als MODY3 bezeichnet wird (Vaxillaire et al., 1995). MODY3 hat sich als verknüpft mit dem Chromosom 12 gezeigt und ist lokalisiert in einer 5 cM-Region zwischen den Markern D12S86 und D12S807/D12S820 des Chromosoms (Menzel et al., 1995).
Obwohl es wohl etabliert ist, dass MODY2 assoziiert ist mit Mutationen in GCK, gibt es noch immer keine Information über die Identität von anderen MODY-Genen. Es besteht ein klares Bedürfnis, diese Gene zu identifizieren und die Mutationen, welche in den Erkrankungs-Zuständen resultieren. Die Identifikation dieser Gene und ihrer Produkte wird ein besseres Verständnis der Erkrankungs-Zustände assoziiert mit Mutationen in diesen Genen ermöglichen und weist wichtige Implikationen für die Diagnose und Therapie von MODY auf.
Da ein Verständnis der molekularen Basis von Diabetes im Allgemeinen und MODY im Speziellen die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für die Behandlung dieser Erkrankungen ermöglichen kann, werden Untersuchungen benötigt, diabetes-empfängliche Gene assoziiert mit MODY zu identifizieren. Darüber hinaus sind Verfahren zum Nachweis von Individuen mit einer Neigung, solche Erkrankungen zu entwickeln, vonnöten. Womöglich sollten die molekularen Mechanismen, welche mit der genetischen Läsion einhergehen, bestimmt werden, um Diagnose und spezifisch-gerichtete Therapie zu ermöglichen.
In N. Miura und K. Tanaka, 1993, Nucleic acids research 21, 3731–3736 wird die Isolation und Charakterisierung der Promotor-Region des Ratten HNF-1-Gens in HepG2-Zellen offenbart.
US Patent Nummer 5.403.712 offenbart ein Verfahren zum Isolieren des Co-Faktors DcoH, welche in der Lage ist, Dimere des Transkriptionsfaktors HNF1α zu stabilisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung der Erfinder, dass der Ort von MODY3 das HNF1α-Gen ist, der Ort von MODY2 das HNF4α-Gen ist, der Ort von MODY2 das HNF4α-Gen ist und der Ort von MODY4 das HNF1β-Gen ist. Die Erfindung betrifft des Weiteren die Entdeckung, dass die Analyse der Mutation in den HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Genen diagnostisch für Diabetes eingesetzt werden kann. Die Erfindung betrifft auch Verwendungen zum Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung von Diabetes mit Blick auf die Tatsache, dass Mutationen in HNF1α, HNF1β und HNF4α Diabetes erzeugen können.
In einer Ausführungsform zielt die Erfindung auf Verfahren zum Screenen auf Diabetes mellitus ab. Diese Verfahren umfassen: Erhalten einer Probe der Nukleinsäure eines Tieres; und Analysieren der Nukleinsäuren, um eine Mutation in einem HNF kodierenden Nukleinsäure-Segment (d.h. HNF1α, HNF1β und HNF4α) nachzuweisen; wobei eine Mutation in der HNF-kodierenden Nukleinsäure ein Hinweis auf die Neigung zu Nicht-Insulin-abhängiger Diabetes ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF1α-kodierende Nukleinsäure. Mit Hinblick auf die Entdeckung der Erfinder, dass der Ort von MODY3 HNF1α ist, ist eine Mutation in der HNF1α-kodierenden Nukleinsäure ein Hinweis auf die Neigung zu Diabetes. In einigen hier bevorzugten Ausführungsformen ist die HNF1α-kodierende Nukleinsäure lokalisiert auf dem menschlichen Chromosom 12q, welches die lokale Stelle des Orts von MODY3 ist.
In einigen Ausführungsformen ist die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure. Mit Blick auf die Entdeckung der Erfinder, dass die Stelle von MODY1 HNF4α ist, ist eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure ein Hinweis auf die Neigung zu Diabetes. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die HNF4α-kodierende Nukleinsäure auf dem menschlichen Chromosom 20 lokalisiert, welches die lokale Stelle des Orts von MODY1 ist. Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Begriffe NIDDM, MODY, MODY1, MODY3 und MODY4 verwendet werden, um Diabetes-Erkrankungs-Zustände zu bezeichnen und die Verwendung eines speziellen solchen Namens nicht immer die gleiche Ursache des Erkrankungs-Zustands repräsentieren kann. Die Erfinder haben entdeckt, dass Mutationen in HNF4α zu einem MODY1 Erkrankungs-Zustand führen können; jedoch können nicht alle Mutationen in HNF4α, welche zu Diabetes führen, einen „MODY1-Erkrankungs-Zustand" herbeiführen. Im Umkehrschluss können nicht alle diabetischen Erkrankungs-Zustände, welche von einer Mutation in HNF4α mit sich gebracht werden, als ein MODY1-Erkrankungs-Zustand betrachtet werden. Folglich bevorzugen die Anmelder in einigen Fällen den Begriff „HNF4α-Diabetes" zu verwenden, um irgendeinen diabetischen Erkrankungs-Zustand, der von einer Mutation oder Fehlfunktion von HNF4α mit sich gebracht wird, zu beschreiben, selbst diejenigen, welche nicht alle oder keine MODY1 Erkrankungs-Zustände zeigen. Dergleichen können die Anmelder die Begriffe „HNF1α-Diabetes" und „HNF1β-Diabetes" anstelle von „MODY3" bzw. „MODY4" verwenden.
Die Nukleinsäure, welche analysiert werden muss, kann entweder RNA oder DNA sein. Die Nukleinsäure kann analysiert werden in einem Gesamt-Gewebe auf einem Träger, einem Homogenat oder vorzugsweise isoliert von dem zu analysierenden Gewebe. In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Schritt des Analysierens der HNF-kodierenden Nukleinsäure das Sequenzieren der HNF-kodierenden Nukleinsäure, um eine Sequenz zu erhalten, und die Sequenz kann dann verglichen werden mit einer nativen Nukleinsäure-Sequenz von HNF, um eine Mutation zu bestimmen. Solch eine native Nukleinsäure-Sequenz von HNF4α kann die Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, haben. Solche eine native Nukleinsäure-Sequenz von HNF4α kann eine Sequenz wie in SEQ ID Nr. 78 dargestellt aufweisen.
Das Verfahren ermöglicht die Diagnose beinahe einer jeden Mutation, einschließend beispielsweise Punktmutationen, Translokations-Mutationen, Deletions-Mutationen und Insertions-Mutationen. Das Verfahren der Analyse kann PCR umfassen, einen RNase-Protektions-Assay, eine RFLP-Prozedur, etc. Unter Verwendung dieses Verfahrens haben die Erfinder der Vielzahl von HNF1α-Mutationen identifiziert, einschließend diejenigen, die in Tabelle 8 dargestellt sind. In bevorzugten Ausführungsformen treten Mutationen an den Kodons 17, 7, 27, 55/56, 98, 131, 122, 142, 129, 131, 159, 171, 229, 241, 272, 288, 289, 291, 292, 273, 379, 401, 443, 447, 459, 487, 515, 519, 547, 548 oder 620 einer HNF1α-kodierenden Nukleinsäure auf, beispielsweise einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1. In anderen bevorzugten Ausfühnangsformen tritt eine Mutation in der Splice-Azepter-Region von Intron 5 und Exon 6 einer HNF1α-kodierenden Nukleinsäure auf. In anderen Ausführungsformen tritt eine Mutation in der Splice-Azeptor-Region von Intron 9 einer HNF1α-kodierenden Nukleinsäure auf. In anderen Ausführungsformen tritt die Mutation unabhängig in Intron 1, Intron 2, Intron 5, Intron 7 oder Intron 9 des HNF1α Gens auf. Die Erfinder haben auch eine Vielzahl von HNF1α Mutationen identifiziert, einschließend diejenigen, die in Tabelle 10 zu finden sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure und eine Mutation tritt in Exon 7 der HNF4α-kodierenden Nukleinsäure auf. In anderen bevorzugten Ausführungsformen tritt eine Mutation an Kodon 268, 127, 130 oder 154 einer HNF4α-kodierenden Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 78 auf.
Die Erfindung umfasst auch Verwendungen zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes in einem Tier ins Auge, umfassend: Diagnostizieren eines Tieres, welches Diabetes hat und Modulieren der HNF-Funktion in einem Tier:
Die Schritte der Diagnose eines Tieres mit Diabetes umfassen häufig die Analyse einer HNF1α-kodierenden Nukleinsäure-Sequenz oder einer HNF4α-kodierenden Nukleinsäure-Sequenz auf eine Mutation hin.
Der Schritt des Modulierens der HNF-Funktion kann das Bereitstellen eines HNF1α- oder HNF4α-Polypeptids für das Tier umfassen. In Fällen, wo eine normale HNF1α- oder HNF4α-Funktion wiederbelebt werden soll, kann das HNF1α- oder HNF4α-Polypeptid ein natives HNF4α- oder HNF4α-Polypeptid sein. Beispielsweise kann ein natives HNF1α-Polypeptid die Sequenz von SEQ ID Nr. 2 sein. Ein natives HNF4α-Polypeptid kann die Sequenz von SEQ ID Nr. 79 sein. Die Bereitstellung eines HNF1α- oder HNF4α-Polypeptids kann auf irgendeinen einer Vielzahl von Wegen realisiert werden. Beispielsweise kann die Expression von HNF1α- oder HNF4α-Polypeptid induziert werden durch Expression von einem HNF1α- oder HNF4α-Polypeptid, kodiert in dem Genom des Tieres, oder durch ein HNF1α- oder HNF4α-Polypeptid kodiert durch eine Nukleinsäure bereitgestellt für das Tier. Die Bereitstellung eines HNF1α- oder HNF4α-Polypeptids kann realisiert werden durch ein Verfahren umfassend das Einbringen einer HNF1α- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure in das Tier, beispielsweise durch Injektion der HNF1α- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure in das Tier.
Das Modulieren der HNF-Funktion in dem Tier kann das Bereitstellen eines Modulators der HNF1α- oder HNF4α-Funktion für das Tier umfassen. Solche Modulationen liegen in der Natur von Wirksubstanzen und können beispielsweise HNF4, HNF6, HNF3 oder irgendwelche anderen Peptide oder Moleküle sein, welche HNF1α regulieren. Diese Modulatoren können in From einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Bereitstellung für das Tier formuliert werden. Der Modulator von HNF1α, HNF1β oder HNF4α-Funktion kann ein Agonist oder Antagonist von HNF1α, HNF1β oder HNF4α sein. Der Modulator kann die Transkription von einer HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure modulieren, die Translation einer HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α- kodierenden Nukleinsäure oder die Funktion des HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptids.
Die Erfindung fasst auch Verfahren zum Screenen nach Modulatoren der HNF-Funktion ins Auge, umfassend: Erhalten eines HNF-Polypeptids, d.h. eines HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptids; Bestimmen einer Standardaktivität des HNF's; in Kontaktbringen des Polypeptids mit einem putativen Modulator und Assaying auf eine Veränderung in der Standardaktivität des Polypeptids; und Identifizieren von Kandidaten, welche die Veränderung in dem Standardaktivitäts-Profil verursachen. In einigen bevorzugten Verfahren wird das Standard-Aktivitäts-Profil eines HNF1α-Polypeptids durch Messen des Bindens des HNF1α-Polypeptids an ein Nukleinsäure-Segment umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 9 bestimmt. Um das Messen der HNF1α-Aktivität zu ermöglichen, kann das Nukleinsäure-Segment umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 9 oder das HNF1α-Polypeptid einen nachweisbaren Label umfassen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das Standard-Aktivitäts-Profil von HNF4α-Polypeptid bestimmt durch Messen des Bindens des HNF4α-Polypeptids an ein Nukleinsäure-Segment umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 85. Um das Messen der HNF1α-Aktivität zu ermöglichen, kann das Nukleinsäure-Segment umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 85 oder das HNF4α-Polypeptid einen nachweisbaren Label umfassen. In anderen Ausführungsformen wird das Standard-Aktivitäts-Profil eines HNF-Polypeptids bestimmt durch Bestimmung der Möglichkeit eines HNF1α-Polypeptids, die Transkription eines Reporter-Gens zu stimulieren, wobei das Reporter-Gen operativ positioniert ist unter der Steuerung eines Nukleinsäure-Segments umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 1. In anderen Ausführungsformen wird das Standard-Aktivitäts-Profil eines HNF-Polypeptids bestimmt durch Bestimmung der Möglichkeit eines HNF4α-Polypeptids, die Transkription eines Reporter-Gens zu stimulieren, wobei das Reporter-Gen operativ positioniert ist unter der Steuerung eines Nukleinsäure-Segments umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 78. Ähnliche Assays werden für das HNF1β-Polypeptid ins Auge gefasst.
Die Erfindung wird illustriert durch Verfahren zum Screenen auf Modulatoren der HNF-Polypeptid-Funktion, umfassend: Erhalten eines HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure-Segments; Bestimmen einer Standard-Transkriptions- und Translationsaktivität der HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure-Sequenz; in Kontaktbringen des HNF1α- oder HNF4α-kodierenden Nukleinsäure-Segments mit einem putativen Modulator; Konservieren des Nukleinsäure-Segments und des putativen Modulators unter Bedingungen, welche normalerweise die HNF1α oder HNF4α Transkription oder Translation ermöglichen; und Assaying auf eine Veränderung in der Transkriptions- und Transaktionsaktivität.
Erläuternd wird die Herstellung von HNF1-Modulatoren, die Herstellung MODY3/HNF1α-Modulatoren, MODY4/HNFβ-Modulatoren und MODY1/HNF4α-Modulatoren zur Verfügung gestellt. Solch ein HNF-Modulator kann hergestellt werden oder herstellbar sein durch einen Prozess umfassend das Screenen nach einem Modulator der HNF-Funktion umfassend: Erhalten eines HNF-Polypeptids; Bestimmen eines Standard-Aktivitäts-Profils des HNF-Polypeptids; und Inkontaktbringen des HNF-Polypeptids mit einem putativen Modulator; und Assaying nach einer Veränderung in dem Standard-Aktivitäts-Profil. Ein HNF-Modulator kann hergestellt werden nach einem Verfahren umfassend das Screening nach Modulatoren der HNF-Funktion umfassend: Erhalten eines HNF-kodierenden Nukleinsäure-Segmentes; Bestimmen einer Standard-Transkriptions- und Translations-Aktivität der HNF-Nukleinsäure-Sequenz; Inkontaktbnngen des HNF-kodierenden Nukleinsäure-Segments mit einem putativen Modulator; Konservieren des Nukleinsäure-Segments und des putativen Modulators unter Bedingungen, welche üblicherweise die HNF-Transkription und Translation ermöglichen; und Assaying nach einer Veränderung in der Transkription- und Translation-Aktivität.
Zur Illustrierung der vorliegenden Erfindung werden isolierte und aufgereinigte Polynukleotide kodierend ein HFN-Polypeptid zur Verfügung gestellt. Solche Polypeptide können sein: eine HNF1α-kodierende Nukleinsäure, eine HNFβ-kodierende Nukleinsäure-Sequenz oder eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure. Alternativ kodiert das Polynukleotid ein HNF1α mit einer Aminosäure-Sequenz dargestellten SEQ ID Nr. 127. Alternativ kann das Polynukleotid eine HNF1α-kodierende Nukleinsäure-Sequenz sein, welche eine Sequenz von SEQ ID Nr. 126 aufweist. Alternativ kodiert das Polynukleotid ein HNF1β mit einer Aminosäure-Sequenz wie in SEQ ID Nr. 139 dargestellt. Alternativ kann das Polynukleotid eine HNF1β-kodierende Nukleinsäure-Sequenz mit einer Se quenz von SEQ ID Nr. 128 sein. Das Polynukleotid kann ein HNF4α kodieren mit einer Aminosäure-Sequenz wie in SEQ ID Nr. 140 dargestellt. Alternativ kann das Polynukleotiv eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure-Sequenz mit einer Sequenz von SEQ ID Nr. 130 sein.
Andere Ausführungsformen umfassen isolierte und aufgereinigte Nukleinsäure-Segmente umfassend: 10, 14, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 oder 500 zusammenhängende Nukleinsäuren identisch mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 128 oder SEQ ID Nr. 126 oder dem Komplement von diesen Sequenzen. Diese Nukleinsäure-Segmente können verwendet werden durch die Fachleute auf dem Gebiet als Hybridisierungs-Sonden, PCR-Primers, zur Expression von HNF-Polypeptiden, zur Expression anderer Polypeptide etc. In einigen Ausführungsformen kodieren die Segmente eine Volllängen-HNF-Polypeptid-Sequenz. Von speziellem Interesse sind die Promotoren von HNF1α und HNF1β, welche in den SEQ ID Nr. 126 bzw. 128 offenbart werden bzw. in den 26 und 27 und an anderer Stelle in dieser Anmeldung diskutiert werden. Diese Promotoren können durch die Fachleute auf dem Gebiet in vielen verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind ein Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um des Weiteren bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Die Erfindung kann besser verstanden werden durch Verweis auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wie hier präsentiert.
1 Stammbäume von MODY3-Familien. Die Individuen untersucht im Klinik Research Center an der Universität von Chicago werden durch MD-1-5 und 8-13 angezeigt und diejenigen mit NIDDM, IGT und NGT sind mit schwarzen Symbolen gezeigt, verschatteten Symbolen bzw. offenen Symbolen. Die Sterne zeigen an, dass diese Individuen den Risiko-Haplotypen assoziiert mit MODY3 in der Familie ererbt haben. Die Genotypen und Haplotypen für die P-Familie wurden beschrieben (Menzel et al., 1995) und der paarweise lod-score zwischen MODY und dem D12S76/D12S321- Haplotyp in dieser Familie ist 2,06 bei einer Rekombinations-Fraktion von 0,00. Der paarweise Lod-Score zwischen MODY und D12S76 im Stammbaum F549 ist 0,65 bei einer Rekombinations-Fraktion von 0,00 (Vaxillaire et al., 1995). Die Stammbäume BDA1 und BDA12 wurden zuvor nicht beschrieben. MODY tritt gemeinsam mit Markern, welche eng verknüpft sind mit MODY3 in diesen Familien mit paarweisen Lod-Scores zwischen MODY und D12S86 von 1,94 bzw. 0,60 bei einer Rekombinationsfraktion von 0,00, auf.
2 Durchschnittliche Glukose (A)-, Insulin (B)- und Insulinsekretions-Raten (ISR)(C)-Profile in 7 Subjekten mit diabetischer MODY3, (☐), 6 nichtdiabetischen MODY3-Subjekten (
) und 6 Kontroll-Subjekten (o) während stufenweise erfolgten Glukose-Infusions-Untersuchungen. Nach einem 30 Minuten-Zeitraum für Basislinien-Stichproben, wurde Glukose in Raten von 1, 2, 3, 4, 6 und 8 mg·kg^–1·min^–1 als Infusion gegeben. Jede Infusions-Rate wurde für einen Zeitraum von 40 min verabreicht und Glukose, Insulin und C-Peptid wurden bei 10, 20, 30 und 40 min in jedem Zeitraum gemessen.
3 Beziehung zwischen durchschnittlichen Plasma-Glukose-Konzentrationen und ISR während der stufenweise verabreichten Glukose-Infusions-Untersuchungen in 7 diabetischen MODY3-Subjekten (☐), 6 nichtdiabetische MODY3-Subjekten (
) und 6 Kontrollsubjekten (o). Die niedrigsten Glukosespiegel und ISR's wurden unter fundamentalen Bedingungen gemessen und nachfolgende Spiegel wurden erhalten während Glukose-Infusions-Raten von 1, 2, 3, 4, 6 und 8 mg·kg^–1·min^–1.
4 Abgestufte intravenöse Glukose-Infusionen wurden 6 Kontrollen (A), 6 nichtdiabetischen MODY3-Subjekten (B) und 7 diabetischen MODY3-Subjekten (C) nach einer Übernacht erfolgten schnellen (Basislinie) (
) und nach einer 42-h intravenösen Infusion von Glukose (Postglukose) (☐) in einer Rate von 4–6 mg·kg^–1·min^–1 verabreicht.
5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F und 5G MODY3-Stammbäume, welche das gemeinsame Auftreten des Mutanten-HNF1α-Allels mit Diabetes mellitus zeigen. Männer sind durch quadratische Symbole und Frauen durch Kreise gekennzeichnet. Individuen mit NIDDM werden durch schwarze Symbole und diejenigen mit durch Schwangerschaft hervorgerufene Diabetes oder beeinträchtigter Glukosetoleranz sind durch verschattete Symbole gekennzeichnet. Eine diagonale Linie durch die Symbole zeigt, dass das Individuum verstorben ist.
Die individuelle ID wird an der oberen rechten Ecke eines jeden Symbols angegeben und der HNF1α-Genotyp, falls er bestimmt wurde, wird unten angegeben: N, normales Allel; M, Mutanten-Allel. Der Pfeil zeigt das Individuum eines jeden Stammbaums, welches nach Mutationen gescreent worden ist. Es gilt festzuhalten, dass einige Individuen das Mutanten-Allel ererbt haben, jedoch nicht NIDDM aufweisen, üblicherweise aufgrund ihres jungen Alters (beispielsweise P-Stammbaum, Individuum IV-6; und Ber-Stammbaum Individuum V-2. Auch weisen einige Individuen NIDDM auf, obwohl sie nicht das Mutanten-HNF1α-Allel, welches in dieser Familie auftritt, ererbt haben (beispielsweise Ber-Stammbaum, Individuum II-2). Solche Heterogenität wurde bereits zuvor festgestellt (Bell et al., 1991) und ist eine Reflektion einer hohen Prävalenz von NIDDM.
6 Die Involvierung des Hepatocyte Nuclear Factors in Diabetes.
7 Ein Alignment einer HNF4α Protein-Sequenz von Menschen (h) mit Sequenzen von Mensch-, Maus (m)-, Xenopus (x)- und Drosophila (d)-Spezies. Die putativen DNA-Bindungs-Stellen sind unterstrichen und die putativen Liganden-Bindung-Stellen sind fett dargestellt.
8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G, 8I, 8H, 8I. Die DNA-Sequenzen für Exon 1, Exon 2, Exon 3, Exon 4, Exon 5, Exon 6, Exon 7, Exon 8, Exon 9 und Exon 10 von HNF1α.
9 Physikalische Kartierung der MODY3-Region von Chromosom 12. YAC, BAC (b)- und PAC (p)-Klone werden als Linien repräsentiert, wobei die Länge davon die Anzahl enthaltenden STSs reflektiert und nicht die tatsächliche Größe. Der physikalische Abstand zwischen benachbarten STSs wurde nicht direkt bestimmt und STSs, für welche die Reihenfolge nicht zweifelsfrei bestimmt wurde, werden in Klammem angegeben. Ein Kreis gibt an, dass der Klon positiv für das angegebene STS war und ein Quadrat gibt ein STS an, abgleitet vom Ende dieses spezifischen Klons. Verschiedene YACs enthalten große internale Deletionen, welche durch Klammem angegeben werden. Die STSs sind von GDB^TM und GenBank STS-Datenbanken.
10 Partielle Sequenz von Exon 4 des HNF1α-Gens von Individuum EA1 (Edinburgh-Stammbau). Die Sequenzen der normalen und mutanten Allele sind dargestellt. Es gibt eine Insertion eines C in Kodon 291 (angegeben durch den Pfeilkopf) in dem Mutanten-Allel resultierend in einer Leserahmen-Verschiebung und einer verfrühten Terrination.
11 Die cDNA-Sequenz von HNF1α angebend die Position der Exons.
12 Modelle von humanem HNF4α zeigen verschiedene Muster von alternativen Splicen und Strukturen der verschiedenen Formen von HNF4α, welche durch alternative Splicen erzeugt werden können. Die Aminosäuren, welche die Grenzen einiger der Regionen des Proteins definieren, sind dargestellt. DBD und LBD korrespondieren mit der DNA und in Liganden-Bindungs-Domänen von HNF4α.
13 Vergleich der Sequenzen der Promotorregionen der menschlichen und Maus-HNF4α-Gene (SEQ ID Nr. 135 bzw. SEQ ID Nr. 137). Identische Reste sind in Umrahmungen dargestellt. Die Bindungs-Stellen der Transkriptions-Faktoren, welche die Expression von HNF4α regulieren können, sind überstrichen. Der Stern gibt die vorhergesagte transkriptionelle Start-Stelle, basierend auf der Untersuchung des Maus HNF4α-Gens (Zhong et al., 1994). Die minimale Promotor-Region benötigt für eine Ex pression des Maus-Gens in Hepatomazellen im Groß-Maßstab, wird durch Verschattung angegeben. Das ATG-Kodon, welches den Start der Translation definiert, wird dargestellt. Der Pfeilkopf zeigt den DNA-Polymorphismus, welcher in der Promotor-Region des Probanten der Familie J2-96 gefunden wurde. Die Gen-Bank-Zugangs-Nummern für die Maus-Promotor-Sequenz sind S74519 bzw. S77762.
14A und 14B Partielle Sequenz von Exon 4 des HNF4α-Gens des Patienten J2-21. Die Sequenzen der normalen (14A, SEQ ID Nr. 141 und korrespondierende Aminosäurensequenz SEQ ID Nr. 142) sowie Mutanten (14B; SEQ ID Nr. 143) Allele sind dargestellt und die Pfeile geben die C→T-Substitution am Kodon 127 an.
15 Stammbäume von japanischen Familien mit Mutationen/Polymorphismen in dem HNF4α-Gen. Individuen mit Diabetes werden durch ausgefüllte Symbole angegeben und nichtdiabetische (oder nicht getestete) Individuen werden durch offene Symbole angegeben. Die Pfeile geben den Probanten an. Die klinischen Symptome eines jeden Subjektes werden dargestellt einschließend Alter bei der Diagnose, derzeitiges Alter und laufende Behandlung. Der HNF4α-Genotyp des getesteten Individuums wird angegeben: N, normal und M, Mutation/Polymorphismus.
16 Identifikation einer Non-Sense-Mutation in dem HNF4α-Gen in einer deutschen Familie, dem Dresden-11-Stammbaum. Die Mitglieder dieser Familie mit MODY und unverträglicher Glukose-Toleranz werden mit schwarzen bzw. verschatteten Symbolen angegeben. Das Alter bei der Diagnose von Diabetes Mellitus, das derzeitige Alter und die Therapie (OHA, oral hypoglycemic agents) und die Natur der Komplikationen (M, makrovaskuläre Erkrankung; R, Retinopathie; und N, peripherale Polyneuropathie) werden angegeben. Der Haplotyp assoziiert mit MODY in dieser Familie wird dargestellt.
17 Partielle Sequenz von Exon 4 des HNF4α-Gens von Subjekt II-4 des Dresen-11-Stammbaums. Die R154X-Mutation wird angegeben (SEQ ID Nr. 144 und SEQ ID Nr. 145). Intron 4 folgt dem Gln Kodon CAG.
18A, 18B, 18C und 18D Orale Glukose-Toleranz-Untersuchung in der Dresden-11 Familie. Die Blut-Glukose (18A)-, Insulin (18B)-, C-Peptid (18C)- und Proinsulin (18D)-Spiegel während dem Verlauf des Glukose-Toleranz-Tests sind dargestellt. Die offenen Symbole sind die Mittelwerte ± SEM (Standardabweichung) für Subjekte mit der R154X-Mutation, einschließend diejenigen mit Diabetes und geschädigter Glukose-Toleranz, und die ausgefüllten Symbole sind die Mittelwerte für die beiden normalen Subjekte.
19A, 19B, 19C und 19D Effekt von Bolus bzw. Infusion von Arginin, von Glukose und von Arginin während hyperglykämischer Klammer auf die Plasma-Konzentration von Glukose (19A), Insulin (19B), C-Peptid (19C) sowie Glukagon (19D) in 3 Gruppen von Subjekten des RW-Stammbaums.
20A und 20B Akute Insulin- (20A) und C-Peptid- (20B) Antwort auf Bolus-Verabreichung von Arginin in 3 Gruppen von Subjekten des RW-Stammbaums bei der grundlegenden und während der hyperglykämischen Klammer-Prozedur. Die Steigung der Linie verknüpfend diese Insulin-Antworten (Steigung der Potentiation) war niedriger in ND[+] vs. ND[–], p < 0,001. Die Steigung für D[+] war am niedrigsten.
21 MODY Stammbaum, Italien-1. Subjekte mit MODY und geschädigter Glukose-Toleranz wurden indiziert durch ausgefüllte bzw. gekreuzt schraffierte Symbole. Nichtdiabetische Subjekte (als Ergebnis des Tests oder historisch bedingt) werden durch offene Symbole angegeben. Die klinischen Symbole der Subjekte werden unter dem Symbol angegeben einschließend die derzeitige Behandlung: Insulin oder orale hypoglykämische Agenzien (OHA). Der Haplotyp der Marker D12S321-D12S76-UC-39 ist angegeben und der Risiko-Haplotyp ist durch Verschattung angegeben. Der HNF1α-Genotyp ist dargestellt: N, normal; M, Mutante (A→C-Substitution an Nukleotid –58). Obwohl mit Insulin behandelt, wies das Subjekt III-9 nüchtern einen C-Peptid-Wert von 1,2 ng/ml auf, was zeigt, dass sie MODY hat und keine insulin-abhängige Diabetes mellitus.
22 Vergleich der Sequenz der Promotor-Region der menschlichen, Ratten-, Maus-, Huhn- und Frosch-HNF1α-Gene (SEQ ID Nr. 134; SEQ ID Nr. 138; SEQ ID Nr. 136; SEQ ID Nr. 132 und SEQ ID Nr. 133). Die A→C-Substitution am Nukleotid 58 und die HNF4α-Bindungs-Stelle sind dargestellt. Reste, identisch zur menschlichen Sequenz, sind umrandet dargestellt. Nukleotide werden relativ zur Transkriptions-Start-Stelle des menschlichen Gens nummeriert (angegeben durch einen Stern). Das umrandete ATG-Triplet ist das initiierende Methionin. Die Pfeile geben Lücken, eingefügt in die Sequenzen an, um dieses Alignment zu erzeugen.
23 Zusammenfassung der Mutationen des menschlichen HNF1α-Gens. Diese Zeichnung zeigt die Exons und Promotor-Regionen als Kästen. Die Mutation und Aminosäure-Polymorphismen stammen von Yamagata et al., 1996; Lehto M, et al., 1997; Kaisaki PJ, et al., 1997; Vaxillaire et al., 1997; Frayling et al., 1997; Hansen T, et al., 1997; Urhammer et al., 1997; Glucksmann et al., 1997. Die Aminosäure-Polymorphismen sind I/L27, A/V98 und S/N487. Die Einzel-Buchstaben-Abkürzungen für die Aminosäuren werden verwendet.
24 Partielle Sequenz von Exon 2 des HNF-1β-Gens des Subjekts J2-20 (SEQ ID Nr. 146 und SEQ ID Nr. 147). Die C→T-Mutation in Kodon 177 wird angegeben.
25 J2-20-Stammbaum. Individuen mit Diabetes mellitus werden durch ausgefüllte Symbole angegeben. Der Pfeil gibt den Probanden an. Das derzeitige Alter, das Alter bei der Diagnose, die laufende Behandlung und Komplikationen werden dargestellt. Der HNF-1β-Typ wird angegeben: N, normal; M, Mutante. OHA, oral hypoglycemic agent; PDR, proliferative diabetic retinopathy; CRF, chronic renal failure; und DKA, diabetic ketoacidosis.
26A bis 26M Partielle Sequenz des menschlichen HNF1α-Gens. SEQ ID Nr. 126 und SEQ ID Nr. 127. Diese Figuren geben eine zusammenhängende Sequenz an und wurden in Abschnitte aufgeteilt aufgrund der Größe der Sequenz. Die Nukleotid- und die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen sind dargestellt. Exon- und Intron-Sequenzen sind in Großbuchstaben bzw. in Kleinbuchstaben dargestellt. Die ungefähre Größe der Lücken in den Introns, deren vollständige Sequenz nicht bestimmt wurde, sind angegeben. In der Promotor-Region sind potentielle Bindungs-Stellen für Transkriptions-Faktoren, wenn die Expression dieses Gens regulieren können, angegeben, wobei dieses Stellen, identifiziert durch DNase-Footprints kursiv angegeben sind, und diejenigen, die durch Sequenz-Homologie identifiziert wurden, mit normalem Schriftbild dargestellt sind. Die minimale Promotor-Region wird fett dargestellt. Die Polymorphismen und Mutationen in dem HNF1α-Gen, die bislang identifiziert wurden, sind fett dargestellt mit der Kennzeichnung der identifizierten Mutation. Der Stern gibt die vorhergesagte Transkriptions-Start-Stelle, basierend auf Untersuchungen von Ratten-HNF1α-Gene an. Der Buchstabe n gibt an, dass die Sequenz nicht eindeutig an dieser Stelle war.
27A bis 27I Partielle Sequenz des menschlichen HNF-1β-Gens. SEQ ID Nr. 128, SEQ ID Nr. 129, und SEQ ID Nr. 139. Diese Figuren stellen eine zusammenhängende Sequenz dar und wurden in Abschnitte aufgeteilt aufgrund der Größe dieser Sequenz. Die Nukleotid-sowie die vorhergesagte Aminosäure-Sequenzen sind dargestellt. Exon- und Intron-Sequenzen sind in Großbuchstaben bzw. in Kleinbuchstaben dargestellt. Die ungefähre Größe der Lücken in den Introns, deren vollständige Sequenz nicht bestimmt wurde, sind dargestellt. In der Promotor-Region sind potentielle Bindungs-Stellen für Transkriptions-Faktoren, die die Expression dieses Gens regulieren können angegeben, wobei die Stellen, welche mit DNase-Footprints bestimmt wur den, kursiv dargestellt sind, und diejenigen identifiziert durch Sequenz-Homologie in normalem Schriftbild dargestellt sind.
28A bis 28V Partielle Sequenz des menschlichen HNF4α. SEQ ID Nr. 130, SEQ ID Nr. 131 und SEQ ID Nr. 140. Diese stellen eine zusammenhängende Sequenz dar und wurden aufgrund der Größe dieser Sequenz in Abschnitten dargestellt. Die Nukleotid- und vorhergesagten Amino-Sequenzen sind dargestellt. Exon- und Intron-Sequenzen sind in Großbuchstaben bzw. Kleinbuchstaben dargestellt.
BESCHREIBUNG DER ILLUSTRATIVEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft die frühe Detektion, Diagnose, Prognose und Behandlung von Diabetes. Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal Mutationen, verantwortlich für HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-verwandte Diabetes. Die spezifische Mutationen und die Identität der korrespondierenden Wildtypgene von diabetischen Subjekten werden offenbart. Diese Mutationen sind Indikatoren von HNF1α, HNF1β und HNF4α verwandter Diabetes und sind diagnostisch für das Potential der Entwicklung von Diabetes. Es ist angedacht, dass die Techniken, die hier offenbart werden, auch verwendet werden, um andere Gen-Mutationen verantwortlich für andere Formen der Diabetes zu identifizieren.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden realisieren, dass die Nukleinsäure-Sequenzen, die offenbart werden, Anwendung in einer Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten finden werden beim Nachweis von Diabetes, Diagnose, Prognose und Behandlung. Beispiele solcher Anwendungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung schließen die Amplifikation von Markern von MODY unter Verwendung spezifischer Primer ein; die Detektion von Markern von HNF1α, HNF1β, HNF4α durch Hybridisierung mit Oligonucleotidsonden; die Inkorporation von isolierten Nukleinsäuren in Vektoren und die Expression von vektor-inkorporierten Nukleinsäuren als RNA und Protein; Die Entwicklung von immunologischen Reagenzien korrespondierend zu genkodierten Produkten; und therapeutische Behandlung für das identifizierte MODY unter Verwendung dieser Reagenzien wie auch von anti-sense Nukleinsäuren oder anderen Inhibitoren spezi fisch für das identifizierte MODY. Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren Screening Assays für Verbindungen, um die Gen-Expression hoch zu regulieren oder die Effekte der mutierten HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Gene zu bekämpfen.
A. DIABETES UND MODY
Diabetes mellitus betrifft ungefähr 5% der Population der Vereinigten Staaten und über 100 Millionen Menschen weltweit (King et al., 1998, Harris et al., 1992). Ein besserer Weg, die Population zu identifizieren, welche das Risiko trägt, Diabetes zu entwickeln, ist vonnöten, da ein Subjekt normale Plasmaglukose-Zusammensetzungen aufweisen mag, jedoch das Risiko tragen kann, offenkundige Diabetes zu entwickeln. Diese Probleme könnten gelöst werden, falls es möglich wäre, empfängliche Personen vor dem Ausbruch der offensichtlichen Diabetes zu diagnostizieren. Dies ist derzeit nicht möglich bei Subjekten mit klinischer Diabetes aufgrund ihrer multifaktoriellen Natur.
MODY ist eine monogenetische Form von Diabetes und folglich können die Gene, welche verantwortlich sind, leichter untersucht werden als diejenigen der Mutationen, die zu der Entwicklung der polygenen Form(en) dieser Erkrankung beitragen wie z.B. Typ 1 und Typ 2 Diabetes Mellitus. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Subjekte mit pubertär ausbrechender Diabetes von jungen Leuten (maturity onset diabetes of the young MODY), eine Unterspezies der Diabetes darstellt, charakterisiert dadurch, dass die Diabetes in der ersten oder zweiten Dekade des Lebens auftritt und eine autosomal dominante Vererbung vorliegt, und dass MODY von Mutationen in Genen auf dem Chromosom 20 (HNF1α/MODY1), Chromosom 7 (Glukokinase/MODY2), Chromosom 12 (HNF1α/MODY3) und Chromosom 17 (HNF1β/MODY4) herrühren kann.
Die klinischen Charakteristika, welche sich in HNF4α-, HNF1α- und HNF1β-Typ-Diabetes manifestieren, ähneln denjenigen, welche in Patienten mit Typ 2 Diabetes festgestellt werden können. Diese Charakteristika schließen häufig schwere Hypoglykämie im nüchternen Zustand ein, das Bedürfnis, nach oralen hypoglykämischen Wirksubstanzen, evtl. die Notwendigkeit von Insulin, sowie vaskuläre und neuropathische Komplikationen (Fajans et al., 1994; Menzel et al., 1995).
Die Erfinder haben gezeigt, dass prädiabetische Subjekte mit Mutationen in den HNF1α- und HNF4α-Genen subtile, jedoch wichtige Veränderungen im normalen Muster der Glukose-stimulierten Insulinsekretion aufweisen. Im Vergleich zu Kontroll-Subjekten, bei denen keine familiäre Historie von Diabetes vorliegt, wiesen sie normale Insulin-Sekretions-Raten bei niedrigeren Glukose-Konzentrationen auf. Jedoch das Ansteigen der Insulin-Sekretions-Rate resultierend von einem Anstieg in der Plasma-Glukose-Konzentration über 8 mM war geringer in prädiabetischen HNF1α-Mutations-Subjekten als in Kontrollen (siehe 2 bis 4).
Die Exposition der normalen β-Zelle gegen erhöhte Plasma-Glukose-Konzentrationen für 42 Stunden resultiert in einem Anstieg in der β-Zell-Antwortfähigkeit auf einen nachfolgenden Glukose-Stimulus. Folgend auf eine 42-stündige Glukose-Infusion, welche die Plasma-Glukose-Konzentration auf einen durchschnittlichen Wert von 7,1 + 1,4 mM ansteigen ließ, stieg die Insulin-Sekretions-Rate von prädiabetischen HNF1α-Mutations-Subjekten um 35% zwischen 5–9 mM Glukose mit einer resultierenden Verschiebung in der Dosis-Antwort-Kurve auf die rechte Seite. Fünf von sechs prädiabetischen HNF1α-Mutations-Subjekten zeigen diesen Anstieg in der Insulin-Sekretionsrate, und nur ein Subjekt MD13 konnte diesen Effekt nicht demonstrieren. Die Größenordnung des grundlegenden Effekts von Glukose war ähnlich zu derjenigen, welcher in Kontrollen auftritt.
Diabetische HNF1α-Mutations-Subjekte demonstrierten verminderte Insulin-Sekretion über den gesamten Bereich der Glukose-Konzentrationen, der untersucht wurde. Folglich sekretierten über den Konzentrationsbereich zwischen 5 und 9 mM Glukose die diabetischen Subjekte 50% weniger Insulin als die Kontrollen und 51% weniger als die prädiabetischen HNF1α-Mutations-Subjekte. Des Weiteren war der grundlegende Effekt von Glukose in Subjekten mit offener Diabetes verlorengegangen.
Die Evaluation der Insulin-Resistenz zeigte, dass HNF1α-Mutations-Subjekte nicht resistenter waren als Kontrollen. Tatsächlich gab es eine Tendenz in Richtung eines geringeren Grades der Insulin-Resistenz in den HNF1α-Mutations-Subjekten, was es höchst unwahrscheinlich macht, dass die Insulin-Resistenz eine primäre Rolle in der Pathophysiologie von Diabetes in diesen Subjekten spielt.
Die Erfinder haben jüngst Insulin-sekretorische Antworten in prädiabetischen HNF4α- und HNF1α-Mutations-Subjekten charakterisiert. Prädiabetische HNF4α- und HNF1α-Mutations-Subjekte haben beide reduzierte Insulin-sekretorische Antworten auf Glukose, welche nur evident sind, wenn der Plasma-Glukose-Spiegel über einen Schwellenwert von 7 bzw. 8 mM steigt. Während in HNF1a-Subjekten der grundlegende Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion erhalten bleibt, zeigte eine Glukose-Infusion in niedriger Dosis keinerlei signifikante Effekte auf die Insulin-Sekretion in prädiabetischen HNF4α-Mutations-Subjekten (Byrne et al., 1995b). In Subjekten mit Mutationen im Glukokinase-Gen wird die Dosis-Antwort-Kurve nach rechts verschoben und ISR wird merklich abgesenkt auf Glukose-Konzentration unterhalb 7 mM, jedoch die Insulin-Sekretion schreitet voran, um mit ansteigenden Plasma-Glukose-Konzentrationen sogar oberhalb von Spiegel von 8 mM anzusteigen. Der grundlegende Effekt von Glukose aus der Insulin-Sekretion wird auch beibehalten (Byrne et al., 1994). Die Erfinder haben jüngst ähnliche Untersuchungen in Subjekten mit klassischer Typ 2 Diabetes und beeinträchtigter Glukose-Toleranz durchgeführt. In Subjekten mit IGT wurde der grundlegende Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion aufrechterhalten, obwohl die Dosis-Antwort-Kurve betreffend Glukose und Insulin-Sekretion nach rechts verschoben war. In Subjekten mit offener Typ 2-Diabetes war der Anstieg der Insulin-Sekretion als Antwort auf einen Anstieg im Glukose-Spiegel merklich reduziert. Der grundlegende Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion ging verloren.
Es scheint folglich, dass die β-Zell-Dysfunktion eine entscheidende, pathophysiologische Rolle in der Entwicklung der drei Formen von MODY spielt, welche bislang charakterisiert worden sind. Eine klare prädiabetische Phase wurde in Subjekten mit Glukokinase-Mutationen nicht identifiziert. Jedoch sind profunde Defekte in der Fähigkeit der β-Zelle auf einen Glukose-Stimulus zu antworten, vorhanden, selbst im Falle von milden Anstiegen in der Glukose-Konzentration, welche die Mehrheit dieser Subjekte charakterisieren. Im Gegensatz dazu ist eine prädiabetische Phase ein Merkmal von HNF4α- und HNF1α-Formen der Diabetes. Diese prädiabetischen Subjekte zeigen reduzierte Insulin-sekretorische Antworten auf erhöhte Konzentrationen von Glukose, induziert durch die schrittweise Glukose-Infusion vor dem Ausbruch der Diabetes. Prädiabetische HNF4α und HNF1α-Subjekte können unterschieden werden basierend auf die Effekte einer niedrig dosierten Glukose-Infusion auf die Insulin-Sekretion. Der grundlegende Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion wird aufrechterhalten in HNF1α-Subjekten der prädiabetischen Phase, geht jedoch verloren nach dem Ausbruch der offenen Hypoglykämie, wohingegen dieser grundlegende Effekt in HNF4α-Diabetes nicht vorliegt, selbst in der prädiabetischen Phase dieser Erkrankung. Die schweren Reduktionen der insulin-sekretorischen Antworten auf Glukose, welche in offen an Diabetes erkrankten HNF1α-Subjekten zu sehen sind, rühren wahrscheinlicherweise zum Teil von den Effekten von hochdosierter Glukose her, berücksichtigt man die gut dokumentierten gegenteiligen Effekte der Hyperglykämie auf die Insulin-Sekretion. Ein volles Verständnis der Ursachen dieser Veränderungen in den Dosis-Antwort-Beziehungen zwischen Glukose und Insulin-Sekretion erfordert ein besseres Verständnis der Rollen von HNF4α und HNF1α bei der Regulation der normalen pancreatischen β-Zell-Funktion.
Weitere Untersuchungen durch die Erfinder haben gezeigt, dass Anstiege in den zwei Stunden nach Eingriff in den Blutglukosespiegel Veränderungen in insulin-sekretorischen Antworten auf Glukose prognostizieren. Jedoch in diesem Fall zeigten Subjekte mit verminderter Glukose-Toleranz verminderte Insulin-sekretorische Antworten über einen Bereich von Glukose-Konzentrationen und nicht nur in Antwort auf Anstiege in Glukose oberhalb von 8 mM, wie dies für prädiabetische HNF1α-Mutations-Subjekte der Fall war. Folglich glauben die Erfinder nicht, dass Veränderungen in der Insulin-Sekretion, auftretend in prädiabetischen HNF1α-Subjekten von den moderaten Anstiegen in der Glukose herrühren. Vielmehr legen die Ergebnisse der Erfinder nahe, dass die prozentualen grundlegenden und insgesamten Insulin-Sekretions-Raten zusammen mit der Glukose-Toleranz schlechter werden und das Fehlen der Fähigkeit, die Insulin-Sekretion zu vergrößern bei hohem Glukose-Spiegel ein Merkmal der Mutation in dem HNF1α-Gen ist.
Von den Untersuchungen, die oben beschrieben werden wie auch in den Beispielen, welche folgen, ist klar, dass die Identifikation und Charakterisierung des Gens (der Gene) assoziiert mit MODY-Diabetes von Bedeutung ist. Mutationen in solchen Genen führen zu Diabetes und es wäre diagnostisch und therapeutisch von Vorteil, die Mutationen in Subjekten, welche eine Prädisposition für solche Mutationen aufweisen, zu identifizieren.
Untersuchungen, welche darauf abzielen, die genetische Lokalisierung des MODY3-Gens zu finden, zeigten, dass das putative Gen verknüpft mit MODY3 Typ Diabetes auf einen 5 cM Intervall zwischen den Markern D12S86 und D12S807/D12S820 (Menzel et al., 1995) lokalisiert war. Jedoch wurde die Identität des Gens bislang nicht erläutert. Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, dass das Gen verknüpft mit MODY3 einen Faktor exprimiert, der zuvor in Leberzellen identifiziert wurde, und als Hepatocycte Nuclear Factor 1α, hier bezeichnet als HNF1α, bekannt ist.
Ähnliche Untersuchungen, welche versuchten, den Ort des MODY1-Gens zu finden, zeigten, dass das putative Gen, verknüpft mit MODY1 Typ Diabetes, lokalisiert auf einem 13 cM-Intervall zwischen den Markern D20S169 und D20S176 (Stoffel et al., 1996) lokalisiert war. Dergleichen wurde wie für MODY3 die Identität des Gens in MODY1 nicht erläutert. Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, dass das Gen verknüpft mit MODY1 einen Faktor exprimiert, der zuvor aus Leberzellen identifiziert worden ist und als Hepatocycte Nuclear Factor 4α, hier bezeichnet als HNF4α, bekannt ist.
Nachfolgend führten die Erfinder Untersuchungen durch, um die genetischen Defekte verantwortlich für andere Formen von MODY zu erläutern. Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, dass MODY wahrscheinlich eine Konsequenz von Mutationen im Hepatocycte Nuclear Factor 1β, hier bezeichnet als HNF1β ist.
Die Assoziation von Mutationen in HNF1α, HNF1β und HNF4α mit Diabetes zeigt die Bedeutung des HNF-Netzwerks bei der Steuerung der pancreatischen β-Zell-Funktion und der Glukose-Homeostase. Folglich weisen die hier präsentierten Untersuchungen kategorisierte Beispiele auf den Mutationen in den HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Genen auf, wie sie durch PCR-Techniken identifiziert wurden. Diese historischen Ergebnisse bilden eine Basis für viele therapeutischen diagnostischen Techniken als Maßnahmen, Diabetes zu lindem, insbesondere HNF1α-Diabetes, HNF1β-Diabetes und HNF4α-Diabetes.
B. HEPATOCYTE NUCLEAR FACTORS SIND DIE GENE VERKNÜPFT MIT MODY-TYP-DIABETES
Hepatocyte Nuclear Factor 1α
Hepatic Nuclear Factor 1α (auch bekannt als APF, LFB1 oder HP1) wurde als eine Sequenz spezifisch für ihr DNA-Binden an Protein von Rattenleber beschrieben. Man glaubt, dass er mit Promotor-Elementen wechselwirkt, die in vielen Genen vorliegen, einschließend Albumin, α und β-Fibrinogen, α-1-Antitrypsin, α-Fetoprotein, Pyruvatkinase, Transthyretin und Aldose B neben weiteren. HNF1α wurde aus Rattenleberextrakten durch DNA-Affinität-Chromatographie unter Verwendung des Fibrinogen-Promotorelements (Courtoise, 1987) gewonnen und wurde als ein einzelnes 88 kDA Protein charakterisiert. Es ist nur bekannt, dass HNF1α ein Transkriptionsfaktor ist.
Mendel und Crabtree (1993) haben vorgeschlagen, dass HNF1α mit „leberzellspezifischen" Genen interagierte, in welchen es eine vorherrschende Rolle in einer Regulation sowohl der in vitro als auch in vivo Transkription spielt. Jedoch wurde später gezeigt, dass HNF1α mRNA auch in mehreren Nichtleberzell-Geweben gefunden werden kann, einschließend Niere, Magen, Gedärme, Thymus, Milz und Pankreas (Baumhueter et al., 1990; Kuo et al., 1990). Dies legt nahe, dass die HNF1α-Expression in der Differenziation von Nicht-Leber-Organen wie auch in der hepatogenen Genese partizipieren kann.
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, welche die Transkription steuern durch Binden von cis-agierenden regulatorischen DNA-Sequenzen in einem Gen. Als solche spielen diese Faktoren in der Entwicklung und Differentiation durch Diktieren des Musters der Expression von Genen innerhalb spezifischer Zellen und Gewebe eine bedeutsame Rolle.
Die Homeodomänen-Proteine sind eine Klasse von Transkriptionsfaktoren. Diese Proteine besitzen alle die unübliche Eigenschaft, dass sie sehr ähnliche DNA-Bindungs-Domänen aufweisen, die selbst, obwohl sie unterschiedliche Effekte mediatisieren. HNF1α ist ein Beispiel eines Homeodomänen-Proteins. HNF1α dimerisiert in Lösung nachweislich mit sich selbst. Es scheint, dass die maximale transkriptionelle Aktivierung durch HNF1α einen neuen Dimerisations-Cofaktor benötigt. Dieser Cofaktor, bekannt als der Dimerisierungs-Cofaktor von HNF1α (DcoH) bindet selbst nicht an DNA, bindet aber an HNF1α.
HNF1α bindet an DNA als ein Dimer; dies wurde durch Untersuchungen betreffend die Aufreinigung und das Klonieren von HNF1α bestätigt. Andere Untersuchungen zeigen, dass es ein DNA-bindendes Protein gab, welches an die HNF1α-Bindungsstelle in Zel-len bindet, welches nicht HNF1α RNA aufweist. Das zweite Protein HNF1β ist ein Homolog von HNF1α, ist jedoch das Produkt eines separaten Gens.
Regulations-Untersuchungen des HNF1α Promotors zeigten, dass Bindungsstellen für Transkriptions-Faktoren HNF3, AP1 und HNF4α essentiell für die Expression von HNF1α sind (Hansen und Crabtree, 1993). Es wurde demonstriert, dass HNF4α, auf dem Chromosom 20 einem menschlichen Genom lokalisiert ist. Die vorliegenden Erfinder schlagen vor, dass MODY1, von der man weiß, dass sie mit dem Chromosom 20 verknüpft ist, als ein Regulator der MODY3-Gen-Expression fungieren kann, da solche Mutationen in HNF4α möglicherweise verantwortlich sind für die MODY1-Form der Diabetes.
HNF1α-Proteine besitzen drei funktionale Regionen, nämlich die Dimerisierungs-, Aktivierungs- und DNA-Bindungs-Domänen. Die Dimerisierungs-Domäne ist an den ersten 32 Aminosäuren des HNF1α-Proteins lokalisiert. Die DNA-Bindungs-Domäne ist eine POU-ähnliche Homeodomäne, welche an eine 13 bp palindrom-artige DNA-Sequenz in den Promotoren der HNF1α bindenden Proteine bindet (Courtois et al., 1988; Frain et al., 1989). Die Konsensus-Sequenz für diese HNF1α-Bindungs-Stelle auf den Genen ist:
GTTAATNATTACC (SEQ ID Nr. 9)
Diabetes mellitus verändert die Transkription verschiedener Gene in vielen verschiedenen Geweben. Die Mechanismen, welche diesen Veränderungen in der Transkription zugrunde liegen, sind weitgehend unbekannt. Ein Beispiel der veränderten Transkription findet sich in der reduzierten Transkription des Albumingens in Diabetes (Wanke et al., 1991). In jüngster Zeit wurde demonstriert, dass HNF1α-Spiegel in Diabetes reduziert sind, was zur Theorie führt, dass die verminderte Gen-Transkription in Diabetes aufgrund des verminderten Spiegels des HNF1α vorliegt, welcher ein Faktor ist, der kritisch für die Regulation der Leber-Albumin-Gen-Expression ist. Man glaubt, dass dies auch in anderen Genen der Fall ist, welche eine HNF1α-Verbindungs-Stelle besitzen und durch Diabetes betroffen werden. Folglich scheinen Veränderungen der Menge an HNF1α bei Diabetes die Expression von Genen zu beeinträchtigen, deren Expression durch diesen Faktor in erster Linie reguliert werden.
