CH696239A5 - Alström-Syndrom, Genvarianten, codiertes Protein und Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die mit dem Alström-Syndrom zusammenhängt (ALMS1), Varianten dieser DNA-Sequenz, das durch diese DNA-Sequenz codierte Protein und Screeningverfahren zum Testen von Individuen, wobei bestimmt wird, ob sie Träger des Alström-Syndroms sind.

Das Alström-Syndrom ist eine homogene autosomale rezessive Störung, die gekennzeichnet ist durch eine Fettsucht im Kindesalter, assoziiert mit Hyperinsulinämie, chronischer Hyperglykämie und neurosensorischen Defiziten (Alstrom, C. H., Hallgren, B., Nilsson, L. B., und Asander, H.; "Retinal degeneration combined with obesity, diabetes mellitus and neurogenous deafness. A specific Syndrome (not hitherto described) distinct from Laurence-Moon-Biedl Syndrome. A clinical endocrinological and genetic examination based on a large pedigree." Acta Phychiatr. Neurol. Scand. 34 (Supplement 129), (1959), 1-35; Goldstein, J. L. und Fialkow, P. J., Medicine Baltimore 52 (1973), 53-71). Der Alström-Locus interagiert wahrscheinlich mit genetischen Modifikatoren, denn es gibt Gruppen von Patienten, die weitere Merkmale zeigen, wie dilatierte Kardiomyopathie (Michaud, J. L. et al., J. Ped. 128 (1996), 225-229), Leberfunktionsstörung (Connolly, M. B., et al., Am. J. Med. Genet. 40 (1991), 421-424), Hypothyreose (Charles, S. J., Moore, A. T., Yates, J. R., Green, T., und Clark, P.; "Alströms Syndrome: further evidence of autosomal recessive inheritance and endocrinological dysfunction"; J. Med. Genet. 27 (1990), 590-592), männlichen Hypogonadismus, Kleinwuchs und eine schwache bis mässige Entwicklungsverzögerung, ausserdem noch in Kombination mit Sekundärkomplikationen, die normalerweise mit dem Typ-Il-Diabetes assoziiert sind, wie Hyperlipidämie und Atherosklerose. Der Locus für das Alström-Syndrom wurde anfänglich in einer grossen französisch-akadischen Verwandtschaft auf dem Chromosom 2p13 innerhalb einer 14,9-cM-Region kartiert (Collin, G. B., Marshall, J. D., Cardon, L. R., und Nishina, P. M., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 213-219), und später dann auf einen genaueren Bereich von 6,1 cM (Collin, G. B., et al., Hum. Genet. 105 (1999), 474-479; Macari, F., et al., Hum. Genet. 103 (6), (Dez. 1998), 658-661).

Anhand einer Positions-Clonierungsstrategie wurde das bisher nicht charakterisierte Transkript KIAA0328 identifiziert, wobei die Mutationsanalyse zeigte, dass bei betroffenen Individuen aus sechs nicht verwandten Familien, die das Alström-Syndrom weitergeben, Sequenzvariationen vorliegen, einschliesslich vier Leserastermutationen und zwei Nonsense-Mutationen. ALMS1 ist ein neues Gen, das ubiquitär in geringen Raten exprimiert wird und keine signifikante Sequenzhomologie zu anderen, bisher beschriebenen Genen aufweist. Die Identifizierung des ALMS1-Gens bietet uns den Zugang zu einem neuen Stoffwechselweg, durch den sowohl das Alström-Syndrom als auch die herkömmlichen Krankheiten aufgeklärt werden können, die dieses Syndrom phänotypisch charakterisieren, wie Fettsucht, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Das ALMS1-Gen kann zur Diagnose des Alström-Syndroms verwendet werden, wobei genetische Tests auf Mutationen in dem Gen durchgeführt werden oder wobei Gewebe von Patienten auf die adäquaten Produktionsraten des durch das Gen codierten Proteins getestet werden. Die Identifizierung von ALMS1 macht auch das Screening von Individuen möglich, wobei durch einen genetischen Test bestimmt wird, ob sie Träger des Alström-Syndroms sind.

Fig. 1: Genaue Auflösung und physikalische Karten der ALMS1-Region. Rekombinationen bei einem betroffenen Kind aus der französisch-akadischen Verwandtschaft (K1) und bei einem Kind aus einer kleinen Kernfamilie (K53) lassen den kritischen ALMS1-Bereich auf eine Region < 2 cM eingrenzen. Acht überlappende BACs vervollständigen einen zusammenhängenden Bereich von 1,2 Mb. Die Positionen von 16 bekannten und vorausgesagten Genen, die von EST-Clustern stammen, sind als dunkle Balken dargestellt. Gene, die durch Mutationsanalyse getestet wurden, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Dunkle Balken, von links nach rechts aufeinanderfolgend: SEC15 (AB023136), SPR (Sepiapterin-Reduktase), EMX1 (leeres Stigma, Drosophila-Homolog 1), THC529835 (c. elegans sre2-Homolog), PP75 (KIAA0857), EST (THC551446)*, ein neues Gen, verwandt mit EMX-Homöobox-Protein*, NN8-4AG (auf Retinsäure ansprechend), CCT7 (Chaperonin-enthaltend TCP1, Untereinheit 7), EST (THC530316), EST (AI014261), EGR4 (frühe Wachstumsantwort 4), EST (KIAA0328), DUSP11 (duale-Spezifität-Phosphatase 11), AMSH* (STAM-assoziiertes Molekül) und ACTG2 (Aktin, Gamma-2, glatter Muskel, Darm).

Fig. 2: Genomische Struktur und alternatives Spleissen des ALMS1-Gens. a: Exon-Intron-Struktur von KIAA0328 (ALMS1) massstäblich dargestellt (vgl. auch Tabelle 1). Das Gen besteht aus 16 Exons, die > 164 kb der genomischen DNA überspannen. 5 - und 3 -UTR und Exonregionen sind durch offene bzw. gefüllte Kästchen dargestellt. Introns, für die unvollständige Sequenzinformationen vorliegen, sind durch Schraffur gekennzeichnet. b: Die wichtigsten alternativen Transkripte des menschlichen ALMS1.

Fig. 3: Mutationen in fünf nicht verwandten Familien, die das ALMS1 weitergeben. Mutationen wurden in allen betroffenen Individuen A1 bis A8 festgestellt, a bis d: Alle Mutationen werden in den betroffenen Individuen zusammen mit der Krankheit in einem homozygoten Zustand weitergegeben. a: Nachweis einer 19 bp grossen Insertion im Exon 9 von KIAA0328 in einer grossen blutsverwandten akadischen Verwandtschaft (K1) (Marshall, J. D., et al., "Genealogy, natural history, and phenotype of Alstrom Syndrome in a large Acadian kindred and three additional families", Am. J. Med. Genet. 73 (1997), 150-161). Das Chromatogramm zeigt die Sequenzunterschiede zwischen einer normalen Kontrolle und einem betroffenen Individuum. Die PCR-Amplifikation der 19 bp grossen Insertion aus einer Kemfamilie innerhalb der akadischen Verwandtschaft ist auf der rechten Seite dargestellt. Die Eltern (1, 2) sind für die Mutation heterozygot (Träger), das nicht betroffene Kind (3) ist für das normale Allel homozygot (439 bp, kein Träger), und das betroffene Kind (4) ist für die Insertion homozygot (458 bp). Die Übertragung der Insertion stimmt vollständig mit früher beschriebenen Haplotypen überein (nicht dargestellt). b: A 1582 C>T, Nonsense-Mutation im Exon 3 eines betroffenen Individuums italienischer Herkunft. c: Mutationen 3808 GA>T; 3813 G>A im Exon 9, die in allen drei betroffenen Nachkommen französischer Herkunft zu einer Verschiebung des Leserasters führen. NS = keine Probe, d. A 3974 del C Leserastermutation im Exon 9 in zwei Sippen. Zwischen diesen zwei Sippen wurde keine genealogische Verwandtschaft nachgewiesen. Ein verfrühtes Terminationssignal entsteht am Codon 1330. e: Eine Nonsense-Mutation 4648 C>T in den sekundären Cousins/Cousinen A7 (homozygot) und A8 (heterozygot). Eine zweite Mutation (1594 ins A) wurde in A8 identifiziert, die zu einer Verschiebung des Leserasters führt.

Fig. 4: Expression von ALMS1 in verschiedenen erwachsenen Mensch- und Maus-Geweben. a: RT-PCR einer menschlichen cDNA Mehrgewebe-Platte (CLON-TECH). b: Northern-Blot-Analyse der Maus von 5 Microg Poly-A<+>-RNA, hybridisiert mit einem 490-bp-cDNA-Fragment, das die Exons 1 bis 3 überspannt, und beta -Aktin als Kontrolle. Obwohl die Expression von ALMS1 im Gehirn und im Muskel durch die Northern-Analyse beim Menschen nicht nachgewiesen wurde, wurde durch RT-PCR eine geringe Expression gezeigt.

Fig. 5: Ähnlichkeit der Aminosäuren zwischen Mensch- und Maus-ALMS1 mit den Domänen der Maus (AK016590) und des Makaks (AB055273).

Anhand einer Positions-Clonierungsstrategie wurde das bisher nicht charakterisierte Transkript KIAA0328 identifiziert, wobei die Mutationsanalyse zeigte, dass bei betroffenen Individuen aus sechs nicht verwandten Familien, die das Alström-Syndrom weitergeben, Sequenzvariationen vorliegen, einschliesslich vier Leserastermutationen und zwei Nonsense-Mutationen. ALMS1 ist ein neues Gen, das mit geringen Raten ubiquitär exprimiert wird und keine signifikante Sequenzhomologie zu anderen, bisher beschriebenen Genen aufweist. Die Identifizierung des ALMS1-Gens bietet uns die Möglichkeit, den Zugang zu einem neuen Stoffwechselweg zu finden, durch den sowohl das Alström-Syndrom als auch die herkömmlichen Krankheiten aufgeklärt werden können, die dieses Syndrom phänotypisch charakterisieren, wie Fettsucht, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Das ALMS1-Gen kann zur Diagnose des Alström-Syndroms verwendet werden, wobei genetische Tests auf Mutationen in dem Gen durchgeführt werden oder wobei Gewebe von Patienten auf die adäquaten Produktionsraten des durch das Gen codierten Proteins getestet werden. Die Identifizierung von ALMS1 macht auch das Screening von Individuen möglich, wobei durch einen genetischen Test bestimmt wird, ob sie Träger des Alström-Syndroms sind.

