PL185549B1 - Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne - Google Patents

Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne

Info

Publication number
PL185549B1
PL185549B1 PL96323109A PL32310996A PL185549B1 PL 185549 B1 PL185549 B1 PL 185549B1 PL 96323109 A PL96323109 A PL 96323109A PL 32310996 A PL32310996 A PL 32310996A PL 185549 B1 PL185549 B1 PL 185549B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
presenilin
sequence
protein
seq
amino acid
Prior art date
Application number
PL96323109A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323109A1 (en
Inventor
Georgehyslop Peter H St
Paul E Fraser
Johanna M Rommens
Original Assignee
Hsc Res Dev Lp
Univ Toronto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/431,048 external-priority patent/US6531586B1/en
Priority claimed from US08/496,841 external-priority patent/US6210919B1/en
Application filed by Hsc Res Dev Lp, Univ Toronto filed Critical Hsc Res Dev Lp
Publication of PL323109A1 publication Critical patent/PL323109A1/xx
Publication of PL185549B1 publication Critical patent/PL185549B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A01K67/0335—Genetically modified worms
    • A01K67/0336—Genetically modified Nematodes, e.g. Caenorhabditis elegans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
    • A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/703—Worms, e.g. Caenorhabdities elegans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne,
Odnośniki do zgłoszeń pokrewnych
Zgłoszenie to jest kontynuacją w części zgłoszenia USA Nr seryjny 08/509359, złożonego 31 lipca 1995, które jest kontynuacją w części zgłoszenia USA Nr seryjny 08/496841, złożonego 28 czerwca 1995, które jest kontynuacją w części zgłoszenia UsA Nr seryjny 08/431048, złożonego 28 kwietnia 1995, wszystkie zatytułowane „Genetic sequences and protein related to Alzheimer's disease” (Wynalazcy: Peter H. St. George-Hyslop, Johanna M. Rommens i Paul E. Fraser) i wszystkie włączone to jako odnośniki.
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny nieprawidłowości neurologicznych i fizjologicznych związanych z chorobą Alzheimera. Bardziej konkretnie, wynalazek dotyczy identyfikacji, izolacji i klonowania genów, które są związane z chorobą Alzheimera, jak również ich transkryptów, produktów genowych wraz z informacją o sekwencjach oraz pokrewnych genów. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobów wykrywania i diagnozowania nosicieli prawidłowych i zmutowanych alleli tych genów, sposobów wykrywania i diagnozowania choroby Alzheimera, sposobów identyfikowania genów i białek związanych lub oddziaływujących z genami i białkami Alzheimera, sposobów poszukiwania potencjalnych leków na chorobę Alzheimera, oraz linii komórkowych i modeli zwierzęcych przydatnych w poszukiwaniu i ocenie potencjalnie użytecznych sposobów leczenia choroby Alzheimera.
Tło wynalazku
W celu ułatwienia odniesienia się do różnych artykułów w czasopismach, lista artykułów jest przedstawiona na zakończenie tego opisu.
Choroba Alzheimera (AD) jest chorobą degeneracyjną ludzkiego centralnego układu nerwowego, charakteryzującą się postępującym zaburzeniem pamięci i osłabieniem zdolności poznawczych i intelektualnych w okresie od wieku dojrzałego do późnej starości (Katzman, 1986). Chorobie towarzyszy zespół objawów neuropatologicznych, z których najważniejszymi są obecność zewnątrzkomórkowych, amyloidowych lub starczych płytek i neurofibrylama degeneracja neuronów. Etiologia choroby jest złożona, chociaż w niektórych rodzinach występuje jako cecha dominująca dziedziczona autosomalnie. Jednakże, nawet wśród tych dziedzicznych postaci AD, przynajmniej trzy różne geny odpowiadają za dziedziczną podatność na tą chorobę (St. George-Hyslop i wsp., 1990). Alleliczny polimorfizm s4 (C112R) genu apolipoproteiny E (ApoE) został powiązany z Ad w znacznej części przypadków późnego występowania objawów choroby (Saunders i wsp., 1993; Strittmatter i wsp., 1993). Podobnie, bardzo mała część rodzinnych postaci choroby, występujących przed 65 rokiem życia, została powiązana z mutacjami w genie prekursorowego białka β-amyloidu (APP) (Chartier-Harlin i wsp., 1991; Goate i wsp., 1991; Murell i wsp., 1991; Karlinsky i wsp., 1992; Mullan i wsp., 1992). Trzeci locus (AD3) powiązany z dużą częścią przypadków wczesnej postaci AD został ostatnio zmapowany na chromosomie 14q24.3 (Schell-enberg i wsp., 1992; St. George-Hyslop i wsp., 1992; Van Broeckhoven i wsp., 1992).
185 549
Jakkolwiek region chromosomu 14q niesie szereg genów, które mogą być rozpatrywane jako geny będące kandydatami na miejsce mutacji powiązanych zAD3 (np. cFOS, alfa-1anty-chymotrypsyna i katepsyna G), większość z tych genów kandydatów została odrzucona na podstawie ich fizycznej lokalizacji poza regionem AD3 i/lub braku mutacji w odpowiadającej im otwartej ramce odczytu (SchelTenberg i wsp., 1992; Van Broeckhoven i wsp., 1992; Rogaev i wsp., 1993; Wong i wsp., 1993).
Istnieje szereg rozwiązań i handlowych kierunków lub strategii odnośnie leczenia choroby Alzheimera i jej diagnozowania. Opublikowane zgłoszenie patentowe PCT WO 94 23049 opisuje transfekcję wysokocząsteczkowym DNA YAC specyficznych komórek mysich. Metoda ta może być stosowana do analizy dużych kompleksów genowych. Przykładowo, transgeniczne myszy mogą mieć zwiększoną dawkę genu APP, co imituje warunki trisomii, które są najważniejsze w zespole Downa, i co umożliwia stworzenie modeli zwierzęcych z β-amyloidazą podobną do tej, która odgrywa główną rolę u osób z chorobą Alzheimera. Opublikowane międzynarodowe zgłoszenie WO 94 00569 opisuje transgeniczne zwierzęta, z wyłączeniem człowieka, mające w sobie duże transgeny, takie jak transgen obejmujący ludzki gen APP. Takie modele zwierzęce mogą dostarczać użyteczne modele chorób dziedzicznych człowieka, takich jak choroba Alzheimera.
Kanadyjskie zgłoszenie patentowe nr 2096911 opisuje kwas nukleinowy, kodujący proteazę przecinającą APP, która jest powiązana z chorobą Alzheimera i zespołem Downa. Informacja genetyczna, którą otrzymano z chromosomu 19, może być użyta do diagnozowania choroby Alzheimera. Kanadyjskie zgłoszenie patentowe 2071105, opisuje wykrywanie i leczenie dziedzicznej lub nabytej choroby Alzheimera poprzez stosowanie sekwencji nukleotydowych YAC. YAC są oznaczone numerami 23CB10, 28CA12 i 26FF3.
Zgłoszenie patentowe USA 5297562 opisuje wykrywanie choroby Alzheimera powiązanej z trisomią chromosomu 21. Leczenie obejmuje metody zmniejszenia rozprzestrzeniania się trisomii chromosomu 21. Kanadyjskie zgłoszenie patentowe nr 2054302 opisuje przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają jądrowe białka komórek mózgowych, kodowane w chromosomie 21, i są używane do wykrywania zmian ekspresji powodowanych chorobą Alzheimera lub zespołem Downa. Przeciwciało monoklonalne jest swoiste wobec białka kodowanego przez ludzki chromosom 21 i jest znajdywane w dużych komórkach piramidowych ludzkiej tkanki mózgowej.
Streszczenie wynalazku
W zgłoszeniu opisano identyfikację, izolację, klonowanie i sekwencjonowanie dwóch ludzkich genów, które zostały oznaczone jako prezenilina-1 (PSI) i prezenilina-2 (PS2). Te dwa geny i odpowiadające im produkty białkowe są członkami rodziny wysoce konserwatywnych genów, prezenilin, mających homologię lub ortologię u innych gatunków ssaków (np. myszy, szczurów), jak również ortologię u gatunków bezkręgowców (np. C. elegans, D. melanogaster^). Mutacje w tych genach zostały powiązane z rozwojem u człowieka rodzinnych postaci choroby Alzheimera i mogą być również przyczyną innych chorób (np. innych percepcyjnych, intelektualnych, neurologicznych lub psychologicznych chorób, takich jak krwotoki mózgu, schizofrenia, depresja, opóźnienie umysłowe i padaczka). Niniejsze zgłoszenie ujawnia sekwencje nukleotydowe, genomowe i cDNA, ludzkich genów PSI (hPSl) i PS2 (hPS2), homologu PSI gryzoni (m'PSl) oraz pokrewnych genów z C. elegans (sel-12, SPE-4) i D. melanogaster (DmPS). Dostarczono również także przewidywanych sekwencji aminokwasowych prezenilin, kodowanych przez te geny i charakterystykę strukturalną prezenilin, włączając w to domniemane domeny funkcjonalne i determinanty antygenowe. Liczne mutacje w prezenilinach, które są przyczyną choroby Alzheimera (AD) u człowieka są także ujawnione i powiązane z funkcjonalnymi domenami białek.
Przedmiotem wynalazku są wyizolowane kwasy nukleinowe, obejmujące sekwencje nukleotydowe kodujące białko prawidłowej i zmutowanej prezeniliny-1, w szczególności wyizolowany kwas nukleinowy którego sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy składającej się z:
(1) sekwencji knuj ąeej Walko Ołekweneji iamCnonwasowajluaekiejpreeeniliny-l SEK. NR ID: 2;
185 549 (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji nmiookwanowej mysiej prezenilmy-1 z SEK. NR ID: 17;
(3) sekwencji kodującej prawidłowa prezeOilinę-1 i zdolnej do l^ybrydγnz.nv;lnia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji. Korzystnie sekwencja nukleotydowa wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się zM146L, H163R, A246E, L286V, i C410Y; i odpowiada sekwencj i nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji nmiookwanowej ludzkiej prezeoilloy-1 z SEK. NR ID: 2;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji amiookwasowej mysiej paezeoiiioy-1 z SEK. NR ID: 17;
(3) sekwencji kodującej prawidłową prezeoilioę-1 i zdolnej do hnbrydyzowania z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEK. NR ID:1 oraz wyizolowany polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC nr 97124 i kodujący ludzką prezeoilinę-1.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, kodującą co najmniej jedną funkcjonalną domenę prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeoilioy-1 i zmutowanej prezeoilion-1. Korzystnie domena funkcjonalna odpowiada domenie wybranej z grupy składającej się z domen prezeoilioy-1: N-końcowej, TM1, TMl->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3-»4, TM4, TM4-*5, TM5, TM5—»6, TM6, TM6—>7, TM7 oraz domeny C-końcowej.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prawidłowej prezeoiliny-1 lub zmutowanej prezeniliny-1. Korzystnie sekwencja nukleotydową wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku koduje determinantę antygenową prezeoilinn-1, odpowiadającą determinancie antygenowej prezeoiliny-1, wybranej z grupy obejmującej reszty aminokwasów 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223, 220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
Pondto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy zawierający wariant alleliczny lub odmienny gatunkowo homolog ludzkiego genu prezeoiimn·
Przedmiotem wynalazku jest również sposób ideotyfikownoia wariantów allelidznych lub odmiennych gatunkowo homologów ludzkiego genu prezeoilion obejmujący następujące etapy:
w^raada sondy kwasu nukleinowego lub startera, zdolnego do hnbtyd}nowanła z sekwencją ludzkiego genu paezeniiiny o SEK. NR ID: 1 w ostrych wnluokadh hybrydyzacji;
zmieszzma tej sondy lub startera z próbką kwasów nukleinowych, która może zawierać kwas nukleinowy, odpowiadający temu wariantowi lub homologowi; i wykrywania hybrydyzacji takiej sondy lub startera do kwasu nukleinowego, odpowiadającego temu wariantowi lub homologowi. Korzystnie próbką w sposobie według wynalazku są kwasy nukleinowe wybrane z grupy składającej się z ludzkiego genomowego DNA, ludzkiego mRNA i ludzkiego cDNA. Korzystnie próbka obejmuje kwasy nukleinowe, wybrane z grupy składającej się z genomowego DNA ssaczego lub bezkręgowców, ssaczego mRNA i ssaczego cDNA.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania wariantów alleliczoych lub odmiennych gatunkowo homologów ludzkiego genu prezeoilioy obejmujący następujące etapy:
wybrania przeciwciała zdolnego do selektywnego wiązama się z ludzką paezeoilioą o SEK. NR ID: 2;
zmieszania tego przeciwciała z próbką białek, która może zawierać białko odpowiadające temu wariantowi lub homologowi;
185 549 wykrywania wiązania się takiego przeciwciała z białkiem odpowiadającym temu wariantowi lub homologowi. Korzystnie gdy próbką w sposobie według wynalazku są białka wybrane z grupy składającej się z białek ludzkich, ludzkich fuzji białkowych oraz ich proteolitycznych fragmentów. Korzystnie próbką są białka wybrane z grupy składającej się z białek ssaczych lub z białek bezkręgowców, ssaczych fuzji białkowych oraz ich proteolitycznych fragmentów.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor z włączoną sekwencją nukleotydową według wynalazku. Korzystnie jeżeli orekombimowany wektor jest wektorem ekspresyjnym, a sekwencja nukleotydowa prezenilmy jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym. Korzystnie gdy wyizolowany kwas nukleinowy jest wektorem ekspresyjnym, który może wyrażać sekwencję prezenilmy w komórkach ssaczych i koduje co najmniej domenę funkcjonalną prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej preoemiliny-1.
Przedmiotem wnalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko, prawidłową prezenilinę-1, którego sekwencja nukleotydowa jest sekwencją kodująca białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezenilmy-1 z SEK. NR ID: 4 albo sekwencją kodującą białko o sekwencji aminokwasowej z SEK, NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290.
Wyizolowany kwas nukleinowy, według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową zmutowanej prezeniliny-1, kodującą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji z SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy obejmującej A260V, A285V, L392V oraz odpowiadającą sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:
(1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezemillmy-1 z SEK. NR ID: 2;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji ammokwasowej ludzkiej preoe'mlilny-1 z SEK. NR ID: 4;
(3) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezemlilny-1 z SEK.
NR ID: 17; ' (4) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
(5) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybrydy/owiała z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (4) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC Nr 97214, kodujący ludzką prezenilmę-2.
Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, złoż^^iąz co najmniej 10 kolejnych nukleotydów, z SEK. NR ID: 3.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną preoenlllnę-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 4, wybranej z grupy obejmującej M146L, H163R, A246E i C410Y, oraz odpowiada sekwencji nukleotydowej kodującej białko o sekwencji ammokwasowej SEK. NR ID: 4.
Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko, wybrane z grupy składającej się z prawidłowej prezemllimy-2 oraz zmutowanej prezemilimy-2. Korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy koduje prawidłową prezemllinę-2 i ma sekwencję nukleotydową wybrane z grupy składającej się z:
(1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji ammokwasowej ludzkiej prezemiliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezemllimę-2 i zdolnej do hybrydyzo'>waαła z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji. Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku koduje zmutowaną
185 549 prezenilinę-2, a jego sekwencja nukleotydowa kotujo co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i NI41I;
i poza tym odpowiada sekwencji cukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji koPującej białko o sekwencji αmicukwαsuwej ludzkiej prezonilmy-2 z SEK. NR ID: 19;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej lubzkiej prozociliny-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji koPującej prawidłową prezocilinę-2 i zdolnej bo hybrydyzuwαnia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prozecilicę-1, która koduje co najmniej jebną mutację, odpowiadającą mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się zM239V i N141I; a poza tym odpowiaba sekwencji nukleutyduwej wybranej z grupy składającej się z:
(1) sekwencji kodującej białko o sekwencji amicukwacowej luPbkięj prezecilicy-1 z SEK. NR ID: 2;
(2) sekwencji koPującej białko o sekwencji amicokwacowęj lupzeiej proze'ciliny-1 z SEK. NR ID: 4;
(3) sekwencji kodującej białko o sekwencji amicokwacuwęj mysiej prezenilmy-1 z SEK. NR ID: 17;
(4) sekwencji kodującej białko o sekwencji amicokwacoweJ przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta αminukwαcowα 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
(5) sekwencji koPującej białko o sekwencji amicokwacuwęj z SEK. NR ID: 4, w której reszta amicukwasowa 253 jest zamiociuca na alaninę i brakuje reszt amicukwαsuwych 254-286;
oraz (6) sekwencji kodującej prawidłową prozocilicę-1 i zdolnej do hybrybybuwacia z sekwencją komplementarną bo dowolnej z sekwencji od (1) - (5) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, który kodujo zmutowaną prezonilinę-2, kodujo co najmniej jobną mutację, która odpowiada mutacjom SEK. NR ID: 2, wybranym z grupy skłabającej się zA79?, V82L,V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, F177S, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, Δ291-319, G384A, L392V, C410Y i I439V; oraz odpowiadającej poza tym odpowiada sekwencji nukloutybowęj, wybranej z grupy składającej się z:
(1) sekwencji koPującej białko o sekwencji ammokwasowoj ludzkiej prozomliny-2 z SEK. NR ID: 19;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasuwęj ludzkiej prozonilmy-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji eudującęj prawidłową prezenilmę-2 i zdolnej bo hybrypyzowania z sekwencją komplomoctarcą Po dowolnej z sekwoncji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję cuklootybuwą, złożoną z co najmniej 10 kolejnych cuklootydów sekwencji nukleotybowej SEK. NR ID: 18.
Ponadto wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukloutydową, kodującą co najmniej jodną funkcjonalną tomonę prezecilicy, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 i zmutowanej prezenilmy-1. Korzystnie domona funkcjonalna jest domoną fucęnjocalcą prezeniliny-2, odpowiadającą Pomonio wybranej z grupy składającej się z tomen prozoniliny-2: N-końcowej, TM1, TM1—2, TM2, TM2—>3, TM3, TM3—4, TM4, TM4->5, TM5, TM5-»6, TM6, TM6->7, TM7 oraz domeny Ckońcowej.
185 549
Ponadto wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prawidłowej prezeniliny-2 albo zmutowanej prezeniliny-2. Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, w którym sekwencja koduje determinantę antygenową prezeniliny-2, odpowiadającą determinancie antygenowej prezeniliny-2, wybranej z grupy zawierającej aminokwasy 25-45, 50-63, 70-75, 114-120, 127-132, 1612-167, 221-226, 282-290, 310-314, 321-338, 345-352, 380-390 i 430435 z SEK. NR ID: 19.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor z włączoną sekwencją nukleotydową według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej :
a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 4;
b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową. o SEK. NR ID: 2, w której reszta 257 jest zastąpiona przez alaninę, zaś reszty 258-290 są pominięte.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza transformowana wektorem według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą białko wybrane z grupy obejmującej normalne białko pre'zęniliny-1 i zmutowane białko prezeniliny-1, lub jej potomstwo.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest modelowe zwierzę, z wyłączeniem człowieka, dla choroby Alzheimera, gdzie genom takiego zwierzęcia lub jego przodka został zmodyfikowany przy zastosowaniu co najmniej jednego zrekombinowanego konstruktu, i gdzie taki zrekombinowany konstrukt wprowadził modyfikację, wybraną z grupy składającej się z(l) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, prawidłowego genu prezeniliny, (2) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, zmutowanego genu prezeniliny, (3) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną pochodzącego z tego samego gatunku homologu zmutowanego, odmiennego gatunkowo genu prezeniliny, i (4) inaktywacji endogennego genu prezeniliny. Korzystnie, gdy taka modyfikacja jest wstawieniem sekwencji nukleotydowej, kodującej co najmniej domenę funkcjonalną prawidłowego lub zmutowanego ludzkiego genu prenizeliny-1. Przedmiotem wynalazku jest również modelowe zwierzę kiedy taka modyfikacja jest wstawieniem sekwencji nukleotydowej, kodującej co najmniej domenę funkcjonalną prawidłowego lub zmutowanego ludzkiego genu prenizeliny-2. Korzystnie modelowe zwierzę jest wybrane z grupy składającej się ze szczurów, myszy, chomików, świnek morskich, królików, psów, kotów, kóz, owiec, świń i naczelnych z wyłączeniem człowieka.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania co najmniej domeny funkcjonalnej prezeniliny obejmujący hodowanie komórek gospodarza według wynalazku, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wyżej wymienionych kwasów nukleinowych według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również zasadniczo czyste białko prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1. Korzystnie gdy zasadniczo czyste białko stanowi prawidłową prezenilinę-1 wybraną z grupy składającej się z:
(1) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
(2) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17;
Korzystnie gdy zasadniczo czysty preparat białka według wynalazku obejmuje zmutowaną prezęnilinę-1, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR iD: 2, wybranej z grupy składającej się z M146l, H163R, A246E, L286V i C410Y; oraz gdy takie białko odpowiada sekwencji aminokwasowej, wybranej z grupy składającej się z:
(^sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
^sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17;
Zasadniczo czyste białko według wynalazku obejmuje prezenilinę-1 wybraną z grupy składającej się z:
185 549 (1) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 4;
(2) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2, w którym reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czyste białko obejmujące zmutowaną prezenilinę-1, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada nmtaaji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się z M146L, H163R, A246E, A260V, A285V, L392V i C410Y, przy czym dodatkowo białko według wynalazku odpowiada sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID: 4.
Zasadniczo czyste białko według wynalazku obejmuje zmutowaną prezenilinę-1, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się zA260V, A285V i L392V, przy czym dodatkowo białko to odpowiada sekwenej i aminokwasowej, wybranej z grupy składającej się z:
(1) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
(2) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17;
Przedmiotem wynalazku jest również zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych reszt aminokwasowych z SEK. NR ID: 2 lub SEK. NR ID: 17 lub SEK. NR ID: 19, oraz zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zawierającego co najmniej jedną funkcjonalną domenę prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1, jak również zasadniczo czysty preparat polipeptydu zawierającego determinantę antygenową prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1. Korzystnie, zasadniczo czysty preparat polipeptydu według wynalazku, obejmuje polipeptyd zawierający determinantę antygenową prezeniliny-1 wybraną z grupy składającej się z reszt aminoOa-asowych 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223, 220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania przeciwciał, które selektywnie wiążą się z prezeniliną, obejmujący etapy podawania zwierzęciu immunogennie skutecznej ilości immunogenu prezeniliny, umożliwienia takiemu zwierzęciu wytworzenia przeciwciał przeciw temu immunogenowi, oraz otrzymania takich przeciwciał z takiego zwierzęcia lub z hodowli komórek pochodzących od niego.
Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty preparat przeciwciał, które selektywnie wiąże się z determinantą antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1. Korzystnie gdy przeciwciało wiąże się selektywnie z determinantą antygenową zmutowanej prezeniliny-1 i nie wiąże się z prawidłową prezeniliną-1.