Die Expression des Insulin-Gens in erwachsenen Säugetieren ist in den β-Zellen in den Pancreas-Inseln lokalisiert. Untersuchungen dieser Gene haben eine kleine Region in dem Promotor, dem FF-Minienhancer, der in der Lage ist, gewebspezifische Glukose responsive transkriptionale Aktivität einem Heterologen-Promotor zu verleihen, definiert (German et al., 1990). Diese Minienhancer-Region besteht aus zwei primären regulatorischen Elementen, der Far-Box und dem FLAT-Element, welche miteinander interagieren, um die Transkription hochzuregulieren.
Weitere Analyse des FLAT-Elements zeigte, dass es ein Cluster von mehreren cis-loci ist, welche diskrete positive und negative Effekte mediatisieren. Der positive Locus ist charakterisiert als FLAT-F und seine Aktivität wird nur beeinträchtigt, wenn eine Mutation im negativen Locus FLAT-E vorliegt. Diese FLAT-F-Region ist in der Lage, spezifisch an eine Vielzahl von DNA-bindenden Proteinen zu binden. Die Sequenz von FLAT-F zeigt signifikante Ähnlichkeit mit der Konsensus-Sequenz von HNF1α. Dies führte zu Untersuchungen, um zu bestimmen, ob HNF1α selbst eine Rolle in der transkriptionalen Regulation des Ratten-Insulin-Gens spielen könnte. Nachfolgend wurde gezeigt, dass eine HNF1α-Expression in der Pankreas-β-Zell-abgeleiteten Insulinom-Zell-Linie HIT vorliegt. Es wurde gezeigt, dass HNF1α mit Ratten-Insulin-Gen Enhancern bindet und diese transaktiviert, sofern sie eine HNF1α-Stelle enthalten.
HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4α
Der Hepatocyte Nuclear Factor 4α (HNF4α) ist ein weiterer Transkriptionsfaktor, der zuallererst mit der Leber assoziiert ist, und eine limitierte Gewebs-Verteilung aufweist (Xanthopoulos et al., 1991; Zhong et al., 1994). HNF4α kann die Transkription in verschiedenen Nicht-Leber-Zell-Linien aktivieren, was darauf hindeutet, dass keine leberspezifische Modifikation für seine Funktion benötigt wird (Sladek et AL., 1990).
Es wurde beobachtet, dass ein offensichtlicher Widerspruch zwischen der molekularen Masse von HNF4α, vorhergesagt gemäß der primären Sequenz (50,6 kDa) (Sladek et al., 1990) und derjenigen bestimmt durch Gen-Elektrophorese (54 kDa) vorliegt, was nahelegt, dass dieser Unterschied aufgrund von post-translatorischen Modifikation(en) herrührt. Unter den vielen Typen von post-translatorischen Modifikationen, welche die Gen-Expression regulieren könnten, wurde die meiste Aufmerksamkeit auf die Phosphorylierung fokussiert, welche die Transkriptions-Faktor-Aktivität in vielerlei Hinsicht beeinflussen kann (Hunter und Karin, 1992).
Drei hauptsächliche Ebenen der Regulation wurden beschrieben: die Phosphorylierung kann die DNA-Bindungsaktivität beeinflussen (Boyle et al., 1991; Segil et al., 1991; Shuai et al., 1994), das transkriptionelle Aktivierungspotential (Yamamoto et al., 1988; Trautwein et al., 1993) bzw. die Translokation des Transkriptions-Faktors vom Cytoplasma in den Zellkern (Metz und Ziff., 1991; Kerr et al., 1991; Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1992). Diese Möglichkeiten schließen sich in keinster Weise gegenseitig aus und prinzipiell kann die Phosphorylierung verantwortlich sein für die gleichzeitige Regulieruang verschiedener unterschiedlicher Ebenen. Mit der Ausnahme von bestimmten Signal-Transkrptions-Proteinen (Darnell et al., 1994), waren alle Beispiele dieses Typs der Regulation die Phosphorylierung an Serin- oder Threonin-Resten involviert.
Es wurde demonstriert, dass die Aktivität von HNF4α post-translatorisch durch Tyrosin-Phosphorylierung reguliert wird, wodurch ein Beispiel eines Nicht-Signal-Transduktions-Faktors, moduliert durch diese Modifikation, zur Verfügung gestellt wird. Das HNF4α-Polypeptid (SEQ ID Nr. 79) enthält 12 Tyrosin-Reste verstreut über die DNA-Bindungs-Dimerisierungs- und die putativen Ligand-Bindungs-Domänen (Sladek et al., 1990), welche potentielle Phosphorylierungs-Stellen sein könnten. Es scheint, dass die Tyrosin-Phosphorylierung von HNF4α für seine DNA-Bindungs-Aktivität benötigt wird. Es wurde gezeigt, dass die transkriptionelle aktive Form von HNF4α in spezifischen subnukleären Domänen lokalisiert ist. Diese intranukleäre Verteilung hängt direkt oder indirekt von Tyrosin-Phosphorylierung ab, was die Existenz eines zusätzlichen Kontroll-Mechanismus auf der Ebene des subnukleären Targetings, welche eine Rolle in der Transkriptions-Regulation spielt, nahe legt.
Der Hepatocyte-Nuclear-Faktor 4α (HNF4α) ist ein positiv-agierender Transkriptions-Faktor, der sehr früh in der embryonalen Entwicklung exprimiert wird und essentiell für die Entwicklung und Funktion der Leber ist (reviews in Sladek, 1993 und Sladek, 1994. Maus HNF4α mRNA scheint im primären Endoderm von implantierenden Blastocyten am Embryo-Tag 4–5 aufzutreten, um der Leber und im Darm am Tag 8–9 (Duncan et al., 1994), während Mäuse, die defizient hinsichtlich HNF4α sind, nicht über den 9. Tag nach der Zeugung hinaus überleben (Chen et al., 1994).
HNF4α wurde auch vorgeschlagen, verantwortlich zu sein, die Differenzierung der Zellen letztendlich in Leberzellen zu bewirken (Nagy et al., 1994). In erwachsenen Nagetieren ist HNF4α primär in der Leber, Niere, im Darm lokalisiert und in Insekten findet sich HNF4α in äquivalenten Geweben (Sladek et al., 1990; Zhong et al., 1993). Von HNF4α weiß man, dass es eine große Vielzahl von essentiellen Genen aktiviert, einschließend diejenigen, involviert in den Cholesterol-Fettsäure- und Glukose-Metabolismus; die Blutzirkulation; die Detoxifikations-Mechanismen; Hepatitis B Virus-Infektionen und Leber-Differentiation (reviews finden sich in Sladek, 1993 und Sladek, 1994).
HNF4α ist ein Mitglied der Superfamilie von Liganden-abhängigen Transkriptions-Faktoren, welche die Steroid-Hormon-Rezeptoren, den Thyroid-Hormon-Rezeptor (TR), den Vitamin A Rezeptor und den Vitamin D Rezeptor (VDR), wie auch eine große Anzahl von Rezeptoren einschließen, für welche Liganden bislang noch nicht identifiziert worden sind, die sogenannten Orphan-Rezeptoren (reviews finden sich in Landers und Spelsberg, 1992; O'Malley und Conneely, 1992; Parker, 1993; und Tsai und O'Malley, 1994). Alle Rezeptoren sind charakterisiert durch zwei konservierte Domänen: die Zinkfingerregion, welche DNA-Bindungen mediatisiert und eine große hydrophobe Domäne, welche die Protein-Dimerisierung, Transaktivierung und das Liganden-Binden mediatisiert.
Ob HNF4α auf einen Liganden antwortet, ist nicht bekannt; es wurde jedoch gezeigt, dass es die Transkription in der Abwesenheit eines exogen hinzugefügten Liganden aktivieren kann (Hall et al., 1994; Kuo et al., 1992; Metzger et al., 1993; Mietus et al., 1992; Reijnen et al., 1992; Sladek et al., 1990). HNF4α ist auch hochkonserviert innerhalb von Drosophila HNF4, welche 91% Aminosäure-Sequenz-Identität mit Ratten HNF4α in der DNA-Bindungsdomäne aufweist und 68% Identität in der großen hydrophoben Domäne (Zhong et al., 1993).
Die Mitglieder der Rezeptor Superfamilie wurden in einer Vielzahl von Wegen klassifiziert, einer davon berücksichtigt ihre Fähigkeit, mit sich selbst zu dimerisieren und mit anderen Mitgliedern der Superfamilie. Beispielsweise binden die Steroidhormonen-Rezeptoren Glucocorticoid-, Mineralocorticoid- und die Progesteron-Rezeptoren (GR, MR bzw. PR) allesamt an DNA und Aktivieren die Transkription als Homodimer. Sie liegen im Cytoplasma komplexiert mit den Heatshock-Proteinen (HSP) vor, bis das Vorliegen des geeigneten Liganden den Komplex zerstört, was ermöglicht, dass die Rezeptoren in den Kern translokalisieren (reviews in Freedman und Luisi, 1993; O'Malley und Tsai, 1993, und Tsai und O'Malley, 1994). Auf der anderen Seite binden der Retinolsäure-Rezeptor (RAR) und Retinol-X-Rezeptor (RXR) wie auch VDR, der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor (PPAR) und TR, welche nicht an HSP binden und primär im Kern vorliegen, allesamt DNA und aktivierende Transkription nicht nur als homodimere sondern auch als Heterodimere (reviews siehe Giguère, 1994; Parker, 1993; und Stunnenberg, 1993). Verschiedene der nukleären Rezeptoren binden sehr ineffizient an DNA, falls überhaupt, solange sie als Homodimere vorliegen (RXRα, RAR, VDR, TR und PPAR), binden jedoch gut an DNA in der Form von Heterodimeren (Reviews siehe Giguère, 1994 und Stunnenberg, 1993). Zumindest zwei der Rezeptoren (RAR und TR) bilden Heterodimere in Lösung mit RXRα (Hermann et al., 199; Kurokawa et al., 1993; Zhang et al., 1992).
Der häufigste Dimerisierungs-Partner für all diese Rezeptoren ist RXRα. Die dritte Klasse der Rezeptoren, identifiziert bis zum heutigen Tage, liegt sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma vor und binden in erster Linie an DNA als Monomere (NGFI-B, FTZ-F1, steroidogenischer Faktor 1 [SF-1], und RORα1) (Giguère et al., 1995; Kurachi et al., 1994; Ohno et al., 1994).
HNF4α ist sehr ähnlich zu den Retinol-Rezeptoren, insbesondere zu RXRα, sowohl in der Aminosäure-Sequenz als auch in der DNA-Bindung-Spezifität. Maus RXRα ist zu 60% identisch mit Ratten-HNF4α in der DNA-Bindungs-Domäne und zu 44% identisch in der großen hydrophoben Domäne. Im Vergleich ist RARα, welches leicht mit RXRα heterodimerisiert, 61% identisch mit RXRα in der DNA-Bindungs-Domäne und nur zu 27% identisch in der großen hydrophoben Domäne (Mangelsdorf et al., 1992). HNF4α und RXRα wurden auch als aufweisend Antwort-Elemente von zumindest sechs verschiedenen Genen wie auch eine Konsensus-Stelle eines direkten Repeats von AGGTCA, unterbrochen durch ein Nukleotid (bezeichnet als DR + 1) identifiziert (Carter et al., 1994; Carter et al., 1993; Garcia et al., 1993; Ge et al., 1994; Hall et al., 1994; Hall et al., 1994; Hall et al., 1992; Kekule et al., 1993; Ladias, 1994; Lucas et al., 1991; Nakshatri und Chambon, 1994; Widom et al., 1992). Die strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten von HNF4α und RXRα legen nahe, dass HNF4α möglicherweise mit RXRα und/oder weiteren Rezeptoren heterodimerisiert.
Elektrophoretische Mobilität-Shift-Analysen (electrophoretic mobility shift analyses, EMSA) von HNF4α und RXRα-Proteinen, exprimiert in vivo wie auch in vitro, zeigten, dass HNF4α tatsächlich nicht mit RXRα in irgendeinem der Vielzahl von Antwort-Elementen heterodimerisiert und, während HNF4α Homodimere in Lösung in der Abwesenheit der DNA ausbildet, es keine Heterodimere mit RXRα ausbildet. Es wurde des Weiteren gezeigt, das HNF4α nicht mit einer Vielzahl anderer Rezeptoren auf DNA heterodimerisiert, was nahe liegt, dass das fehlende Auftreten der Heterodimerisierung eine allgemeine Eigenschaft von HNF4α darstellt.
Diese Untersuchungen führten zur Hypothese, dass HNF4α eine neue Subfamilie von nukleären Rezeptoren definiert, welche derzeit exklusiv im Kern vorliegen, in Lösung existieren, DNA als Homodimere binden und keine heterodimere RXRα oder andere Rezeptoren ausbilden.
HNF4α ist ein Mitglied der Steroid-Hormon-Rezeptor-Familie. Die Mitglieder dieser Familie wurden klassifiziert gemäß der Aminosäure-Sequenz im Fingergelenk des Zinkfingers (auch bezeichnet als die P-Box), eine Region, welche bedeutsam ist für das Erkennen der Sequenz der Mitte des Palindroms in den Hormon-Antwort-Elementen (Forman und Samuels, 1990). Beispielsweise enthalten Mitglieder der Thyroid-Hormon-Rezeptor-Subfamilie die Aminosäure-Sequenz EGCKG (SEQ ID Nr. 83) und binden an das Thyroid-Antwort-Element (TRE). Mitglieder der Östrogen-Rezeptor-Subfamilie enthalten die Aminosäuren EGCKG (SEQ ID Nr. 84) und binden an Östrogen-Antwort- Elemente (ERE). Die Sequenz von HNF4α ist DGCKS (SEQ ID Nr. 85) und ist sehr ähnlich zu derjenigen des Thyroid-Antwort-Elementes. Trotz dieser Ähnlichkeit erscheint es, dass HNF4α nicht an TRE bindet und auch nicht an ERE bindet, und dass der wirkliche Ligand für HNF4α bislang noch nicht bestimmt wurde. Die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung werden den Fachmann auf dem Gebiet dazu bringen, solch einen Liganden oder Liganden zutage zu fördern.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Exon-Intron-Organisation und die partielle Sequenz des menschlichen HNF4α-Gens. Darüber hinaus haben die Erfinder die Exons, auf flankierenden Introns und die minimale Promotor-Region auf Mutationen in einer Gruppe von 57 nicht miteinander mit japanischen Subjekten gescreent, die an früh ausbrechender Diabetes/MODY mit unbekannter Ursache litten. Die Ergebnisse dieser Screens legen nahe, dass Mutationen in dem HNF1α-Gen möglicherweise die früh ausbrechende Diabetes/MODY in Japanern verursachen können, jedoch weniger üblich sind als Mutationen in dem HNF4α-/MODY3-Gen. Die Information, die hier präsentiert betreffend die Sequenz des HNF4α-Gens und seine Promotor-Region wird die Suche nach Mutation in anderen Populationen sowie Untersuchungen zur Rolle dieses Gens bei der Bestimmung der normalen Pancreas-β-Zell-Funktion ermöglichen.
Des Weiteren basiert das derzeitige Verständnis der MODY1-Form von Diabetes auf Untersuchungen nur einer einzelnen Familie, dem R-W-Stammbaum. Hier berichten die Erfinder von der Identifikation einer zweiten Familie mit MODY1 und der ersten, in welcher eine detaillierte Charakterisierung der Leber-Funktion vorgenommen wurde. Die vorliegenden Erfinder demonstrieren, dass MODY1 in erster Linie eine Erkrankung der β-Zell-Funktion ist; jedoch haben die Erfinder sichergestellt, dass Mutation in HNF4α möglicherweise zu sekretorischen Defekten von α-Zellen wie auch β-Zellen führen oder zu einer Reduktion in der Langerhans-Inselchen- (pancreatic islets) Masse.
Hepatic Nuclear Factor 1β and DCoH
Menschliches HNF1β ist ein Homeodomänen-enthaltender Transkriptionsfaktor von 557 Aminosäuren (Typ A), wobei alternatives Splicen zwei weitere Formen von 531 (Typ B) bzw. 399 Aminosäuren (Typ C) erzeugt (Mendel et al., 1991a; De Simone et al., 1991; Rey Campos et al., 1991; Bach und Yaniv, 1993). Die Nuklein- und Aminosäure-Sequenzen für menschliches HNF1β sind in SEQ ID Nr. 128 bzw. SEQ ID Nr. 129 dargestellt. HNF1β ist strukturell verwandt mit HNF1α und fungiert als Homodimer oder Heterodimer mit HNF1α. Diese Dimere werden durch das bifunktionale Protein, DcoH/PCBD (Mendel et al., 1991 b; Citron et al., 1992) stabilisiert, welches an die Dimerisierungs-Domäne von HNF1 bindet und dabei einen heterotetrameren Komplex ausbildet und die transkriptionelle Aktivität verstärkt. Als ein Homotetramer ist PCBD in die Regernation von Tetrahydrobiopterin involviert, einem essentiellen Cofaktor der Phenylalanin-Hydroxylase und anderer Mono-Oxygenasen, welche die Konversion von 4-Hydroxytetrahydrobiopterin zu Quinonoid-dihydrobiopterin katalysieren (Citron et al., 1993; Johnen et al., 1995). Der Verlust der Funktions-Mutation in PCBD ist assoziiert mit einer seltenen autosomalen rezessiven Form der milden Hyperphenylalaninämie. HNF1β und DCoH mRNA werden in Langerhans-Inselchen von Mäusen exprimiert, was impliziert, dass sie zusammen mit HNF1α fungieren können, so dass sie die Gen-Expression in diesem Gewebe regulieren können. Menschliches DcoH ist ein Protein von 104 Aminosäuren (einschließend das Anfangs-Methionin) (Thöny et al., 1995) und fungiert wie hier unten beschrieben.
MODY-Typ Diabetes ist eine Manifestation von Defekten in Hepatocyte Nuclear Factors
Es ist etabliert, dass alle Formen von Typ 2-Diabetes mit merklichen Insulin-sekretorischen-Defekten assoziiert sind, welche den Verlust der Erstphasen-Antwort auf intravenöse Glukose einschließen, verzögerte oder abgestumpfte Antworten auf die Aufnahme von vermischten Nahrungsmitteln, den Verlust der normalen oszillatorischen Muster der Insulin-Sekretion und erhöhte Sekretion von Proinsulin und proinsulinartigen Produkten. Die molekulare Basis dieser sekretorischen Defekte im Menschen ist unbekannt, obwohl in Ratten gezeigt wurde, dass globale Veränderungen in der Gen-Expression in den Inselchen von diabetischen und prädiabetischen Tieren vorliegen. Eine solche globale Veränderung ist die Reduktion in den Spiegeln der mRNAs, welche viele Langerhans-Inselchen-spezifische Proteine kodieren. Dieser Defekt in der Gen-Expression wäre kompatibel mit verminderten Spiegeln eines Master-Transkriptions-Faktors, dessen Spiegel die Expression eines gesamten Arrays von untergeordneten Genen beeinträchtigen würde.
Die vorliegende Erfindung sagt voraus, dass die β-Zell-Dysfunktion und die Insulinsekretorischen-Defekte, assoziiert mit MODY3, als ein Ergebnis einer Mutation in HNF1α zu sehen ist; des Weiteren wird demonstriert, dass die β-Zell-Dysfunktion assoziierten mit MODY1 ein Ergebnis von Mutation in HNF4α ist.
Die Merkmale der MODY-Typ-Diabetes sind sehr ähnlich zu derjenigen der spät ausbrechenden Typ 2 Diabetes. Folglich können erworbene Defekte bei der Expression von HNF1α, HNF4α bzw. HNF1β leicht in spät ausbrechender Diabetes auftreten und zur β-Zell-Dysfunktion und Insulin-sekretorischen Defekten in dieser Form der Diabetes führen. Die Identifikation von Wirksubstanzen, welche die Transkription von HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α aktivieren, wird therapeutisch für die Behandlung von MODY wie auch für spät ausbrechende Typ 2-Diabetes sein. Die vorliegende Erfindung stellt im Detail Verfahren für die Identifikation solcher Wirksubstanzen dar, welche dann verwendet werden, um die Expression von HNF1α, HNF1β und HNF4α zu verstärken, was wiederum zu einer erhöhten Transkription/Expression oder Aktivierung von β-Zell-Genen z.B. Insulin führen wird.
Es ist klar aus dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, dass Hepytocyte-Nuclear-Factors, ihre Expression, Regulation und Modifikation weitreichende Implikationen für Diabetes aufweisen. Bis dato geht man davon aus, dass drei der vier Typen von MODY-Diabetes, die bislang identifiziert wurden, die Gen-Expression beeinträchtigen. Andere Formen von MODY können nicht ausgeschlossen werden, beispielsweise sagen genetische Verknüpfungsanalyse-Untersuchungen das Vorliegen weiterer MODY-Gene voraus, wobei die chromosomale Lokalisierung von diesen derzeit unbekannt ist.
Die absolute HNF4α-Abhängigkeit des HNF1α-Promotors in Verbindung mit dem Nachweis der Fähigkeit von HNF4α, die endogene HNF4α-Expression zu retten, ist ein Hinweis, dass HNF1α ein essentieller Regulator von HNF1α ist (6). Folglich wird die Aktivierung oder Repression von HNF4α in einer indirekten Aktivierung oder Repression von HNF1α resultieren. Die vorliegende Erfindung erläutert Verfahren zum Identifizieren von Faktoren verantwortlich für das Modulieren der HNF4α-Expression und/oder Aktivität.
HNF1β, auch bekannt als vHNF1, ist eng verknüpft mit HNF1α und ist in der Lage, Neterodimere mit HNF1α zu ausbilden. Die Dimerisierung zwischen Mitgliedern von Klassen von Transkriptions-Faktoren erscheint das Problem des Steuerns der Expression einer sehr großen Anzahl von Genen zu lösen. Ein offensichtlicher Vorteil der Dimerisierung-Fähigkeit eines Transkriptions-Faktors ist, dass er eine Möglichkeit bereitstellt, die Vielzahl der regulatorischen Mechanismen zu diversifizieren, welche assoziiert sein können mit einer einzelnen regulatorischen DNA-Bindungs-Stelle. Ein weiterer Vorteil liegt in der Möglichkeit, subtile Veränderungen in den relativen Spiegeln der Expression von Mitgliedern eines Dimerisierungs-Paares in einen substantiellen quantitativen Effekt für die Transkription zu translatieren.
6 fasst die unterschiedlichen Faktoren involviert in die Regulation der Expression und die Aktivität der HNF-Transkriptions-Faktoren wie oben beschrieben zusammen. Aus den Untersuchungen der Erfinder kann geschlossen werden, dass Abweichungen an irgendeinem Punkt entlang des Pfades oder von irgendwelchen Faktoren, welchen diesen Pfad beeinträchtigen, direkt oder indirekt in der β-Zell-Dysfunktion und Diabetes mellitus münden werden, entweder in Form von MODY oder als spätausbrechende Diabetes.
Die vorliegende Erfindung hat gezeigt, dass Mutationen in HNF1α klar verantwortlich sind für die Diabetes vom MODY3-Typ. Wie zuvor diskutiert, bindet HNF1α an DNA in Form eines Dimers. Dies kann entweder ein Homodimer oder ein Heterodimer mit HNF1β (SEQ ID Nr. 80) sein. Die beiden Formen von HNF1α werden in vergleichbaren Mengen in der Leber exprimiert, jedoch besteht eine dreifache Expression von HNF1β in der Niere im Vergleich zu HNF1α.
HNF1β weist keine transkriptionelle Aktivität, wie sie HNF1α zugeordnet werden kann, auf. Eine potentielle Konsequenz dieser Beobachtung, in Kombination mit seiner Fähigkeit, mit HNF1α zu dimerisieren, ist, dass HNF1β wahrscheinlicherweise ein negativer Regulator der HNF1α transkriptionalen Aktivität ist. Diese Beobachtung wird nahegelegt durch das Vorliegen von vHNF1 in Systemen, welche nicht die Mehrzahl der leberzellspezifischen Genprodukte exprimieren (Baumhueter et al., 1988). Jedoch waren Untersuchungen von Mendel et al., (1991) nicht in der Lage, diese Beobachtung zu bestätigen.
Die Untersuchungen von Mendel et al., (1991) zeigten, dass ein Dimerisierungs-Cofaktor von HNF1α (DCoH) die Stabilität von HNF1α-Dimeren verbessern kann. Folglich wird nahegelegt, dass DCoH das Potential hat, die Aktivität von HNF1α und/oder HNF1β zu begrenzen. Es gibt eine Reihe von Hypothesen, wie DCoH die HNF1α-Aktivierung der Transkription beeinträchtigen könnte. HNF1α ist ein Monomer in Lösung und kann an DNA nur in Form eines Dimers binden, wobei das Vorliegen von DCoH die Ausbildung der Dimeren HNF1α-Form begünstigt. Alternativ ist es plausibel, dass DCoH eine konformatorische Veränderung in HNF1α induziert, um einen potenteren transkriptionellen Aktivator zu erzeugen, entweder direkt oder durch Ermöglichen der Interaktion mit anderen Proteinen, beispielsweise HNF1β. Eine noch weitere Alternative ist, dass DCoH die Rate des HNF1α-Abbaus vermindert, und dadurch HNF1α stabilisiert und die Effekte von HNF1α potenziert.
Die vorliegende Erfindung demonstriert, dass MODY4, welche zuvor nicht charakterisiert worden war, eine Manifestation von Defekten in HNF1β ist. Die vorliegende Erfindung beschreibt spezifische Mutationen in HNF1β, welche zu MODY4 in bestimmten Individuen geführt haben. Im Lichte dieser Beobachtungen werden hier Verfahren zur Identifikation und Isolation von Faktoren beschrieben, welche in die Aktivität von HNF1β und DCoH involviert sind, unter dem Gesichtspunkt, Einblick in therapeutische Eingriffe in Diabetes zu erhalten.
C. In vitro Screening Assays für Kandidaten-Substanzen
Bestimmte Aspekte der Erfindung betreffen Verfahren zur Bewertung von günstigen Kandidaten-Substanzen, um Verbindungen zu identifizieren, welche in der Lage sind, HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-mediatisierte Transkription zu stimulieren. Solche Verbindungen werden in der Lage sein, die Gen-Expression voranzutreiben, und man kann sagen, dass sie hochregulierende Aktivität aufweisen. Insofern als die erhöhte Gen- Expression, beispielsweise des Insulin-Gens im Körper so fungiert, dass dadurch die Symptome der Diabetes gelindert werden, werden alle erdenklichen positiven Substanzen identifiziert durch die Assays der vorliegenden Erfindung antidiabetische Wirkstubstanzen sein. Vor dem Verabreichen an den Menschen würden solche Verbindungen streng getestet unter Verwendung von konventionellen Tiermodellen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
Erfolgreiche Kandidaten-Substanzen können in Abwesenheit von Mutationen in HNF1α, HNF1β oder HNF4α funktionieren, wobei in diesem Fall die Kandidaten-Verbindung als ein „positiver Stimulator" von HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α eingestuft wird. Alternativ können solche Verbindungen die Transkription in der Gegenwart von mutiertem HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α stimulieren, und dabei die Effekte der Mutationen kompensieren, z.B. so zu fungieren, dass sie den HNF1α- und/oder HNF1β- und/oder HNF4α-Mutanten-mediatisierten Formen der Diabetes entgegenwirken und folglich als „ein HNF1α-Mutanten-Agonist", „HNF1β-Mutanten-Agonist" bzw. „HNF4α-Mutanten-Agonist" bezeichnet werden. Verbindungen können sogar entdeckt werden, welche alle drei diese Wirkungsweisen kombinieren. Obwohl die Agonistenklasse von Verbindungen ultimativ die am meisten wünschenswerte zu sein scheint, werden Verbindungen in jeder anderen Klasse ebenfalls wahrscheinlicherweise bedeutsame therapeutische Agenzien für die Anwendung in der Stimulation der Gen-Expression und beim Kampf gegen MODY1, MODY3, MODY4 und der spät ausbrechenden Typ 2 Diabetes in menschlichen Subjekten sein.
Kandidaten für HNF1α
Da für HNF1α hier gezeigt wird, dass es mit dem MODY3-Typ verknüpft ist, ist ein Verfahren, durch welches eine Kandidaten-Substanz identifiziert werden soll, welche in der Lage ist, die HNF1α-mediatisierte Transkription in Diabetes zu stimulieren eines, welches auf spezifischem Protein-an-DNA-Binden basiert ist. Dementsprechend kann man, um solch einen Assay durchzuführen, eine HNF1α-bindende Protein-Zusammensetzung herstellen, wie z.B. rekombinantes HNF1α, und die Fähigkeit einer Kandidaten-Substanz bestimmen, die HNF1α-Protein-Bindung an ein DNA-Segment zu verstär ken, einschließend eine komplementäre HNF1α-bindende Sequenz, d.h., die Stärke der Bindungs-Affinität eines Protein-zu-DNA-Komplexes zu vergrößern.
Dies würde im Allgemeinen erreicht werden unter Verwendung zweier paralleler Assays, wobei einer davon HNF1α und die spezifische DNA allein enthält und einer davon HNF1α, DNA und die Kandidaten-Substanz-Zusammensetzung enthält. Man würde jeden Assay unter Bedingungen durchführen und über einen Zeitraum, welcher effektiv ist, die Ausbildung von Protein-zu-DNA-Komplexen zu ermöglichen und man würde anschließend die gebundenen Protein-zu-DNA-Komplexe von jeglichem ungebundenen Protein oder jeglicher ungebundenen DNA trennen und die Menge der Protein-zu-DNA-Komplexe messen. Ein Anstieg in der Menge der gebundenen Protein-zu-DNA-Komplexe ausgebildet in der Gegenwart der Kandidaten-Substanz, wäre ein Hinweis dafür, dass die Kandidaten-Substanz in der Lage ist, HNF1α-Binden voranzutreiben und folglich in der Lage ist, die HNF1α-mediatisierte Transkription stimulieren.
In solchen Bindungs-Assays kann die Menge des Protein-zu-DNA-Komplexes gemessen werden nach der Entfernung der ungebundenen Spezies durch Nachweis eines Labels, wie z.B. eines radioaktiven oder enzymatischen Labels, welcher in die ursprüngliche HNF1α-Protein-Zusammensetzung oder das rekombinante Protein oder ein HNF1α-enthaltendes DNA-Segment eingebracht worden ist. Alternativ könnte man den Proteinteil des Komplexes mit Hilfe eines Antikörpers gerichtet gegen das Protein, wie hier offenbart, nachweisen.
Bevorzugte Bindungs-Assays sind diejenigen, in welchen entweder das HNF1α-Protein, das rekombinante Protein oder die aufgereinigte Zusammensetzung oder das HNF1α-enthaltende DNA-Segment an eine feste Unterlage gebunden sind und mit der anderen Komponente in Kontakt gebracht werden, um eine Komplex-Ausbildung zu ermöglichen. Ungebundene Protein- oder DNA-Komponenten werden dann von den Protein-zu-DNA-Komplexen durch Waschen abgetrennt und die Menge des verbleibenden gebundenen Komplexes könnte durch Nachweis des Labels oder mit Hilfe von Antikörpern quantifiziert werden. Solche DNA-Bindungs-Assays bilden eine Grundlage von Filter-Bindungs- und Mikrotiter-Platten-Typ-Assays und können in halbautomatisierter Art und Weise durchgeführt werden, um die Analyse einer großen Vielzahl von Kandidaten-Substanzen in einem kurzen Zeitraum zu ermöglichen. Elektrophorese-Verfahren, wie z.B. der Gel-Shift-Assay, der hier offenbart wird, könnten auch eingesetzt werden, um ungebundenes Protein oder DNA von gebundenen Protein-zu-DNA-Komplexen zu trennen, jedoch sind solche arbeitsintensiven Verfahren nicht bevorzugt.
Assays, wie die oben beschriebenen, sind ursprünglich, darauf gerichtet, positive Stimulator-Kandidaten-Substanzen zu identifizieren und adressieren nicht selbst die Aktivität der Substanz in der Gegenwart von HNF1α-Mutanten. Jedoch können sich solche positiven Regulatoren auch herausstellen als solche, die als HNF1α-Mutanten-Agonisten fungieren, und in jedem Fall wahrscheinlich für die transkriptionelle Promotion, entweder in vitro oder in vivo wirken würden. Positive Regulatoren würden wahrscheinlich weiter untersucht, um die Effekte von HNF1α-Mutanten auf ihre Wirkweise zu bewerten, beispielsweise durch Ausbrechen eines zellulären Reporter-Gen-Assays wie z.B. diejenigen, die unterschrieben werden.
Virtuell kann jede Kandidaten-Substanz analysiert werden durch diese Verfahren, einschließend Verbindungen, welche mit HNF1α bindenden Protein(en) wechselwirken, mit HNF1α oder Protein zu DNA-Komplexen, und solche Substanzen wie z.B. Enzyme können durch physikalische Veränderung einer der vorliegenden Strukturen wirken. Beispielsweise kann jede Verbindung, die aus natürlichen Quellen, wie z.B. Pflanzen, Tieren oder sogar aus Meeres-, Wald- oder Boden-Proben, isoliert worden ist, in solchen Assays untersucht werden, und gleiches gilt für synthetische chemische oder rekombinante Proteine.
Ein weiteres potenzielles Verfahren zum Stimulieren der HNF1α-mediatisierten Transkription ist, eine HNF1α-Protein-Zusammensetzung herzustellen, und die Protein-Zusammensetzung in einer Art und Weise zu modifizieren, welche effektiv ist, das HNF1α-Protein-Binden an ein DNA-Segment zu modifizieren, welche die HNF1α-Protein-Bindungs-Sequenz enthält. Die Bindungs-Assays würden parallel durchgeführt, ähnlich zu denjenigen wie oben beschrieben, was ermöglicht, dass natives und modifiziertes HNF1α-bindendes Protein miteinander verglichen würden. Zusätzlich zu Phosphatasen und Kinasen können andere Substanzen einschließen Proteasen und chemische Wirksubstanzen eingesetzt werden, um das HNF1α-bindende Protein zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung öffnet mit dem Klonieren von Mutanten-HNF1α-cDNA auch den Weg zum genetischen Erzeugen von HNF1α-Protein, um die Gen-Transkription in Diabetes voranzutreiben. In dieser Hinsicht wird die Mutation von potentiellen Phosphorylierungs-Stellen und/oder die Modifikation oder Deletion anderer Domänen ins Auge gefasst.
Kandidaten für das HNF1α-Binden
Die Kriterien, die oben dargelegt sind, hinsichtlich des Screenens für Modulatoren von HNF1α gelten auch für HNF4α. HNF4α ist ein Mitglied der Steroid-Hormon-Rezeptor-Superfamilie, jedoch ist der Ligand für HNF4α unbekannt. Die Identifikation des endogenen Liganden für HNF4α-Binden wäre ein wichtiger Schritt in Richtung des Aufklärung des Mechanismus der eukaryontischen Gen-Steuerung und würde auch biomedizinische Erkenntnis zur Verfügung stellen mit einem bedeutsamen Werkzeug, durch welches die spezifische Gen-Expression reguliert werden könnte. Solch eine Entwicklung würde zu verschiedenen bedeutsamen Anwendungen in pharmazeutischer und biotechnologischer Industrie führen. Obwohl viele Anwendungen angedacht sind, wäre eine besonders bedeutsame Anwendung diejenige in Form der zentralen Komponente in einem Screening-Assay, um neue Klassen von pharmakologisch aktiven Substanzen zu identifizieren, welche eingesetzt werden können, um die Transkription von Genen zu manipulieren und insbesondere voranzutreiben, deren Expression in Diabetes verändert ist.
Folglich wäre HNF1α von großer Bedeutung für die Identifizierung von Wirksubstanzen, um MODY und Typ 2 Diabetes zu bekämpfen. Ein Antidiabetes-Wirkstoff, isoliert durch Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung, würde so fungieren, dass er die zelluläre Transkription oder Funktion von HNF4α vorantreiben würde, was wiederum dazu dienen würde, die Transkription der Gene zu steigern, deren Aktivität durch HNF4α reguliert wird (beispielsweise HNF1α) wodurch die Transkription der Gene involviert in Diabetes verstärkt würde und die Symptome der Diabetes gelindert würden.
Kandidaten für HNF1β-Bindung
Die Kriterien, die oben dargelegt sind hinsichtlich des Screenens für Modulatoren von HNF1α und HNF4α gelten auch für HNF1β. HNF1β umfasst 557 Aminosäuren und ist strukturell verwandt mit HNF1α und fungiert als ein Homodimer bzw. Heterodimer mit HNF1α. Diese Dimere werden durch DCoH stabilisiert. Die Identifizierung von Faktoren, welche diese Dimerisierung beeinflussen oder irgendwelchen der Faktoren, involviert in den heterotetrameren Komplex, werden bedeutsame Verbindungen für die Modulation der transkriptionellen Aktivität zur Verfügung stellen. Solch eine Entwicklung würde zu einer Vielzahl von bedeutsamen Anwendungen in der pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie führen. Obwohl viele Anwendungen angedacht sind, wäre eine insbesonders bedeutsame Anwendung diejenige als zentrale Komponente in Screening-Assays, um neuen Klassen von pharmakologischer aktiven Substanzen zu identifizieren, welche eingesetzt werden könnten, um die Transkription von Genen zu manipulieren und insbesondere voranzutreiben, deren Expression in Diabetes verändert wird.
Folglich wäre HNF1β von großer Bedeutung für die Identifizierung von Genen, um MODY- und Typ 2-Diabetes zu bekämpfen. Ein Anti-Diabetes Wirkstoff, isoliert durch die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung, würde so fungieren, dass er die zelluläre Transkription oder Funktion von HNF1β vorantreibt, was wiederum dazu dienen würde, die Transkription von Genen zu verstärken, deren Aktivität durch HNF1β reguliert wird (beispielsweise HNF1α), und dadurch würde die Transkription von Genen involviert in Diabetes verstärkt werden und die Symptome der Diabetes würden gelindert werden.
D. Reporter-Gene und Zell-basiertes Screening-Assays
Zelluläre Assays sind auch verfügbar zum Screening von Kandidaten-Substanzen, um diejenigen zu identifizieren, die in der Lage sind, HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-mediatisierte Transkription bzw. Gen-Expression zu stimulieren. In diesen Assays kann die verstärkte Expression von irgendeinem natürlichen oder heterologen Gen unter der Steuerung eines funktionellen HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Proteins als ein Maß für die stimulatorische Aktivitäteingesetzt werden, obwohl die Anwendung von Reporter-Genen bevorzugt wird. Ein Reporter-Gen ist ein Gen, welches seiner rekombinanten Wirtszelle einen fertig verfügbaren Phenotyp verleiht, welcher nur unter spezifischen Bedingungen zutage tritt. Im vorliegenden Fall wird das Reporter-Gen, welches unter der Steuerung eines funktionellen HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Proteins steht, im Allgemeinen unter den Bedingungen von MODY3, MODY4 bzw. MODY1 Diabetes zurückgedrängt und wird im Allgemeinen in MODY3-, MODY4 bzw. MODY1-Nicht-Diabetes-Zuständen exprimiert werden.
Reporter-Gene sind Gene, welche ein Polypeptid kodieren, welches sonst nicht von der Wirtszelle produziert wird, welches nachweisbar ist durch Analyse der Zellkultur, beispielsweise durch fluorometrische, radioisotopische oder spektrophotometrische Analyse der Zellkultur. Beispiele auf die Enzyme schließen Luziferasen, Transferasen, Esterasen, Phosphatasen, Proteasen (Tissue Plasminogen-Aktivator oder Urokinase) sowie andere Enzyme ein, welche in der Lage sind, durch ihre physikalische Präsenz oder funktionelle Aktivität nachgewiesen zu werden. Ein häufig eingesetztes Reporter-Gen ist Chloramphenikol-Azetyltransferase (CAT), welches mit einem radiogelabelten Substrat eingesetzt werden kann oder Luziferase, welches fluorometrisch gemessen wird.
Eine weitere Klasse von Reporter-Genen, welche einer Wirtszelle nachweisbare Charakteristika verleihen, sind diejenigen, welche Polypeptide, im Allgemeinen Enzyme, kodieren, welche ihre Transformanten resistent gegen Toxine machen, beispielsweise das Neo-Gen, welches die Wirtszellen gegen toxische Spiegel des Antibiotikums G418 schützt, sowie Gene, welche Dihydrofolat-Reduktase kodieren, welche Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Gene dieser Klasse sind nicht im Allgmeinen bevorzugt, da der Phenotyp (Resistenz) nicht eine günstige oder schnelle quantitative Ausgabeinformation zur Verfügung stellt. Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein Toxin benötigt Tage in Zellkultur zur Bestätigung oder komplexe Assay-Prozeduren, falls eine weitere Bestimmung neben einer biologischen durchgeführt werden muss.
Weitere Gene von Potential zur Anwendung in Screening-Assays sind diejenigen, die in der Lage sind, Wirtszellen zu transformieren, so dass sie einzigartige Zelloberflächen-Antigene exprimieren, beispielsweise virale Env-Proteine, wie z.B. HIV gp 120 oder Herpes gD, welche in Immunoassays leicht nachweisbar sind. Jedoch sind Antigen Reporter nicht bevorzugt, da sie, anders als Enzyme, nicht katalytisch sind und folglich ihre Signale nicht amplifizieren.
Die Polypeptid-Produkte des Reporter-Gens werden sekretiert, entweder intrazellulär oder – wie oben erwähnt – als Membran gebundene Polypeptide. Falls das Polypeptid nicht herkömmlich sekretiert wird, wird es an eine heterologe Signalsequenz fusioniert, um die Verarbeitung und Sekretion zu ermöglichen. Unter anderen Umständen wird das Signal modifiziert, um Sequenzen zu entfernen, welche die Sekretion behindern. Beispielsweise würde das Herpes gD Hüll-Protein modifiziert durch ortsspezifische Deletion seiner Transmembran-bindenden Domäne, was seine Sekretion ermöglicht ( EP 139,417A ). Diese verkürzte Form des Herpes gD-Proteins ist nachweisbar im Kulturmedium in Form konventioneller Immunoassays. Vorzugsweise werden die Produkte des Reporter-Gens in intrazellulären oder Membran-Kompartementen eingefangen. Sie können dann an einen Kultur-Behälter fixiert werden, beispielsweise an Mikrotiter-Wells, in welchen sie kultiviert werden, gefolgt von der Zugabe einer ein nachweisbares Signal erzeugenden Substanz, wie z.B. eines chromogenen Substrates für Reporter-Enzyme.
Der Transkriptions-Promotions-Prozess, welcher in seiner Gesamtheit zur verstärkten Transkription führt, wird als „Aktivierung" bezeichnet. Der Mechanismus, mit welchem eine erfolgreiche Kandidaten-Substanz fungiert, ist nicht von Bedeutung, da es die Aufgabe ist, die HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-mediatisierte Gen-Expression voranzutreiben oder selbst die Gen-Expression in der Gegenwart von Mutanten-HNF1α-, HNF1β-, oder HNF4α-Gen-Produkten, mit welchen Mitteln auch immer, voranzutreiben.
Um einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Plasmid zu erzeugen zur Anwendung in solchen Assays, würde man den HNF1α enthaltenden Promotor, entweder als Hybrid oder den nativen HNF1α-Promotor an ein DNA-Segment ligieren, welches das Reporter-Gen kodiert, und zwar mit Hilfe konventioneller Verfahren. Ähnliche Assays werden auch ins Auge gefasst unter Verwendung von HNF1β- und HNF1α-Promotoren. Die HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Promotor-Sequenzen können durch in vitro Synthese erhalten werden oder von genomischer DNA erhalten werden und sollten strangaufwärts vom Start-Kodon des Reporter-Gens ligiert werden. Die vorliegende Erfindung stellt die Promotor-Region für menschliches HNF1α zur Verfügung, ein Vergleich der Sequenz der Promotor-Region der menschlichen, Ratten-, Maus-, Huhn- und Frosch-HNF1α- Gene wird in 22 dargestellt. Es wird hier auch ein Vergleich zur Verfügung gestellter Sequenzen der Promotor-Regionen des menschlichen bzw. des Maus-HNF4α-Gens (13). Die partielle Sequenz des menschlichen HNF1β-Gens einschließend den Promotor wurde auch von den vorliegenden Erfindern identifiziert und in der Gen-Bank Datenbank unter den Zugangs-Nummern U90279-90287 und 096079 hinterlegt. Irgendeiner dieser Promotoren kann insbesondere in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sein. Eine AT-reiche TATA-Box-Region könnte auch eingesetzt werden und sollte zwischen der HNF-Sequenz und dem Reporter-Gen-Start-Kodon lokalisiert sein. Die Region 3' zu kodierenden Sequenz für das Reporter-Gen wird idealerweise eine Transkriptions-Terminations- und eine Polyadenylierungsstelle aufweisen. Der Promotor und das Reporter-Gen können in einen replizierbaren Vektor insertiert sein und in einen Klonierungs-Wirt wie z.B. E. coli transfiziert werden, der Wirt kann kultiviert werden und der replizierte Vektor zurückgewonnen werden, um hinreichende Mengen der Konstruktion für spätere Transfektion in einen geeigneten eukaryontischen Wirt zu präparieren.
Wirtszellen zur Anwendung in Screening-Assays der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen Säugetier-Zellen sein und sind bevorzugte Zell-Linien, welche im Zusammenhang mit transienten Transfektions-Untersuchungen eingesetzt werden können. Zell-Linien sollten relativ leicht in Kulturen im Groß-Maßstab zu kultivieren sein. Auch sollten sie so wenig nativen Hintergrund wie möglich enthalten, berücksichtigt man die Natur des Reporter-Polypeptids. Beispiele schließen die Hep G2, VERO-, Hela-, menschliche embryonen Nieren (human embryonic kidney HEK)-293-, CHO-, WI38-, BHK-, COS-7-, und MDCK-Zell-Linien ein, wobei Affen CV-1-Zellen insbesondere bevorzugt sind.
Des Screening Assay wird typischerweise durchgeführt durch Kultivieren von rekombinanten Wirtszellen in der Gegenwart und in Abwesenheit von Kandidaten-Substanzen und Bestimmen der Menge oder der Aktivität des Reporter-Gens. Um die Kandidaten-Substanzen zu Assay, welche in der Lage sind, ihre Effekte in der Gegenwart von mutanten HNF1α-, HNF1β- und/oder HNF4α-Gen-Produkten auszuüben, würde man serielle molare Verhältnisse solcher Gen-Produkte, welche HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-mediatisierte Expression verändern, durchführen. Man würde idealerweise den Reporter-Signal-Spiegel nach einem Inkubations-Zeitraum messen, welcher hinrei chend ist, um die Mutanten-mediatisierte Repression der Signal-Expression in Kontrollen, allein inkubiert mit Mutanten, zu demonstrieren. Zellen, welche verschiedene Anteile von Kandidaten-Substanzen enthalten, würden dann ausgewertet hinsichtlich der Signal-Aktivierung im Vergleich zu den Unterdrückten spiegeln.
Kandidaten, welche dosis-abhängige Verstärkung der Reporter-Gen-Transkription oder der Expression demonstrieren, werden dann zur weiteren Auswertung als klinische, therapeutische Wirksubstanzen ausgewählt. Die Stimulation der Transkription kann in der Abwesenheit von Mutanten von HNF1α, HNF1β oder HNF4α beobachtet werden, wobei in diesem Fall die Kandidaten-Verbindung ein positiver Stimulator der HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Transkription sein könnte. Alternativ könnte die Kandidaten-Verbindung nur eine Stimulation in der Gegenwart von mutiertem HNF1α-, HNF1β- oder mutiertem HNF4α-Protein sein, was anzeigen würde, dass sie so fungieren würde, dass sie der Mutations-mediatisierten Unterdrückung der Gen-Expression entgegenwirken würde. Kandidaten-Verbindungen einer jeden Klasse könnten bedeutsam als therapeutische Wirksubstanzen sein, welche die Gen-Expression stimulieren würden und dadurch MODY und Typ 2 Diabetes bekämpfen könnten.
E. Nukleinsäuren
Wie in den Beispielen beschrieben, offenbart die vorliegende Erfindung das Gen an der MODY3-Stelle von Chromosom 12, die MODY4-Stelle als eine die assoziiert ist mit HNF1β, und das Gen an der MODY1-Stelle von Chromosom 20. Mutationen in diesen Genen sind verantwortlich für Diabetes. Die vorliegende Erfindung offenbart Mutationen in den HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Genen, identifiziert durch PCR-Techniken. Das Gen für die MODY3-Stelle wurde zum ersten Mal identifiziert als Hepytocyte-Nuclear-Faktor 1α, hier auch als HNF1α bezeichnet. Das Gen für die MODY1-Stelle wurde als Hepatocyte-Nuclear-Faktor 4α (HNF4α) identifiziert. Das Gen für die MODY4 Stelle wurde als Hepatocyte-Nuclear-Faktor 1β (HNF1β) identifiziert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung finden die Nukleinsäure-Sequenzen, die hier offenbart werden, Einsatz als Hybridisierungs-Sonden oder Amplifikations-Primer. In bestimmten Ausführungsformen bestehen diese Sonden und Primer aus Oli gonukleotid-Fragmenten. Solche Fragmente sollten hinreichend an Länge sein, um eine spezifische Hybridisierung an RNA oder DNA-Proben extrahiert als Gewebe zur Verfügung zu stellen. Die Sequenzen werden typischerweise 10–20 Nukleotide lang sein, können aber auch länger sein. Längere Sequenzen, beispielsweise 40, 50, 100, 500 und sogar bis zur vollen Länge sind für bestimmte Ausführungsformen bevorzugt.
Nukleinsäure-Molekule mit zusammenhängenden Abschnitten von ungefähr 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75 oder 100 oder 500 Nukleotiden aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, HNF1α und dessen Mutanten, werden ins Auge gefasst. In anderen Ausführungsformen werden Nukleotide von einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 78, SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 54, HNF1α und dessen Mutanten, ins Auge gefasst. In noch anderen Ausführungsformen werden Nukleotide einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 128, HNF1β und dessen Mutanten, ins Auge gefasst. Moleküle, welche komplementär zu den oben erwähnten Sequenzen sind und welche an diese Sequenzen unter Bedingungen hoher Stringenz binden, werden auch ins Auge gefasst. Diese Sonden sind bedeutsam für eine Vielzahl von Hybridisierungs-Ausführungsformen, wie z.B. Southern und Northern Blotting. In einigen Fällen ist ins Auge gefasst, dass Sonden verwendet werden könnten, um an multiple Target-Sequenzen zu binden, ohne ihre Fähigkeit, effektiv Diabetes (MODY1, MODY3 und MODY4) zu diagnostizieren, in Frage zu stellen. In bestimmten Ausführungsformen ist ins Auge gefasst, dass multiple Sonden zur Hybridisierung einer einzelnen Probe verwendet werden können.
Verschiedene Sonden und Primer können für die offenbarten Nukleotid-Sequenzen konzipiert werden. Primer können von irgendeiner Länge sein, sind jedoch typischerweise 10–20 Basen an Länge. Durch Zuordnen von numerischen Werten zu einer Sequenz, beispielsweise ist der erste Wert Rest 1, der zweite Rest 2, etc., kann ein Algorithmus definierend alle Primer vorgeschlagen werden:
n to n + y,
worin n eine ganze Zahl ist von eins bis zur letzten Nummer der Sequenz und y ist die Länge des Primers minus eins, wobei n + y nicht über die letzte Nummer der Sequenz hinausgeht. Folglich korrespondieren für ein 10-mer die Sonden mit den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12 ... und so weiter. Für ein 15-mer korrespondieren die Sonden die Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 ... und so weiter. Für ein 20-mer korrespondieren die Sonden mit den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22 ... und so weiter.
Die Werte von n in dem Algorithmus oben für die Nukleinsäure-Sequenzen sind: SEQ ID Nr. 1, n = 3238 für HNF1α, SEQ ID Nr. 78, n = 1441 für HNF4α, SEQ ID Nr. 128 für HNF1β.
Die Verwendung einer Hybridisierungssonde von zwischen 17 und 100 Nukleotiden an Länge ermöglicht die Ausbildung eines Duplex-Moleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle mit komplementären Sequenzen über Abschnitte von mehr als 20 Basen an Länge sind im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad eines speziell erhaltenen Hybrid-Moleküls zu verbessern. Man wird im Allgemeinen bevorzugen, Nukleinsäure-Moleküle zu konzipieren mit Stücken von 20 bis 30 Nukleotiden oder sogar längeren Stücken, wo dies gewünscht wird. Solche Fragmente können leicht hergestellt werden, beispielsweise durch direktes Synthetisieren des Fragmentes mit chemischen Mitteln oder durch Einbringen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion.
Dementsprechend können die Nukleotid-Sequenzen der Erfindung eingesetzt werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, selektiv Duplex-Moleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNAs auszubilden, oder um Primer zur Amplifikation von DNA oder RNA aus Geweben zur Verfügung zu stellen. Abhängend von der angedachten Anwendung wird man wünschen, verschiedene Bedingungen der Hybridisierung einzusetzen, um variierende Grade der Selektivität einer Sonde gegenüber einer Target-Sequenz zu erreichen.
Für Anwendungen, welche hohe Selektivität benötigen, wird man typischerweise wünschen, relativ stringente Bedingungen einzusetzen, um die Hybride zu formen, beispielsweise wird man relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperatur-Bedingungen auswählen, wie z.B. bereitgestellt durch ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,10 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 70°C. Solche Bedingungen hoher Stringenz tolerieren wenig, falls überhaupt Mismatches zwischen der Sonde und dem Templat oder dem Target-Strang und wären speziell geeignet zum Isolieren von spezifischen Genen oder zum Nachweis spezifischer mRNA-Transkripte. Es ist allgemein anerkannt, dass Bedingungen stringente gemacht werden können durch die Zugabe von wachsenden Mengen an Formamid.
Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise für die Substitution von Nukleotiden durch ort-spezifische Mutagenese, wird akzeptiert, dass niedrige, stringente Bedingungen benötigt werden. Unter diesen Bedingungen kann die Hybridisierung eintreten, selbst wenn die Sequenzen des Sonden- bzw. Target-Strangs nicht perfekt komplementär miteinander sind, sondern Mismatches an der einen oder anderen Position auftreten. Die Bedingungen können weniger stringent gemacht werden durch Erhöhen der Salz-Konzentration und absenken der Temperatur. Beispielsweise könnte ein Zustand mittlerer Stringenz zur Verfügung gestellt werden durch ungefähr 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 37°C bis ungefähr 55°C, wohingegen niedrig stringente Bedingungen bereitgestellt werden könnten durch ungefähr 0,15 M bis ungefähr 0,9 M Salz, bei Temperaturen, welche von ungefähr 20°C bis ungefähr 55°C reichen. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden, abhängend von den gewünschten Ergebnissen.
In anderen Ausführungsformen kann die Hybridisierung erreicht werden unter Bedingungen von beispielsweise 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1,0 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen zwischen ungefähr 20°C bis ungefähr 37°C. Andere Hybridisierungs-Bedingungen, die eingesetzt werden, könnten ungefähr 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, bei Temperaturen, welche von ungefähr 40°C bis ungefähr 72°C reichen, einschließen.
In bestimmten Ausführungsformen wird es von Vorteil sein, Nukleinsäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit geeigneten Mitteln, wie z.B. einem Label zum Bestimmen der Hybridisierung einzusetzen. Eine große Vielzahl geeigneter Indikator-Mittel ist im Stand der Technik wohlbekannt, einschließend fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden wie z.B. Avidin/Biotin, welche in der Lage sind, nachgewiesen zu werden. In bevorzugten Ausführungsformen mag man wünschen, einem fluoreszenten Label oder ein enzymatisches Tag, wie z.B. Urease, Alkalinphosphatase oder Peroxid einzusetzen, anstelle von radioaktiven oder sonst wie Umwelt-unerwünschten Reagenzien. In dem Fall von enzymatischem Tags sind Indikator-Substrate bekannt, welche eingesetzt werden können, um ein Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, welches für das menschliche Auge sichtbar ist oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um die spezifische Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-enthaltenden Proben zu identifizieren.
Im Allgemeinen ist angedacht, dass die Hybridisierungs-Sonden wie hier beschrieben bedeutsam sein werden sowohl als Reagenzien für die Hybridisierungs-Lösung, wie auch in der PCR zum Nachweis der Expression von korrespondierenden Genen, wie auch in Ausführungsformen einsetztend Fest-Phasen. In Ausführungsformen involvierend eine feste Phase wird die Test-DNA (oder RNA) adsorbiert oder anderweitig an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche fixiert. Diese fixierte, einzelstrangige Nukleinsäure wird dann einer Hybridisierung unterzogen mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen. Die ausgewählten Bedingungen werden von den speziellen Umständen basierend auf den speziell benötigten Kriterien abhängen (abhängend, beispielsweise vom G + C-Anteil, vom Typ der Target-Nukleinsäure, von der Quelle der Nukleinsäure, von der Größe der Hybridisierungs-Sonde, etc.). Folgend auf das Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht-spezifisch gebundene Sonden-Moleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung mit Hilfe der Label nachgewiesen, oder sogar quantifiziert.
Es wird sich verstehen, dass diese Erfindung nicht limitiert ist auf spezielle Sonden, die hier offenbart werden und insbesondere angedacht ist, zumindest Nukleinsäure-Sequenzen einzuschließen, welche an die offenbarten Sequenzen hybridisierbar sind oder funktionelle Analoge dieser Sequenzen sind.
Für Anwendungen, in welchen die Nukleinsäure-Segmente der vorliegenden Erfindung eingebracht werden, wie Vektoren, wie z.B. Plasmide, Kosmide oder Viren, können diese Segmente kombiniert werden mit anderen DNA-Sequenzen, wie z.B. Promotoren, Polyadenylierungs-Signalen, Restriktions-Enzym-Stellen, multiple Klonierungs-Stellen, andere „kodierende Segmente" und dergleichen, so dass ihre Gesamtlänge merklich variieren kann. Es ist angedacht, dass ein Nukleinsäure-Fragment von beinahe einer jeden Länge eingesetzt werden kann, wobei die gesamte Länge vorzugsweise durch die Art der Präparierung des gewünschten rekombinanten DNA-Protokolls limitiert ist.
DNA-Segmente kodierend ein spezifisches Gen können in rekombinante Wirtszellen eingebracht werden und eingesetzt werden zum Exprimieren spezifischer struktureller regulatorischer Proteine. Alternativ kann durch die Anwendung von genetischen Konstruktions-Techniken, ein Unterabschnitt oder ein Derivat von ausgewählten Genen eingesetzt werden. Strangaufwärts gelegene Regionen enthaltende regulatorische Regionen wie z.B. Promotor-Regionen können isoliert werden und nachfolgend zur Expression des ausgesetzten Gens eingesetzt werden.
In einer alternativen Ausführungsform können die HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Nukleinsäuren, die eingesetzt werden, tatsächlich Antisens-Konstrukte kodieren, welche unter intrazellulären Bedingungen an ein HNF1α- bzw. irgendeine HNF1α-Nukleinsäure hybridisieren. Die Bezeichnung „Antisens-Konstrukt" ist dazu gedacht, sich auf Nukleinsäuren zu beziehen, vorzugsweise auf Oligonukleotide, welche komplementär zu Basissequenzen einer Target-DNA oder RNA sind. Antisens-Oligonukleotide, wenn sie in eine Target-Zelle eingebracht werden, binden spezifisch an ihre Target-Nukleinsäure und wechselwirken mit der Transkription, der RNA-Verarbeitung, dem Transport, der Translation und/oder der Stabilität.
Antisens-Konstrukte können konzipiert werden, um an den Promotor zu binden bzw. an andere Steuer-Regionen, Exons, Introns oder sogar Exon-Intron-Grenzen eines Gens. Antisens-RNA-Konstrukte oder DNA kodierend solche Antisens RNA's können eingesetzt werden, um die Gen-Transkription oder Translation oder beide innerhalb einer Wirtszelle zu inhibieren, entweder in vitro oder in vivo, wie z.B. innerhalb eines Wirts-Tieres, einschließend eines menschlichen Subjektes. Nukleinsäure-Sequenzen, welche „komplementäre Nukleotide" umfassen, sind diejenigen, welche in der Lage sind, ein Basen-Paaren einzugehen gemäß den üblichen Watson-Crick-Regeln der Komplementarität. Das heißt, die größeren Purine werden eine Basen-Paarung eingehen mit den kleineren Pyrimidinen, um Kombinationen von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin gepaart mit entweder Thymin (A:T), im Falle von DNA, oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U), im Falle von RNA, einzugehen. Der Einschluß von weniger üblichen Basen wie z.B. Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin oder anderen in hybridisierende Sequenzen beeinträchtigt das Paaren nicht.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „komplementär" Nukleinsäure-Sequenzen, welche substantiell komplementär über ihre gesamte Länge sind und sehr wenig Basen-Mismatche aufweisen. Beispielsweise können Nukleinsäure-Sequenzen von fünfzehn Basen an Länge komplementär genannt werden, wenn sie ein komplementäres Nukleotid an dreizehn oder vierzehn Positionen aufweisen mit nur einem einzelnen Mismatch. Natürlich werden Sequenzen, welche „komplett komplementär" sind, Nukleinsäure-Sequenzen sein, welche vollständig komplementär über ihre vollständige Länge sind und keine Basen-Mismatches aufweisen.
Andere Sequenzen, mit niederen Graden von Homologie, werden auch ins Auge gefasst. Beispielsweise könnte ein Antisens-Konstrukt, welches limitiertere Regionen hoher Homologie aufweist, jedoch auch eine nicht-homologe Region (beispielsweise ein Ribozym) enthält, konzipiert werden. Diese Moleküle, obwohl sie weniger als 50% Homologie aufweisen, würden an Target-Sequenzen unter gleichen Bedingungen binden.
Während Volllängen- oder partielle Sequenzen von HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Gen-Sequenzen im Kontext von Antisens-Konstruktionen eingesetzt werden können, sind kürzere Oligonukleotide einfacher herzustellen und erhöhen die in vivo Zugänglichkeit. Jedoch steigt sowohl die Affinität als auch die Sequenz-Spezifität eines Antisens-Oligonukleotides als ein komplementäres Target mit wachsender Länge. Es ist angedacht, dass Antisens-Oligonukleotide von 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder mehr Basen-Paaren eingesetzt werden werden. Man kann leicht bestimmen, ob eine gegebene Antisens-Nukleinsäure effektiv für das Targeting des korrespondierenden Wirtszell-Gens ist, einfach durch Testen der Konstrukte in vitro, um zu bestimmen, ob die endogene Gen-Funktion beeinträchtigt wird oder ob die Expression von verwandten Genen mit komplementären Sequenzen beeinträchtigt wird.
In bestimmten Ausführungsformen wird man wünschen, Antisens-Produkte einzusetzen, welche andere Elemente einschließen, beispielsweise diejenigen, welche C-5- Propyn-Pyrimidine ausbrechen. Oligonukleotide, welche C-5-Propyn-Analoge von Uridin und Cytidin einsetzen, wurden als RNA mit hoher Affinität Binden identifiziert und als potente Antisens-Inhibitoren der Gen-Expression nachgewiesen (Wagner et al., 1993).
Durch diese Anwendung soll der Begriff „Expressions-Konstrukt so belegt sein, dass er irgendeinen Typ eines genetischen Konstruktes einschließt, enthaltend eine Nukleinsäure, kodierend ein Gen-Produkt, in welchem ein Teil oder die vollständige von der Nukleinsäure kodierte Sequenz in der Lage ist, transkribiert zu werden. Das Transkript kann translatiert werden in ein Protein, jedoch muss dies nicht der Fall sein. Folglich enthält in bestimmten Ausführungsformen die Expression sowohl die Transkription eines Gens als auch die Translation einer RNA in ein Gen-Produkt. In anderen Ausführungsformen schließt Expression nur die Transkription in eine Nukleinsäure ein, beispielsweise, um Antisens-Konstrukte zu erzeugen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure unter transkriptioneller Steuerung eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche durch die Synthese-Maschinerie der Zelle erkannt wird oder die eingebrachte synthetische Maschinerie, welche benötigt wird, um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Die Bezeichnung „unter transkriptioneller Steuerung" meint, dass der Promotor an der korrekten Position und in korrekter Orientierung relativ zur Nukleinsäure steht, um die RNA-Polymerase-Initiation zu steuern sowie die Expression des Gens.
Der Begriff „Promotor" wird hier verwendet werden, um sich auf eine Gruppe von transkriptionellen Steuer-Modulen zu beziehen, welcher um die Initiations-Stelle für RNA-Polymerase II geclustert sind. Viele Hypothesen, betreffend, wie Promotoren organisiert sind, wird von Analysen von mehreren viralen Promotoren abgeleitet, einschließend diejenigen für die HSV-Thymidin-Kinase (tk) und frühe SV40-Transkriptions-Einheiten. Diese Untersuchungen, bereichert durch zusätzliche jüngste Arbeit, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen zusammengesetzt sind, welche jeweils aus ungefähr 7 bis 20 bp an DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungs-Stellen für transkriptionelle Aktivator- oder Repressor-Proteine enthalten.
Zumindest ein Modul in jedem Promotor dient dazu, die Start-Stelle zur RNA-Synthese zu positionieren. Das beste bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, jedoch in einigen Promotoren, welche die TATA-Box nicht aufweisen, wie z.B. der Promotor für das terminale Deoxynukleotidyltransferase-Gen in Säugetieren und der Promotor für die späten SV40-Gene, hilft ein diskretes Element, welches die Start-Stelle überlagert selbst, die Stelle der Initiation zu fixieren.
Weitere Promotor-Elemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionellen Initiation. Typischerweise sind diese 30–110 bp strangaufwärts der Start-Stelle lokalisiert, obwohl eine Vielzahl von Promotoren jüngst als auch enthaltend funktionelle Elemente strangabwärts von der Start-Stelle identifiziert worden sind. Der Abstand zwischen Promotor-Elementen ist häufig flexibel, so dass die Promotor-Funktion konserviert wird, wenn Elemente insertiert werden oder relativ zueinander verschoben werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotor-Elementen auf 50 bp voneinander erhöht werden, bevor die Aktivität beginnt, abzunehmen. Abhängend vom Promotor scheint es, dass individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig voneinander funktionieren können, um die Transkription zu aktivieren.
Der spezielle Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression einer Nukleinsäure zu steuern, scheint nicht kritisch zu sein, solange er in der Lage ist, die Nukleinsäure in der Target-Zelle zu exprimieren. Folglich ist es bevorzugt, dort, wo eine menschliche Zelle als Target verwendet wird, die Nukleinsäure-kodierende Region benachbart zu und unter der Kontrolle eines Promotors, welcher in der Lage ist, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden, zu positionieren. Allgemein gesagt könnte ein solcher Promotor entweder einen menschlichen oder viralen Promotor einschließen. Bevorzugte Promotoren schließen diejenigen abgeleitet von HSV, HNF1α (siehe beispielsweise 22), HNF1β oder HNF4α-Promotoren (siehe beispielsweise 13) ein. Die partielle Sequenz des menschlichen HNF1β-Gens einschließend den Promotor wurde auch identifiziert durch die vorliegende Erfindung und in der GenBank Datenbank unter den Zugangs-Nummern U90279-90287 und 096079 (SEQ ID Nr. 128) hinterlegt. Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist der Tetracyclin gesteuerte Promotor.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen können der unmittelbare frühe menschliche Cytomegalovirus (CMV) Gen-Promotor, der frühe SV40 Promotor und die Rous sarcoma Virus Long Terminal Repeats verwendet werden, um Expression im großen Maßstab von Transgenen zu erhalten. Die Verwendung von anderen viralen oder Säugetier-zellulären oder Bakteriophagen-Promotoren, welche aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind, um die Expression eines Transgen zu erzielen, ist ebenfalls angedacht, vorausgesetzt, dass die Spiegel der Expression für einen gegebenen Zweck hinreichend sind. Tabellen 1 und 2 führen verschiedene Elemente/Promotoren auf, welche im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um die Expression eines Transgens zu regulieren. Diese Liste soll nicht als erschöpfend für alle der möglichen Elemente, involviert in die Produktion der Transgen-Expression angesehen werden, sondern soll in erster Linie exemplarisch dafür sein.
Verstärker wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, welche die Transkription eines Promotors verstärkten, welcher an einer entfernten Position auf dem gleichen DNA-Molekül lokalisiert war. Diese Fähigkeit, über einen großen Abstand hinweg zu agieren, hatte kaum Vorbilder in klassischen Untersuchungen von prokaryontischer transkriptionaler Regulation. Nachfolgende Arbeit zeigte, dass Regionen von DNA mit dem Hang zur Aktivität sehr ähnlich wie Promotoren organisiert waren. Das heißt, sie sind aus vielen individuellen Elementen zusammengesetzt, wobei ein jedes davon an eines oder mehrere transkriptionelle Proteine bindet.
Der grundlegende Unterschied zwischen Enhancern und Promotoren ist operational. Eine Enhancer-Region als ein Ganzes muss in der Lage sein, die Transkription bei einem Abstand zu stimulieren; dies muss nicht für eine Promotor-Region gelten oder seine Komponenten-Elemente. Auf der anderen Seite muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, welche die Initiation der RNA-Synthese an einer speziellen Stelle lenken und in einer speziellen Orientierung, wohingegen Enhancer diese Spezifitäten nicht aufweisen. Promotoren und Enhancer sind häufig miteinander überlagernd und zusammenhängend, und scheinen oft sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen.
Des Weiteren könnte jegliche Promotor-Enhancer-Organisation (wie z.B. durch die Eukaryoten-Promotor-Daten-Bank EPDB, Eukaryotic Promotor Data Base) auch verwendet werden, um die Expression eines Transgens zu steuern. Die Verwendung eines T3, T7 oder SP6 cytoplasmischen Expressionssystems ist eine weitere mögliche Aus führungsform. Eukaryontische Zellen können cytoplasmische Transkription eines speziellen bakteriellen Promotors unterstützen, falls geeignete bakterielle Polymerase bereitgestellt wird, entweder als Teil des Zufuhr-Komplexes oder als weiteres genetisches Expressions-Konstrukt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Die Verwendung des bakuloviralen Systems wird hohe Spiegel der Expression von dem hochpotenten Polyhedron-Promotor involvieren.
Man wird typischerweise einen Polyadenylierungs-Signal einschließen, um eine geeignete Polyadenylierung des Transkriptes zu bewirken. Die Natur des Polyadenylierungs-Signals wird dabei als nicht entscheidend für die erfolgreiche Praktizierung der Erfindung betrachtet, und irgendeine einer solchen Sequenz kann eingesetzt werden. Bevorzugte Ausführungsformen schließen das SV40 Polyadenylierungs-Signal ein und das Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungs-Signal, welches geeignet und bekannt ist als gut in verschiedenen Target-Zellen funktionierend. Auch ins Auge gefasst als ein Element der Expressions-Cassette ist ein Terminator. Dieses Element kann dazu dienen, die Nachrichten-Spiegel zu verstärken, und den Ablesedurchsatz von der Cassette in andere Sequenzen zu minimieren.
Ein spezifisches Initiations-Signal kann auch zur effektiven Translation von kodierenden Sequenzen benötigt werden. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Kodon und benachbarte Sequenzen ein. Exogene translatorische Steuer-Signale, einschließend das ATG-Initiations-Kodon können für die Zurverfügungstellung benötigt werden. Ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet ist leicht in der Lage, dies zu bestimmen und die nötigen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist wohlbekannt, dass das Initiations-Kodon im „Leserahmen" mit dem Leserahmen der gewünschten kodierenden Sequenz liegen muss, um die Translation des vollständigen Inserts sicherzustellen. Die exogenen translationalen Steuer-Signale und Initiations-Kodons können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die Effizienz der Expression kann verstärkt werden durch das Einschließen geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente (Bittner et al., 1987).
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können Expressions-Konstrukte einen Virus umfassen oder ein konzipiertes Konstrukt, abgeleitet von einem viralen Genom. Die Fähigkeit bestimmter Viren, in Zellen über Rezeptor-mediatisierte Endozytose einzudringen, und in das Wirtszell-Genom zu integrieren bzw. virale Gene stabil und effizient zu expremieren, haben sie zu attraktiven Kandidaten zum Transfer von Fremdgenen in Säugetier-Zellen gemacht (Ridgeway, 1988; Nicolas und Rubenstein, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Temin 1986). Die ersten Viren, welche als Vektoren eingesetzt wurden, waren DNA-Viren einschließend die Papovaviren (Simianvirus 40, Rinder-Papillomavirus und Polyom) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986) sowie Adenoviren (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986) und Adeno-assoziierte Viren. Retroviren sind auch attraktive Gen-Transfer-Vehikel (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986) wie dies Vaccin-Viren (Ridgeway, 1988) und Adeno-assoziierte Viren sind (Ridgeway, 1988). Solche Vektoren können eingesetzt werden, um (I) Zell-Linien in vitro zum Zweck der Expression von gewünschten Proteinen zu transformieren oder (II) Zellen in vitro oder in vivo zu transformieren, um therapeutische Polypeptide in einem Gen-therapeutischen Szenario zur Verfügung zu stellen.
In einigen Ausführungsformen ist der Vektor HSV. Da HSV neurotroph ist, hat es merkliches Interesse für die Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems geweckt. Da Insulin-sekretierende Pankreas-β-Zellen viele gemeinsame Eigenschaften mit Neuronen aufweisen, kann HSV bedeutsam für die Zufuhr von Genen zu β-Zellen sein und zur Gen-Therapie von Diabetes. Des Weiteren besitzt HSV die Fähigkeit, latente Infektionen in nicht-teilenden neuronalen Zellen zu etablieren, ohne in das Wirts-Zell-Chromosom zu integrieren oder sonst wie den Wirts-Zell-Metabolismus zu verändern, zusammen mit der Existenz eines Promotors, der aktiv ist während der Latenzzeit. Und obwohl viel Aufmerksamkeit auf neurotrope Anwendungen von HSV fokussiert worden ist, kann dieser Vektor auch für andere Gewebe eingesetzt werden.
Ein weiterer Faktor, welcher HSV zu einem attraktiven Vektor macht, ist die Größe und Organisation des Genoms. Da HSV groß ist, ist die Inkorporation multipler Gene oder von Expressions-Cassetten weniger problematisch als in anderen kleineren viralen Systemen. Darüber hinaus macht es die Verfügbarkeit verschiedener viraler Steuer-Sequenzen mit variierender Leistungsfähigkeit (zeitlich, Stärke, etc.) es möglich, die Expression zu einem größeren Ausmaß zu steuern, als in anderen Systemen. Es ist auch von Vorteil, dass das Virus relativ wenig gesplicte Nachrichten aufweist, was des Weiteren die genetischen Manipulationen erleichtert.
HSV ist auch relativ einfach zu manipulieren und kann in hohen Titern kultiviert werden. Folglich ist die Zufuhr, sowohl im Hinblick auf die benötigten Volumina, um hinreichende MOIs zu erzielen, als auch in einem geringeren Maße für wiederholte Dosierungen weniger ein Problem.
F. Kodierte Proteine
Sobald die vollständige kodierte Sequenz eines Marker-assoziierten Gens bestimmt worden ist, kann das Gen in ein geeignetes Expressions-System insertiert werden. Das Gen kann in irgendeiner der Vielzahl verschiedener rekombinanter DNA-Expressionssysteme exprimiert werden, um große Mengen des Polypeptid-Produktes zu erzeugen, welches dann aufgereinigt werden kann und verwendet werden kann, um Tiere zu impfen, um Antiseren zu erzeugen, mit welchen weitere Untersuchungen durchgeführt werden können.
Beispiele von Expressionssystemen, welche dem geübten Anwender auf dem Gebiet bekannt sind, schließen Bakterien ein, wie z.B. E. coli, Hefe, wie z.B. Saccharomyces cerevisiae, und Pichia pastoris, baculovirale und Säugetier-Expressionssysteme, wie z.B. in COS- oder CHO-Zellen. In einer anderen Ausführungsform werden Polypeptide in E. coli exprimiert und in baculoviralen Expressionssystemen. Ein vollständiges Gen kann exprimiert werden oder alternativ können Fragmente des Gens kodierend Teile des Polypeptids produziert werden.
In einer Ausführungsform wird die Gen-Sequenz kodierend das Polypeptid analysiert, um putative Transmembran-Sequenzen nachzuweisen. Solche Sequenzen werden typischerweise sehr hydrophob sein und leicht nachgewiesen werden durch die Anwendung von Standard-Sequenz-Analyse-Software wie z.B. MacVektor (IBI, New Haven, CT). Das Vorliegen von transmembranen Sequenzen ist häufig von Nachteil, wenn ein rekombinantes Protein in vielen Expressionssystemen synthetisiert wird, speziell im E. coli, da es zur Produktion von unlöslichen Aggregaten führt, welche schwierig in die native Konformation des Proteins zu renaturieren sind. Deletion von Transmembran-Sequenzen verändert typischerweise nicht signifikant die Konformation der verbleibenden Protein-Struktur.
Des Weiteren sind Transmembran-Sequenzen, welche per Definition innerhalb einer Membran eingebettet sind, nicht zugänglich. Folglich werden sich Antikörper gegen diese Sequenzen nicht als einsetzbar für in vivo oder in situ-Untersuchungen herausstellen. Die Deletion von transmembran-kodierenden Sequenzen von den Genen, verwendet zur Expression, kann erreicht werden durch Standard-Techniken. Beispielsweise können zufällig platzierte Restriktionsenzym-Stellen eingesetzt werden, um das gewünschte Gen-Fragment auszuschneiden oder PCR-artige Amplifikation kann eingesetzt werden, um nur den gewünschten Teil des Gens zu amplifizieren. Der Fachmann wird realisieren, dass solche Veränderungen konzipiert werden müssen, um nicht den translationalen Leserahmen für strangabwärts gelegene Abschnitte der Proteinkodierenden Sequenz zu verändern.
In einer Ausführungsform wird Computer-Sequenz-Analyse eingesetzt, um die Lokalisierung von vorhergesagten hauptsächlichen Antigen-bestimmten Epitopen des Poly peptids zu bestimmen. Software, welche in der Lage ist, diese Analyse durchzuführen, wird leicht, zellverfügbar sein, beispielsweise MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software verwendet üblicherweise Standard-Algorithmen wie z.B. die Kyte/Doolittle oder Hopp/Woods-Verfahren zum Lokalisieren von hydrophilen Sequenzen, welche charakteristischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden und folglich wahrscheinlicherweise als das antigene Determinanten fungieren werden.
Sobald diese Analyse durchgeführt worden ist, können Polypeptide hergestellt werden, welche zumindest die essentiellen Merkmale der antigenen Determinante enthalten und welche eingesetzt werden können in der Erzeugung von Antiseren gegen das Polypeptid. Minigene oder Genfusionen kodierend diese Determinanten können konstruiert wem den und insertiert werden in Expressions-Vektoren mit Hilfe von Standard-Verfahren, beispielsweise durch Verwendung der PCR-Methodologie.
Das Gen oder Gen-Fragmente kodierend ein Polypeptid können insertiert werden in einen Expressions-Vektor durch Standard-Subklonierungs-Techniken. In einer Ausführungsform wird ein E. coli Expressions-Vektor eingesetzt, der das rekombinante Polypeptid als ein Fusions-Protein produziert, was die schnelle Affinitäts-Aufreinigung des Proteins ermöglicht. Beispiele solch eines Fusions-Protein-Expressions-Systems sind das Glutathion S-transferase System (Pharmacia, Piscataway, NJ), das Maltosebindende Protein-System (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das 6xHis-System (Qiagen, Chatsworth, CA).
Einige dieser Systeme erzeugen rekombinante Polypeptide, welche nur eine kleine Anzahl weiterer Aminosäuren tragen, welche wahrscheinlicherweise nicht die antigene Fähigkeit des rekombinanten Polypeptids beeinträchtigen. Beispielsweise fügen sowohl das FLAG-System als auch das 6xHis-System nur kurze Sequenzen, wobei beide davon als wenig antigen bekannt sind und diese nicht in nachteilhafterweise das Falten des Polypeptids in seine native Konformtion beeinträchtigen, hinzu. Andere Fusions-Systeme erzeugen ein Polypeptid, wo es wünschenswert ist, den Fusionspartner vom gewünschten Polypeptid auszuschneiden. In einer Ausführungsform ist der Fusions-Partner mit dem rekombinanten Polypeptid durch eine Peptid-Sequenz verknüpft enthaltend eine spezifische Erkennungs-Sequenz für eine Protease. Beispiele geeigneter Sequenzen sind diejenigen erkannt durch die Tobacco Etch Virus-Protease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).
Rekombinante bakterielle Zellen, beispielsweise E. coli, werden in irgendeiner Vielzahl geeigneter Medien kultiviert, beispielsweise LB, und die Expression des rekombinanten Polypeptids wird durch Zugriff von IPTG zum Medium oder durch Schalten der Inkubation auf eine höhere Temperatur induziert. Nach Kultivieren der Bakterien für einen weiteren Zeitraum von zwischen 2 und 24 Stunden werden die Zellen gesammelt durch Zentrifugation und gewaschen, um überschüssiges Medium zu entfernen. Die bakteriellen Zellen werden dann lysiert, beispielsweise durch Zerstören in einem Zell-Homogenisator und zentrifugiert, um die dichten Einschlusskörperchen sowie Zellmembrane von den löslichen Zellkomponenten abzutrennen. Diese Zentrifugation kann durchgeführt werden unter Bedingungen, wobei die dichten Einschluss-Körperchen selektiv angereichert werden durch das Einbringen von Zuckern wie z.B. Succrose in den Puffer und Zentrifugation bei ausgewählter Geschwindigkeit.
In einer weiteren Ausführungsform ist das ausgewählte Expressions-System eines, welches durch den bakuloviralen Polyhedron-Promotor gesteuert wird. Das Gen-Kodieren des Polypeptid kann manipuliert werden durch Standard-Techniken, um das Klonieren in den bakuloviralen Vektor zu ermöglichen. Ein bakuloviraler Vektor ist der pBlueBac-Vektor (Invitrogen, Sorr'ento, CA). Der Vektor, der das Gen für das Polypeptid trägt, wird in (Spodoptera frugiperda Sf9)-Zellen transfiziert durch Standard-Protokolle und die Zellen werden kultiviert und verarbeitet, um das rekombinante Antigen zu erzeugen. Siehe Summers et al., A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station.
Als eine Alternative zu rekombinanten Polypeptiden können synthetische Peptide korrespondierend zu den antigenen Determinanten erzeugt werden. Solche Peptide sind zumindest sechs Aminosäure-Reste lang und können bis zu ungefähr 35 Reste enthalten, was der ungefähren oberen Grenze der Länge vom automatisierten Peptid-Synthese-Maschinen entspricht, wie z.B. diejenigen, die vom Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältlich sind. Die Verwendung solcher kleinen Peptide für die Vaccination benötigt typischerweise die Konjugation des Peptids an ein immunogenes Träger- Protein, wie z.B. das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen, das Keyhole Limpet Hemocyanin oder Rinder-Serumalbumin. Verfahren zum Durchführen dieser Konjugation sind auf dem Gebiet wohlbekannt.
In einer Ausführungsform können Aminosäure-Sequenz-Varianten des Polypeptids hergestellt werden. Diese können beispielsweise kleinere Sequenz-Varianten des Polypeptids sein, welche aufgrund der natürlichen Variation mit der Population auftreten oder sie können Homologe sein, die in anderen Spezies zu finden sind. Es können auch Sequenzen sein, welche nicht natürlicherweise auftreten, welche jedoch hinreichend ähnlich sind, so dass sie ähnlich funktionieren und/oder eine Immunantwort auslösen, welche mit natürlichen Formen des Polypeptids kreuz-reagiert. Sequenz-Varianten können hergestellt werden durch Standard-Verfahren der ortspezifischen Mutagenese wie z.B. diejenigen, die unten im folgenden Abschnitt beschrieben werden.
Aminosäure-Sequenz-Varianten des Polypeptids können Substitutions-, Insertions- oder Deletions-Varianten sein. Deletions-Varianten fehlt (fehlen) ein oder mehrere Reste des nativen Proteins, welche nicht essentiell für die Funktion oder immunogene Aktivität sind und Beispiele dafür sind Varianten, welchen die oben beschriebene Transmembran-Sequenz fehlt. Ein weiterer üblicher Typ der Deletions-Variante ist eine, der sekretorische Signal-Sequenzen fehlen oder Signal-Sequenzen, welche ein Protein dazu bringen, an einen speziellen Teil einer Zelle zu binden. Ein Beispiel der letztgenannten Sequenz ist die SH2-Domäne, welche das Protein induziert, an Phosphortyrosin-Reste zu binden.
Substitutions-Varianten enthalten typischerweise den Austausch einer Aminosäure anstelle einer anderen an einer oder an mehreren Stellen innerhalb des Proteins und können so konzipiert werden, dass sie eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids modulieren, wie z.B. die Stabilität gegen das proteolytische Schneiden. Substitutionen sind vorzugsweise konservativ, d.h. eine Aminosäure wird durch eine von einer ähnlichen Form und Ladung ersetzt. Konservative Substitutionen sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen beispielsweise ein die Veränderungen von: Alalin zu Serin; Arginin zu Lysin; Asparagin zu Glutamin oder Histidin; Aspartat zu Glutamat; Cysein zu Serin; Glutamin zu Asparagin; Glutamat zu Aspartat; Glycin zu Prolin; Histidin zu Asparagin oder Glutamin; Isoleucin zu Leucin oder Valin; Leucin zu Valin oder Isoleucin; Ly sin zu Arginin; Methionin zu Leucin; Phenylalanin zu Tyrosin, Leucin oder Methionin; Serin zu Threonin; Threonin zu Serin; Tryptophan zu Tyrosin; Tyrosin zu Tryptophan oder Phenylalalin; und Valin zu Isoleucin oder Leucin.
Insertionsvarianten schließen Fusions-Proteine ein, z.B. diejenigen, welche verwendet werden, um die schnelle Aufreinigung des Polypeptids zu ermöglichen und können auch Hybrid-Proteine einschließen enthaltend Sequenzen von anderen Proteinen und Polypeptiden, welche Homologe der Polypeptide sind. Beispielsweise könnte eine Insertions-Variante Teile der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids einer anderen Spezies enthalten, zusammen mit Teilen des homologen Polypeptids von einer anderen Spezies. Andere Insertions-Varianten können diejenigen einschließen, in welchen weitere Aminosäuren werden innerhalb der kodierenden Sequenz des Polypeptids eingebracht. Diese sind typischerweise kleinere Insertionen als die Fusionsproteine wie oben beschrieben und werden eingebracht beispielsweise in seine Protease-Schnitt-Stelle.
In einer Ausführungsform werden hauptsächlich Antigen-Determinanten des Polypeptids durch einen empirischen Ansatz bestimmt, in welchem Teile des Gens kodierend das Polypeptid in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden und die resultierenden Proteine auf ihre Fähigkeit getestet werden, eine Immunantwort auszulösen. Beispielsweise kann PCR eingesetzt werden, um einen Bereich von cDNAs herzustellen, welche Peptide kodieren, denen sukzessiv längere Fragmente des C-Terminus des Proteins fehlen. Die immunoschützende Aktivität eines jeden dieser Peptide identifiziert dann diejenigen Fragmente oder Domänen des Polypeptids, welche essentiell für die Aktivität sind. Weitere Beispiele, in welchen nur eine kleine Anzahl von Aminosäuren bei jeder Iteration entfernt wird, ermöglichen dann Lokalisierung der antigenen Determinanten des Polypeptids.
Eine weitere Ausführungsform zur Herstellung der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von Peptid-Mimetics. Mimetics sind Peptid-enthaltende Moleküle, welche Elemente der sekundären Struktur des Proteins nachahmen. Siehe beispielsweise Johnson et al., „Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman und Hall, New York (1993). Das zugrundeliegende Prinzip hinter der Anwendung von Peptidmimetics ist, dass das Peptidrückgrat der Proteine in erster Linie dazu dient, die Aminosäuren-Seitenketten in solch einer Art und Weise zu orientieren, dass molekulare Wechselwirkungen ermöglicht werden wie z.B. diejenigen von Antikörper und Antigen. Von einem Peptidmimetic erwartet man dann, dass es molukulare Wechselwirkungen ähnlich wie beim natürlichen Molekül erlaubt.
Erfolgreiche Anwendungen des Peptidmimetik-Konzepts haben sich bislang auf Mimetics fokussiert von β-Krümmungen innerhalb von Proteinen, von denen man weiß, dass sie hoch antigen sind. Wahrscheinliche β-Krümmungs-Strukturen innerhalb eines Polypeptids können durch Computer-basierte Algorithmen, wie oben diskutiert, vorhergesagt werden. Sobald die Aminosäuren-Komponenten der Krümmung bestimmt worden sind, können Peptidmimetics konstruiert werden, um ähnliche räumliche Orientierung der essentiellen Elemente der Aminosäure-Seitenketten zu erreichen.
Modifikation und Veränderungen können in der Struktur eines Gens durchgeführt werden und dabei wird immer noch ein funktionelles Molekül erhalten, welches ein Protein oder Polypeptid mit gewünschten Eigenschaften kodiert. Es folgt eine Diskussion, welche auf Veränderungen der Aminosäuren eines Proteins basiert, um ein Äquivalent zu erzeugen, oder sogar ein verbessertes Molekül der zweiten Generation. Die Aminosäure-Veränderungen können realisiert werden durch Verändern der Kodons der DNA-Sequenz gemäß den folgenden Daten.
Beispielsweise können bestimmte Aminosäuren anstelle von anderen Aminosäuren in einer Protein-Struktur substituiert werden, ohne merklichen Verlust der interaktiven Eindungs-Kapazität mit Strukturen wie z.B. antigen-bindenden Regionen von Antikörpern oder Bindungs-Stellen auf Substrat-Molekülen. Da es die interaktive Kapazität und die Natur eines Proteins ist, welche die biologisch-funktionelle Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuren-Substitutionen in einer Protein-Sequenz durchgeführt werden und in seiner zugrundeliegenden DNA-kodierenden Sequenz und dabei wird nichts desto weniger ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten. Es ist folglich durch die vorliegenden Erfinder angedacht, dass verschiedene Veränderungen in den DNA-Sequenzen von Genen durchgeführt werden können ohne einen merklichen Verlust der biologischen Einsetzbarkeit oder Aktivität.
Bei der Durchführung solcher Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäure-Index beim Verleihen der biologischen Funktion auf ein Protein ist im Allgemeinen auf dem Gebiet verstanden (Kyte & Doolittle, 1982).
Tabelle 3
Es ist akzeptiert, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zur sekundären Struktur des resultierenden Proteins beiträgt, was wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen definiert, beispielsweise mit Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen.
Jede Aminosäure weist einen zugeordneten hydropathischen Index auf der Basis der Hydrophobizität und Ladungs-Charakteristika auf (Kyte & Doolittle, 1982); diese sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (3,5); Aspartat (3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert sein können, welche einen ähnlichen hydropathischen Index oder Wert aufweisen und dabei immer noch zu einem Protein führen, welches ähnliche biologische Aktivität aufweist, d.h. immer noch ein biologisch äquivalentes Protein erzeugen. Beim Durchführen solcher Veränderung ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indices innerhalb von ± 2 liegen, bevorzugen, diejenigen, welche innerhalb von ±1 liegen, sind besonders bevorzugt, und diejenigen, die innerhalb von ±0,5 liegen, sind sogar noch mehr besonders bevorzugt.
Es ist auch im Stand der Technik verstanden, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilizität durchgeführt werden kann. US-Patent 4.554.101, hier per Verweis eingeschlossen, führt an, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilizität eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilizität der angrenzenden Aminosäuren erzeugt wird, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie in US-Patent 4.554.101 detailliert ausgeführt wird, wurden die folgenden Hydrophilizität-Werte den Aminosäure-Resten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin –0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
Es versteht sich auch, dass eine Aminosäure anstelle einer anderen mit einem ähnlichen Hydrophilizitäts-Wert substituiert sein kann und dabei immer noch ein biologisches Äquivalent oder ein immunologische äquivalentes Protein erzeugt werden kann. Bei solchen Änderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilizität-Wert innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, diejenigen, welche innerhalb von ±1 liegen, isstbesonders bevorzugt und diejenigen, die innerhalb von ±0,5 liegen, sind sogar noch mehr besonders bevorzugt.
Wie oben ausgeführt ist, basieren Aminosäure-Substitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäuren Seitenketten-Substituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobizität, Hydrophilizität, Ladung, Größe und dergleichen. Exemplarische Substitutionen, welche verschiedene der oben genannten Eigenschaften in Erwägung ziehen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen ein:
Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin sowie Valin, Leucin und Isoleucin.
G. Ortsspezifische Mutagenese
Ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die bedeutsam ist für die Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Protein oder Peptiden durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Die Technik stellt des Weiteren eine fertige Fähigkeit Sequenz-Varianten herzustellen und zu testen, zur Verfügung, einbringend eine oder mehrere der oben genannten Betrachtungen, durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotid-Sequenz-Änderungen in die DNA. Ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch die Anwendung spezifischer Oligonukleotid-Sequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, wie auch einer hinreichenden Anzahl von benachbarten Nukleotiden, um eine Primer-Sequenz von hinreichender Größe und Sequenz-Komplexität zur Verfügung zu stellen, um ein stabiles Duplex auf beiden Seiten der Deletions-Verknüpfung durchgeführt werden soll. Typischerweise ist ein primer von ungefähr 17 bis 25 Nukleotiden an Länge bevorzugt, mit ungefähr 5 bis 10 Resten nach beiden Seiten der Verknüpfung der Sequenz, die verändert werden soll.
Im Allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese im Stand der Technik wohlbekannt. Wie eingesehen werden wird, setzt die Technik typischerweise einen Bakteriophagen-Vektor ein, welcher sowohl in einzelsträngiger Form existiert. Typische Vektoren, einsetzbar in der ortsspezifischen Mutagenese schließen Vektoren ein, wie z.B. den M13-Phagen. Diese Phagen-Vektoren sind zellverfügbar und ihre Anwendung ist im Allgemeinen gut bekannt für die Fachleute auf dem Gebiet. Doppelsträngige Plasmide werden auch routinemäßig eingesetzt in der ortsspezifischen Mutagenese, was den Schritt des Transferierens des Gens von Interesse von einem Phagen in ein Plasmid eliminiert.
Im Allgemeinen wird die ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, zunächst durch Erhalten eines einzelsträngigen Vektors oder des Abschmelzens von zwei Strängen eines doppelsträngigen Vektors, welcher innerhalb seiner Sequenz einer DNA-Sequenz kodierend das gewünschte Protein einschließt. Ein Oligonukleotid-Primer, welcher die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird synthetisch hergestellt. Der Primer wird dann mit der einzelsträngigen DNA-Präparation annealed und DNA polymerisierenden Enzymen ausgesetzt wie z.B. E. coli Polymerase I Klenow-Fragment, um die Synthese des Mutations-tragenden Stranges zu vervollständigen. Folglich wird eine Heteroduplex ausgebildet, wobei ein Strang die ursprüngliche nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann eingesetzt, um geeignete Zellen zu transfermieren, wie z.B. E. coli-Zellen und Klone werden ausgewählt, welche rekombinante Vektoren einschließen, welche die mutierte Sequenz-Anordnung tragen.
Die Herstellung von Sequenz-Varianten des ausgewählten Gens unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese wird bereitgestellt als ein Mittel zum Erzeugen von potentiell bedeutsamen Spezies und soll nicht als begrenzend betrachtet werden, da es andere Wege gibt, in welchen Sequenz-Varianten von Genen erhalten werden können. Beispielsweise können rekombinante Vektoren kodierend das gewünschte Gen mit mutagenen Wirksubstanzen behandelt werden, wie z.B. Hydroxylamin, um Sequenz-Varianten zu erhalten.
H. Expression und Aufreinigung von kodierten Proteinen
1. Expression von Proteinen von klonierten cDNAs
Die cDNA-Spezies spezifiziert in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 und HNF1α können exprimiert werden als kodierte Peptide oder Proteine. In anderen Ausführungsformen können cDNA-Spezies spezifiziert in SEQ ID Nr. 78, SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 54 und HNF1α als kodierte Peptide oder Proteine exprimiert werden. Die DNA-Spezies spezifiziert in SEQ ID Nr. 128 und HNF1β können als kodierte Peptide oder Proteine exprimiert werden. Das Konzipieren von DNA-Segment(en) zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System kann durchgeführt werden mit Techniken, die im Allgemeinen den Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten Expression bekannt sind. Man glaubt, dass beinahe ein jedes Expressionssystem eingesetzt werden kann für die Expression der beanspruchten Nukleinsäure-Sequenzen.
Sowohl cDNA als auch genomische Sequenzen sind geeignet für die eukaryontische Expression, da die Wirtszelle im Allgemeinen die genomischen Transkripte verarbeiten wird, und zu funktioneller mRNA zur Translationen in Protein führen wird. Allgemein gesprochen mag es günstig sein, als rekombinantes Gen eine cDNA-Version des Gens einzusetzen. Man glaubt, dass die Anwendung einer cDNA-Version Vorteile zur Verfügung stellen wird dahingehend, dass die Größe des Gens im Allgemeinen viel kleiner sein wird und viel leichter eingesetzt werden kann, um die Target-Zelle zu transfizieren, als dies für das genomische Gen der Fall sein wird, welches typischerweise bis hin zu einer Größenordnung größer als das cDNA sein wird. Jedoch schließt der Erfinder nicht die Möglichkeit aus, eine genomische Version eines speziellen Gens, wo dies gewünscht wird, einzusetzen.
Wie hier verwendet, sind die Begriffe „technisch erzeugte" und „rekombinante" Zellen dazu gedacht, sich auf Zellen zu beziehen, in welche ein exogenes DNA-Segment oder Gen, z.B. eine cDNA oder ein Gen, eingebracht worden sind. Folglich sind technisch erzeugte Zellen unterscheidbar von natürlich auftretenden Zellen, welche keine rekombinant eingebrachten exogenen DNA-Segmente oder Gene enthalten. Technisch er zeugte Gene sind folglich Zellen mit einem Gen oder mit Genen, eingebracht durch Menschenhand. Rekombinante Zellen schließen diejenigen ein, welche eine eingebrachte cDNA oder eine eingebrachte genomische DNA aufweisen und schließen auch Gene ein, die angrenzend an einen Promotor positioniert sind, der nicht natürlicherweise mit dem speziell eingebrachten Gen assoziiert ist.
Um ein rekombinant kodiertes Protein oder Peptid zu expriminieren, entweder eine Mutante oder Wild-Typ, würde man in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung einen Expressions-Vektor erzeugen, welcher eine der beanspruchten isolierten Nukleinsäuren unter der Steuerung von einem oder mehreren Promotoren umfasst. Um die kodierende Sequenz „unter die Kontrolle eines" Promotors zu bringen, positioniert man das 5' Ende der translatorischen Initiations-Seite des Leserahmens im Allgemeinen zwischen ungefähr 1 und 50 Nukleotide „strangabwärts" von (d.h. 3' von) dem gewählten Promotor. Der „strangaufwärts" gelegene Promotor stimuliert die Transkription der insertierten DNA und treibt die Expression des kodierten rekombinanten Proteins voran. Dies ist die Bedeutung der „rekombinanten Expression" im hier verwendeten Kontext.
Viele Standard-Techniken sind verfügbar, um Expressions-Vektoren zu konstruieren, enthaltend die geeigneten Nukleinsäuren und transkriptionellen/translatorischen Steuer-Sequenzen, um Protein- oder Peptid-Expressionen in einer Vielzahl von Wirts-Expressions-Systemen zu erreichen. Zell-Typen verfügbar zur Expression schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Bakterien, wie z.B. E. coli und B. subtilis transformiert mit rekombinanter Phagen DNA, Plasmid DNA oder Cosmid DNA Expressions-Vektoren.
Bestimmte Beispiele von prokaryontischen Wirten sind E. coli Strang RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli χ 1776 (ATCC Nr. 31537) wie auch E. coli W3110 (F-, Lambda-, Prototroph, ATCC Nr. 273325); Bacilli wie z.B. Bacillus subtilis; und andere Enterobacteriaceae, wie z.B. Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und verschiedene Pseudonomas Spezies.
Im Allgemeinen werden Plasmid-Vektoren enthaltend das Replicon und Steuer-Sequenzen, welche abgeleitet sind von Spezies, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verknüpfung mit diesen Wirtszellen verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikations-Stelle wie auch markierende Sequenzen, die in der Lage sind, die Phenotypen-Selektionen in transformierten Zellen zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise wird E. coli häufig unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid abgeleitet von einer E. coli Spezies. Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich leichte Mittel zum Identifizieren von transformierten Zellen zur Verfügung. Das pBR322 Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen auch enthalten oder können modifiziert werden, so dass sie Promotoren, welche durch den mikrobiologischen Organismus verwendet werden können, zur Expression seiner eigenen Proteine enthalten.
Darüber hinaus können Phagen-Vektoren enthaltend ein Replicon und ein Steuer-Sequenzen, welche kompatibel sind mit den Wirtszellen-Mikroorganismen als transformierende Vektoren in Verknüpfung mit diesen Wirtszellen verwendet werden. Beispielsweise kann der Phage Lambda GEM^TM-11 eingesetzt werden zur Erzeugung eines rekombinanten Phagen-Vektors, welcher verwendet werden kann, um Wirtszellen wie z.B. E. coli LE392, zu transformieren.
Weitere bedeutsame Vektoren schließen pIN-Vektoren (Inouye et al., 1985); und pGEX-Vektoren zur Anwendung im Erzeugen von löslichen Glutathion S-Transferase (GST) Fusions-Proteinen für die spätere Aufreinigung und Trennung oder Abspaltung ein. Andere geeignete Fusions-Proteine sind diejenigen mit β-Galactosidase, Ubiquitin oder dergleichen.
Promotoren, welche am häufigsten eingesetzt werden in der rekombinanten DNA-Konstruktion schließen die β-Lactamase- (Penicillinase-), Lactase- und Tryptophan (trp)-Promotor-Systeme ein. Während diese die am häufigsten verwendeten Typen sind, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt und Details betreffend ihre Nukleotid-Sequenz wurden publiziert, was dem Fachmann auf dem Gebiet in die Lage versetzt, sie funktionell mit Plasmid-Vektoren zu legieren.
Zur Expression in Saccharomyces wird im allgemeinen beispielsweise das Plasmid Yrp7 eingesetzt (Stinchomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält das trp1-Gen, welches einen Selektions-Marker für einen Mutanten-Strang von Hefe zur Verfügung stellt, welchem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Das Vorliegen der trp1-Läsion als ein Merkmal des Hefe-Zell-Wirts-Genoms stellt dann eine effektive Umgebung zum Nachweis der Transformation durch das Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan zur Verfügung.
Geeignete Promotor-Sequenzen in Hefe-Vektoren schließen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyde-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase, ein. Beim Konstruieren von geeigneten Expressions-Plasmiden werden die Terminations-Sequenzen, assoziiert mit diesen Genen auch in den Expressions-Vektor 3' zur Sequenz ligiert, von der gewünscht wird, dass sie exprimiert wird, um die Polyadenylierung von der mRNA und die Termination zur Verfügung zu stellen.
Weitere geeignete Promotoren, welche weitere Vorteile bei der Transkription, gesteuert durch Wachstumsbedingungen aufweisen, schließen die Promotor-Region für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, degradative Enzyme assoziiert mit dem Stickstoffmetabolismus und die zuvor erwähnte Glyceraldehyde-3-Phosphatdehydrogenase und Enzyme verantwortlich für den Einsatz von Maltose und Galactose ein.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von Zellen abgeleitet von multizellulären Organismen auch als Wirte eingesetzt werden. Im Prinzip ist eine jede solcher Zell-Kulturen einsetzbar, entweder von Wirbeltier- oder Nicht-Wirbeltier-Kulturen. Zusätzlich zu Säugetier-Zellen schließt dies Insekten-Zell-Systeme infiziert mit rekombinanten viralen Expressions-Vektoren (beispielsweise Baculovirus); sowie Pflanzenzellsysteme infiziert mit rekombinanten viralen Expressions-Vektoren (beispielsweise der Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV [cauliflower mosaic virus]; der Tabakmosaikvirus, TMV [tobacco mosaic virus]) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressions-Vektoren (beispielsweise Ti Plasmid) enthaltend eine oder mehrere kodierende Sequenzen, ein.
In einem verwendbaren Insekten-System wird der Autograph californica Nuclear Polyhidrosis Virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um ein fremdes Gen zu expremieren. Der Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die isolierten kodierenden Nukleinsäure-Sequenzen werden in nicht-essentielle Regionen des Virus kloniert (beispielsweise das Polyhedron-Gen) und unter der Steuerung eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedron-Promotors) platziert. Erfolgreiche Insertion der kodierenden Gene resultiert in der Inaktivierung des Polyhedron-Gens und der Produktion von nicht-umhüllten rekombinanten Viren (d.h. Viren, denen eine Protein-Hülle kodiert durch das Polyhedron-Gen fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda Zellen zu infizieren, in welchen das insertierte Gen exprimiert wird (beispielsweise US-Patent Nr. 4.215.051).
Beispiele verwendbarer Säugetier-Wirtszell-Linien sind VERO und HeLa-Zellen, chinesische Hamsterovar-Zell-Linien (CHO), WI38, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN und MDCK-Zell-Linien. Darüber hinaus kann eine Wirtszelle ausgewählt werden, welche die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Gen-Produkt in der gewünschten spezifizierten Art und Weise verarbeitet. Solche Modifikationen (beispielsweise Glycosylierung) und Verarbeitung (beispielsweise Schneiden) von Protein-Produkten kann bedeutsam für die Funktion des kodierten Proteins sein.
Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das post-translatorische Verarbeiten und die Modifikation von Proteinen. Geeignete Zell-Linien oder Wirts-Systeme können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des fremden exprimierten Proteins sicherzustellen. Expressions-Vektoren zur Anwendung in Säugetier-Zellen schließen üblicherweise einen Ursprung der Replikation (wenn notwendig), einen Promotor lokalisiert vor dem zu expremierenden Gen, zusammen mit irgendwelchen notwendigen Ribosom-Bindungs-Stellen, RNA-Splice-Stellen, Polyadenylierungs-Stellen und transkriptionellen Terminator-Sequenzen ein. Der Ursprung der Replikation kann entweder durch Konstruktion des Vektors zur Verfügung gestellt werden, so dass er einen exogenen Ursprung einschließt, wie z.B. einen, der von SV40- oder anderen viralen (beispielsweise Polyom, Adeno, VSV, BPV) Quellen abgeleitet ist, oder kann zur Verfügung gestellt werden durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle. Falls der Vektor in das Wirtszell-Chromosom integriert ist, ist das Letztgenannte häufig ausreichend.
Der Promotor kann abgeleitet sein vom Genom der Säugetier-Zellen (beispielsweise der Metallothionin-Promotor) oder von Säugetier-Viren (beispielsweise der späte Adenovirus-Promotor; der Vaccin-Virus 7,5K Promotor). Des Weiteren ist es auch möglich und wünschenswert, Promotoren oder Steuer-Sequenzen einzusetzen, welche normalerweise mit der gewünschten Gen-Sequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, dass solche Steuer-Sequenzen kompatibel mit dem Wirtszell-Systemen sind.
Eine Vielzahl von viral basierten Expressions-Systemen kann eingesetzt werden, beispielsweise werden häufig die Promotoren abgeleitet von Polyom, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 (SV40) eingesetzt. Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus sind bedeutsam, da sie beide leicht vom Virus als Fragment abgeleitet werden können, welches auch den viralen SV40 Ursprung der Replikation enthält. Kleinere oder größere SV40 Fragmente können auch eingesetzt werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp-Sequenz, welche sich von der HinDIII-Stelle bis zur Bg/I-Stelle, lokalisiert im viralen Ursprung der Replikation erstrecht, liegt darin enthalten vor.
In Fällen, wo ein Adenovirus als ein Expressions-Vektor eingesetzt wird, können die kodierenden Sequenzen an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Steuer-Komplex ligiert sein, beispielsweise die späte Promotor und dreiteilige Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch eine in vitro- oder in vivo-Rekombination insertiert werden. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (beispielsweise die E1 oder E3 Region) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, welcher überlebensfähig und in der Lage ist, Proteine in infizierten Wirtszellen zu exprimieren.