Demgemäss stellt die Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die ALMS1 umfasst. Der hier verwendete Begriff "ALMS1" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül auf Chromosom 2p13, das das Gen umfasst, welches mit dem Alström-Syndrom assoziiert ist, und ausserdem auf einen Teil oder ein Fragment des isolierten Nucleinsäuremoleküls, der/das das ALMS1-Polypeptid codiert, vorzugsweise auf eine Nucleinsäure, die eine Sequenz umfasst, die ein ALMS1-Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül die SEQ ID NO: 1 oder das Komplement davon. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereit, die mit ALMS1 oder dem Komplement von ALMS1 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Der Begriff "unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren" bedeutet, dass zwei Nucleinsäurefragmente in der Lage sind, miteinander unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, wobei diese Hybridisierungsbedingungen beschrieben sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Insbesondere bezieht sich der hier verwendete Begriff "stringente Bedingungen" auf eine Hybridisierung bei 65 deg. C in einem Hybridisierungspuffer, der aus 250 mMol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 7% (Gew./Vol.) SDS, 1% (Gew./Vol.) BSA, 1 mMol/l EDTA und 0,1 mg/ml einzelsträngiger Lachssperma-DNA besteht. Ein letzter Waschgang erfolgt bei 65 deg. C in 125 mMol/l Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 1 mMol/l EDTA und 1% (Gew./Vol.) SDS.

Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können Folgendes sein: RNA, z.B. mRNA, DNA, wie cDNA und genomische DNA. DNA-Moleküle können doppelsträngig oder einzelsträngig vorliegen; einzelsträngige RNA oder DNA kann entweder den codierenden oder Sense-Strang oder den nicht-codierenden oder Antisense-Strang darstellen. Das Nucleinsäuremolekül kann die gesamte codierende Sequenz des Gens oder einen Teil davon umfassen, und es kann ausserdem zusätzliche nicht-codierende Sequenzen enthalten, wie Introns und nicht-codierende 3 -und 5 -Sequenzen, einschliesslich regulatorischer Sequenzen. Ferner kann das Nucleinsäuremolekül mit einer Markersequenz fusioniert sein, z.B. mit einer Sequenz, die ein Polypeptid codiert, wodurch eine Isolierung oder Reinigung des Polypeptids erleichtert wird. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise isolierte Nucleinsäuremoleküle.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nucleinsäure ALMS1 mit einer Mutation, die mit dem Alström-Syndrom assoziiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus DNA-Sequenzen, die mit ALMS1 oder dem Komplement von ALMS1 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, DNA-Sequenzen, die die gleiche Aminosäuresequenz wie ALMS1 codieren, und Nucleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die ein ALMS1-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei 19 Nucleotide hinter dem 3737. Nucleotid von ALMS1 eingefügt sind; einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei das 1582. Nucleotid von ALMS1 T ist; einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei das 3808. Nucleotid von ALMS1 T ist, das 3809. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist und das 3813. Nucleotid von ALMS1 A ist; einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei das 3974. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist; einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei das 4648. Nucleotid von ALMS1 T ist; und einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, wobei ein A hinter dem 1594. Nucleotid von ALMS1 eingefügt ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nucleinsäurekonstrukte, die eines der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Konstrukte umfassen einen Vektor (z.B. einen Expressionsvektor), in den eine erfindungsgemässe Sequenz in Sense- oder in Antisense-Orientierung eingefügt wurde. Der hier verwendete Begriff "Vektor" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nucleinsäure zu transportieren, an die es gekoppelt wurde.

Rekombinante ALMS1-Nucleinsäuremoleküle, Antisense-Moleküle, Vektoren, die solche Nucleinsäuremoleküle einbauen, oder Antisense-Moleküle können durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann der Molekularbiologie bekannt sind. Hierzu zählt z.B. die Auswahl von Vektoren, diese hängen von der gewünschten Funktion ab und umfassen Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere Vektoren, die üblicherweise in der Gentechnik eingesetzt werden. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um verschiedene Plasmide und Vektoren zu konstruieren; vgl. z.B. die Techniken, die beschrieben sind in Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), New York; und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., (1989), (1994). Andererseits können die Nucleinsäuremoleküle und Vektoren in Liposomen rekonstituiert werden, so dass sie zu Zielzellen transportiert werden können. Wenn die Expression eines bestimmten Polypeptids erforderlich ist, können die relevanten Sequenzen in Expressionsvektoren übertragen werden. Typische Clonierungsvektoren umfassen pBscpt sk, pGEM, pUC9, pBR322 und pGBT9. Typische Expressionsvektoren umfassen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, pET, pGEX, pMALC, pPIC9, pBac. Das rekombinante Nucleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung kann für die Expression eines erfindungsgemässen Polypeptids in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen entworfen werden, z.B. Bakterienzellen, Insektenzellen, Hefezellen oder Säugerzellen. Der Fachmann kennt noch andere geeignete Wirtszellen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Wirtszellen, in die ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt der Erfindung eingeführt wurde. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier austauschbar verwendet. Es ist so zu verstehen, dass diese Begriffe sich nicht nur auf die bestimmten betreffenden Zellen beziehen, sondern auch auf die Nachkommen oder die möglichen Nachkommen einer solchen Zelle.

Das Nucleinsäurekonstrukt kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.

Eine Wirtszelle der Erfindung, wie z.B. eine prokaryotische oder eine eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann eingesetzt werden, um ein Polypeptid der Erfindung herzustellen. Demgemäss stellt die Erfindung ferner Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch die erfindungsgemässen Nucleinsäuremoleküle codiert ist, unter Verwendung der erfindungsgemässen Wirtszellen bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Züchten der erfindungsgemässen Wirtszelle (in die ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt eingeführt wurde, welches ein erfindungsgemässes Polypeptid codiert) unter Bedingungen, die für eine Expression der Nucleinsäuremoleküle geeignet sind. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren des Polypeptids aus dem Medium oder der Wirtszelle.

Die Wirtszelle der Erfindung kann auch verwendet werden, um nichtmenschliche transgene Tiere herzustellen. Z.B. ist die erfindungsgemässe Wirtszelle in einer Ausführungsform eine befruchtete Eizelle oder eine embryonale Stammzelle, in die ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung eingeführt wurde. Solche Wirtszellen können anschliessend zur Herstellung nicht-menschlicher transgener Tiere, bei denen exogene Nucleotidsequenzen ins Genom eingeführt wurden, oder homologer rekombinanter Tiere verwendet werden, bei denen endogene Nucleotidsequenzen verändert wurden. Anhand solcher Tiere kann die Funktion und/oder die Aktivität der Nucleotidsequenz und des durch die Sequenz codierten Polypeptids untersucht werden, ausserdem können Modulatoren ihrer Aktivität identifiziert und/oder getestet werden. Das hier verwendete "transgene Tier" ist ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säugetier, stärker bevorzugt ein Nagetier, wie eine Ratte oder eine Maus, wobei eine oder mehrere Zellen des Tiers das Transgen enthalten. Ein Transgen ist eine exogene DNA, die in das Genom einer Zelle eingebaut ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt, und die in dem Genom des reifen Tiers verbleibt, so dass die Expression eines codierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers gesteuert wird. Verfahren zur Herstellung transgener Tiere mittels Embryomanipulation und Mikroinjektion, insbesondere von Tieren wie Mäusen, sind dem Fachmann nach dem Stand der Technik inzwischen geläufig. Die Herstellung transgener Embryos und ihr Screening kann durchgeführt werden, wie z.B. von A. L. Joyner, Hrsg., Gene Targeting, A Practical Approach, (1993), Oxford University Press, beschrieben.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein transgenes Tier, das eine erfindungsgemässe Nucleinsäure umfasst. Ausserdem stellt die Erfindung transgene Zellen und Gewebe bereit, die aus den transgenen Tieren stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt die transgene Zelle, das transgene Gewebe oder das transgene nicht-menschliche Tier im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Zelle, zum entsprechenden Wildtyp-Gewebe oder nicht-menschlichen Tier eine wesentlich reduzierte oder erhöhte Rate der ALMS1 -Expression. Vorzugsweise führt die wesentlich reduzierte oder erhöhte Rate der ALMS1-Expression zu einer veränderten und zu einer typischen Antwort der transgenen Zelle, des transgenen Gewebes oder des transgenen nicht-menschlichen Tiers. Üblicherweise umfasst das transgene nicht-menschliche Tier, das eine reduzierte Rate der ALMS1-Expression zeigt, mindestens ein mutiertes Allel von ALMS1 oder ein entsprechendes transdominantes Allel eines anderen Gens. Vorzugsweise ist das transgene nicht-menschliche Tier ein ALMS1-"Knockout"-Tier. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das transgene nicht-menschliche Tier eine Maus.

Ausserdem kann es wünschenswert sein, die Expression oder Funktion des ALMS1-Polypeptids in einem bestimmten Entwicklungsstadium und/oder Lebensabschnitt des transgenen Tiers zu inaktivieren. Dies kann erreicht werden, indem z.B. gewebespezifische, entwicklungs- und/oder zellregulierte und/oder induzierbare Promotoren eingesetzt werden, die die Expression z.B. eines Antisense oder eines Ribozyms steuern, das gegen das RNA-Transkript gerichtet ist, welches die ALMS1-codierende RNA codiert. Ein geeignetes induzierbares System ist z.B. die Tetracyclin-regulierte Genexpression, wie z.B. von Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551; und Gossen et al., Trends Biotech. 12 (1994), 58-62, beschrieben. Genauso kann die Expression des (mutierten) ALMS1-Polypeptids durch solche regulatorischen Elemente kontrolliert werden.

Ausserdem betrifft die Erfindung transgene nicht-menschliche Tiere und eukaryotische Zellen, die ein ALMS1-Nulceinsäuremolekül oder einen Teil davon enthalten (vorzugsweise stabil ins Genom eingebaut), wobei die Transkription und/oder die Expression des Nucleinsäuremoleküls oder des Teils davon zu einer Reduktion der Synthese eines ALMS1-Polypeptids führt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reduktion durch einen Antisense-, Sense-, Ribozym-, Co-Suppressions- und/oder dominanten Mutanten-Effekt erreicht. "Antisense" und "Antisense-Nucleotide" beziehen sich auf DNA- oder RNA-Konstrukte, die die Expression des natürlich vorkommenden Genprodukts blockieren.