Przedmiotem wynalazku jest również zasadniczo czysty preparat przeciwciał, które selektywnie wiąże się z determinantą antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 oraz zmutowanej prezeniliny-2. Korzystnie, przeciwciało wiąże się selektywnie z determinantą antygenową zmutowanej prezeniliny-2 i nie wiąże się z prawidłową prezeniliną-2.
Przedmiotem wynalazku są również linie komórkowe wytwarzające przeciwciała opisane powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związków, które mogą modulować ekspresję genu prezeniliny, obejmujący doprowadzenie do kontaktu komórki z testowanym kandydatem, przy czym taka komórka zawiera region regulatorowy genu prezeniliny połączony w sposób funkcjonalny z regionem kodującym, i wykrywanie zmian w ekspresji takiego regionu kodującego, przy czym zmiana ekspresji wskazuje, że badany kandydat moduluje ekspresję genu prezeniliny.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związków, które mogą selektywnie wiązać się z prezeniliną, obejmujący dostarczenie preparatu zawierającego co najmniej jeden składnik typu prezeniliny, doprowadzenie do kontaktu takiego preparatu z próbką zawierającą co najmniej jeden związek kandydat oraz wykrywanie wiązania takiego składnika typu prezeniliny ze związkiem kandydatem metodą wybraną z grupy obejmującej: chromatografię powinowactwa, koimmunoprecypitację, test oddziaływań bibmblekulamych (Biomolecular Interaction Assay) oraz drożdżowy układ dwu-hybrydowy.
185 549
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związków, które mogą modulować aktywność prezeniliny, obejmujący etapy dostarczenia komórki wyrażającej gen prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny, doprowadzenia do kontaktu takiej komórki z co najmniej jednym związki2w kandydatem i wykrywania zmiany w aktywności markera przy czym pomiar takiego markera wskazuje na różnicę pomiędzy komórkami niosącymi podlegający ekspresji zmutowany gen prezeniliny, a komórkami pod innymi względami identycznymi, ale nie zawierającymi podlegającego ekspresji zmutowanego genu prezeniliny. Korzystnie gdy komórka jest eksplantowana z gospodarza niosącego co najmniej jeden zmutowany gen prezeniliny. Korzystniej gdy komórka jest komórką człowieka poddawanego testowi kilnicznewu.
Przedmiotem wynalazku jest sposób określania czy dany osobnik jest narażony na ryzyko wystąpienia wcześnie objawiającej się rodzinnej choroby Alzheimera (AD)obęjmujący:
(a) uzyskania próbki kwasów nukleinowych od osobnika i (b) przeprowadzania testu z próbką kwasów nukleinowych, w których wykrywa się obecność lub nieobecność mutacji genu prezenibny-1 zwiąoanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje na ryzyko rozwoju Ad. Korzystnie gdy test jest wybrany z grupy obejmującej bezpośrednie S2Cwenajonowanie' nukleotydów, hybrydyzację ze specyficzną sondą, analizowania fragmentów trawienia enzymem restrykcyjnym, i analizę ruchliwości elektrofor2tyaznej fragmentów. Korzystnie gdy próbka w sposobie według wynalazku jest RNA, a test jest testem bezpośredniego sekwenajznzwanla. Korzystniej sposób według wynalazku obejmuje etapy:
(a) odwrotnej transkrypcji próbki RNA i wytworzenia odpowiedniego cDNA;
(b) przeprowadzania co najmniej jednej łańcuchowej reakcji polimerazy z odpowiednimi starterami oligznukleotzdzwywi w celu oawpliflkowania cDNA prezeniliny-1;
(c) uzyskania sekwencji nukl2otydzwej amplifikowanego cDNA pr2zeniiiny-1;
(d) oznaczenia w tej sekwencji nukleotydowej obecności lub nieobecności mutacji w genie prezeniliny-1, związanej z AD. Najkorzystniej etap (d) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji pzlinukl2ztydu o SEK. NR ID:ł, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A685C; A737G; C986A; C1105G i G1478A. Korzystnie próbka jest próbką DNA, a korzystniej próbką genzwzwego DNA, a test obejmuje etapy:
(a) amplifikacji docelowej części sekwencji nuCleotydzwej genomowego DNA;
(b) uzyskania sekwencji nuCl2otydzwej tej amplifikowanej docelowej części;
(c) oznaczenia w sekwencji nukleotydowej tej docelowej części obecności lub nieobecności mutacji w genie pr2Z2iinyl1 związanej z AD.
Najkorzystiej etap (c) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji polinukleotydu o SEK. NR ID:1, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A685C; A737G; C986A; C1105G i G1478A..
Ponadto sposób określania według wynalazku czy dany osobnik jest narażony na ryzyko wystąpienia wcześnie objawiającej się rodzinnej choroby Alzheimera (AD), obejmuje następujące etapy:
(a) uzyskania próbki kwasów nukleinowych od osobnika i (b) przeprowadzania testu z próbką kwasów nukleinowych, w których wykrywa się obecność lub nieobecność mutacji genu prezenibny-2 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje na ryzyko rozwoju AD. Korzystnie, test obejmuje etapy:
(a) odwrotnej transkrypcji próbki RNA i wytworzenia odpowiedniego cDNA;
(b) przeprowadzenia co najmniej jednej łańcuchowej reakcji polimerazy z odpowiednimi starterami zligonukl2otydowzml w celu zamplifikowania cDNA prezeniliny-2;
(c) uzyskania sekwencji nukl2otydzwej amplifikowanego cDNA prez2niliny-n;
(d) oznaczenia w tej sekwencji nukleotydowej obecności lub nieobecności mutacji w genie pr2oenilinz-2, związanej z AD.
Korzystniej w sposobie według wynalazku etap (d) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji polinukleotydu o SEK. NR ID: 18, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A787T iA1080G. Jeszcze korzystniej, próbka kwasów nukleinowych jest próbką genomowego DNA a test obejmuje etapy:
(a) amplifikacji docelowej części sekwencji nukl2otydzwej genomowe.go DNA;
185 549 (b) uzyskania sekwencji nukleotydowej tej amplifikowanej docelowej części;
(c) oznaczenia w sekwencji nukleotydowej tej docelowej części obecności lub nieobecności mutacji zwiąoamej z AD w genie prezeniliny-2. Najkorzystniej gdy etap (c) obejmuje oznacoemie obecności lub nieobecności polinukleotydu o SEK. NR ID: 18, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A787T i A1080G.
Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania czy osobnik, u którego występują objawy neurodegemeracyjme, jest chory na AD, obejmujący etapy:
(a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
(b) przeprowadzenia testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezenilmy-1 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest chory na AD.
Sposób oznaczania czy osobnik, u którego występują objawy neurodegemerαcyjme, jest chory na AD, weług wynalazku obejmuje etapy:
(a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
(b) przeprowadzania testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezeniliny-2 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest chory na AD.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania czy osobnik jest wolny od AD obejmujący etapy:
(a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
(b) przeprowadzenia testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezeniliny-1 związanej z AD, przy czym nieobecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest wolny od Ad.
Sposób oznaczania czy osobnik jest wolny od AD, według wynalazku może obejmować etapy:
(a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
(b) przeprowadzania testu z próbką kwasu nukleinowego w celu ozmaczemla obecności lub nieobecności mutacji genu prezemiliny-2 związanej z AD, przy czym nieobecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest wolny od Ad.
Wynalazek dotyczy również sposobu oznaczania czy osobnik ma prawidłowe białko prezeIriilnę-1, czy białko zmutowane związane z AD, który obejmuje etapy:
(a) otrzymywania od osobnika próbki białka prezeniliny- 1, (b) przeprowadzenia z tą próbką białka testu wykrywającego sekwencję aminokwasową prawidłowej lub zmutowanej prezemimy-1 lub wykrywającego prawidłową łub nieprawidłową funkcję prezemiliny-1.
Korzystnie test w sposobie oznaczania jest testem do wykrywania sekwencji aminokwasowej prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1, wybranym z grupy obejmującej test immunologiczny, specyficzny test na miejsce enzymu („enzyme site specific assay”), analizę ruchliwości elektroforetycznej białka i analizę wzorców cięcia proteolitycznego. Korzystniej, test jest testem wykrywającym co najmniej jedną mutację w sekwencji aminokwasowej SEK NR:2, która jest wybrana z grupy mutacji obejmujących Metl46Leu, His 163Arg, Ala246Glu, Leu286Val i Cys410Tyr·.
Według wynalazku sposób oznaczania czy osobnik ma prawidłowe białko preoemilinę-2, czy białko zmutowane związane z AD, obejmuje etapy:
(a) otrzymywania od osobnika próbki białka prezemllimy-2, (b) przeprowadzania testu z tą próbką białka wykrywającego sekwencję aminokwasową prawidłowej lub zmutowanej prezemillny-2 lub wykrywającego prawidłową lub nieprawidłową funkcję prezenilmy-2. Korzystnie gdy test jest testem do wykrywania sekwencji aminokwasowej prawidłowej lub zmutowanej prezemlllny-2, jest wybrany z grupy obejmującej test immunologiczny, specyficzny test na miejsce enzymu („enzyme site specific assay”), analizę ruchliwości elektroforetycznej białka i analizę wzorców cięcia proteolitycznego. Korzystniej, test jest testem wykrywającym co najmniej jedną mutację w sekwencji aminokwasowej SEK NR:19, która jest wybrana z grupy mutacji obejmujących M239V i N141I.
185 549
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, zawierająca zasadniczo czyste białko prezenilinę i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie białko jest ludzką prezeniliną-1.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera zasadniczo czyste białko prezenilinę-2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna., zawierająca wektor ekspresyjny, kodujący w sposób funkcjonalny prezenilinę-2, który może wyrażać taką prezenilinę w organizmie człowieka, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora ekspresyjnego, kodującego w sposób funkcjonalny prezenilinę, przy czym może on wyrażać taką prezenilinę w organizmie człowieka, do wytwarzania leku do leczenia stanów spowodowanych zmutowanym genem prezeniliny.
Ponadto, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora ekspresyjnego, kodującego w sposób funkcjonalny sekwencję antysensowną prezeniliny, który może wyrażać taką sekwencję antysensowną prezeniliny w organizmie człowieka, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia stanów spowodowanych mutacją genu prezeniliny.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zasadniczo czystego przeciwciała, które selektywnie wiąże się ze zmutowaną prezeniliną, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia stanów spowodowanych mutacją genu prezeniliny. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest zasadniczo wolna od przeciwciała, które selektywnie wiąże się z prawidłową prezeniliną.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka prezeniliny do wytwarzania leku do leczenia stanów spowodowanych zmutowanym genem prezeniliny.
Przedmiotem wynalazku jest zwierzę transgeniczne z wyłączeniem człowieka, które zawiera polinukleotyd kodujący zmutowaną prezenilinę, która ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID: 2 ale z substytucją w pozycji 260, 285 i/lub 392 lub ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID: 4 ale z substytucją w pozycji 146, 163, 246, 260, 285, 392 i/lub 410.
Ponadto zwierzę transgeniczne według wynalazku z wyłączeniem człowieka, zawiera polinueleotyd kodujący zmutowaną, prezenilinę, która ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK. NR ID: 19 ale z substytucją w pozycji 141 lub 239.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą homolog Drosophila melanogaster ludzkiego genu prezeniliny. Korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku obejmuje polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC Nr 97428. Korzystniej, wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 106, zawiera sekwencję nukleotydową, wybraną z grupy składającej się z:
(1) sekwencji kodującej białko zawierające sekwencję aminokwasową DmPS z SEK. NR ID: 21;
(2) sekwencji kodującej homolog prezeniliny i zdolnej do hybrydj'zowama z sekwencją komplementarną do sekwencji (1) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów, wybranych z grupy składającej się z SEK. NR ID: 21 oraz sekwencji komplementarnej do SEK. NR ID: 21.
Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-1, która odpowiada mutacji L171P z SEK. NR ID: 2 i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydewej wybranej z grupy składającej się z:
(1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 2;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwnnowej mysiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 17;
Ponadto wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-2, przy czym sekwencja nukleotydowa koduje mutację I420T SEK. NR ID: 19 i poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej, wybranej z grupy składającej się z:
185 549 (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezenilinn-2 z SEK. NR ID: 19;
(2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeoilinn-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezeoilinę-2 i zdolnej do hybandnzowaoin z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
Konkretnie ujawnione sekwencje oukieotndowe i aminokwasowe według niniejszego wynalazku są numerowane: SEK NR ID: 1-25. Dodatkowo, zgodnie z ustaleniami Porozumienia Budapeszteńskiego ujawnione tutaj określone kwasy nukleinowe zdeponowano w ATCC (Rockville, Md). Depozyty te obejmują: Numer Depozytu 97412 (zdeponowany 28 kwietnia 1995), Numer Depozytu 97508 (zdeponowany 28 kwietnia 1995), Numer Depozytu 97214 (zdeponowany 28 czerwca 1995) i Numer Depozytu 97428 (zdeponowany 26 stycznia 1995). Skrótowy opis rysunków
Figura 1: Figura ta przedstawia strukturalną organizację genomowego DNA hPSl. Eksony oiekodująde są zaznaczone przez jednolicie zaciemnione bloki. Eksony kodujące są zaznaczone przez nie zaciemnione bloki lub przez zakreskowane bloki w przypadku sekwencji alternatywnie składanych. Miejsca restrykcyjne są następujące: B = BamHI; E = EcoRI; H = Hindin; N = Notl; P = PstI; V = PvuII; X = Xbal. Nieciągłości w poziomych liniach pomiędzy miejscami restaykdyjonmi przedstawiają nieznane sekwencje genomowe. Sklonowane fragmenty genomowe zawierające poszczególne eksony są przedstawione przez podwójne horyzontalne strzałki. Podane są wielkości klonów genomowych i numer depozytu dla każdej genomow^e) sekwencji.
Figura 2: Figura ta przedstawia wykres hydrofobowości domniemanego białka PSI. Wykres był wyliczany zgodnie z metodą Kyte i Doolittle (1982).
Figura 3: Figura ta przedstawia dopasowanie sekwencji białkek hPSl i mPSl. Pionowe linie pokazują identyczne aminokwasy
Figura 4: Figura ta przedstawia dopasowanie sekwencji białkek hPSl i hPS2. Pionowe linie pokazują identyczne aminokwasy
Figura 5: Figura ta jest schematycznym rysunkiem spodziewanej struktury białka PSI. Liczby rzymskie oznaczają domeny taaosbiooowe. Domniemane miejsca glikozylacji są wskazane przez gwiazdki, a większość miejsc fosforylacji jest zlokalizowanych po tej samej stronie błony, co dwie kwaśne hydrofitowe' pętle. Miejsce dla kinazy MAP jest obecne przy reszcie ammokwowej 115, a miejsce dla PKC przy reszcie aminokwasowej 114. Miejsca mutacji FAD są wskazane przez poziome strzałki.
Figura 6: Figura ta jest schematycznym rysunkiem spodziewanej struktury białka PS2. Liczby rzymskie oznaczają domeny traosbłooowe. Domniemane miejsca glikozy^i są wskazane przez gwiazdki, a większość miejsc fosforylacji jest zlokalizowanych po tej samej stronie błony, co dwie kwaśne hydrofitowe pętle. Miejsca mutacji FAD są wskazane przez poziome strzałki.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje
W celu ułatwienia przeglądu różnych wykonań wynalazku i zrozumienia różnych elementów i części składowych zastosowanych przy tworzeniu i stosowaniu wynalazku, przedstawione są następujące definicje dla poszczególnych terminów użytych w opisie i dołączonych zastrzeżeniach.
Paezeoilioą. Stosowany tu, bez dalszych modyfikacji, termm „prezeniliną” lub „prezeoilioy” oznacza geny/białka paezeoilioy-1 (PSI) i/lub prezenilion-2 (PS2). W szczególności, niezmodyfikownoe terminy „prezenilmą” lub „paezeoiliny” odnoszą się ssaczych genów/białek PSI i/lub PS2, a korzystnie ludzkich genów/białek PSI i/lub PS2.
Gen paezeoiliny-1. Stosowany tu termin „gen prezenilmy-1” lub gen „PSI” oznacza gen ssaczy, po raz pierwszy ujawniony i opisany w Zgłoszeniu USA Nr seryjny 08/431048, złożonym 28 kwietnia, 1995 i dalej opisany w Sheariogton i wsp. (1995), włączając w to dowolny wariant alleliczon i odmienny gatunkowo ssaczy homolog. Jedna z ludzkich sekwencji cDNA
185 549 prezeniliny 1 (pPSl) jest tu ujawniona jako SEK NR ID: 3. Inna ludzka sekwencja cDNA, będąca wynikiem alternatywnego składania transkryptu mRNA hPSl jest ujawniona jako SEK NR ID: 3. Zostały również znalezione dodatkowe ludzkie warianty składania, jak opisano poniżej, w których region kodujący trzydzieści trzy aminokwasy może być wycięty z niektórych trancCryptów. cDNA z mysiego homologu (m/PSl) jest opisany jako SEK NR ID: 16. Terminy „gen prezeniliny-Γ’ lub gen ..PSI” dotyczą przede wszystkim sekwencji kodującej, ale mogą również obejmować niektóre lub wszystkie otaczające regiony regulatorowe i/lub introny. Termin gen PSI obejmuje w szczególności sztuczne lub zrekombinzwan2 geny utworzone z cDNA lub genomowego DNA, włączając w to zrekombinowane geny w oparciu 0 warianty składania. Gen pr2Z2nilinz·-1 jest również określany jako gen SI 82 (np. Sherrington i wsp. 1995) lub jako gen białka błonowego związanego z chorobą Alzheimera (ang. Alzheimers' Related Membrane Protein; ARPM) (np. zgłoszenie USA Nr ser. 08/431048, złożone 28 kwietnia, 1995).
Białko pr2zenlliny-1. Stosowany tu termin „białko prez2nlliny-1” lub „białko PSI” oznacza białko kodowane przez gen PSI, włączając w to warianty aΠeliazn2 i odmienne gatunkowo ssacze homologi. Jedna z ludzkich sekwencji białka prezeniliny 1 (hPSl) jest ujawniona tu jako SEK NR ID: 2. Inna ludzka sekwencja białka PSI, będąca wynikiem alternatywnego składania transkryptu mRNA hPSl jest ujawniona jako SEK NR ID: 4. Zostały również znalezione dodatkowe ludzkie warianty składania, jak opisano poniżej, w których region kodujący trzydzieści trzy aminokwasy może być wycięty z niektórych transkryptów. Warianty te są również objęte stosowanym tu terminem białka prezeniliny-1. Sekwencja białkowa mysiego homologu (mPSl) jest opisana jako SEK NR ID: 17. Białko może być wytwarzane przez zrekombinowane komórki lub organizmy, może być w dużym stopniu zczyszazone z naturalnych tkanek lub linii komórkowych lub może być syntetyzowane chemicznie lub enzymatycznie. A zatem termin „białko pr2Z2niliny-1” lub „białko PSI” ma obejmować białko w postaci glikozylowanej, częściowo glikozylowanej lub nie glikozylowanej, jak również w postaci fosforylowanej, częściowo fosforz'iowanej, nie fzsforylzwan2j, siarczanowane, częściowo siarczanowanej lub nie siarczanowanej. Termin obejmuje również warianty all2liazne 1 inne funkcjonalne równoważniki sekwencji awlnokwacowej PSI, włączając w to biologicznie aktywne fragmenty proteolityczne lub innego rodzaju. Białko to jest również określane jako białko S182 (np. Sherrington i wsp. 1995) lub jako Białko Błonowe związane z chorobą Alzheimera (ARPM) (np. Zgłoszenie USA Nr ser. 08/431048, złożone 28 kwietnia, 1995).
Gen i/lub białko hPSl. Stosowane tu oznaczenie „hPSl” dotyczy ludzkiego homoteg^ i ludzkich wariantów allelicznych genu i/lub białka PSI. Dwie sekwencje cDNA ludzkiego genu PSI są ujawnione tutaj jako SEK NR ID: i SEK NR ID: 3. Odpowiadające im sekwencje białka hSPl są ujawnione tutaj jako SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 4. Liczne warianty alleliczne, włączając w to szkodliwe mutanty, są ujawnione i udostępnione poprzez następujący dalej opis.
Gen i/lub białko mPSl. Stosowane tu oznaczenie „mPSl” dotyczy mysich homo^ów i mysich wariantów allelicznych genu i/lub białka PSI. Sekwencja cDNA jednego mysiego genu PSI jest ujawniona tutaj jako SEK NR ID: 16. Odpowiadająca mu sekwencja białka mSPl jest ujawniona tutaj jako SEK NR ID: 17. Warianty alleliczne, włączając w to szkodliwe mutanty, są udostępnione w następującym dalej opisie.
Gen prezeniliny-2. Stosowany tu termin „gen prezenilinz-2” lub gen „PS2” oznacza gen ssaczy po raz pierwszy ujawniony i opisany w Zgłoszeniu USA Nr ser. 08/496841, złożonym 28 czerwca, 1995 i dalej opisany w Sherrington i wsp. (1995) oraz Le-yy-Lahad i wsp. (1995), włączając w to dowolny wariant alleliczny i odmienne gatunkowo ssacze ^mologi. Jedna z ludzkich sekwencji cDNA prezeniliny 2 (pPS2) jest ujawniona i tu jako SEK NR ID: 18. Zostały również znalezione dodatkowe ludzkie warianty składania, jak opisano poniżej, w których pojedynczy kodon lub region kodujący trzydzieści trzy aminokwasy może być wycięty z niektórych transkryptów. Terminy „gen prezeniliny-2” lub gen „PS2” dotyczą przede wszystkim sekwencji kodującej, ale mogą również obejmować niektóre lub wszystkie otaczające regiony regulatorowe i/lub introny Termin gen PS2 w szczególności obejmuje sztuczne lub zreCzwbinzwane geny utworzone z cDNA lub genomowego DNA, włączając
185 549 w to zrekombinowane geny w oparciu o warianty składania. Gen prezeniliny-2 jest również określany jako gen E5-1 (np. Rogaev i wsp. 1995; Zgłoszenie USA Nr ser. 08/496841 złożone czerwca, 1995) lub gen STM2 (np. Levy-Lahad i wsp., 1995).