Spezifische Initiations-Signale können auch benötigt werden zur effekten Translation der beanspruchten isolierten kodierenden Nukleinsäure Sequenzen. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Kodon und angrenzende Sequenzen ein. Exogene translationale Steuer-Signale, einschließend das ATG-Initiations-Kodon können des Weiteren benötigt werden, so dass sie bereitgestellt werden müssen. Ein gewöhnlicher Fachmann auf dem Gebiet wird leicht in der Lage sein, diese Bedürfnisse zu bestimmen und die notwendigen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist wohlbekannt, dass das Initiations-Kodon im Rahmen (oder in Phase) mit dem Leserahmen der gewünschten kodierten Sequenz liegen muss, um die Transkription des gesamten Insert sicherzustellen. Diese exogenen translatorischen Steuer-Signale und Initiations-Kodons können von einer Vielzahl von Ursprüngen sein, sowohl von natürlichem als auch synthetischem Ursprung. Die Effizienz der Expression kann verstärkt werden durch den Einschluss geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente oder Transkriptions-Terminatoren (Bittner et al., 1987).
Bei der eukaryontischen Expression wird man typischerweise wünschen, eine geeignete Polyadenylierungs-Stelle in die transkriptionelle Einheit einzubringen (beispielsweise 5'-AATAAA-3'), falls noch keine innerhalb des ursprünglich klonierten Segments enthalten war. Typischerweise wird die Poly A-Additions-Stelle ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide „strangabwärts" zur Terminations-Stelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptions-Termination platziert werden.
Für eine langfristige Produktion in großem Maßstab von rekombinanten Proteinen ist die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zell-Linien, welche stabil Konstrukte kodierend Proteine exprimiert, technisch erzeugt werden. An Stelle der Verwendung von Expressions-Vektoren, welche virale Ursprünge der Replikation enthalten, können Wirts-Zellen transformiert mit Vektoren, gesteuert durch geeignete Expressions-Steuer-Elemente (beispielsweise Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptions-Terminationen, Polyadenylierungs-Stellen etc), und einem auswählbaren Marker transformiert werden. Folgend auf die Einbringung der fremden DNA kann man den technisch erzeugten Zellen erlauben, für 1–2 Tage in angereichertem Medium zu wachsen, bevor man sie in ein selektives Medium überführt. Der auswählbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegen die Auswahl und ermöglicht Zellen, stabil das Plasmid in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foci auszubilden, welche wiederum kloniert und expandiert in Zell-Linien werden können.
Eine Vielzahl von Selektionssystemen kann eingesetzt werden, einschließen jedoch nicht limitiert auf die Herpes Simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962) sowie Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gene (Lowy et al., 1980), in tk, hgprt bzw. aprt-Zellen. Auch Antimetaboliten-Resistenz kann eingesetzt werden als die Basis der Selektion für dhfr, welche Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980; O'Hare et al., 1981); gpt, welche Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan et al., 1981); neo, welche Resistenz gegen Aminoglycosid G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981) verleiht; sowie hygro, welche Resistenz gegen Hygromycin verleiht.
Es ist angedacht, dass die isolierten Nukleinsäuren der Erfindung „überexprimiert" werden können, d.h. in erhöhten Spiegeln relativ zu ihrer natürlichen Expression in menschlichen Zellen exprimiert werden oder sogar relativ zur Expression von anderen Protein in der rekombinanten Wirtszelle. Solche Überexpression kann bewertet werden durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließend Radio-Labeln und/oder Protein-Aufreinigung. Jedoch sind einfache oder direkte Verfahren bevorzugt, beispielsweise diejenigen involvierende SDS/PAGE und Protein-Anfärben oder Western-Blotten, gefolgt von quantitativen Analysen, wie z.B. densitometrisches Scannen des resultierenden Gels oder Blots. Ein spezifischer Anstieg im Spiegel des rekombinanten Proteins oder Peptids im Vergleich zum Spiegel in natürlichen menschlichen Zellen ist ein Hinweis auf die Überexpression, wie auch ein relativer Überfluss des spezifischen Proteins relativ zu anderen Proteinen produziert durch die Wirts-Zelle und beispielsweise sichtbar auf einem Gel.
2. Aufreinigung von exprimierten Proteinen
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Aufreinigung, in besonderen Ausführungsformen die substantielle Aufreinigung eines kodierten Proteins oder Peptids. Die Bezeichnung „aufgereinigtes Protein oder Peptid", wie hier verwendet, ist dazu gedacht, sich auf eine Zusammensetzung, isolierbar vom anderen Komponenten zu beziehen, wobei das Protein oder Peptid aufgereinigt wird bis zu irgendeinem Grad relativ zu seinem natürlich erhältlichen Zustand (d.h. in diesem Falle relativ zu seiner Reinheit innerhalb eines Leberzell- oder β-Zell-Extraktes. Ein aufgereinigtes Protein oder Peptid bezieht sich daher auch auf ein Protein oder Peptid, welches frei von der Umgebung ist, in welcher es natürlicherweise auftreten kann.
Im Allgemeinen wird „aufgereinigt" sich auf eine Protein- oder Peptid-Zusammensetzung beziehen, welche einer Fraktionierung unterzogen worden ist, um verschiedene andere Komponenten zu entfernen, wobei die Zusammensetzung substantiell ihre exprimierte biologische Aktivität aufrecht erhält. Wo die Bezeichnung „substantiell aufgereinigt" verwendet wird, wird sich diese Bezeichnung auf eine Zusammensetzung bezie hen, in welcher das Protein oder Peptid die hauptsächliche Komponente der Zusammensetzung ausbildet und z.B. ungefähr 50% oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung konstituiert.
Verschiedene Verfahren zum Quantifizieren des Grades der Aufreinigungs-Proteins oder Peptids werden den Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Diese schließen beispielsweise ein, das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder das Auswerten der Vielzahl von Polypeptiden innerhalb einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse. Ein bevorzugtes Verfahren zum Auswerten der Reinheit einer Fraktion ist die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, sie mit einer spezifischen Aktivität des ursprünglichen Extraktes zu vergleichen und folglich den Grad der Reinheit zu berechnen, der hier durch eine „– fache Aufreinigungs-Zahl" bewertet wird. Die tatsächlich verwendeten Einheiten, um die Stärke der Aktivität zu repräsentieren, werden selbstverständlich von der speziellen Assay-Technik, die ausgebildet wird, um auf die Aufreinigung zu folgen, abhängen und davon, ob das exprimierte Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität zeigt oder nicht.
Verschiedene Techniken geeignet zur Anwendung in der Protein-Aufreinigung werden den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sein. Diese schließen beispielsweise ein die Präzipitation mit Ammoniumsulphat, Polyethylenglycol, Antikörpern und dergleichen oder durch Hitzedenaturierung, gefolgt von Zentrifugation; Chromatographie-Schritte wie z.B. Ionenaustausch, Gel-Filtration, Revers-Phasen, Hydroxylapatit- und Affinitäts-Chromatographie; Isoelektrisches Fokussieren; Gel-Elektrophorese und Kombinationen von solchen und anderen Techniken. Wie allgemein im Stand der Technik bekannt ist, glaubt man, dass man die Reihenfolge des Durchführens verschiedene Aufreinigungsschritte verändern kann, ohne dass bestimmte Schritte weggelassen werden können, und man trotzdem immer noch in einem geeigneten Verfahren zur Herstellung eines substantiell aufgereinigten Proteins oder Peptids enden wird.
Es gibt keine allgemeine Bestimmung, dass das Protein oder Peptid immer in seinem am meisten aufgereinigten Zustand zur Verfügung gestellt wird. Tatsächlich ist angedacht, dass weniger substantiell aufgereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen Einsatz finden werden. Partielle Aufreinigung kann realisiert werden unter Verwendung weniger Aufreinigungsschritte in Kombination oder durch Einsatz verschiedener Formen des gleichen allgemeinen Aufreinigungsschemas. Beispielsweise kann eingesehen werden, dass eine Kationen-Austausch-Säulen-Chromatographie durchgeführt unter Verwendung eines HPLC-Apparates, im Allgemeinen in einer höher-fachen Aufreinigung resultieren wird als die gleiche Technik unter Verwendung eines Niedrigdruckchromatographie-Systems. Verfahren, welche einen geringeren Grad der relativen Aufreinigung zeigen, können Vorteile in der insgesamten Rückgewinnung des Protein-Produkts aufweisen oder im Aufrechterhalten der Aktivität eines exprimierten Proteins.
Es ist bekannt, dass die Migration eines Polypeptids, manchmal sogar signifikant, mit den verschiedenen Bedingungen von SDS/PAGE variieren kann (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425, 1977). Es wird daher eingesehen werden, dass unter verschiedenen Elektrophorese-Bedingungen die offensichtlichen molekularen Gewichte der aufgereinigten oder partiell aufgereinigten Expressions-Produkte variieren können.
I. Herstellung von Antikörpern spezifisch für kodierte Proteine
Antikörper-Erzeugung
Für einige Ausführungsformen wird es wünschenswert sein, Antikörper zu erzeugen, welche mit hoher Spezialität an das Protein-Produkt (die Protein-Produkte) einer isolierten Nukleinsäure binden ausgewählt aus der Gruppe umfassend: SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, oder irgendeine andere Mutante von HNF1α, SEQ ID Nr. 78, SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 54 oder irgendeine andere Mutante von HNF1α, SEQ ID Nr. 128 (HNF1β) oder irgendeine Mutante von HNF1β. Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe beispielsweise Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; hier per Verweis eingeschlossen.
Verfahren zum Erzeugen von Polyklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik wohlbekannt. Kurz gesagt wird ein polyklonaler Antikörper hergestellt zum Immunisieren eines Tieres mit einer antigenen Zusammensetzung und Sammeln der Antiseren vom immunisierten Tier. Ein großer Bereich der tierischen Spezies kann eingesetzt werden zur Erzeugung von Antiseren. Typischerweise ist das Tier, das zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt wird ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens des Kaninchens ist ein Kaninchen die bevorzugte Wahl zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern.
Wie im Stand der Technik wohlbekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenizität variieren. Es ist daher häufig notwendig, das Wirts-Immunsystem zu boosten, was erreicht werden kann durch Koppeln eines Peptids oder Polypeptids an einen Carrier. Beispielhafte und bevorzugte Carrier sind das Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) und das Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin). Andere Albumine wie z.B. Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können auch als Carrier verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Carrier-Protein sind wohlbekannt im Stand der Technik und schließen Glutaraldehyde, m-Maleinmidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-biazotiertes Benzidin ein.
Wie auch wohlbekannt im Stand der Technik ist, kann die Immunogenizität einer speziellen Immunogen-Zusammensetzung verstärkt werden durch die Anwendung von nicht-spezifischen Stimulatoren der Immun-Antwort, welche als Adjuvantien bekannt sind. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen vollständiges Freud'sches Adjuvans (einen nicht-spezifischen Stimulator der Immun-Antwort enthaltend abgetötetes Mycobacterium tuberculosis), unvollständiges Freud'sches Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvans ein.
Die Menge der Immunogen-Zusammensetzung, verwendet in der Produktion von polyklonalen Antikörpern, variiert mit der Natur des Immunogens wie auch dem für die Immunisierung verwendeten Tier. Eine Vielzahl von Wegen kann eingesetzt werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern kann überwacht werden durch Sammeln von Blut vom immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung. Eine zweite Booster-Injektion kann auch gegeben werden. Der Prozess des Boostens und Titens wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Wenn ein geeigneter Grad der Immunogenizität erhalten ist, kann das immunisierte Tier zur Ader gelassen werden und das Serum isoliert und gelagert werden und/oder in einigen Fällen kann das Tier verwendet werden, um MAbs zu erzeugen. Zur Produktion von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern kann das Tier zur Ader gelassen werden durch eine Ohr-Vene oder alternativ durch kardiäre Punktur. Das entfernte Blut lässt man dann koagulieren und es wird zentrifugiert, um Serum-Komponenten von den gesamten Zellen abzutrennen und von dem Blutpfropfen. Das Serum kann wie es ist für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden oder die gewünschte Antikörper-Fraktion kann durch wohlbekannte Verfahren, wie z.B. Affinitäts-Chromatographie, unter Verwendung eines anderen Antikörpers oder eines Peptids gebunden an eine feste Matrix aufgereinigt werden.
Monoklonale Antikörper (MAbs) können leicht hergestellt werden durch die Verwendung von wohlbekannten Techniken, wie z.B. denjenigen, die beispielhaft ausgeführt sind in US-Patent 4.196.265, per Verweis eingeschlossen. Typischerweise involviert diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers in einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, beispielsweise einem aufgereinigten oder partiell aufgereinigten exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird in einer Art und Weise verabreicht, welche effektiv die Antikörper erzeugenden Zellen stimuliert.
Das Verfahren zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern (MAbs) beginnt im Allgemeinen mit etwa den gleichen Linien wie diejenigen zum Erzeugen von polyklonalen Antikörpern. Nagetiere, wie z.B. Mäuse und Ratten, sind bevorzugte Tiere, jedoch ist auch die Verwendung von Kaninchen-, Schaf- oder Frosch-Zellen möglich. Die Verwendung von Ratten kann einen bestimmten Vorteil zur Verfügung stellen (Goding, 1986, pp. 60–61), jedoch sind Mäuse bevorzugt, wobei BALB/c-Mäuse am meisten bevorzugt sind, da sie routinemäßig am meisten eingesetzt werden und im Allgemeinen einen höheren Prozentsatz von stabilen Fusionen ergeben.
Den Tieren wird, wie oben erwähnt, Antigen injiziert. Das Antigen kann an Carrier-Moleküle wie z.B. das Keyhole Limpet Hemocyanin, falls dies notwendig ist, gekoppelt werden. Das Antigen würde typischerweise mit einem Adjuvans vermischt werden wie z.B. im Freud'schen vollständigen oder unvollständigen Adjuvans. Booster-Injektionen mit dem gleichen Antigen würden in ungefähr zweiwöchigen Intervallen auftreten. Auf die Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zum Erzeugen von Antikörpern, spezifisch B Lymphozyten (B-Zellen), zur Anwendung in dem MAb erzeugenden Protokoll ausgewählt. Diese Zellen können von biopsierten Milzen, Tonsilen oder Lympfknoten erhalten werden oder von einer peripheralen Blutprobe. Milz-Zellen und peripherale Blut-Zellen sind bevorzugt, die Erstgenannten, da sie eine reiche Quelle von Antikörper produzierenden Zellen darstellen, welche in dem sich teilenden Plasmablast-Zustand und die Letztgenannteren, da peripherales Blut leicht zugänglich ist. Häufig wird ein Panel von Tieren immunisiert worden sein und die Milz des Tiers mit dem höchsten Antikörper-Titer wird entfernt und die Milz-Lymphozyten werden erhalten durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze. Typischerweise enthält eine Milz von einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 50⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die Antikörper erzeugenden B-Lymphozyten von dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer immortalen Myelom-Zelle fusioniert, im Allgemeinen einer gleichen Spezies wie das Tier, das immunisiert worden ist. Myeloma-Zell-Linien geeignet zur Anwendung in Hybridoma-erzeugenden Fusions-Prozeduren sind bevorzugt nicht-Antikörper-erzeugend, haben hohe Fusionseffizienz und haben Enzymeffizienzen, welche sie davon abhalten, in bestimmten auswählbaren Medien zu wachsen, welche nur das Wachstum der gewünschten fusionierten Zellen (Hybridomas) unterstützen.
Irgendeine einer Vielzahl von Myeloma-Zellen kann verwendet werden, wie dies den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist (Goding, pp. 65–66, 1986; Campbell, pp. 75–83, 1984). Beispielsweise kann man, wenn das immunisierte Tier eine Maus ist, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 BuI verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F verwenden und 4B210 und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-Hmy2 und UC729-6 sind alle bedeutsam in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen.
Eine bevorzugte murine Myeloma-Zelle ist die NS-1 Myeloma-Zell-Linie (auch bezeichnet also P3-NS-1-Ag4-1), welche leicht verfügbar ist von dem NIGMS (Human Genetic Mutant Cell Repository) durch Beantragen der Zell-Linien Zugangs-Nummer GM3573. Eine weitere Myeloma-Zell-Linie, welche in der 8-Azaguanin-resistenten Maus verwendet werden kann, ist die murine Myeloma SP2/0 Non-Producer Zell-Linie.
Verfahren zum Erzeugen von Hybriden von Antikörper-erzeugenden Milz- oder Lymphknoten-Zellen mit Myeloma-Zellen umfassen üblicherweise das Mixen von somatischen Zellen mit Myeloma-Zellen in einem Verhältnis von 2:1, obwohl das Verhältnis von ungefähr 20:1 bis ungefähr 1:1 variieren kann und zwar in der Gegenwart einer Wirksubstanz oder von Wirksubstanzen (chemisch oder elektrisch), welche die Fusion von Zellen Membranen fördern. Fusions-Verfahren unter Verwendung des Sendai-Virus wurden von Kohler und Milstein (1975; 1976) beschrieben und diejenigen unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) wie z.B. 37% (v/v) PEG wurden von Gefter et al. (1977) beschrieben. Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist auch geeignet (Goding PP. 71–74, 1986).
Fusions-Prozeduren erzeugen üblicherweise lebensfähige Hybride in geringen Zahlen (1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Jedoch stellt diese niedrige Frequenz kein Problem dar, da die überlebensfähigen fusionierten Hybride aus den parentalen, unfusionierten Zellen differenziert werden (speziell die nicht-fusionierten Myeloma-Zellen, welche normalerweise unbegrenzt sich weiter teilen würden) durch Kultivieren in einem selektiven Medium. Das selektive Medium ist im Allgemeinen eines, welches ein Agens enthält, welches die de novo Synthese von Nukleotiden in den Gewebskulturmedien blockiert. Exemplarische und bevorzugte Agenzien sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purin-Synthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat eingesetzt wird, wird das Medium angereichert mit Hypoxanthin und Thymidin als Quelle der Nukleotide (HAT-Medium). Wo Azaserin eingesetzt wird, wird das Medium mit Hypoxanthin angereichert.
Das bevorzugte Selektions-Medium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Nukleotid Salvage-Pfade zu betreiben, sind in der Lage, im HAT-Medium zu überleben. Die Myeloma-Zellen haben Defekte in bestimmten Schlüssel-Enzymen des Salvage-Pfades beispielsweise Hypoxanthin Phosphoribosyl Transferase (HPRT) und können folglich nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Pfad betreiben, weisen jedoch eine limitierte Lebensdauer in Kultur auf und sterben im Allgemeinen innerhalb von zwei Wochen ab. Folglich sind die einzigen Zellen, welche in den ausgewählten Medien überleben können, diejenigen Hybride ausgewählt von Myeloma und B-Zellen.
Dieses Kultivieren stellt eine Population von Hybridomas zur Verfügung, von welchen spezifische Hybridomas ausgewählt werden können. Typischerweise wird die Selektion von Hybridomas durchgeführt durch Kultivieren der Zellen durch Einzel-Klon-Verdünnung in Mikrotiter-Platten, gefolgt vom Testen der individuellen klonalen Überstände (nach ungefähr zwei bis drei Wochen) für die gewünschte Reaktivität. Der Assay sollte sensitiv, einfach und schnell sein, wie dies Radioimmunoassays, Enzyme-Immuno-Assays, Cytotoxizitäts-Assays, Plaque-Assays, dot immunobindende Assays und dergleichen sind.
Die ausgewählten Hybridomas würden dann seriell verdünnt und in individuelle Antikörper erzeugende Zell-Linien kloniert, welche unbegrenzt propagiert werden können, um MAbs zur Verfügung zu stellen. Die Zell-Linien können ausgebeutet werden zur MAb-Erzeugung in zwei grundlegenden Art und Weisen. Eine Probe des Hybridoms kann (häufig in die peritoneale Kavität) in ein histokompatibles Tier des Typs initiiert werden, wenn es verwendet wurde, um die somatische und Myeloma-Zellen zur ursprünglichen Fusion zur Verfügung zu stellen. Das injizierte Tier entwickelt Tumore, welche spezifische monoklonale Antikörper erzeugt und das fusionierte Zell-Hybrid sekretiert. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie z.B. Serum- oder Ascites-Flüssigkeit werden dann abgezapft, um MAbs in hoher Konzentration zur Verfügung zu stellen. Die individuellen Zell-Linien könnten auch in vitro kultiviert werden, wo die MAbs natürlicherweise in das Kultur-Medium sekretiert werden, von welchem sie leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. Mabs, erzeugt auf eine von diesen beiden Arten, können weiter aufgereinigt werden, falls dies gewünscht wird, unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren wie z.B. HPLC oder Affinitäts-Chromatographie.
Große Mengen der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch erhalten werden durch Multiplizieren von Hybridoma-Zellen in vivo. Zell-Klone werden in Säugetiere injiziert, welche histokompatibel mit den Vorläufer-Zellen sind, beispielsweise syngenetische Mäuse, um Wachstum von Antikörper-erzeugenden Tumoren zu verursachen. Optional werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff geprimed, speziell mit Ölen wie z.B. Pristan (Tetramethylpentadecan), vor der Injektion.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können Fragmente der monoklonalen Antikörper der Erfindung erhalten werden von den monoklonalen Antikörpern erzeugt wie oben beschrieben, durch Verfahren, welche Verdauen mit Enzymen wie z.B. Pepsin oder Papain einschließen und/oder das Spalten von Disulfid-Brücken durch chemische Reduktion. Alternativ können monoklonale Antikörper-Fragmente umfasst durch die vorliegende Erfindung, synthetisiert werden unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthese-Automatens oder durch Expression eines Voll-Längen-Gens oder von Gen-Fragmenten in E. coli.
Die monoklonalen Konjugate der vorliegenden Erfindung werden hergestellt durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise durch Umsetzen eines monoklonalen Antikörpers hergestellt wie oben beschrieben mit, beispielsweise einem Enzym in der Gegenwart eines koppelnden Agens, wie z.B. Glutaraldehyde oder Periodat. Konjugate mit Fluoreszin-Markern werden hergestellt in der Gegenwart dieses koppelnden Agens oder durch Reaktion mit einem Isothiocyanat. Konjugate mit Metall-Chelaten werden einfach hergestellt. Andere Gruppen, an welche Antikörper konjugiert werden können, schließen Radionukleotide ein, wie z.B. ²H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu und ⁹⁹Tc. Diese sind weitere bedeutsame Label, welche an Antikörper konjugiert werden können. Radioaktiv gelabelte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung werden gemäß wohlbekannten Verfahren im Stand der Technik erzeugt. Beispielsweise können monoklonale Antikörper iodiert werden durch Kontakt mit Natrium- oder Kalium-Iodid und einem chemischen oxidieren Agens wie z.B. Natriumhypochlorid oder einem enzymatisch oxidierenden Agens wie z.B. Lactoperoxidase. Monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können mit Technetium-⁹⁹ durch Ligandenaustausch-Prozess gelabelt werden, beispielsweise durch Reduzieren von Pertechnat mit Zinnlösung, Chelatbilden des reduzierten Technetiums auf einer Sephadex-Säule und Anwenden der Antikörper auf diese Säule oder durch direkte Label-Techniken, beispielsweise durch Inkubieren von Pertechnat, einem reduzierten Agens wie z.B. SnCl₂, einer Pufferlösung wie z.B. Natrium, Kalium-Phthalatlösung und dem Antikörper.
Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet eingesehen werden, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper, spezifisch für HNF1α, HNF1β oder HNF4α (für Proteine, welche in MODY3, MODY4 und MODY1 mutiert sind) Einsatz in verschiedenen Typen von Anwendungen finden werden. Diese können die Produktion von diagnostischen Kits zur Anwendung im Nachweis oder Diagnose von MODY3, MODY4 und MODY1-Typ-Diabetes einschließen. Der geübte Fachmann wird realisieren, dass solche Anwendungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
J. Immunonachweis-Assays
Die Immunonachweis-Assays der vorliegenden Erfindung haben nachweisbaren Einsatz in der Diagnose von Zuständen wie z.B. MODY3, MODY4 und MODY1 verwandter NIDDM. Hier wird eine biologische oder klinische Probe, von der man erwartet, dass sie entweder das kodierte Protein oder Peptid enthält oder ein korrespondierender Antikörper eingesetzt. Jedoch finden diese Ausführungsformen auch Anwendungen für nicht-klinische Proben wie z.B. in Titern von Antigen- oder Antikörper-Proben, in der Auswahl von Hybridomas und dergleichen.
In der klinischen Diagnose des Überwachens von Patienten mit MODY3, MODY4 oder MODY1 ist der Nachweis eines Antigens, kodiert durch eine HNF1α-Nukleinsäure, HNF4α-Nukleinsäure, HNF1β-Nukleinsäure oder die Abnahme in den Spiegeln auf solch eines Antigens, im Vergleich zu Spiegeln in einer korrespondierenden biologischen Probe von einem normalen Subjekt ein Hinweis auf einen Patienten mit MODY3, MODY4 und MODY4 und MODY1. Die Grundlage für solch ein diagnostisches Verfahren liegt teilweise im Auffinden der Tatsache, dass die Nukleinsäuren von HNF1α-, HNF1β- und HNF4α-Mutanten identifiziert in der vorliegenden Erfindung, verantwortlich für MODY3, MODY4 bzw. MODY1 verwandter Diabetes sind. Folglich kann geschlussfolgert werden, dass zumindest einige dieser Mutationen erhöhte Spiegel von kodierten Proteinen erzeugen, welche auch als Marker für MODY3, MODY4 oder MODY1 verwendet werden können.
Die Fachleute auf dem Gebiet sind sehr vertraut mit dem Differenzieren zwischen der signifikanten Expression eines Biomarkers, welcher eine positive Identifikation repräsentiert und niedriger Spiegel oder Hintergrund-Expression eines Biomarkers. Tatsächlich werden Hintergrund-Expressions-Spiegel häufig verwendet, um einen „cut-off" auszubilden, oberhalb von welchem eine erhöhte Färbung als signifikant oder positiv einge stuft wird. Signifikante Expression kann repräsentiert werden durch hohe Grade von Antigenen in Geweben oder innerhalb von Körperflüssigkeit oder alternativ durch einen hohen Anteil von Zellen innerhalb eines Gewebes, welche jeweils ein positives Signal ergeben.
1. Immuno-Nachweisverfahren
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immuno-Nachweisverfahren zum Binden, Aufreinigen, Entfernen, Quantifizieren oder sonst wie allgemein Nachweisen von biologischen Komponenten. Die kodierten Proteine oder Peptide der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um Antikörper nachzuweisen mit einer Reaktivität damit oder alternativ Antikörper, hergestellt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um die kodierten Proteine oder Peptide nachzuweisen. Die Schritte verschiedener bedeutsamer Immun-Nachweisverfahren wurden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben wie z.B. in Nakamura et al. (1987).
Im Allgemeinen schließen die Immunobindungs-Verfahren das Erhalten einer Probe ein, von der man erwartet, dass sie ein Protein, Peptid oder Antikörper enthält, sowie das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper oder Protein oder Peptid in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, je nach Fall, unter Bedingungen, welche effektiv sind, die Ausbildung von Immunokomplexen zu ermöglichen.
Die Immunobindungs-Verfahren schließen Verfahren zum Nachweis oder Quantifizieren der Menge einer reaktiven Komponente in einer Probe ein, wobei diese Verfahren den Nachweis oder die Quantifizierung von irgendwelchen Immun-Komplexen, ausgebildet während des Bindungsprozesses benötigen. Hier würde man eine Probe erhalten, von der man erwartet, dass sie ein HNF1α oder HNF1β-Mutanten kodiertes Protein enthält, ein Peptid oder einen korrespondierenden Antikörper, und man würde die Probe mit einem Antikörper bzw. einem kodierten Protein oder Peptid in Kontakt bringen, je nach Situation, und anschließend die Menge der Immun-Komplexe, welcher unter spezifischen Bedingungen ausgebildet wird, nachweisen oder quantifizieren.
Im Hinblick auf den Antigen-Nachweis kann die biologische Probe, die analysiert werden soll, irgendeine Probe sein, von der man erwartet, dass sie ein HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Antigen enthält, wie z.B. Pankreas-β-Zellen, einen homogenisierten Gewebs-Extrakt, eine isolierte Zelle, eine Zellmembran-Präparierung, abgetrennte oder aufgereinigte Formen von irgendwelchen der oben genannten Protein-enthaltenden Zusammensetzungen oder sogar irgendwelche biologische Flüssigkeiten, welche in Kontakt kommen mit diabetischem Gewebe, einschließend Blut.
Inkontaktbringen der ausgewählten biologischen Probe mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter Bedingungen, welche effektiv sind für einen Zeitraum, hinreichend, um die Ausbildung von Immunokomplexen (pimären Immunokomplexen) zu erlauben, ist im Allgemeinen eine Frage des einfachen Zugebens der Zusammensetzung zu einer Probe und des Inkubierens der Mischung über einen Zeitraum, welcher lang genug ist, damit sich die Antikörper-Immunokomplexe mit irgendwelchen vorliegenden Antikörpern ausbilden, d.h. an irgendwelche vorliegenden Antikörper binden. Nach dieser Zeit werden die Proben-Antikörper-Zusammensetzungen wie z.B. ein Gewebsschnitt, eine ELISA-Platte, Dot Blot oder Western Blot im Allgemeinen gewaschen, um irgendwelche nicht-spezifisch gebundene Antikörper-Spezies zu entfernen, was nur den spezifisch mit dem primären Immunkomplex gebundenen Antikörpern ermöglicht, nachgewiesen zu werden.
Im Allgemeinen ist der Nachweis der Immunokomplex-Ausbildung im Stand der Technik wohlbekannt und kann erreicht werden durch die Anmeldung verschiedener Ansätze. Diese Verfahren sind im Allgemeinen basiert auf dem Nachweis eines Labels oder Markers wie z.B. irgendwelchen radioaktiven, fluoreszenten, biologischen oder enzymatischen Tags oder Labels, welche üblicherweise im Stand der Technik eingesetzt werden. US-Patente, welche die Anwendung solcher Label betreffen, schließen ein, 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 und 4.366.241, alle hier per Verweis eingeschlossen. Natürlicherweise wird man weitere Vorteile finden durch die Anwendung eines Sekundär-bindenden Ligandens, wie z.B. eines sekundären Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Liganden bindenden Anordnung, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Das kodierte Protein, Peptid oder der korrespondierende Antikörper, welcher in dem Nachweis eingesetzt wird, kann selbst an einen nachweisbaren Label verknüpft sein, wobei man dann einfach diesen Label nachweisen würde, um die Menge der primären immunkomplexe in der Zusammensetzung zu bestimmen.
Alternativ kann die erste hinzugegebene Komponente, welcher innerhalb der primären Immun-Komplexe gebunden werden wird, nachgewiesen werden durch Mittel eines zweiten bindenden Ligandens, welcher Bindungsaffinität für das kodierte Protein, Peptid oder den korrespondierenden Antikörper aufweist. In diesen Fällen kann der zweite bindende Ligand an einen nachweisbaren Label verknüpft sein. Der zweite bindende Ligand ist selbst häufig ein Antikörper, welcher wiederum als „sekundärer" Antikörper bezeichnet wird. Die primären Immun-Komplexe werden in Kontakt gebracht mit dem gelabelten, sekundär bindenden Liganden oder Antikörper und zwar unter Bedingungen, welche effektiv über einen Zeitraum sind, welcher hinreichend ist, um die Ausbildung von sekundären Immun-Komplexen zu ermöglichen. Die sekundären Immun-Komplexe werden dann im Allgemeinen gewaschen, um irgendwelche nicht-spezifisch gebundenen gelabelten sekundären Antikörper oder Liganden zu entfernen und die verbleibenden Label in den sekundären Immun-Komplexen werden dann nachgewiesen.
Weitere Verfahren schließen den Nachweis von primären Immun-Komplexen durch einen zweischrittigen Ansatz ein. Ein zweiter bindender Ligand, wie z.B. Antikörper, welcher Bindungsaffinität für das kodierte Protein, Peptid oder den korrespondierenden Antikörper aufweist, wird verwendet, um sekundäre Immun-Komplexe, wie oben beschrieben, auszubilden. Nach dem Waschen werden die sekundären Immun-Komplexe mit einem dritten bindenden Liganden oder Antikörper in Kontakt gebracht, welcher Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wiederum unter Bedingungen, welche effektiv sind und für einen Zeitraum, welcher hinreichend ist, um die Ausbildung von Immun-Komplexen zu ermöglichen (Tertiärer Immunkomplex). Der dritte Ligand oder Antikörper wird an einen nachweisbaren Label verknüpft, was den Nachweis der tertiären Immun-Komplexe, die so ausgebildet wurden, ermöglicht. Dieses System kann Signal-Amplifikationen, falls gewünscht, zur Verfügung stellen.
2. Immunohistochemie
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch im Zusammenhang mit sowohl frisch gefrorenen als auch Formalin-fixierten, Paraffin-eingebundenen Gewebsblöcken, hergestellt für Untersuchungen durch Immunohistochemie (ICH) eingesetzt werden. Beispielsweise besteht jeder Gewebs-Block aus 50 mg vom verbleibenden „pulverisierten" diabetischen Gewebe. Das Verfahren des Herstellens von Gewebs-Blöcken von diesen speziellen Proben wurde erfolgreich eingesetzt in früheren IHC-Untersuchungen von verschiedenen prognostischen Faktoren und ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
Kurz gesagt können gefrorene Schnitte hergestellt werden durch Rehydrieren von 50 ng von gefrorenem „pulverisiertem" diabetischen Gewebe bei Raumtemperatur in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) in kleinen Plastikkapseln; Pelletieren der Partikel durch Zentrifugation; Resuspendieren in einem Viskos-einbettendem Medium (OCT); Invertieren der Kapsel und erneutes Pelletieren durch Zentrifugation; Fallen-Einfrieren in –70°C Isopentan; Schneiden der Plastik-Kapsel und Entfernen des gefrorenen Zylinders des Gewebes; Sicherstellen des Gewebs-Zylinders auf einer Cryostat-Mikrotom-Spannvorrichtung und Schneiden von 25–50 seriellen Schnitten.
Permanente Schnitte können hergestellt werden durch ein ähnliches Verfahren involvierend die Rehydration der 50 mg Probe in einer Plastik-Mikrofugen-Tube; Pelletieren; Resuspendieren in 10% Formalin für 4 Stunden Fixieren; Waschen/Pelletieren; Resuspendieren in warmem 2,5%igen Agar; Pelletieren; Kühlen in Eiswasser, um den Agar auszuhärten; Entfernen des Gewebes/Agar-Blocks aus der Tube; Infiltrieren und Einbinden des Blocks in Paraffin; und Schneiden von bis zu 50 seriellen permanenten Schnitten.
3. ELISA
Wie erwähnt, ist angedacht, dass die kodierten Proteine oder Peptide der Erfindung Einsatz finden werden als Immunogene (beispielsweise in Verknüpfung mit der Impfstoff-Entwicklung, in der Immunohistochemie und in ELISA-Assays). Eine einleuchtende Einsatzmöglichkeit der kodierten Antigene und der korrespondieren Antikörper ist in Im munoassays zum Nachweis von HNF1α, HNF1β und HNF4α, von mutierten Proteinen, wie diese in der Diagnose und prognostischen Überwachung von MODY benötigt wird.
Immunoassays in ihrer einfachsten Form und in direktem Sinne sind Bindungs-Assays. Bestimmte bevorzugte Immuno-Assays sind die verschiedenen Typen von Enzymverknüpften Immunosorbenten Assays (ELISA), und Radioimmunoassays (RIA), welche im Stand der Technik bekannt sind. Immunohistochemischer Nachweis unter Verwendung von Gewebs-Schnitten ist auch besonders bedeutsam. Jedoch wird leicht eingesehen werden, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken begrenzt ist und das western blotten, dot blotten, FACS-Analysen und dergleichen auch eingesetzt werden können.
In einem exemplarischen ELISA werden Antikörper, welche an die kodierten Proteine der Erfindung binden, auf eine ausgewählte Oberfläche welche Protein-Affinität zeigt, immobilisiert, wie z.B. ein Well in einer Polystyrerol-Mikrotiter-Platte. Anschließend wird eine Test-Zusammensetzung, von der man erwartet, dass sie die HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutante enthält, wie z.B. eine klinische Probe, zu den Wells hinzugegeben. Nach dem Binden und Waschen, um die nicht-spezifisch gebundenen Immunkomplexe zu entfernen, können die gebundenen Antikörper nachgewiesen werden. Der Nachweis wird im Allgmeinen erreicht durch Zugabe eines zweiten Antikörpers, spezifisch für das Target-Protein, welcher an einem nachweisbaren Label verknüpft ist. Dieser Typ von ELISA ist ein einfacher „Sandwich ELISA". Der Nachweis kann auch realisiert werden durch die Zugabe eines zweiten Antikörpers, gefolgt von der Zugabe eines dritten Antikörpers, welcher eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wobei der dritte Antikörper an einen nachweisbaren Label gebunden ist.
In einem weiteren exemplarischen ELISA werden die Proben, von denen man erwartet, dass sie das Mutanten-HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Antigen enthalten, auf eine Well-Oberfläche immobilisiert und anschließend mit den Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht wird. Nach Binden und Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Immun-Komplexe zu entfernen, wird das gebundene Antigen nachgewiesen. Wo die ursprünglichen Antikörper an einen nachweisbaren Label geknüpft sind, können die Immun-Komplexe direkt nachgewiesen werden. Wiederum können Immun-Komplexe nachgewiesen werden unter Verwendung eines zweiten Antikörpers, welcher an die Bindungsaffinität an den ersten Antikörper aufweist, wobei der zweite Antikörper an einen nachweisbaren Label verknüpft ist.
Ein weiterer ELISA, in welchem die Proteine oder Peptide immobilisiert sind, involviert die Anwendung der Antikörper-Kompetition in der Detektion. In diesem ELISA werden gelabelte Antikörper zu den Wells hinzugegeben, man ermöglicht ihnen an das Mutanten-HNF1α-Protein zu binden, bzw. das Mutanten-HNF1β-Protein oder das Mutanten-HNF4α-Protein, und detektiert sie mit Hilfe ihrer Label. Die Menge des Marker-Antigens in einer unbekannten Probe wird dann bestimmt durch Vermischen der Probe mit den gelabelten Antikörpern vor oder während der Inkubation mit den gecoateten Wells. Die Gegenwart des Marker-Antigens in der Probe bewirkt, dass die Menge des Antikörpers, verfügbar zum Binden an die Wells, reduziert wird und folglich das ultimative Signal reduziert wird. Dieses Prinzip ist geeignet zum Nachweis von Antikörpern in einer unbekannten Probe, wobei die ungelabelten Antikörper an die Antigen-gecoateten Wells binden und auch die Menge von Antigen verfügbar, die gelabelten Antikörper zu binden, verringern.
Unabhängig von dem eingesetzten Format haben ELISA's bestimmte Merkmale gemeinsam, wie z.B. das Coaten, Inkubieren oder Binden, Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Spezies zu entfernern sowie das Nachweisen von gebundenen Immun-Komplexen. Diese Gemeinsamkeiten werden wie folgt beschrieben:
Beim Coaten einer Platte, entweder mit Antigen oder Antikörper, wird man im Allgmeinen die Wells der Platte mit einer Lösung des Antigens oder Antikörpers inkubieren, entweder über Nacht oder für einen spezifischen Zeitraum von Stunden. Die Wells der Platte werden dann gewaschen, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen. Irgendwelche verbleibenden verfügbaren Oberflächen der Wells werden dann mit einem nicht-spezifischen Protein„gecoatet", welches Antigen-neutral ist im Hinblick auf die Test-Antiseren. Diese schließen Rinderserum Albumin (BSA, bovine serum albumin), Casein und Lösungen von Milch-Pulver ein. Das Coaten von nicht-spezifischen Adsorptions-Stellen auf der immobilisierten Oberfläche reduziert den Hintergrund, erzeugt durch nicht-spezifisches Binden der Antiseren an die Oberfläche.
In ELISAs ist es wahrscheinlicherweise günstiger, ein zweites oder ein drittes Nachweismittel anstelle einer direkten Prozedur einzusetzen. Folglich wird nach dem Binden eines Proteins oder Antikörpers an das Well, dem Coaten mit einem nicht-reaktiven Material, um den Hintergrund zu reduzieren, und dem Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, die immobilisierende Oberfläche in Kontakt gebracht mit den Kontroll-MODY3-, MODY4- oder MODY1- und/oder klinischen oder biologischen Proben, welche getestet werden sollen, unter Bedingungen, welche effektiv sind, um die Immun-Komplexe (Antigen/Antikörper)-Ausbildung zu ermöglichen. Der Nachweis des Immun-Komplexes benötigt dann einen gelabelten sekundären bindenden Liganden oder Antikörper oder einen sekundär-bindenden Liganden oder Antikörper in Verknüpfung mit einem gelabelten tertiaren Antikörper oder einem dritten bindenden Liganden.
„Unter Bedingungen effektiv, um die Ausbildung des Immun-Komplexes (Antigen/Antikörper) zu ermöglichen, bedeutet, dass die Bedingungen bevorzugt das Verdünnen der Antigene und Antikörper mit Lösungen, wie z.B. BSA, Rindergammaglobulin (BGG, bovine gamma globulin) und Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS)/Tween^TM, einschließen. Diese hinzugegebenen Agenzien tendieren auch dazu, die Reduktion des nicht-spezifischen Hintergrundes zu assistieren.
Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten auch, dass die Inkubation bei der Temperatur durchgeführt wird und über einen Zeitraum, welcher hinreichend ist, effektives Binden zu ermöglichen. Inkubations-Schritte werden typischerweise von ungefähr 1 bis 2 bis 4 Stunden, bei Temperaturen vorzugsweise in der Größenordnung von 25°C bis 27°C oder möglicherweise über Nacht für ungefähr 4°C usw. liegen.
Folgend auf alle Inkubationsschritte in einem ELISA wird die kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-komplexiertes Material zu entfernen. Eine bevorzugte Wasch-Prozedur schließt das Waschen mit einer Lösung ein, wie z.B. PBS/Tween^TM oder Borat-Puffer. Folgend auf die Ausbildung von spezifischen Immun-Komplexen zwischen der Testprobe und dem ursprünglich gebundenen Material und auf das nachfolgende Waschen kann das Auftreten selbst kleinster Mengen von Immunkomplexen bestimmt werden.
Um Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, werden der zweite oder dritte Antikörper einen assoziierten Label aufweisen, um den Nachweis zu ermöglichen. Vorzugsweise wird dieser Label ein Enzym sein, welches eine Farb-Entwicklung erzeugt nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat. Folglich wird man beispielsweise wünschen, den ersten oder zweiten Immun-Komplex mit einem Urease, Glukoseoxidase-alkalischer Phosphatase oder Wasserstoff-Peroxidase-konjugierten Antikörper über einen Zeitraum und unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, welche die Entwicklung weiterer Immun-Komplex-Ausbildung favorisieren (beispielsweise Inkubation über 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung wie z.B. PBS-Tween^TM).
Nach Inkubation mit dem gelabelten Körper und nachfolgendem Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge des Labels quantifiziert, beispielsweise durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie z.B. Harnstoff und Bromocresol purple oder 2,2'-Azido-di-(3-Ethyl-Benzthiazolin)-6-Sulfonsäure [ABTS] und H₂O₂ im Falle von Peroxidase als dem enzymatischen Label. Quantifikation wird dann erreicht durch Messen des Grades der Farb-Erzeugung, beispielsweise unter Verwendung eines sichtbaren Spectra Spektrophotometers.
4. Anwendung von Antikörpern zum Radioimaging
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden eingesetzt, um die Expression von kodierten Marker-Proteinen zu quantifizieren und lokalisieren. Der Antikörper wird beispielsweise durch irgendeines einer Vielzahl von Verfahren gelabelt und eingesetzt, um die lokalisierte Konzentration der Zellen, welche das kodierte Protein erzeugen, zu visualisieren. Solach ein Assay wird auch die subzelluläre Lokalisierung des Proteins zutage fördern, was diagnostische wie auch therapeutische Anwendungen nach sich ziehen kann.
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon durch irgendeine von verschiedenen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, gelabelt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch paramagnetische Isotope zum Zwecke des in vivo-Nachweises einsetzen.
Elemente, welche speziell bedeutsam im magnetischen Resonanz-Imaging („MRI", Magnetic Resonance Imaging) sind, schließen ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe ein.
Die Verabreichung des gelabelten Antikörpers kann lokal oder systemisch sein und intravenös realisiert werden, intraarteriell, über die spinale Flüssigkeit oder dergleichen. Die Verabreichung kann auch intradermal oder intrakavitär sein, abhängend von der Körpergröße, welche untersucht wird. Nach dem Verstreichen einer hinreichenden Zeitspanne, so dass der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon mit einem erkrankten Gewebe binden kann, beispielsweise nach 30 Minuten bis 48 Stunden wird die Körperstelle des Subjektes, welches untersucht wird, durch routinemässige Imaging-Techniken, wie z.B. MRI, SPECT, planarem Scintillation-Imaging oder neu entstehenden Imaging-Techniken untersucht. Das exakte Protokoll wird notwendigerweise variieren, abhängig von den Faktoren spezifisch für den Patienten, wie oben erwähnt, und abhängig von der Körperstelle, die untersucht wird, vom Verfahren der Abreichung und vom Typ des verwendeten Labels; die Bestimmung spezifischer Prozeduren wird für den Fachmann Routine sein. Die Verteilung des gebundenen radioaktiven Isotops und sein Anstieg oder seine Abnahme innerhalb der Zeit wird dann untersucht und aufgezeichnet. Durch vergleichende Ergebnisse mit Daten erhalten aus Studien von klinischen normalen Individuen kann das Vorliegen und die Menge des kranken Gewebes bestimmt werden.
Es wird für die Fachleute wieder offensichtlich sein, dass ein ähnlicher Ansatz verwendet werden kann, um die Produktion von codierten HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutanten-Proteinen in menschlichen Patienten radio-bildgebend darzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die in vivo-Diagnose von MODY3, MODY4 oder MODY1 in einem Patienten zur Verfügung. Solche Verfahren schließen im Allgemeinen ein das Verabreichen eines HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutanten-spezifischen Antikörpers in der effektiven Menge, wobei an den Antikörper ein Marker konjugiert ist, wie z.B. ein radioaktives Isotop oder ein Spin-gelabeltes Molekül, welches durch nicht-invasive Verfahren nachgewiesen werden kann. Das Antikörper-Marker-Konjugat lässt man über hinreichende Zeit stehen, so dass es in Kontakt mit reaktiven Antigenen kommt, welche innerhalb von Geweben des Patienten liegen und der Patient wird dann einem Detektions-Gerät ausgesetzt, um den nachweisbaren Marker zu identifizieren.
5. Kits
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Immuno-Nachweis-Kits zur Anwendung mit dem Immuno-Nachweis-Verfahren wie oben beschrieben. Da die kodierten Proteine oder Peptide eingesetzt werden können, um Antikörper zu detektieren und die korrespondierenden Antikörper eingesetzt werden können, um kodierte Proteine oder Peptide nachzuweisen, kann eine oder können beide solcher Komponenten in dem Kits zur Verfügung gestellt werden. Der Immuno-Nachweis-Kit wird folglich in geeigneten Container-Mitteln ein kodiertes Protein oder Peptid umfassen und einen ersten Antikörper, welcher an das kodierte Protein oder das kodierte Peptid bindet sowie ein Immuno-Nachweis-Reagenz.
In bestimmten Ausführungsformen kann das kodierte Protein oder Peptid oder der erste Antikörper, welcher an das kodierte Protein oder Peptid bindet, an eine feste Unterlage gebunden sein, wie z.B. eine Säulen-Matrix oder ein Well einer Mikrotiter-Platte.
Die Immuno-Nachweis-Reagenzien des Kits können eine der Vielfalt von Formen einnehmen, einschließend diejenigen nachweisbaren Label, welche assoziiert sind mit oder verknüpft sind an den gegebenen Antikörper oder das gegebene Antigen sowie nachweisbare Label, welche assoziiert sind mit oder angebunden sind an sekundärbindende Liganden. Exemplarische sekundäre Liganden sind diejenigen sekundären Antikörper, welche Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das erste Antigen aufweisen und sekundäre Antikörper, welche Bindungsaffinität für einen menschlichen Antikörper aufweisen.
Weitere geeignete Immuno-Nachweis-Reagenzien zur Anwendung in den vorliegenden Kits schließen die Zwei-Komponenten-Reagenzien ein, welche einen sekundären Antikörper umfassen, welcher eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das erste Antigen aufweist, zusammen mit einem dritten Antikörper, welcher eine Bindungsaffinität aufweist für den zweiten Antikörper, wobei der dritte Antikörper mit einem nachweisbaren Label verknüpft ist.
Die Kits können des weiteren eine geeignet aliquotierte Zusammensetzung des kodierten Proteins oder Polypeptid-Antigens umfassen, entweder gelabelt oder ungelabelt, so wie sie verwendet werden kann, um eine Standard-Kurve für einen Nachweis-Assay zu erzeugen.
Die Kits können Antikörper-Label-Konjugate enthalten, entweder in vollständig konjugierter Form, in der Form von Zwischenprodukten oder als separate Gruppen, welche durch den Anwender des Kits konjugiert werden müssen. Die Komponenten des Kits können entweder in wässrigen Medien oder in lyophilisierter Form verpackt sein.
Die Container-Mittel der Kits werden im Allgemeinen zumindest eine Phiole enthalten, eine Testtube, einen Kolben, eine Flasche, eine Spitze oder andere Container-Mittel, in welche der Antikörper oder das Antigen platziert werden können und vorzugsweise geeignet aliquotiert werden können. Wo ein zweiter oder ein dritter bindender Ligand oder eine zusätzliche Komponente zur Verfügung gestellt wird, wird der Kit auch einen zweiten, dritten oder weiteren zusätzlichen Container enthalten, in welchen dieser Ligand oder diese Komponente platziert werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise auch ein Mittel enthalten zum Enthalten des Antikörpers, Antigens und irgendwelche andere Reagenz-Container in geschlossener Verpackung zum kommerziellen Vertrieb. Solche Container können Injektions- oder eingeschmolzene Plastik-Container enthalten, in welchen die gewünschten Phiolen aufbewahrt werden.
K. Nachweis und Quantifizierung von Nukleinsäure-Spezies
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis von HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutanten in einer biologischen Probe durch Amplifizieren und Nachweis von Nukleinsäuren korrespondierend mit HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutanten. Die biologische Probe kann irgendein Gewebe sein oder eine Flüssigkeit, in welchen diese Mutanten vorliegen können. Verschiedene Ausführungsformen schließen β- und α-Zellen von Langerhals-Inselchen (Pancreas Islets), Knochenmarks-Saug-Biopsien, Knochenmarks-Biopsien, Lymphknot-Saug-Biopsien, Lymphknot-Biopsien, Milz-Gewebe, Feinnadel-Saug-Biopsien, Haut-Biopsien oder organischen Gewebs-Biopsien ein. Weitere Ausführungsformen schließen Proben ein, wo die Körperflüssigkeit perepherales Blut, Lymphflüssigkeit, Ascites, Serumflüssigkeit, Pleural-Effusion, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Lacrimalflüssigkeit, Stuhl oder Urin ist.
Nukleinsäuren, verwendet als Templat zur Amplifikation werden aus Zellen isoliert, enthalten in der biologischen Probe gemäß Standardverfahren (Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann genomische DNA sein oder fraktionierte oder Gesamtzell-RNA. Wo RNA verwendet wird, kann es wünschenswert sein, die RNA in eine komplementäre DNA umzuwandeln. In einer Ausführungsform ist die RNA-Gesamtzell-DNA und wird direkt als Templat-zur Amplifikation verwendet.
Paare von Primern, welche selektiv an Nukleinsäuren hybridisieren, korrespondierend mit HNF1α-, HNF1β- oder HNF1α-Mutanten, werden in Kontakt gebracht mit der isolierten Nukleinsäure unter Bedingungen, welche die selektive Hybridisierung ermöglichen. Sobald hybridisiert, wird der Nukleinsäure:Primer-Komplex mit einem oder mehreren Enzymen in Kontakt gebracht, welche eine Templat-abhängige Nukleinsäure-Synthese ermöglichen. Mehrere Durchläufe der Amplifikation, welche auch als „Zyklen" bezeichnet werden, werden durchgeführt, bis eine hinreichende Menge des Amplifikationsproduktes hergestellt wird.
Als Nächstes wird das Amplifikations-Produkt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann die Detektion durchgeführt werden durch visuelle Mittel. Alternativ kann die Detektion die indirekte Identifikation des Produktes über Chemilumineszenz, radioaktive Scintigraphie des eingebrachten Radiolabels oder fluoreszierenden Labels oder sogar mittels eines Systems unter Verwendung von elektrischen oder thermalen Impuls-Signalen (Affymax technology; Bellus 1994) involvieren.
Auf die Detektion folgend kann man die Ergebnisse, welche für einen bestimmten Patienten erscheinen, mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe normaler Patienten vergleichen bzw. mit MODY oder tatsächlich MODY-abhängigen Diabetikern und nicht-MODY-abhängigen Diabetikern. Auf diese Weise wird es möglich, die Menge von HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Mutanten, welche nachgewiesen wurden, mit verschiedenen klinischen Zuständen zu korrelieren.
1. Primer
Die Bezeichnung „Primer", wie hier definiert, soll jegliche Nukleinsäure einschließen, welche in der Lage ist, die Synthese einer natürlichen Nukleinsäure in einem Templatabhängigen Prozess zu primen. Typischerweise sind Primer Oligonukleotide von zehn bis zwanzig Basenpaaren an Länge, jedoch können längere Sequenzen eingesetzt werden. Primer können in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form zur Verfügung gestellt werden, obwohl die einzelsträngige Form bevorzugt ist.
2. Templatabhängige Amplifikations-Verfahren
Eine Vielzahl von Templat-abhängigen Verfahren sind verfügbar, um Marker-Sequenzen, welche in einer gegebenen Templat-Probe vorliegen, zu amplifizieren. Eines der bestbekannten Amplifikations-Verfahren ist die Polymeraseketten-Reaktion (hier als PCR bezeichnet), welche im Detail beschrieben wird in U.S.-Patent Nm. 4.683.195, 4.683.202 und 4.800.159 bzw. Innis et al., 1990), wobei alle diese Referenzen hier vollständig per Verweis eingeschlossen sind.