Techniken, mit denen dies erreicht werden kann, sind dem Fachmann bekannt. Diese umfassen z.B. die Expression von Antisense-RNA, Ribozymen, Molekülen, die Antisense- und Ribozym-Funktionen kombinieren, und/oder Molekülen, die einen Co-Suppressionseffekt bereitstellen. Wenn zur Senkung der Menge der ALMS1-Polypeptide in der Zelle die Antisense-Vorgehensweise eingesetzt wird, ist das Nucleinsäuremolekül, das die Antisense-RNA codiert, vorzugsweise homologen Ursprungs hinsichtlich der Tierart, die für die Transformation verwendet wird. Jedoch ist es auch möglich, Nucleinsäuremoleküle einzusetzen, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen vorkommenden Nucleinsäuremolekülen zeigen, welche ein ALMS1-Polypeptid codieren. In diesem Fall ist die Homologie vorzugsweise höher als 80%, insbesondere höher als 90% und noch stärker bevorzugt höher als 95%. Die Reduktion der Synthese des ALMS1-Polypeptids in den transgenen eukaryotischen Zellen kann zu einer Veränderung führen, wie sie z.B. beim Alström-Syndrom zu finden ist. Bei transgenen Tieren, die solche Zellen enthalten, kann dies verschiedene physiologische, die Entwicklung betreffende und/oder morphologische Veränderungen zur Folge haben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Proteine und Polypeptide, die durch ALMS1 codiert sind, sowie Fragmente und Varianten davon, ausserdem Polypeptide, die durch die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung codiert sind. Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren und ist nicht auf eine bestimmte Länge beschränkt. Somit sind in der Definition des Polypeptids Peptide, Oligopeptide und Proteine enthalten. Vorzugsweise ist das erfindungsgemässe Polypeptid ein isoliertes Polypeptid. Die erfindungsgemässen Polypeptide können bis zur Homogenität gereinigt werden. Es ist so zu verstehen, dass Präparate verwendet werden können, in denen das Polypeptid nicht bis zur Homogenität gereinigt ist. Der kritische Punkt besteht darin, dass das Präparat die gewünschte Funktion des Polypeptids und seine Identifizierung möglich macht, auch wenn beträchtliche Mengen anderer Komponenten vorliegen. Aus diesem Grund umfasst die Erfindung verschiedene Reinheitsgrade der erfindungsgemässen Polypeptide.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das durch eine Nucleinsäuresequenz codiert ist, die ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: einer DNA-Sequenz, umfassend ALMS1, DNA-Sequenzen, die mit ALMS1 oder dem Komplement von ALMS1 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, mALMS1, den vorstehend erwähnten Nucleinsäuresequenzen, umfassend Mutationen, die mit dem Alström-Syndrom assoziiert sind, und DNA-Sequenzen, umfassend ALMS1 mit den folgenden Mutationen, Deletionen und Insertionen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgenden besteht: wobei 19 Nucleotide hinter dem 3737. Nucleotid von ALMS1 eingefügt sind; wobei das 1582. Nucleotid von ALMS1 T ist; wobei das 3808. Nucleotid von ALMS1 T ist, das 3809. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist und das 3813. Nucleotid von ALMS1 A ist; wobei das 3974. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist; wobei das 4648. Nucleotid von ALMS1 T ist; und wobei ein A hinter dem 1594. Nucleotid von ALMS1 eingefügt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.

Die erfindungsgemässen Polypeptide umfassen ferner Fragmente und Sequenzvarianten. Varianten enthalten ein im Wesentlichen homologes Polypeptid, das durch den gleichen genetischen Locus in einem Organismus codiert ist, z.B. eine Allelvariante, und ausserdem andere Spleissvarianten. Varianten umfassen auch im Wesentlichen homologe Polypeptide, die durch einen anderen Genlocus in einem Organismus codiert sind, die jedoch zu der gleichen Proteinfamilie gehören, und ausserdem im Wesentlichen homologe oder identische Polypeptide aus einem anderen Organismus, z.B. orthologe Moleküle. Varianten umfassen ferner im Wesentlichen homologe oder identische Polypeptide, die durch chemische Synthese oder rekombinante Verfahren hergestellt wurden.

Somit umfasst die vorliegende Erfindung die ALMS1-Polypeptidvarianten, die im Wesentlichen homolog sind. Solche Varianten umfassen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Substitutionen, die gemäss den allgemeinen Regeln nach dem Stand der Technik so gewählt sind, dass sie nur eine geringe Wirkung auf die Aktivität haben. Z.B. findet sich eine Anleitung zur Herstellung von phänotypisch stummen Aminosäuresubstitutionen in Bowie, Science 247 (1990), 1306-1310, worin die Autoren zeigen, dass es zwei Hauptstrategien gibt, um die Toleranz einer Aminosäuresequenz, sich zu verändern, zu untersuchen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die ALMS1-Polypeptid-Variante eine Aminosäuresequenz, die mit einer ALMS1-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung zu mehr als 90% identisch ist.

Neben einer konservativen Aminosäuresubstitution umfassen Varianten von ALMS1 (i) Substitutionen mit einem oder mehreren der nicht-konservierten Aminosäurereste, wobei die subsitutierten Aminosäurereste solche sein können, die durch den genetischen Code codiert sind oder die nicht dadurch codiert sind, oder (ii) Substitution mit einem oder mehreren Aminosäureresten, die eine Substituentengruppe aufweisen, oder (iii) Fusion des reifen Polypeptids mit einer weiteren Verbindung, z.B. einer Verbindung zur Erhöhung der Stabilität und/oder der Löslichkeit des Polypeptids (z.B. Polyethylenglykol), oder (iv) Fusion des Polypeptids mit weiteren Aminosäuren, wie z.B. einem IgG-Fc-Fusionsregions-Peptid, oder einer Leader- oder Sekretionssequenz, oder einer Sequenz zur Erleichterung der Reinigung. Solche Variantenpolypeptide sollen im Umfang der vorliegenden Erläuterungen liegen, wie aus der hier dargestellten Beschreibung für einen Fachmann ersichtlich ist.

Z.B. können ALMS1-Polypeptidvarianten, die Aminosäuresubstitutionen von geladenen Aminosäuren durch andere geladene oder neutrale Aminosäuren enthalten, Proteine mit verbesserten Eigenschaften produzieren, z.B. mit einer geringeren Aggregation. Die Aggregation pharmazeutischer Formulierungen reduziert die Aktivität und steigert ausserdem aufgrund der immunogenen Aktivität des Aggregats die Clearance; vgl. z.B. Pinckard, Clin. Exp. Immunol. 2 (1967), 331-340; Robbins, Diabetes 36 (1987), 838-845; Cleland, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (1993), 307-377.

Das Polypeptid der Erfindung kann aus Zellen gereinigt werden, die es von Natur aus exprimieren, es kann aus Zellen gereinigt werden, die so verändert wurden, dass sie es rekombinant exprimieren, oder es kann synthetisiert werden, wobei die bekannten Methoden der Proteinsynthese eingesetzt werden. In einer Ausführungsform wird das Polypeptid durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt.

Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um Antikörper zu induzieren oder um eine Immunantwort hervorzubringen. Ausserdem können die Polypeptide als ein Reagens, z.B. als ein markiertes Reagens, in Tests verwendet werden, um die Spiegel von Molekülen, an die es in biologischen Flüssigkeiten bindet, quantitativ zu bestimmen. Ferner können die Polypeptide als Marker eingesetzt werden, um ein entsprechendes bindendes Mittel zu isolieren und um nach Peptid- oder kleinen Molekül-Antagonisten oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu suchen.

Ferner umfasst die Erfindung einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das selektiv an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung bindet. Ein gegen ALMS1 (oder eine ALMS1-Variante) gerichteter Antikörper der vorliegenden Erfindung kann ein monoclonaler Antikörper, ein polyclonaler Antikörper, ein einzelkettiger Antikörper, ein menschlicher oder vermenschlichter Antikörper, ein primatisierter, xenogener, chimärisierter oder ein Fragment davon sein, der/das spezifisch an ein ALMS1-Polypeptid bindet, und ausserdem umfassend einen bispezifischen Antikörper, einen synthetischen Antikörper, ein Antikörperfragment, wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente usw., oder ein chemisch modifiziertes Derivat davon. Die allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind bekannt und wurden z.B. in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 494, beschrieben und in J. G. R. Hurrel, Hrsg., "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL, (1982), zusammengefasst sowie ausserdem in L. T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604-619, dargestellt. Ferner können Antikörper oder Fragmente davon für die vorstehend erwähnten Polypeptide unter Verwendung der Verfahren erhalten werden, die z.B. in Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind.

Im Allgemeinen können Antikörper der Erfindung eingesetzt werden, um ein Polypeptid der Erfindung durch Standardtechniken zu isolieren, z.B. durch Affinitäts-Chromatographie oder Immunfällung. Ferner kann ein Antikörper, der für ein Polypeptid der Erfindung spezifisch ist, verwendet werden, um das Polypeptid nachzuweisen (z.B. in einem Zelllysat, einem Zellüberstand oder in einer Gewebeprobe), wodurch die Verbreitung und das Expressionsmuster des Polypeptids untersucht werden können. Antikörper können diagnostisch eingesetzt werden, um Proteinspiegel im Gewebe zu überwachen, wobei es sich um einen Teil eines klinischen Testverfahrens handeln kann. Der Nachweis kann erleichtert werden, indem der Antikörper an eine nachweisbare Substanz gekoppelt wird. Beispiele nachweisbarer Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Stoffe, lumineszierende Stoffe, biolumineszierende Stoffe und radioaktive Substanzen.

Ausserdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms, das mit dem Vorliegen des ALMS1-Gens oder Genprodukts assoziiert ist, bei einem Individuum. Diagnostische Tests können so entwickelt werden, dass die ALMS1-Genexpression bestimmt wird oder dass das Vorliegen oder die Aktivität von ALMS1-Polypeptiden bestimmt wird. Die Tests können an einer biologischen Probe durchgeführt werden, so dass dadurch bestimmt werden kann, ob ein Individuum am Alström-Syndrom leidet oder ob die Gefahr besteht, dass sich bei ihm ein Alström-Syndrom entwickelt. Ausserdem stellt die Erfindung einen prognostischen Test bereit, mit dem bestimmt werden kann, ob ein Individuum ein Träger des Alström-Syndroms ist und ob es empfänglich dafür ist, dass sich bei ihm ein Alström-Syndrom entwickelt.