Prezenilina-2. Stosowany tu termin „prezenilina^” lub „białko PS2” oznacza białko kodowane przez gen PS2, włączając to warianty alleliczne i odmienne gatunkowo ssacze homologi. Jedna z ludzkich sekwencji prezeniliny 1 (hPS2) jest tu ujawniona jako SEK NR ID: 19. Zostały również znalezione dodatkowe ludzkie warianty składania, jak opisano poniżej, w których pojedynczy kodon lub region kodujący trzydzieści trzy aminokwasy może być wycięty z niektórych transkryptów. Warianty te są również objęte stosowanym tu terminem prezeniliny-2. Białko może być wytwarzane przez zrekombinowane komórki lub organizmy, może być w dużym stopniu oczyszczone z naturalnych tkanek lub linii komórkowych lub może być syntetyzowane chemicznie lub enzymatyczne. A zatem termin „prezenilina^” lub „białko PS2” ma obejmować białko w postaci glikozylowanej, częściowo glikozylowanej, lub nie glikozylowanej, jak również w postaci fosforylowanej, częściowo fosforylowanej, nie fosforylowanej, siarczanowanej, częściowo siarczanowanej lub nie siarczanowanej. Termin obejmuje również warianty alleliczne i inne funkcjonalne równoważniki sekwencji aminokwasowej PS2, włączając w to biologicznie aktywne fragmenty proteolityczne lub innego rodzaju. Białko to jest również określane jako białko E5-1 (np. Sherrington i wsp. 1995) Rogaev i wsp., 1995; Zgłoszenie USA Nr ser. 08/496841 złożone 28 czerwca, 1995) lub białko STM2 (np. Levy-Lahad i wsp., 1995)
Gen i/lub białko hPS2. Stosowane tu oznaczenie „hPS2” dotyczy ludzkiego homologu i ludzkich wariantów allelicznych genu i/lub białka PSI. Jedna sekwencja cDNA ludzkiego genu PS2 jest ujawniona tutaj jako SEK NR ID: 18. Odpowiadająca jej sekwencja białka hSP2 jest ujawniona tutaj jako SEK NR ID: 19. Liczne warianty alleliczne, włączając w to szkodliwe mutanty, są ujawnione i udostępnione poprzez następujący dalej opis.
Gen i/lub białko DmPS. Stosowane tu oznaczenie „DmPS” dotyczy homologów Drosophila i wariantów allelicznych genów i/lub białek PSI i PS2. Definicja ta jest rozumiana jako obejmująca polimorfizm kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych, gdzie podstawienia, wstawienia lub delecje w genie lub sekwencji białkowej nie wpływają na istotną funkcję produktu genu. Sekwencja nukleotydowa cDNA genu DmPS jest ujawniona tutaj jako SEK NR ID: 20, a odpowiadająca jej sekwencja białka jest ujawniona jako SEK NR ID: 21. Termin „gen DmPS” dotyczy przede wszystkim sekwencji kodującej, ale może również obejmować niektóre lub wszystkie otaczające regiony regulatorowe i/lub introny.
Prawidłowy. Stosowany tu w odniesieniu do genów termin „prawidłowy” dotyczy genu, który koduje prawidłowe białko. Stosowany tu w odniesieniu do białek termin „prawidłowy” dotyczy białka, które spełnia swoją zwykłą lub fizjologiczną rolę i które nie jest związane lub stanowi przyczynę przypadku lub stanu patogennego. A zatem, stosowany tu termin „prawidłowy” jest zasadniczo synonimem zwykłego znaczenia określenia „typ dziki”. Dla dowolnego danego genu lub odpowiadającego mu białka, może istnieć duża liczba wariantów allelicznych, z których żaden nie jest związany z wystąpieniem przypadku lub stanu patogennego. Takie prawidłowe warianty alleliczne obejmują miedzy innymi, warianty w których jedno lub więcej podstawień nukleotydowych nie prowadzi w rezultacie do zmiany w zakodowanej sekwencji aminokwasowej.
Zmutowany. Stosowany tu w odniesieniu do genów termin „zmutowany” dotyczy genu, który koduje zmutowane białko. Stosowany tu w odniesieniu do białek termin „zmutowane” dotyczy białka, które nie spełnia swojej zwyczajnej lub fizjologicznej roli i które jest związane lub stanowi przyczynę przypadku lub stanu patogennego. A zatem, stosowany tu termin „zmutowany” jest zasadniczo synonimem terminu niefunkcjonalny, patogenny, powodujący chorobę oraz szkodliwy. W odniesieniu do genów i białek prezeniliny według niniejszego wynalazku, termin „zmutowany” oznacza geny/prezeniliny niosące jedno lub więcej podstawień nukleotydowych/aminokwasowych, insercji i/lub delecji, które typowo prowadzą do rozwoju objawów choroby Alzheimera i/lub odpowiednich dziedzicznych fenotypów (np. krwotoku mózgowego, opóźnienia rozwoju umysłowego, schizofrenii, psychozy i depresji) wówczas, gdy podlegają ekspresji u ludzi. Definicja ta jest rozumiana jako obejmująca różne
185 549 mutacje, które istnieją naturalnie, włączając w to między innymi te ujawnione tutaj, jak również mutacje syntetyczne lub otrzymane poprzez rekombinowanie DNA wytworzone przez ludzką interwencję. Termin „zmutowany” stosowany do genów prezeniliny, nie ma obejmować sekwencji wariantów, które na skutek degeneracji kodu genetycznego kodują białka identyczne z prawidłowymi sekwencjami ujawnionymi lub w inny sposób tutaj udostępnionymi; ani nie mają obejmować sekwencji wariantów, które jakkolwiek kodują różne białka, kodują białka, które są funkcjonalnie równoważne w stosunku do prawidłowych prezenilin.
Funkcjonalny ekwiwalent. Stosowany tu przy opisywaniu sekwencj i genowych i sekwencj i aminokwasowych termin „funkcjonalny ekwiwalent” oznacza, że wymieniona sekwencja może nie być identyczna z konkretną ujawnioną sekwencją z listy SEK NR ID, ale powinna jedynie dostarczać sekwencję, która działa biologicznie i/lub chemicznie jako ekwiwalent ujawnionej sekwencji.
Zasadniczo czysty. Stosowany tu w odniesieniu do białek (włączając w to przeciwciała) i innych preparatów, termin „zasadniczo czysty” oznacza preparat, w którym co najmniej 60% wagowo (suchej masy) stanowi związek będący przedmiotem zainteresowania. Korzystnie, jeżeli preparat jest w 75%, korzystniej, w co najmniej 90%, a najkorzystniej w co najmniej 99% wagowo związkiem będącym przedmiotem; zainteresowania. Czystość może być mierzona dowolną odpowiednią metodą np. poprzez chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu lub analizę HPLC.
W odniesieniu do białek, włączając w to przeciwciała, jeżeli preparat zawiera dwa lub więcej różnych związków będących przedmiotem zainteresowania, immunogenów, domen funkcjonalnych lub innych polipeptydów według wynalazku, preparat „zasadniczo czysty” oznacza preparat, w którym całkowita masa (sucha masa) wszystkich związków będących przedmiotem zainteresowania stanowi co najmniej 60% całkowitej suchej masy. Podobnie, dla takich preparatów zawierających dwa lub więcej związki będące przedmiotem zainteresowania, korzystne jest, jeżeli całkowita masa związku będącego przedmiotem zainteresowania wynosi co najmniej 75%, korzystniej, co najmniej 90%, a najkorzystniej co najmniej 99% całkowitej suchej masy preparatu.
Wyizolowany kwas nukleinowy. Stosowany tu termin „wyizolowany kwas nukleinowy” oznacza kwas rybonukleinowy, kwas dezoksyrybonukleinowy lub analog kwasu nukleinowego zawierający sekwencję polinukleotydową, który został wyizolowany lub wydzielony z sekwencji, które bezpośrednio z nim sąsiadują (jedna na końcu 5' i jedna na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi. Termin obejmuje zatem, przykładowo, zrekombinowany kwas nukleinowy, który jest włączony do wektora, do autonomicznie replikującego się plazmidu lub wirusa lub do genomowego DNA organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego, albo który istnieje jako oddzielna cząsteczka (np. cDNA lub genomowy fragment dNa wytworzony poprzez PCR lub działanie endonukleazami restrykcyjnymi) niezależnie od innych sekwencji. Obejmuje on również zrekombinowany DNa, który jest częścią genu hybrydowego kodującego dodatkowe sekwencje polipeptydowe i/lub włączając w to egzogenne sekwencje regulatorowe.
Sekwencja zasadniczo identyczna. Stosowany tu termin „zasadniczo identyczna” sekwencja aminokwasowa obejmie sekwencją aminokwasowi która różni się jedynie konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, przykładowo, podstawieniem jednego aminokwasu drugim z tej samej klasy (np. walina glicyną, arginina lizyną itd.) lub jednym lub więcej podstawieniem niekonserwatywnym, delecjami lub insercjami zlokalizowanymi w pozycjach sekwencji aminowkwasowej, która nie niszczy funkcji białka (testowanej np. jak opisano tutaj). Korzystnie jeżeli, taka sekwencja jest w co najmniej 85%, korzystniej w 90%, a najkorzystniej w 95% identyczna na poziomie aminokwasów z sekwencją białka lub peptydu, z którym jest porównywana. Dla kwasów nukleinowych, długość porównywanych sekwencji będzie generalnie wynosiła co najmniej 50 nukleotydów, korzystniej co najmniej 60 nukleotydów, jeszcze korzystniej co najmniej’ 75 nukleotydów, a najkorzystniej 110 nukleotydów. „Zasadniczo identyczna” sekwencja nukleotydowa koduje zasadniczo identyczną sekwencję aminoOwasowąjaO zdefiniowano powyżej.
185 549
Transformowana komórka. Stosowany tu termin „transformowana komórka” obejmuje komórkę, do której (lub do komórki z której ona pochodzi) została wprowadzona, za pośrednictwem technik rekombmowama DNA, cząsteczka kwasu nukleinowego będąca przedmiotem zainteresowania. Kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania będzie typowo kodować peptyd lub białko. Transformowana komórka może wyrażać sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania lub może być stosowana jedynie do namnażania sekwencji. Termin „transformowany” może być zastosowany dla dowolnej metody wprowadzenia egzogennego kwasu nukleinowego, włączając w to między innymi transformację, transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję i temu podobne.
Połączony w sposób funkcjonalny. Sekwencję kodującą i region regulatorowy określa się tutaj jako „połączone w sposób funkcjonalny” jeżeli są kowalencyjnie połączone w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja sekwencji kodującej dostaje się pod wpływ lub kontrolę regionu regulatorowego. Jeżeli jest pożądane, aby sekwencje kodujące podlegały translacji do funkcjonalnego białka, dwie sekwencje DNA określa się jako połączone w sposób funkcjonalny, jeżeli indukcja funkcji promotora daje w rezultacie transkrypcję sekwencji kodującej i jeżeli wiąoamie pomiędzy dwoma sekwencjami DNA (1) nie powoduje wprowadzenia mutacji typu przesunięcia ramki odczytu (2) nie zaburza zdolności regionu regulatorowego do kierowania transkrypcją sekwencji kodującej lub (3) nie zaburza zdolności odpowiedniego transkryptu RNA do podlegania translacji do białka. A zatem region regulatorowy byłby w sposób funkcjonalny połączony z sekwencją kodującą, jeżeli region regulatorowy miałby zdolność wpływania na transkrypcję tej sekwencji DNA w taki sposób, że powstały w rezultacie transkrypt mógłby podlegać translacji do pożądanego białka lub polipeptydu.
Ostre warunki hybrydyzacji. Ostre warunki hybrydyzacji i jest to stosowany w tej dziedzinie termin zrozumiały przez znawców. Dla dowolnej danej sekwencji kwasu nukleinowego ostrymi warunkami hybrydyzacji są takie warunki temperatury kwasów chaotropowych, buforu i siły jonowej, które pozwalają na hybrydyzację takiej sekwencji kwasu nukleinowego do swojej sekwencji komplementarnej, ale nie do zasadniczo odmiennych sekwencji. Dokładne warunki, które składają się na warunki ostre zależą od natury sekwencji nukleotydowej, długości sekwencji i częstości wystąpienia części takiej sekwencji w obrębie innych nie identycznych sekwencji. Poprzez zmianę warunków hybrydyzacji od poziomu ostrości, przy którym następuje niespecyficzna hybrydyzacja, do poziomu, przy którym obserwowana jest jedynie specyficzna hybrydyzacja, biegły w tej dziedzinie może bez wykonywania zbędnych doświadczeń określić warunki, które umożliwią danej sekwencji hybrydyzowanie jedynie z sekwencjami komplementarnymi. Odpowiednie zakresy takich warunków ostrości są opisane w Krause i Aronson, 1991. Warunki hybrydyzacji, w zależności od długości i powszechności występowania sekwencji, mogą obejmować temperaturę 20°C65°C i siłę jonową od 5x do 0,lx SSC. Niezwykle ostre warunki hybrydyzacji obejmują temperaturę tak niską, jak 40-42°C (z denaturantami takimi jak formamid) lub aż do 60-65°C przy sile jonowej tak niskiej, jak 0,1 x SSC. Zakresy te, jednakże, stanowią jedynie ilustrację i w zależności od natury sekwencji docelowej i możliwego przyszłego rozwoju technologicznego mogą być bardziej ostre niż potrzeba. Mniej ostre warunki są stosowane do izolowania sekwencji kwasów nukleinowych, które są zasadniczo podobne, allelicome lub homologiczne do dowolnej danej sekwencji.
Wiąże się selektywnie. Stosowane tu w odmiesiemiu do przeciwciał określenie, że przeciwciało „wiąże się selektywnie” z celem oznacza, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże się ze związkiem docelowym będącym przedmiotem zainteresowania, ale nie rozpoznaje w stopniu zasadniczym i nie wiąże się z innymi cząsteczkami w próbce, np. biologicznej, która zawiera związek docelowy będący przedmiotem zainteresowania.
II Preoemiliny
Obecny wynalazek jest oparty w części na ujawnieniu rodziny ludzkich genów, które w postaci zmutowanej, są powiązane z rozwinięciem się choroby Alzheimera. Ujawnienie tych genów, oznaczonych prezenilina-1 i prezenilina-2, podobnie jak charakterystyka tych genów, ich produktów białkowych, mutantów i możliwej funkcji są opisane poniżej. Homologi prezenilin bezkręgowców są także dyskutowane, ponieważ mogą one rzucać światło na
185 549 funkcję prezeniEn i do pewnego stopnia mogą być przydatne w różnych wykonaniach opisanych poniżej.
Izolacja ludzkiego genu pecizylicy-1
Genetyczne mapowanie regionu AD3
Początkowa izolacja i charakteryzacja gonu PSI, opisanego jako gon AD3 lub S182 została opisana przez Shorringtuca i wsp., (1995). Po wstępnym zmapowaniu regionu występowania locus genu AD3 to 14q24.3, w pobliżu anonimowych markerów mikrosatolitamych D14S43 iD14S53 (Schellenborg i wsp., 1992; St. Goorge-Hyslop i wsp., 1992; Van Broeck^yon i wsp., 1992) użyto dwudziestu jobon rodowodów do ustalenia sposobu segregacji AD jako cechy przypuszczalnie autosumalcie dominującej (St. Georgo-Hyslop i wsp., 1992) i to zbadania segregacji 18 dodatkowych markerów genetycznych z regionu 14q24.3, któro były niezwykle gęsto ułożone na mapie sprzężeń genetycznych (Weissonbach i wsp., 1992; Gyapay i wsp., 1994).
Opublikowana uprzednio analiza maksymalnego prawdopodobieństwa wystąpienia w parzo potwierdziła zasadnicze, zgromadzono dowody na sprzężenie pomiędzy rodzinną postacią choroby Alzheimera (FAD) i wszystkimi tymi markerami. Jebcaęże, większość danych genetycznych potwierdzających sprzężenie z tymi markerami pochodziło z sześciu dużych rodowodów dla wczesnej postaci choroby, FAD1 (Nee i wsp., 1983), FAD2 (Frommolt i wsp., 1991), FAD3 (Goutsmit i wsp., 1981; Pollon, 1993), fAD4 (Foncm i wsp., 1985), ToRi. 1 (Bergamini, 1991) i 603 (Pericak-Vacco i wsp., 1988), z których każdy dostarczał przynajmniej jotcogu anonimowogo markera genetycznego z 14q24.3 (St. Georgo-Hy^op i wsp., 1992).
Colem bardziej precyzyjnego określenia położenia genu AD3 względem znanych lokalizacji markerów genetycznych z 14q24.3, poszukiwano rekombicacyjcynh znaczników poprzez bezpośrednią analizę świeżych tanych dotyczących haplotypów genutypuwαcynh chorych członków sześciu rodzin, wykazujących zdecydowane sprzężenie z chromosomem 14. Ta selektywna strategia w tych szczególnych przykładach stanowczo odrzuca bano dotyczące rekonstruowanych genotypów zmarłych chorych, jak również starszych 0ezu0jawuwych członków , dużych rodzin, i nie uwzględnia małych robzin o niepewnym statusie sprzężeń. Jetnakżo, ta strategia jest bardzo rozsądna, ponieważ równocześnie unika brania pot uwagę potencjalnych wprowadzających w błąt tanych dotyczących genotypów, wynikających z błędów przy rekonstruowaniu genotypów zmarłych chorych członków, biorących się z braku ujnustwa lub błętów oznaczenia lub z włączenia rodowodów nie sprzężonych.
Analiza danych dotyczących haplotypów osób chorych, członków sześciu dużych rodzin, których genotypy zostały bezpośrednio określone, wykazała istnienie nio budzących wątpliwości rekumbicαntów dla D14S48 iD14S53 oraz D14S258 iD14S63. Pojedynczy rekombicact dla D14S53, który określa granicę regionu PAD ot strony tolomoru, występuje u tej samej osoby chorej z rodziny FAD1, u której poprzednio stwierdzono rekombinację bla szeregu innych markerów zlokalizowanych po stronie tolomeru względem D14S53, włączając w to D14S48 (St. Geurge-Hyslup i wsp., 1992). Odwrotnie, pojedynczy rekumbicat bla D14S258, który wyznacza granice regionu PAD od strony centromeru, występuje u chorej osoby z rodziny FAD3, która takżo wykazuje rekombinację tla kilku innych markerów po stronie contromeru względem D14S258, włączając w to D14S63. Dla obu analizowanych rokomOicαntów istniały wyraźno objawy choroby Alzheimera potwierdzone poprzez standartowe tosty klininzce dla choroby w przypadku innych dotkniętych osób z ich robzin, a genotypy obu zrokombicowacych osób były informacyjne i wskazywały na ko-sogrogację tla wielu loci na obcinku leżącym po stronie co-momoru względem D14S53 i tolomeru względem D14S258.
Kioty analizy haplotypów rozszerzono, włączając bo nich zrokucstruuwαce genotypy zmarłych członków sześciu dużych robzin, jak również dane z pozostałych piętnastu rodzin z prawdopodobieństwem sprzężenia mniejszym niż 0,95, wykryto kilka Podatkowych rokombicactów dla jetnego lub więcej markerowych loci na utcicku pomiędzy D14S53 i D14S258. Tak więc, aetec dodatkowy rekombinact został wykryty w zrekonstruowanym genotypie zmarłego członka rodziny w każdej z trzech tużych rodzin FAD (FAD1, FAD2 i innych spo185 549 krewnionych rodzin), a osiem dodatkowych rekombinantów wykryto wśród chorych członków rodzin z siedmiu mniejszych rodzin FAD. Jednakże, jakkolwiek niektóre z tych rekombinantów mogą mieć prawidłowo usytuowany gen AD3 w obrębie określonego regionu docelowego, koniecznym było traktowanie tych potencjalnie bliższych „wewnętrznych rekombinantów” jako mało wiarygodnych, nie tylko z powodu przyczyn dyskutowanych wcześniej, ale również ponieważ dostarczały one wzajemnie niespójnych lokalizacji genu AD3 w obrębie odcinka D14S53-D14S258.
Konstrukcja fizycznie przylegających do siebie fragmentów obejmujących region AD3
Jako wyjściowy krok w kierunku klonowania genu AD3, skonstruowano zbiór nakładających się genomowych fragmentów DNA sklonowanych w wektorach opartych o sztuczne chromosomy drożdży, wektorach fagowych i wektorach kosmidowych. Wyniki mapowania techniką FISH przy zastosowaniu kosmidów pochodzących z klonów YAC 932c7 i 964f5 sugerowały, że odcinek, który najprawdopodobniej przenosił gen AD3 miał wielkość co najmniej pięć megazazad. Ponieważ duży rozmiar tego najmniejszego ke-segregującego regionu mógł uczynić trudnymi strategie klonowania pozycyjnego, poszukiwano dodatkowych wskaźników genetycznych, które zawęziłyby poszukiwania genu AD3 do jednego lub więcej podregionów w obrębie odcinka otoczonego przez D14S53 i D14S258. Analiza haplotypów dla markerów pomiędzy D14S53 iD14S258 nie doprowadziła do uzyskania statystycznie znaczących dowodów na sprzężenie i/lub powiązanie pomiędzy cechą fAd i allelami dla któregokolwiek z tych markerów, niezależnie od tego, czy analiza ograniczała się do rodzin, u których występowały wczesne postaci FAD, czy była prowadzona w szerokim zakresie z uwzględnieniem wszystkich rodzin. Wynik ten nie był zaskoczeniem, biorąc pod uwagę różnice etniczne badanych rodzin. Jednakże, przy porównywaniu rodowodów o podobnym pochodzeniu etnicznym, bezpośrednia analiza haplotypów obserwowanych dla przenoszących chorobę chromosomów, segregujących w różnych rodzinach o podobnym pochodzeniu etnicznym, wykazała dwa zgrupowania loci markerowych. Pierwsze z tych zgrupowań zlokalizowane centromerycznie względem D14S77 (D14S786, D14S277 i D14S268) i rozciągało się na odcinku 0,95 Mb zawartym w YAC 78842. Drugie zgrupowanie zlokalizowane było telomerycznie względem D14S77 (D14S43, D14S273 ÓD14-S78) i rozciągało się na odcinku 1 Mb, znajdującym się w obrębie zachodzących na siebie klonów 964c2, 74163, 797dll i części 854f5. Identyczne allele obserwowano w co najmniej dwóch rodzinach o tym samym pochodzeniu etnicznym. Jako część tej strategii, wyciągnięto wniosek, że obecność wspólnych alleli w jednej z tych grup fizycznie zgrupowanych loci markerowych mogłaby odzwierciedlać wspólne dziedziczenie małego regionu fizycznego otaczającego gen PSI w wyjściowym, założycielskim chromosomie w każdej etnicznej populacji. Znaczące jest, że każdy ze wspólnych rozległych haplotypów był rzadki w normalnej populacji kaukaskiej, a występowania wspólnych alleli nie obserwowano dla innych grup markerów, zajmujących podobny obszar genetyczny gdzie indziej na chromosomie 14q24.3.
Mapowanie transkrypcyjne i analiza genów kandydatów
W celu wyizolowania podlegających ekspresji sekwencji zakodowanych w obu krytycznych odcinkach, zastosowano strategię bezpośredniej selekcji, zakładającą użycie unieruchomionego, sklonowanego, ludzkiego genomowego DNa jako celu hybrydyzacji dla otrzymania transkrybowanych sekwencji z pul pierwotnego komplementarnego DNa pochodzącego z ludzkiego mRNA z mózgu (Rommens i wsp., 1993). Około 900 potencjalnych fragmentów cDNA o wielkości od 100 do 600 par zasad uzyskano z tych regionów. Fragmenty te hybrydyzowano do filtrów Southern zawierających genomowy DNA z każdego z zachodzących na siebie klonów YAC i genomowego DNA z ludzi i innych ssaków. Zidentyfikowano w ten sposób zbiór 151 klonów, które dawały dowody na konserwowanie sekwencji w ewolucji i/lub złożoną strukturę, co sugerowało, że pochodziły ze składanego mRNA. Klony w obrębie tego zbioru porównywano na podstawie położenia na mapie fizycznej, hybrydyzacji krzyżowej i sekwencji nukleotydowej i zastosowano do przeszukania zwykłych ludzkich bibliotek cDNA z mózgu pod kątem dłuższych cDNA. Izolowano co najmniej 19 niezależnych klonów cDNA o długości ponad 1 kb, a następnie dopasowywano do częściowej mapy transkrypcyjnej regionu AD3. Jedynie trzy z tych transkryptów odpowiadają znanym scharakteryzowa36
185 549 nym genom (cFOS, transferaza dihydrolipoamidosukcynylowa i utajone transformujące białko 2 wiążące się z czynnikiem wzrostowym). Izolacja genów kandydatów.