Kurzgesagt werden in der PCR zwei Primer-Sequenzen hergestellt, welche komplementär sind mit Regionen auf entgegengesetzt komplementären Strängen der Marker-Sequenz. Ein Überschuss an Deoxynukleosid-Triphosphaten wird zu einer Reaktionsmischung hinzugegeben, zusammen mit einer DNA-Polymerase, beispielsweise Tag-Polymerase. Falls die Marker-Sequenz in einer Probe vorliegt, werden die Primer an den Marker binden, und die Polymerase wird verursachen, dass die Primer über die Marker-Sequenz durch Hinzugabe von Nukleotiden verlängert wird. Durch Anheben und Absenken der Temperatur der Reaktionsmischung werden die verlängerten Primer von dem Marker dissoziieren, um Reaktionsprodukte zu formen, überschüssiger Primer wird an den Marker binden, wie auch an Reaktionsprodukten und der Prozess beginnt von Neuem.
Eine reverse Transkriptase-PCR-Amplifikation-Prozedur kann durchgeführt werden, um die Menge der amplifizierten mRNA zu quantifizieren. Verfahren des reversen Transkribierens von RNA nach cDNA sind wohlbekannt und werden beschrieben in Sambrook et al., 1989. Alternative Verfahren zur reversen Transkription setzen thermo stabile RNA-abhängige DNA-Polymerasen ein. Diese Verfahren werden beschrieben in WO 90/07641, eingereicht am 21. Dezember 1990. Polymeraseketten-Reaktions-Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Ein weiteres Verfahren zur Amplifikation ist die Ligase-Kettenreaktion („LCR"), offenbart in EP-A-320 308. In der LCR werden zwei komplementäre Sonden-Paare hergestellt und in der Gegenwart der Target-Sequenz wird jedes Paar an entgegengesetzt komplementäre Stränge des Targets binden, so dass sie angrenzen. In der Gegenwart einer Ligase werden die beiden Sonden-Paare verknüpft, so dass sie eine einzelne Einheit bilden. Durch Temperatur-Zyklisieren, dissoziieren die gebundenen ligierten Einheiten – wie in der PCR – von den Targets und dienen dann als „Target-Sequenzen" zur Ligation der überschüssigen Sonden-Paare. US-Patent 4.883.750 beschreibt ein Verfahren ähnlich zu LCR zum Binden von Sonden-Paaren an eine Target-Sequenz.
Qbeta-Replicase, beschrieben in WO87/06270. kann auch als ein weiteres Amplifikations-Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz von RNA, welche eine Region aufweist, komplementär zu derjenigen eines Targets. zu einer Probe in der Gegenwart einer RNA-Polymerase hinzugegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, welche dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermales Amplifikationsverfahren, in welchem die Restriktons-Endonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Targetmolekülen zu erreichen, welche Nukleotid-5'-[alpha-thio]-Triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten, kann auch bedeutsam in der Amplifikation der Nukleinsäure in der vorliegenden Erfindung sein, Walker et al., 1992.
Strang-Ablösungs-Amplifikation (SDA, Strand Displacement Amplification) ist ein weiteres Verfahren zum Durchführen der isothermalen Amplifikation von Nukleinsäuren, welches viele Runden des Strang-Ablösens und der Synthese, d.h. eine just in time-Translation einschließt. Ein ähnliches Verfahren, genannt reparierende Kettenreaktion (RCR, Repair Chain Reaction) involviert das Annealen von mehreren Sonden über eine Region, welche amplifiziert werden soll, gefolgt von einer reparierenden Reaktion, in welche nur zwei der vier Basen vorliegen. Die anderen beiden Basen können als biotinylierte Derivate zum einfachen Nachweis hinzugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz wird in SDA eingesetzt. Target-spezifische Sequenzen können auch nachgewiesen werden unter Verwendung einer zyklischen Sonden-Reaktion (CPR). In der CPR wird eine Sonde mit 3'- und 5'-Sequenzen von nicht-spezifischer DNA und einer mittleren Sequenz von spezifischer RNA an DNA hybridisiert, welche in einer Probe vorliegt. Nach Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde werden als unterschiedliche Produkte identifiziert, welche nach Verdauung freigesetzt werden. Das ursprüngliche Templat wird an eine andere zyklisierende Sonde annealt und die Reaktion wird wiederholt.
Noch weitere Amplifikations-Verfahren, beschrieben in GB-A-2 202 328 und in WO89/09284 können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In der oben genannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR-ähnlichen, Templat- und Enzym-abhängigen Synthese eingesetzt. Die Primer können modifiziert werden durch Label mit einer einfangenden Gruppe (beispielsweise Biotin) und/oder einer nachweisenden Gruppe (beispielsweise einem Enzym). In der letztgenannten Anmeldung wird ein Überschuss an gelabelten Sonden zu einer Probe hinzugegeben. In der Anwesenheit einer Target-Sequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach dem Spalten wird die Target-Sequenz intakt freigesetzt, um durch überschüssige Sonde gebunden zu werden. Spalten der gelabelten Sonde signalisiert das Vorliegen der Target-Sequenz. Weitere Nukleinsäure-Amplifikations-Prozeduren schließen Transkriptions-basierte Amplifikations-Systeme (TAS), einschließend Nukleinsäure-Sequenz basierte Amplifikationen (NASBA) sowie 3SR (Kwoh et al., 1989); Gingeras et al., WO 88/10315, ein. In NASBA können die Nukleinsäuren hergestellt werden zur Amplifikation durch übliche Phenol/Chloroform-Extraktion, Nitzedenaturieren einer klinischen Probe, Behandlung mit Lysispuffer und Minispin-Säulen zur Isolation von DNA und RNA oder Guanidinchlorid-Extraktion von RNA. Diese Amplifikations-Techniken involvieren das Annealen eines Primers, welcher Target-spezifische Sequenzen aufweist. Folgend auf die Polymerisation werden die DNA/RNA-Hybride verdaut mit der RNase H während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut denaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA vollständig doppelsträngig gemacht durch Zugabe zweiter Target-spezifischer Primer, gefolgt von Polymerisierung. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann multiple transkribiert durch eine RNA-Polymerase wie z.B. T7 oder SP6. In einer isothermalen zyklischen Reaktion werden die RNA's revers transkribiert in einzelsträngige DNA, welche dann in doppelsträngige DNA konvertiert wird, und anschließend nochmals transkribiert mit einer RNA-Polymerase, wie z.B. T7 oder SP6. Die resultierenden Produkte, entweder verkürzt oder vollständig, zeigen Target-spezifische Sequenzen an. Davey et al., EP-A-329 822 offenbart einen Nukleinsäure-Amplifikations-Prozess involvierende das zyklische Synthetisieren von einzelsträngigen RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngige DNA (dsDNA), welche in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die ssRNA ist ein Templat für ein erstes Primer-Oligonukleotid, welches durch reverse Transkriptase elongiert wird (RNA-abhängige DNA-Polymerase). Die RNA wird dann von dem resultierenden DNA:RNA-Duplex durch die Wirkung der Ribonuclease H (RNase H, einer RNase spezifisch für RNA im Duplex entweder mit DNA oder RNA) entfernt. Die resultierende ssDNA ist ein Templat für einen zweiten Primer, welcher auch die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors enthält (beispielhaft dargestellt durch T7 RNA-Polymerase), 5' zu seiner Homologie mit dem Templat. Dieser Primer wird dann verlängert durch DNA-Polymerase (beispielhaft dargestellt durch das große „Klenow"-Fragment von E. coli DNA-Polymerase), was in einem doppelsträngigen DNA („dsDNA")-Molekül resultiert, mit einer Sequenz identisch zu derjenigen der ursprünglichen RNA zwischen den Primern und zusätzlich dazu aufweisend an einem Ende eine Promotor-Sequenz. Diese Promotor-Sequenz kann verwendet werden durch die geeignete RNA-Polymerase, um viele RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann erneut in den Zyklus einfließen, was zu einer sehr raschen Amplifikation führt. Durch die eigene Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isotherm durchgeführt werden ohne Zugreifen von Enzymen auf jeden Zyklus. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Prozesses kann die Ausgangssequenz in der Form entweder von DNA oder RNA gewählt werden.
Miller et al. WO 89/06700 offenbaren eine Nukleinsäure-Sequenz-Amplifikations-Übersicht, basierend auf der Hybridisierung einer Promotor/Primer-Sequenz an eine einzelsträngige Target-DNA („ssDNA"), gefolgt von Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d.h. neue Template werden nicht hergestellt aus den resultierenden RNA-Transkripten. Andere Amplifikations-Verfahren schließen „RACE" und „einseitige PCR" (Frohman, M. A., In: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, N. Y., 1990; Ohara et al., 1989 ein.
Verfahren basierend auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden in der Gegenwart von Nukleinsäure mit der Sequenz des resultierenden „di-Oligonukleotide", wodurch die di-Oligonukleotide amplifiziert werden, können auch in dem Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wu et al., 1989).
3. RNase-Schutz-Assay
Verfahren zum genetischen Screenen durch Identifizieren von Mutationen assoziiert mit den meisten genetischen Erkrankungen, wie z.B. Diabetes, müssen in der Lage sein, große Regionen des Genoms auszuwerten. Sobald eine relevante Mutation in einem gegebenen Patienten identifiziert worden ist, können andere Familien-Mitglieder und betroffene Individuen gescreent werden unter Verwendung von Verfahren, welche auf diese Stelle abzielen. Die Fähigkeit, verteilte Punkt-Mutationen nachzuweisen, ist kritisch für die genetische Beratung, Diagnose und den frühen klinischen Eingriff, wie auch für die Forschung hinsichtlich der Etiologie von Krebs oder anderen genetischen Erkrankungen. Das ideale Verfahren zum genetischen Nachweis sollte schnell, billig und akkurat alle Typen von weitverbreiteten Mutationen in Proben von genomischer DNA, cDNA und RNA nachweisen, abhängend von der spezifischen Situation.
Historisch wurde eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren eingesetzt, um Punkt-Mutation nachzuweisen, einschließend die denaturierende Gradienten-Gel-Elektrophorese (denaturing gradient gel electrophoresis, „DGGE"), die Restriktions-Enzym-Polymorphismus-Analyse, chemische und enzymatische Schnitt-Verfahren und andere (Cotton, 1989). Die üblicheren Prozeduren, welche derzeit verwendet werden, schließen das direkte Sequenzieren von Target-Regionen, amplifiziert durch PCR^TM sowie die einzelsträngige Konformations-Polymorphismus-Analyse („SSCP") ein.
Ein weiteres Verfahren zum Screenen nach Punkt-Mutationen basiert auf dem RNase-Schneiden von Basen-, Paar-Mismatches in RNA/DNA und RNA/RNA-Heteroduplexen. Wie hier verwendet, ist der Begriff „Mismatch" definiert als eine Region von einem oder mehreren ungepaarten oder fehlgepaarten Nukleotiden in einem doppelsträngigen RNA/DNA- oder DNA/DNA-Molekül. Diese Definition schließt folglich Mismatches henührend von Insertions/Deletions-Mutationen, wie auch einzelne und multiple Basen-Punkt-Mutationen ein. US-Patent Nr. 4.946.773 beschreibt einen RNa se A-Mismatch-Schneide-Assay, welcher das Annealen von einzelsträngiger DNA oder von RNA-Test-Proben mit einer RNA-Sonde involviert und die nachfolgende Behandlung der Nukleinsäure-Duplexe mit RNase A. Nach der RNase-Schneide-Reaktion wird die RNase inaktiviert durch proteolytische Verdauung und organische Extraktion und die Schnitt-Produkte werden denaturiert durch Erhitzen und analysiert durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Für den Nachweis von Mismatches werden die einzelsträngigen Produkte der RNase A-Behandlung elektrophoretisch abgetrennt je nach Größe und mit ähnlich behandelten Kontroll-Duplexen verglichen. Proben enthaltend kleinere Fragmente (Schnitt-Produkte), welche nicht im Kontroll-Duplex zu sehen sind, werden als + bewertet.
Derzeit verfügbare RNase-Mismatch-Schnitt-Assays schließen diejenigen ein, durchgeführt gemäß US-Patent Nr. 4.946.773, und benötigen die Verwendung von radiogelabelten RNA-Sonden. Myers und Maniatis in US-Patent nr. 4.946.773 beschreiben den Nachweis von Basen-Paar-Mismatches unter Verwendung von RNase A. Andere Forscher haben die Anwendung von E. coli Enzym, RNase I, in Mismatch-Assays beschrieben. Da es breitere Spaltungs-Spezifität als RNase A, aufweist, wäre RNase I ein wünschenswertes Enzym, um es beim Nachweis von Basen-Paar-Mismatches einzusetzen, falls Komponenten gefunden werden können, welche das Ausmaß des nicht-spezifischen Spaltens vermindern und die Häufigkeit des Schneidens von Mismatches vergrößern. Die Verwendung von RNase I zum Mismatch-Nachweis wird beschrieben in der Literatur von Promega Biotech. Promega vermarktet einen Kit enthaltend RNase I, welcher entsprechend ihrer Literatur angeblich drei von vier bekannten Mismatches schneidet, vorausgesetzt der Enzym-Anteil ist hinreichend hoch.
Der RNase-Schutz-Assay, wie zuerst beschrieben von Melton et al. (1984) wurde verwendet, um die Enden von spezifischen mRNA-Targets in Lösung zu kartieren. Der Assay setzt darauf, dass er in der Lage ist, leicht hochspezifische Aktivitätsradiogelabelte RNA-Sonden komplementär zu mRNA von Interesse durch in vitro Transkription erzeugen kann. Ursprünglich waren die Template zu in vitro Transkription rekombinante Plasmide enthaltend Bakteriophagen-Promotoren. Die Sonden werden vermischt mit Proben von gesamtzellulärer RNA, um die Hybridisierung mit ihren komplementären Targets zu ermöglichen und anschließend wird die Mischung mit RNase behandelt, um die überflüssige unhybridisierte Sonde abzubauen. Des Weiteren wird, wie ursprünglich beabsichtigt, die RNase, die verwendet wird, spezifisch für einzelsträngige RNA sein, so dass hybrisierte doppelsträngige Sonden gegen Abbau geschützt sind. Nach Inaktivierung und Entfernen der RNase wird die geschützte Sonde (welche in ihrer Menge proportional ist zur Menge von Target mRNA, welche vorlag) zurückgewonnen und auf einem Polyacrylamid Gel analysiert.
Der RNase-Schutz-Assay wurde adaptiert zum Nachweis von Einzel-Basen-Mutationen durch Myers und Maniatis (1985) und durch Winter und Perucho (1985). In diesem Typ eines RNase A Mismatch-Schneide-Assays werden radiogelabelte RNA-Sonden, transkribiert in vitro aus Wildtyp-Sequenzen mit komplementären Target-Regionen abgeleitet von Test-Proben hybridisiert. Das Test-Target umfasst im Allgemeinen DNA (entweder genomische DNA oder DNA amplifiziert durch Klonieren und Plasmiden oder durch PCR^TM), obwohl RNA-Targets (endogene mRNA) gelegentlich verwendet werden (Gibbs und Caskey, 1987; Winter et al., 1985). Falls Einzel-Nukleotid- (oder größere) Sequenz-Unterschiede zwischen den hybridisierten Sonden und Targets auftreten, kann die resultierende Zerstörung der Watson-Crick-Wasserstoffbrücken an dieser Position („mismatch") erkannt werden und in einigen Fällen durch einzelsträngige spezifische Ribonuclease geschnitten werden. Bis heute wird RNase A beinahe exklusiv zum Schneiden von Einzel-Basen-Mismatches eingesetzt, obwohl RNase I in jüngster Zeit als bedeutsam auch für das Mismatch-Spalten gezeigt worden ist. Es gibt neue Beschreibungen des Einsatzes von MutS-Protein und anderen DNA-reparierenden Enzymen zum Nachweis von Einzel-Basen-Mismatches (Ellis et al., 1994; Lishanski et al., 1994).
Durch Hybridisieren eines jeden Stranges der Wild-Typ-Sonde in RNase-Spalt-Mismatch-Assays werden separat durch die komplementären Sense- und Antisense-Stränge des Test-Targets zwei unterschiedliche komplementäre Mismatches (beispielsweise A-C und G-U oder G-T) und folglich zwei Möglichkeiten zum Nachweis einer jeden Mutation durch separate Spaltereignisse zur Verfügung gestellt. Myers et al., (1985) verwendete den RNase A-Spaltungs-Assay, um 615 bp-Regionen des menschlichen β-Globin-Gens, enthaltend in rekombinanten Plasmid-Targets zu screenen. Durch Nachweis mit beiden Strängen war man in der Lage, die meisten, wenn nicht alle, der β-Globin-Mutation in ihren Modellen nachzuweisen. Die Sammlung von Mutanten enthielt Beispiele aller 12 möglicher Typen von Mismatches zwischen RNA und DNA: rA/dA, rC/dC, rU/dC, rC/dA, rC/dT, rU/dG, rG/dA, rG/dG, rU/dG, rA/dC, rG/dT und rA/dG.
Myers et al., (1985) zeigten, dass bestimmte Typen von Mismatch häufiger und vollständiger durch RNase A als andere gespalten wurden. Beispielsweise wurden die rC/dA-, rC/dC- und rC/dT-Mismatches in allen Fällen gespalten, wohingegen der rG/dA-Mismatch nur in 13% der Fälle, welche getestet wurden, gespalten wurde, und der rG/dT-Mismatch einer war, der vollständig resistent gegen Spalten war.
Im Allgemeinen war das Komplement eines schwer nachzuweisenden Mismatches viel einfacher nachzuweisen. Beispielsweise wird der refraktäre rG/dT-Mismatch, erzeugt durch Sondieren (Probing) eines G- an ein A-Mutanten Target mit einer Wildtyp-Sense-Strang-Sonde komplementiert durch den leicht gespaltenen rC/dA-Mismatch, erzeugt durch Sondieren des Mutanten-Targets mit dem Wildtyp Antisens-Strang. Durch Sondieren beider Target-Stränge haben Myers und Maniatis (1986) abgeschätzt, dass zumindest 50% von allen Einzelbasen-Mutationen durch den RNase A-Spaltungs-Assay nachgewiesen werden sollten. Diese Autoren äußerten, dass ungefähr ein Drittel aller möglichen Typen von Einzelbasen-Substitutionen nachgewiesen werden sollten durch Verwendung einer Einzelsonde für nur einen Strang der Target DNA (Myers et al., 1985).
In den typischen RNase-Spaltungs-Assays werden die separierenden Gele unter denaturierenden Bedingungen für die Analyse der Spaltungs-Produkte laufen gelassen. Dies benötigt, dass die RNase durch Behandeln der Reaktion mit Protease (üblicherweise Proteinase K, häufig in der Gegenwart von SDS) inaktiviert wird, um die RNase abzubauen. Auf diese Reaktion folgt im Allgemeinen eine organische Extraktion mit einer Phenol/Chloroform-Lösung, um Proteine sowie überschüssige RNase-Aktivität zu entfernen. Auf die organische Extraktion folgt dann eine Aufkonzentrierung und Rückgewinnung der Spalt-Produkte durch Alkohol-Präzipitation (Myers et al., 1985; Winter et al., 1985; Theophilus et al., 1989).
4. Abtrennungsverfahren
Folgend auf die Amplifikation kann es wünschenswert sein, das Amplifikations-Produkt vom Templat abzutrennen und vom Überschuss an Primer zum Zwecke des Bestimmens, ob eine spezifische Amplifikation aufgetreten ist. In einer Ausführungsform werden die Amplifikations-Produkte durch Agarose abgetrennt, Agarose-Acrylamid- oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von Standard-Verfahren siehe Sambrook et al., 1989.
Alternativ können chromatographische Techniken eingesetzt werden, um die Spaltung zu bewirken. Es gibt viele Arten der Chromatographie, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorption, Partition, Ionenaustausch und Molekularsiebe und viele spezialisierte Techniken zur Anwendung einschließend Säulen-, Papier-, Dünnschicht und Gas-Chromatographie (Freifelder, 1982).
5. Nachweis-Verfahren
Amplifikations-Produkte müssen visualisiert werden, um die Amplifikation der Marker-Sequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungs-Verfahren involviert das Anfärben eines Gels mit Ethidium-Bromid und die Visualisierung unter UV-Licht. Alternativ können die Amplifikations-Produkte, falls die Amplifikations-Produkte integral mit radio- oder fluorometrisch-gelabelten Nukleotiden gelabelt sind, dann einem Röntgenstrahlfilm ausgesetzt werden oder visualisiert werden mit Hilfe geeigneter Anregungsspektren folgend auf die Abtrennung.
In einer Ausführungsform wird die Visualisierung indirekt erzielt. Folgend auf die Abtrennung der Amplifikations-Produkte wird eine gelabelte Nukleinsäure-Sonde in Kontakt gebracht mit der amplifizierten Marker-Sequenz. Die Sonde ist vorzugsweise konjugiert mit einem Chromophor, kann aber auch radiogelabelt sein. In einer weiteren Ausführungsform wird die Sonde mit einem Bindungspartner konjugiert, wie z.B. einem Antikörper oder Biotin und das andere Glied des Bindungspaares trägt eine nachweisbare Gruppe.
In einer Ausführungsform erfolgt der Nachweis durch Southern Blot und Hybridisierung mit einer gelabelten Sonde. Die Techniken involviert in Southern Blotten sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und können in vielen Standardwerken über moleku lare Protokolle gefunden werden. Siehe Sambrook et al., 1989. Kurz gesagt werden Amplifikations-Produkte durch die Elektrophorese abgetrennt. Das Gel wird dann mit einer Membran in Kontakt gebracht, beispielsweise Nitrozellulose, was den Transfer der Nukleinsäure und das nicht-kovalente Binden ermöglicht. Anschließend wird die Membran mit Chromophor-konjugierter Sonde inkubiert, welche in der Lage ist, mit einem Target-Amplifikations-Produkt zu hybridisieren. Die Detektion erfolgt durch Exposition der Membran gegen Röntgenstrahlfilm oder Ionen-emittierende Detektions-Einheiten.
Ein Beispiel für des oben genannte wird in US Patent Nr. 5.279.721, hier per Verweis eingeschlossen, beschrieben, welches einen Apparat oder ein Verfahren zur automatisierten Elektrophorese und zum Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Der Apparat ermöglicht Elektrophorese und Blotten ohne äußere Manipulation des Gels und ist ideal geeignet zum Durchführen von Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
6. Kit Komponenten
Alle die essentiellen Materialien und Reagenzien, benötigt zum Nachweis von MODY-Markern in einer biologischen Probe können gemeinsam in einem Kit vereinigt werden. Dieser wird im Allgemeinen vorausgewählte Primer für spezifische Marker umfassen. Auch eingeschlossen sein können Enzyme, geeignet zur Amplifikation von Nukleinsäuren, einschließend verschiedene Polymerasen (RT, Tag, etc.), Deoxynukleotide und Puffer, um die nötige Reaktionsmischung zur Amplifikation bereitzustellen.
Solche Kits werden im Allgemeinen in geeigneten Mitteln verschiedene Container für jedes individuelle Reagenz und Enzym umfassen, wie auch für jedes Marker-Primer-Paar. Bevorzugte Paare von Primern zum Amplifizieren von Nukleinsäuren werden ausgewählt, um die Sequenzen zu amplifizieren, welche spezifiziert sind in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 5, gemeinsam mit den cDNAs für HNF1α (SEQ ID Nr. 1), HNF1β (SEQ ID Nr. 128) und HNF1α (SEQ ID Nr. 78). In anderen Ausführungsformen werden bevorzugte Paare von Primern zur Amplifikation ausgewählt, um Sequenzen zu amplifizieren, welche spezifiziert sind in SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 54.
In einer weiteren Ausführungsform werden solche Kits Hybridisierungs-Sonden, spezifisch für MODY3, umfassen, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend Nukleinsäuren, korrespondierend zu den Sequenzen, spezifiziert in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 7, zusammen mit den cDNAs für HNF1α (SEQ ID Nr. 1). In noch einer anderen Ausführungsform werden solche Kits Sonden umfassen, spezifisch für MODY1, ausgewählt aus einer Gruppe einschließend Nukleinsäuren korrespondierend mit den Sequenzen, spezifiziert in SEQ ID Nr. 78, SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 54, HNF1α. In noch einer weiteren Ausführungsform werden solche Kits Sonden umfassen, welche spezifisch sind für MODY4, ausgewählt aus der Gruppe einschließend Nukleinsäuren, korrespondierend mit den Sequenzen, welche spezifiziert werden in SEQ ID Nr. 128, HNF1β oder irgendwelchen der Exons dargestellt in 27A–27I oder Genbank-Zugangs-Nummern U90279-90287 und 096079, welche hier per Verweis eingeschlossen sind.
Solche Kits werden im Allgemeinen in geeigneten Mitteln verschiedene Container für jedes individuelle Reagenz und Enzym, wie auch für jede Marker-Hybridisierungs-Sonde umfassen.
L. Verwendung von RNA Fingerprints, um MODY3-, MODY4 und MODY1-Marker zu identifizieren
RNA-Fingerprinting ist ein Mittel, durch welches RNAs, welche aus vielen verschiedenen Geweben isoliert sind, Zelltypen oder Behandlungsgruppen zur gleichen Zeit untersucht werden können, um RNA zu identifizieren, deren relative Mengen variieren. Zwei Formen dieser Technologien wurden zur gleichen Zeit entwickelt und 1992 als „RNA-Fingerprinten durch differenzielle Darstellung" veröffentlicht (Liang und Pardee, 1992; Welsh et al., 1992). (Siehe auch Liang und Pardee, US-Patent 5.262.311, hier per Verweis in der Gesamtheit eingeschlossen). Einige der Experimente, die hier beschrieben werden, wurden in ähnlicher Art und Weise durchgeführt von Donahue et al., J. Biol. Chem. 269: 8604–8609, 1994.
Alle Formen des RNA-Fingerprints durch PCR sind theoretisch ähnlich, unterscheiden sich aber in ihrem Primer-Design und in ihrer Anwendung. Der am meisten entscheidende Unterschied zwischen der differenziellen Darstellung (differential display) und anderen Verfahren des RNA-Fingerprintens ist, dass die differenzielle Darstellung Anker-Primer einsetzt, welche mit dem Poly A-Schwänzen von mRNAs hybridisieren. Als eine Konsequenz sind die PCR-Produkte, amplifiziert in der differenziellen Darstellung auf die 3' nicht-translatierten Regionen von mRNAs gerichtet.
Die grundlegende Technik der differenziellen Darstellung wurde beschrieben im Detail in Liang und Pardee, 1992. Die Gesamt-Zell-RNA wird zur diversen Transkription des ersten Stranges mit einem Anker-Primer geprimt, der aus Oligo dT besteht und aus irgendwelchen zweien der vier Deoxynukleotide. Der oligo dT-Primer wird verlängert unter Verwendung einer reversen Transkriptase, beispielsweise Moloney Murine Leukemia virus (MMLV) Reverse Transkriptase. Die Synthese des zweiten Stranges wird mit einem zufällig ausgebildeten Oligonukleotid geprimt, unter Verwendung von vermindert stringenten Bedingungen. Sobald die doppelsträngige cDNA synthetisiert worden ist, schreitet die Amplifikation durch Standard PCR-Techniken voran unter Einsatz der gleichen Primer. Der resultierende DNA-Fingerprint wird durch Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung oder Audioradiographie analysiert. Ein Nebeneinander-Vergleich von Fingerprints erhalten aus Tumor versus normalen Gewebs-Proben unter Verwendung der gleichen Oligonukleotid-Primer identifiziert mRNAs, welche differenziell exprimiert werden.
Die RNA-Fingertechnologie hat sich als effektiv beim Identifizieren von Genen erwiesen, welche differenziell beim Krebs exprimiert werden (Liang et al., 1992; Wong et al., 1993; Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994; Chen et al., 1995; An et al., 1995). Die vorliegende Erfindung setzt die RNA-Fingerprint-Technik ein, um Gene zu identifizieren, welche bei Diabetes differenziell exprimiert werden.
Design und theoretische Betrachtungen für die relative quantitative RT-PCR
Die reverse Transkription von RNA zu cDNA, gefolgt von relativ quantitativer PLCR (RT-PCR) kann verwendet werden, um die relativen Konzentrationen von spezifischen mRNAs Spezies, isoliert aus MODY3-, MODY4- und MODY1-Patienten, zu bestim men. Durch Bestimmen, dass die Konzentration einer spezifischen mRNA-Spezies variiert, wird gezeigt, dass das Gen-kodierend die spezifische mRNA-Spezies differenziell exprimiert wird. Diese Technik kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass mRNA-Transkripte, von denen gezeigt wird, dass sie differenziell durch RMA-Fingerprint reguliert werden, differenziell in MODY zugeordneter Diabetes exprimiert werden.
In der PCR vergrößert sich die Anzahl der Moleküle der amplifizierten Target-DNA durch einen Faktor, welcher zwei erreicht mit jedem Zyklus der Reaktion, bis irgendein Reagenz limitierend wird. Danach wird die Rate der Amplifikation mehr und mehr vermindert, bis kein Anstieg im amplifizierten Target zwischen den Zyklen mehr auftritt. Wenn ein Graph gezeichnet wird, in welchem die Zyklenzahl auf der X-Achse ist und der log der Konzentration der amplifizierten Target-DNA auf der Y-Achse ist, wird eine Funktion von charakteristischer Form ausgebildet durch Verbinden der verknüpfenden Punkte. Beginnend mit dem ersten Zyklus ist die Steigung der Linie positiv und konstant. Man nennt dies den linearen Abschnitt der Kurve. Nachdem ein Reagenz limitierend wird, beginnt sich die Steigung der Linie zu vermindern und wird evtl. Null. An diesem Punkt beginnt sich die Konzentration der amplifizierten Target-DNA asymptotisch einem bestimmten Wert anzunähern. Man nennt dies den Plateau-Abschnitt der Kurve.
Die Konzentration der Target-DNA in dem linearen Abschnitt der PCR-Amplifikation ist direkt proportional zur Ausgangs-Konzentration des Targets, bevor die Reaktion begonnen hat. Durch das Bestimmen der Konzentration der amplifizierten Produkte der Target-DNA in PCR-Reaktionen, welche die gleiche Anzahl an Zyklen durchlaufen haben und welche in ihren linearen Bereichen liegen, ist es möglich, die Relativ-Konzentrationen der spezifischen Target-Sequenz in der ursprünglichen DNA-Mischung zu bestimmen. Falls die DNA-Mischungen cDNAs sind, synthetisiert aus RNAs, isoliert von verschiedenen Geweben oder Zellen, kann die relative Menge der spezifischen mRNA, aus welcher die Target-Sequenz abgeleitet worden ist, für die entsprechenden Gewebe oder Zellen bestimmt werden. Diese direkte Proportionalität zwischen der Konzentration der PCR-Produkte und den relativen mRNA-Mengen ist nur im linearen Bereich der PCR-Reaktion anzutreffen.
Die letztendliche Konzentration der Target DNA in dem Abschnitt des Plateaus der Kurve wird bestimmt durch die Verfügbarkeit von Reagenzien in der Reaktionsmischung und ist abhängig von der ursprünglichen Konzentration von Target-DNA. Folglich ist die die erste Bedingung, welche erfüllt sein muss, bevor die relativen Mengen einer mRNA-Spezies durch RT-PCR für eine Sammlung von RNA-Populationen bestimmt werden können, dass die Konzentrationen der amplifizierten PCR-Produkte bestimmt werden müssen, wenn die PCR-Reaktion in Ihren linearen Abschnitt der jeweiligen Kurven sind.
Die zweite Bedingung, welche für ein RT-PCR-Experiment erfüllt sein muss, um erfolgreich die relative Menge einer speziellen mRNA-Spezies zu bestimmen, ist, dass die relativen Konzentrationen der emplifizierbaren cDNAs normalisiert werden müssen auf einen unabhängigen Standard. Das Ziel eines RT-PCR-Experimentes ist es, die Menge einer speziellen mRNA-Spezies relativ zur durchschnittlichen Menge aller mRNA-Spezies in der Probe zu bestimmen. In den Experimenten, wie unten beschrieben, wurden mRNAs für β-Actin, Asparagin-Synthetase und Lipocorin II als externe und interne Standards verwendet, und bezogen auf diese werden die relative Menge von anderen mRNAs verglichen.
Die meisten Protokolle der kompetitiven PCR setzen interne PCR-Standards ein, welche ungefähr so häufig wie das Target sind. Diese Strategie ist effektiv, falls die Produkte der PCR-Amplifikationen während ihrer linearen Phase bestimmt werden. Falls die Produkte bestimmt werden, wenn die Reaktionen die Plateau-Phase erreichen, wird das in geringerer Menge vorhandene Produkt relativ überrepräsentiert. Vergleiche von relativen Mengen, durchgeführt für viele verschiedene RNA-Proben, wie z.B. im Falle, wenn RNA-Proben hinsichtlich differenzieller Expressions-Unterschiede untersucht werden, werden verzerrt in solch einer Art und Weise, dass Unterschiede in relativen Mengen von RNAs weniger erscheinen als sie tatsächlich sind. Dies ist kein signifikantes Problem, solange der interne Standard weit häufiger ist als das Target. Falls der interne Standard weit häufiger als das Target ist, kann ein direkter linearer Vergleich zwischen RNA-Proben durchgeführt werden.
Die obige Diskussion beschreibt theoretische Betrachtungen für ein RT-PCR-Assay für klinisch abgeleitete Materialien. Die Probleme, welche inhärent in klinischen Proben auftreten, sind dass sie von variabler Häufigkeit sind (was die Normalisierung problematisch macht) und dass sie von variabler Qualität sind (was die Co-Amplifikation einer verlässlichen internen Kontrolle nötig macht, vorzugsweise von einer größeren Größe als das Target. Beide dieser Probleme werden gelöst, falls sie RT-PCR als eine relative quantitative RT-PCR durchgeführt mit einem internen Standard, wobei der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment ist, das größer ist als das Target-cDNA-Fragment und bei welchem die Menge der mRNA kodierend den internen Standard ungefähr 5–100-fach höher als die mRNA ist, welche das Target kodiert. Dieser Assay misst die relative Menge, nicht die absolute Menge der jeweiligen mRNA-Spezies.
Andere Untersuchungen können durchgeführt werden unter Verwendung von herkömmlicheren relativen quantitativen RT-PCR-Assays mit einem externen Standard-Protokoll. Diese Assays untersuchen PCR-Produkte im linearen Abschnitt ihrer Amplifikations-Kurven. Die Anzahl der PCR-Zyklen, welche optional für die Durchführung sind, müssen empirisch bestimmt werden für jedes Target cDNA-Fragment. Darüber hinaus müssen die reversen Transkriptase-Produkte einer jeden RNA-Population, isoliert aus den verschiedenen Gewebe-Proben sorgsam normalisiert werden auf gleiche Konzentrationen von amplifizierbaren cDNAs. Diese Betrachtung ist sehr bedeutend, da der Assay die absolute mRNA-Menge misst. Die absolute mRNA-Menge kann als ein Maß der differenziellen Gen-Expression nur bei normalisierten Proben verwendet werden. Während die empirische Bestimmung des linearen Bereichs der Amplifikationskurve und der Normalisierung von cDNA-Präparierungen aufwendige und zeitraubende Prozesse sind, sind die resultierenden RT-PCR-Assays möglicherweise denjenigen abgeleitet von den relativ quantitativen RT-PCR-Assays mit einem internen Standard überlegen.
Ein Grund für diesen Vorteil ist, dass ohne den internen Standard/Vergleich alle der Reagenzien in ein einziges PCR-Produkt im linearen Bereich der Amplifikationskurve konvertiert werden können, wodurch die Sensivität des Assays verstärkt wird. Ein weiterer Grund ist, dass mit nur einem PCR-Produkt, die Darstellung des Produktes auf einem Elektrophorese-Gel oder einem anderen Darstellungs-Verfahren weniger komplex wird, weniger Hintergrund aufweist und leichter zu interpretieren ist.
M. Verfahren zum Aktivieren von Gen-Expression
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für die verstärkte Gen-Expression oder Aktivierung in einer Zelle zur Verfügung gestellt. Dies ist besonders bedeutsam, wo eine Abweichung im Gen-Produkt vorliegt oder wo die Gen-Expresion nicht hinreichend für die normale Funktion ist. Dies wird die Linderung von Symptomen von MODY3-Typ-Diabetes, wahrgenommen als ein Ergebnis der Mutation in HNF1α, der MODY4-Diabetes, wahrgenommen als ein Ergebnis der Mutation in HNF1β bzw. MODY1-Typ-Diabetes, wahrgenommen als ein Ergebnis der Mutation in HNF1α möglichen.
Der allgemeine Ansatz, um die Gen-Expression zu verstärken, wie er mediatisiert wird durch HNF1α, HNF1β oder HNF4α gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zelle zur Verfügung stellen mit einem HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptid, und dadurch ermöglichen, dass die transkriptorische promotionelle Aktivität von HNF1α, HNF1β oder HNF4α stattfindet. Während es möglich ist, dass das Protein direkt angeliefert wird, involviert eine bevorzugte Ausführungsform das Zurverfügungstellen einer Nukleinsäure kodierend ein HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptid, d.h. ein HNF1α- oder HNF4α-Gen für die Zelle. Folgend auf diese Zurverfügungstellung wird das HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α Polypeptid durch die transkriptionelle und translatorische Maschinerie der Wirtszelle synthetisiert, wie auch diejenigen, die vom Expressionsdruck zur Verfügung gestellt werden.
Cis-fungierende regulatorische Elemente, notwendig um die Expression des HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Gens zu unterstützen, werden zur Verfügung gestellt in der Form eines Expressionskonstruktes. Es ist auch möglich, dass die Expression der viral kodierten HNF1α, HNF1β oder HNF4α stimuliert oder verstärkt werden könnte oder dass das exprimierte Polypeptid stabilisiert werden könnte, wodurch der gleiche oder ein ähnlicher Effekt erzielt wird.
Um die Expression der Konstrukte kodierend HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Gen zu bewirken, muss das Expressions-Konstrukt in die Zelle eingebracht werden. Ein Mechanismus der Zufuhr ist über eine virale Infektion, wobei das Expressions-Konstrukt in einem viralen Partikel verkapselt wird, welches entweder eine replizierende oder nicht- replizierende Nukleinsäure liefern wird. In bestimmten Ausführungsformen wird ein HSV-Vektor eingesetzt, obwohl im Prinzip jeder Vektor geeignet wäre.
Verschiedene nicht-virale Verfahren zum Transfer der Expressions-Konstrukte in kultivierte Säugetier-Zellen werden auch von der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst. Diese schließen Kalzium-Phosphat-Prezipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-Dextran- (Gopal, 1985), Elektroproporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposome (Nikolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofektamin-DNA-Komplexe, Zell-Ultraschall (Fechheimer et al., 1987), Gen-Bombardierung unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits Mikroprojektil (Yang et al., 1990) und Rezeptor-mediatisierte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988) ein. Einige dieser Techniken können erfolgreich adaptiert werden für die Anwendung in vivo oder ex vivo, wie unten diskutiert werden wird.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Expressions-Konstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder aus Plasmiden bestehen. Der Transfer der Konstrukte kann durchgeführt werden durch irgendeines der Verfahren wie oben erwähnt, welche physikalisch oder chemisch die Zellmembrane durchlässig machen. Dies ist insbesondere anwendbar für den in vitro Transfer, kann aber auch für die Anwendung in vivo eingesetzt werden. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Transfer eines nackten DNA-Expressions-Konstruktes in Zellen kann das Partikel-Bombardieren einschließen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit, DNA-gecoatete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit beschleunigen, ab, was es diesen ermöglicht, die Zell-Membranen zu durchlöchern und in die Zellen, ohne sie abzutöten, einzudringen (Klein et al., 1987). Verschiedene Geräte zum Beschleunigen kleiner Partikel wurden entwickelt. Ein solches Gerät setzt auf eine Hochspannungs-Entladung, um einen elektrischen Strom zu erzeugen, welcher wiederum die auslösende Kraft liefert (Yang et al., 1990). Die Mikroprojektile, welche eingesetzt werden, bestehen aus biologisch-inerten Substanzen, wie z.B. Wolfram- oder Gold-Beads.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressions-Konstrukt in einem Liposom verkapselt sein. Liposome sind vesikuläre Strukturen, charakterisiert durch eine Membran aus einer Phospholipid-Doppelschicht und einem inneren wässe rigen Medium. Multilamellare Liposome haben multiple Lipidschichten, getrennt durch wässeriges Medium. Sie bilden sich spontan aus, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässerigen Lösung suspendiert werden. Die Lipid-Komponenten werden einer Selbst-Organisation unterworfen, bevor die Ausbildung von geschlossenen Strukturen auftritt und Wasser und aufgelöste Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten eingekapselt werden (Ghosh und Bachhawat, 1991). Auch beabsichtigt sind Lipofektamin-DNA-Komplexe.
Liposom-mediatisierte Nukleinsäure-Zufuhr und Expression von Fremd-DNA hat sich in vitro als sehr erfolgreich gezeigt. Wong et al., (1980) demonstrierte die Möglichkeit der Liposom-mediatisierten Zufuhr und Expression von Fremd-DNA in kultivierten Hühner-Embryos, HeLa- und Hepatom-Zellen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Liposom mit Hemagglutinierendem Virus (HVJ) komplexiert werden. Man hat gezeigt, dass dies die Fusion mit der Zell-Membran ermöglicht und den Zell-Eintritt der Liposom-verkapselten DNA erleichtert (Kanada et al., 1989). In weiteren Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit chromosomalen Nicht-Histon-Chromosomal-Proteinen (HMG-1) (Kato et al., 1991) eingesetzt werden. In noch weiteren Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert werden oder in Verbindung sowohl mit HVJ als auch HMG-1 eingesetzt werden. In anderen Ausführungsformen kann das Zufuhr-Vehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Wo ein bakterieller Promotor eingesetzt wird im DNA-Konstrukt wird es auch wünschenswert sein, innerhalb des Liposoms eine geeignete bakterielle Polymerase einzuschließen.
Andere Expressions-Konstrukte, welche eingesetzt werden können, um eine Nukleinsäure kodierend ein HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Transgen in Zellen einzubringen, sind Rezeptor-vermittelte Zufuhr-Vehikel. Diese nutzen in vorteilhafterweise die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-mediatisierte Endozytose in beinahe allen Eukaryonten-Zellen aus. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann die Zufuhr hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993).
Rezeptor-mediatisierte Gen-Target-Vehikel bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zell-Rezeptor-spezifischen Liganden und einem DNA-Bindungs-Agens. Mehrere Liganden können eingesetzt werden zum Rezeptor-mediatisierten Gen-Transfer. Die am detailliertest charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1990). In jüngster Zeit wurde ein synthetisches Neoglykoprotein, welches den gleichen Rezeptor wie ASOR erkennt, als Gen-Zufuhr-Vehikel eingesetzt (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994). Mannose kann verwendet werden, um den Mannose-Rezeptor auf Leberzellen anzusteuern. Des Weiteren können Antikörper gegen CO5 (CLL), CD22 (lymphoma), CD25 (T-Zell Leukämien und MAA (Melanom) in ähnlicher Art und Weise als Targeting-Gruppe eingesetzt werden. In anderen Ausführungsformen können die Zufuhr-Vehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen.
Primäre Säugetier-Zellen-Kulturen können auf verschiedene Art und Weise hergestellt werden. Damit die Zellen überlebensfähig bleiben, solange sie in vitro vorliegen und in Kontakt mit dem Expressions-Konstrukt, ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Zellen in Kontakt mit dem korrekten Verhältnis von Sauerstoff und Kohlenstoffdioxid wie auch Nährstoffen sind, jedoch von mikrobieller Kontamination geschützt sind. Zell-Kultur-Techniken sind gut dokumentiert und werden hier per Verweis offenbart (Freshner, 1992).
Eine Ausführungsform des oben genannten involviert die Verwendung des Gen-Transfers, um Zellen für die Produktion von Proteinen zu immortalisieren. Das Gen für das Protein von Interesse kann transferiert werden wie oben beschrieben in die geeigneten Wirtszellen, gefolgt von einer Kultur von Zellen unter den geeigneten Bedingungen. Das Gen für im Prinzip jedes Polypeptid kann in dieser Art und Weise eingesetzt werden. Die Erzeugung von rekombinanten Expressions-Vektoren und den darin enthaltenden Elementen werden oben diskutiert. Alternativ kann das zu produzierende Protein ein endogenes Protein sein, welches normal durch die fragliche Zelle synthetisiert wird.
Beispiele von bedeutsamen Säugetier-Wirtszell-Linien sind Vero- und HeLa-Zellen und Zell-Linien von chinesischen Hamster Ovar-, W138-, BHK-COS-7-, 293-, HepG2-, NIH3T3-, RIN- und MDCK-Zellen. Darüber hinaus kann ein Wirtszell-Stamm ausgewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und als Gen-Produkt in der gewünschten Art und Weise verarbeitet. Solche Modifikationen (beispielsweise Glycosylierung) und Verarbeitung (beispielsweise Schneiden) der Protein-Produkte kann bedeutsam für die Funktion des Proteins sein. Unterschiedliche Wirts-Zellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das posttranslatorische Verarbeiten und die Modifikation von Proteinen und geeignete Zell-Linien oder Wirts-Zell-Systeme können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und das Verarbeiten der fremden Proteine, welche exprimiert werden, sicherzustellen.
Eine Vielzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließend, jedoch nicht limitiert auf HSV Thymidin Kinase, Hypoxanthin-Guanin Phosphoribosyltransferase und Adenin Phosphoribosyltransferase Gene, in tk-, hgprt- oder aprt-Zellen. Darüber hinaus kann die anti-Metabolit-Resistenz als die Basis zum Auswählen von dhfr, verwendet werden, welches Resistenz verleiht gegen Methotrexat; gpt, welches Resistenz verleiht gegen Mycophenolsäure; neu, welches Resistenz verleiht gegen das Aminoglykosid G418; sowie hygro, welches Resistenz verleiht gegen Hygromycin.
Tierische Zellen können propagiert werden in vitro auf zwei verschiedene Art und Weise: als Nicht-Anker-abhängige Zellen, welche in Suspension über den Zellverband der Kultur wachsen oder als Anker-abhängige Zellen, welche das Anhaften an ein festes Substrat für ihre Propagierung benötigen (beispielsweise ein Monoschicht-Typ des Zellwachstums).
Nicht-Anker-abhängige oder Suspensions-Kulturen aus kontinuierlich etablierten Zell-Linien sind die am häufigsten verwendeten Mittel der Produktion von Zellen und Zell-Produkten in großem Maßstab. Jedoch haben die in Suspension kultivierten Zellen Grenzen hinsichtlich ihres tumorgenen Potentials und der geringen Protein-Produktion im Vergleich zu anhaftenden Zellen.
Suspensionskulturen im großen Maßstab von Säugetier-Zellen in gerührten Behältern stellen ein allgemein übliches Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen dar. Zwei Suspensions-Kultur-Reaktor-Designs sind weit verbreitet, der gerührte Reaktor und der Lufthub-Reaktor. Das rührende Design wurde erfolgreich verwendet bei einer 8000 Liter-Kapazität zur Produktion von Interferon. Die Zellen werden in rostfreien Stahl-Behältern mit einem Höhen-zu-Durchmesser-Verhältnis von 1:1 bis 3:1 kultiviert. Die Kultur wird üblicherweise mit einem oder mehreren Rührern vermischt, basie rend auf Rotationsschreiben oder Schiffsrotor-Mustern. Rührsysteme, welche geringere Scherkräfte als Propellerscheiben aufweisen, wurden beschrieben. Rühren kann entweder direkt oder indirekt durch magnetisch gekoppelte Steuerung angetrieben werden. Indirekter Antrieb reduziert das Risiko der mikrobiellen Kontamination durch Versiegelung der Rührschafte.
Der Lufthub-Reaktor, auch ursprunglich beschrieben zur mikrobiellen Fermentation und später angewandt auf Säugetier-Kultur, setzt auf das Prinzip eines Gasstroms, um die Kultur zu vermischen und mit Sauerstoff zu versorgen. Der Gasstrom läuft in einen anhebenden Sektor des Reaktors und treibt die Zirkulation an. Das Gas tritt an der Kulturoberfläche aus, was bewirkt, dass die dichtere Flüssigkeit, frei von Blasen, nach unten in nach unten laufenden Abschnitts-Reaktors wandert. Der hauptsächliche Vorteil dieses Konzepts ist die Einfachheit sowie die Vermeidung des Bedarfs für mechanisches Vermischen. Typischerweise ist das Höhen-zu-Durchmesser-Verhältnis 10:1. Der Lufthub-Reaktor kann relativ leicht im Maßstab vergrößert werden, zeigt guten Massentransfer der Gase und erzeugt relativ geringe Scherkräfte.
N. Verfahren zum Blockieren der Wirkung von HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α-Mutanten
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Blockieren der Funktion von mutiertem HNF1α in MODY3, HNF1β in MODY4 und HNF4α ins Auge gefasst. Auf diesem Wege kann es möglich werden, die Effekte der Mutation in Diabetes einzuschränken. Darüber hinaus kann es sich als effektiv erweisen, diese Art der therapeutischen Intervention in Kombination mit traditionelleren Diabetes-Therapien einzusetzen, wie z.B. der Verabreichung von Insulin.
Die allgemeine Form, dass dieser Aspekt der Erfindung eintritt, besteht im Zurverfügungstellen eines Agens für eine Zelle, wobei das Agens die Funktion von mutiertem HNF1α, HNF1β oder HNF4α inhibieren wird. Vier solche Agenzien sind angedacht. Zuerst kann man eine Antisense-Nukleinsäure einsetzen, welche entweder mit dem mutierten HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Gen oder dem mutierten HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Gen-Transkript hybridisiert, und dadurch die Transkription bzw. Translation verhindert. Die Überlegungen, relevant für das Design der Antisense-Konstrukte wur den oben dargelegt. Als zweites kann man ein an ein mutiertes HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-bindendes Protein oder Peptid, beispielsweise ein Peptidomimetik oder ein Antikörper, welcher immunologisch an mutiertes HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α bindet, einsetzen, wobei dieses Anbinden entweder die Aktivität des mutierten HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α blockieren oder vermindern wird. Die Verfahren zum Durchführen und Auswählen von Peptid-Bindungspartnern und Antikörpern sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Als drittes kann man der Zelle einen Antagonisten von mutiertem HNF1α, HNF1β oder HNF4α zur Verfügung stellen, beispielsweise die Transaktivierungs-Target-Sequenz, allein oder gekoppelt an ein weiteres Agens. Und viertens kann man ein Agens zur Verfügung stellen, welches an das mutierte HNF1α, HNF1β oder HNF4α-Target bindet, ohne dass die gleiche Funktion auftritt, welche sich ergeben würde für das Binden von mutiertem HNF1α, HNF1β oder HNF4α.
Das Zurverfügungstellen eines HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Gens, eines mutierten HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Proteins oder eines Antagonisten eines mutierten HNF1α, HNF1β oder HNF4α würde einem geeigneten pharmazeutischen Weg entsprechen. Die Formulierung solcher Zusammensetzungen und ihre Zufuhr zu Geweben wird unten diskutiert. Das Verfahren, durch welches die Nukleinsäure, das Protein oder die chemische Substanz transferiert wird, zusammen mit dem bevorzugten Weg der Verabreichung, wieder ausgewählt basiert auf der speziellen Stelle, die behandelt werden soll. Die Fachleute auf dem Gebiet sind in der Lage, die geeignetsten Verfahren basierend auf den relevanten klinischen Überlegungen zu bestimmen.
Viele der Gen-Transfer-Techniken, welche allgemein in vitro eingesetzt werden, können zur Anwendung ex vivo oder in vivo adaptiert werden. Beispielsweise wurden ausgewählte Organe, einschließend Leber, Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen in vivo bombardiert (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Nackte DNA wurde auch verwendet in klinischen Anwendungen, um Gen-Therapie durchzuführen. Diese Anlässe können das Aussetzen gegenüber operativen Eingriffen des Target-Gewebes oder die direkte Target-Gewebs-Injektion benötigen. Nicolau et al. (1987) realisierten den erfolgreichen Liposom-mediatisierten Gen-Transfer in Ratten nach intravenöser Injektion.
Dubensky et al. (1984) injizierten erfolgreich Polyomavirus DNA in der Form von CaPO₄ Präzipitaten in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, was die aktive virale Replikation und akute Infektion demonstrierte. Benvenisty und Neshif (1986) demonstrierten auch, dass die direkte intraperitoneale Injektion vom CaPO₄ Präzipitat Plasmiden in der Expression der transfizierten Gene resultiert. Folglich ist angedacht, dass DNA kodierend ein Antisense-Konstrukt auch in ähnlicher Art und Weise in vivo transferiert werden kann.
Wo die Ausführungsform die Anwendung eines Antikörpers involviert, welcher ein mutiertes HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptid erkennt, müssen Überlegungen getroffen werden hinsichtlich des Mechanismus, durch welchen der Antikörper in das Zell-Cytoplasma eingebracht wird. Dies kann realisiert werden, beispielsweise durch Zurverfügungstellung eines Expressions-Konstruktes, welches eine einkettige Version des Antikörpers, der zur Verfügung gestellt werden soll, kodiert. Der größte Teil der obigen Diskussion betrifft Expressions-Konstrukte für Antisens-Versionen von HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Genen und wird für diesen Aspekt der Erfindung relevant sein. Alternativ ist es möglich, einen bifunktionellen Antikörper zu präsentieren, wobei ein Antigen-bindender Arm des Antikörpers ein HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Polypeptid erkennt und der andere Antigen-bindende Arm einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle, auf die gezielt werden soll, erkennt. Beispiele geeigneter Rezeptoren würden ein HSV-Glycoprotein darstellen, wie z.B. gB, gC, gC oder gH. Darüber hinaus kann es möglich sein, die Fc-bindende Funktion, assoziiert mit HSV gE auszunutzen, wodurch die Notwendigkeit, einen Arm des Antikörpers zum Zwecke des Zell-Targetings zu opfern, überflüssig würde.