Die hier beschriebenen Nucleinsäuren, Polypeptide und Antikörper können in Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms oder einer Empfänglichkeit für das Alström-Syndrom eingesetzt werden, ausserdem in Kits zur Diagnose des Alström-Syndroms oder einer Empfänglichkeit für das Alström-Syndrom.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms oder zum Screening nach Trägern des Alström-Syndroms bereitgestellt, umfassend das Testen von genetischem Material aus einem mutmasslichen Träger auf Mutationen im ALMS1, wobei das Vorliegen von Mutationen im Gen das Alström-Syndrom anzeigt.

Bei den meisten der vorstehend beschriebenen diagnostischen Verfahren sind Nucleinsäuresonden als ein äusserst wichtiges Element enthalten. Wenn die Sonden verwendet werden, um das Vorliegen der Zielsequenzen nachzuweisen, kann die biologische Probe, die analysiert werden soll, wie Blut oder Serum, so behandelt werden, dass die Nucleinsäuren extrahiert werden. Die Nucleinsäure der Probe kann auf verschiedene Art und Weise zubereitet werden, so dass der Nachweis der Zielsequenz erleichtert wird, z.B. durch Denaturierung, Restriktionsspaltung, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die Zielregion der Analyt-Nucleinsäure muss normalerweise mindestens zum Teil einzelsträngig vorliegen, so dass Hybride mit der zielenden Sequenz der Sonde gebildet werden können. Wenn die Sequenz von Natur aus einzelsträngig ist, ist keine Denaturierung erforderlich. Wenn die Sequenz jedoch doppelsträngig ist, ist es möglicherweise erforderlich, dass sie denaturiert wird. Die Denaturierung kann durch verschiedene Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind.

Zielnucleinsäuren, Sonde und Analyt können unter Bedingungen inkubiert werden, die die Bildung eines stabilen Hybrids zwischen der Zielsequenz in der Sonde und der mutmasslichen gezielten Sequenz im Analyt fördern. Die Region in der Sonde, die zum Binden an das Analyt verwendet wird, kann vollständig komplementär gemacht werden zu der gezielten Region des menschlichen Chromosoms 2. Aus diesem Grund sind Bedingungen mit einer hohen Stringenz wünschenswert, wodurch falsch positive Ergebnisse verhindert werden können. Jedoch werden Bedingungen mit einer hohen Stringenz nur dann eingesetzt, wenn die Sonden zu Regionen des Chromosoms komplementär sind, die im Genom einmalig vorliegen. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während der Waschprozeduren bestimmt, einschliesslich Temperatur, lonenstärke, Basenzusammensetzung, Sondenlänge und Konzentration von Formamid. Diese Faktoren finden sich z.B. in Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; und Sambrook et al., 1989. Unter bestimmten Umständen kann die Bildung von Hybriden höherer Ordnung, wie Triplexen, Quadraplexen usw., wünschenswert sein, um die Mittel zum Nachweis von Zielsequenzen bereitzustellen.

Die Hybridisierung von Nucleinsäuren wird durch bestimmte Bedingungen beeinflusst, wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel, ausserdem durch die Basenzusammensetzung, Länge der komplementären Stränge und Zahl von Nucleotidbasen-Fehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nucleinsäuren, wie dem Fachmann bekannt ist. Stringente Temperaturbedingungen umfassen im Allgemeinen Temperaturen über 30 deg. C, typischerweise über 37 deg. C und vorzugsweise über 45 deg. C. Stringente Salzbedingungen liegen normalerweise unter 1000 mM, typischerweise unter 500 mM und vorzugsweise unter 200 mM. Jedoch ist die Kombination von Parametern viel wichtiger als die Einstellung der einzelnen Parameter. Sondensequenzen können unter bestimmten Bedingungen auch spezifisch mit Duplex-DNA hybridisieren, wodurch Triplex- oder andere DNA-Komplexe höherer Ordnung gebildet werden. Die Herstellung solcher Sonden und geeignete Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt.

Der Nachweis des resultierenden Hybrids, sofern er durchgeführt wird, erfolgt normalerweise unter Verwendung von markierten Sonden. Alternativ kann die Sonde auch unmarkiert sein, kann jedoch durch eine spezifische Bindung mit einem Liganden direkt oder indirekt nachgewiesen werden, der seinerseits markiert ist. Geeignete Markierungen und Verfahren zur Markierung von Sonden und Liganden sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. radioaktive Markierungen, die durch bekannte Verfahren eingebaut werden können (z.B. durch Nick-Translation, Random-Priming oder Kinasebehandlung), Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z.B. Dioxetane, insbesondere markierte Dioxetane), Enzyme, Antikörper und dergleichen. Ausserdem kennt der Fachmann Verfahren, die von diesem grundlegenden Schema abweichen, etwa Verfahren, die eine Trennung der nachzuweisenden Hybride von Fremdstoffen erleichtern, und/oder die das Signal aus der markierten Einheit verstärken. Verschiedene solche veränderten Verfahren sind z.B. in Matthews und Kricka, Anal. Biochem. 169 (1988), 1; und Landegren et al., Science 242 (1988), 229; Mittlin, 1989; dargestellt.

Wie vorstehend angegeben betrifft diese Erfindung eine Reihe von nicht-PCR-basierten Screeningtests. In einem Verfahren hybridisiert eine Nucleinsäuresonde (oder ein Analog, bei dem z.B. ein Methylphosphonat-Rückgrat anstelle des normalen Phosphodiesters vorliegt) mit der in einer niedrigen Konzentration vorliegenden Ziel-DNA. Diese Sonde kann ein Enzym aufweisen, das so an die Sonde kovalent gebunden ist, dass die kovalente Bindung nicht die Spezifität der Hybridisierung stört. Dieser Komplex aus Enzym-Sonde-Konjugat und Zielnucleinsäure kann sodann von dem freien Sonde-Enzym-Konjugat abgetrennt werden, anschliessend wird ein Substrat für den Nachweis des Enzyms zugefügt. Die enzymatische Aktivität wird als eine Änderung in der Farbentwicklung oder im lumineszierenden Ausstoss festgestellt, hierdurch kommt es zu einer erhöhten Empfindlichkeit. Ein Beispiel zur Herstellung von Konjugaten aus Oligodesoxynucleotid und alkalischer Phosphatase und ihre Verwendung als Hybridisierungssonden findet sich in Jablonski et al., N. A. R. 14 (1986), 6115-6128. Ausserdem kennt der Fachmann zweistufige Markierungsverstärkungsverfahren. Diese Tests arbeiten auf dem Prinzip, dass ein kleiner Ligand (wie Digoxigenin, Biotin oder dergleichen) an eine Nucleinsäuresonde angehängt wird, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemässe ALMS1-Sequenz zu binden. Ausserdem sind im Umfang der Erfindung Allel-spezifische Sonden enthalten, wobei Beispiele von Allel-spezifischen Sonden solche Sonden betreffen, die die prädisponierenden Mutationen der vorliegenden Erfindung umfassen.

In einer Ausführungsform wird der kleine Ligand, der an der Nucleinsäuresonde befestigt ist, durch ein Antikörper-Enzym-Konjugat spezifisch erkannt. In einer anderen Ausführungsform wird Digoxigenin an die Nucleinsäuresonde angehängt. Die Hybridisierung wird durch einen Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen, der an ein Alkalische-Phosphatase-Konjugat konjugiert ist. Die alkalische Phosphatase modifiziert ein chemilumineszierendes Substrat, das sodann nachgewiesen werden kann. Verfahren zum Markieren von Nucleinsäuresonden gemäss dieser Ausführungsform finden sich in Martin et al., BioTechniques 9 (1990), 762-768. In einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand durch ein zweites Ligand-Enzym-Konjugat erkannt, das in der Lage ist, spezifisch mit dem ersten Liganden zu komplexieren. Eine bekannte Ausführungsform dieses Beispiels ist die Wechselwirkung vom Biotin-Avidin-Typ. Verfahren zur Markierung von Nucleinsäuresonden und ihre Verwendung in Tests, die auf Biotin-Avidin beruhen, finden sich in Nguyen et al., BioTechniques 13 (1992), 116-123. Ausserdem liegt es im Umfang der vorliegenden Erfindung, dass in den erfindungsgemässen Nucleinsäuresonden-Tests eine Kombination von Nucleinsäuresonden eingesetzt wird, die in der Lage sind, ALMS1-Mutationen nachzuweisen. Somit wird in einem Beispiel zum Nachweis des Vorliegens von Mutationen in einer Zellprobe mehr als eine zu dem Gen komplementäre Sonde eingesetzt, und insbesondere kann es sich bei den verschiedenen Sonden entweder um zwei, drei oder fünf unterschiedliche Nucleinsäure-Sondensequenzen handeln. In einem weiteren Beispiel zum Nachweis des Vorliegens von Polymorphismus in der ALMS1-Sequenz in einem Patienten werden mehr als eine zum Gen komplementäre Sonde eingesetzt.

Anhand beliebiger Sequenzunterschiede, die durch eine der vorstehend beschriebenen Techniken aufgedeckt werden, lässt sich ein Individuum identifizieren, das eine molekulare Variante von ALMS1 aufweist, die möglicherweise mit dem Alström-Syndrom assoziiert ist. Diese Varianten können in verschiedenen Formen vorliegen und sie können sowohl in codierenden als auch in nicht-codierenden Regionen auftreten. Bestimmte Mutationen, die mit einem exprimierten Gen assoziiert sind, könnten ein abnormes Protein erzeugen oder sie könnten die Proteinexpression signifikant verändern. Weitere disruptive Mutationen könnten kleine Deletionen innerhalb des Rasters und nicht-konservative Basenpaarsubstitutionen umfassen, die eine signifikante Wirkung auf das erzeugte Protein haben könnten, wie Veränderungen zu oder von einem Cysteinrest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt oder andere Polymorphismen, die die Sekundär- oder die Tertiärstruktur des Proteins beeinflussen würden. Bei stummen Polymorphismen oder solchen, die zu konservativen Aminosäure-Mutationen führen, kann man im Allgemeinen davon ausgehen, dass sie die Funktion des Proteins nicht zerstören.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms bei einem Patienten bereitgestellt, wobei in dem Verfahren das Vorliegen oder die Abwesenheit des durch ALMS1 codierten Proteins in einer Gewebeprobe des Patienten bestimmt wird. Das Vorliegen eines ALMS1-Polypeptids kann durch verschiedene Verfahren untersucht werden, einschliesslich "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA), Western-Blot, Immunfällungen und Immunfluoreszenz. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens besteht der Schritt, in dem das Vorliegen oder die Abwesenheit des durch ALMS1 codierten Proteins bestimmt wird, darin, dass ein Antikörper, der für das durch ALMS1 codierte Protein spezifisch ist, zu den Proteinen aus der Gewebeprobe zugegeben wird, und die Menge des Antikörpers bestimmt wird, der an die Proteine aus der Gewebeprobe gebunden ist.