Każdy z fragmentów otwartych ramek odczytu genów kandydatów otrzymano poprzez RT-PCR z mRNA izolowanego po śmierci z tkanki mózgowej zdrowych kontrolnych osobników, bądź z tkanki mózgowej po śmierci lub hodowanych linii komórkowych fibroblastów chorych członków sześciu rodzin powiąoamych definitywnie z chromosomem 14. Produkty RT-PCR przeszukiwano następnie pod kątem różnic w sekwencji przy zastosowaniu metod cięcia chemicznego i analizy polimorfizmu konformacyjnego jednoniciowych sekwencji fragmentów restrykcyjnych (Saleeba i Cotton, 1993; Liu i Sommer, 1^995) lub poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie. Poza jednym wyjątkiem, wszystkie badane geny, jakkolwiek warte zainteresowania, nie zawierały zmian sekwencji, które były unikatowe dla chorych osób lub ko-segregowały z chorobą. Jedynym wyjątkiem był gen kandydat reprezentowany przez klon SI82, który zawierał serie zmian nukleotydowych nie obserwowanych u zdrowych osób, a które, jak przewidywano, zmieniały sekwencję aminokwasową u osób dotkniętych chorobą. Gen odpowiadający temu klonowi został teraz maowamy preze'mllina-1 (PSI). Dwie sekwencje cDNA PSI, reprezentujące warianty alternatywnego składania opisane poniżej, są tu ujawnione jako SEK Nr ID: 1 i SEK NR ID: 3. Odpowiednie przewidziane sekwencje aminokwasów są ujawnione odpowiednio jako SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 4. Klony cDNA zawierające plazmidy BlueScript zostały zdeponowane w ATCC, Rockville, Md, pod Numerami Dostępu ATCC 97124 i 97508, 28 kwietnia, 1995. Sekwencje odpowiadające sekwencjom SEK NR ID: 1 i SEK NR ID: 2 zostały również zdeponowane w bazie danych GeneBank i mogą być znalezione pod Numerem Dostępu #42110.
2. Izolacja mysiego genu prezemiliny-1
Mysi homolog mPSl ludzkiego genu PSI został otrzymany poprzez przeszukanie mysiej biblioteki cDNA wyznakowaną ludzką sondą DNA z genu hPS 1. W ten sposób uzyskano część transkryptu o wielkości 2 kb (reprezentującą koniec 3' genu) i kilka produktów RT-PCR reprezentujących koniec 5'. Sekwemcjomowanie odpowiednich transkryptów cDNA mysiego homologu wykazało istotną zgodność aminokwasów z hPS 1. Co jest ważne, jak przedstawiono szczegółowo poniżej, wszystkie aminokwasy zmutowane w rodzinach FAD były konserwowane między mysim homologiem i prawidłowym ludzkim wariantem. Ta konserwatywność genu PSI wskazuje, że ortologiczny gen występuje u myszy (mPSl) i, że jest teraz możliwe sklonowanie innych ssaczych homologów lub ortologów poprzez przeszukiwanie bibliotek genomowych lub cDNA przy zastosowaniu ludzkich sond PSI. A zatem podobne podejście uczyni możliwym zidentyfikowanie i scharakteryzowanie genu PSI u innych gatunków. Sekwencja nukleotydowa klonu PSI jest ujawniona tutaj jako SEK nR ID: 16, a odpowiednia sekwencja aminokwasowa jest ujawniona jako SEK Nr ID: 17. Obie sekwencje zostały zdeponowane w bazie danych GemeBank i mogą być znalezione pod Numerem Dostępu 42177.
3.Izolacja ludzkiego genu prezemiliny-2
Wyizolowano drugi ludzki gen, obecnie nazwany prezemilina-2 (PS2), i pokazano, że wykazuje on istotną homologię na poziomie nukleotydów i aminokwasów z genem PSI. Dokonana po raz pierwszy izolacja tego genu jest opisana szczegółowo w Rogaev i wsp., (1995). Izolacja ludzkiego genu PS2 (oznaczanego jako „STM2”) prawie identyczna metodą jest również przedstawiona u Levy-Lahad i wsp., (1995). Pokrótce, gen PS2 został zidemtyfϊkowany przy zastosowaniu sekwencji nukleotydowej cDNA dla PSI do przeszukania baz danych przy zastosowaniu programu BLASTN Altschul i wsp., (1990). Znaleziono trzy podlegające ekspresji sekwencje - znaczniki (EST), oznaczone nr dostępu # T03796, RI4600 i R05907, które wykazywały istotną homologię (p < 1,0 e'1<X), większe niż 97% identyczności na odcinku co najmniej 100 kolejnych par zasad).
Na podstawie tych sekwencji wytworzono startery OHgonukleotydowe i zastosowano je do otrzymania produktów PCR poprzez PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR). Te krótkie produkty RT-PCR częściowo zsekwencjonowano dla potwierdzenia ich identyczności z sekwencjami w bazie danych i użyto następnie jako sondy do hybrydyzacji do przeszukiwania bibliotek cDNA pełnej długości. Kilka różnych klonów cDNA, o wielkości w zakresie od
185 549 kb do 2,3 kb uzyskano z biblioteki cDNA z komórek nowotworowych (Caco2) i z biblioteki cDNA z ludzkiego mózgu (ES-1, Gl-1, cc54, cc32). Sekwencja nukleztydzwa tych klonów potwierdziła, że wszystkie pochodziły z tego samego transkryptu.
Gen kodujący transkrypt, gen PS2, zmapowany na ludzkim chrowzszml2 1 przy zastosowaniu paneli do mapowania dla dwóch zestawów klonów CEPH Mega YAC, które zostały umieszczone na mapie fizycznej sąsiadujących fragmentów (klony YAC 750g7, 921dm zmapowane poprzez FiSh do lq41 i klon YAC 787gl2 mapujący się jako Ip36.1-p35). Sekwencja nukl2otydzwa klonu hPS2 jest ujawniona tu jako SEK Nr ID: 18, a odpowiadająca sekwencja aminokwasowa jest ujawniona jako SEK NR ID: 19. Obie sekwencje zostały zdeponowane w bazie danych GeneBank i mogą być znalezione pod numerem dostępu # L44577. Sekwencja DNA klonu hPS2 została również włączona do wektora i zdeponowana w ATCC, Rocryille, MD., pod Nr dostępu ATCC 97214, 28 czerwca, 1995.
4. Identyfikacja homologów z C. cdegans i D. wejanogasttjr
A. SPE-4 z C. elegans
Porównanie kwasów nukleinowych i przewidywanych sekwencji aminzCwasowych PS1 z dostępnymi bazami danych, stosując sposób dopasowywania. BLAST, wykazało pewne podobieństwo amlnzCwaszw2 do wewnątrzbionzw2go białka spermy C. elegans SPE-4 (P=l,5e-25, 24-37% identyczności dla trzech grup co najmniej 50 aminokwasów i słabsze podobieństwo do części kilku innych znajdujących się w błonie białek, włączając w to ssaczą ahrzwzgraninę A i podjednostkę alfa ssaczych kanałów chlorkowych zależnych od napięcia (Altschul i wsp., 1990). Podobieństwa sekwencji aminzkwaszwych w obrębie proypuczazalnych domen transbłznzwzah mogą czasami dawać dopasowanie, które pojawia się po prostu ze względu na ograniczoną liczbę aminokwasów hydrofobowych, ale ma miejsce również rozległe dopasowanie sekwencji pomiędzy PSI i SPE-4 dla kilku domen hydrofilowych. Przewiduje się, że zarówno przypuszczalne białko PSI, jak i SPE-4, mają porównywalną wielkość (odpowiednio, 467 i 465 aminokwasów i, jak opisano dokładnie poniżej, zawierają co najmniej siedem domen transbSznowych z dużą domeną kwaśną poprzedzającą ostatnią przewidywaną domenę transbłonową. Białko PSI ma dłuższy przewidywany region hydrofobowy na końcu N.
Analiza dopasowania BLAST wykryła również znaczącą ^mo^gię pomiędzy PS2 i białkiem SPE-4 C. elegans (p = 3,5e-26; identyczność 20-63% na obszarze 5 domen złożonych z co najmniej 22 aminokwasów), oraz słabe hzwzlzgię do kanałów sodowych w mózgu (podjednostki alfa III) i podjednostki alfa ssaczzah kanałów chlorkowych zależnych od napięcia z różnych gatunków (p = 0,02; identyczność 20-28% na obszarze dwóch lub więcej domen, każda złożona z co najmniej 35 aminokwasów) (Altschul, 1990). Dopasowania te są podobne do opisanych powyżej dla genu PSI.
Sel-m z C. elegans
Stwierdzono, że białko Sel-12 z C. elegans o wielkości 461 aminokwasów i S182 (SEK NR ID: 2) wykazują 48% identyczności sekwencji na odcinku 460 aminokwasów (Leyitan i Greenwald, 1995). Uważa się, że białko Sel-12 posiada również wiele transbłznzwyah domen. Gen Sel-12 (Numer Dostępu U35660) został zidentyfikowany poprzez poszukiwanie supresorów mutacji prowadzącej do zyskania funkcji lin-12 i został sklonowany poprzez przywrócenie funkcji poprzez transformację (Leyitan i Greenwald, 1995).
DwPS z D. melanogaster
Zestaw nukleotydów kodujących wysoce konserwowane regiony prezenilin/białek Sel-12 przygotowano i zastosowano do zidentyfikowania odpowiednich mRNA z osobników dorosłych i zarodków D. weΊaIizgast2r. Te mRNA s ekwencjonowano i wykazano, że zawierają otwartą ramkę odczytu z przypuszczalną sekwencją aminokwasową wysoce homologiczną do sekwencji ludzkich prezenilin. cDNA DmPS jest przedstawione jako SEK NR ID: 20.
Sekwencja ta koduje polipeptyd złożony z 541 aminokwasów (SEK NR ID: 21), wykazujący około 52% identyczności z ludzkimi preo2nllinami.
Struktura homologu D. melanogaster jest podobna do struktury ludzkich prezenilin z co najmniej 7 przypuszczalnymi domenami trancbłznowywl (Analiza hydrofobości Kyt2-Dzzlittle przy zastosowaniu okna 15 i wartości odcięcia 1,5). Wykryto obecność co najmniej jednego
185 549 miejsca alternatywnego składania w tym klonie pDsl3, zawierającym ORF złożoną z 541 aminokwasów, podczas gdy w klonach pds7, pdsl4 i pdsl brakowało nukleotydów
1300-1341. To alternatywne składanie powinno dawać w rezultacie zmianę Gli do Ala dla reszty 384 w przypuszczalnej pętli T6——Ί i fuzję w ramce odczytu z resztą Glu w kodonie 399 dłuższej ORF. Najważniejsze różnice pomiędzy sekwencją aminokwasów D. melanogaster genami ludzkimi dotyczy N-końcowej, kwaśnej domeny i kwaśnej hydrofilowej części pętli T6—»7. Reszty aminokwasowe otaczające pętlę T6-»7 są szczególnie konserwowane (reszty 220-313 i 451-524), co sugeruje, że są one domenami ważnymi funkcjonalnie. Szesnaście spośród dwudziestu reszt amlnbOwasbwych w ludzkim PSI lub PS2, w których zidentyfikowano mutacje, prowadzące do wystąpienia u ludzi FAD, wykazuje konserwację w homologu D. melanogaster.
Sekwencja DNA genu DmPS po sklonowaniu została wstawiona do plazmidu Bluescript. Ten stabilny wektor został zdeponowany w ATCC, Rockville, MD, pod Numerem Dostępu ATCC 97428 w dniu 26 stycznia 1996 roku.
Charakterystyka ludzkich genów prezenilin
Transkrypty hPSl i struktura genu.
Hybrydyzacja klonu PSI (SI82) do filtrów Northern zidentyfikowała transkrypty powstające w wyniku szeroko rozprzestrzenionej ekspresji w wielu obszarach mózgu i tkanek obwodowych, jako transkrypt główny -2,8 kb i transkrypt drugorzędny ~7,5 kb (patrz np. fig.
u Sherrington i wsp., 1995). PSI podlega ekspresji dość jednolicie w większości regionów mózgu i w większości tkanek obwodowych, z wyjątkiem wątroby, gdzie transkrypcja jest niska. Podczas gdy tożsamość transkryptu ~7,5 kb jest niejasna, dwie obserwacje sugerują, że transkrypt -2,8 kb reprezentuje aktywny produkt genu. Hybrydyzacja klonu PSI do filtrów Northern zawierających mRNA z różnych tkanek mysich, włączając w to mózg, identyfikuje jedynie transkrypt identycznych rozmiarów z ludzkim transkryptem -2,8 kb. Wszystkie dotychczas uzyskane dłuższe klony cDNA (2,6-2,8 kb), które obejmują zarówno 5'UTR, jak i 3'UTR, i które składają się na pasmo -2,8 kb na filtrze Northern, mapowały się wyłącznie do tego samego fizycznego regionu chromosomu 14.
Na podstawie tych doświadczeń, transkrypt -7,5 kb mógłby reprezentować bądź rzadką, alternatywnie złożoną lub poliadenylowaną izoformę transkryptu -2,8 kb, bądź mógłby reprezentować inny gen wykazujący homologię do PSI. Biblioteka cDNA z linii komórkowej Caco2, w której zachodzi ekspresja zarówno PSI, jak i PS2 na wysokim poziomie, była przeszukiwana pod kątem dłuższych transkryptów. Otrzymano dwa różne klony, GL40 i B53. SeOwencjbnowanie wykazało, że obydwa klony zawierały podobny 5'UTR i ORF, która była identyczna z ORF z krótszego transkryptu w mózgu.
Obydwa klony zawierały niezwykle długi 3'UTR. Ten długi 3'UTR powstaje w wyniku użycia alternatywnego miejsca poliadenylacji około 3 kb dalej za genem. Ten długi 3'UTR zawiera liczne motywy sekwencji nukleotydowej, które prowadzą do tworzenia palindromów lub wypętlonych struktur Struktury te są związane ze stabilnością mRNA i również wydajnością translacji. Korzyść z tej obserwacji jest taka, że można by tworzyć zrekombinowane konstrukty ekspresyjne i/lub transgeny, w których bliższe miejsce poliadenylacji jest usunięte, forsując tym samym użycie dalszego miejsca poliadenylacji i dłuższy 3'UTR. W niektórych przypadkach może to zwiększać stabilność wybranych klas mRNA, z preferencyjną translacją co mogłoby być zastosowane do zmiany równowagi transkryptów zmutowanych względem typu dzikiego w docelowych liniach komórkowych, lub nawet in vivo w mózgu, bądź poprzez terapię w liniach zarodkowych, bądź jako forma terapii genowej poprzez użycie wektorów wirusowych, takich jak zmodyfikowane wektory w oparciu wirusa opryszczki.
Gen hPSl rozciąga się na odcinku genomu co najmniej 60 kb w obrębie 200 kb klonu PAC1, RCCI-1 54D12, z biblioteki Roswell Park PAC i trzech zachodzących na siebie klonów kosmidowych 57-H10, 1-G9 i 24-D5 z biblioteki kosmidowej LOS Almos Chromosome 14. Transkrypty genu PSI zawierają RNA z 13 eksonów, które zostały zidentyfikowane przez wielokrotną hybrydyzację oligonukleotydów i sond z fragmentami cDNA do klonowanych fragmentów restrykcyjnych PAC i klonów kosmidowych oraz poprzez bezpośrednie ustalenie sekwencji nukleotydowej tych klonów. 5'UTR zawiera się w obrębie eksonów
185 549
1-4, gdzie eksony 1 i 2 reprezentują alternatywne końce 5' transkryptu. ORF jest zawarta w eksonach od 4 do 13, przy czym alternatywne składanie prowadzi w rezultacie do braku części ekso/u 4 i całego eksonu 9. Ekson 13 obejmuje również 3'UTR.
O ile nie ea/nazaoiK) inaczej, wt ro swe o Meeowność i zwięzłowó, wszystkiz odnośnikż do pozycji nuklootndownch w sekwencjach nukleotydowych pochodzących z hPSl będą stosowały numerację zasad z SEK NR ID: 1 (L42110), sekwencji cDNA hPSl rozpoczynającej się od Eksonu 1. W tym cDNA Ekson 1 jest połączony w wyniku skindnnjn bezpośrednio z Eksooom 3, który jest połączony z Eksonami 4-13. W SEK NR ID: 1, Ekson 1 rozciąga się od pozycji nukieotydowoj 1 do 113, Ek^n 3 rozciąga się od pozycji nukleotndnwoj 114 do 195, DEso/ 4 rozciąga się od pozycji 196 do 335, Ekson 5 rozciąga się od pozycji 336 do 586, Eksoo 6 rozciąga się od pozycji 587 do 728, Eksoo 7 rozciąga się od pozycji 729 do 796, Ekszo 8 rozciąga się od pozycji 797 do 1017, Ekson 9 rozciąga się od pozycji 1018 do 1116, Ekson 10 rozciąga się od pozycji 1117 do 1203, DEso/ 11 rozciąga się od pozycji 1204 do 1377, Ekson 12 rozciąga się od pozycji 1378 do 1496, DEson 13 rozciąga się od pozycji 1497 do 2765. Podobnie, o ile nie zaznadzooz inaczej, wszystkie odnośniki do pozycji amjookwasowych w sekwencjach pochodzących z sekwencji białka hPSl, będą stosowały numerację zasad z SEK NR ID: 2, produktu tra/slacji SEK NR ID: 2.
Otrzymano otacz^jące sekwencje genomowe dla Ekso/ów 1-21 i przedstawiono je w SEK nR ID: 5-14 (Numery dostępu L76518-L76527). Sekwencja genomowa po stronie 5' Ekso/u 13 została również ustalona i przedstawiona w SEK nR ID: 15 (Numer dostępu L76528). SEK NR ID: 1-14 również obejmują wszystkie sekwencje eksonowo. SEK NR ID: 15, jednakże, nie zawiera końca 3' Ekso/u 13. Sekwencje genomowe odpowiadające Ekso/om 1 i 2 są umieszczone w odległości 240 par zasad od siebie we fragmeOcie BamHI-HindIII o wielkości 2,6 kb, SEK NR ID: 5. Ekso/y 3 i 4 ( które zawierają kodo/ startu ATG) znajdują się w odrębnym fragmencie BamHI o wielkości 3 kb. Pełna sekwencja I/tronu 2, pomiędzy miejscem BamHI -850 bp po/iżej Esko/u 2 i miejscem BamHI ~600 bp powyżej Esko/u 3 /ie została jeszcze zjdontyfikownon, i nie została bezpośrednio otrzymana poprzez rozległy PCR przy zastosowaniu starterów z otaczających miejsc BamHI, co wskazuje, że I/tron 2 może być duży.
Analiza sekwencji oukieztydowej otaczającej Ekso/ 1 i 2 (SEK NR ID: 5) wykazała obecność licznych dinuklentydów CpG, włączając w to miejsce rostrnkdyjno Notl w I/tronie 1. Sekwencje najwyższej zgodności dla kilku biaiok-aegulatoaów o taa/skanpcji, włączając w to licz/e zgrupowania Białka Aktywatorowegoró (AP-2), Przekaźników Syg/ałów i Aktywatorów Taa/skanpcjj(STAT 3) (Schindler i Damell, 1995), Sekwencji Aktnwatornwndh Gamma (GAS lub STAT1). Leżący poniżej Element wielokrotnego startu (MEDKInce i Scotto, 1995) oraz elementy GC, były obecne znrównz w Intro/ie 1, jak i sekwencji po itronio 5' Ekso/u 1 (patrz SEK nR ID: 5). Dwa potencjalne bloki TATA znajdują się przed Eksonom 1, w pozycjach 935-933 i 978-987 w SEK nR ID: 5, a za nimi są dwie potencjalne sekwencje nąjwnż;soęj zgodności dla rozpoczęcia tanoskaypdjj (CAP lub Chamboo-Trifonov) w pozycjach 1002-1007 i 1038-1043, 484 zasad od SEK nR ID: 5. W przeciwieństwie do tego, sokwondJ’o bezpośrednio za Ekso/em 3 nie mają bloków TATA lub miejsc CAP, ale są wzbogacone w zgrupowania wysp CpG.
Schematyczna mapa strukturalnej orgamoadji ge/u hPSl jest przedstawiona na fig.1. Eksony nie kodujące są zao/adzzne jako jod/zljcjo zacjomnio/o bloki. Eksony kodujące są zaznadzono przez nie zapełnio/e bloki, a alter/atnw/je składane sekwencje przez znkaonknwa/e bloki. Miejsca restrykcyjne są następujące: B = BamHI; E = EcoRI; H = Hi/dIII; N = Notl; P = Pstl; V = PvuII; X = Xbal. Przerwy w poziomych liniach pomiędzy miejscami restrykcyjnymi przedstawiają /ie zdefiniowane sekwencje genomowe. Sklonowane fragmenty ge/omowe zawierające poszczególne ekso/y są przedstawione poprzez dwustronne horyzontalne strzałki. Podana jest iów/ioż wielkość klonów ge/omowych i numer Depozytu dla każdej z genomowych sekwencji.
Przewidywania struktury daugzrzędowej w oparciu o sekwencję nukleotydową w obrębie 290 bp przed Ekso/em 1 i w obrębie Eksonu 1 ujawniło kilka paljodromów o stabilności większej niż 16 kcal/mol. Te analizy struktur daugoazędzwydh przewidziały również obecność
185 549 trzech stabilnych motywów (w pozycjach 1119-1129/1214-1224 bp; U387-K^‘9^//1^^1^-1469 bp;
1422-1429/1508-1515; bp; wszystkie w SEK NR ID: 5), gdzie wielkość pętli była wystarczająca dla otoczenia nukleosomu (~76). Takie struktury łodyżki i pętli są powszechnie występującą cechą genów zawierających TATA (Kollmar i Farnham, 1993).
Podsumowanie własności regionów 5 jest przedstawione w tabeli 1. Wszystkie odnośniki do pozycji zasad są zgodne z SEK NR ID: 5.
Najdłuższa przewidywana otwarta ramka odczytu w SEK NR ID: 1 koduje białko złożone z 467 aminokwasów, SEK NR ED 2. Kodon startowy dla tej otwartej ramki odczytu jest w fazie z pierwszym ATG w fazie, umiejscowionym poniżej kodonu stop TGA. Nie ma klasycznych sekwencji Kozak wokół dwóch kodonów ATG w fazie (Sherrington i wsp., 1995). Tak, jak w przypadku innych genów pozbawionych klasycznych „mocnych” kodonów start, przypuszczalny 5' UTR ludzkich transkryptów jest bogaty w GC.