In vorteilhafter Art und Weise kann man diesen Ansatz mit konventionelleren Diabetes-Therapie-Optionen kombinieren.
O. Pharmazeutika und in vivo-Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen
Wässerige pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer effektiven Menge ein HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Expressions-Konstrukt, ein Antisens-HNF1α-, HNF1β- oder HNF4α-Expressions-Konstrukt, ein Expressions- Konstrukt, welches ein therapeutisches Gen zusammen mit HNF1α, HNF1β oder HNF4α kodiert, ein Protein oder eine Verbindung, welche die Funktion vom mutiertem HNF1α, HNF1β bzw. HNF4α inhibiert, wie z.B. einen Antimutanten-HNF1α-Antikörper, einen Antimutanten-HNF1β-Antikörper, oder einen Antimutanten-HNF1α-Antikörper oder ein mutiertes HNF1α-Polypeptid, ein mutiertes HNF1β-Polypeptid oder ein mutiertes HNF4α-Polypeptid aufweisen. Solche Zusammensetzungen werden im Allgemeinen aufgelöst bzw. dispergiert in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem wässerigen Medium. Eine „effektive Menge" zum Zwecke der Therapie ist definiert als die Menge, welche einen klinisch messbaren Unterschied im Zustand des Subjekts verursacht. Diese Menge wird von der Substanz, dem Zustand des Patienten, dem Typ der Behandlung, der Stelle der Läsion etc. abhängen.
Die Bezeichnungen „pharmazeutisch bzw. pharmakologisch verträglich" beziehen sich auf molekulare Entitäten und Zusammensetzungen, welche keinerlei nachteilige, allergische oder ansonsten unpassende Reaktion erzeugen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen in geeigneter Form verabreicht werden. Wie hier verwendet, schließt „pharmazeutisch verträglicher Träger" jegliche Art von und alle Lösungsmittel, Dispersions-Medien, Coatings, antibakterielle und antifungale Agenzien, isotonische und Absorptions-verzögernde Agenzien und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohlbekannt. Außer insofern als irgendwelche konventionellen Medien oder Agenzien inkompatibel mit den aktiven Ingredienzen sind, ist ihre Anwendung in therapeutischen Zusammensetzungen beabsichtigt. Ergänzende aktive Ingredienzien, wie z.B. andere antidiabetische Wirkstoffe, können auch in die Verbindungen eingebracht werden.
Zusätzlich zu den Verbindungen, formuliert für die parenterale Verabreichung, wie z.B. diejenigen für die intravenöse oder intramuskuläre Injektion, schließen andere pharmazeutisch verträgliche Formen, beispielsweise Tabletten oder andere Feststoffe zur oralen Verabreichung; Zeit verzögert freisetzende Kapseln; und irgendwelche anderen Formen, die hier verwendet werden, einschließlich Cremen, Lotionen, Mundspülungen, Inhalate und dergleichen ein.
Der aktiven Verbindungen der vorliegenden Erfinden werden oft formuliert zur parenteralen Verabreichung, beispielsweise formuliert zur Injektion über die intravenösen, in tramuskulären, subkutanen oder intraperitonealen Routen. Die Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung, welche inhibitorische Verbindungen für mutiertes HNF1α, HNF1β oder HNF4α enthält und zwar allein oder in Kombination mit Agenzien für eine konventionelle Diabetes-Therapie als aktive Ingredienzien, werden den Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Typischerweise können solche Zusammensetzungen hergestellt werden als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, geeignet zur Anwendung um Lösungen herzustellen oder Suspensionen nach Zugabe einer Flüssigkeit vor der Injektion können auch hergestellt werden; und die Präparationen können auch emulgiert werden.
Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Basen oder pharmakologisch verträgliche Salze können hergestellt werden in Wasser, geeignet angemischt mit einem Tensid, wie z.B. Hydroxypropylzellulose. Dispersionen können auch hergestellt werden in Glyzerol, flüssigen Polyethylenglykolen und Mischungen davon und in Öl. Unter üblichen Bedingungen zur Lagerung und Anwendung enthalten diese Präparationen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, geeignet zur Injektions-Anwendung, schließen sterile wässerige Lösungen und Dispersionen ein; Formulierungen schließen Sesamöl, Erdnuß-Öl oder wässerige Propylenglykol-Formulierungen ein; sowie sterile Pulver für die improvisierte Herstellung von steriler injezierbare Lösungen oder Dispersionen. In vielen Fällen muss die Form steril sein und muss flüssig sein in einem Maße, dass sie leicht per Spritze verabreichbar ist. Sie muss stabil sein unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung und muss konserviert sein gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien und Pilzen.
Die aktiven Verbindungen können formuliert werden in einer Zusammensetzung in einer neutralen oder einer Salzform. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen die sauren Additionssalze (ausgebildet mit freien Aminogruppen des Proteins) und diejenigen, welche ausgebildet werden mit anorganischen Säuren, wie z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen ein. Salze ausgebildet in freien Carboxylgruppen können auch abgeleitet werden von anorganischen Basen, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium- oder Eisen-Hydroxiden, und solchen organischen Basen, wie z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen.
Der Träger kann auch ein Lösungsmittel oder ein Dispersions-Medium sein, enthaltend, beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glyzerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon sowie Pflanzenöle. Die geeignete Fluidität kann erhalten werden, beispielsweise durch die Anwendung eines Coatings wie z.B. Lecithin durch Aufrechterhalten der gewünschten Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Anwendung von Tensiden. Das Verhindern der Wirkung von Mikroorganismen kann realisiert werden durch verschiedene antibakterielle und antifungale Wirksubstanzen, beispielsweise Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isothonische Agenzien einzuschließen, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid. Die verlängerte Absorption der injektierbaren Zusammensetzungen kann realisiert werden durch die Anwendung in Zusammensetzung von Wirksubstanzen, welche die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminium-Monostearate und Gelatine.
Sterile injektierbare Lösungen werden hergestellt durch Einbringen der aktiven Verbindungen in die gewünschte Menge des geeigneten Lösungsmittels mit verschiedenen der anderen Ingredienzien, die oben aufgeführt sind, je nach Bedarf gefolgt von filtrierter Sterilisation. Im Allgmeinen werden Dispersionen hergestellt durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten aktiven Ingredienzien in ein steriles Vehikel, welches das grundlegend Dispersionsmedium enthält und der gewünschten anderen Ingredienzien aus denjenigen, die oben aufgelistet werden. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injezierbaren Lösungen sind die bevorzugten Verfahren der Herstellung Vakuum-Trocknungs- und Gefrier-Trocknungs-Techniken, welche ein Pulver des aktiven Ingredienz zusammen mit zusätzlich gewünschten Ingredienzen aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergeben.
Nach Formulierung werden die Lösungen in einer Art und Weise, die kompatibel mit der Dosier-Formulierung ist, in solch einer Menge, die therapeutisch effektiv ist, verabreicht. Die Formulierungen werden leicht verabreicht in einer Vielzahl von Dosierformen, wie z.B. dem Typus von injezierbaren Lösungen, wie oben beschrieben, mit gleichmäßig wirkstoff-freisetzenden Kapseln und dergleichen, welche einsetzbar sind.
Zu parenteralen Verabreichungen in einer wässerigen Lösung soll die Lösung beispielsweise gepuffert sein, falls notwendig und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst isotonisch gemacht werden mit einer ausreichenden Menge an Salzlösung oder Glukose. Diese speziellen wässerigen Lösungen sind speziell geeignet zur intravenösen, intramuskulären, subkutan und intraperitonealen Verabreichung. In diesem Zusammenhang werden die sterilen wässerigen Medien, welche eingesetzt werden können, den Fachleuten auf dem Gebiet im Licht der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Beispielsweise könnte eine Dosierung aufgelöst sein in 1 mL an isotonischer NaCl-Lösung und entweder zu 1000 mL an Hypodermoclysis-Flüssigkeit hinzugegeben werden oder an der geeigneten Stelle der Infusion injiziiert werden; (siehe beispielsweise „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035–1038 und 1570–1580). Etwas Variation in der Dosierung wird notwendigerweise auftreten abhängend von dem Zustand des Subjektes, das behandelt werden soll. Die Person, verantwortlich für die Verabreichung wird, in jedem Falle die geeignete Dosis für das individuelle Subjekt bestimmen.
P. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte von den Fachleuten auf dem Gebiet erkannt werden, dass die Techniken, offenbart in diesen Beispielen, welche folgen, Techniken repräsentieren, welche durch die Erfinder als gut in der Praxis der Erfindung funktionierend identifiziert werden, und welche folglich als bevorzugte MODY der Durchführung in der Praxis betrachtet werden können. Jedoch sollten die Fachleute auf dem Gebiet im Licht der vorliegenden Offenbarung einsehen, dass viele Veränderungen in den spezifischen Ausführungsformen durchgeführt werden können, welche offenbart sind und noch immer ein gleichartiges oder ähnliches Ergebnis erhalten, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1
Veränderte sekretorische Insulin-Antworten auf Glukose in Diabeteserkrankten und Nicht-Diabetes-erkrankten Subjekten mit Mutationen in dem für Diabetes mellitus empfänglichem Gen MODY3 auf Chromosom 12
Das vorliegende Beispiel bestimmt, ob Veränderungen in der Dosis-Antwort-Beziehung zwischen Plasma-Glukose-Konzentration und Insulin-Sekretions-Rate (ISR) in Subjekten identifiziert werden können, welche ein Risiko MODY3-Allel geerbt haben, welche jedoch noch nicht offene Diabetes entwickelt haben.
1. Verfahren
Subjekte von MODY3 Stammbäumen
Dreizehn kaukasische Subjekte, welche positiv für MODY3 Marker auf Chromosom 12q waren, wurden untersucht. Zwei Subjekte waren Mitglieder eines französischen Stammbaums F549 (Vaxillaire et al., 1995), drei waren vom P-Stammbaum von Michigan (Menzel et al., 1995), zwei von einem New Yorker Stammbaum des H-Stammbaums, dargestellt in 1, zwei waren von einem Liverpool-Stammbaum, dem BDA1-Stammbaum, und vier von einem Nottingham-Stammbaum, dem BDA12-Stammbau (1). Jedes Subjekt wurde typisiert mit einer Serie von DNA-Markern in der Region von MODY3, um zu bestimmen, ob es einen Risiko-Haplotypen einhergehend mit MODY3 in der Familie ererbt hatte. Der Diabetes-Status eines jeden Subjektes, außer für MD13, wurde bestimmt durch orale Glukose-Toleranz-Tests (OGTT) gemäß den Kriterien der Weltgesundheits-Organisation (WHO) (WHO Study Group on Diabetes Mellitus, 1985) und bestätigt zum Zeitpunkt der Untersuchungen durch die Messung von glykosyliertem Hämoglobin. Basierend auf den Ergebnissen des OGTT und der glykosylierten Hämoglobin-Werte innerhalb oder oberhalb des normalen Bereiches des Labors der Erfinder (< 7,4%) wurden die Subjekte in diabetische und nicht-diabetische Gruppen unterteilt.
Nichtdiabetische MODY3 Subjekte (n = 6)
Die klinischen Profile dieser Subjekte sind in Tabelle 4 dargestellt. Alle zeigten normal ansteigende Glukose- und glykosylierte Hämoglobin (< 7,4%) Spiegel zum Zeitpunkt dieser Untersuchung, Zum Zeitpunkt der Untersuchung zeigten 4 Subjekte IGT (MD1, MD4, MD9, MD13) und 2 Subjekte zeigten normale Glukose-Toleranz (NGT) (MD3, MD5). Basierend auf früheren Glukose-Toleranz-Tests MD1, IGT, MD3 demonstrierte Konsistenz NGT auf seriellen DGTTs, MD4 wurde mit IGT diagnostiziert in 6/93 und zeigte persistentes IGT mit einem Blutglukose-Spiegel von 147 mg/dl zwei Stunden nach dem Essen, MD5 wurde ursprünglich diagnostiziert mit IGT und zeigte nachfolgend 2 normale OGTTs, mit 2-h Blut-Glukose-Werten von 130 mg/dl bzw. 105 mg/dl, MD9 wies IGT auf, mit einem 2-h nach Essens-Blut-Glukose-Spiegel von 167 mg/dl mit keinem weiteren Blut-Glukose-Spiegel oberhalb von 200 mg/dl und MD13 wies IGT auf mit erhöhten Nach-Essens-Blut-Glukose-Spiegel im Nachhinein von bis zu 160 mg/dl. Das Alter der Diagnose bezieht sich auf das Alter, bei welchem die abnormale Glukose-Toleranz diagnostiziert worden war. Keines der Subjekte wurde jemals mit NIDDM diagnostiziert.
Diabetische MODY3 Subjekte (n = 7)
Klinische Profile sind in Tabelle 4 gezeigt. Alle Subjekte wurden mit oralen hypoglykämischen Substanzen behandelt außer bei MD8, der Insulin bekam, welches zwei Tage vor der Untersuchung unterbrochen war und MD12, der mit Diät allein behandelt wurde. Alle Subjekte hatten eine unterbrochene Behandlung mit oralen hypoglykämischen Substanzen, zumindest drei Wochen bevor sie untersucht wurden. Wie in Tabelle 4 gezeigt, waren die nüchternen Plasmaglukose und insgesamten glykosylierten Hämoglobin-Spiegel in der diabetischen Gruppe höher und die nüchternen Insulin-Spiegel waren niedriger. Die diabetische Gruppe war auch signifikant älter als die beiden anderen Gruppen.
Nichtdiabetische Kontrollen
Die Kontroll-Subjekte bestanden aus 5 Männern und einer Frau (5 Kaukasier und 1 Afro-Amerikaner), welche keine persönliche oder familiäre Vergangenheit mit NIDDM aufwiesen. Sie lagen alle innerhalb von 20% des idealen Körpergewichts, zeigten keinerlei medizinische Erkrankungen und empfingen keinerlei Medikamente. Daten von vier der Kontroll-Subjekte wurden zuvor publiziert (Byrne et al., 1994; Byrne et al., 1995a). BMI war nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Kontroll- und den diabetischen oder nicht-diabetischen MODY3-Gruppen.
Weibliche Freiwillige zeigten reguläre Menstruations-Zyklen und wurden nur in der frühen Phase der folliken Reifung untersucht. Die Untersuchung wurde zugelassen vom Institutional Review Board of the University of Chicago Medical Center und alle Subjekte und/oder Eltern lieferten eine schriftliche Einverständniserklärung.
Experimentelles Protokoll
Die Studien begannen um 8.00 h mit Subjekten in ruhender Position nach einer 12-stündigen Ausnüchterung über Nacht. Ein intravenöser Katheter wurde in jedem Unterarm platziert, einer zum Entnehmen von Blutproben und einer für die Verabreichung von Glukose. In allen Experimenten wurde der Arm enthaltend den Probenentnahme-Katheter in einer Hitzemanschette oder einer Heißhand-Box gehalten, um die Arterialisation der venösen Probe zu gewährleisten.
Abgestufte Glukose-Infusions-Untersuchungen
Diese Untersuchungen waren so konzipiert, dass sie die Dosis-Antwort-Beziehungen zwischen Glukose und Insulin-Sekretions-Rate (ISR) charakterisierten. Um potentiell störende Effekte der Unterschiede in den ursprünglichen Glukose-Konzentrationen zu eliminieren, begann jede Untersuchung mit der Verabreichung einer kleinen Bolus von Insulin auf intravenösem Weg (0,007 U/kg), gefolgt von einer niedrigen Infusion von Insulin bei geringerer Dosis, um den nüchternen Plasma-Glukose-Spiegel auf ähnliche Spiegel in allen Gruppen einzustellen (Target Plasma Glukose = 5 mM). Nach einem Zeitraum von 20 min, während dessen das exogen verabreichte Insulin sich abbauen konnte, wurden die Proben in 10 min Intervallen für 30 min genommen, um einen Basiswert für Insulin, Glukose und C-Peptid-Spiegel zu erhalten. Eine intravenöse Infusion von 20% Dextrose wurde dann gestartet in einer Rate von 1 mg/kg/min), gefolgt von Infusionen von 2 mg/kg/min, 3 mg/kg/min, 4 mg/kg/min, 6 mg/kg/min und 8 mg/kg/min. Jede Infusionsrate wurde verabreicht über einen Zeitraum von 40 min. Insulin, C-Peptid und Glukose-Konzentrationen wurden gemessen bei 10, 20, 30 und 40 min in jeder Infusionsperiode.
Effekte von verlängerter intravenöser Glukose-Verabreichung auf die Insulin-sekretorischen Antworten nach abgestuften Glukose-Infektionen
Am Ende der abgestuften Glukose-Infusions-Untersuchung, wie oben beschrieben, wurde die Glukose intravenös per Infusion über einen 42-stündigen Zeitraum in einer Rate von 4,6 mg/kg/min zugeführt, um zu bestimmen, ob die sekretorischen Insulin-Antworten auf Glukose durch die Exposition gegen milde Hyperglykämie grundgelegt werden könnten. Die Subjekte konsumierten auch drei Kohlenhydrat angereicherte Mahlzeiten, während des zweiten Tages der Glukose-Infusion. Am Ende der 42-stündigen Infusions-Periode wurde die Infusionsrate über einen 60-minütigen Zeitraum vermindert und dann gestoppt. Dreissig Minuten später wurde die abgestufte Glukose Infusions-Untersuchung wiederholt. Plasma-Glukose-Spiegel wurden erhalten alle vier Stunden während der 42-stündigen Glukose-Infusion.
Assays
Plasma-Glukose wurde gemessen durch die Glukose-Oxidase-Technik (YSI analyzer, Yellow Springs, OH). Der Coeffizient der Variation dieses Verfahrens ist < 2%. Serum-Inuslin wurde ausgewertet durch eine Doppel-Antikörper-Technik (Morgan und Lazarow, 1963). Der Durchschnitt des Intra-Assay-Coeffizienten der Variation betrug 6%. Plasma C-Peptid wurde gemessen wie früher beschrieben (Faber et al., 1978). Der untere Grenzwert der Sensitivität des Assays war 0,02 pmol/ml und der Intra-Assay-Coeffizient der Variation betrug im Durchschnitt 6%. Alle Proben wurden zweifach gemessen. Assays wurden durchgeführt an der University of Chicago.
Daten-Analyse
Abschätzung von ISRs
ISRs wurden abgeleitet durch Dekonvolution von Plasma C-Peptid-Konzentrationen unter der Annahme eines Zwei-Compartment-Modells der C-Peptid-Leerungs-Kinetik (Van Cauter et al., 1992; Eaton et al., 1980; Polonsky et al., 1986).
Verhältnis zwischen Glukose und ISRs
Das Verhältnis zwischen Plasma-Glukose und ISR wurde untersucht in jedem Individuum durch Analysieren der Daten der abgestuften Glukose-Infusions-Untersuchungen. Ausgangswert-Glukose, Insulin, C-Peptid und ISRs wurden berechnet als Mittelwert der Werte in den –30, –20, –10 und 0 min-Proben. Während einer jeden Glukose-Infusions-Periode wurden durchschnittliche Glukose und ISRs berechnet. Mittlere ISRs für jede Periode wurden dann aufgetragen gegen die korrespondierenden Glukose-Spiegel, wodurch eine Dosis-Antwort-Beziehung zwischen Glukose und ISR etabliert wurde. Mittlere ISRs wurden bestimmt für 1 mM Glukose-Konzentrations-Intervalle durch Berechnen der Fläche unter der Kurve für jedes Intervall unter Verwendung der Trapezoidal-Regel. Diese Fläche wurde geteilt durch 1 mM, um die korrekten Einheiten zu erhalten (pmol/min).
Statistische Analysen
Alle Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standard-Abweichungen dargestellt. Daten-Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung des Statistical Analysis System (SAS Version 6 Edition for Personal Computers, SAS Institute, Inc., Cary, NC). Die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen wurde bestimmt unter Verwendung von gepaarten oder ungepaarten t-Tests oder Analyse der Varianz, wo dies geeignet war. Der Tukey-Student Bereichs-Test wurde verwendet für post-hoc-Vergleiche. Pearson's Korrelation-Coeffizient wurde verwendet, um Korrelationen zwischen Paaren von Parametern auszuwerten.
2. Ergebnisse
Glukose, Insulin und ISR während der abgestuften intravenösen Glukose-Infusion
Nüchterne Plasma-Glukose-Spiegel waren höher in der der diabetischen MODY3-Gruppe, verglichen mit der nicht-diabetischen Gruppe oder Kontrollen (7,5 ± 0,7 mM vs. 4,5 ± 0,2 mM und 4,7 ± 0,2; P > 0,0008. Die korrespondierenden nüchternen Plasma-Insulin-Spiegel waren niedriger in der diabetischen MODY3-Gruppe verglichen mit nicht-diabetischen Gruppen und Kontrollen (Tabelle 4). Glukose, Insulin und ISR-Antworten auf die Glukose-Infusionen sind dargestellt in 2A, 2B bzw. 2C.
Durchschnittliche Glukose-Konzentrationen über die Dauer der Untersuchung waren höher in den diabetischen MODY3-Subjekten im Vergleich mit den nicht-diabetischen MODY3 und Kontroll-Subjekten (8,5 ± 0,4 mM vs. 6,3 ± 0,3 mM und 64 ± 0,2; P < 0,0002) (2A). Durchschnittliche Insulin-Spiegel waren niedriger in den diabetischen und nicht-diabetischen MODY3-Gruppen als in den Kontrollen (57,4 ± 8,2 pmol/L und 79,8 ± 11,0 vs. 139,3 ± 14,7 pmol/L; P < 0,0006) (2B). Durchschnittliche ISR's waren signifikant niedriger in den diabetischen Gruppen verglichen mit den nicht-diabetischen MODY3-Subjekten und den Kontrollen (116 ± 18,8 pmol/min vs. 179,7 ± 19,9 pmol/min und 1995 ± 18,7; P < 0,02) (2C).
Tabelle 5
Die Menge des sekretierten Insulins mit dem Anstieg von Glukose von 5 bis 9 mM in Studien-Subjekten vor und nach den vorbereitenden intravenösen Infusionen von Glukose. Der Stern bezieht sich auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den diabetischen Subjekten und denjenigen in den anderen beiden Gruppen unter Verwendung von Tukey-Student Bereichs-Tests für post-hoc-Vergleiche.
Veränderungen in der Insulin-Sensitivität
Die Insulin-Resistenz abgeschätzt durch die Homeostase Modell-Auswertungsmethode (HOMA) (Matthews et al., 1985) konnte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zeigen (diabetische MODY3: 1,9 ± 0,2; nicht-diabetische MODY3: 1,7 ± 0,3; Kontrollen: 2,4 ± 0,2; P = 0,11).
Die Dosis-Antwort-Beziehung zwischen Glukose und ISR
Die ISR in den drei Gruppen wurde mit dem gleichen Plasma-Glukose-Spiegel durch Darstellen der mittleren ISR bei jeder Glukose-Infusions-Rate gegen den korrespondierenden mittleren Glukose-Spiegel verglichen. Die resultierenden Glukose-ISR-Dosis-Antwort-Beziehungen sind in 3 gezeigt. Über die 5–9 mM Glukose-Konzentrations-Inveralle sekretierte die diabetische MODY3-Gruppe signifikant weniger Insulin, als Subjekte in der nicht-diabetischen MODY3- und Kontroll-Gruppen (101 ± 17 pmol/min vs. 214 ± 25 pmol/min bzw. 211 ± 27 pmol/min, p < 0,004). Die mittlere Insulin-Sekretions-Rate wich nicht-signifikanten von diesen beiden letztgenannten Gruppen ab.
Die Dosis-Antwort-Kurven (3) zeigen, dass die Insulin-Sekretions-Raten ähnlich in nicht-diabetischen MODY-Subjekten und Kontrollen bei niedrigeren Glukose-Konzentrationen waren. Die Menge an Insulin sekretiert mit ansteigender Glukose-Konzentration von 5–7 mM war ähnlich in diesen beiden Gruppen (180 ± 19 vs. 160 ± 17 pmol/min; P = 0,45). Über das 7–8 mM Glukose-Intervall sekretierten die MODY3-Subjekte 243,5 ± 31,5 pmol/min verglichen mit 284,7 ± 30,5 pmol/min; in Kontrollen P = 0,37. Von 8–9 mM Glukose sekretierten sie 257,1 ± 35,0 pmol/min verglichen mit 354,0 ± 43,4 pmol/min; in Kontrollen P = 0,12 (3). Wenn die Glukose-Konzentration von 7–8 mM auf 8–9 mM erhöht wurde, war der Anstieg der Insulin-Sekretions-Rate in den nicht-diabetischen MODY3-Subjekten signifikant geringer als in den Kontrollen (37,3 ± 13,5 vs. 75,7 ± 9,5 pmol/min; P < 0,05).
Effekt der Niedrig-Dosis-Glukose-Infusion auf das Verhältnis zwischen Glukose und ISR
Mittlere Glukose-Spiegel erreicht während der konstanten 43-stündigen Glukose-Infusion waren signifikant höher in den Diabetikern verglichen mit den nicht-diabetischen MODY3-Gruppen und Kontrollen (14,9 ± 0,6 mM vs. 10,0 ± 1,4 mM vs. 6,6 ± 0,3 mM; P < 0,0001). Die Glukose-Infusion wurde unterbrochen nach 42 h und eine niedrig-dosierte Insulin-Gabe erfolgte, welche in einem Absenken der Plasma-Glukose-Konzentration auf ähnliche Spiegel in den beiden Gruppen führte. Die abgestufte intravenöse Glukose-Infusion-Untersuchung wurde dann in jedem Subjekt wiederholt.
Um den vorbereitenden Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion zu quantifizieren, wurde der durchschnittliche ISR, gemessen während einer jeden Glukose-Infusions-Rate, gegen die durchschnittliche Plasma-Glukose-Konzentration aufgetragen und verglichen mit Werten erhaltend vor der Glukose-Infusion. Über den Glukose-Konzentrationsbereich zwischen 5 und 9 mM Glukose, sekretierten die Kontroll-Subjekte 211 ± 27 pmol/min vor und 287 ± 32 pmol/min (P < 0,005) Insulin nach Glukose-Infusion (4A). Es trat eine Verschiebung in der Glukose-ISR-Dosis-Antwort-Kurve nach oben und nach links auf, wobei ISR sich um 38 ± 7% vergrößerte. Die nicht-diabetische MODY3-Gruppe erhöhte ihren ISR von 214 ± 25 pmol/min auf 259 ± 21 pmol/min (P < 0,03). (4B). Die diabetische MODY3-Gruppe zeigte eine kleinere und nicht signifikante Abnahme von 13 ± 10% an ISR nach Glukose-Verabreichung (101 ± 17 pmol/min auf 90 ± 21 pmol/min; P > 0,9) (4C). Individuelle Werte für ISR von 5–9 mM Glukose vor und nach niedrig-dosierter Glukose Infusion sind in Tabelle 5 gegeben.
Beziehung zwischen glykosylierten Hämoglobin-Spiegeln und Parametern der sekretorischen Insulin-Antwort auf Glukose
Es trat eine signifikant negative Korrelation zwischen glykosyliertem Hämoglobin und prozentualer Vorbereitung (r = 0,78; P < 0,002) und zwischen glykosyliertem Hämoglobin und ISR von 5–9 mM Glukose (r = 0,61; P < 0,03) auf. Im Gegensatz dazu trat keine signifikante Abnahme in ISR mit ansteigenden Glukose-Konzentrationen von 7–8 auf 8,9 mM bei ansteigendem glykosyliertem Hämoglobin-Spiegeln auf (r = 0,07; P = 0,82).
3. Diskussion
Die grundlegenden (= Ausgangswert-) Glukose-Spiegeln waren höher und die Insulin-Spiegel niedriger in MODY3-Subjekten mit Diabetes im Vergleich zu nicht-diabetischen Subjekten oder normal gesunden Kontrollen. Als Antwort auf die abgestufte Glukose-Infusion waren die Insulin-sekretorischen Raten signifikant niedriger in den diabetischen Subjekten über einen weiten Bereich der Glukose-Konzentrationen. Insulin-Sekretions-Raten in den nicht-diabetischen MODY3-Subjekten waren nicht signifikant unterschiedlich von den Kontrollen bei Plasma-Spiegeln < 8 mM. Mit Anstieg der Glukose über diesen Grad war jedoch der Anstieg in der Insulin-Sekretion in diesen Subjekten signifikant vermindert. Die Verabreichung von Glukose durch intravenöse Infusion für 42 h resultierte in einem signifikanten Anstieg der Menge an Insulin sekretiert über den 5–9 mM Glukose-Konzentrations-Bereich in den Kontrollen bzw. die nicht-diabetischen MODY3-Subjekten (um 38% bzw. 35%), jedoch wurde keine signifikante Veränderung in den diabetischen MODY3-Subjekten beobachtet. Man kann schlussfolgern, dass in nicht-diabetischen MODY3-Subjekten die Insulin-Sekretion eine verminderte Fähigkeit der Antwort demonstriert, wenn Blut-Glukose über 8 mM hinausgeht. Der grundlegende Effekt von Glukose auf die Insulin-Sekretion ist konserviert. Folglich ist die β-Zell-Dysfunktion vor dem Ausbrechen der offenkundigen Hyperglykämie in dieser Form von MODY vorhanden. Der Defekt in der Insulin-Sekretion in den nicht-diabetischen MODY3-Subjekten unterscheidet sich von denjenigen, welche früher in nicht-diabetischen MODY1 oder mild-diabetischen MODY2-Subjekten berichtet wurden.
Beispiel 2
Mutationen in HNF1α in Bezug auf MODY3-Typ Diabetes
1. Materialien und Methoden
Die Isolierung der partiellen Sequenz des menschlichen HNF1α-Gens
Der PAC-Klon, 254A7, enthaltend das menschliche HNF1α-Gen, wurde isolierte aus einer Bibliothek (Genome Systems, St. Louis, MO) durch Screenen von PAC DNA-Pools mit PCR und den Primern HNF1P1 (5'-TACACCACTCTGGCAGCCACACT-3' SEQ ID Nr. 10) und HNF1P2 (5'-CGGTGGGTACATTGGTGACAGAAC-3' SEQ ID Nr. 11). Die Sequenzen der Exons und der flankierenden Introns wurden bestimmt nach Subklonieren der Fragmente des 254A7 in pGEM-4Z (Promega Biotec, Madison, WI) oder pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) und Sequenzieren unter Verwendung von Primern basierend auf der Sequenz der menschlichen HNF1α cDNA (Bach et al., 1990; und Bach und Yaniv, 1993) und ausgewählt unter Verwendung der konservierten Exon-Intron-Organisation der Maus- und Ratten-Gene als Hilfe (Bach et al., 1992). Sequenzieren wurde durchgeführt unter Verwendung eines AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequening Kits (ABI, Foster City, CA) auf einem ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer (ABI). Die Sequenzen der Exon 2/Intron 2, Exon 3/Intron 3, Intron 6/Exon 7, und Intron 8/Exon 9/Intron 9-Verbindungen wurden bestimmt durch direkte Sequenzen der PCR-Produkte erzeugt durch Amplifikation von PAC 254A7 oder menschlicher genomischer DNA. 11 zeigt die cDNA-Sequenz von HNF1α.
Screening von HNF1α Gen auf Mutationen
Die zehn Exons und flankierende Introns des HNF1α-Gens eines betroffenen Subjektes von Familien, in welchen MODY einherging mit Markern aufspannend die MODY3-Region von Chromosom 12-Subjekten mit der MODY3-Form von NIDDM, wurden amplifiziert unter Verwendung von PCR und spezifischen Primern (Tabelle 6). PCR-Bedingungen waren Denaturierung bei 94°C für 5 min gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 30 sec, Annealen bei 62°C für 30 sec (außer für Exon 9, wobei die Annealing-Temperatur 60°C war) und Verlängerung bei 72°C für 45 sec, und letztendlich Verlängerung bei 72°C für 10 min. Die PCR-Produkte wurde aufgereinigt unter Verwendung einer Centricon-100 Membran (Amicon, Beverly, MA) und sequenziert von beiden Enden unter Verwendung der Primer, die in Tabelle 6 dargestellt sind, einem AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit und einem ABI Prism^TM 377 DNA Sequenzer. Das Vorliegen einer spezifischen Mutation in anderen Familien-Mitgliedern wurde ausgewertet durch Amplifizieren und direktes Sequenzieren des geeigneten Exons. Zumindest 40 normale, nicht verwandte gesunde, nicht-diabetische, nicht-spanische weiße Subjekte (80 Chromosomen) wurden zur gleichen Zeit in ähnlicher Art und Weise gescreent. DNA-Polymorphismen identifiziert im Verlauf des Screenens von Patienten für Mutationen wurden charakterisiert durch PCR und direktes Sequenzieren oder Verdauen mit einer geeigneten Restriktions-Endonuklease und Gel-Elektrophorese.
2. Ergebnisse
Tabelle 7 identifiziert die DNA Polymorphismen, identifiziert in der kodierenden Region des HNF1α-Gens. Selbstverständlich sind dies beispielhafte Polymorphismen und die Fachleute auf dem Gebiet werden leicht in der Lage sein, die Verfahren sowie die Beschreibungen dargestellt in der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren anderer Polymorphismen einzusetzen.
Tabelle 7 DNA-Polymorphismen identifiziert in der kodierenden Region des menschlichen HNF1α-Gens
Tabelle 8 zeigt eine Zusammenfassung von Mutationen, identifiziert in menschlichem HNF1α in Patienten mit MODY3. Sechzehn beispielhafte Mutationen sind in dem HNF1α-Gen in MODY3-Patienten identifiziert, waren jedoch nicht in nicht betroffenen Individuen vorhanden, wobei diese Mutationen Leserahmen-Verschiebungen in den Exons 1, 4, 6 und 9, Missense-Kodons in den Exons 2 und 7, wie auch abnormales Splicen in Introns 5 und 9 einschließen. Die Ergebnisse wie hier beschrieben demonstrieren, dass Mutationen in diesem Transkriptionsfaktor Diabetes mellitus auslösen können und wecken die Aufmerksamkeit auf die Rolle von HNF1α im Bestimmen von normaler Pankreas-β-Zell-Funktion.
3. Diskussion
Die Verknüpfungsanalyse lokalisierte MODY3 in einem 10 cM Intervall von Chromosom 12 zwischen den Markern D12S86 und D12S342 (Vaxillaire et al., 1995) und anschließend in einem 5 cM Intervall zwischen den Markern D12S86 und D12S807/D12S820 (Menzel, S. et al., 1995). Ein kombiniertes YAC, BAC und PAC Contig aufspannend D12S86 und D12S807 (9) wurde erzeugt in der Verwendung von Information in öffentlichen Datenbanken (Chumakov et al., 1995; Hudson et al., 1995) und Screenen geeigneter Bibliotheken (YAC und BAC, Research Genetics, Huntsville, Alabama; und PAC, Genome Systems, St. Louis, Missouri) mit STSs aus der MODY3-Region. Die physikalische Kartierung ermöglicht die Lokalisierung neuer Polymorphismen wie berichtet wie auch die Erzeugung neuer Marker um desweiteren Rekombinationsereignisse in Schlüssel-Individuum zu lokalisieren. Solche Untersuchungen verfeinerten die Lokalisierung von MODY3 auf ein 3 cM-Intervall zwischen D12S1666 und den polymorphen STS UC-39. Chromosomale in situ Fluoreszenz-Hybridisierung unter Verwendung des BAC 162B15 kartierte das Contig auf Chromosom-Band 12q24.2.
Diese Kombination von genetischer und physikalischer Kartierungs-Information wurde verwendet, um eine systematische Suche nach MODY3 durchzuführen. Unter Verwendung einer Kombination von Ansätzen, einschließend Test-Genen, von denen man weiß, dass sie auf dem langen Arm des Chromosoms 12 liegen, um zu sehen, ob sie in dem Contig kartiert sind, Exon-Trappen (Church, et al., 1994), und cDNA-Selektion (Kaplan et al., 1992) unter Verwendung von menschlichen Langerhans-Inselchen cDNA (klinische Studien hatten gezeigt, das Insulin-Sekretion abnormal in MODY3-Patienten war und folglich waren die Inselchen eine wahrscheinliche Stelle der Expression von MODY3 mRNA und Protein), identifizierten die Autoren 14 Gene, kodierend bekannte Proteine (γ-Untereinheit der AMP-aktivierten Protein-Kinase, Zitron, das GTP-bindende Protein H-ray, Paxillin, das saure Ribosomale Phospho-Protein PO, die Pancreas-Phospholipase A2, den Splice-Faktor SRp30, die Zytochrome C-Oxidase-Untereinheit VIa, die kurzkettige Acyl CoA-Dehydrogenase, HNF1α, mit dem Thyroid-Rezeptor wechselwirkendes Protein (TRIP14), Ca²⁺/Calmodulin-abhängige Protein-Kinase, P_2×4 Purinoceptor und Restin), 5 Pseudogene (Metallopanstimulin-artig, ein Protein ähnlich wie das Zelloberflächen-Heparin-bindende Protein, ein Protein ähnlich dem Ribosomal-Protein L12, ein Protein-ähnlich der Nukleosid-Diphosphatkinase und eines ähnlich dem ADP Ribosylierungsfaktor), 12 ESTs (yq81d09, yd50d03, IB383, hbc3028, yu36h05, yn75d09, yz51b06, yd88g07, ym03h09, ym30e05, WI-6178/c-01h06, WI-6239/c-04b12) und 9 unbekannte Gene (9).
Diese Gene wurden systematisch sequenziert in betroffenen und nicht-betroffenen Subjekten unter Verwendung von verschachtelter PCR und illegitimer Transkription von Lymphoblastoiden RNA (Kaplan et al., 1992), wie auch von PCR von individuellen Exons des Gens. Vergleich der Sequenzen mit der Pancreas-Phospholipase A2, γ-Untereinheit von AMP-aktivierter Protein-Kinase, H-ray, Zytochrom C Oxidase Untereinheit VIa, saurem ribosomalen Phospho-Protein PO, Paxillin, Splice-Faktor (SRp30, kurzkettige Acyl CoA Dehydrogenase und P_2×4 purinoceptor-Gene von Patienten und Kontrollen zeigt eine Vielzahl von Polymorphismen, jedoch keine MODY3 assoziierten Mutationen.
Das HNF1α-Gen wurde lokalisiert im Intervall enthaltend MODY3 unter Verwendung von PCR und HNF1α-Gen spezifischen Primern (9). HNF1α cDNAs wurden auch isoliert in hoher Häufigkeit durch cDNA-Selektion aus menschlichen Langerhans-Inselchen cDNA unter Verwendung von PAC 254A7, ein Ergebnis, welches konsistent ist mit dem Bericht von Emens et al., (1992), welcher zeigt, dass HNF1α in Hamster-Insulinom-Zellen exprimiert wurden und als schwacher Transaktivator des Insulin-I-Gens in Ratten fungierte. Das menschliche HNF1α-Gen wurde isoliert und teilweise sequenziert, um die Exon-Intron-Organisation zur Verfügung zu stellen und die Sequenzen der Introns aus welchen Primer für die PCR ausgewählt werden könnten. Das menschliche Gen besteht aus 10 Exons mit Introns 1-8, lokalisiert an der gleichen Stelle wie in Genen von Ratte und Maus (Bach et al., 1992). Intron 9 unterbricht das Kodon 590 (phase 1) und liegt in den Genen von Ratten und Maus nicht vor, tritt jedoch im Gen von Huhn auf (Hörlein et al., 1993), was konsistent ist mit dem Verlust dieses Introns während des Zeitraums, als Menschen und Nagetiere den letzten gemeinsamen Vorfahren teilten. Die Amplifikation und das direkte Sequenzieren von Exon 4 des Subjekts EA1 (Edingburgh Stammbaum, 5A) zeigte eine Insertion eines C im Kodon 289 (Pro), was in einer Leserahmen-Verschiebung und einer unausgereiften Termination mündete (abgekürzt P289fsinsC) (10). Diese Mutation zeigte sich in allen betroffenen Mitgliedern und in keinen der nicht betroffenen Mitglieder in dieser Familie. Sie zeig te sich auch nicht beim Screenen von 55 gesunden, nicht-diabetischen weißen Subjekten (110 Chromosomen). Folglich wurde geschlossen, dass das HNF1α-Gen MODY3 ist, was die Erfinder dazu führte, das HNF1α-Gen in anderen Familien, in welchen NIDDM mit Markern aus der MODY3-Region einhergeht, zu sequenzieren.
Fünfzehn weitere Mutationen wurden gefunden (Tabelle 8), welche allesamt gemeinsam mit NIDDM einhergingen und nicht in irgendwelchen von zumindest 50 gesunden nichtdiabetischen weißen Subjekten auftraten. Jedoch gab es Individuen in verschiedenen Stammbäumen (GK-Stammbaum, III-3; Ber-Stammbaum, V-2; und P-Stammbaum, IV-5 und IV-6), welche das mutierte Chromosom ererbt hatten (und den gefährdeten Chromosom 12-Haplotyp), welche aber Nicht-Diabetiker waren oder nur Belege von gestörter Glukose-Intoleranz oder Diabetes während der Schwangerschaft zeigten. Diese Individuen werden wahrscheinlich NIDDM in der Zukunft entwickeln. Darüber hinaus zeigte ein Subjekt mit NIDDM das Mutanten-Allel nicht (Ber-Stammbaum, II-2). Bei ihm wurde NIDDM im Alter von 65 Jahren diagnostiziert, zu einer Zeit, in der er leicht übergewichtig war, mit einem Body-Maß-Index von 27 kg/m², was eine Diagnose einer spät beginnenden NIDDM nahe legt, und eher nicht MODY. Solche Heterogenität zwischen MODY-Familien wurde bislang festgestellt (Bell et al., 1991; Vionnet 1992) und ist begründet in der hohen Häufigkeit von spät auftretender NIDDM, welche 10% oder mehr von Individuen über 65 Jahre betrifft (Kenny et al., 1995). Zusätzlich zu den Mutationen, aufgeführt in Tabelle 8, wurden drei Aminosäure-Polymorphismen (I/L27, A/V98 und S/N487), vier ruhende Polymorphismen (in Kodons für L17, G288, L459 und T515 und sieben Polymorphismen in Introns in dem HNF1α-Gen (Tabellen 7 und 8) gefunden.
Sechzehn verschiedene Mutationen in dem HNF1α-Gen wurden im Patienten mit der MODY3-Form von Diabetes gefunden. Die Splicing- und Leserahmen-Verschiebungs-Mutationen sollten in der Expression eines verkürzten Proteins resultieren mit zumindest den Aminosäuren-1-290 des nativen Proteins. Die Missense-Mutationen, R131Q und P447L stammen von Resten, welche im Menschen, Ratten, Maus, Hamster, Huhn, Xenopus und Lachs HNF1α konserviert sind sowie im strukturell-verwandten Transkriptions-Faktor, menschliches HNF1β, was nahe liegt, dass diese Reste funktionell bedeutsam sind.
HNF1α ist nur einer von einer Gruppe von Transkriptions-Faktoren, welche in der Leber exprimiert werden, welche zusammen wirken, um gewebsspezifische Expression von diesem Gewebe zu vermitteln (Tranche et al., 1992; Bach et al., 1990). Es wurde auch in Niere, Darm, Magen und Bauchspeicheldrüse gefunden, einschließend den Langerhans-Inselchen, und in geringen Spiegeln in Milz und Hoden, was nahe liegt, das eine Rolle spielt in der transkriptionellen Regulation auch in diesen Geweben. HNF1α besteht aus drei funktionellen Domänen: einer NH₂-terminalen Dimerisierungsdomäne (Aminosäuren 1–32), einer DNA-bindenden Domäne mit POU-ähnlichen und homeodomain-ähnlichen Moviten (Aminosäuren 150-280) sowie einer COOH-terminalen Transaktivierungsdomäne (Aminosäuren 281-631). Die funktionale Form von HNF1α ist ein Dimer und HNF1α kann Homodimere oder Heterodimere mit den strukturell-verwandten Protein HNF1β (Mendel et al., 1991) bilden.
Pontoglio et al. (1996) haben Mäuse erzeugt, welchen HNF1α fehlt, erzeugt. Homozygote HNF1α defiziente Tiere zeigten keinerlei Wachstum und starben zur Zeit des Stillens. Sie litten auch unter Phenylketonurie und renaler tubulärer Dysfunktion. Jedoch schienen die homozygoten HNF1α defizienten Mäuse nicht diabetisch zu sein, da sie normale Blut-Glukose-Spiegel und eine normale Antwort auf eine intravenöse Bolus-Injektion von Glukose zeigten. Die massive Glukosurie in diesen Tieren kann möglicherweise das Vorliegen von Diabetes mellitus maskiert haben. Die Insulinsekretorischen Antworten von heterozygoten HNF1α defizienten Mäusen, Tieren, welche am ähnlichsten mit menschlichen Subjekten mit HNF1α-Mutation und MODY sein können, wurden nicht berichtet. Im Hinblick auf die vorliegenden Ergebnisse, dass Mutationen in dem HNF1α-Gen ein früh anschaltendes NIDDM auslösen, ist eine detailliertere Evaluation der β-Zellen sowie der Leberfunktion in HNF1α-defizienten Mäusen angezeigt.
Der Mechanismus, durch welchen die Mutationen in dem HNF1α-Gen, wenn es auf einem einzelnen Allel auftritt, Diabetes erzeugen kann ist unklar, jedoch ist es möglich, dass eine teilweise Defizienz von HNF1α zu einer β-Zell-Dysfunktion und Diabetes führen kann. Alternativ können Mutationen in HNF1α Diabetes durch einen dominant-negativen Mechanismus (Herskowitz, 1987) durch Wechselwirken mit der Funktion von Wild-Typ HNF1α und anderen Proteinen, welche konzertiert mit HNF1α wirken und die Transkription in den β-Zellen und/oder der Leber zu regulieren, verursachen. Alle der HNF1α-Gen-Mutationen, welche bis heute identifiziert worden sind, würden zu der Synthese eines mutierten Proteins führen, welches geschädigt ist in DNA-Binden oder in der Transaktivierung, jedoch nicht in der Dimerisierung. Diese mutierten Proteine könnten nicht-produktive Dimere ausbilden mit dem Produkt des normalen HNF1α-Allels oder anderen Proteinen, wie z.B. HNF1β, und dadurch die normale Funktion von HNF1α beeinträchtigen.
Die Erfinder haben früher gezeigt, dass Diabetes mellitus in der Zucker-Diabetes Fettratte, einem Nagetier-Modell der Fettsucht und von NIDDM, mit einer verminderten Expression einer Vielzahl von β-Zell-Genen assoziiert ist, einschließend Gene, wie z.B. Insulin, dessen Expression auf die β-Zellen beschränkt ist, wie auch andere mit viel breiterer Gewebs-Verteilung (Tokuyama, et al., 1995). Folglich glaubt man, dass NIDDM wahrscheinlich eine Erkrankung der Transkription mit genetischen oder erlangten Defekten ist, welche Schlüssel-Proteine betreffen, welche die Transkription regulieren, was zur β-Zell-Dysfunktion und Diabetes führt.
Beispiel 3
Mutationen in HNF4α, verwandt mit MODY1-Typ Diabetes
Der PAC-Klon, 114E13, 130B8, 207N8, enthaltend das menschliche HNF4α-Gen wurde isoliert aus einer Bibliothek (Genome Systems, St. Louis, MO) durch Screenen von PAC DNA Pools mit PCR und mit den Primern HNF4P1 (5'-CACCTGGTGATCACGTGGTC-3' SEQ ID Nr. 81) und HNF4P2 (5'-GTAAGGCTCAAGTCATCTCC-3' SEQ ID Nr. 82). Die Sequenzen der Exons und der flankierenden Introns wurden bestimmt durch direktes Sequenzieren unter Verwendung von Primern, basierend auf der Sequenz der menschlichen HNF1α cDNA (Chartier et al., 1994; Drewes et al., 1996) und ausgewählt unter Verwendung der konservierten Exon-Intron-Organisation der Maus (Taraviras et al., 1994) als eine Richtlinie. Das Sequenzieren wurde durchgeführt unter Verwendung eines AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequening Kit (ABI, Foster City, CA) auf einem ABI Prism TM 377 DNA Sequencer (ABI).
Screenen des HNF4α-Gens auf Mutationen
Die elf Exons und flankierende Regionen des HNF4α-Gens eines betroffenen Subjekts in Familien, in welchen MODY mit Markern aufspannend die MODY1-Region von Chromosom 20 in Subjekten mit der MODY1-Form von NIDDM einherging, wurden amplifiziert unter Verwendung von PCR und spezifischen Primern (Tabelle 9). PCR-Bedingungen waren Denaturierung bei 94°C für 5 min gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 30 sec, Annealen bei 60°C für 30 sec und Verlängerung bei 72°C für 30 sec, und letztendlich Verlängerung bei 72°C für 10 min. Die PCR-Produkte wurde aufgereinigt unter Verwendung einer Centricon-100 Membran (Amicon, Beverly, MA) und sequenziert von beiden Enden unter Verwendung der Primer, die in Tabelle 9 dargestellt sind, einem AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit und einem ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer. Das Vorliegen einer spezifischen Mutation in anderen Familien-Mitgliedern wurde ausgewertet durch Verdauen mit Bta3 Restriktions-Endonuklease, die aus Mutation und Gel-Elektrophorese resultierte. Zumindest 100 normale und verwandte gesunde nicht-diabetische nicht-spanische weiße Subjekte (200 normale Chromosome) wurden zur gleichen Zeit in ähnlicher Art und Weise gescreent. DNA-Polymorphismen identifiziert im Verkauf des Screenens von Patienten für Mutationen wurden charakterisiert durch PCR und direktes Sequenzieren oder Verdauen mit einer geeigneten Restriktions-Endonuclease und Gel-Elektrophorese.
Tabelle 10 identifiziert die DNA Polymorphismen und Mutationen, identifiziert in der kodierenden Region des HNF4α-Gens. Selbstverständlich sind dies beispielhafte Polymorphismen und die Fachleute auf dem Gebiet werden leicht in der Lage sein, die Verfahren sowie die Beschreibungen dargestellt in der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren anderer Polymorphismen einzusetzen. 7 zeigt ein Alignment der HNF4α-Protein-Sequenz von Menschen mit Sequenzen von Maus, X. Laves und Drosophila. Die möglichen DNA-Bindungs-Stellen sind unterstrichen und die möglichen Liganden-Bindungsstellen sind fett dargestellt. Die DNA-Sequenzen für Exon 1, Exon 1b, Exon 2, Exon 3, Exon 4, Exon 5, Exon 6, Exon 7, Exon 8, Exon 9 und Exon 10 von HNF4α sind in 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G, 8I, 8H, 8I und SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 52 und SEQ ID Nr. 54 dargestellt. Es ist angedacht, dass Mutationen von HNF4α in irgendwelchen dieser Exons oder den verwandten Intron-Regionen dazwischen in MODY1 Typ Diabetes resultieren.
Tabelle 10 Polymorphismen und Mutationen in dem menschlichen HNF4α-Gen
Der R-W-Stammbaum, welcher mehr als 360 Mitglieder enthält, aufspannend 6 Generationen und 74 Mitglieder mit Diabetes, einschließend diejenigen mit MODY, wurde mit Weitblick seit 1958 untersucht (Fajans, 1989). Die Mitglieder dieser Familie sind Nachkommen eines Mannes, welcher in East Prussia in 1809 geboren wurde und nach Detroit, Michigan 1861 mit seinen vier Söhnen emigrierte, von denen drei Diabetiker waren sowie mit fünf Töchtern, von welchen eine Diabetikerin war (Fajans, 1989; Fajans et al., 1994). Verknüpfungsuntersuchungen haben gezeigt, dass das Gen verantwortlich für MODY in dieser Familie, MODY1, eng verknüpft ist mit Markern im Chromosom-Band 20q12-q13,1 mit einem Multipoint Lod Score > 14 in Zweigen der Familie, in welchen MODY abgesondert wird (Bell, et al., 1991; Bowden, et al., 1992; Irwin, et al., 1994). Die Analyse der Schlüssel-Rekombinanten in dem R-W-Stammbaum lokalisierte MODY1 auf einem 13-cM Intervall (~7 Mb) zwischen D20S169 und D20S176, ein Intervall, welches auch das Gen einschließend HNF4 (Stoffel, M. et al., 1996) einschließt. Der Nachweis in früheren Beispielen, dass Mutationen in dem HNF1α-Gen die Ursache der MODY3-Form von NIDDM sind, haben die Erfinder veranlasst, das HNF4α-Gen auf Mutationen in dem R-W-Stammbaum zu screenen.
Das menschliche HNF4α-Gen besteht aus 11 Exons, wobei die Introns an der gleichen Position wie Maus-Gen lokalisiert sind (Tavaviras, et al., 1994). Alternatives Splicen erzeugt eine Familie von HNF4α mRNAs, HNF4 1, 2 und 4, wobei die beiden letzten Inserts von 30 bzw. 90 Nukleotiden enthalten (Tavaviras et al., 1994; Laine et al., 1994; Drewes, 1996). Von diesen scheint HNF4 2 mRNA das am häufigst vorkommende Transkript in vielen Geweben zu sein. Im Gegensatz zu einem früheren Bericht (Drewes et al., 1996), zeigen die Untersuchungen der Erfinder, dass HNF4α mRNA eine verkürzte und vermutlich nicht-funktionelle Form von HNF4α kodiert. Die Sequenz von Exon 1B, dem Exon kodierend die Insertion in HNF4α mRNA liefert ein zusätzliches T zwischen den Nukleotide 219 und 220 in beiden Allelen von fünf unverwandten Individuen (10 Chromosomen), welche in der cDNA-Sequenz nicht vorliegen (Drewes et al., 1996), was eine Leserahmen-Verschiebung und die Erzeugung eines Proteins von 98 Aminosäuren verursacht, dessen Funktion, falls es eine gibt, unbekannt ist. Die elf Exons des HNF4α-Gens von zwei betroffenen, V-20 und 22 und einem unbetroffenen Subjekt aus dem R-W-Stammbaum, VI-9, wurden amplifiziert und die PCR-Produkte wurden direkt sequenziert. Die Sequenzen waren identisch untereinander und mit der cDNA (Drewes et al., 1996; Laine et al., 1994) außer einer C→T Substitution in Exon 4, Kodon 130, und Exon 7, Kodon 268. Die C→T Substitution in Kodon 130 resultiert in einer Substitution Thr (ACT)→Ille (ATT) und ist ein Polymorphismus (T/I 130) mit einer Häufigkeit des Ile Allels in einer Gruppe von 55 verwandten, nicht-diabetischen nicht-spanischen weißen Subjekten von 5%. Die C→T Substitution in Kodon 268 resultiert in einer Nicht-Sense-Mutation CAG (Gln)→TAG (AM) (Q268X). Die Nicht-Sense-Mutation wurde bestätigt durch Klonieren und Sequenzieren von PLCR-Produkten ab geleitet von beiden Allelen. Die Q268X Mutation erzeugte eine Stelle für das Enzym Bfa I mit Verdauen des normalen Allels, was Fragmente von 281 und 34 bp erzeugte, und des Mutanten Allels, 152, 129 und 34 bp, und was das Testen auf diese Mutation in anderen Mitgliedern des R-W-Stammbaums ermöglichte. In dem R-W-Stammbaum waren Ile 130 und die gelbe Mutation am Kodon 268 im gleichen Allel vorhanden.