Kits (z.B. Reagens-Kits), die für die Diagnoseverfahren eingesetzt werden können, umfassen Komponenten, die in beliebigen hier beschriebenen Verfahren verwendet werden können, einschliesslich z.B. Hybridisierungssonden oder Primer, Reagenzien zum Nachweis von markierten Molekülen, Restriktionsenzyme, Allel-spezifische Oligonucleotide, Antikörper, die an ein mutiertes oder an ein natives ALMS1-Polypeptid binden, Mittel zur Amplifikation von Nucleinsäuren, die ALMS1 enthalten, oder Mittel zur Analyse der Nucleinsäuresequenz von ALMS1 oder zur Analyse der Aminosäuresequenz des ALMS1-Polypeptids usw.

Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Reagens bereit, mit dem eine Probe auf das Vorliegen einer ALMS1-Nucleinsäure getestet werden kann, wobei das Reagens eine Nucleinsäure umfasst, die eine zusammenhängende Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens teilweise komplementär ist zu einem Teil der Nucleinsäuresequenz des ALMS1.

Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Reagens-Kit bereit, mit dem eine Probe auf das Vorliegen einer ALMS1-Nucleinsäure-Mutation getestet werden kann, wobei das Kit in getrennten Behältern Folgendes enthält: a) eine oder mehrere markierte Nucleinsäuren, umfassend eine zusammenhängende Nucleotidsequenz, die mindestens teilweise komplementär ist zu einem Teil der Nucleotidsequenz von ALMS1, und b) Reagenzien zum Nachweis der Markierung.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die ALMS1-Mutation aus einer Gruppe ausgewählt, die aus den folgenden Mutationen, Deletionen und Insertionen besteht: wobei 19 Nucleotide hinter dem 3737. Nucleotid von ALMS1 eingefügt sind; wobei das 1582. Nucleotid von ALMS1 T ist; wobei das 3808. Nucleotid von ALMS1 T ist, das 3809. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist und das 3813. Nucleotid von ALMS1 A ist; wobei das 3974. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist; wobei das 4648. Nucleotid von ALMS1 T ist; und wobei ein A hinter dem 1594. Nucleoitd von ALMS1 eingefügt ist.

Ausserdem wird in einer weiteren Ausführungsform ein Reagens-Kit bereitgestellt, mit dem eine Probe auf das Vorliegen eines ALMS1-Proteins getestet werden kann, wobei das Kit einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das selektiv an das ALMS1-Protein oder eine ALMS1-Proteinvariante bindet, sowie Mittel zum Nachweis des gebundenen Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments davon umfasst.

Die Entdeckung von ALMS1 und seiner Verbindung zum Alström-Syndrom macht eine verbesserte Diagnose des Alström-Syndroms möglich. Patienten können unter Nutzung dieser Informationen anhand verschiedener neuer Verfahren auf das Alström-Syndrom getestet werden. Genetisches Material (insbesondere genomische DNA oder mRNA) kann aus den Patienten isoliert und durch bekannte Verfahren sequenziert werden, so dass das Vorliegen von Mutationen in der codierenden Sequenz des ALMS1-Gens bestimmt werden kann, wodurch das Alström-Syndrom angezeigt wird. Ausserdem könnte die DNA-Sequenz von ALMS1, ihr komplementärer Strang oder Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz von ALMS1 oder ihrem komplementären Strang unter stringenten Bedingungen hybridisieren, in einer Northern-Blot-Analyse eingesetzt werden, um die Transkriptionsspiegel der Gene zu testen. Das Alström-Syndrom könnte anhand von Werten diagnostiziert werden, die unter den normalen Transkriptionsspiegeln des Gens liegen, da ein Fehlen der Transkription anzeigen würde, dass in den Geweben nicht genügend funktionales ALMS1-Genprodukt vorliegt. Schliesslich könnte das durch ALMS1 codierte Protein exprimiert und isoliert werden, und ein Antikörper, der für dieses Protein spezifisch ist, könnte durch herkömmliche Verfahren der Biotechnologie hergestellt werden. Anschliessend kann der Antikörper dann eingesetzt werden, um das Vorliegen oder die Abwesenheit des ALMS1-Proteins in Gewebeproben aus Patienten nachzuweisen. Nicht genügend ALMS1-Protein würde auf das Alström-Syndrom hinweisen. Sämtliche vorstehenden Verfahren können durch den Fachmann durchgeführt werden, sobald er die Sequenz von ALMS1 und die Verbindung zwischen ALMS1 und dem Alström-Syndrom kennt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele weiter beschrieben.

Beispiele

Familien:

DNA von Alström-Familienmitgliedern und Kontrollpersonen wurde aus dem peripheren Vollblut unter Verwendung eines Standardprotokolls isoliert (Kunkel, L. M., et al., Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 1245-1249). Die Aufnahmekriterien basierten auf der Beurteilung der wichtigsten Merkmale von ALMS und ausserdem auf der klinischen Diagnose. Von allen Personen lag eine schriftliche Einverständniserklärung vor. Alle Protokolle wurden vorher durch das "Internal Review Board" am Jackson Laboratory bewilligt.

Gendiagnose:

Oligonucleotid-Primer zur Amplifikation von kurzen Tandem-Sequenzwiederholungs-Polymorphismen (STRPs) wurden entweder von Research Genetics bezogen oder entworfen (MacVector 6.0) (Rastogi, P. A., MacVector; Integrated sequence analysis for the Macintosh; Methods Mol. Biol. 132 (2000), 47-69) und nach Kundenwunsch hergestellt (One Trick Pony). Die PCR-Amplifikation von STRPs erfolgte mit <33>P-markierten Oligonucleotiden wie früher beschrieben (Collin, G. B., et al., Physical and genetic mapping of novel microsatellite polymorphisms on human chromosome 19; Genomics 37 (1996), 125-130). Die PCR-Produkte wurden auf einem 6% denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Mutationsanalyse:

16 Exons von Alms1 wurden durch Standard-PCR-Protokolle PCR-amplifiziert (vgl. Tabelle 2 und SEQ ID NO: 3 bis 34). Die amplifizierten Produkte wurden auf einem 1 bis 1,2% Gel aufgetrennt, ausgeschnitten und unter Verwendung von Nucleospin-Säulen (CLONTECH) gereinigt und sequenziert (ABI Prism 3700). Die Ergebnisse der Sequenzierung wurden mit einer nichtbetroffenen Kontrolle, BAC-Sequenz (AC069346 und AC074008) und cDNA (KIAA0328) verglichen.

Sequenz der Maus-cDNA:

Die Gesamt-RNA wurde aus dem ganzen Gehirn von männlichen C57BL/6J-Mäusen hergestellt. Die Gewebe wurden homogenisiert und die RNA durch Behandlung mit TRIzol (Life Technologies) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die cDNA wurde unter Verwendung des Superscript One-Step RT-PCR-Kits (Life Technologies) hergestellt. Primer für die PCR-Amplifikation von Alms1 wurden aus Sequenzen von ausgerichteten ESTs aus der Celera-Datenbank entworfen. Die PCR-Amplifikation von cDNA erfolgte unter Verwendung des Expand-Template-Systems (Roche).

Analyse der Expression:

Northern bei der Maus:

Die Sonde für die Northern-Analyse wurde hergestellt, indem cDNA der Maus-C57BL/6J-Retina mit Exon-1-spezifischen Primern (Vorwärts: 5 -TTCAGACTCTCTTGATGGAAGC-3 , und Rückwärts 5 -TTGTTGTCCCATGAGCAGC-3 ) unter Verwendung des Expand-Template-Systems (Roche) PCR-amplifiziert wurde. Das 394 bp grosse Produkt wurde gereinigt und radiomarkiert (Markierungssystem Rediprime II, Amersham Pharmacia). Mehrgewebe-Blots der Maus (Nishina, P. M., North, M. A., Ikeda, A., Yan, Y., und Naggert, J. K., Molecular characterization of a novel tubby gen family member, TULP3, in mouse and humans; Genomics 54 (1998), 215-220) wurden eine Stunde mit Rapid Hyb-Puffer (Amersham Pharmacia) vorhybridisiert und die Hybridisierung über Nacht durchgeführt. Die Membranen wurden gewaschen und die hybridisierten Produkte durch Autoradiographie nach einer Exposition von acht Tagen sichtbar gemacht. Die Blots wurden mit beta -Aktin als Kontrolle als Sonde getestet (Nishina, P. M., North, M. A., Ikeda, A., Yan, Y., und Naggert, J. K., Molecular characterization of a novel tubby gen family member, TULP3, in mouse and humans; Genomics 54 (1998), 215-220).

Northern beim Menschen:

Ein Mehrgewebe-Blot des Menschen (FirstChoise Blot 1, Ambion) wurde mit einer 490 bp grossen Sonde hybridisiert, die durch PCR-Amplifikation von genomischer DNA hergestellt wurde (Primer: Vorwärts, 5 -TATGGCACTGAAACGATGC-3 und Rückwärts 5 -TTTATTCCCAATGGTTCCACT-3 ). Die Hybridisierung wurde wie vorstehend durchgeführt.

RT-PCR:

Eine Mehrgewebe-cDNA-Platte I des Menschen (CLONTECH) wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers 5 -TGTACTGGAGCATCTGTGGG-3 und des Rückwärts-Primers 5 -CAGTGATTTGGGGCTGACTG-3 35 Zyklen bei einer Anelierungstemperatur von 56 deg. C PCR-amplifiziert.

GenBank-Hinterlegungsnummern:

Sequenzdaten für das menschliche Transkript KIAA0328, AB002326, Maus C57BL6/J-cDNA, AF425257 und menschliche BACs, AC069346 und AC074008.