Alternatywna Transkrypcja i Składanie 5'UTR hSPl
Jakkolwiek pierwsze trzy eksony i część czwartego eksonu zawierają sekwencje nie podlegające translacji, analiza licznych klonów cDNA pełnej długości, izolowanych z biblioteki cDNA z ludzkiego hipokampa (Stratagene, LaJola CA) i z linii komórkowej gruczolakoraka okrężnicy (Caco2 od J. Rommens) wykazała, że w większości klonów początkowe sekwencje pochodziły z Eksonu 3 (Numer Dostępu L42110, SEK NR ID: 1). Zmniejszą częstością (1 z 9 klonów), początkowe transkrybowane sekwencje pochodziły z Eksonu 2 i były połączone poprzez składanie z Eksonem 3 (Numer Dostępu L76517, SEK NR ID: 3). Bezpośrednie ustalenie sekwencji nukleotydowej co najmniej 40 niezależnych transkryptów RT-PCR, izolowanych przy użyciu startera wEksonie 1, nie doprowadziło do zidentyfikowania klonów zawierających zarówno Ekson 1, jak i Ekson 2. Ostatecznie, badanie genomowej sekwencji przed Eksonem 2 nie wykazało sekwencji miejsca składania 5'. Obserwacje te sugerują, że Ekson 2 jest rzeczywistym początkowym eksonem, a nie postacią transkryptów rozpoczynających się w Eksonie 1, powstałą w wyniku alternatywnego składania lub artefaktem klonowania. Ponadto, ponieważ klon (cc44) zawierający Ekson 2 został otrzymany z tych samych monoklonalnych linii Caco2, jest prawdopodobne, że obydwa transkrypty zawierające Ekson występują, w tych samych komórkach.
Aby przetestować przypuszczenie dotyczące miejsc inicjacji transkrypcji w oparciu o sekwencję nukleotydową regionu 5' poprzedzającego Ekson 1, przebadaliśmy końce 5' sekwencji trzech niezależnych klonów cDNA pełnej długości, zawierających Ekson 1 (cc33, cc58, i cc48), i trzy sekwencje uzyskane poprzez wydłużanie startera przy zastosowaniu antysensownego startera zlokalizowanego w Eksonie 3. Największy powstający produkt wydłużania w kierunku 5' obserwowano dla cDNA G40L, co mapowało najdalej położone miejsce startu transkrypcji w pozycji 1214 genomowej sekwencji, zawierającej Ekson 1, SEK NR ID: 5 (L76518), a zatem odpowiadało pozycji -10 w SEK Nr ID: 1. Dwa dodatkowe klony (cDnA cc48 i produkt #5 5' RACE) miały wspólne miejsce startu w pozycji 1259 bp sekwencji genomowej, SEK NR ID: 5, co odpowiada pozycji 34 SEK NR ID: 1. Dwa pozostałe cDNA, jak również pozostałe klony 5' RACE, rozpoczynały się dalej w obrębie Eksonu 1. Klon 5' RACE #8 rozpoczynał się w pozycji 1224 bp, czyli pozycji 1 SEK NR ID: 1. A zatem żaden dla tych klonów nie sięgał do przewidzianego miejsca CAP przed Eksonem 1. Na skutek niskiego poziomu transkryptów, zawierających początkowe sekwencje Eksonu 2, podobne badania ich miejsc startu nie były przeprowadzone.
Alternatywne składanie ORF hSPl
Poza transkryptami z różnymi sekwencjami początkowymi, analiza licznych klonów cDNA uzyskanych z różnych bibliotek ujawniła również dwa warianty transkryptów PSI, które dotyczą ORF.
W pierwszym z nich brakuje 12 nukleotydów z końca 3' Eksonu 4, nukleotydów od 324 do 335 z SEK NR ID: 1. Może być to wynikiem cięcia po nukleotydzie 323 zamiast po 335 przy składaniu Eksonu 4. Transkrypt będący wynikiem takiego alternatywnego składania Eksonu 4 nie koduje aminokwasów Val26-Arg27-Sęr28-Gln29 z SEK NR ID: 2. Transkrypty będące wynikiem takich dwóch alternatywnych sposobów składania Eksonu 4 były wykrywane z mniej więcej równą częstością we wszystkich analizowanych tkankach. Warto zauwa185 549 żyć, biorąc pod uwagę dotychczas zbadane klony, że mysie transkrypty PSI nie zawierają jedynie sekwencji cDNA dla Ile26-Arg27-Ser28-Gln29, a sekwencja dla motywu Val-Arg-Ser-Gln jest jedynie częściowo konserwowana w ludzkim PS2 jako Arg48-Ser49-Gln50 (Rogaev i wsp., 1995). Każda z tych obserwacji sugeruje,że różnice te nie są krytyczne dla prawidłowego działania PSI.
Drugi wariant składania, wpływający na ORF, prowadzi do braku Eksonu 9, nukleotydów od 1018 do 1116 z SEK NR ID: 1. Analiza produktów RT-PCR pochodzących z mRNA z różnorodnych tkanek wykazała, że w mózgu (włączając w to obszary kory nowej zwykle dotknięte przez AD) i kilku innych tkankach (mięśnie, serce, płuca, okrężnica) zachodzi ekspresja głównie pojedynczego transkryptu zawierającego Ekson 9. Z drugiej strony w leukocytach (ale nie limfoblastach) zachodzi również ekspresja mniejszej postaci, nie zawierającej Eksonu 9. Przewiduje się, że alternatywne składanie Eksonu 9 zmienia kwas asparaginowy w pozycji 257 w SEK NR ID: 2 na alaninę, eliminuje następne 33 aminokwasy i prowadzi do powstania fuzji w ramce zresztą białka kodowanego wEksonie 10, rozpoczynającą się od treoniny w pozycji 291.
Transkrypty hPS2
Genomowy DNA obejmujący ludzki gen PS2 nie został jeszcze w pełni scharakteryzowany. Tym niemniej, oczywistych jest wiele podobieństw miedzy genami PSI i PS2. Granice intron/eicson obu genów wydają się być bardzo podobne lub identyczne, z wyjątkiem regionu pętli TM6—»7.
Hybrydyzacja klonów cDNA PS2 do filtrów Northern wykryła pasmo mRNA ~2,3 kb w wielu tkankach, włączając w to regiony mózgu, jak również pasmo ~2,6 mRNA w mięśniach, mięśniu sercowym i trzustce. PS2 ulega ekspresji na stosunkowo niskim poziomie w większości regionów mózgu z wyjątkiem ciała modzelowatego, gdzie transkrypcja jest wysoka. W mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym i trzustce, gen PS2 ulega ekspresji na stosunkowo wyższym poziomie niż w mózgu i jako dwa odrębne transkrypty o wielkości -2,3 kb i -2,6 kb. Oba transkrypty mają wielkość wyraźnie odróżnialną od wielkości 2,7 kb transkryptu PSI i nie hybrydyzują z sondami PSI w ostrych warunkach. Sekwencja cDNA jednego allelu hPS2 jest oznaczona jako SEK NR ID: 18 (Nr Dostępu L44577).
Najdłuższa ORF w obrębie ustalonej sekwencji nukleotydowej cDNA PS2 przewiduje polipeptyd zawierający 448 aminokwasów (SEK NR ID: 19) numerowanych od pierwszego kodonu ATG w fazie, w pozycji 366-368 w SEK NR ID: 18, który jest otoczony przez sekwencje największej zgodności Kozak. Kodon stop znajduje się w pozycji 1712.
Tak samo jak w przypadku PSI, analiza produktów RT-PCR z kilku tkanek, włączając w to RNA z mózgu i mięśni, ujawniła dwa alternatywne warianty składania, w których stosunkowo duży odcinek może ulec wycięciu. A zatem, ze stosunkowo niską częstością wytwarzane są transkrypty, w których nukleotydy 1152-1250 z transkryptu PS2, SEK NR ID: 18 (kodujące aminokwasy 263-295, SEK NR ID: 19) są wycięte w wyniku alternatywnego składania. Jak dyskutowano poniżej, taki sposób składania ściśle odpowiada alternatywnemu składaniu Eksonu 9 PSI (Rogaev i wsp., 1995).
Dodatkowy wariant składania sekwencji cDNA PS2, z brakiem trójki GAA w pozycji nukleotydowej 1338-1340 w SEK NR ID: 18 został również znaleziony we wszystkich analizowanych tkankach. To alternatywne składanie prowadzi w rezultacie do wypadnięcia reszty Glu w pozycji aminokwasowej 325.
Struktura Prezenilin
Rodzina białkowa prezenilin
Ujawniono ostatnio, że prezeniliny stanowią nową rodzinę wysoce konserwowanych, wchodzących w skład błony białek, z wspólnym motywem strukturalnym, wspólnym wzorem alternatywnego składania i wspólnymi regionami występowania mutacji, które korelują z przypuszczalnymi domenami strukturalnymi i które są obecne w komórkach zwierzęcych wielu bezkręgowców i kręgowców. Analiza przewidywanych sekwencji aminokwasowych ludzkich genów prezeniliny przy użyciu algorytmu Hoppa i Woodsa sugeruje, że białka te są białkami błonowymi, z wieloma domenami przechodzącymi przez błonę, podobnie jak receptory, białka kanałowe lub błonowe białka strukturalne. Wykres hydrofo42
185 549 bowości wg Ryto-Doolittlo przypuszczalnego białka hPSl jest przedstawiony na figurze 2. Wykres hydrofoOuwośni i analiza strukturalna sugerują, że to białka mają około siedmiu hydrofobowych domen trαnsbionowynh (opisanych ot TM1 do TM7) rozdzielonych przez hydrofilowo „petle”. Można przewidywać inno modele, zakładające jedynie 5 i aż 10 domen tracsOłocuwynh, w zależności ob parametrów stosowanych w algorytmie przewidywania. Jednakże obecność siedmiu tomon przechodzących przoz błonę jest cechą charakterystyczną kilku klas białek receptorowych G, ale jest również obserwowany bla innych białek (np. białek kanałowych). Warty zauważenia jest brak rozpoznawanego wyraźnego sygnału poptydowego i miejsc glikozylacji.
Sekwencje aminoewasuwe białok hPSl imPSl są porównane na fig. 3, a sekwencjo białok hPS2 i mPS2 są porównane na fig. 4. Na każdej figurze identyczne aminokwasy są zaznaczone poprzez poziome kroski. Sietom przypuszczalnych tracsbiucowych bomon zaznaczono poprzez horyzontalne linio powyżej i poniżej sekwencji.
Główno różnico pomiędzy członkami tej rodziny dotyczą sekwencji aminukwαsuwynh hydrofitowych, kwaśnych domen z pętlą, znajdujących się na końcu N i pomiędzy domniomanymi pomocami TM6 i TM7 prezecihcy (pętla TM6->7).Większość aminokwasów zakodowanych przez EIso- 9 hPSl, który podlega alternatywnemu składaniu w niektórych niecorwowych tkankach, tworzy część dumciemacej pętli TM6—7. Ponadto, obpowiednik alternatywnego wariantu składania zidentyfikowany w hPS2 okazuje się kodować część przypuszczalnej pętli T6->7. Zróżnicowano składacie tej hydrofitowej pętli i fakt, że sekwencja amicokwasuwa pętli różni się między członkami rodzimy goców, sugeruje, że ta pętla stanowi funkcjonalną domenę białka i możo być odpowiedzialna za specyficzność niektórych fizjologicznych i patogennych oddziaływań poszczególnych białok prezemliny. Ponieważ N-końcową, hydrofitowa tomoca ma taki sam kwaśny łatucok, jak hydrofitowa kwaśna pętla, i w modelu z siobmioma tradsOłodowymi bomecami prawdopodobne jest, że ma taką samą orientację w stosunku to 0łuny, a także wykazuje zmienność w obrębie prezenilin, jest barbzo prawtopotobco, żo te dwie Pomocy pełnią taką samą funkcję, bądź w sposób seoortycowany, bądź niezależny (np. takio same lub różne ligandy albo własności fuckcjocalco). A zatem jest prawdopodobno, żo konioc N jest również ważną funkcaunαlną domeną białka i możo być odpowiedzialny za powcą specyficzność oddziaływań fizaulegiczcynh i patogennych poszczególnych prezecilin.
' Jak opisano szczegółowo poniżej, patogenne mutacjo wPSliPS2 są zgrupowane w okolicach Pomocy z pętlą TM1—2 i pętlą TM6—7, dodatkowo sugerując, żo te pomocy są fucecjocalcymi domenami tych białek. Fig. 5 i 6 przedstawiają schematyczne rysunki przewidzianych struktur białek, odpowiednio, PSI i PS2, z zaznaczonymi ca figurze zmamymi miejscami mutacji. Jak pokazano na figurach, przewiduje się, że sekwencja łącząca TMl-»2 znajduje się po przeciwnej stronie błony w stosunku do końca N i pętli TM6->7, i możo być ważna w komucikacji tradsbtonuwęj. Potwierdza to mutacja Y115H w PSI, która była obserwowana w rodzicach z wczesną postacią rodzinnej AD(30-40 lat) i przez dodatkowo mutacje w helisach TM1/2, bla których można oczokiwać, że będą destabilizować pętlę. Pętla TMl—>2 jest stosunkowo krótka (PSI: reszty 101-132; PS2: roszty 107-134), co czyni tą sekwencję osiągalną poprzez kucwoncjunaldą syntezę peptytów. Siedem mutacji PSI grupuje się w rogiocio mniej więcej pomiędzy kodonem 82 i 146, co obejmuje przypuszczalną pierwszą domenę trαcsbtocuwą (TM1), pętlę TM1—2 i domenę TM2 w pSi. Podobnie, mutacja w ^^-ϊο 141 PS2 jest również zlokalizowana w domenie TM2. Mutacje to prawdopodobnie destabilizują tomocę z pętlą TM1— 2 i jej miejsce zakotwiczenia. Dwanaście mutacji PS1 dajo w rezultacie zmianę aminokwasów pomiędzy kodonami 246 i 410, któro tworzą domeny TM6, pętlę TM6-»7 i TM7. Mutacjo to mogą modyfikować strukturę lub stabilność pętli TM6—7 (óątź bezpośrednio, bądź poprzez modyfikację konformacji TM6 lub TM7).
Dalszym dowodom na ważną rolę funkcjonalną pętli TM6—7 jest zróżcicowacio sekwencji w centralnej pętli TM7 (w przybliżeniu pomiędzy aminokwasami ob 300 do 371) w obrębie różnych nzłumków rodziny prozomilin. Podobnie, ponieważ kocioc N sekwencji członków rodzicy prozonilic jest również bardzo zróżcicowany, jest prawdopodobno, żo niewiele różniące się sekwencjo odgrywają rolę w nadawaniu specyficzności fUdkcJumalnoj każ185 549 dej z różnych prezemllim, podczas gdy sekwencje konserwowane są odpowiedzialne za wspólną aktywność biologiczną. Te regiony mogą reprezentować miejsce wiązania ligandów. Jeżeli tak jest, mutacje w regionie TM6->7 prawdopodobnie modyfikują aktywność wiązania ligandów. Pętla TM1—>2, która jest konserwowana w obrębie różnych członków rodziny prezenilin, prawdopodobnie reprezentuje domenę efektorową na przeciwległej stronie błony. Z wyjątkiem mutacji dotyczącej składania Eksonu 10, większość innych mutacji (missens) jest zlokalizowanych po tej samej stronie przypuszcoaimych helis transbłonowych, co sugeruje, że mogą wpływać na wiązanie ligandu lub funkcje kanału. A zatem te domeny (np. pętle TM6—>7, TM1——2 mogą być użyte jako miejsca dla opracowania specyficznych czynników wiążących w celu zahamowania wpływu mutacji i/lub przywrócenia normalnej funkcji prezenilm u osób z chorobą Alzheimera.
Podobieństwo pomiędzy przypuszczalnymi produktami genów SPE-4 C. elegans i PSI sugeruje. że mogą one mieć podobne aktywności. Białko SPE-4 wydaje się być zaangażowane w tworzenie i stabilizację kompleksu włóknistych ciałek błonowych (ang. fibrous body-membranes - FMBO) w czasie spermatogenezy. FMBO jest wyspecjalizowanym organellum pochodzącym z aparatu Golgiego złożonym ze związanych z błoną pęcherzyków przytwierdzonych i częściowo otaczających kompleks włókien białkowych i może uczestniczyć w transporcie i gromadzeniu rozpuszczalnych i związanych z błoną polipeptydów. Mutacje w SPE-4 niszczą kompleksy FBMO i zatrzymują spermatogenezę. A zatem funkcją fizjologiczną SPE-4 może być bądź stabilizacja oddziaływań pomiędzy uwypuklaniem się błony wewnętrznej i fuzją, bądź stabilizacja oddziaływań pomiędzy błoną i białkami fibrylamymi w czasie transportu wewnątrzkomórkowego kompleksu FBMO w czasie spermatogenezy. Podobne funkcje można sobie wyobrazić dla prezenUm. Przykładowo PSI mógłby być zaangażowany bądź w zakotwiczanie się innych, związanych z błoną białek, takich jak PAPP, bądź transport osiowy i zlewanie się oraz wypączkowywanie związanych z błoną pęcherzyków w czasie transportu białek, tak jak to ma miejsce w aparacie Golgiego lub systemie endosom-lizosom. Jeżeli te hipotezy są słuszne, wówczas można się spodziewać, że mutacje będą prowadziły w rezultacie do nieprawidłowego transportu i obróbki PAPP i/lub nieprawidłowych interakcji z białkami cytoszkieletowymi, takimi jak związane z mikrotubulami białko Tau. Nieprawidłowości w wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej lokalizacji zarówno PAPP, jak i Tau, są faktycznie integralną częścią objawów neurofizjologicznych choroby Alzheimera. Jakkolwiek lokalizacja mutacji PSI i PS2 w wysoce konserwowanych resztach aminokwasowych w obrębie konserwowanych domen przypuszczalnego białka sugeruje że są one patogenne, co najmniej trzy z tych mutacji są same konserwatywne, co pozostaje w proporcji z wystąpieniem choroby u osób dorosłych. Ponieważ żadna z obserwowanych dotychczas mutacji nie jest delacjąlub mutacją nonsens, które, jak można się spodziewać powodowałyby całkowitą utratę ekspresji lub funkcji, nie możemy przewidzieć, czy te mutacje będą miały dominujący efekt zyskania funkcji, a zatem prowadzący do nieprawidłowej obróbki pAPP, czy dominujący efekt utraty funkcji, powodujący zatrzymanie prawidłowej obróbki pAPP. Mutacja dotycząca składania Eksonu 10 powoduje fuzję w ramce Eksonu 9 z 10 i może mieć wpływ na skukturę białka PSI, eo mogłoby zmiemać wewnątrzkomórkowy transport lub wiązanie ligandu albo w inny sposób wpływać na funkcję PSI.
Alternatywna możliwość jest taka, że produkt genu PSI może reprezentować receptor lub białko kanałowe. Mutacje w takich białkach są zwykle kojarzone z kilkoma innymi dominującymi chorobami neurologicznymi, zarówno u kręgowców (np. złośliwa hipertemia, hiperkalemiczny okresowy paraliż u ludzi) i u organizmów bezkręgowych (mutanty deg-1 (d) u C. elegans). Jakkolwiek patologia tych chorób nie przypomina choroby Alzheimera, istnieją dane na temat funkcjonalnej nieprawidłowości kanałów jonowych w chorobie Alzheimera. Przykładowo, istnieją doniesienia o anomaliach w kanale potasowym llpS wrażliwym na jony tetraetyloamonowe oraz w homeostazie wapniowej. Perturbacje w przepływie wapnia przez błony mogłyby być w szczególności brane pod uwagę, w świetle słabej homologii pomiędzy PSI i podjednostką a kanałów wapniowych zależnych od napięcia oraz obserwacji, że zwiększenie wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w hodowlach tkankowych może
185 549 odtwarzać niektóre cechy biochemiczne choroby Alzheimera, takie jak zmianę fosforylacji związanego z mikrotubulami białka Tau i zwiększone wytwarzanie peptydów Ap.
Struktura hP S1
Jak pokazano w SEK NR ID: 2, największa znana postać ludzkiego białka PSI zawiera 467 aminokwasów i ma przewidywaną, masę cząsteczkową około 51,37 kD. Wariant, z opisanym powyżej alternatywnym składaniem Eksonu 4 (w którym reszty awlnoCwacowe odpowiadające pozzajow 26-29 w SEK NR ID: 2 są usunięte) zawierałby o 4 aminokwasy mniej i miał masę około 50,93 kD. Podobnie, wariant z opisanym powyżej alternatywnym składaniem Eksonu 9 (w którym reszty aminokwasowe odpowiadające pozycjom 258-290 w SEK NR ID: 2 są usunięte) zawierałby o 33 aminokwasy mniej i miał masę około 47,74 kD.
Pozycja przypuszczalnych domen jest przedstawiona w tabeli 2. Należy ponownie zauważyć, że numerowanie pozycji reszt aminoCwaszwych jest w odniesieniu do SEK NR ID: 2 i je^t: przybllżone (tj. ± 2 reszty aminokwasowe).
Schematyczny rysunek przypuszczalnej struktury PSI jest pokazany na fig. 5. Koniec N jest wysoce hydrofitową ujemnie naładowaną domeną z kilkoma potencjalnymi regionami fosforylacji, za nią następuje hydrofobowa domena przechodząca przez błonę, o wielkości około 19 aminokwasów (TM1), naładowana hydrofilową pętla obejmująca około 32 aminokwasów(TMl->2), pięć dodatkowych hydrofitowych domen przechodzących przez błonę (od TM2 do TM6), oddzielonych krótkimi (1-15 aminokwasów) hydrofitowymi domenami (od TM2—>3 do TM5—>6), dodatkowa dłuższa, kwaśna hydrofilową naładowana pętla (TM6—>7) i co najmniej jedna (TM7), a może dwie inne hydrofobowe domeny, które mogłyby przechodzić przez błonę, a wreszcie polarna domena na końcu C.
Białko zawiera również kilka potencjalnych miejsc fosforylacji, jedno z nich jest miejscem największej zgodności dla kinazy MAP, która jest również zaangażowana w hiperfosforylację Tau w czasie przekształcania się prawidłowego Tau w sploty neurofibrylame. Ta sekwencja najwyższej zgodności może dostarczać domniemanego elementu stanowiącego powiązanie aktywności białka z innymi aspektami choroby Aizh2iwara i reprezentowałaby prawdopodobny cel terapeutyczny. Analiza struktury białka ukazuje dwie sekwencje YTPF (reszty 115-118, SEK NR ID: 2) i STPE (reszty 353-356, SEK NR ID: 2), reprezentujące motyw 5/T-P, który jest sekwencją największej zgodności dla kinazy MAP. Istnieje kilka innych miejsc fosforylacji, z sekwencjami największej zgodności dla aktywności Kinazy Białkowej C (PKC). Ponieważ aktywność PKC jest związana z różnicami w metabolizmie APP, który pozostaje w związku z chorobą Alzheimera, miejsca te w białku PSI i ich homologach są również celem dla leków. Wstępne dane wskazują że proynajwni2j w transf2Cowanzch komórkach, białko PSI jest fosforytowane jedynie w małym stopniu, podczas gdy białko PS2 jest, znacząco fosforytowane. Przynajmniej w przypadku białka PS2 wydaje się, że ta fosforylacja ma miejsce dla seryny w domenie N-końcowej poprzez mechanizm, w którym nie bierze udziału PKC (Capell i wsp., 1996).