Die Q268X Mutation trat gemeinsam mit dem gefährdeten Haplotypen und NIDDM in dem R-W-Stammbaum auf und wurde nicht beobachtet beim Screenen von 108 gesunden nicht-diabetischen, nicht-spanischen weißen Subjekten (216 normale Chromosome). Sieben Subjekte in dem R-W-Stammbaum, welcher das mutierte Allel vererbt hatten (V-18, 37 und 48; und VI-6, 11, 15 und 20) weisen normale Glukose-Toleranz auf. Das Alter von fünf dieser Subjekte (V-48 und VI-6, 11, 15 und 20) sind geringer als 25 Jahre und folglich liegen sie immer noch in einem Altersbereich, in dem Diabetes sich üblicherweise in gefährdeten Individuen in dieser Familie entwickelt. Bei den anderen ist Subjekt V-18 44 Jahre alt und zeigte normale Glukose bei allen oralen Glukose-Toleranz-Tests und Subjekt V-37, die 36 Jahre alt ist zeigte im Glukose-Toleranz-Test eine Charakteristik von geschädigter Glukose-Toleranz und eine von Diabetes im Alter von 16–17 Jahren, wobei jedoch für die letzten 19 Jahre jeder Glukose-Toleranz-Test normal war, obwohl sie eine geringe Insulin-Antwort auf die oral verabreichte Glukose zeigte. Sie ist sehr mager und aktiv und hat eine erhöhte Sensitivität auf Insulin während der häufig genommenen intravenösen Glukose-Toleranz-Test gezeigt. Während einer verlängerten niedrig dosierten Glukose-Infusion zeigte sie merkliche Hyperglykämie (Herman, et al., 1994; Byrne, et al., 1995). Zwei Subjekte (V-1 und 4), welche die Mutation aufweisen, wurden als Nicht-Diabetiker betrachtet, basierend auf ihrer medizinischen Vergangenheit und ihr betroffener Status muss durch orale Glukose-Toleranz-Tests bewertet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Nicht-Sense-Mutation in dem HNF4-Gen in dem R-W-Stammbaum hoch jedoch nicht vollständig durchdringend ist, obwohl das Alter des Ausbrechens der Diabetes variabel ist.
Zusätzlich zu den Subjekten, welche die Q268X Mutation ererbt haben, aber derzeit nicht unter Diabetes leiden, gibt es Subjekte in dem R-W-Stammbaum, welche NIDDM aufweisen, jedoch nicht die Q268X Mutation oder den gefährdeten Haplotypen ererbt haben. Subjekt IV-9 wurde mit NIDDM diagnostiziert im Alter von 38 Jahren und war hyperinsulinämisch, eine Diagnose, welche konsistent ist mit spät ausbrechender NIDDM, eher als von MODY. Die Erfinder testeten auch ihre sechs Kinder, wobei eines davon NIDDM aufwies und ein anderes eine geschädigte Glukose-Toleranz und alle zwei normale Allele aufwiesen. Ähnlich wurden zehn Kinder des Subjekts III-7 getestet, von denen fünf NIDDM aufwiesen und keines die Q268X Mutation ererbt hatte, was nahe legt, dass die NIDDM in diesem Zweig der R-W-Familie von einer anderen Ätiologie stammt. Schließlich wurden die fünf Nicht-Diabetiker-Kinder von III-11 auch getestet und alle waren normal. Das Vorliegen von sowohl MODY als auch spät-ausbrechendem NIDDM in der R-W-Familie wurde bereits früher registriert (Bell, et al., 1991; Bowden, et al., 1992). Der MODY-Phenotyp resultiert von einer Mutation im HNF4-Gen. Die Ursache(n) der spät ausbrechenden NIDDM ist (sind) unbekannt.
HNF4 ist ein Mitglied der Steroid/Thyroid-Hormon-Rezeptor-Superfamilie und wird in den höchsten Spiegeln in Leber, Niere und Darm exprimiert (Xanthopoulos et al., 1991; Sladek et al., 1990). Es wird auch in den Langerhans-Inselchen und Insulinom-Zellen exprimiert (Miquerol, et al., 1994). In der Leber ist HNF4α ein Schlüssel-Regulator der hepatischen Gen-Expression und ist ein Haupt-Aktivator von HNF1α, welches wiederum die Expression einer Vielzahl von Leber-spezifischen Genen, einschließend diejenigen involviert in Glukose-, Cholesterol- und Fettsäure-Metabolismen (Sladek et al., 1990; Kuo et al., 1992) aktiviert. Seine Expression in Niere, Darm und Langerhans-Inselchen impliziert, dass es eine zentrale Rolle in der Gewebs-spezifischen Regulation der Gen-Expression auch in diesen Geweben spielt, obwohl seine spezifische Funktion in nicht-hepatischen Geweben nicht adressiert worden ist. Homozygoter Verlust von funktionellem HNF4α-Protein verursacht Embryo-Sterblichkeit charakterisiert durch die Defekte in der Gastrulation, was die Schlüsselrolle, eingenommen von diesem Transkriptions-Faktor in der Entwicklung und Differentiation unterstreicht (Chen et al., 1994). Der Phenotyp der heterozygoten Tiere wurde nicht beschrieben und weitere Untersuchungen sind notwendig, um zu bestimmen, ob sie ein Maus-Modell von MODY repräsentieren.
HNF4α definiert eine Unterklasse von nukleären Rezeptoren, welche in erster Linie im Kern befindlich sind und an ihre Erkennungs-Stelle binden und die Transkription von Homodimeren regulieren (Sladek et al., 1994; Kuro et al., 1992). Die Schlüsselrolle, gespielt von HNF4α in der Regulation von hepatischer Gen-Expression ist wohl etabliert (Sladek et al., 1994; Kuo et al., 1992). Jedoch ist seine Rolle wie auch diejenige von HNF1α, dem MODY3-Produkt und einem strangabwärts gelegenen Target der HNF4α Wirkweise, beim Regulieren der Gen-Expression in den Insulin-sekretierten Pankreas β-Zellen gemeinhin unbekannt, obwohl Emens et al., (1992) gezeigt haben, dass HNF1α ein schwacher Transaktivator des Insulin-Gens ist. Folglich ist der Mechanismus, durch welchen die Mutationen in HNF4α in einer autosomal dominanten Form von NIDDM resultieren, charakterisiert durch Pancreas-β-Zell-Dysfunktion, unklar. Die Nicht-Sense-Mutation in HNF4α, gefunden in den R-W-Familien, wird als in der Synthese eines Proteins von 267 Aminosäuren mit einer intakten DNA-Bindungsdomäne resultierend prognostiziert. Jedoch fehlen die Regionen involviert in die Dimerisierung und die transkriptionelle Aktivierung in anderen Mitgliedern der Steroid/Thyroid-Hormon-Superfamilie (Zhang, et al., 1994; Bourguet, et al., 1995; Renaud, et al., 1995; Wagner, R. L. et al., 1995) und als eine Konsequenz glaubt man, dass es nicht in der Lage ist zu dimerisieren, an seine Erkennungsstelle zu binden und die Transkription zu aktivieren. Folglich rührt die dominante Vererbung von einer Reduktion in der Menge von HNF1α per se und weniger von einem dominant negativen Mechanismus her. Die verminderten Spiegel von funktionellem HNF4α scheinen einen kritischen Effekt auf die β-Zell-Funktion aufzuweisen, vielleicht als eine Konsequenz der verminderten HNF4α Gen-Expression, wobei Mutationen in diesem Gen auch zu einer Art von MODY führen, wie in den Beispielen oben beschrieben. Prädiabetische Subjekte mit Mutationen, entweder in den HNF4α- oder HNF1α-Genen, zeigen ähnliche Normalitäten in der Glukose-stimulierten Insulin-Sekretion, mit normalen Insulin-Sekretions-Raten bei niedrigeren Glukose-Konzentrationen, jedoch geringer als normale Raten, wenn die Glukose-Konzentration ansteigt (Byrne et al., 1995), ein Ergebnis, welches konsistent ist mit der Auswirkung von HNF4α und HNF1α auf einen gemeinsamen mechanistischen Pfad in den Pankreas-β-Zellen. Die Abwesenheit von offenkundiger hepatischer, renaler oder gastrointestinaler Dysfunktion in betroffenen Mitgliedern des R-W-Stammbaums legt nahe, dass die Spiegel von HNF4α in diesen Geweben, obwohl sie möglicherweise geringer sind als normal, hinreichend sind, die normale Funktion zu gewährleisten, oder dass alternative mechanistische Pfade hinreichend sind für die Expression von Schlüssel-Genen. Jedoch wurden detaillierte Untersuchungen der hepatischen Glukose-Produktion bzw. des Mechanismus in Subjekten des R-W-Stammbaum nicht durchgeführt und es ist möglich, dass geringfügige Veränderungen in diesen Prozessen vorliegen können.
Die Demonstration, dass MODY von Mutationen in den HNF1α- und HNF4α-Genen herrühren kann, legt nahe, dass diese Form von NIDDM in erster Linie einer Erkrankung von abnormaler Gen-Expression ist. In dieser Hinsicht sollten Gene, kodierend andere Proteine in der HNF1α/HNF4α regulatorischen Kaskade, wie z.B. andere Mitglieder der HNF1- (Mendel et al., 1994) bzw. HNF4-Familien (Drewes et al., 1996), wie auch HNF3 (Lai et al., 1993), HNF6 (Lemaigre, et al., 1996) und vielleicht dem Dimerisations-Co-Faktor von HNF1 (Mendel et al., 1991) als Kandidaten für andere Formen von MODY und/oder spät ausbrechender NIDDM betrachtet werden. Die Rolle von HNF4α in der Entwicklung der üblicheren spät-ausbrechenden NIDDM ist unbekannt. Es gibt keinen Hinweis auf eine Verknüpfung von Markern flankierend das HNF4α-Gen mit spätausbrechender NIDDM in mexikanischen Amerikanern oder Japanern, was impliziert, dass Mutationen in dem HNF4α-Gen unwahrscheinlich dafür sind, dass ein signifikanter genetischer Faktor zur Entwicklung der spät ausbrechenden NIDDM beiträgt. Jedoch können erlangte Defekte in der HNF4α-Expression, zumindest teilweise, zur β-Zell-Dysfunktion beitragen, welche das spät-ausbrechende NIDDM charakterisiert (Polonsky et al., 1996), speziell, da sie eine zentrale Rolle beim Regulieren der Gen-Expression in den Pankreas-β-Zellen spielt, wie durch seine Assoziation mit MODY nahegelegt wird. Des Weiteren eröffnet die Ähnlichkeit zwischen HNF4α und Ligandenabhängigen Transkriptions-Faktoren die Möglichkeit, dass HNF4α und die Gene, die es reguliert, auf einen nicht-identifizierten Liganden antworten. Die Identifikation solch eines Ligandens durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung wird zu neuen Ansätzen zur Behandlung von Diabetes führen.
BEISPIEL 4
Organisation und Teilsequenz des HNF4α-/MODY1-Gens und Identifikation von Missense-Mutation, R127W, in einer Japanischen Familie mit MODY
HNF4α ist ein Mitglied der Kern-Rezeptor-Superfamilie, eine Klasse von Ligandenaktivierten Transkriptions-Faktoren. Eine Nicht-Sense-Mutation in dem Gen, kodierend diesen Transkriptions-Faktor wurde in jüngster Zeit in einer weißen Familie gefun den mit einer Form der in der Pubertät beginnenden Diabetes in jungem Alter, MODY1. Im vorliegenden Beispiel berichten die Erfinder von der Exon-Intron-Organisation und der Partial-Sequenz des menschlichen HNF4α-Gens. Darüber hinaus haben die Erfinder die zwölf Exons, flankierende Introns und die minimale Promotor-Region auf Mutationen in einer Gruppe von 57 japanischen Subjekten, die nicht miteinander verwandt sind, mit früh beginnendem NIDDM/MODY von unbekannter Ursache gescreent. Acht Nukleotid-Substitutionen wurden festgehalten, von welchen eine in einer Mutation eines konservierten Arginin-Restes, Arg127 (CGG)→Trp (TGG) bzw. R127W), lokalisiert in der T-Box, einer Region des Proteins, welches eine Rolle in der HNF4α-Dimeristion und den DNA-Binden spielen kann, resultierte. Diese Mutation wurde nicht in 214 nicht an Diabetes erkrankten Subjekten, welche nicht miteinander verwandt waren, gefunden (53 Japaner, 53 Chinesen, 51 Weiße und 57 Afro-Amerikaner). Die R127W Mutation lag nur in drei von fünf an Diabetes erkrankten Mitgliedern dieser Familie vor, was nahe legt, dass sie nicht die einzige Ursache von Diabetes in dieser Familie ist. Die verbleibenden sieben Nukleotid-Substitutionen waren lokalisiert in der benachbarten Promotor-Region und den Introns. Man glaubt nicht, dass sie die Transkription des Gens oder die mRNA-Prozessierung beeinträchtigen und sie repräsentieren Polymorphismen und seltene Varianten. Die Ergebnisse legen nahe, dass Mutationen in dem HNF4α-Gen das frühe Ausbrechen von NIDDM/MODY in Japanern verursachen können, aber sie sind mit weniger Gemeinsamkeiten ausgestattet als Mutationen in dem HNF1α/MODY3-Gen. Die Information auf der Sequenz des HNF4α-Gens und seiner Promotor-Region wird die Suche nach Mutationen in anderen Populationen und Untersuchungen der Rolle dieses Gens bei der Bestimmung der normalen Pankreas-β-Zell-Funktion ermöglichen.
1. Methoden
Isolierung und Partial-Sequenz des menschlichen HNF4α-Gens
Drei P1-abgeleitete artifizielle Chromosomen- (PAC) Klone, (114E13, 130B8 und 207N8), enthaltend das menschliche HNF4α-Gen wurden isoliert durch Screenen von PAC DNA-Pools (Genome System, St. Louis, MO) durch PCR^TM mit HNF4α-spezifischen Primern (Yamagata et al., 1996a). Die Partialsequenz des HNF4α-Gens wurde bestimmt unter Verwendung von DNA aus PAC's 114E13 und 207N8 und Sequenz-spezifischen Primern mit einem AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit und einem ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer (ABI, Foster City, CA). Die Promotor-Sequenz wurde untersucht auf Transkriptions-Faktor-Bindungs-Stellen unter Verwendung von Mat-Inspector (Quandt et al., 1995) und TFSEARCH (Version 1.3 http//www.genome.ad.gp/kit/tfsearch.html). Die Sequenzen von alternativ gesplicten mRNAs wurden bestätigt durch Sequenzieren von PCR^TM-Produkten, erzeugt durch Amplifikation von menschlicher Leber cDNA unter Verwendung spezifischer Primer.
Screenen von HNF4α-Gen auf Mutationen
Die 12 Exons, flankierende Introns und die minimale Promotor-Region wurden auf Mutationen gescreent durch Amplifizieren und direktes Sequenzieren von beiden Strängen des PCR^TM-Produktes unter Verwendung von spezifischen Primern (wobei diese Sequenzen der Primer verfügbar sind bei www.diabetes.org/diabetes). Die Sequenz der Mis-Sense-Mutation (R127W) wurde bestätigt durch Klonieren des PCR^TM-Produktes in pGEM-T (Promega, Madison, WI) und Sequenzieren von Klonen, welche beide Allele repräsentieren. Die R127W Mutation führt zum Verlust einer Msp I-Stelle und Subjekte wurden getestet auf das Vorliegen dieser Mutation durch Verdauung des PCR^TM-Produktes von Exon 4 mit Msp I, Abtrennen der Fragmente durch Elektrophorese auf einem 3% NuSieve^® 3:1 Agarose Gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) sowie Visualisieren durch Ethidium-Bromid-Anfärben. Die Sequenzen der DNA Polymorphismen basieren auf dem Sequenzieren von beiden Strängen des PCR^TM-Produktes und wurden nicht bestätigt durch direktes Klonen bzw. Sequenzieren des PCR^TM-Produktes.
Subjekte
Die Population der Untersuchung bestand aus 57 japanischen Subjekten, welche nicht miteinander verwandt waren und die am Diabetes Clinic, Tokyo Women's Medical College teilnahmen, und bei welchen NIDDM vor 25 Jahren diagnostiziert worden war, und/oder welche Mitglieder von Familien waren, in welchen NIDDM in drei oder mehr Generationen vorlag: Alter bei der Diagnose, 20,1 ± 7,5 Jahren (Mittelwert ± SE); männlich/weibliche Probanten: 31/26; und Behandlung, Insulin – 36, orale hypoglykämische Wirksubstanzen – 10 und Diät – 11. Zweiunddreissig der Subjekte erfüllten strikt die Krite rien für eine Diagnose von MODY (d.h. NIDDM in zumindest drei Generationen mit autosomal dominanter Transmission und Diagnose vor 25 Jahren in zumindest einem betroffenen Subjekt). NIDDM wurde diagnostiziert unter Verwendung der Kriterien der World Health Organization (Bennett et al., 1994). Zum Zeitpunkt der Rekrutierung wurde eine Einverständniserklärung von jedem Subjekt eingeholt und eine Blutprobe wurde zu DNA-Isolierungen genommen. Dreiundfünfzig nicht miteinander verwandte nichtdiabetische japanische Subjekte wurden auf jede Nukleotid-Substitution und Mutation getestet, um zu bestimmen, ob die Sequenz-Veränderung ein Polymorphismus oder eine Erkrankungs-assoziierte Mutation war. Darüber hinaus wurden 53 Chinesen (15), 51 Weiße (16) und 57 Afro-Amerikaner, welche nicht miteinander verwandt waren und nicht an Diabetes litten (16), auf die R127 W-Mutation getestet.
2. Ergebnisse
Die Organisation und die partielle Sequenz des menschlichen HNF4α-Gens. Das menschliche HNF4α-Gen (Gen-Symbol, TCF14) besteht aus 12 Exons, welche ungefähr 30 kb aufspannen, von welchen ungefähr 10 kb sequenziert wurden einschließend 1 kb der Promotor-Region (die Gen-Sequenz ist verfügbar bei www.diabetes.org/diabetes). Menschliche HNF4α mRNA wird alternativ gesplict (Hata et al., 1992; Chartier et al., 1994; Drewes et al., 1996; Kritis et al., 1996), was nicht weniger als sechs verschiedene Formen von HNF4α (12) erzeugen kann. HNF4α2 ist die prädominante Form, welche in vielen Erwachsenen Geweben vorliegt, einschließend Leber, Niere und Darm. Die Erfinder haben RT-PCR^-TM eingesetzt, um zu bestimmen, welche HNF4α-Transkripte im menschlichen Langerhans-Inselchen exprimiert werden. Die Analyse zeigte, dass Inselchen mRNAs für HNF4α1, 2 und 3 exprimieren. Die Erfinder konnten keine Inselchen-Transkripte nachweisen, welche die Exons 1C bzw. 1B enthielten, obwohl Transkripte enthaltend diese beiden Exons in der menschlichen Leber durch RT-PCR^TM nachgewiesen werden konnten.
Die Sequenz von 1 kb der Promotor-Region des menschlichen HNF4α-Gens wurde bestimmt (13). Der Vergleich der Sequenzen der menschlichen und Maus-Gene zeigte Regionen von Sequenz-Konservierung, die den vorhergesagten Start der Transkription und die Bindungs-Stellen für verschiedene Transkriptions-Faktoren ent hielten, einschließend HNF6, AP-1, HNF3, HNF1α und NF-1. Die Transkriptions-Start-Stelle für das menschliche Gen wurde nicht direkt bestimmt, sondern wurde von Untersuchungen mit dem Maus-Gen abgeleitet, welches multiple Start-Stellen verteilt über ein 10 bp Intervall zeigte (Zhong et al., 1994; Tavaviras et al., 1994), von welchen eine als Nukleotid + 1 definiert wurde (Zhong et al., 1994). Die Sequenz-Homologie in den Promotoren der Gene von Mensch und Maus legt nahe, dass die Transkription des HNF4α-Gens in ähnlicher Art und Weise reguliert werden könnte. In dieser Hinsicht haben Zhong et al. (Zhong et al., 1994) gezeigt, dass die hauptsächliche Promotor-Aktivität in der Hepatom-Zell-Linie mit einem 126 bp-Fragment des Maus-Promotors assoziiert war (Nukleotide 289-414 in 13). Es besteht eine 83%ige Identität zwischen den menschlichen und den Maus-Sequenzen in dieser minimalen Promotor-Region.
Mutationen und Polymorphismen in dem HNF4α-Gen. Die zwölf Exons, die flankierenden Introns und die minimale Promotor-Region wurden auf Mutationen in 57 japanischen Subjekten gescreent, welche nicht miteinander verwandt waren und früh ausbrechende NIDDM/MODY aufwiesen. Die Analyse lieferte eine mögliche Mutation (14) und sieben DNA-Polymorphismen/Varianten (Tabelle 11). Die mögliche Mutation in Exon 4 am Kodon 127, CGG (Arg)→TGG (Trp) (R127W) verändert eine konservierte Aminosäure, welche in der T-Box lokalisiert sind, eine Region, welche in Rezeptor-Dimerisierung und DNA-Binden impliziert ist (Lee et al., 1993; Rastinejad et al., 1995; Gronemeyer und Moras, 1995; Jiang und Sladek et al., 1997). Die C→T Substitution in Kodon 127 resultiert im Verlust einer Stelle für das Enzym Msp I und das Verdauen des normalen Allels erzeugt Fragmente von 104, 91 und 76 hp, wohingegen die Mutanten-Allel-Fragmente von 104 und 167 bp erzeugen. Die PCR^TM-RFLP-Analyse zeigte, dass die R127W Mutation nicht in irgendeinem der 214 nicht miteinander verwandten nicht-diabetischen Subjekten von verschiedenen ethnischen Gruppen vorlag (53 Japaner, 53 Chinesen, 51 Weiße und 57 Afro-Amerikaner).
Tabelle 11 DNA Polymorphismen/Varianten in dem menschlichen HNF4α-Gen in japanischen Subjekten
Die R127W Mutation lag in drei der fünf Mitglieder der J2-21-Familie mit Diabetes vor, einer MODY-Familie, charakterisiert durch ernste mikrovaskuläre Komplikationen (Iwasaki et al., 1988) (15). Darüber hinaus muss Subjekt II-2 ein Träger sein, da sie Kinder sowohl mit normalen Homozygoten als auch Heterozygoten Genotypen aufweist. Das Alter bei der Diagnose der Diabetes in zwei von vier Subjekten mit der R127W Mutation betrug < 25 Jahre (Subjekt II-2, 16 Jahre; und Subjekt III-4, 17 Jahre). Eines der Subjekte mit der R127W Mutation wurde positiv für Diabetes diagnostiziert im Alter von 90 Jahren, was die variable Durchdringung des mutierten Allels zeigt. Ein weiteres Subjekt, der 12 Jahre alte Sohn von Subjekt III-4, hatte das mutierte Allel geerbt, ist aber kein Diabetiker. Er ist jedoch noch nicht über das gefährdete Alter hinaus und kann möglicherweise Diabetes in der Zukunft entwickeln. Es gibt zwei Subjekte mit Diabetes in der J2-21-Familie, welche nicht das gefährdende Allel geerbt haben (Subjekte III-3 und -6). Eine solch ätiologische Heterogenität wurde bereits früher festgestellt (Bell et al., 1991).
Die sieben DNA-Polymorphismen/Varianten wurden in der Promotor-Region und in den Introns lokalisiert (Tabelle 11, 13). In Subjekt (J2-96 (15) trat eine G→A-Substitution am Nukleotid 922 in der die Promotor-Region umgebenden Region auf, was die menschliche Sequenz so verändert, dass sie stärker der Sequenz des Maus-Genes ähnelt (13). Diese Substitution wurde nicht beim Screenen von 53 Subjekten ohne Diabetes gefunden. Da diese Substitution einen konservierten Rest nicht verändert oder die Bindungsstelle für einen der Faktoren nicht zerstört, von denen man glaubt, dass sie die Transkription des HNF4α-Gens regulieren, glauben die Erfinder, dass es eine seltene Variante ist, und eher keine Diabetes assoziierte Mutation. Jedoch sind weitere Untersuchungen notwendig, um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden.
Die sechs Substitutionen, welche sich in den Introns finden (Tabelle 11), zerstören nicht die konservierten GT- und AG-Dinukleotide der Splice-Donor und Akzeptor-Stellen und sind folglich höchstwahrscheinlich ohne Einfluss auf das Splicen. Die Substitutionen an den Nukleotiden 1486, 2420, 3142 und 3175 fanden sich in japanischen Subjekten sowohl mit als auch ohne Diabetes, was anzeigt, dass sie Polymorphismen darstellen und eher weniger Diabetes-assoziierte Mutationen. Die Substitutionen an den Nukleotiden 1364 und 2218 wurden nur in den beiden unterschiedlichen, nicht verwandten Subjekten mit früh anschaltendem NIDDM/MODY gefunden. Die Erfinder glauben, dass diese eher seltene Varianten sind, als Diabetes-assoziierte Mutationen, da sie nicht in der Nähe des Splice Donnor- und Akzeptor-Stellen liegen, sondern eher im zentralen Abschnitt des Introns.
BEISPIEL 5
Hepatische Funktion in einer Familie mit einer Nicht-Sense-Mutation (R154X) im HNF4α/MODY1-Gen
MODY ist eine genetisch heterogene monogenetische Erkrankung, charakterisiert durch eine autosomal dominante Vererbung, den Beginn (Ausbrechen) üblicherweise vor dem Erreichen eines Alters von 25 Jahren und durch abnormale Pankreas β-Zell-Funktion. Mutationen in den Hepytocyte Nuclear Factor (HNF)4α/MODY1-, Glukokinase/MODY2- und HNF1α/MODY3-Genen können diese Form der Diabetes verursachen. Im Ge gensatz zur Glukokinase und den HNF1α-Genen sind Mutationen im HNF4α-Gen eine relativ unübliche Ursache von MODY und das Verständnis der MODY1-Form von Diabetes der Erfinder basiert auf Untersuchungen einer einzelnen Familie, dem R-W-Stammbau. Hier berichten die Erfinder von der Identifikation einer weiteren Familie und der ersten, in welcher eine detaillierte Charakterisierung der hepatischen Funktion vorgenommen wurde. Die betroffenen Mitglieder der Familie, Dresden-11, haben eine Nicht-Sense-Mutation, R154X, in dem HNF4α-Gen ererbt und man glaubt, dass sie verminderte Spiegel dieses Transkriptions-Faktors in den Geweben aufweisen, in welchen er exprimiert wird, einschließend Langerhans-Inselchen, Leber, Niere und Darm. Subjekte mit der R 154X-Mutation zeigten eine verminderte Insulin-sekretorische Antwort auf die orale Glukose. HNF4α spielt eine zentrale Rolle in gewebs-spezifischer Regulation der Gen-Expression in der Leber, einschließend die Kontrolle der Synthese von Proteinen, involviert in Cholesterol- und Lipo-Protein-Metabolismus und die Koagulationskaskade. Jedoch zeigten Subjekte mit der R154X-Mutation keinerlei Abnormalitäten im Metabolismus oder der Koagulation, außer bei einem paradoxen 3,3-fach Anstieg in Serum-Lipo-Protein(a)-Spiegeln. Des Weiteren gab es keinerlei Beleg für eine renale Dysfunktion in diesem Subjekt. Die Ergebnisse schlagen vor, dass MODY1 in erster Linie eine Erkrankung der β-Zell-Funktion ist.
1. Methoden
Subjekte
Die Untersuchungs-Population bestand aus Mitgliedern von zwölf nicht miteinander verwandten Familien mit früh ausbrechender NIDDM, bestätigt durch das Department of Internal Medicine III, University Clinic Carl Gustav Carus of the Technical University, Dresden, Germany. Die Familien wurden ausgewählt basierend auf dem Vorliegen von Nicht-Insulin-abhängiger (Typ 2) Diabetes mellitus (NIDDM) in zwei oder mehr Generationen mit Diagnose vor einem Alter von 35 Jahren in zumindest einem Subjekt. Hinreichend viele Familien-Daten waren verfügbar, welche eine Diagnose von MODY in neun dieser Familien vorschlagen (d.h., NIDDM in drei Generationen mit autosomal dominanter Vererbung und Ausbrechen vor einem Alter von 25 Jahren in zumindest einem betroffenen Subjekt) (Fajans et al., 1994). Die verbleibenden drei Familien wurden klassifiziert als aufweisend früh beginnende NIDDM. Das Durchschnittsalter zum Zeitpunkt der Diagnose der Diabetes in den betroffenen Mitgliedern dieser Familien betrug 29,9 ± 2,8 Jahre (Bereich, 14–60 Jahre) (Mittelwert ± SEM) und schloss 18 Männer und 13 Frauen ein, von welchen 12, 12 und 7 mit Insulin, oralen hypoglykämischen Wirksubstanzen bzw. eine Diät behandelt wurden. Zum Zeitpunkt der Rekrutierung wurde eine Einverständniserklärung von jedem Subjekt erhalten und Blut-sowie Urin-Proben zur DNA-Isolierung und für die klinischen Untersuchungen wurden erhalten.
Screenen von HNF4α-Gen auf Mutationen
Die minimale Promotor-Region (Nukleotide –21 bis –459) (Zhong et al., 1994) und 10 Exons kodierend die HNF4α-Form (Drewes et al., 1996) von HNF4α wurden auf Mutationen durch Polymerase-Kettenreaktions (PCR^TM)-Amplifikation gescreent sowie durch direktes Sequenzieren von beiden Strängen des amplifizierten PCR^TM-Produktes wie vorher beschrieben (Yamagata et al., 1996). Sequenz-Veränderungen wurden bestätigt durch Klonieren des PCR^TM-Produktes im pGEM-4Z (Promega, Madison, WI) und Sequenzieren der Klone abgeleitet von beiden Allelen. Die Sequenzen der Primer für die Amplifikation sowie das Sequenzieren der minimalen Promotor-Region waren P1, 5'-CAAGGATCCAGAAGATTGGC-3' (SEQ ID Nr. 120), und P2, 5'-CGTCCTCTGGGAAGATCTGC-3' (SEQ ID Nr. 121); die Größe des PCR^TM-Produktes ist 479 bp. Die Sequenz des Promotors des menschlichen HNF4α-Gens wurde hinterlegt in der GenBank Database mit der Zugangs-Nummer U72959.
Verknüpfungs-Analyse
Familienmitglieder wurden typisiert mit den Markern D20S43, D20S89, D20S119, D20S169 und D20S424, welche alle mit dem HNF4α-Gen (Stoffel et al., 1996) eng verknüpft sind. Tests für die Verknüpfung wurden durchgeführt unter Verwendung des Haplotyps, ausgebildet aus diesen Markern und unter der Annahme, einer Rekombinations-Häufigkeit zwischen benachbarten Markern von 0,001 mit dem Computer-Programm ILINK (Lathrop et al., 1984; Lathrop und Lalouel, 1984). Die Häufigkeiten der Haplotypen wurden aus diesen Daten abgeschätzt. Die Analyse nahm eine Erkrankungs-Allel-Häufigkeit von 0,001 und zwei Anfälligkeitsklassen ein. Die Anfälligkeitsklasse 1 enthielt Individuen, welche 25 Jahre alt waren mit Durchdringungen von 0,00, 0,95 bzw. 0,95 für die normale homozygote, heterozygote bzw. die empfängliche homo zygote Form. Die Anfälligkeitsklasse 2 enthielt Individuen, welche < 25 Jahre alt waren mit Durchdringungen von 0,00, 0,60 und 0,95 für normale homozygote Form, heterozygote Form und empfängliche homozygote Form. Der Zustands-Status des einen Subjektes mit geschädigter Glukose-Toleranz wurde als betroffen eingeordnet. Der maximal erwartete Lod-Score (maximum expected lod score ELOD) wurde bestimmt unter Verwendung des Computer-Programms SLINK (Ott, 1989; Weeks et al., 1990).
Klinische Untersuchungen
Ein herkömmlicher 75 g oraler Glukose-Toleranz-Test wurde Subjekten nach 25 h Ausnüchtern über Nacht verabreicht. Behandlung mit Insulin und oralen hypoglykämischen Wirksubstanzen wurde für 12 bzw. 24 h unterbrochen, bevor die Tests durchgeführt wurden. Blut-Proben für Glukose, Insulin, C-Peptid und Proinsulin wurden genommen nach 0, 30, 60, 90 bzw. 120 min. Nüchterne Blut-Proben wurden auch genommen für die Messung von Insulin, Inselchen-Zellen und Glutaminsäure Decarboylase (GAD)-Antikörper, glykosyliertem Hämoglobin (HbA_Ic), Lipo-Protein(a), Apolipo-Proteinen AI, AII, B, CII, CIII und E, Cholesterol (insgesamt und in VLLDL, LDL, HDL, HDL2 und HDL3), Triglyceriden (insgesamt und in VLDL und LDL + HDL), Koagulationszeit (QUICK-Test) und partielle Thromboplastin-Zeit (PTT), Fibrinogen, von Willebrand Faktor Antigen (vWFr:Ag), Plasminogen Aktivator Inhibitor-1 (Pal-1), Tissue-Typ Plasminogen Aktivator (tPA), Alanin Aminotransferase, γ-Glutamyl Transferase, Bilirubin, Albumin, Gesamt-Protein, Hämoglobin, Kreatinin, Harnstoff, Amylase, Lipase und Harnsäure. Eine Urin-Probe (aus einer 24 h Sammlung an Urin) wurde für Messungen von Kreatinin und Mikroalbumin verwendet.
Assays
Blut-Glukose wurde gemessen mit einer Hexokinase-Methode (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany), Plasma Insulin und C-Peptid durch Radioimmunoassay (DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim, Germany; bzw. C Peptid RIA Diagnostic Systems Laboratories, Sinsheim, Germany), Plasma Proinsulin durch ELISA (DRG Instruments, Marburg, Germany), HbA_Ic durch HPLC (DIAMAT Analyzer, Bio-Rad, Munich, Germany), Fibrinogen durch das Clauss Verfahren (Fibrinogen A Kit, Boehringer-Mannheim), PAI-1 durch Bio-Immunoassay und ELISA (TC^® Actibind PAI-1 und TC^® PAI-1 ELISA, Technoclone/Immuno GmbH Deutschland, Heidelberg, Germany), tPA durch ELISA (TintElize^® tPA, Biopool AB, Umeå, Sweden, vWFr:Ag auf enzymatischem Weg (ELISA Asserachrom^® vWF, Boehringer-Mannheim), Insulin- und GAD-Ab durch ELISA und Radioimmunoassay (ELISA, Freiburg, Germany), Inselchen-Zell-Ab durch einen Immunofluoreszenz-Assay (unter Verwendung einer positiven Probe von EUROIMMUN Immunologie GmbH, Groß Grönau, Germany), Koagulation und teilweise Thromboplastinzeit durch den AMAX Analyzer (Munich, Germany). Gesamtes Cholesterol, Cholesterol in VLDL, HDL, LDL +HDL und HDL3 werden gemessen durch den CHOD-PAP, die gesamten Triglyceride und Triglycerid in VLDL und LDL +HDL durch das GPO-PAP-Verfahren unter Verwendung des Ciba Coming 550 Express Clinical Chemistry Analyzer (Boehringer-Mannheim). HDL2-Cholesterol wurde berechnet unter Verwendung der Formel HDL2=HDL-HDL3. Proben zur Messung von Cholesterol, Triglyceriden in VLDL, HDL, LDL +HDL wurden hergestellt durch präparative Ultrazentrifugation unter Verwendung einer Beckman Optima Tabletop TLX Ultrazentrifuge mit einem TLA-120,2 Rotor. Serum Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Gesamt-Protein, Alanin-Aminotransferase, γ-Glutamyl-Transferase, Bilirubin, Amylase und Urin-Kreatinin wurden gemessen unter Verwendung des BM Hitachi 717 Chemistry Analyzers (Boehringer Mannheim). Lipase wurde gemessen unter Verwendung des Monarch Systems (Sigma Germany, Munich, Germany). Apolipoproteine AI, AII und B und Urin-Mikroalbumin wurden gemessen unter Verwendung des Behring-Nephelometer BN II (Behringwerke, Marburg, Germany). Apolipoproteine CIII und E wurden gemessen unter Verwendung des Sebia-System (Fulda, Germany), Apolipoprotein CII unter Verwendung des RID-System (WAK, Bad Homburg, Germany).
2. Ergebnisse
Identifikation einer Non-Sense-Mutation in dem HNF4α-Gen
Zwölf Familien mit früh beginnender NIDDM/MODY wurden für die genetischen Untersuchungen von MODY in Subjekten von deutscher Abstammung zugelassen. Mutationen in den HNF1α/MODY3-Genen (Yamagata et al., 1996) fanden sich in drei dieser Familien (Kaisaki et al., 1997). Das HNF4α-Gen wurde auf Mutationen in einem betroffenen Subjekt von den verbleibenden neun Familien gescreent. Es trat eine C→T Substitution in Kodon 154 von Exon 4 in den Probanden (II-4) der Familie (Dresden-11 (16) auf, was eine Non-Sense-Mutation CGA (Arg)→TGA (OP) (R154X, 17) erzeugte. Die R154X Mutation würde in der Synthese eines verkürzten Proteins von 153 Aminosäuren mit einer intakten DNA-bindenden Domäne resultieren, dem jedoch die Liganden-Bindungs- und Transaktivierungsdomäne fehlen (Sladek et al., 1990). Zusätzlich zu dieser Mutation gab es eine ruhende C-T Substitution im Kodon für Ala58 (GCC/GCT) in einem Subjekt, welche nicht zusammen mit MODY/früh beginnender NIDDM einherging.
Das Vorliegen der R154X Mutation in anderen Mitgliedern der Dresden-11-Familie wurden bestimmt durch PCR^TM-Amplifikation und direktes Sequenzieren von Exon 4. Die R154X Mutation ging mit MODY in der Dresden-11-Familie (16) einher. Alle Subjekte mit Diabetes wiesen die R154X Mutation auf und Gleiches gilt für ein 14 Jahre altes männliches Subjekt (III-2) mit geschädigter Glukose-Toleranz. Der gefährdete Haplotyp zeigte einen gewissen Beleg für die Verknüpfung mit MODY mit einem Lod Score von 1,20 bei einer Rekombination von 0,00 (der maximal zu erwartende Lod Score in diesem Stammbaum ist 1,20).
Alter bei der Diagnose
Drei Subjekte wurden mit NIDDM diagnostiziert zwischen 15–25 Jahren und zwei weitere waren 28 bzw. 44 Jahre alt (16). Das Subjekt I-1, bei dem Diabetes im Alter von 44 Jahren diagnostiziert worden war, zeigte eine proliferative Retinopathie zum Zeitpunkt der Diagnose, was nahe legt, dass der Beginn der Diabetes viele Jahre früher erfolgt war.
Klinisches Ausmaße der Diabetes
Die Diabetes in der Dresden-11-Familie war schwer und alle der an Diabetes leidenden Subjekte wurden behandelt entweder mit Insulin oder oralen hypoglykämischen Wirksubstanzen. Subjekte mit Diabetes von langer Dauer (beispielsweise I-1, II-4) zeigten Diabetes-Komplikationen einschließend proliferative Retinopathie, makrovaskuläre Erkrankung (koronäre Herz-Erkrankung) sowie peripherale Polyneuropathie. Überraschenderweise zeigte keines der Subjekte mit der R154X einen Beleg für Nephropathie. Folglich ist der Diabetes-Phenotyp der Dresden-11-Familie sehr ähnlich zu demjeni gen, der sich in R-W-Stammbäumen (Fajans et al., 1994) findet. Keines der Subjekte in der Dresden-11-Familie war positiv für Inselchen, Insulin oder GAD-Antikörper.
Insulin-sekretorische Antwort
Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass prädiabetische Subjekte mit einer Mutation in HNF4α einen charakteristischen Defekt im normalen Muster der Glukosestimulierten Insulin-Sekretion wie auch Abnormalitäten in anderen Ausmaßen der normalen β-Zell-Funktion aufwiesen (Herman et al., 1994; Byrne et al., 1995). Die OGTT-Untersuchungen zeigten eine merkliche Reduktion in der Insulin-Sekretion, einhergehend mit verminderten C-Peptid- und Proinsulin-Spiegeln in Subjekten mit der R154X-Mutation (18).
Lipid-Spiegel
Keines der Subjekte mit der R154X Mutation zeigte einen Beleg für sekundäre Hypertriglyzeridemie, obwohl verschiedene von ihnen (I-1, II-4, III-1) eine schlechte metabolische Steuerung mit HbA_Ic-Spiegeln von 10,6, 8,8 bzw. 10,1, aufweisen (Tabelle 12).
Tabelle 12 Klinische Parameter der Dresden-11-Familie
Tabelle 12 – Fortsetzung Klinische Parameter der Dresden-11-Familie
Werte sind Mittelwerte ± SEM (Standardfehler der Mittelwerte). Die beiden normalen Subjekte sind mit einzelnen Werten dargestellt. Referenzwerte sind diejenigen vom Institut von Clinical Laboratory Diagnostics, University Clinic Carl Gustav Carus, Dresden.
Hepatische und renale Funktion
HNF4α wird in der Leber und in der Niere exprimiert und als solche könnte man erwarten, dass Mutationen in HNF4α die normale Funktion dieser Gewebe beeinträchtigen sollte (Sladek et al., 1990; Cereghini, 1996). In dieser Hinsicht reguliert HNF4α die Expression einer Vielzahl von Apolipoproteinen, einschließend AI, AIV, B und CIII (Cereghini, 1996). Die Serum Apolipoprotein-Spiegel und Lipoprotein-Fraktionen waren in den Subjekten mit der R154X-Mutation normal, außer in puncto Lipoprotein(a)-Spiegel, welche um 3,3-fach erhöht waren (Tabelle 12). Lipoproteine(a)-Spiegel wurden als erhöht in Subjekten mit NIDDM in einigen Untersuchungen berichtet (Nakagawa et al., 1996; Hirata et al., 1995), jedoch nicht in anderen (Durlach et al., 1996; Chico et al., 1996). Jedoch scheint eine Erhöhung in den Lipoprotein(a)-Spiegeln in Subjekten mit HNF4α-Defizienz paradox zu sein, da die Expression von Lipoprotein(a) durch HNF1α gesteuert wird (Wade et al., 1994), welches wiederum durch HNF4α (Cereghini, 1996) reguliert wird. Folglich würden niedrigere Lipoprotein(a)-Spiegel, jedoch keine höheren, in Subjekten mit der R154X-Mutation zu erwarten sein. Weitere Untersuchungen werden notwendig sein, um die Beziehung zwischen Lipoprotein(a)-Spiegeln und Mutation in HNF4α zustimmen.
HNF4α reguliert auch die Expression von Albumin, Fibrinogen und den Koagulations-Faktoren VII, VIII, IX und X (Cereghini, 1996; Erdmann und Heim, 1995; Figueiredo und Brownlee, 1995; Naka und Brownlee, 1996; Hung und High, 1996). Die Serum-Spiegel von Albumin und Fibrinogen und die Messungen der Koagulationszeit waren in Subjekten mit der R154X-Mutation (Tabelle 12). HNF4α wird auch in der Niere exprimiert, obwohl die Identität des Target-Gens in diesem Organ unbekannt ist (Sladek et al., 1990; Cereghini, 1996). Die Urin-Creatinin und Mikroalbumin-Spiegel waren normal in Subjekten mit der R154X-Mutation (Tabelle 12) normal, was nahe legt, dass die renale Funktion in den Subjekten mit Mutationen in dem HNF4α-Gen nicht geschädigt war.
Beispiel 6
Verminderte Insulin- und Glukagon-sekretorische Antworten auf Arginin in Subjekten ohne Diabetes mit einer Mutation im HNF4α/MODY1-Gen
Subjekte ohne Diabetes mit der Q268X Mutation in dem Hepatocyte Nuclear Factor (HNF) 4α/MODY1-Gen zeigen beeinträchtigte Glukose-induzierte Insulin-Sekretion. Um die Effekte des Nicht-Glukose-Sekretagogen Arginin auf Insulin und die Glukagon-Sekretion in diesen Subjekten zu bestätigen, haben wir 18 Mitglieder des RW-Stammbaums untersucht: 7 nicht an Diabetes erkrankte, Mutations-negative (ND[–]), nicht an Diabetes erkrankte, Mutationspositive (ND[+]), und 4 an Diabetes erkrankte Mutationspositive (D[+]). Wir gaben Arginin als ein 5 g Bolus, gefolgt von einer 25 minütigen Infusion Ausgangs-Glukose-Konzentration und nach Glukose-infusion, um den Plasma-Spiegel der Glukose bei ungefähr 200 mg/dl einzustellen. Die akute Insulin-Antwort (AIR), die 10–60 minütige Insulinfläche unter der Kurve (AUC) sowie die Insulin-Sekretionsrate (ISR) wurden verglichen, wie auch die akute Glukagon-Antwort (AGR) sowie Glukagon AUC. Die ND[+] und D[+]-Gruppen zeigten verminderte Insulin AUC und ISR sowie verminderte Glukose-Potentierung von AIR, Insulin AUC und ISR auf Arginin Verabreichung im Vergleich zu den ND[–]-Gruppen. Bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen war der AUC am größten für ND[–], mittlere Werte wurden erhalten für ND[+] und die höchsten Werte wurden erhalten für D[+]-Gruppen. Während der hyperglykämischen Einstellung gab es eine verminderte Unterdrückung von Glukagon AUC sowohl für ND[+] als auch D[+]-Gruppen, im Vergleich zu der ND[–]-Gruppe. Die verminderte ISR auf Arginin in der ND[+]-Gruppe im Vergleich zu der ND[–]-Gruppe vervielfacht durch Glukose-Potentiation, zeigt an, das HNF4α den Signal gegebenen mechanistischen Pfad für die Arginin-induzierte Insulin-Sekretion beeinflusst. Ein Abnehmen in Glukagon AUC sowie eine verminderte Unterdrückung von Glukagon AUC mit Hyperglykämie legt nahe, dass Mutation in HNF4α zu α-Zell-wie auch β-Zellsekretorischen Defekten führen können oder zu einer Reduktion in der Langerhans-Inselchen-Masse.
1. Verfahren
Subjekte
Achtzehn Mitglieder des RW-Stammbaums von den Zweige II-2 und II-5, Generationen III, IV und V wurden untersucht (Fajans, 1990; Fajans et al., 1994). Die Untersuchung wurde überwacht und begutachtet durch das Institutional Review Board of the University of Michigan Medical Center und alle Subjekte und/oder Patienten lieferten eine schriftliche Einverständnis-Erklärung. Der glykämische Zustand eines jeden Subjektes wurde bestimmt durch den oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) wie definiert durch die National Diabetes Data Group (NDDG) (1979). Jedes Subjekt wurde ursprünglich mit einer Serie von DNA-Markern auf Chromosom 20q typisiert, um zu bestimmen, ob er oder sie den erweitert gefährdeten Haplotypen (definiert durch Allele an den Stellen ADA, D20S17, D20S79 und D20S4), assoziiert mit MODY1 geerbt hatte (Bell et al., 1991; Bowden et al., 1992; Cox et al., 1992; Rothschild et al., 1993). Wenn die Q268X-Mutation in dem HNF4α-Gen als Ursache für MODY1 in dem RW-Stammbaum (Yamagate et al., 1996a) gezeigt wurde, wurden die Subjekte direkt auf diese Mutation getestet. Alle die Subjekte enthalten in dieser Untersuchung, außer dem nicht an Diabetes erkrankten Individuum GM11626, wurden auf das Vorliegen von der Q268X Mutation hin getestet. Jedoch wurde sein nicht an Diabetes erkrankter Vater, IV-16, getestet und er weist keine Q268X Mutation auf. Basierend auf den OGTT-Ergebnissen und im Vorliegen oder der Abwesenheit der Q268X Mutation oder dem gefährdeten Haplotyp wurden die Familien-Mitglieder in drei Gruppen unterteilt:
Nicht an Diabetes erkrankte Q268X Mutations-negative Gruppen (ND[–]).
Sieben nicht an Diabetes erkrankte Mutations-negative Subjekte wurden untersucht. GM-Identifikations-Nummern (Human Genetic Mutant Cell Repository) wie von Bell et al. (1991), wie von Bell angegeben, RW-Stammbaum-Generation- und Person-Nummern, wie von Fajans et al. (1994) angegeben, und Alter und Zeit der Untersuchung waren wie folgt: GM10085, IV-22, 45 Jahre GM11429, IV-41, 32 Jahre; GM11626, Nachkomme von IV-16, 17 Jahre; GM10153, Nachkomme von IV-17, 18 Jahre; GM11579, Nachkomme von IV-19, 16 Jahre; GM11331, Nachkomme von IV-21, 21 Jahre; und GM11333, Nachkomme von IV-21, 22 Jahre. Vier dieser Subjekte waren Nachkommen von an Diabetes erkrankten Eltern (GM10085, GM11429, GM10153 und GM11579).
Nicht an Diabetes erkrankte Q268X Mutations-positive Gruppe (ND[+])
Diese Gruppe enthielt sieben Subjekte. Zwei Subjekte hatten niemals Diabetes oder geschädigte Glukose-Toleranz bei OGTT: GM11090, Nachkomme von IV-143, 16 Jahre; und GM10668, Nachkomme von IV-141, 16 Jahre. Fünf Subjekte hatten frühere Abnormalitäten der Glukose-Toleranz, jedoch hatte keiner jemals eine abnormale nüchterne Plasma-Glukose- oder glykosylierte Hämoglobin-Konzentration. Zwei wiesen einzelne diabetische OGTTs 4 bzw. 22 Jahre vor der Untersuchung auf, hatten jedoch eine Vielzahl von normalen Glukose-Toleranz-Tests danach: GM10018, IV-168, 25 Jahre und GM8072, IV-143, 39 Jahre. Drei Subjekte hatten die NDDG-diagnostischen Kriterien für Diabetes durch OGTT in der Vergangenheit erfüllt. Vor der Untersuchung hatten sie normale OGTTs bei 2,4 bzw. 5 Gelegenheiten, über 2, 4 bzw. 4 Jahre. Dies waren: GM11600, Nachkomme von IV-143, 14 Jahre; GM8759, IV-166, 31 Jahre und GM8073, Nachkomme von 143, 19 Jahre.
An Diabetes erkrankte Q268X Mutations-positive Gruppe (D[+])
Die vier Subjekte in dieser Gruppe hatten konsistent diabetische OGTTs für 6 oder mehr Jahre und milde nüchterne Hyperglykämie (< 200 mg/dl), wenn sie nicht behandelt wurden. Sie waren GM8106, III-35, 59 Jahre; GM7974, IV-141, 43 Jahre; GM8107, IV-165, 26 Jahre und GM107234, Nachkomme von IV-142, 17 Jahre. Das Subjekt GM8106 wurde mit Tolbutamid zwischen 1958 und 1968 behandelt und mit Chlorpropamid seit Mai 1995. Ohne Behandlung war sein höchster nüchterner Plasma-Glukose-Wert 160 mg/dl und sein höchster gesamter glykosylierter Hämoglobin-Wert 9,1% (normal < 6,3%). Bei 100 mg an Chlorpropamid pro Tag war seine nüchterne Plasma-Glukose 91 mg/dl und sein glykosyliertes Hämoglobin betrug 5,3%. Chlorpropamid wurde 26 Tage vor dieser Untersuchung abgesetzt und der nüchterne Plasma-Glukose-Wert war 99 mg/dl und die gesamte glykosylierte Hämoglobin-Konzentration war 5,8% am Tag der Untersuchung. Das Subjekt GM7974 wurde allein mit Diät behandelt. Sie hatte periodisch diabetische OGTTs seit 1969; OGTTs waren konsistent diabetisch seit 1990. Ihr nüchterner Plasma-Glukose-Wert war 84 mg/dl und ihr insgesamter glykosylierter Hämoglobin-Wert war 6,9% am Tag der Untersuchung. Der höchste nüchterne Plasma-Glukose-Wert von Subjekt GM8107 war 192 mg/dl und ihr höchster gesamter glykosylierter Hämoglobin-Wert war 9,5%, ohne Behandlung. Bei Behandlung mit Glyburid von 1,25 mg täglich zeigte sie normale nüchterne normale Werte nach dem Essen für die Glukose-Konzentrationen und gesamte glykosylierte Hämoglobin-Werte von 6,7%. Glyburid wurde 11 Tage vor dieser Untersuchung abgesetzt. In ihre nüchterne Plasma-Glukose-Konzentration war 106 mg/dl und ihr gesamter glykosylierter Hämoglobin-Wert war 6,9% am Tag dieser Untersuchung. Das Subjekt GM10725 wurde mit Glyburid 2,5 mg zweimal am Tag seit 1989 behandelt. Ihr höchster gesamter glykosylierter Hämoglobin-Konzentrationswert war 9,0%. Ihre Medikation wurde 5 Tage vor dieser Untersuchung abgesetzt und ihr nüchterner Plasma-Glukose-Wert war 158 mg/dl und ihr gesamter glykosylierter Hämoglobin-Wert war 7,7% am Tag dieser Untersuchung.