Indem auf die Kartierung des Alström-Syndroms nach dem bisherigen Stand der Technik auf eine 6,1-cM-Region von Chromosom 2p13 aufgebaut wurde, konnte durch eine weitere rekombinatorische und physikalische Kartierung der kritische Bereich auf < 2 cM aufgelöst werden, der eine Region von 1,2 Mb umfasst (Fig. 1). Der physikalische zusammenhängende Bereich wurde aus den für die Öffentlichkeit zugänglichen Sequenzdaten (GenBank) zusammengestellt, indem überlappende BAC-Clone ausgerichtet wurden und Fragmente durch den Transkriptionseinheit-Inhalt angefügt wurden. Die Genkandidaten für die Mutationsanalyse wurden identifiziert, indem die zusammenhängende Sequenz mit den Sequenzen identifizierter Gene und exprimierter Sequenz tag (EST)-Cluster verglichen wurde, wobei die NIX-Annotation-Pipeline verwendet wurde (Williams, G. W., Woolard, P. M., und Hingamp, P.; Nix: A Nucleotid identification system at the "HGMP-RC" URL http://www.hgmp.mrc.ac.uk/NIX/ (1998)) und einzelne Datenbanken durchsucht wurden (Incyte Genomics and GenBank). 16 Gene und EST-Cluster wurden innerhalb des minimalen Bereichs identifiziert. Die Gene-Kandidaten wurden anfangs aufgrund ihres Expressionsmusters und ihrer Funktion nach Priorität geordnet. Anschliessend wurde ein systematisches Screening aller Gene in der Region durchgeführt.

Ein EST-Cluster, das die neue cDNA-Sequenz KIAA0328 (AB002326) enthielt, bestand aus cDNA-Fragmenten, die in vielen betroffenen Geweben bei Alström-Patienten exprimiert sind, und wurde deshalb einer Mutationsanalyse unterworfen. Um die codierende Sequenz der vollen Länge der entsprechenden cDNA zu erhalten, wurden Alignments zwischen KIAA0328 und überlappenden Transkripten durchgeführt (Incyte Genomics, NCBI und TIGR). Eine gesamte menschliche cDNA-Sequenz von 6 612 bp wurde mit einem offenen Leseraster hergeleitet, das 1902 Aminosäuren überspannt (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2). Eine Translations-Initiationsstelle wurde am Nucleotid 597 identifiziert und zwei mutmassliche Polyadenylierungsstellen (AATAAA) wurden an den Positionen 6389 bzw. 6591 festgestellt. Durch das Alignment der cDNA-Sequenz mit der genomischen Sequenz wurden 16 Exons mit unterschiedlichen Längen (45 bis 1865 bp) identifiziert.

Die Exon-Intron-Struktur des KIAA0328-Gens, nun als ALMS1 bezeichnet, ist in Fig. 2a dargestellt. Zwei überlappende menschliche BAC-Clone, ctd2005P16 und RPCI-582H21 (AC069346 und AC074008), umfassen die gesamte genomische Sequenz von etwa 160 kb (codierende Exons). Verschiedene Spleissvarianten von ALMS1 wurden aus öffentlichen und Incyte Genomics cDNA-Bank-Datenbanken identifiziert (Fig. 2b). Die relative Verteilung der Varianten wurde aus der Zahl von GenBank-Clonen, die die verschiedenen Sequenzen darstellen, und anhand der in der Incyte-Datenbank beschriebenen Gewebeverteilung abgeschätzt. Die am stärksten verteilte Variante ist die b-Form (TIGR, THC530050), die aus 16 Exons besteht. Die carboxyterminalen Exons, 14 bis 16, sind im ursprünglich identifizierten alpha -Transkript (GenBank, AB002326) nicht vertreten, das eine andere Polyadenylierungsstelle im Intron 14 nutzt. Das vorausgesagte offene Leseraster der alpha -Form endet unmittelbar hinter Exon 14. Die Sequenzanalyse lässt voraussagen, dass das beta -Proteinprodukt (1902 As) sich vom alpha -Proteinprodukt (1855 As) nur durch eine Verlängerung von 47 Aminosäuren am C-Terminus unterscheidet. Ausserdem wurden mittels Durchsuchen von Datenbanken andere seltene Variantensequenzen identifiziert, einschliesslich einer delta -Form (GenBank, W11846; Incyte, 1453614.1), die ein verkürztes 3. Exon aufweist, und zwar vermutlich aufgrund der Verwendung einer inneren Spleiss-Donor-Stelle im Exon 3, einer epsilon-Variantensequenz (Incyte, 1453614.3), die ein 5 -verIängertes Exon 13 und ein 3 -verlängertes Exon 14 aufweist, und einer -Variante (GenBank, AW082244), die das Ergebnis der Prozessierung eines Introns in der 3 -nicht-codierenden Region ist und die ein Polyadenylierungssignal 867 bp stromabwärts von demjenigen der beta -Variante nutzt (nicht gezeigt). Diese Varianten werden in verschiedenen Geweben exprimiert, einschliesslich Gehirn, Nebenniere, Lunge und Hoden.

In einem Intron liegende Primer wurden entworfen, um die gesamte codierende Region in der DNA aus sechs nicht verwandten, vom Alström-Syndrom betroffenen Individuen zu amplifizieren und zu sequenzieren. In einer grossen blutsverwandten akadischen Sippe (Marshall, J. D., et al., Am. J. Med. Genet. 73 (1997), 150-161), (K1), wurde eine 19-bp-lnsertion im Exon 9 identifiziert (Fig. 3a), die eine Verschiebung des Leserasters auslöst, welche eine frühe Termination am Codon 1263 zur Folge hat. Die Insertion lag bei allen fünf betroffenen Personen in der Verwandtschaft in einem homozygoten Zustand vor. Die Übertragung des Insertionsallels bei nicht-betroffenen Trägern stimmte mit früher beschriebenen Haplotypen überein (Collin, G. B., Marshall, J. D., Cardon, L. R., und Nishina, P. M., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 213-219). Das Insertionsallel wurde in 100 nicht verwandten Individuen aus der allgemeinen Population nicht festgestellt. Fünf weitere Mutationen wurden in fünf nicht verwandten Familien mit unterschiedlicher ethnischer Herkunft identifiziert (Fig. 3b bis e, Tabelle 3). Alle Mutationen segregierten mit ALMS1. In einer blutsverwandten italienischen Familie (K57) wurde eine homozygote Mutation identifiziert, 1582 C>T, wodurch ein TAA-Terminationssignal erzeugt wurde, während in einer blutsverwandten französischen Familie (K22) bei drei betroffenen Nachkommen eine Leserastermutation 3808 GA>T; 3813 G>A festgestellt wurde, die ein frühes Terminationssignal am Codon 1279 zur Folge hat. In einer blutsverwandten portugiesischen Familie (K59) wurde bei zwei entfernten Cousins/Cousinen eine TAA-Nonsense-Mutation, 4648 C>T, identifiziert. Bei einem Cousin liegt die Mutation in einem homozygoten Zustand vor, während beim anderen nur eine Einzelkopie der Mutation vorhanden ist. Eine zweite Mutation, 1594 ins A, die zwei Aminosäuren stromabwärts am Codon 535 ein Stoppsignal erzeugt, wurde im letzeren Individuum identifiziert, woraus ein zusammengesetzter heterozygoter Zustand resultierte.

Eine Mutation, 3974 del C, wurde bei zwei nicht verwandten jungen Erwachsenen festgestellt; bei einem 19 Jahre alten Mann einer britischen Ahnenreihe (K42, Person A5) und bei einem 21 Jahre alten Mann, dessen Vorfahren vor zwei Jahrhunderten aus Britannien gekommen waren (K3, Person A6). Bei beiden trat schon in den ersten zwei Lebensmonaten eine infantile Kardiomyopathie auf, später entwickelten sich Kleinwuchs, Skoliose, Typ-Il-Diabetes mellitus und Niereninsuffizienz. Diese beiden Patienten unterschieden sich jedoch im Verlauf ihrer Krankheit. Beim Patienten K42 A5 trat im Alter von 18 Jahren plötzlich wieder eine dilatierte Kardiomyopathie auf, wobei er keine Leberfunktionsstörung zeigte. Beim Patienten K3 A6 dagegen kam es im Alter von 20 zu einem schweren Leberversagen, bei ihm trat jedoch keine Kardiomyopathie mehr auf. Aufgrund dieser unterschiedlichen Krankheitsprogression bei Individuen, die die gleiche Mutation tragen, kann man davon ausgehen, dass die bei vielen Alström-Patienten festgestellte phänotypische Vielfältigkeit möglicherweise durch genetische oder umweltbedingte Modifikatoren zustande kommt, die mit dem ALMS1-Locus interagieren.

Die Analyse der Expression erfolgte an Maus- und Mensch-RNA. Beim Testen eines menschlichen Mehrgewebe-Blots (Ambion) mit ALMS1-cDNA-Fragmenten als Sonden konnte nach sieben Tagen Exposition keine Expression von ALMS1 nachgewiesen werden, dies legt eine geringe Verteilung des Transkripts nahe. Jedoch zeigte die RT-PCR einer menschlichen cDNA-Platte I (CLONTECH), dass ALMS1 ubiquitär exprimiert wird (Fig. 4a). Northern-Analysen von Poly A<+>-RNA der Maus (5 Microg) bestätigten die ubiquitäre, jedoch geringe Expression in Lunge, Herz, Niere, Dickdarm, Milz, Auge und Ovar (Fig. 4b). In Übereinstimmung mit der Verteilung von ALMS1 in den Hoden-cDNA-Banken, wie aus den öffentlichen und Incyte Genomics-Datenbanken ersichtlich, wurde in Maushoden eine hohe Expressionsrate festgestellt. Weitere Gewebe, die nicht durch RT-PCR oder Northern-Analyse getestet wurden und die in menschlichen cDNA-Banken aus der Incyte Genomics-Datenbank eine Expression zeigten, umfassten Nebenniere, Schilddrüse, Hypophyse und Brustdrüsen, Thymus, Uterus, Harntrakt, Colon und Bindegewebe.

Während in der NCBI-Datenbank keine signifikante Homologie zu anderen menschlichen Genen nachgewiesen wurde, konnte die Alms1-cDNA-Sequenz der Maus (5,6 kb) aus Alignments mehrerer EST-Sequenzen zusammengebaut werden (GenBank & TIGR), und ausserdem durch Ausrichten der menschlichen cDNA-Sequenz mit genomischen Spurendaten der Maus (GenBank) und genomischen Fragmenten der Maus (Celera). Die cDNA-Sequenz der Maus wurde durch Sequenzieren der PCR-amplifizierten Alms1-cDNA der Maus in C57BL6/J-Mäusen bestätigt (GenBank AF425257). Die hergeleitete Aminosäuresequenz ist zu 67,3% mit der menschlichen ALMS1-Proteinsequenz identisch.