Należy zauważyć, że alternatywne składanie na końcu Eksonu 4 usuwa cztery aminokwasy z hydrofitowej, N-końcowej domeny i, jak można się spodziewać, usuwa mi2j'sa2 najwyższej zgodności dla fosforylacji. Dodatkowo, alternatywne składane Eksonu 9 prowadzi w rezultacie do powstania skróconej izoformy białka PSI, w której brakuje pięciu C-końcowych hydrofobowych reszt TM6 i części hydrofitowej, ujemnie naładowanej pętli TM6—>7, bezpośrednio przylegającej do końca C tM6. Ta izoforma, powstała poprzez alternatywne składanie, charakteryzuje się zachowaniem sekwencji z końca N aż do tyrozyny w pozycji 256 w SEK NR ID: 2, omieniająa asparaginian w pozycji 257 na alaninę i dołączając ją do C-końcowej części białka od tyrozyny 291 włącznie. Takie różnice w składaniu często pozostają w powiązaniu z ważnymi domenami funkcjonalnymi białek. Przemawia to za tym, że hydrofilową pętla (i konsekwentnie N-końcową hydrofitową pętla o podobnym ładunku! aminokwasów) jest/są funkcjznalnzmπ domenami produktu PSI, a zatem wlejsaawl docelowymi dla leków.
Struktura ludzkiego PS2
Ludzkie białka PS1 i PS2 wykazują, ogólnie ponad 63% identyczności na poziomie aminokwasów, a kilka domen wykazuje faktycznie pełną identyczność. A zatem, jak można
185 549 się spodziewać, analiza hydrofobowości sugeruje, że obydwa białka mają również wspólną organizację strukturalną. Tak więc przewiduje się, że oba białka posiadają siedem domniemanych hydrofobowych transbłonowych domen i oba białka zawierają duże kwaśne hydrofitowe domeny na końcu N oraz pomiędzy TM6 i TM7. Dalsze podobieństwo było jasne na podstawie powyżej opisanej analizy produktów RT-PCR z RNA z mózgu i mięśni, która wykazała, że nukleotydy 1153-1250 transkryptu PS2 są alternatywnie składane. Nukleotydy te kodują aminokwasy 263-296, które są zlokalizowane w domenie pętli TM6—>7 przypuszczalnego białka PS2 i wykazują 94% identyczności sekwencji z alternatywnie składanymi aminokwasami 257-290 w PSI.
Pozycja przypuszczalnych domen funkcjonalnych w białku hPS2 jest opisana w tabeli 3. Należy zauważyć, że pozycje reszt aminokwasowych odnoszą się do pozycji aminokwasów w SEK NR ID: 9 i pozycje te są przybliżone (tj. ± 2 reszty aminokwasowe).
Schematyczny rysunek przypuszczalnej struktury PS2 jest pokazany na fig 6. Podobieństwo pomiędzy hPSl i hPS2 jest największe dla kilku domen białka, odpowiadających odcinkom między TM1 iTM6 i od TM7 do końca C białka PSI. Główne różnice pomiędzy hPSl i hPS2 dotyczą wielkości i sekwencji aminokwasowych ujemnie naładowanych hydrofitowych pętli TM6——7 oraz sekwencji N-końcowych domen hydrofitowych.
Najbardziej widoczne różnice pomiędzy dwiema przewidywanymi sekwencjami aminokwasowymi występują w sekwencji aminokwasowej w centralnej części hydrofilowej pętli TM6—7 (reszty 304-374 whPSl; 310-355 whPS2) iwN-końcowej domenie hydrofitowej. Przez analogię, domena ta jest również mniej konserwowana między mysimi i ludzkimi genami PSI (identyczność = 47/60 reszt amniokwasowych) i nie wykazuje podobieństwa do odpowiedniego regionu SPE-4.
Mutanty prezenilin
Mutanty PSI
Zidentyfikowano kilka mutacji w genie PSI, które powodują poważne typy rodzinnej choroby Alzheimera. Jedna, albo kombinacja tych mutacji może być odpowiedzialna za tą postać choroby Alzheimera, jak również kilku innych chorób neurologicznych. Mutacjami mogą być dowolne typy podstawień, insercji lub delecji w sekwencji nukleotydowej, które prowadzą do zmiany w przewidywanej sekwencji aminokwasowej lub, które prowadzą do nieprawidłowej obróbki, poziomu lub stabilności transkryptu. Specyficzne, powodujące chorobę mutacje w postaci delecji lub podstawień nukleotydowych i/lub aminokwasowych są opisane poniżej, ale przewiduje się, że dodatkowe mutacje będą znalezione w innych rodzinach. Rzeczywiście, po wyjściowym odkryciu pięciu różnych mutacji missens wśród ośmiu różnych rodzin (Sherrington i wsp., 1995) oczekiwano, na podstawie doświadczenia z innymi chorobami dziedzicznymi (np. amylotropową boczną sklerozą związaną z mutacjami w genie dysmutazy ponadtlenkowej Ca2+), że będą zidentyfikowane dodatkowe mutacje. To oczekiwanie zostało spełnione przez nasze następujące po tym odkrycie dodatkowych mutacji w prezenilinach (Rogaev i wsp., 1995) i przez podobne obserwacje poczynione przez innych (np. Cruts i wsp., 1995, Campion i wsp., 1995). A zatem, stosowany tu odniesieniu do genów i białek PSI termin „zmutowany” nńe ogranicza się do tych konkretnych mutaejj, ale raczej, ma być interpretowany jak zdefiniowano powyżej. Bezpośrednie sekwencjonowanie zachodzących na siebie produktów RT-PCR obejmujących transkrypt S182 o wielkości 2,8 kb, izolowany z chorych przedstawicieli sześciu dużych rodzin związanych z chromosomem 14, doprowadziła wyjściowo do odkrycia pięciu mutacji missens w każdej z sześciu rodzin. Każda z tych mutacji kosegregowała z chorobą w odpowiednich rodzinach i była nieobecna w ponad 142 nie spokrewnionych neurologicznie zdrowych osób pochodzących z tej samej grupy etnicznej, co rodziny FAD (284 nie spokrewnione chromosomy). Położenie genu w obrębie fizycznego odcinka segregującego z cechą AD, obecność ośmiu różnych mutacji missens, które kosegregowały z chorobą w sześciu rodzinach, związanych w sposób rozstrzygający z chromosomem 14, i brak tych mutacji w 284 niezależnych prawidłowych chromosomach, łącznie potwierdziło, że gen PSI stanowi locus AD3. Dalsze potwierdzenie biologiczne tej hipotezy pochodziło z faktów, że zmutowane reszty aminokwasowe w rodzinach z FAD są konserwowane w ewolucji (np. hPSl względem mPSl), że mutacje są zlokalizowa46
185 549 ne w domenach białka, które są również wysoce konserwowane u innych homologów kręgowców i bezkręgowców oraz, że produkt geny PSI podlega ekspresji na wysokich poziomach w większości regionów mózgu, włączając w to najbardziej dotknięte przez AD.
Od pierwszego ujawnienia genu PSI, zakatalogowano wiele dodatkowych mutacji związanych z rozwojem AD. Tabela 4 charakteryzuje kilka z nich. Każda z obserwowanych delecji lub podstawień nukleotydowych miała miejsce w obrębie przypuszczalnej ORF transkryptu PSI i przewiduje się, że zmienia zakodowany aminokwas w pokazanej pozycji. Mutacje są wymienione w odniesieniu do ich pozycji nukleotydowej w SEK NR ID: 1 i w odniesieniu do pozycji aminokwasowej SEK NR ID: 2. „NA” oznacza, że dane nie były dostępne.
Jak przedyskutowano w następnej sekcji, ujawniono liczne mutacje PS2. Porównanie sekwencji hPSl i hPS2 jest przedstawione na figurze 4 i pokazuje, że te patogenne mutacje znajdują się w regionach białka PS2, które są konserwowane w białku PSI. Dlatego oczekuje się, że odpowiednie mutacje w białku PSI będą patogenne i są one dołączone do dostarczonych i udostępnionych tutaj mutantów PSI. Ponadto, można przypuszczać, że dowolna patogenna mutacja zidentyfikowana w dowolnym konserwowanym regionie genu prezeniliny będzie reprezentować mutanta · innych prezenilin, które również zawierają ten konserwowany region.
Co jest interesujące, wszystkie mutacje, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286Y, A291-319, G384A, L392V i C410Y, występują w lub blisko kwaśnej pętli hydrofilowej pomiędzy domniemanymi domenami transbłonowymi TM 6 i TM7. Osiem z tych mutacji (A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280A, E280G, A285V, L286V) jest także położonych w domenie związanej z alternatywnym składaniem (reszty 257-290 w SEK NR ID: 2).
Wszystkie te mutacje mogą być testowane na różne sposoby (bezpośrednie sekwencjonowanie nukleotydów, oligonukleotydy specyficzne dla allelu, reakcja łańcuchowa ligazy, SSCP, RFLP, nowe technologie z „mikroprocesorem DNA” itd.) stosując produkty RT-PCR przedstawiające dojrzałe sekwencje mRNA/cDNA lub DNA genomowy.
W końcu, należy odnotować, że odkryto również szereg polimorfizmów bez widocznego efektu szkodliwego. Jeden z nich, zmiana T—»G w nukleotydzie 863 w SEK NR ID: 1, jest przyczyną polimorfizmu F205L wTM4. Inne (C—»A w pozycji nukleotydowej 1700; G—»A w pozycji nukleofeydowej 2603; delecją w pozycji nukleotydowej 2620) występują także w 3'UTR.
B. Mutanty PS2
Silne podobieństwo pomiędzy produktami genowymi PSI i PS2 zwiększyło prawdopodbbieństwb, że gen PS2 może być miejscem mutacji powodujących chorobę w niektórych z nielicznych rodzin z wczesną postacią AD, w których badania sprzężenia genetycznego wykluczyły chromosomy 14, 19, i 21. RT-PCR zastosowano do izolacji DNA odpowiadającego transkryptowi PS2 z limfoblastów, fibroblastów lub pośmiertnych tkanek mózgu chorych przedstawicieli ośmiu rodzin z wczesną postacią FAD, w których mutacje w genach PAPP I PSI były poprzednio wykluczone poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie.
Badania tych produktów RT-PCR wykryły heterozygotyczne podstawienie A——G dla nukleotydu 1080 u wszystkich czterech chorych członków rozległej rodziny pochodzenia włoskiego (FlolO) z wczesną postacią patologicznie potwierdzonej FAD (wiek wykrycia 50-70 lat). Można przewidywać, że ta mutacja jest przyczyną mutacji missens Met-»Val w kodonie 239 w tM5.
Drugą mutację (A—>T pozycji nukleotydowej 787), powodującą podstawienie Ans——Ile w kodonie 141 w TM2, znaleziono u chorych członków grupy spokrewnionych rodzin pochodzących od Niemców Nadwołżańskich (reprezentowanych przez linie komórkowe AG09369, AG09907, AG09952, iAG09905, Corriel Institute, Cadmen NJ). Znaczące jest, że jedna z osób (AG09907) była homozygotyczna pod względem tej mutacji, co stanowi obserwację zgodną z wsobnym charakterem tych rodowodów. Istotne jest, że osoba ta nie wykuje znacząco różniącego się obrazu klinicznego od osób heterozygotycznych pod względem mutacji NI4II. Żadna z mutacji w genie PS2 nie była znaleziona u zdrowych osobników kontrolnych pochodzenia kaukaskiego ani nie była obecna u chorych członków rodzin z typem AD3 AD.
185 549
Można przewidywać, że obydwie te mutacje będą powodowały podstawienia reszt ami^kwasowych, które są silnie konserwowane w obrębie rodziny genów P1/P2.
Dodatkowa mutacja PS2 jest powodowana podstawieniem w pozycji nukleotydowej
1624, powodując substytucję Ile do Thr w kodonie 420 na końcu C. Ta mutacja została znaleziona w jeszcze jednym przypadku wczesnej postaci (45 lat) rodzinnej AD.
Te mutacje hSP2 są wymienione w tabeli 5, z odniesieniem do ich pozycji nukleotydowej w SEK NR ID: 18 i z odniesieniem do ich pozycji aminokwasowej w SEK NR ID: 19. Oznaczenie „NA” w tabeli wskazuje, że dane nie były dostępne.
Jak przedyskutowano w poprzedniej sekcji, znaleziono liczne mutacji PS2. Porównanie sekwencji hPSl i hPS2 jest przedstawione na figurze 4 i pokazuje, że te patogenne mutacje znajdują się w regionach białka PSI, które są konserwowane w białku PS2. Dlatego oczekuje się, że odpowiednie mutacje w białku PS2 będą patogenne i są one dołączone do dostarczonych i udostępnionych tutaj mutantów PS2. Ponadto, można przypuszczać, że dowolna patogenna mutacja zidentyfikowana w dowolnym konserwowanym regionie genu prezeniliny będzie reprezentować mutanta innych prezenilin, które również zawierają ten konserwowany region.
Znalezienie genu, którego produkt, jak można przewidzieć, wykazuje zasadnicze podobieństwo aminokwasowe i strukturalne z produktem genu PSI, sugeruje, że te białka mogą być funkcjonalnie pokrewne jako niezależne białka o nakładających się funkcjach, ale być może z nieznacznie różniącymi się aktywnościami specyficznymi, jako fizycznie połączone podjednostki polipeptydów multimerycznych lub jako niezależne białka pełniące następujące po sobie funkcje w tym samym szlaku.
Zaobserwowanie trzech różnych mutacji missens w konserwowanych domenach białka PS2 u osób z rodziną formą AD przemawia za tym, że mutacje te są, podobnie do tych w PSI, przyczyną AD. Wniosek ten jest znaczący, ponieważ, jakkolwiek fenotyp choroby związany z mutacjami w genie PSI (wystąpienie objawów 30-50 lat, czas trwania 10 lat) wykazuje niewielkie różnice w porównaniu z fenotypem związanym z mutacjami w genie PS2 (wystąpienie objawów 40-70 lat, czas trwania do 20 lat), ogólne podobieństwo wyraźne podobieństwo wyraźnie przemawia za tym, że szlak biochemiczny przeprowadzany przez członków tej rodziny genów, ma zasadnicze znaczenie dla genezy przynajmniej wczesnej postaci AD. Subtelne różnice w fenotypie choroby mogą odzwierciedlać niższy poziom ekspresji transkryptu PS2 w CNS, lub mogą odzwierciedlać odmienną rolę produktu genu PS2.
Przez analogię z efektami mutacji PSI, PS2 po zmutowaniu może być przyczyną błędnej obróbki APP (białko prekursora amyloidu) do peptydu Ap, hiperfosforylacji białka Tau związanego z mikrotubulami i nieprawidłowości w wewnątrzkomórkowej homeostazie wapnia. Przeszkadzanie w tych nieprawidłowych oddziaływaniach stanowi możliwość interwencji terapeutycznych w AD.
W końcu, znaleziono co najmniej jeden polimorfizm nuklektydowy u jednej zdrowej osoby, której cDNA PS2 ma zmianę C—>T w pozycji nuklektydowej 626 bp w SEK NR ID: 18, bez jakiejkolwiek zmiany w kodowanej sekwencji aminokwasów.
III. Korzystne wykonania
W oparciu, po części, na odkryciach zamieszczonych i opisanych tutaj, dostarczone są następujące korzystne wykonania niniejszego wynalazku.
1. Wyizolowane kwasy nukleinowe
Wynalazek dostarcza wyizolowanych kwasów nukleinowych odpowiadających lub spokrewnionych z ujawnionymi tu sekwencjami nukleinowymi prezenilin. Jak opisano pełniej poniżej, sekwencje te obejmują prawidłowe sekwencje PSI i PS2 z człowieka i innych gatunków ssaków, zmutowane sekwencje PSI i PS2 z człowieka i innych gatunków ssaków, homologiczne sekwencje z gatunków nie będących ssakami, takich jak Drosophila i C. elegans, części tych sekwencji użytecznych jako sondy i startery PCR, części tych sekwencji kodujące fragmenty prezenilin lub odpowiadające poszczególnym domenom strukturalnym lub regionom pelimorficznym, sekwencje komplementarne lub antysensowne, odpowiadające fragmentom genów prezenilin, sekwencje, w których regiony kodujące prezenilin zostały połączone w sposób funkcjonalny z egzogennymi regionami regulatorowymi oraz sekwencje ko48
185 549 dujące fuzje białkowe części prezenilin połączonych z innymi białkami przydatnymi jako wskaźniki ekspresji, jako „etykietki” do oczyszczania lub przy poszukiwaniu lub testach pod kątem białek oddziaływujących z prezenilinami.
A zatem dostarczone są wyizolowane kwasy nukleinowe, które kodują prawidłową lub zmutowaną wersję białek PSI i PS2. Przykłady takich sekwencji kwasów nukleinowych są ujawnione tutaj. Te kwasy nukleinowe mogą być sekwencjami genomowymi (np. SEK NR ID: 5-15) lub mogą być sekwencjami cDNA (np. SEK NR ID: 1, 3, 16 i 18). Ponadto, kwasy nukleinowe mogą być genami zrekombimowamymi lub „minigenami”, w których wszystkie lub niektóre introny są usunięte. Można stworzyć różne kombinacje imtromów i eksonów z obecnymi tam elementami regulatorowymi działającymi w układzie cis, przy wytwarzaniu konstruktów lub wektorów do mammαżamia lub ekspresji. A zatem, przykładowo, wynalazek dostarcza sekwencji kwasów nukleinowych, w których opisane tu warianty alternatywnego składania są włączone do DNA, umożliwiając w ten sposób komórce zawierającej te sekwencje wyrażanie jedynie jednego wariantu alternatywnego składania dla każdego z miejsc składania. Przykładowo, można wytworzyć zrekombmowany gen, w którym koniec 3' Eksonu 1 genu PSI (pozycja nukleotydowa 1337 w SEK NR ID: 5) został przyłączony bezpośrednio do końca 5' Eksonu 3 (pozycja nukleotydowa 588 z SEK Nr ID: 6), a zatem wytwarzane są jedynie transkrypty odpowiadające głównemu transkryptowi. Jest oczywiste, że można również wytworzyć zrekombinowany gen „forsując” alternatywne składanie Eksonu 2 i Eksonu 3. Podobnie można wytworzyć zrekombmowany gen, w którym jeden z wariantów składania eksonów PSI, Eksonu 4 lub Eksonu 9, (lub odpowiadający mu wariant składania PS2 TM6->7), jest wstawiony do DNA w taki sposób, że komórki zawierające ten zrekombinowany gen mogą wyrażać jeden z tych wariantów. W celu zmniejszenia rozmiaru zrekombinowanego genu prezeniliny, można użyć cDNA genu lub można usunąć z konstruktu DNA różne kombinacje intronów i nie podlegających translacji eksonów. W końcu, można wytworzyć zrekombinowame geny, w których 5' UTR jest zmieniony w taki sposób, że transkrypcja zachodzi wyłącznie z jednego lub z drugiego, spośród dwóch miejsc inicjacji. Takie konstrukty mogą być szczególnie użyteczne, jak opisano poniżej, przy identyfikowaniu związków, które mogą indukować lub hamować ekspresję prezenilin. Udostępnionych teraz będzie wiele wariantów tych wykonań poprzez szczegółowy opis dostarczonych tu genów prezenUm.
Dodatkowo, oprócz ujawnionych sekwencji prezeniliny, biegły w tej dziedzinie, będzie teraz miał możliwość identyfikowania i izolowania kwasów nukleinowych reprezentujących geny lub cDNA prezenilin, które są alleliczme do ujawnionych sekwencji lub które są ich odmiennymi gatunkowo homologami. A zatem, obecny wynalazek dostarcza wyizolowanych kwasów nukleinowych odpowiadających tym allelom i homologom, jak również różnym, wyżej opisanym, zrekombimowamy konstruktom pochodzącym z tych sekwencji, przy zastosowaniu sposobami, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Pokrótce, biegły w tej dziedzinie może obecnie przeszukiwać preparaty genomowego DNA lub cDNA, włączając w to próbki otrzymane z poszczególnych organizmów (np. chorych ludzi z AD lub członków ich rodzin), jak również bibliotek genomowych lub cDNA bakteryjnych, wirusowych, drożdżowych lub innych, stosując sondy lub startery PCR do identyfikacji sekwencji alleliconych lub homologicznych. Ponieważ jest pożądaną identyfikacja dodatkowych mutacji genu prezenilmy, które mogą być odpowiedzialne za rozwój AD lub innych chorób, ponieważ jest pożądaną identyfikacja dodatkowych polimorfizmów prezenilm, które nie są patogenne, i ponieważ jest także pożądanym stworzenie różnych modeli zwierzęcych, które mogą być użyte do badania AD i poszukiwania potencjalnych leków, jest szczególnie istotne, żeby wyizolować dodatkowe sekwencje prezemlin z innych preparatów lub bibliotek ludzkich kwasów nukleinowych albo z preparatów lub bibliotek ze zwierząt, włączając w to szczury, myszy, chomiki, świnki morskie, króliki, psy, koty, kozy, owce, świnie, i naczelne z wyłączeniem człowieka. Ponadto, homologi prezenUm z drożdży lub gatunków bezkręgowców, włączając w to C. elegans i inne miciemie, jak również Drosophila i imre owady, mogą być szczególnie użyteczne przy poszukiwaniu lekarstw. Przykładowo, bezkręgowce zawierające zmutowane homologi prezenilm (lub trarnsgeny ssaczych prezenilin), które powodują szybko występujące i łatwo wyróżnialme fenotypy (np. widoczny po kilku dniach nieprawidłowy rozwój otworu płciowego lub oka),
185 549 mogą być użyte do poszukiwania lekarstw, które blokują efekty zmutowanego genu. Takie bezkręgowce mogą okazać się dużo lepsze do szybszych i wndąj/iojszydh, prowadzonych na dużą skalę poszukiwań, niż większe zwierzęta kręgowe.