Protokoll
Subjekte wurden untersucht in der University of Michigan General Clinical Research Center (CRC). Die Subjekte wurden ins CRC am Abend aufgenommen und wurden in liegender Position nach 10–12 stündiger Ausnüchterung über Nacht untersucht. Ein intravenöse Proben entnehmender Katheter wurde in einer rückwärts gerichteten Richtung in einer dorsalen Vene der Hand eingebracht und die Hand wurde in einer hölzernen Box thermostatisch auf 60°C erhitzt, um eine Arterialisierung von venösem Blut zu erreichen. Ein zweiter Katheter für Insulin, Arginin und Glukose-Verabreichung wurde in die kontralaterale Antecubital-Vene insertiert. In Subjekten mit Hyperglykämie in nüchternem Zustand, wurde ein kleiner intravenöser Bolus von menschlichem regulären Insulin (0,007 U/kg oder etwa 0,5 U) bei –50 min verabreicht, um die Plasma-Glukose auf ungefähr 75 mg/dl zu verringern.
Blut-Proben zur Messung der Ausgangs-Glukose, Inuslin, C-Peptid und Glukagon-Konzentrationen wurden erhalten bei –30, –20, –10 und 0 min. Bei 0 Minuten wurde Arginin verabreicht. Die gesamte Arginin-Dosis wurde berechnet als 0,41 mg/kg Körpergewicht bis zu einem Maximum von 30 g. Zum Zeitpunkt 0 wurde 5 g Arginin verabreicht als eine i.v. Bolus über 30 sec und zum Zeitpunkt von 5 min wurde das verbleibende Arginin mit einer Pumpe bei einer konstanten Rate über 25 min per Infusion verabreicht. Proben wurden entnommen bei 2, 3, 5, 7, 10, 20 und 30 min zur Messung von Glukose, Insulin, C-Peptid und Glukagon. Folgend auf die erste Arginin-Bolus und Infusion gab es eine 60 minütige Auswasch-Periode. Blut-Proben zur Messung der gleichen Konstituenten wurden erhalten bei 40, 50, 60, 70, 80 und 90 min. Bei 90 min wurde Glukose (150 mg/kg) über 30 sec verabreicht und eine Infusion variabler Rate von 20% Dextrose mit 10 mEq KCl/l wurde begonnen, um den Plasma-Glukose-Spiegel auf 200 mg/dl für den Rest dieser Untersuchung einzustellen, wie durch häufige Blut-Glukose-Messungen am Krankenbett bestimmt wurde. Blut-Proben der oben genannten Zusammensetzungen wurden erhalten bei 92, 93, 95, 97, 100, 110, 120, 130, 140 und 150 min. Bei 150 min wurde Arginin (0,41 g/kg, maximum 30 g) erneut verabreicht als eine 5 g Bolus, gefolgt nach 5 min durch eine Infusion über 25 min wie zuvor und Proben wurden entnommen bei 152, 153, 155, 157, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230 und 240 min zur Messung von Glukose, Insulin, C-Peptid und Glukagon.
Assay-Prozeduren
Alle Blut-Proben wurden auf Eis gesammelt und bei –70°C bis zur Untersuchung gelagert. Plasma-Glukose wurde gemessen auf einem Kodak Ektachem 700 Analyzer unter Verwendung einer Hexokinase-Methode (intra-Assay-Coeffizient der Variation [CV] 1,7% bei 5,0 mmol und 1,2% bei 16,1 mmol). Immunoreaktives Insulin wurde gemessen durch Doppelt-Antikörper-Radioimmunoassay (RIA) (intra-assay CV 6,4%) (Hayashi et al., 1977). C-Peptid wurde gemessen durch einen spezifischen RIA (intra-assay CV 3,9%) (Faber et al., 1978). Glukagon wurde gemessen durch Doppelt-Antikörper-Radioimmunoassay (intra-assay CV 3,2%) (Hayashi et al., 1977). Alle Proben wurden gemessen in zweifacher Ausführung und ihre Mittelwerte wurden verwendet. Proben von individuellen Subjekten wurden in einem einzelnen Assay gemessen. Alle Assays wurden durchgeführt in dem Michigan Diabetes Research and Training Center Chemistry Core laboratory.
Datenanalyse
Akute Insulin-Antworten (AIR), akute C-Peptid-Antworten (ACR) und akute Glukagon-Antworten (AGR) wurden berechnet als die Mittelwerte der 2, 3, 4 und 5 Minuten-Hormon-Spiegel minus den Mittelwerten der –10, –5 und 0 Minuten-Hormon-Spiegel. Glukose, Insulin, C-Peptid und Glukagon-Flächen unter der Kurve wurden berechnet mit der Trapez-Regel für das Zeit-Intervall zwischen 10 bis 60 min, wenn die Arginin-Bolus zum Zeitpunkt 0 verabreicht wurde und die Arginin-Infusion zum Zeitpunkt 5 min begann. Ausgangswerte, berechnet als die mittleren Hormon-Spiegel, gemessen bei –10, –5 und 0 min, unmittelbar vor dem Arginin-Bolus, wurden von den Flächen unter der Kurve subtrahiert. Insulin-Sekretions-Raten wurden berechnet durch Dekonvolution der C-Peptid-Werte (Polonsky et al., 1986). Alle diese Indizes der Insulin-Sekretion wurden ausgewertet während der Arginin-Verabreichung bei Ausgangs-Glukose-Spiegeln, während der Glukose-Verabreichung und während der Arginin-Verabreichung während der hyperglykämischen Einstellung. Die Steigerung der Potentiation wurde berechnet als Unterschied zwischen der AIR oder der ACR auf Arginin, welches während der hyperglykämischen Einstellung und den Ausgangs-Glukose-Spiegeln erhalten wurde, dividiert durch die Differenz zwischen diesen beiden Glukose-Spiegeln (Halter et al., 1979). Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± Standardabweichungen der Mittelwerte. Statistische Signifikanz der Unterschiede unter Gruppen wurde ausgewertet mit dem chi-Quadrat- und dem ungepaarten t-Test. Die primären Vergleiche von Interesse lagen zwischen den ND[–] und ND[+]-Gruppen. P < 0,05 wurde definiert als die Grenze der statistischen Signifikanz.
2. Ergebnisse
Achtzehn Mitglieder des RW-Stammbaums wurden untersucht: Sieben nicht an Diabetes erkrankte Mutations-Negative (ND[–]), sieben nicht an Diabetes erkrankten Mutations-Positive (ND[+]) und vier an Diabetes erkrankten Mutations-Positive (D[+]) (Tabelle 13).
Es gab keine signifikanten Unterschiede unter Gruppen im Hinblick auf ihr Geschlecht oder ihr Alter, obwohl D[+]-Subjekte dazu tendieren, älter zu sein. Alle Subjekte waren nicht fettleibig. Nüchterne Glukose- und Insulin-Spiegel unterschieden sich nicht signifikant unter den Gruppen, obwohl D[+]-Subjekte dazu tendierten, höhere Glukose-Spiegel aufzuweisen sowie niedrigere Insulin-Spiegel. Nüchterne C-Peptid-Spiegel waren niedriger in D[+]-Subketen im Vergleich zu ND[–]-Subjekten. Nüchterne Glukagon-Spiegel unterschieden sich nicht unter den Gruppen. Glykosylierte Hämoglobin-Konzentrationen unterschieden sich nicht zwischen den beiden nicht-diabetischen Gruppen, war jedoch höher in den D[+]-Gruppen.
Tabelle 13 Charakteristika von Subjekten vom RW-Stammbaum Durch Glukose-Toleranz und Mutations-Status
19 demonstriert das Protokoll und illustratiert Konzentrationen von Glukose (19A), Insulin (19B), C-Peptid (19C) und Glukagon (19D) während der Dreiphasen-Untersuchung. Diese waren: A) Verabreichung von Arginin (Bolus und Infusion) bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen, B) Verabreichung von Glukose (Bolus sowie Infusion bei variabler Rate), um den Glukose-Spiegel auf 200 mg/dl einzustellen, und C) Verabreichung von Arginin (Bolus und Infusion) während der hyperglykämischen Einstellung.
Tabelle 14 fasst die durchschnittlichen Glukose-Spiegel zusammen; die akuten Insulin-Antworten (AIR) und die C-Peptid-Antworten (ACR) auf Arginin; und die Hormon-Flächen unter der Kurve (AUC) sowie die Insulin-Sekretions-Rate (ISR), gemessen 10 bis 60 min nach Beginn der drei Untersuchungsphasen. Diese sind A) Verabreichen von Arginin bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen, B) Verabreichung von Glukose und C) Verabreichung von Arginin während der hyperglykämischen Einstell-Phase.
Tabelle 14 Plasma-Konzentrationen von Glukose, akute Insulin- und C-Peptid-Antworten (AIR und ACR), Flächen unter der Kurve (AUC 10–60 min) für Insulin und C-Peptid und Insulin-Sekretions-Raten (ISR) während der Verabreichung von A) Arginin bei Ausgangs-Glukose-Bolus und Infusion, B) Glukose (Bolus und Infusion) sowie C) Arginin (Bolus und Infusion) während der hyperglykämischen Einstellung
Effekte von Arginin und Glukose auf die Insulin-Sekretion
Verabreichung von Arginin bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen
Am Ausgangs-Punkt unterschieden sich die Glukose-Spiegel nicht unter den einzelnen Gruppen (Tabelle 13). Nach der 5 g Arginin Bolus unterschieden sich AIR und ACR nicht unter den Gruppen, tendierten jedoch dazu, niedriger für die D[+] Gruppe (Tabelle 14) zu sein. Während und nach der nachfolgenden Arginin-Infusion waren die Glukose-Spiegel leicht höher bei 10, 20 und 30 Minuten Intervallen in der ND[–] im Vergleich zu der ND[+] Gruppe (19), jedoch die durchschnittlichen Glukose-Spiegel während des 10–60 Minuten Zeit-Intervalls (Tabelle 14) sowie die Glukose-Fläche unter der Kurve (1171 ± 99 vs. 1012 ± 141 mg/dl, p = 0,37) unterschieden sich nicht. Insulin- und C-Peptid-Spiegel stiegen auf einen Peak bei 30 Minuten in der ND[–] Gruppe, waren aber merklich vermindert sowohl in der ND[+] als auch der D[+] Gruppe (19). Die Insulin-Fläche unter der Kurve (AUC_I) sowie die C-Peptid-Fläche unter der Kurve (AUC_C) waren signifikant in der ND[+] Gruppe im Vergleich zur ND[–] Gruppe (Tabelle 14) vermindert. Sie waren des Weiteren vermindert in der D[+] Gruppe im Vergleich zur ND[+] Gruppe (Tabelle 14). Der ISR war signifikant vermindert in ND[+] im Vergleich zu ND[–]-Subjekten und weiter reduziert in D[+] im Vergleich zu ND[+] Subjekten (Tabelle 14).
Verabreichung von Glukose
Die Glukose-Spiegel unterschieden sich nicht unter den Gruppen während der Bolus und der Glukose-Infusion von variabler Rate (Tabelle 14). AIR und ACR auf Glukose hin unterschieden sich nicht zwischen den ND[+] und ND[–]-Gruppen, waren jedoch signifikant reduziert in der D[+]-Gruppe im Vergleich zur ND[–]-Gruppe (19, Tabelle 14). AUC_I, AUC_C sowie ISR während der Glukose-Infusion unterschieden sich nicht zwischen den ND[–] und in ND[+]-Gruppen (Tabelle 14). Sie waren vermindert in der D[+]-Gruppe im Vergleich zur ND[–]-Gruppe (Tabelle 14).
Verabreichung von Arginin während der hyperglykämischen Einstellungsphase
Die Glukose-Spiegel unterschieden sich nicht zwischen den Gruppen während der Glukose-Infusion mit variabler Rate sowie der zweiten Arginin Bolus und der Infusion (Tabelle 14). Bei hyperglykämischen Plasma-Glukose-Spiegeln im Vergleich zu euglykämischen Spiegeln waren AIR und ACR auf Arginin sowie AUC_I, AUC_C und ISR erhöht und Unterschiede zwischen den Gruppen waren stark vergrößert (19, Tabelle 14). Alle Indizes der Insulin-Sekretion waren signifikant vermindert in der ND[+]-Gruppe im Vergleich zur ND[–]-Gruppe und es gab eine weitere Reduktion in der D[+]-Gruppe (Tabelle 14).
20A und 20B demonstrieren den Anstieg der Potentiation für Insulin bzw. C-Peptid. Glukose-Potentiation von Arginin stimulierter Insulin-Sekretion wurde reduziert, sowohl bei ND[+](0,80 ± 0,18 und D[+](0,24 ± 0,04)-Gruppen im Vergleich zu der ND[–]-Gruppe (2,12 ± 0,25, p < 0,001).
Die Insulin-Steigerung der Potentiation wurde auch reduziert in D[+]-Gruppen verglichen mit der ND[+]-Gruppe (p < 0,05). Die Glukose-Potentiation der Arginin stimulierten C-Peptid-Sekretion war auch vermindert in den ND[+](0,02 ± 0,00) und D[+](0,01 ± 0,0)-Gruppen im Vergleich zu der ND[–]-Gruppe (0,07 ± 0,01, p < 0,01).
Effekte von Arginin auf die Plasma-Glukagon-Konzentrationen
Am Ausgangswert unterschied sich der Glukagon-Spiegel nicht signifikant in den einzelnen Gruppen (Tabelle 13). Akute Glukagon-Antworten auf die 5 g Bolus von Arginin verabreicht bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen, unterschieden sich nicht signifikant unter ND[–], ND[+] und D[+]-Gruppen (104 ± 19, 92 ± 16 bzw. 82 ± 23 pg/ml). Auf der anderen Seite zeigte die Glukagon-Fläche unter der Kurve (10–60 min) während und folgend auf die Arginin-Infusion bei Ausgangs-Glukose-Konzentrationen eine Verminderung in D[+] im Vergleich zu ND[–]-Subjekten (4,778 ± 1,087 vs 7,549 ± 639 pg/ml, p < 0,05). ND[+]-Subjekte zeigten dazwischenliegende Volumina (5,772 ± 734 pg/ml; p = 0,09 vs. ND[–]-Gruppe). Während der hyperglykämischen Einstellung gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Glukagon-Flächen unter der Kurve für irgendeine der Gruppen (4,237 ± 406, 3,963 ± 508, und 2,941 ± 568 pg/ml, für ND[–], ND[+] und D[+]). Um die Auswirkung der Glukose Infusion auf die Glukagon-Antwort auf Arginin in den drei Untersuchungs-Gruppen zu bewerten, bewerteten die Erfinder die Unterschiede in der Glukagon-Fläche unter der Kurve, zwischen den euglykämischen und hyperglykämischen Perioden. Abnahmen in den Glukagon-Flächen, induziert durch die hyperglykämische Einstellung zwischen der ersten und der zweiten Arginin-Infusion waren 3312 ± 404, 1809 ± 387 und 1836 ± 535 pg/ml für die ND[–], ND[+] und D[+]-Gruppen, (p < 0,02 ND[–] vs ND[+]).
Beispiel 7
MODY aufgrund von Mutationen in der HNF4α-Bindungs-Stelle in dem HNF1α-Gen-Promotor
Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Mutation in dem Transkriptions-Faktor Hepatocyte Nuclear Factor (HNF)-1α die Ursache einer Form der im Entwicklungsstadium beginnenden Diabetes junger Menschen, MODY3, ist. Diese Untersuchungen haben Mutationen in der mRNA sowie in den Protein kodierenden Regionen dieses Gens gefunden, welche in der Synthese von abnormaler mRNA oder Protein führten. Hier berichten die Erfinder von einer italienischen Familie, in welcher eine A→C Substitution am Nukleotid – 58 der Promotor-Region des HNF1α-Gens mit MODY zusammenfällt. Diese Mutation ist in einer hochkonservierten Region des Promotors lokalisiert und zerstört die Bindungsstelle für den Transkriptions-Faktor HNF4α, wobei Mutationen in dem Gen HNF4α eine weitere Ursache für MODY (MODY1) sind. Dieses Ergebnis demonstriert, dass verminderte Spiegel von HNF1α per se MODY verursachen können. Darüber hinaus wird angezeigt, dass sowohl der Promotor als auch die kodierten Regionen des HNF1α-Gens auf Mutationen in Subjekten gescreent werden sollten, von denen man glaubt, dass sie MODY haben aufgrund von Mutationen in diesem Gen.
1. Verfahren
Subjekte
Die MODY-Familie Italy-1 wurde bestätigt durch die Diabetes Clinic of Santo Spirito's Hospital. Der betroffene Zustand wurde bestätigt unter Verwendung der Kriterien der National Diabetes Data Group. Der betroffene Zustand von nicht betroffenen Familien-Mitgliedern wurde definiert als normal oder geschädigt basierend auf den Ergebnissen eines Standard 75 g OGTT. Diese Untersuchung hat eine institutionelle Genehmigung und alle Subjekte haben ihre schriftliche Einverständnis-Erklärung abgegeben.
Verknüpfungsanalyse
Die Familien-Mitglieder wurden genotypisiert mit den Markern D12S321, D12S76 und UC-39, welche allesamt eng verknüpft sind mit dem HNF1α-Gen (MODY3) (Yamagata et al., 1996). Die Vorwärts- und die Rückwärts-Primer für die polymorphe Sequenz getagte Stelle (STS) UC-39 sind 5'-GCAACAGAGCAAGACTCCATCTCA-3' (SEQ ID Nr. 122 und 5'-GAGTTTAATGGAAGAACTAACC-3' (SEQ ID Nr. 123) und die PCR enthielt die ursprüngliche Denaturierung bei 94°C für 5 min sowie 35 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 1 min, Annealen bei 63°C für 1 min und Verlängerung bei 72°C für 1 min mit einer letztendlichen Extension bei 72°C für 10 min. Der Vorwärts-Primer wurde gelabelt mit ³²P und die MgCl₂-Konzentration in der Reaktion betrug 1,0 mM. Die PCR wurde durchgeführt in einem GeneAmp 9600 PCR System (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Die PCR-Produkte wurden abgetrennt durch Elektrophorese auf einem 5% Polyacrylamid Sequenzier-Gel und visualisiert durch Autoradiographie. Tests für die Verknüpfung wurden durchgeführt unter Verwendung des Haplotyps, ausgebildet von D12S321, D12S76 und UC-39 und unter der Annahme einer Rekombinations-Häufigkeit zwischen den benachbarten Markern von 0,001, mit dem Computer-Programm MLINK aus dem LINKAGE-Paket (version 5.1) (Lathrop et al., 1985). Die Häufigkeiten des Haplotyps wurden abgeschätzt aus den Daten. Die Analysen nahmen eine Erkrankungs-Allel-Häufigkeit von 0,001 an und zwei verantwortliche Klassen. Die Verantwortlichkeitsklasse 1 enthielt Individuen, die älter als > Jahre waren mit Durchdringungen von 0,00, 0,95 und 0,95 für die normale homozygote, heterozygote und empfänglich homozygote Form. Die verantwortliche Klasse 2 enthielt Individuen < 25 Jahre an Alter mit Durchdringen von 0,00, 0,50 und 0,95 für die normale homozygote, heterozygote und empfänglich homozygote Form. Der betroffene Status des einen Subjektes mit geschädigter Glukose-Toleranz war als unbekannt eingeordnet worden.
Identifikation von Mutationen
Jedes Exon und die minimale Promotor-Region des HNF1α-Gens der Subjekte II-5 und III-1 wurden gescreent auf Mutationen wie vorher beschrieben (Yamagata et al., 1996; Kaisaki et al., 1997). Die Mutation wurde bestätigt durch Klonieren des PCR-Produktes in pGEM-4Z sowie Sequenzieren der Klone, abgeleitet von beiden Allelen. Das Vorliegen der Mutation in anderen Familien-Mitgliedern sowie nicht verwandten, nicht an Diabetes leidenden Subjekten wurde getestet durch PCR-Amplifikation der benachbarten Promotor-Region sowie direktes Sequenzieren.
2. Ergebnisse
Verknüpfungs-Untersuchungen
Die NIDDM in dem Stammbaum Italy-1 weist die klinischen Merkmale von MODY auf, einschließend autosomal dominante Vererbung und Alter bei der Diagnose < 25 Jahre in multiplen Familien-Mitgliedern (21). Die sechs betroffenen Mitglieder wurden behandelt entweder mit Insulin (Individuen II-1, II-5 und III-9) oder oral hypoglykämischen Wirksubstanzen (II-7, III-1 und III-2). Die drei Subjekte mit Insulin-Therapie zeigten Nachweis von diabetischen Komplikationen einschließend Retinopathie (III-1 und II-5 sowie Nephropathie (III-9). Ein Mitglied dieses Stammbaums, III-6 zeigt eine geschädigte Glukose-Toleranz.
Die polymorphen Marker D12S321, D12S76 und UC-39, welche eng mit dem HNF1α-Gen verknüpft sind (Reihenfolge: Cen-D12S321-D12S76-HNF1α-U-39 qter) wurden typisiert in dieser Familie. Der Haplotyp 3-3-7 trat zusammen mit MODY auf mit keinen obligaten Rekombinanten (21). Ein Subjekt mit IGT (Alter 18 Jahre) hat auch diesen Haplotyp ererbt, wie dies auch bei zwei nicht betroffenen jungen Frauen der Fall war, Individuen III-5 und III-13, welche 21 bzw. 14 Jahre alt waren. Diese drei Subjekte könnten gefährdet sein, Diabetes in der Zukunft zu entwickeln. Der LOD-Score in dieser Familie betrug 1,28 bei einer Rekombinations-Fraktion von 0,00. Obwohl dieser LOD-Score nicht die formalen Kriterien zum Etablieren einer Verknüpfung erfüllte (d.h. der LOD Score ist < 3,0), beträgt der p-Wert assoziiert mit dem Nachweis für die Verknüpfung 0,008, was hinreichend ist, eine Suche auf Mutationen in dem HNF1α-Gen zu rechtfertigen.
Mutations-Screenen
Zwei diabetische Subjekte, II-5 und III-1, wurden gescreent auf Mutationen in dem HNF1α-Gen. Keine Mutationen wurden gefunden beim Screenen der mRNA/Proteinkodierten Regionen, Exons 1–10, obwohl die Subjekte heterozygot für verschiedene zuvor beschriebene Polymorphismen waren (Yamagata et al., 1996). Da keine Mutationen in der kodierenden Region des HNF1α-Gens gefunden wurden, wurde die umgebende Promotor-Region gescreent. Diese Analyse lieferte, dass beide betroffenen Subjekte heterozygot für eine A→C Substitution am Nukleotid –58 waren, welches in einer hoch konservierten Region des Promotores des HNF1α-Gens lokalisiert ist, welches die Bindungs-Stelle für HNF4α enthält (22) (Tian und Schibler et al., 1991; Kuo et al., 1992). Da diese Mutation nicht zur Erzeugung oder zum Verlust einer Stelle für die Restriktions-Endonuclease führte, wurde sie getestet durch PCR-Amplifikation und direktes Sequenzieren. Die A→C Substitution an Nukleotid –58 fiel zusammen mit dem Risiko gefährdeten Haplotyp in dem Italy-1-Stammbaum (21) und lag nicht in einer Probe von 50 nicht-verwandten weißen Subjekten vor, was nahe legt, dass sie eine Mutation verantwortlich für MODY in dieser Familie ist.
Beispiel 8
Mutation in HNF1β assoziiert mit MODY
HNF1α und HNF4α sind Mitglieder eines komplexen transkriptionellen regulatorischen Netzwerkes, welches andere Homeodomänen-Proteine und nukleäre Rezeptoren wie auch Mitglieder der Forkhead/Winged Helix und Leucine CCAAT/Enhancer Binding Protein-Familien enthält (Cereghini, 1996). Die Erfinder haben zwei andere Mitglieder dieses Netzwerks, HNF1β (Mendel et al., 1991a; De Simone et al., 1991; Rey-Campos et al., 1991; Bach and Yaniv, 1993) sowie das bi-funktionelle Protein Dimerisations-Co-Factor von HNF1α (DCoH/Pterin-4-Carbinolamine Dehydratase (PCBD) (Mendel et al., 1991b; Citron et al., 1992) auf Mutationen in japanischen Subjekten mit MODY gescreent. Keine Diabetes-assoziierten Mutationen wurden gefunden in DCoH. Jedoch haben die Erfinder ein Subjekt mit einer Nicht-Sense-Mutation in HNF1β gefunden, R177X, welche zusammenfiel mit früh-beginnender Diabetes. Die Identifikation von Mutationen in drei Mitgliedern der HNF-Familie von Transkriptions-Faktoren zeigt die Bedeutung dieses regulatorischen Netzwerkes bei der Aufrechterhaltung der Glukose-Homeostase.
1. Verfahren
Population der Untersuchung
Die Population der Untersuchung bestand aus 57 nicht miteinander verwandten japanischen Subjekten, welche am Diabetes Clinic of Tokyo Women's Medical College anwesend waren und welche die Diagnose NIDDM vor dem 25. Lebensjahr aufwiesen und/oder welche Mitglieder von Familien waren, in welchen NIDDM in drei oder mehr Generationen vorlag: Alter bei der Diagnose, 20,1 ± 7,5 Jahre (Mittelwert ± SE); männlich/weiblich: 31/26; und Behandlung, Insulin – 36, oral hypoglykämische Agenzien – 10 und Diät – 11. Diese Subjekte wurden gescreent auf Mutationen in dem HNF1α/MODY3-Gen und alle waren negativ auf Mutationen in diesem Gen (Lazzaro et al., 1992). Zwei unddreissig der Subjekte erfüllten die strikten Kriterien für eine Diagnose von MODY (d.h. NIDDM in den letzten drei Generationen mit autosomal dominanter Übertragung und Diagnose vor dem 25. Lebensjahr in zumindest einem betroffenen Subjekt). NIDDM wurde diagnostiziert unter Verwendung der Kriterien der World Health Organization (Bennett, 1994). Zum Zeitpunkt der Rekrutierung wurde eine schriftliche Einverständnis-Erklärung von jedem Subjekt erhalten und eine Blut-Probe wurde zur DNA-Isolierung genommen. Dreiundfünfzig nicht miteinander verwandte nicht an Diabetes erkrankte japanische Subjekte wurden getestet auf jede Nukleotid-Substitution und Mutation, um zu bestimmen, ob die Sequenz-Veränderung ein Polymorphismus oder eine Erkrankungs-assoziierte Mutation ist.
Stammbau J2-20
Der Proband (Subjekt III-2, 25) zeigt die Glukosurie seit dem 10. Lebensjahr und wurde ins Krankenhaus eingewiesen. Man diagnostizierte Diabetes bei ihr und behandelte sie mit Insulin für zwei Tage und anschließend mit Diät nur für zwei Jahre. Im Alter von 12 Jahren empfing sie eine Insulin-Therapie (28 U/day). Sie wurde zur klinischen Überwachung wiederum im Alter von 21 Jahren eingewiesen, aufgrund einer Pyelonephritis und schlecht kontrollierter Diabetes. Im Alter von 23 Jahren wurde sie an das Hospital von Tokyo Women's Medical College eingewiesen aufgrund von verschwommenem Sehen. Ihr Urin-C-Peptid-Spiegel zu dieser Zeit war 3,2 g/day (normal, 50 ± 25 g/day), was auf eine geringe Insulin-sekretorische Kapazität hinweist. Trotz dauerhafter hoher Blut-Glukose-Spiegel zeigte sie keine Ketosis-Historie. Das Subjekt wurde mit NIDDM, basierend auf ihrem klinischen Verlauf, diagnostiziert. Subjekt III-3 wurde mit allgemeiner Ermüdung im Alter von 15 Jahren erfasst. Er hatte 15 kg zugenommen während vergangener drei Monate und sein Gewicht zu diesem Zeitpunkt war 75 kg. Man diagnostizierte Diabetes bei ihm und er wurde zunächst mit Insulin und anschließend mit Diät und physischem Training behandelt. Er wurde gut überwacht, wobei er sein Gewicht bei 60 kg hielt. Im Alter von 18 Jahren hatte er erneut an Gewicht zugenommen und eine Insulin-Behandlung wurde begonnen. Sein C-Peptid im Urin zu dieser Zeit betrug 57,5 g/Tag mit nüchternem C-Peptid- und Glukose-Spiegeln von 2,4 ng/ml bzw. 106 mg/dl. Es gab keine Historie für Ketosis und er wurde mit NIDDM diagnostiziert. Er zeigt derzeit verminderte Pankreas-Zell-Funktion und keinen Anstieg in C-Peptid- Spiegeln folgend auf die Verabreichung von Glukagon. Alle Individuen, dargestellt in 25, wurden eingeladen, an dieser Studie teilzunehmen, jedoch weigerten sich viele.
Isolation und partielle Sequenz von menschlichem HNF1β-Gen
Der PAC Klon 319P12, enthaltend das menschliche HNF1β-Gen wurde isoliert aus einer Bibliothek (Genome Systems, St. Louis, MO) durch Screenen von PAC DNA Pools unter Verwendung der Polymerase Ketten-Reaktion (PCR^TM) und der Primer vHNFP1 (5'CCTCATGGAGAAACATCCTAAGT-3') (SEQ ID Nr. 124) und vHNFP2 (5'-AGGGAGTGCACGGCTGAGCTCCTG-3') (SEQ ID Nr. 125). Die Sequenz der Exons, der flankierenden Introns und der Promotor-Region wurde bestimmt durch Sequenzieren von PCR^TM-Produkten und geeigneter Restriktions-Fragmenten kloniert in pGEM^®-4Z (Promega, Madison, WI) mit einem AmpliTag FS Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) und ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer. Primer für PCR^TM und Sequenzieren wurden ausgewählt unter Verwendung der Exon/Intron-Organisation des menschlichen HNF1α-Gens (Yamagata et al., 1996a) als Hilfe, da verwandte Gene oft ähnliche Exon/Intron-Organisationen aufweisen. Die partielle Sequenz des menschlichen HNF1β-Gens, einschließend Promotor, wurde hinterlegt in der GenBank-Datenbank unter der Zugangs-Nummer U90279-90287 bzw. U96079.
Mutation Screenen
Die neun Exons, flankierend Introns und minimale Promotor-Region des HNF1β-Gens wurde amplifiziert unter Verwendung von PCR^TM und spezifischen Primern (Tabelle 17) und die PCR^TM-Produkte wurden sequenziert von beiden Enden wie oben beschrieben. PCR^TM für Exon 1 wurde durchgeführt unter Verwendung von ELONGASE Enzyme^TM Mix (Life Technologies, Grand Island, NY) mit Denaturierung bei 94°C für 1 min, gefolgt von 35 Cyclen der Denaturierung bei 94°C für 30 sec, Annealen bei 55°C für 30 sec und Extension bei 68°C für 1 min und letztendlicher Extension bei 68°C für 10 min. PCR^TM für die Exons 2–9 wurde durchgeführt unter Verwendung der Tag DNA-Polymerase und 1,5 mM MgCl₂ mit Denaturierung bei 94°C für 5 min, gefolgt von 35 Cyclen der Denaturierung bei 94°C für 30 sec, Annealen bei 60°C für 30 sec und Extension bei 72°C für 30 sec und einer letztendlichen Extension bei 72°C für 10 min. Die Sequenz einer jeden Mutation wurde bestätigt durch Klonieren des PCR^TM-Produktes in pGEM^®-T Easy (Promega, Madison, WI) sowie Sequenzieren der Klone repräsentierend beide Allele. Die Exons 2–4 des DCoH-Gens wurden amplifiziert unter Verwendung von Tag DNA Polymerase/1,5 mM MgCl₂ und spezifischen Primern (Tabelle 16) und sequenziert wie oben beschrieben. Exon 1 des DCoH-Gens kodierend die 5'-untranslatierte Region und das Met am Anfang war refraktär für die PCR^TM Amplifikation und wurde folglich nicht auf Mutation gescreent. Das Vorliegen einer spezifischen Mutation oder eines Polymorphismus in anderen Individuen wurde bestimmt durch PCR-RFLP Analyse, falls sie in einer Zunahme oder einem Verlust einer Stelle für eine Restriktions-Endonuclease resultierte oder PCR^TM sowie direktem Sequenzieren, falls keinerlei Veränderungen in einer solchen Stelle auftraten.
Verknüpfungs-Untersuchungen
Die menschlichen HNF1β (STS WI-7310) und DCoH-Gene wurden kartiert und bestätigt für die YACs 969C9 (Chromosom 17) (Schuler et al., 1996) bzw. 849H3 (Chromosome 10). Die benachbarten polymorphen STSs D17S1788 und D10S1688 wurden auf die Verknüpfung mit NIDDM in betroffenen blutsverwandten Japanischen Paaren (258 bzw. 268 mögliche Paare) getestet. Bei einem Genom-weiten Screen von mexikanischen Amerikanischen betroffenen blutsverwandten Paaren, 23, wurden die Gene HNF1β und DCoH in den Intervallen D17S1293-D17S1299 und D10S589-D10S535 sowie Schuler et al., 1996) gefunden.
Transaktivierungs-Untersuchungen von normalem und mutiertem menschlichen HNF1β
Das Konstrukt pcDNA3.1-HNF1β wurde hergestellt durch Klonieren der Typ A menschlichen HNF1β cDNA (Nucleotide 195-2783 inclusive, GenBank Accession Nr. X58840; SEQ ID Nr. 128) in pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die R177X Mutation wurde eingebracht durch ortsspezifische Mutagenese (QuikChange^TM Mutagenesis Kit; Stratagene, La Jolla, CA), um pcDNA3.1-HNF1β-R177X zu erzeugen. Das Reporter-Gen-Konstrukt pGL3-RA wurde hergestellt durch Klonieren des Promotors des Ratten-Albumin-Gens, Nukleotide –170 bis +5 (Ringeisen et al., 1993), in den Firefly Luciferase Reporter Vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI). Die Sequenzen aller Kon strukte wurden bestätigt. HeLa-Zellen wurden transfiziert für 5 Stunden unter Verwendung von lipofectAMINE^TM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) mit 500 ng an pGL3-RA, 250 ng an pcDNA3.1-HNF1β oder pcDNA3.1-HNF1β-R177X und 25 ng an pRL-SV40, um die Effizienz der Transfektion zu steuern. PcDNA3.1 + DNA wurde zu jeder Transfektion hinzugegeben, so dass die letztendliche Menge an DNA, die hinzugegeben worden war, 2 g betrug. Nach 24 h wurde die Transaktivierungsaktivität der normalen und mutierten HNF1β-Proteine, unter Verwendung des Dual-Luciferase^TM Reporter Assay System (Promega, Madison, WI), gemessen.
2. Ergebnisse
Die neun Exons, flankierende Introns und die minimale Promotor-Region des menschlichen HNF1β-Gens (TCF2), welche alle Formen von HNF1β kodieren, wurden auf Mutationen gescreent in 57 nicht miteinander verwandten japanischen Subjekten mit MODY. Die Analyse lieferte vier Nukleotid-Substitutionen, eine C→T Substitution in Kodon 177 (exon 2) in dem Probanden aus Familie J2-20, welcher eine Nicht-Sense-Mutation (CGA (Arg) TGA (OP) (R177X) (24) erzeugt, eine unübliche ruhende Mutation in Kodon 463 (exon 7), für welche ein Subjekt homozygot war, und zwei Polymorphismen in Intron 8 (Tabelle 15), von denen für beide prognostiziert wurde, dass sie nicht das RNA-Splicen beeinträchtigen. Nicht-Sense-Mutation R177X zeigte sich beim Screenen von 53 nicht miteinander verwandten, nicht-diabetischen japanischen Subjekten. Ein nicht an Diabetes erkranktes Subjekt war heterozygot für die ruhende Mutation in Kodon 463 (Tabelle 15).
Tabelle 15 Mutationen und DNA Polymorphismen in menschlichen HNF1β und DCoH-Genen
DNA Polymorphismen, gefunden in Introns, wurden als relativ zur Splice-Donor- oder Akzeptor-Stelle gefunden. nt, Nukleotid. In dem HNF1β-Gen resultierten die C→T Substitution in Kodon 463 sowie der C-Insertions-Polymorphismus in Intron 8, nt 48, im Zugewinn einer Dde I-Stelle und im Verlust einer Nae I-Stelle. In dem menschlichen DCoH-Gen (Genbank Zugangs-Nummer L41560, per Verweis eingeschlossen), ist das Nukleotid 9306 in der Region kodierend die 3' nicht-translatierte Region von DcoH mRNA und liegt 36 Nukleotide nach dem Translations-Terminations-Kodon.
Familie J2-20 zeigt eine bilineale Vererbung von Diabetes (25). Die R177X-Mutation, welche von mütterlicher Seite her vererbt worden ist, ist assoziiert mit einer früh ausbrechenden NIDDM, fortschreitender Insulin-Behandlung und schweren Komplikationen. Das frühe Alter bei der Diagnose in dem Probanden und ihrem Bruder kann möglicherweise von der Vererbung von Diabetes empfänglichen Genen von beiden Eltern herrühren. Das vom Vater vererbte Diabetes-Gen, welches den Effekt der HNF1β-Mutation potenzieren kann, ist unbekannt, ist jedoch kein ansonsten bekanntes MODY-Gen, da Mutationen in den HNF1α und HNF4α und Glukokinase-Genen des Probanden nicht gefunden wurden (Iwasaki, et al., 1997; Furuta et al., 1997; Iwasaki et al., 1995). Der ältere Bruder des Probanden war gesund bis zum Entwickeln einer üblichen Erkältung und starb eine Woche später an einer diabetischen Ketoacidose. Die Großväter mütterlicherseits des Probanden, die beide schon gestorben sind, waren nicht als Diabetiker bekannt. Jedoch hatte sie einen Onkel mütterlicherseits mit einer milden Diätkontrollierten NIDDM, diagnostiziert im Alter von 60 Jahren. Der Unterschied im Phenotyp zwischen der Mutter des Probanden und dem Onkel mütterlicherseits und der Abwesenheit von Diabetes bei den Großvätern mütterlicherseits legt nahe, dass die R177X-Mutation eine neue Mutation in der Mutter des Probanden repräsentieren kann. Der Vater und zwei Onkel väterlicherseits haben eine spät beginnende NIDDM behandelt mit oralen hyperglykämischen Wirksubstanzen. Von der Großmutter väterlicherseits des Probanden wurde berichtet, dass sie Diabetes hatte. Das Vorliegen von MODY und spät ausbrechender NIDDM innerhalb der gleichen Familie ist nicht unüblich und wurde bereits zuvor berichtet (Bell et al., 1991). Mit Blick auf das Vorliegen von Nephropathie in den Subjekten mit der R177X Mutation in HNF1β ist interessant, festzuhalten, dass HNF1β in den höchsten Spiegeln in der Niere exprimiert wird (Mendel et al., 1991a; De Simone et al., 1991; Rey-Campos et al., 1991; Bach und Yaniv, 1993; Lazzaro et al., 1992) und möglicherweise verminderte Spiegel dieses Transkriptions-Faktors zur renalen Dysfunktion beitragen.
HNF1β enthält eine zweiteilige DNA-Bindungs-Region, bestehend aus einem POU-ähnlichen Element und einer Homeodomäne (Mendel et al., 1991a; De Simone et al., 1991; Rey-Campos et al., 1991; Bach und Yaniv, 1993). Die R177X-Mutation ist lokalisiert am Ende der POU-ähnlichen Domäne und erzeugt ein Protein von 176 Aminosäuren mit der NH₂-Dimerisierung und POU-Domänen (Cereghini, 1996; Mendel et al., 1991a; De Simone et al., 1991; Rey-Campos et al., 1991; Bach und Yaniv, 1993). Dieses verkürzte Protein kann die Stimulation eines Ratten-Albumin-Promotorverknüpften Reporter-Gens nicht stimulieren und inhibiert die Aktivität von Wild-Typ HNF1β (Tabelle 16) nicht. Dies legt nahe, dass die R177X-Mutation eine Mutation mit Verlust-Funktion repräsentiert, welche in verminderten HNF1β-Spiegeln resultiert und einer korrespondierenden Reduktion in der Expression von HNF1β-Target-Genen.
Tabelle 16 Die Transaktivierungs-Aktivität von menschlichem HNF1β und R177X Mutation
Die Aktivität eines jeden Konstrukts wurde gemessen in dreifacher Ausführungsform, und die Mittelwerte ± SD sind gezeigt. Diese Ergebnisse sind repräsentativ von zumindest zwei unabhängigen Experimenten.
Menschliches DCoH ist ein Protein von 104 Aminosäuren (einschließend das Methionin) (Thöny et al., 1995). Die Exons 2–4, welche die Aminosäuren 2-104 kodieren, wurden auf Mutationen hin gescreent in den 57 nicht miteinander verwandten japanischen Subjekten mit MODY, die oben beschrieben wurden. Die Sequenzen waren identisch untereinander, mit Ausnahme eines A→G, lokalisiert in der 3' nicht-translatierten Region (Tabelle 15), deren Häufigkeit zwischen MODY- und Nicht-Diabetikern bei den Subjekten nicht unterschiedlich war. Folglich scheint die Mutation in DCoH keinerlei Beitrag zur Entwicklung von MODY bei Japanern zu liefern.
Die Häufigkeit von HNF1β-Mutation in der Population der Studie der Erfinder von japanischen Subjekten mit MODY ist 2% (1/57), was genauso hoch ist wie bei den Mutationen in HNF4α (Furuta et al., 1997), wohingegen die Häufigkeit von HNF1α-Mutation ungefähr 8% sind (Iwasaki et al., 1997) (die Häufigkeit der Glukokinase-Mutation in dieser Probe ist unbekannt). Jedoch ist es unwahrscheinlich, dass die genetische Variation in HNF1β oder DCoH ein hauptsächlicher Faktor ist, der zur üblicheren spät ausbrechenden NIDDM beiträgt, da es keinen Beleg für eine Verknüpfung von Markern benachbart mit diesen Genen gibt mit der Diabetes in Japanischen oder mexikanischen Amerikanischen betroffenen blutsverwandten Paaren (Hanis et al., 1996).
Die Assoziation einer Mutation in HNF1β mit Diabetes deutet auf die Bedeutung des HNF-regulatorischen Netzwerkes bei der Bestimmung der Pancreas-Zell-Funktion hin. Darüber hinaus ist HNF1α nicht in der Lage, die Verminderung in der HNF1β-Aktivität zu kompensieren, was impliziert dass die primären Target-Gene für diese Transkriptions-Faktoren in den Pankreas-β-Zellen unterschiedlich sind. Die Identifikation dieser Target-Gene werden ein besseres Verständnis für die molekularen Mechanismen zur Verfügung steilen, welche die normale Zellfunktion bestimmen und zu neuen Ansätzen in der Behandlung von Diabetes führen können.
Beispiel 9
Erläuterung der Gene, verantwortlich für weitere MODY-Erkrankungs-Zustände
Die Erfinder haben identifiziert, dass verschiedene MODY-Typ-Diabetes-Erkrankungs-Zustände verursacht werden durch Mutationen in verschiedenen HNF-Proteinen in den erkrankten Individuen. Jedoch kennen die Erfinder Familien, welche klassische „MODY"-Erkrankungszustände zeigen, welche nicht durch Mutation in HNF1α, HNF1β oder HNF4α verursacht werden. Folglich ist es ein Aspekt der Erfindung, mit dem Screenen des genetischen Komplements dieser Familie fortzufahren, um die Gene zu bestimmen, welche weitere MODY-Erkrankungs-Zustände verursachen. Solches Screenen kann durchgeführt werden in der Art und Weise, welche erfolgreich durch die Erfinder eingesetzt wurde, um die Ursachen von MODY1, MODY2 und MODY3 zu erforschen. Ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage und motiviert sein, im Blick auf die Lehren dieser Anmeldung, weiter an der Aufklärung von Genen zu arbeiten, welche, wenn sie mutiert sind, weitere MODY-Erkrankungs-Zustände verursachen. Sobald solche Gene aufgeklärt sind, werden alle Aspekte, Diagnose, Behandlung und andere Aspekte der Erfindung durch die Fachleute auf dem Gebiet für weitere MODY-Kausalketten realisierbar werden. Um diese Aspekte der Erfindung zu erreichen, wird man einfach die Prozeduren und Protokolle, welche in dieser Beschreibung gelehrt werden, in geeigneter Art und Weise adaptiert auf das spezifische Gen, für welches bestimmt wurde, dass es den MODY-Erkrankungs-Zustand verursacht, modifizieren müssen.
Alle der Zusammensetzungen und/oder Verfahren, welche hier offenbart und beansprucht werden, können durchgeführt bzw. hergestellt werden ohne unzumutbare Experimente im Licht der vorliegenden Offenbarung. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung mit Blick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden sind, wird es den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass Variationen für die Zusammensetzungen und/oder Verfahren und in den Schritten oder in der Sequenz von Schritten der hier beschriebenen Verfahren realisiert werden können, ohne vom Konzept, Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Genauer gesagt, würde es offensichtlich sein, dass bestimmte Wirksubstanzen, welche chemisch und physiologisch verwandt sind, Substanzen, die hier beschrieben werden, ersetzen können, während gleiche oder ähnliche Resultate erhalten werden würden. Alle solchen ähnlichen Substitute und Modifikationen, die den Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sind, sollten also innerhalb des Geistes, des Umfangs und des Konzepts der Erfindung als eingeschlossen gelten, so wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
Literatur-Verweise
Die folgenden Literatur-Verweise sind spezifisch hier per Verweis eingeschlossen insofern, als sie exemplarische, verfahrensmäßige oder andere Details ergänzend für diejenigen, die hier dargestellt sind, zur Verfügung stellen:

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Sequenz-Protokoll

Claims

Ein in vitro Verfahren zum Sreenen nach Diabetes umfassend: Analysieren einer Proben-Nukleinsäure, zuvor erhalten von einem Tier, um eine Mutation in einem HNF-1α, HNF-1β oder HNF-α kodierenden Nukleinsäure-Segment nachzuweisen; wobei eine Mutation in der HNF-kodierenden Nukleinsäure auf die Prädisposition für nicht-insulinabhängige Diabetes hindeutet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-1α-kodierende Nukleinsäure auf dem menschlichen Chromosom 12q lokalisiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-1α-kodierende Nukleinsäure an der MODY3-Stelle lokalisiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF4α-kodierende Nukleinsäure auf dem menschlichen Chromosom 20 lokalisiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF4α-kodierende Nukleinsäure an der MODY1-Steile lokalisiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF-1β-kodierende Nukleinsäure ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Nukleinsäure DNA ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt des Analysierens der HNF-kodierenden Nukleinsäure das Sequenzieren der HNF-kodierenden Nukleinsäure umfasst, um eine Sequenz zu erhalten.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Sequenz der HNF-kodierenden Nukleinsäure verglichen wird mit einer nativen Nukleinsäuresequenz eines HNF-Gens.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Sequenz der HNF-kodierenden Nukleinsäure verglichen wird mit einer nativen Nukleinsäuresequenz von HNF-1α.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die native Nukleinsäuresequenz von HNF-1α eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Sequenz der HNF-kodierenden Nukleinsäure verglichen wird mit einer nativen Nukleinsäuresequenz von HNF4α.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die native Nukleinsäuresequenz von HNF4α eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 78 dargestellt aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Sequenz der HNF-kodierenden Nukleinsäure verglichen wird mit einer nativen Nukleinsäuresequenz von HNF-1β.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die native Nukleinsäuresequenz von HNF-1β eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 128 dargestellt aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure zumindest eine Punktmutation umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine Translokations-Mutation oder eine Deletions-Mutation oder eine Insertions-Mutation aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF-1α-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation in Exon 2, Exon 4, Exon 6 oder Exon 9 der HNF-1α-kodierenden Nukleinsäure auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin eine Mutation am Kodon 131, 142, 159, 171, 289, 291, 292, 273, 379, 401, 447, 547 oder 548 einer HNF-1α-kodierenden Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF-1α-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation an dem Splice-Akzeptor von Intron 5 oder Intron 9 auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF-1α-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation eine Mutation ist wie in der folgenden Tabelle definiert:
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation in Exon 7 der HNF4α-kodierenden Nukleinsäure auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin eine Mutation am Kodon 268, 130 oder 273 einer HNF4α-kodierenden Nukleinsäure mit der SEQ ID NO: 78 auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF4α-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation eine Mutation ist wie in der folgenden Tabelle definiert:
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eine HNF-1β-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation in Exon 2, Exon 7 oder Intron 8 der HNF-1β-kodierenden Nukleinsäure auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin eine Mutation am Kodon 177, 463, an den Nukleotiden 48 von Intron 8 oder dem Nukleotid 22 von Intron 8 einer HNF-1β-kodierenden Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 128 auftritt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die HNF-kodierende Nukleinsäure eines HNF-1β-kodierende Nukleinsäure ist und eine Mutation eine Mutation ist wie in der folgenden Tabelle definiert:
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt des Analysierens der HNF-kodierenden Nukleinsäure PCR oder einen RNase-Protektions-Assay umfasst oder eine RFLP-Prozedur.
Die Verwendung von HNF-1α Polypeptiden oder Modulatoren von HNF-1α, von HNF-1β Polypeptiden oder Modulatoren von HNF-1β oder HNF-4α Polypeptiden oder Modulatoren von HNF-α zum Herstellen eines Medikamentes zur Regulation von Diabetes in einem Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei besagtes Medikament ein HNF-1α Polypeptid umfasst.
Die Verwendung von Anspruch 30, wobei das HNF-1α Polypeptid ein natives HNF-1α Polypeptid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei das native HNF-1α Polypeptid die Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
Die Verwendung einer Nukleinsäure kodierend einer HNF-1α Polypeptid zum Herstellen eines Medikaments zum Regulieren von Diabetes in einem Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 30, worin besagtes HNF-1α Polypeptid bereitgestellt wird zur Injektion in das Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin besagtes Medikament einen Modulator der HNF-1α Funktion umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 35, wobei der Modulator der HNF-1α Funktion ein Agonist von HNF-1α ist.
Die Verwendung von Anspruch 35, wobei der Modulator der HNF-1α Funktion die Transkription oder Translation einer HNF-1α-kodierenden Nukleinsäure moduliert.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei besagtes Medikament ein HNF4α Polypeptid umfasst.
Die Verwendung von Anspruch 38, wobei das HNF4α Polypeptid ein natives HNF4α Polypeptid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 38, wobei das native HNF4α Polypeptid die Sequenz von SEQ ID NO: 79 aufweist.
Die Verwendung einer Nukleinsäure kodierend einer HNF4α Polypeptid zum Herstellen eines Medikaments zum Regulieren von Diabetes in einem Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 38, worin besagtes HNF4α Polypeptid bereitgestellt wird zur Injektion in das Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin besagtes Medikament einen Modulator der HNF4α Funktion umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei der Modulator der HNF4α Funktion ein Agonist von HNF4α ist.
Die Verwendung von Anspruch 43, wobei der Modulator der HNF4α Funktion die Transkription oder Translation einer HNF4α-kodierenden Nukleinsäure moduliert.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin besagtes Medikament einen Modulator der HNF-1β Funktion umfasst.
Die Verwendung von Anspruch 46, wobei das HNF-1β Polypeptid ein natives HNF-1β Polypeptid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 46, wobei das native HNF-1β Polypeptid die Sequenz von SEQ ID NO: 129 aufweist.
Die Verwendung einer Nukleinsäure kodierend einer HNF-1β Polypeptid zum Herstellen eines Medikaments zum Regulieren von Diabetes in einem Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 46, worin besagtes HNF-1β Polypeptid bereitgestellt wird zur Injektion in das Tier.
Die Verwendung gemäß Anspruch 29, worin besagtes Medikament einen Modulator der HNF-1β Funktion umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 51, wobei der Modulator der HNF-1β Funktion ein Agonist von HNF-1β ist.
Die Verwendung von Anspruch 51, wobei der Modulator der HNF-1β Funktion die Transkription oder Translation einer HNF-1β-kodierenden Nukleinsäure moduliert.
Ein Verfahren zum Screenen nach anti-diabetischen Wirksubstanz-Kandidaten, welche die HNF-Funktion modulieren, umfassend die folgenden Schritte: (a) Erhalten eines HNF-1α, HNF-1β oder HNF4α-Polypeptids; (b) Bestimmen eines Standardaktivitäts-Profil des HNF-1α-, HNF-1β- oder HNF4α-Polypeptids; (c) Inkontaktbringen des HNF-1α-, HNF-1β- oder HNF4α-Polypeptids mit einer Kandidaten-Substanz; und (d) Durchführen eines Assays auf eine Veränderung im Standardaktivitäts-Profil; (e) Identifizieren von Kandidaten welche die Veränderung von (d) in dem Standard-Aktivitäts-Profil verursachen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, worin das Standard-Aktivitäts-Profil des HNF-1α-Polypeptids bestimmt wird durch Messen des Bindens des HNF-1α-Polypeptids an ein Nukleinsäure-Segment umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 9.
Das Verfahren gemäß Anspruch 55, wobei das Polypeptid-Segment umfassend die Sequenz SEQ ID NO: 2 einen nachweisbaren Label umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei das HNF-1α-Polypeptid einen nachweisbaren Label umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei das Standardaktivitäts-Profil des HNF-1α-Polypeptids bestimmt wird durch Bestimmen der Fähigkeit des HNF-1α-Polypeptids, die Transkritption eines Reportergens zu stimulieren, wobei das Reportergen operativ positioniert ist unter der Steuerung eines Nukleinsäure-Segments umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 1.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, worin das Standard-Aktivitäts-Profil des HNF4α-Polypeptids bestimmt wird durch Messen des Bindens des HNF4α-Polypeptids an ein Nukleinsäuresegment umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 85.
Das Verfahren gemäß Anspruch 59, wobei das Polypeptid-Segment umfassend die Sequenz SEQ ID NO: 79 einen nachweisbaren Label umfasst
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei das HNF4α-Polypeptid einen nachweisbaren Label umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, worin das Standard-Aktivitäts-Profil des HNF4α-Polypeptids bestimmt wird durch Messen des Bindens des HNF4α-Polypeptids an ein Nukleinsäuresegment umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 78.
Das Verfahren gemäß Anspruch 54, wobei das HNF-1β-Polypeptid einen nachweisbaren Label umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 63, worin das Standard-Aktivitäts-Profil des HNF-1β-Polypeptids bestimmt wird durch Messen des Bindens des HNF-1β-Polypeptids an ein Nukleinsäuresegment umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 128.