In einem Versuch, die Funktion von ALMS1 herzuleiten, wurden die Prosite- und Pfam-Datenbanken auf Motiv und Homologie durchsucht. Keine Signalsequenzen oder Transmembranregionen wurden nachgewiesen, dies legt zusammen mit einer insgesamt hydrophilen Natur des Proteins eine intrazelluläre Lage nahe. Ein Leucin-Zippermotiv (PS00029, As 213 bis 234) und eine Serin-reiche Region (As 1590 bis 1606) wurden in dem vorausgesagten menschlichen Protein gefunden (SEQ ID NO: 2). Ausserdem wurden in der Sequenz der Maus mögliche Kernlokalisations-Signale (PS50079, As 1538 bis 1563 und 1670 bis 1687) und ausserdem eine Histidin-reiche Region (As 1219 bis 1256) identifiziert. Alle diese Merkmale sind zwischen Mensch- und Maus-ALMS1 konserviert; da jedoch diese Motive in verschiedenen Proteinen häufig vorkommen, muss die funktionale Signifikanz dieser Übereinstimmungen experimentell getestet werden. Zusätzlich zu den vorstehenden Domänen wurde am C-Terminus von ALMS1 eine aus 120 Aminosäuren bestehende Region identifiziert, die eine Sequenzähnlichkeit zu Regionen von zwei vorausgesagten Proteinen aus dem Makak (AB055273) und der Maus (AK016590) zeigte. Aufgrund des relativ kleinen Homologiebereichs ist es unwahrscheinlich, dass diese Sequenzen weitere Mitglieder der Genfamilie darstellen. Es ist eher wahrscheinlich, dass dieses gut konservierte ALMS-Motiv eine Proteindomäne definiert, die möglicherweise eine strukturelle oder funktionale Signifikanz hat (Fig. 5).

Fettsucht und Typ-Il-Diabetes, die immer grössere Probleme für die Gesundheit der Bevölkerung darstellen, gehen mit einem erhöhten Risiko der Morbidität und Mortalität einher und betreffen einen hohen Prozentsatz der Bevölkerung (Kopelman, P. G., Obesity as a medical problem; Nature 404 (2000), 635-643). Beide Krankheiten werden durch Umweltbedingungen, jedoch auch durch eine starke genetische Komponente beeinflusst (Froguel, P., und Velho, G., Genetic determinants of type 2 diabetes; Recent Prog. Horm. Res. 56 (2001), 91-105; Naggert, J., Harris, T., und North, M., The genetics of obesity; Curr. Opin. Genet. Dev. 7 (1997), 398-404). Interessanterweise standen die meisten Gene, die bisher als Auslöser von Fettsucht und Typ-Il-Diabetes identifiziert wurden, im Zusammenhang mit Syndromkrankheiten, wie dem Bardet-Biedl-Syndrom (Slavotinek, A. M., et al., Mutations in MKKS cause Bardet-Biedl syndrome; Nat. Genet. 26 (2000), 15-16; Mykytyn, K., et al., Nat. Genet. 28 (2001), 188-191; Nishimura, D. Y., et al., Hum. Mol. Genet. 10 (2001), 865-874). Die Fettsucht im Kindesalter, die bei Alström-Patienten festzustellen ist, ist mit grösster Wahrscheinlichkeit eine primäre Folge der Veränderung des Alström-Gens, da es sich hierbei um einen früheren Phänotyp handelt (schon im frühen Alter von sechs Monaten), der bei allen betroffenen Kindern festzustellen ist. Die Probleme der Insulinresistenz und der chronischen Hyperglykämie, die mit sekundären Komplikationen wie Hyperlipidämie und Atherosklerose einhergehen, wie beim Alström-Syndrom festgestellt werden kann, sind Zustände, die bei herkömmlichen Formen des im Erwachsenenalter auftretenden Typ-Il-Diabetes zu beobachten sind, mit dem Unterschied, dass sie bei Alström-Patienten schneller auftreten. Dies legt nahe, dass ALMS1 möglicherweise im gleichen oder in einem parallelen Weg wie der mit Fettsucht-assoziierte NIDDM liegt. Indem die Funktion des ALMS1-Gens bestimmt wird, können möglicherweise Einblicke gewonnen werden, wie dieses Gen mit anderen Genen interagiert, dass seine pathologischen Effekte zustande kommen. Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass Mutationen innerhalb des ALMS1 bei herkömmlichen Krankheiten in der allgemeinen Bevölkerung eine wichtige Rolle spielen, liegt der tatsächliche Wert, den Untersuchungen dieses Gens bringen können, darin, dass neue metabolische und regulatorische Wege aufgedeckt werden, die an der Entstehung von Fettsucht, Typ-Il-Diabetes, neurosensorischen Krankheiten und verwandten Störungen beteiligt sind. In der Literatur gibt es viele Beispiele, welche Folgen eine solche Identifizierung einzelner Genmutationen haben kann, wobei die Stromaufwärts- und Stromabwärts-Moleküle in einem biologischen Stoffwechselweg identifiziert werden konnten (d.h. der Leptin- und der Jak/Stat-Kinase-Stoffwechselweg bei der Fettsucht (Inui, A., Feeding and bogy-weight regulation by hypothalamic neuropeptides - mediation of the actions of leptin; Trends Neurosci. 22 (1999), 62-67)).

Tabelle 1: ALMS1-Spleissübergänge

Exon<sep>Exongrösse (bp)<sep>5 -Spleiss-Donor<sep>3 -Spleiss-Akzeptor<sep>Introngrösse (kb) 1<sep>742<sep>ACGAGCACATGgtaagaaga....agaggtcGGACCTTATA<sep>1.096 2<sep>134<sep>TTGTCCAAGgtataaaaga....atcttctagGGTTTACAGAG<sep>34.342 3<sep>1865<sep>TGCAGATCGgtgagtctcat....ttggtcagATTACCAGAGA<sep>>24.5 4<sep>242<sep>CACAGATGgtaagagaat....cctccttagGCCAGCCTTT<sep>>21.6 5<sep>126<sep>CCATTCAGgtattatg....ttttctgtagGATCCAATGA<sep>15.323 6<sep>171<sep>AAATGCAGgtaactggat...gttattccagATGCCTCAGTTC<sep>6.786 7<sep>135<sep>ATACTGCAGgtagctaaact....cctttcgtagATTCCAGTGC<sep>1.618 8<sep>171<sep>ATATTGAAGgtaatgggat....ctccttttcagAGTCCGAATGTC<sep>13.130 9<sep>1163<sep>ACACATCCAGgtacatggcta....tatttttctagGTAGCAAACCAT<sep>>25.6 10<sep>121<sep>TACAAGCAGgtaattacttg....ccttcccctcagGTAACTTGGAGAT<sep>1.158 11<sep>204<sep>CCCATGAAGgtcagtttctcat....tttcctgtagGAGTTTCCTGGT<sep>0.315 12<sep>242<sep>ACCCTTCAGgtgcagtgacgt....ttttcttttagGAATCGCTTCAGT<sep>0.750 13<sep>184<sep>CCAAGAGAGgtacgccctgccc....tcttgcctagTCTTCCTGGCTAT<sep>0.874 14<sep>64<sep>GGTCCAAACGgtaagaccaaga....gagatctcatGACTCTGCACCC<sep>>6.144 15<sep>100<sep>TATAAAAAGgtcagtgggtc....cttctacagAGAGTGACCAAT <sep>0.998 16<sep>45<sep>CCCTGGGACTGA...3 ŰTR<sep>

Tabelle 2: Primerpaare für die Analyse einer Mutation von ALMS1

SEQ ID NO.<sep>Primerpaar<sep>Grösse (bp)<sep>Exon 3<sep>5 -TGCAGGTTTTAGAGATGTTGG-3 <sep>929<sep>1 4<sep>5 -TGCTTGTATTTTTCATTGGCT-3 <sep><sep>1 5<sep>5 -CATACTAAGCATTGCAGTGGG-3 <sep>312<sep>2 6<sep>5 -GAATGGGTGATGGAATTAGGA-3 <sep><sep>2 7<sep>5 -TGTCTAATCTTAGCGTGGGT-3 <sep>2081<sep>3 8<sep>5 -CCGTGTGATTTCTCTGAGTGG-3 <sep><sep>3 9<sep>5 -TTGACATTGATGTGTCCACAAT-3 <sep>533<sep>4 10<sep>5 -ATTTGCATAGCTGTCAACAGAA-3 <sep><sep>4 11<sep>5 -GCCTGAAACATAGAAGGCATT-3 <sep>301<sep>5 12<sep>5 -GGAGTGACAAAAGTCCAGTGC-3 <sep><sep>5 13<sep>5 -CTCAATCTCATGTCGCTATTTG-3 <sep>355<sep>6 14<sep>5 -TGCTCAATATAACAGCAAGGAG-3 <sep><sep>6 15<sep>5 -GGGTTTTGTTTGTAATTGTGG-3 <sep>343<sep>7 16<sep>5 -GAGAGCTGAAGACAGCAAGAAG-3 <sep><sep>7 17<sep>5 -CGCTACCTCTTTTTCTGACTG-3 <sep>457<sep>8 18<sep>5 -TGGAAACACTAACACTGACCCT-3 <sep><sep>8 19<sep>5 -GAGGCTACTAAGCAACAAGGC-3 <sep>1376<sep>9 20<sep>5 -GCAGTCACATTGCCAGATG-3 <sep><sep>9 21<sep>5 -TGGCTTGCTTATCCTGTGG-3 <sep>330<sep>10 22<sep>5 -TCTGACAAGATGAAAATTGGC-3 <sep><sep>10 23<sep>5 -TCCCAGAGACACCTATGATCC-3 <sep>101<sep>11 24<sep>5 -CTTGGAGTTGGGAAAGTTATC-3 <sep><sep>11 25<sep>5 -GCCAAAAAACACACTCGAGATGTTG-3 <sep>818<sep>11 26<sep>5 -CCAAGTCACAGAGCCAGCTT-3<sep><sep>11 27<sep>5 -GCATATCCTGGATAAGAGCTG-3 <sep>484<sep>12 28<sep>5 -GAGAAACCCAACCCTCGTG-3 <sep><sep>12 29<sep>5 -TCAGACTTCCCCAAACCTCT-3 <sep>1379<sep>13, 14 30<sep>5 -TCAGTGCCATAAGTGAGAAATG-3 <sep><sep>13, 14 31<sep>5 -GACTCTGCACCCTGGTAACC-3 <sep>205<sep>15 32<sep>5 -CGCCAATAAACCTGATCCAT-3 <sep><sep>15 33<sep>5 -GCCTCTGATGGCAGTAATATCT-3 <sep>435<sep>16 34<sep>5 -TCTCCAGATGGGAAAGAATTG-3 <sep><sep>16

Tabelle 3: Zusammenfassung von Mutationen, die in sechs Alström-Syndrom-Verwandtschaften gefunden wurden

<sep>Verwandtschaft<sep>Mutationen/ Betroffene Individuen<sep>Zahl der Kontrollchromosomen 3737ins(n)19<sep>1<sep>10/5<sep>200 1582C>T<sep>57<sep>2/1<sep> 3808GA>Tdel; 3813G>A<sep>22<sep>6/3<sep> 3974delC<sep>42<sep>2/1<sep> 3974delC<sep>3<sep>2/1<sep> 4648C>T<sep>59<sep>3/2<sep> 1594insA<sep>59<sep>1/2<sep>In Proben aus der allgemeinen Kontrollpopulation wurden keine Mutationen festgestellt.