Standardowe poszukiwania poprzez hybrydyzację lub techniki PCR mogą być prowadzone (co zastosowano na przykład, przy identyfikacji genu mPSl) w celu identyfikacji i/lub izolacji takich sekwencji allolicz/nch i homologicznych, stosując stosunkowo krótkie sekwencje ge/u paozomimn'. Sekwencje mogą obejmować 8 lub mniej nukleotydów w zależności od natury sekwencji docelowej, stosowanej metody oraz wymaganej spocyfidz/zścj. Przyszły rozwój todhoologidz/y może umożliwić korzystne zastosowanie nawet krótszych sekwencji. Przy obecnej technologii korzystne są sekwencje 9-50 /uklootydów, a korzystniejsze około 18-24. Sekwencje te mogą być wybrane spośród ujawnionych tutaj lub mogą pochodzić z j/ondh udostępnionych tutaj homologów alloijczoych lub odmiennych gatunkowo. Przy badaniu mRNA lub przeszukiwaniu bibliotek cDNA korzystniej jest stosować so/dy i startery z sekwencji kodującej (niż z i/tronów), a zwykle unika się sekwoodji, których brakuje w alternatywnie składanych wariantach, o ile /ie jest konkretnie pożądana identyfikacja tych wariantów. Można się spodziewać, że waria/ty allelicz/o genów paozooilio będą hybrydnoowałn do ujawnionych sekwencji w ostrych warunkach hybrydyzacji, takich jakie są tutaj odefmjowaoe, podczas gdy łagodniejsze warunki mogą być zastosowane do idootnfjkndjj homologów odmje//ndh gatunkowo.
Ponadto wynalazek dostarcza izolowa/ych kwasów nukleinowych, które obejmują część iekwoocjj paezoojlin lub sekwencje do /ich komplementarne. Jak zaonadzooo powyżej takie sekwencje będą miały zastosowanie jako so/dy i startery PCR do identyfikacji i izolacji nlleljdznych i homologicznych wariantów genów preoeojlio. Części sekwencji odpowiadające regionom polimoafjczonm preze/ilin, jak opisano powyżej, będą miały również szczególne zastosowanie przy przeszukiwaniu i/lub ustalaniu genotypu osobników dla celów diagnostycznych, jak opisano powyżej. Dodatkowo, rów/ież jak opisano powyżej, takie części będą miały zastosowanie do kodowania (1) fragmentów piozozIIIo do wstawienia do fuzji białkowych, (2) fragmentów, które zawierają funkcjonal/e domeny proze/iljo do zastosowania w badaniach wiązania, (3) fragmentów preze/ilin, które mogą być zastosowane jako immunogenn do wytworzenia przeciwciał przeciw paozo/iljoom i (4) fragmentów prezoojli/, które mogą działać jako inhibitory współzawodniczące lub mogą upodabniać się do paezezjljz, aby hamować lub naśladować ich funkcje fizjologiczne. W końcu, takie części mogą kodować lub reprezentować sekwencje komplementarne lub azntiozsowne, które mogą h^^d^ować go ge/ów prezenilin lub tra/skryptów mRNA paezeoiljo w warunkach fiojolngjcozndh, w celu zahamowania taazskaypcji lub translacji tych sekwencji. A zatem, w zależności od zamioaoonego zastosowania, moiojszn wynalazek dostarcza sekwencji kwasów nukleinowych będących częścią genów prozeniliz, których wielkość może wahać się od 8-10 nukleotydów (np. przy zastosowaniu jako starter do PCR), do prawie pełnej długości go/omowogo DNA lub cDNA prezenilm. A zatem, ziziejszn wynalazek dostarcza izolowanych kwasów /ukloioowych zawierających sekwencje odpowiadające co najmniej 8-10, koaznstnjoj 15, a nąjknazystzjęj co oajm/joj 20 kolejnym nukleztydom z genów paeze/jlio, jak ujawniono lub w inzn sposób udostępniono tutaj, lub sekwencjom do nich komplementarnym. Jednakże, jak zaozadoonn powyżej, krótsze sekwencje mogą być przydatne w róż/ych technologiach.
Nizjoj'szn wynalazek dostarcza kwasów /ukiejozwndh, w których sekwencje kodujące prezo/iliny, z i/tro/ami lub bez, lub podda/e zabiegom izżnzjoril ge/etycznej jak opisano powyżej, są połączone w sposób fuokcjoonion z eodzgenonmj lub egoogenznmi regionami regulatorowymi 5' i/lub 3'. Ezdogozze regiony regulatorowe genu hSPl są tutaj opisane i ujawnione w szczegółach. Stosując /j/iojszo ujawnienie i standardowe techniki gozetydzzo (/p. wydłużanie w reakcji PCR, docelowe kaodzonjo po gonie) biegły w tej dziodzizio może teraz klonować również odpowiednie ozdogenoe rogio/y regulacyjne 5' i/lub 3' hPS2. Podobnie, warianty an-licz/e oodogo/onch regionów regulatorowych, jak również o/dogen/o regiony regulatorowe z ioondh kaczych homologów są w podobnym stopniu dostępno boz przeprowadzania zbędnych eksperymentów. Alternatywnie, egzogo/ne rogio/y regulatorowe (tj. aegjooy regulatorowe z róż/ych ge/ów z tego samego gatunku lub aogio/n regulatorowe
185 549 odmienne gatunkowo) mogą być połączone w sposób funkcjonalny z sekwencjami kodującymi prezeniliny w celu kierowania ekspresją. Odpowiednie regiony regulatorowe 5' będą obejmowały elementy promotorowe i mogą również obejmować dodatkowe elementy, takie jak sekwencje operatora lub wzmacniacza, sekwencje dla wiązania rybosomu, sekwencje dla dołączania czapeczki i temu podobne. Region regulatorowy może być wybrany z sekwencji, które kontrolują ekspresję genów w komórkach przCariotzcznych lub eukariotycznych, ich wirusów i kombinacji jednych i drugich. Takie regiony regulatorowe obejmują między innymi, system lac, system trp, system tac, system trc; regiony głównego operatora i promotora faga X; region kontrolny białka płaszcza fd; wczesny i późny promotor SV40; promotory pochodzące z polioma, adenowirusa, retrowirusa, bakulowirusa i wirusa małpiego; promotor kinazy 3lfosfoglicerznzwej, promotory kwaśnej fosfatazy drożdżowej, drożdżowe czynniki płciowe alfa, elementy prowojorowe innych genów eukariotycznych podlegających ekspresji w neuronach lub innych typach komórek i ich kombinacja. W szczególności, można wybrać elementy regulatorowe, które podlegają indukcji lub represji (np. promotor p-galaCtzzydaoy) dla umożliwienia kontrolowanej i/lub podatnej na manipulacje ekspresji genów prezenilin w komórkach transformowanych tymi kwasami nukleinowymi. Alternatywnie, regiony kodujące prezenilin mogą być połączone w sposób funkcjonalny z regionami regulatorowymi, które dają ekspresję specyficzną tkankowo w organizmach wielokomórkowych. Takie konstrukty są szczególnie przydatne przy wytwarzaniu prezeniliny w organizmach jransgeniczych do powodowania ekspresji genów prezeniliny jedynie w odpowiednich tkankach. Wybór odpowiednich regionów regulatorowych pozostaje w zakresie możliwości i swobody biegłego w tej dziedzinie i stosowanie wielu takich regionów regulatorowych poprzez rekombinowanie DNA jest obecnie powszechne w tej dziedzinie.
Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych kwasów nukleinowych kodujących całe lub część białek prezenilin w postaci fuzji białkowej. W tych wykonaniach, kwas nukleinowy stanowiący region regulatorowy (egzo-genny lub endogenny) jest połączony w sposób funkcjonalny z pierwszym regionem kodującym, który jest kowalencyjnie połączony w ramce z jednym lub większą liczbą dodatkowych regionów kodujących, a ostatni region kodujący jest połączony z kodonem termlnacyjnzw i, ewentualnie, odpowiednimi regionami regulatorowymi 5' (np. sygnałami poliadenylacji). Sekwencje prezenilin w fuzjach białkowych mogą reprezentować pierwszy, drugi i dowolne dodatkowe regiony kodujące. Sekwencjami prezenilin mogą być domeny konserwowane lub ni2kznserwowane i mogą być one umieszczone w dowolnym regionie kodującym fuzji. Sekwencje nie pochodzące z prezenilin w fuzji mogą być wybrane zgodnie z potrzebami i przy zachowaniu swobody biegłego i nie są ograniczone przez niniejszy wynalazek. Przydatne sekwencje nieprezenilinowe obejmują między innymi krótkie sekwencje „etykietek”, takich jak determinanty antygenowe lub znaczniki poli-His, które mogą być stosowane dla ułatwienia identyfikacji lub oczyszczania otroywanej w rezultacie fuzji białkowej. Alternatywnie, region kodujący niepreoeniiinowy może kodować duże białko lub fragment białka, taki jak enzym lub białko wiążące, które również może uczestniczyć przy identyfikacji lub oczyszczaniu białka, lub które może być użyteczne w testach takich, jak te opisane poniżej. Szczególnie brane pod uwagę fuzje białkowe prezenilin obejmują ftizje z poli-His i GST (transferazą S-g^abona), które są przydatne przy izolowaniu i oczyszczaniu prezenUm, oraz drożdżowe fuzje dwuhybrydzwe, opisane poniżej, które są przydatne w testach do identyfikowania innych białek, które wiążą się lub oddziaływają z prezenilinawi.
Ponadto wynalazek dostarcza kwasów nukleinowych w postaci konstruktów or2kzmblnowanego DNA, w których marker klub gen wskaźnikowy (np. βlgalaktzzydaoa, lucyferaza) są połączone w sposób funkcjonalny z regionami regulatorowymi 5' genu prezeniliny, tak, że ekspresja genu markerowego jest pod kontrolą sekwencji regulatorowych prezemlin. Stosując regiony regulatorowe prezenilin, ujawnione lub w inny sposób tu udostępnione, włączając w to sekwencje regulatorowe genów PSI i PS2 z człowieka i innych gatunków ssaków, biegły w tej dziedzinie będzie teraz mógł wytworzyć takie konstrukty Jak dyskutowano w sposób pełny poniżej, takie izolowane kwasy nukleinowe mogą być zastosowane do wytworzenia komórek, linii komórkowych lub zwierząt transgeniaznyah, które są przydatne do identyfika185 549 cji związków, które mogą, bezpośrednio lub pośrednio, w sposób zróżnicowany wpływać na ekspresję prezenilin.
W końcu, izolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku obejmują dowolną z powyżej opisanych sekwencji, włączoną do wektora. Odpowiednie wektory obejmują wektory do klonowania i wektory ekspresyjne wszystkich typów, włączając w to plazmidy, fagi, kosmidy, episomy i temu podobne, jak również wektory integracyjne. Wektory mogą również zawierać różne geny markerowe (np. geny oporności na antybiotyki lub podatności), przydatne przy identyfikowaniu komórek, które udało się nimi stransformować. Dodatkowo wektory mogą obejmować sekwencje regulatorowe, do których kwasy nukleinowe według wynalazku są przyłączane w sposób funkcjonalny i/lub mogą również obejmować regiony kodujące takie, że kwasy nukleinowe według wynalazku, jeżeli są odpowiednio włączone do wektora, są poddawane ekspresji jako fuzje białkowe. Takie wektory mogą również obejmować wektory do zastosowania w drożdżowym systemie „dwuhybrydowym”, bakulowirusie i systemie wykrywania poprzez fagi (ang. phage-display). Wektory mogą być wybrane tak, aby być przydatnymi do ekspresji prokariotycznej, eukariotycznej lub wirusowej, zgodnie z koniecznością lub zapotrzebowaniem w konkretnym zastosowaniu. Przykładowo, wektory wirusa ospy bydlęcej lub małpie wektory wirusowe z promotorem SV40 (np. pSV2) albo wirus opryszczki lub wirus towarzyszący adenowirusom mogą być użyteczne do transfekcji komórek ssaczych, włączając w to hodowle neuronów lub in vivo, a wektory bakulowirusowe mogą być stosowane do transfekowania komórek owadzich (np. komórek motyli). Duża liczba różnych wektorów jest obecnie dostępna handlowo i znana w tej dziedzinie, a wybór odpowiedniego wektora pozostaje w zakresie możliwości i swobody wyboru biegłego w tej dziedzinie.
Zasadniczo czyste białka
Niniejszy wynalazek dostarcza zasadniczo czystych preparatów prezenilin, fragmentów prezenilin i fuzji białkowych zawierających prezeniliny i ich fragmenty. Białka, fragmenty i fuzje mają zastosowanie, jak tu opisano, przy wytwarzaniu przeciwciał przeciw prawidłowym i zmutowanym prezenilinom, przy identyfikacji białek wiążących prezenilinę oraz w metodach diagnostycznych i leczniczych. A zatem, w zależności od planowanego zastosowania, niniejszy wynalazek dostarcza zasadniczo czystych białek i peptydów o sekwencjach aminokwasowych, które stanowią części sekwencji kompletnych prezenilin i które mogą mieć długość wahającą się od 4-10 aminokwasów (np. przy zastosowaniu jako immunogeny) lub 10-100 aminokwasów (np. przy zastosowaniu w testach wiązania) do długości odpowiadającej całej prezenilinie. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza zasadniczo czystych białek lub peptydów o sekwencji odpowiadającej co najmniej 4-5, korzystnie 6-10, a najkorzystniej co najmniej 50 lub 100 następującym po sobie aminokwasom prezenilin, jak ujawniono lub w inny sposób tutaj udostępniono.
Białka lub peptydy według wynalazku mogą być izolowane i oczyszczane poprzez różnorodne metody wybrane na podstawie własności wyniOająeyeh z ich sekwencji białkowych. Ponieważ prezeniliny mają własności integralnych lub przechodzących przez błonę białek, można izolować frakcję błonową komórek, w których prezenilina podlega normalnie wysokiej ekspresji (np. neuronów, oligodendrogleju, mięśni, trzustki) i białka można ekstrahować na przykład poprzez upłynnienie detergentem. Alternatywnie prezenilinę, fuzję białkową lub jej fragment można oczyszczać z komórek transformowanych lub transfekownych wirusami ekspresyjnymi (np. w systemie eakulowirusowym, wektorami pPbac i pMbac (Stratagene, La Jola, CA); w drożdżowym systemie ekspresyjnym, wektorami pYESHIS Xpress (Invitrogen, San Diego, CA); w eukariotycznych systemach ekspresyjnych, pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) który ma stałą konstytutywną ekspresję lub LacSwitch (Stratagene, La Jola, CA), który jest indukowalny; lub prokariotycznymi wektorami ekspresyjnymi, takimi jak pKK233-3 (Clontech, Paolo Alto, CA). W przypadku kiedy białko lub fragment wbudowuje się do retikulum endoplazmatycznego lub błony plazmatycznej zrekombinowanych komórek (np. unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych lub innych komórek eukariotycznych), białko może być oczyszczane z frakcji błonowej. Alternatywnie jeżeli białko nie jest prawidłowo zlokalizowane lub agreguje w ciała inkluzyjne w zrekombinowanych komórkach (np. komór52
185 549 kach prukariutynznych), białko możo być oczyszczono z całych pobbacych lizio komórek lub z upłynnionych ciałek inęluzyjnych.
Oczyszczenie można uzyskać stosując standartowe procedury oczyszczania, włączając w to między innymi, sączenie molekularne, chromatografię aonuwymiocma, chromatografię cieczową o wysokiej rozdzielczości (RP-HPLC, HPLC jomuwymionmą) HPLC z sączeniom molekularnym), chromatoogciskowamio, o wysokiej rozdzielczości, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, immucoprocypitanję lub oczyszczacie poprzez immumopowinuwactwo. Można również zastosować elektroforezę w żelu (np. PAGE, SDS-PAGE) do izolowania białka lub poptytu w oparciu o jogo masę cząsteczkową, łatunok i hytrefl)Oewuść.
Probonihma lub aoj fragment mogą być również w dogodny sposób oczyszczano poprzez utworzocio fuzji białkowoj, zawierającej pożądaną sekwencję prezeniliny połączoną z innym poptydom, takim jak determinanta antygenowa łub znacznik poli-His (np. wektory Q1Aoxpross, QIAGEN Corp., Chatsworth, CA) lub większym białkiem (np. GST przy zastosowaniu wektora pGEX-27 (Amrat, USA)) lub białkiem o zielonej fluorosnomcji przy zastosowaniu wektora Goen Lantom (GIBCO/BRL, Gaithorsburg, MD). Fuzja białkowa możo ulogać ekspresji i być odzyskana z komórek prokariotyczcych lub eukariotycznych i oczyszczona poprzez powolną zo standardowych motob opartych o sekwencję wektora do fuzji. Przykładowo fuzja białkowa może być oczyszczona poprzez immumopowinuwactwu lub immumupronypitację z przeciwciałom do części fuzji nie będącej prezeniliną lub, w przypadku znacznika poli-His, poprzez wiązanie powinowactwa do kolumny niklowej. Pożądana prozonilmą lub jej fragment mogą być następnie dalej oczyszczano z fuzji białkowoj poprzez cięcio enzymatyczne fuzji białkowoj. Motoby przygotowywania i stosowania takich konstruktów do otrzymywania fuzji w celu oczyszczania białok s, dobrzo znano w tej dziedzinie i jost obecnie dostępnych handlowo kilka zestawów do tych celów. W świetle niciojszogo ujawnienia istnieje teraz możliwość stosowania takich kunstruktów bo fuzji z prozomihnami.
Przeciwciała przeciw prozonilimum
Niniejszy wynalazek dostarcza rówcioż przeciwciał i sposobów wytwarzania przeciwciał, któro selektywnie wiąz, się z probonilinami lub ich fragmentami. Co ma szczególno znaczenie, poprzez identyfikowanie fuckcjucalcych domen prozonilicy i polimorficzcych regionów związanych z AD, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciał i sposobów wytwarzania przeciwciał, któro będą się wiązały selektywnie z, i w ton sposób, identyfikowały i/lub rozróżniały prawitłowo i zmutowano (tj. patogenno) postaci prozonilim. Przeciwciała według wynalazku mają zastosowanie jako odczynniki laboratoryjne bo, między imcymi, oczyszczania prozonilin poprzez immunopowinowactwo, techniki Western do identyfikowania komórek lub tkanek, w których następuje ekspresja probonilim, i technik immunochomii lub immumufluorosnoncji do ustalenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji białka. Ponadto, jak opisano poniżej, przeciwciała według wynalazku mogą być zastosowano jako narzędzia diagnostyczno to identyfikowania nosicieli alloli prozonilm, związanych z AD, lub jako narzędzie leczniczo to selektywnego wiązania i hamowania patogennych postaci prozonilin in vivo.
Przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzano przy zastosowaniu całych prozocilin wobług wynalazku lub stosując dowolny opitop prozoniliny, który jost charakterystyczny dla togo białka i który w sposób zasadniczy opróżnia go od innych białok gospodarza. Takie opitopy można zidentyfikować poprzez porównanie sekwencji, przykładowo 4-10 aminokwasów z sekwencji prozonilicy, z komputerową bazą danych sokwoccji białkowych odpowiedniego gospodarza. Korzystno jest, jeżeli opitopy są wybrano z końców N i C lub z domen z pętlami, któro łączą domeny tracsbłocowo białek. W szczególności, można się spodziewać, żo przeciwciała do polimorfinznynh regionów N końcowych, pętli TM1—>2 lub pętli TM6—7 bębą miały największe zastosowanie zarówno diagnostyczno, jak i leczniczo. Z drugiej strony, możca się spodziewać, żo przeciwciała przeciw wysoce zakonserwowanym domenom będą miały największe zastosowanie do oczyszczania lub identyfikacji prozomilic.
Przy zastosowaniu programu IBI Pustoll, zidomtyfikuwamu pozycjo aminokwacuwo będące potencjalnymi miejscami antygenowymi w białku hSPl, któro mogą być użyteczno przy wytwarzaniu przeciwciał według wynalazku. Pozycjo to, otpowiadająco pozycjom w SeK NR ID: 2, są wymieniono w tabeli 6.
185 549
Inne metody wyboru determinant antygenowych są oczywiście znane w tej dziedzinie i mogą być zastosowane. Ponadto, można zastosować większe fragmenty (np. 8-20 lub korzystniej, 9-15 reszt aminokwasowych), włączając w to niektóre z tych e'pitopów. Przykładowo, fragment zawierający epitop 109-112 może obejmować reszty 107-114 lub 105-116. Korzystne mogą być również nawet większe fragmenty, włączając w to przykładowo, całą funkcjonalną domenę lub domeny wielo^nkcyjne (np. TM1, TM1 —>2 i TM2 lub TM6, TM6—>7 iTM7). Dla innych prezenilin (np. dla mPSl lub innych homologów nie pochodzących od człowieka, lub dla PS2, mogą być wybrane miejsca homologiczne.
Przy zastosowaniu tego samego programu IBI Pustell, zidentyfikowano pozycje aminokwasowe jako potencjalne miejsca antygenowe w białku hSP2, które mogą być użyteczne przy wytwarzaniu przeciwciał według wynalazku. Pozycje te, odpowiadające pozycjom w SEK NR ID: 19, są wymienione w tabeli 7. Tak jak dla PSI, inne metody wyboru determinant antygenowych są oczywiście znane w tej dziedzinie i mogą być zastosowane. Ponadto można zastosować większe fragmenty (np. 8-20 lub korzystniej, 9-15 reszt aminokwasowych), włączając w to niektóre z tych epitopów. Przykładowo fragment zawierający epitop 310-314 może obejmować reszty 308-316 lub 307-317. Korzystne mogą być również nawet większe fragmenty, włączając w to przykładowo całą funkcjonalną domenę lub domeny wielofunkcyjne (np. TM1, TMl-»2 i TM2 lub TM6, TM6—>7 i TM7). Dla innych prezenilin (np. dla PS2 lub innych homologów nie pochodzących od człowieka, lub dla PSI) mogą być wybrane miejsca homologiczne.
Preparaty immunogenu prezeniliny mogą być wytwarzane z surowych ekstraktów (np. frakcji błonowych komórek, w których białko ulega ekspresji na wysokim poziomie), z białek lub peptydów zasadniczo oczyszczonych z komórek, w których podlegają one ekspresji, naturalnie lub w wyniku rekombinowania DNA, lub z krótkich immunogenów poprzez syntezę chemiczną peptydów. Immunogeny prezeniliny mogą również występować w postaci fuzji białkowej, w której region nie będący prezeniliną jest wybrany ze względu na swoje właściwości adiuwanta. Stosowany tu termin immunogen prezeniliny jest zdefiniowany jako preparat, zawierający peptyd obejmujący co najmniej 4-8, a korzystniej co najmniej 9-15 kolejnych aminokwasów prezenilin, jak ujawniono lub winny sposób tu udostępniono. Sekwencje 0 mniejszej liczbie aminokwasów mogą oczywiście również mieć zastosowanie w zależności od planowanego użycia i przyszłego rozwoju technologicznego. A zatem, sekwencje pochodzące z prezenilin, które są stosowane do wytworzenia przeciwciał przeciw prezenilinom powinny być uważane za immunogeny prezenilin.
Przeciwciała według wynalazku mogą być monoklonalne lub poliklonalne albo mogą być fragmentami przeciwciał, włączając w to fragmenty F(ab')2, i fragmenty pojedynczych łańcuchów przeciwciała. Ponadto, po zidentyfikowaniu przydatnych przeciwciał metodami według wynalazku można wytworzyć zrekombinowane przeciwciała, zawierające dowolny z fragmentów przeciwciał wymienionych powyżej, jak również humanizowane przeciwciała w oparciu o przeciwciała przeciw prezenilinom nie pochodzące z człowieka. W świetle niniejszego ujawnienia prezenilin, jak również charakterystyki innych prezenilin udostępnionych tutaj, biegły w tej dziedzinie może wytworzyć opisane powyżej przeciwciała dowolnym z różnorodnych standardowych sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Dla przeglądu technik dla przeciwciał patrz Antibody Engineering: A Practical Guide, Borrebank, wyd., W.H. Freeman & Company, NY (1992), lub Antibody Engineering, wyd 2, Borrebank, wyd, Oxford University Press, Oxford (1995).