Während diese Erfindung insbesondere mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen davon gezeigt und beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass darin verschiedene Änderungen in Form und Einzelheiten durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen, wie in den beiliegenden Patentansprüchen definiert ist.

Sequenzprotokoll

<110> : F. Hoffmann-La Roche <120> : Alström-Syndrom-Gen <130> : Case 21023 <140> : US60/345883 <141> : 2001-11-09 <160> : 34 <170> : PatentIn Version 3.1 <210> : 1 <211> : 6612 <212> : DNA <213> : Homo sapiens <220> : <221> : CDS <222> : (597) .. (6302) <223> :

<210><sep>2<sep> <211><sep>1902<sep> <212><sep>PRT<sep> <213><sep>Homo sapiens<sep><400> 2

<210><sep>3<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>3<sep> tgcaggtttt agagatgttg g<sep>21 <sep><sep> <210><sep>4<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>4<sep> tgcttgtatt tttcattggc t<sep>21 <sep><sep> <210><sep>5<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>5<sep> catactaagc attgcagtgg g<sep>21 <sep><sep> <210><sep>6<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich <sep> <sep><sep> <400> <sep>6<sep> gaatgggtga tggaattagg a<sep>21 <sep><sep> <210><sep>7<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>7<sep> tggtctaatc ttagcgtggg t<sep>21 <sep><sep> <210><sep>8<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400> <sep>8<sep> ccgtgtgatt tctctgagtg g<sep>21 <sep><sep> <210><sep>9<sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>9<sep> ttgacattga tgtgtccaca at <sep>22 <210><sep>10 <sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>10<sep> atttgcatag ctgtcaacag aa<sep>22 <sep><sep> <210><sep>11<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>11<sep> gcctgaaaca tagaaggcat t<sep>21 <sep><sep> <210><sep>12<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>12<sep> ggagtgacaa aagtccagtg c<sep>21 <sep><sep> <210><sep>13<sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>13<sep> ctcaatctca tgtcgctatt tg<sep>22 <sep><sep> <210><sep>14<sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>14<sep> tgctcaatat aacagcaagg ag<sep>22 <sep><sep> <210><sep>15<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA <sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>15<sep> gggttttgtt tgtaattgtg g<sep>21 <sep><sep> <210><sep>16<sep>

<211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>16<sep> gagagctgaa gacagcaaga ag<sep>22 <sep><sep> <210><sep>17<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>17<sep> cgctacctct ttttctgact g <sep>21 <sep><sep> <210><sep>18<sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich <sep> <sep><sep> <400><sep>18<sep> tggaaacact aacactgacc ct <sep>22 <sep><sep> <210><sep>19<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>19<sep> gaggctacta agcaacaagg c<sep>21 <sep><sep> <210><sep>20<sep> <211><sep>19<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich <sep> <400><sep>20<sep> gcagtcacat tgccagatg<sep>19 <sep><sep> <210><sep>21<sep> <211><sep>19<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>21<sep> tggcttgctt atcctgtgg<sep>19 <sep><sep> <210><sep>22<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich <sep> <sep><sep> <400><sep>22<sep> tctgacaaga tgaaaattgg c<sep>21 <sep><sep> <210><sep>23<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>23<sep> tcccagagac acctatgatc c<sep>21 <sep><sep> <210><sep>24<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>24<sep> cttggagttg ggaaagttat c<sep>21 <sep><sep> <210><sep>25<sep> <211><sep>25<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>25 <sep> gccaaaaaac acactcgaga tgttg<sep>25 <sep><sep> <210><sep>26 <sep> <211><sep>20<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>26<sep> ccaagtcaca gagccagctt<sep>20 <sep><sep> <210><sep>27<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>27<sep> gcatatcctg gataagagct g<sep>21 <sep><sep> <210><sep>28<sep> <211><sep>19<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>28 <sep> gagaaaccca accctcgtg<sep>19 <sep><sep> <210><sep>29 <sep> <211><sep>20<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich <sep> <sep><sep> <400><sep>29<sep> tcagacttcc ccaaacctct<sep>20 <sep><sep> <210><sep>30<sep> <211><sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>30<sep> tcagtgccat aagtgagaaa tg<sep>22 <sep><sep> <210><sep>31<sep> <211><sep>20<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>31<sep> gactctgcac cctggtaacc<sep>20 <sep><sep> <210><sep>32<sep> <211><sep>20<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>32<sep> cgccaataaa cctgatccat<sep>20 <sep><sep> <210><sep>33<sep> <211> <sep>22<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>33<sep> gcctctgatg gcagtaatat ct<sep>22 <sep><sep> <210><sep>34<sep> <211><sep>21<sep> <212><sep>DNA<sep> <213><sep>Künstlich<sep> <sep><sep> <400><sep>34<sep> tctccagatg ggaaagaatt g<sep>21

Claims (18)

1. ALMS1-DNA Sequenz, wobei diese Sequenz die Nucleotidsequenz von SEQ ID No: 1 ist.

2. DNA-Sequenz, wobei diese DNA Sequenz eine Nucleotidsequenz ist, die ein ALMS1-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert.

3. DNA-Sequenz, gemäss Ansprüchen 1 und 2 mit einer Mutation, die mit dem Alström-Syndrom assoziiert ist.

4. DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 3, ausgewählt aus: einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei 19 Nucleotide hinter dem 3737. Nucleotid von ALMS eingefügt sind; einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei das 1582. Nucleotid von ALMS1 T ist; einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei das 3808. Nucleotid von ALMS1 T ist, das 3809. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist und das 3813. Nucleotid von ALMS1 A ist; einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei das 3974. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist; einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei das 4648. Nucleotid von ALMS1 T ist; und einer DNA Sequenz gemäss Ansprüchen 1 bis 3, wobei ein A hinter dem 1594. Nucleotid von ALMS1 eingefügt ist.

5. Nucleinsäurekonstrukt, mit einem Vektor und einer DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus den DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 besteht.

6. Rekombinante Wirtszelle, mit dem Vektor nach Anspruch 5.

7. Transgenes nicht-menschliches Tier, mit einer DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül codiert ist, umfassend Züchtung der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen, die für die Expression des Nucleinsäuremoleküls geeignet sind.

9. Protein, das ausgewählt ist aus den Aminosäuresequenzen, die durch die DNA-Sequenzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 codiert sind.

10. Polypeptid, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.

11. Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon, der/das selektiv an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 10 bindet.

12. Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms oder zum Durchmustern nach Trägern des Alström-Syndroms, umfassend das Testen eines genetischen Materials aus einem mutmasslichen Träger auf Mutationen in ALMS1, wobei das Vorliegen der Mutationen in dem Gen das Alström-Syndrom anzeigt und wobei das Gen eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 umfasst.

13. Verfahren zur Diagnose des Alström-Syndroms bei einem Patienten, wobei das Verfahren die Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit des durch ALMS1 codierten Proteins nach einem der Ansprüche 9 und 10 in einer Gewebeprobe des Patienten umfasst.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt zur Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit des durch ALMS1 codierten Proteins durchgeführt wird, indem ein Antikörper nach Anspruch 11, der für das durch ALMS1 codierte Protein spezifisch ist, zu den Proteinen aus der Gewebeprobe zugegeben wird und die Menge des Antikörpers bestimmt wird, die an die Proteine aus der Gewebeprobe bindet.

15. Reagens zum Testen einer Probe auf das Vorliegen einer ALMS1-Nucleinsäure, wobei das Reagens eine Nucleinsäure umfasst, die eine zusammenhängende Nucleotidsequenz enthält, die mindestens teilweise komplementär ist zu einem Teil der Nucleotidsequenz des ALMS1-Gens, wobei das ALMS1-Gen eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 umfasst.

16. Reagens-Kit zum Testen einer Probe auf das Vorliegen einer ALMS1-Nucleinsäure-Mutation, umfassend in getrennten Behältern: a) eine oder mehrere markierte Nucleinsäuren, umfassend eine zusammenhängende Nucleotidsequenz, die mindestens teilweise komplementär ist zu einem Teil der Nucleotidsequenz von ALMS1, wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert und b) Reagenzien zum Nachweis der Markierung.

17. Reagens-Kit nach Anspruch 16, wobei die ALMS1-Mutation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Mutationen, Deletionen und Insertionen besteht: wobei 19 Nucleotide hinter dem 3737. Nucleotid von ALMS1 eingefügt sind; wobei das 1582. Nucleotid von ALMS1 T ist; wobei das 3808. Nucleotid von ALMS1 T ist, das 3809. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist und das 3813. Nucleotid von ALMS1 A ist; wobei das 3974. Nucleotid von ALMS1 deletiert ist; wobei das 4648. Nucleotid von ALMS1 T ist; und wobei ein A hinter dem 1594. Nucleotid von ALMS1 eingefügt ist.

18. Reagens-Kit zum Testen einer Probe auf das Vorliegen eines ALMS1-Proteins, umfassend einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das selektiv an das ALMS1-Protein oder eine ALMS1-Proteinvariante bindet, und Mittel zum Nachweis des gebundenen Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments davon, wobei das ALMS1-Protein oder eine ALMS1-Proteinvariante ein Protein nach Anspruch 9 und 10 ist.