Generalnie, poliklonalne przeciwciała mogą być wytwarzane poprzez immunizowanie myszy, królika, kozy lub innych odpowiednich zwierząt immunogenem prezeniliny z odpowiednim nośnikiem. Dla zwiększenia immunogenności preparatu immunogen może być związany z białkiem nośnikowym lub zmieszany z adiuwntem (np. adiuwntem Freunda). Wstrzyknięcia przypominające, jakkolwiek niekonieczne, są polecane. Po odpowiednim czasie dla odpowiedzi humoralnej, korzystnie kilku tygodniach, zwierzęta mogą być skrwawiane i można oczyścić surowicę w celu wyizolowania składnika immunoglobulinowego.
Podobnie, w ogólności, monoklonalne przeciwciała przeciw prezenilinie mogą być wytwarzane poprzez wstrzykniecie myszy, królikowi, kozie lub innym odpowiednim zwie54
185 549 rzętom immunogenu prezeniliny z odpowiednim nośnikiem. Jak wyżej, można zastosować białko nośnikowe lub adiuwnty i zalecane są wstrzyknięcia przypominające (np. co dwa-trzy tygodnie przez 8-10 tygodni). Po umożliwieniu rozwoju odpowiedzi humoralnej, zwierzęta są poświęcane, pobiera się ich śledziony i zawiesza na przykład w roztworze soli buforowanym fosforanem .(PBS). Komórki śledziony służą jako źródło limfocytów, wśród których są produkujące przeciwciała o odpowiedniej swoistości. Komórki te są następnie poddane fuzji z unieśmiertelnioną linią komórkową (np. szpiczaka) i produkty fuzji są wysiewane do licznych studzienek do hodowli tkankowej w obecności czynnika selekcyjnego, takiego jak HAT. Studzienki są seryjnie przeszukiwane i ponownie wysiewane, za każdym razem selekcjonując komórki wytwarzające użyteczne przeciwciała. Typowo, przeprowadza się kilka przeszukiwań i kolejnych wysiewów, dopóki ponad 90% studzienek nie zawiera pojedynczych klonów, które są pozytywne ze względu na wytwarzanie przeciwciał. Monoklonalne przeciwciała wytwarzane przez takie klony mogą być oczyszczane poprzez standardowe metody, takie, jak chromatografia powinowactwa przy zastosowaniu złoża Protein A Sepharose, poprzez chromatografię jonowymienną lub poprzez odmiany i kombinacje tych technik.
Przeciwciała według wynalazku mogą być znakowane lub łączone z innymi związkami lub materiałem do zastosowań diagnostycznych i/lub leczniczych. Przykładowo, mogą być one przyłączane do nukleotydów radioaktywnych, związków fluorescencyjnych lub enzymów dla uwidaczniania lub leczenia albo do liposomów w celu kierowania związków zawierających liposomy do specyficznego miejsca w tkance.
Transformowane linie komórkowe
Niniejszy wynalazek dostarcza także komórek lub linii komórkowych, zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych, które zostały stransformownne lub stransfekowane kwasami nukleinowymi według tego wynalazku, tak aby doprowadzić do klonalnego namnażania się tych kwasów nukleinowych i/lub ekspresji kodowanych przez nie białek lub peptydów. Takie komórki lub linie komórkowe będą użyteczne zarówno przy namnażaniu, jak i wytwarzaniu kwasów nukleinowych oraz białek według niniejszego wynalazku, a także, jak dalej tutaj opisano, jako system modelowy dla diagnostyki i testów terapeutycznych. Stosowany tu termin „stransformewana komórka” ma obejmować dowolną komórkę lub potomstwo dowolnej komórki, do której został włączony dowolny z kwasów nukleinowych według tego wynalazku, czy to poprzez transformację, transfekcję, infekcję, czy inny sposób. Sposoby wytwarzania odpowiednich wektorów, transformowania komórki tymi wektorami i identyfikowania transformantów są dobrze znane w tej dziedzinie i są tutaj omówione tylko pobieżnie (patrz, na przykład, Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York).
Komórki prokariotyczne przydatne do wytwarzania stransformowanych komórek według wynalazku, obejmują przedstawicieli bakteryjnego rodzaju Escherichia (np. E. coli), Pseudomonas (np. P. aerouginosa) i Bacillus (np. B. subtilis, B. stearothermophjlus), jak również wiele innych dobrze znanych i często używanych w tej dziedzinie. Komórki prokariotyczne są szczególnie użyteczne w celu wytwarzania dużej ilości białek lub peptydów według wynalazku (np. prawidłowych lub zmutowanych prezenilin, fragmentów prezenilin, fuzji białkowych z βrezemljnnmi). Komórki bakteryjne (np. E. coli) mogą być użyte z różnymi ekspresyjnymi systemami wektorowymi obejmującymi na przykład, plazmidy z systemem βromoter/βoli-meraza RNA T7, sekwencje regulatorowe bakteriofaga X lub mGPI-2 faga Ml 3. Gospodarze bakteryjni mogą także być transformowani wektorami do fuzji białkowych celem wytworzenia fuzji białkowej z, na przykład, lacZ, trpE, białkiem wiążącym maltozę, znacznikiem poly-His, lub transferazą-S-glutationu. Wszystkie one, podobnie jak wiele innych prokariotycznych systemów ekspresji, są dobrze znane w tej dziedzinie i szeroko dostępne handlowo [np. pGEX-27 (Amrad, USA) dla fuzji GST].
Komórki eukariotyczne i linie komórkowe użyteczne dla wytwarzania stransformowanych komórek według tego wynalazku obejmują komórki ssacze i nerwiaka niedojrzałego, hybrydom}, ludzkie komórki zarodkowe nerki 293, oocyty, macierzyste komórki zarodkowe linie komórkowe owadów [np. przy zastosowaniu wektorów bαkulewjrusowych, takich jak pPbac lub pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)] drożdży [np. przy zastosowaniu wektorów eks185 549 βresyjmych drożdży, takich jak pYESHIS (Invitrogen, CA)] oraz grzybów. Komórki eukariotyczne są szczególnie użyteczne przy wykonaniach, w których jest konieczne, aby prezeniliny lub ich funkcjonalne fragmenty, spełniały funkcje i/lub podlegały wewnątrzkomórkowym oddziaływaniom, związanymi z prawidłowym bądź zmutowanym białkiem. A zatem, przykładowo, korzystne jest stosowanie stramsformowαrych komórek eukariotycznych jako modeli dla funkcji lub oddziaływań prezenUm oraz korzystne jest użycie stransformowanych komórek eukariotycznych w testach do poszukiwania kandydatów terapeutycznych.
Aby uzyskać ekspresję w komórkach eukariotycznych, opracowano i udostępniono szereg różnych wektorów, które umożliwiają indukowaną (np. wektory ekspresyjne LacSwich, Stratagene, La Jolla, CA) lub pokrewną (np. wektory pcDNA3, ^iń-ogon, Chatsworth, CA) ekspresję sekwencji nukleotydowych prezenilin pod kontrolą sztucznych elementów promotorowych. Takie elementy promotorowe często pochodzą z genów wirusów CMV i SV40, chociaż ime silne elementy promotorowe, które są aktywne w komórkach eukariotycznych, mogą także być stosowane do indukcji transkrypcji sekwencji nukleotydowych prezenUm. Typowo, wektory te zawierają również sztuczne sekwencje poliademylacji i 3'UTR, które mogą także pochodzić z egzogennych sekwencji genów wirusowych lub z innych genów eukariotycznych. Ponadto, w niektórych konstrukatch do wektorów włączone są sztuczne, miekodujace, podlegające składaniu introny oraz eksony, dla wzmocnienia ekspresji sekwencji nukleotydowych będących przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku, sekwencji prezenUm). Te systemy ekspresyjne są ogólnie dostępne ze źródeł handlowych, a ich przykładami są wektory takie, jak pcDNA3 i pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA). Obydwa z tych ostatnich wektorów mogą być z sukcesem zastosowane w celu spowodowania ekspresji prezenUm w stransfekowanych komórkach COS, CHO i PC12 (Levesque i wsp., 1966). Niezwykle liczne handlowo dostępne, jak również robione na zamówienie, wektory ekspresyjne są dostępne ze źródeł handlowych dla umożliwienia ekspresji dowolnego pożądanego transkryptu prezemllim we w zasadzie dowolnym pożądanym typie komórek, konstytutywnie, bądź po zadziałaniu pewnymi egzogennymi czynnikami stymulującymi (np. usunięcie tetracykliny lub zadziałanie IPTG).
Wektory mogą być wprowadzane do komórek biorców lub „gospodarzy” różnymi metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie, włączając w to między innymi, transfekcję z zastosowaniem fosforanu wapnia, transfekcję z zastosowaniem fosforanu strontu, transfekcję z zastosowaniem dekstranu DEAE, elektroporację, lipofekcję (np. z odczynnikiem do transfekcji Dosper Liposomal, Boehringer, Mannheim, Niemcy), mikroinjekcję, wprowadzenie poprzez bombardowanie mikrokulkami, fuzję protoplastów lub, w przypadku wektorów wirusowych lub fagowych, poprzez infekcję rekombmowanymi wirusami lub fagami.
Modelowe zwierzęta transgeniczne
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania modelowych zwierząt transgemiczmych, z wyłączeniem człowieka, do badania choroby Alzheimera, do poszukiwania kandydatów na związki farmaceutyczne, do wytwarzania przeszczepionych ssaczych hodowli tkankowych CNS (np. neuronowych, glejowych, hodowli tkankowych typowych dla narządu lub mieszanych), w których sekwencje prezenilmy, zmutowane lub typu dzikiego, ulegają ekspresji lub w których geny prezeniliny zostały zlmaktywowame (np. delecje typu „knock out” (ang.)) i dla oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Wcześniej, przed niniejszym wynalazkiem, istniał częściowy model zwierzęcy choroby Alzheimera poprzez wstawienie i nadprodukcję zmutowanej postaci ludzkiego genu prekursorowego białka amyloidu w formie minigenu pod kontrolą elementu promotorowego receptora czynnika wzrostowego β pochodzącego z płytek krwi (Games i wsp., 1995). Ten mutant (PAPP717 Val Ile) powoduje pojawienie się patologii synaptycznej i odkładanie się peptydu - amyloidu β w mózgu tramtgemicznych zwierząt przenoszących ten transgen w dużej liczbie kopii. Te zmiany w mózgu tramsgemlcznych zwierząt są bardzo podobne do obserwowanych dla ludzkiej AD (Games i wsp., 1995). Jest jednakże jak dotychczas niejasne, czy te zwierzęta staną się otępiałe, ale panuje ogólna zgoda co do tego, że jest obecnie możliwe odtworzenie co najmniej niektórych aspektów AD u myszy.
185 549
Gatunki zwierząt, które są odpowiednie do zastosowania w modelach zwierzęcych według niniejszego wynalazku, obejmują między innymi, szczury, myszy, chomiki, świnki morskie, króliki, psy, koty, kozy owce, świnie, naczelne z wyłączeniem człowieka (np. małpy Rhesus, szympansy). Do wstępnych badań korzystne są transg2nlczne gryzonie (np. myszy) z powodu stosunkowo łatwej hodowli i krótszego życia. W praktyce, jak zaznaczono powyżej, jransgenlczne drożdże lub bezkręgowce (np. robaki płaskie, owady) mogą być korzystne w pewnych badaniach, ponieważ umożliwiają jeszcze szybsze i bardziej rozległe poszukiwania. Jednakże transgeniczne naczelne z wyłączeniem człowieka mogą być korzystne przy długzjrwałzah badaniach ze względu na ich większe podobieństwo do ludzi i ich większe możliwości spokrewnienia się.
Stosując kwasy nukleinowe ujawnione i w inny sposób tutaj udostępnione, dostępnych jest obecnie kilka rozwiązań dla wytwarzania modelowych zwierząt transgeniaznych dla choroby Alzheimera. A zatem, dostępne zwierzęce modele obejmują (1) Zwierzęta, w których prawidłowy ludzki gen prezeniliny został poprzez r2Cowbinzwanle DNA wprowadzony do genomu zwierzęcia jako dodatkowy gen pod kontrolą zewnętrznego albo wewnętrznego elementu przmotorowegz i jako minigen albo duży fragment genomowy; w których prawidłowy ludzki gen pr2Z2nilinz został poprzez rekombinowanie DNA podstawiony w miejsce jednej lub obu kopii zwierzęcego homologicznego genu prezeniliny poprzez homologiczną rekombinację lub kierowanie genu; i/lub, w których jedna lub obie kopie jednego ze zwierzęcych homo^ów genu prezeniliny została na drodze rekzwblnowanla DNA „humanizowana” poprzez częściowe podstawienie sekwenccą kodującą ludzki homolog na drodze homologicznej rekombinacji lub kierowania genu. Zwierzęta te są przydatne do oceny efektów jransgeniaznych procedur i skutków wprowadzania lub podstawienia ludzkim lub humanlozwanyw genem prezeniliny (2) Zwierzęta, w których zmutowany (tj. patogenny) ludzki gen prezeniliny został poprzez rekombinowanie DNA wprowadzony do genomu zwierzęcia jako dodatkowy gen pod kontrolą zewnętrznego bądź wewnętrznego elementu promojorzwegz i jako minigen bądź duży fragment genomowy; w których zmutowany ludzki gen prezeniliny został poprzez reCzmbinzwanl2 DNA podstawiony w wi2jsce jednej lub obu kopii zwierzęcego homologicznego genu prezeniliny poprzez rekombinację homologiczną lub kierowanie genu; i/lub, w których jedna lub obie kopie jednego ze zwierzęcych ^mologów genu prezeniliny została poprzez rekombinowanie DNA „humanizowana” poprzez częściowe podstawienie sekwencją kodującą zmutowany ludzki homolog na drodze homologicznej rekombinacji lub kierowania genu. Zwierzęta te są przydatne jako modele, które uwidocznią niektóre lub wcoystCi2 cechy charakterystyczne, na poziomie biochemicznym, flzjolzglaznzw i/lub zachowania, ludzi przenoszących jeden lub więcej alleli, które są patogenne w chorobie Alzheimera lub w innych chorobach związanych z mutacjami w genach prezeniliny. (3) Zwierzęta w których zmutowana wersja jednego z takich zwierzęcych genów prezeniliny (przenosząca np. specyficzną mutację, odpowiadającą lub podobną do, jednej z patogennych mutacji ludzkich prezenilin) została poprzez rekombinowanie DNA wprowadzona do genomu zwierzęcia jako dodatkowy gen pod kontrolą zewnętrznego bądź wewnętrznego elementu promzjzrow2gz, jako minigen bądź duży fragment genomowy; w których zmutowana wersja jednego z takich zwierzęcych genów prezeniliny (przenosząca np. specyficzną mutację odpowiadającą lub podobną do jednej z patogennych mutacji ludzkich prezenilin) została poprzez r2kombinowani2 DNA podstawiona w miejsce jednej lub obu kopii owi2roęcego homologicznego genu prezeniliny poprzez homologiczną rekombinację lub kierowanie genu w miejsce docelowe. Zwierzęta te są również przydatne jako modele, które uwidocznią niektóre lub wszystkie cechy charakterystyczne na pzziowie biochemicznym, fizjologiaznyw i/lub zachowania, ludzi przenoszących jeden lub więcej alleli, które są patogenne w chorobie Alzheimera lub w innych chorobach zwiąoanzah z mutacjami w genach prezeniliny. (4) Zwierzęta ze zinaktzwzwanzw genem („knock-out”), w których jedna lub obie kopie jednego ze zwierzęcych genów prezenilin zostały częściowo lub całkowicie usunięte poprzez rekombinację homologiczną lub kierowanie genu w więjsc2 docelowe lub została unleazynnlzna poprzez wstawienie lub podstawienie na drodze rekombinacji homologicznej lub kierowania genu w miejsce docelowe sekwencji egzogennych (np. kodonów stop, miejsc lox p). Takie zwierzęta stanowią przydatne modele do
185 549 badania skutków, jakie może mieć utrata ekspresji genu prezeniliny, do oceny, czy utrata funkcji jest korzystniejsza od stałej ekspresji postaci zmutowanej i do zbadania, czy inne geny mogą być brane pod uwagę dla zastąpienia zmutowanej prezeniliny (np. podstawienie PS2 w miejsce PSI) lub przeciwdziałania efektom innych genów (np. APP lun ApoE), wywołujących Ad, jako sposób leczenia AD i innych chorób. Przykładowo, prawidłowy gen prezeniliny może być niezbędny do działania zmutowanych genów APP w kierunku wystąpienia AD, a zatem modelowe zwierzęta z transgeniczną prezeniliną mogą mieć zastosowanie przy ocenie takich wielogenowych oddziaływań.
W celu utworzenia modelu zwierzęcego (np. transgenicznej myszy), prawidłowy lub zmutowany gen prezeniliny (np. prawidłowy lub zmutowany hPSl, mPSl, hPS2, mPS2, itd.) lub prawidłowa lub zmutowana wersja zrekombinowanego kwasu nukleinowego, kodującego co najmniej funkcjonalną domenę prezeniliny (np. zrekombinowany konstrukt zawierający sekwencję mPSl, do której została wstawiona sekwencja nukleotydowa, odpowiadająca zmutowanej sekwencji ludzkiej), może być wstawiony do linii zarodkowej lub komórek macierzystych przy zastosowaniu standardowych technik mikrowstrzyknięcia do oocytów lub transfekcji albo miOrowstrzyknieeia do macierzystych komórek zarodkowych. Zwierzęta wytwarzane na drodze tych lub podobnych procesów są określane jako transgeniczne. Podobnie, jeżeli pożądana jest inaktywacją lub wymiana endogennego genu prezeniliny, może być zastosowana homologiczna rekombinacja zużyciem macierzystych komórek zarodkowych. Zwierzęta wytwarzane na drodze tych lub podobnych procesów są określane jako modele „knoeO-but” (reaktywacją) lub „OnbeO-in” (podstawienie).
Przy nastrzyknięciu oocytów, jedna lub więcej kopii zrekombinowanych konstruktów DNA według niniejszego wynalazku może być wstawiona do pronukleusa dopiero co zapłodnionego oocytu. Oocyt ten zostaje następnie implantowany do zastępczej matki z ciążą rzekomą. Żywo urodzone zwierzęta są przeszukiwane pod kątem integrantów przy zastosowaniu analiz DNA (np. z żył ogonowych potomnych myszy) na podstawie obecności wstawionych zrekombinowanych sekwencji transgenu. Transgenem może być kompletna sekwencja genomowa wstrzyknięta jako YAC, BAC, PAC lub inne fragmenty chromosomu, cDNA z naturalnym promotorem lub promotorem heterologicznym albo minigen zawierający wszystkie regiony kodujące i inne elementy, dla których stwierdzono, że są niezbędne dla optymalnej ekspresji.
W celu wstawienia zrekombinowanych konstruktów według wynalazku można również dokonać infekcji wczesnych zarodków retrowirusami. W tej metodzie transgen (np. prawidłowa lub zmutowana sekwencja hPSl lub PS2) jest wstawiony do wektora tetrowirusowego, którego używa się do nastrzyknięcia zarodków (np. mysich lub naczelnych z wyłączeniem człowieka) bezpośrednio w czasie wczesnych stadiów rozwoju, w celu wytworzenia chimer, z których niektóre będą prowadziły do przekazywania w linii płciowej.
Rekombinacja homologiczna przy zastosowaniu linii macierzystych umożliwia poszukiwania komórek przekazujących gen w celu zidentyfikowania rzadkich zjawisk rekombinacji homologicznej. Po zidentyfikowaniu mogą być one użyte do wytworzenia chimer poprzez wstrzyknięcie do blastocyst, a część otrzymanych w rezultacie zwierząt będzie wykazywała przekazywanie w linii płciowej z linii zrekombinowanej. Metodologia ta jest szczególnie przydatna, jeżeli pożądana jest reaktywacją genu prezeniliny. Przykładowo, można dokonać reaktywacji mPSl u myszy poprzez zaprojektowanie fragmentu DNA, który zawiera sekwencje eksonu mPSl, otaczające marker selekcyjny. Homologiczna rekombinacja prowadzi do wstawienia sekwencji markerowych w środku eksonu, powodując inaktywację genu mPSl i/lub delecję wewnętrznych sekwencji. Analiza DNA poszczególnych klonów może być następnie zastosowana do wykrycia zdarzeń homologicznej rekombinacji.
Techniki wytwarzania transgenicznych zwierząt, jak również techniki homologicznej rekombinacji lub kierowania genu w miejsce docelowe są obecnie powszechnie akceptowane i stosowane. Dostępny jest przykładowo zbiór protokołów laboratoryjnych dotyczących manipulacji zarodkiem mysim, przedstawiający szczegółowo standardowe laboratoryjne techniki do wytwarzania transgenicznyeh myszy (Hogan i wsp., 1986). Aby wytworzyć transgen, docelowa sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania (np. sekwencje prezenilin, zmutowa58
185 549 /e lub typu dzikiego) są typowo wstawiane poprzez ligację w miejscu klonowania położonym za elementom promotoaownm, który będzie regulował ekspresję RNA z sekwencji preze/ili/y. Za sekwencją prezeoill/n typowo znajduje się sztuczno miejsce poljado/ylacji. W modelach traosgeoicz/ndh, które zostały z powodzeniom zastosowano do wytworzenia zwierząt, któro imitują aspekty dzledzidzoych ludzkich chorób oourodoge/oracnjoydh, najlepszymi elomo/tami promotorowymi były promotor podjed/ostkl β receptora czy/nika wzrostowego pochodzącego z płytek krwi i promotor genu dla białka prio/owego chomika, jakkolwiek i/ne elementy promotorowo, któro kierują ekspresją w komórkach ce/tral/ogo układu nerwowego mogą być również przydatno. Alternatywnym podejściem do utwoaoeoja tra/sgo/u jest zastosowanie eodogeooego promotora prezooiljoy i sekwencji regulatorowych do kierowania ekspresją tra/sgo/u paozeoilloy. W końcu, możliwo jost wytworzenie tra/sge/u przy zastosowaniu dużych go/omowych fragmentów DNA, takich jak YAC, któro zawierają cały ge/ paezeollloy, jak rów/ież jego odpowiednie sekwencje regulatorowe. Takie konstrukty zostały z powodzeniem zastosowano do kierowania ekspresją ludzkiego APP w tra/sgo/icz/ych myszach (Lamb i wsp., 1993).
Zwierzęta modelowo mogą być również utworzone poprzez kierowa/ie e/dogen/ogo ge/u prozenili/y w miejsce docelowe w celu zmiany o/dogeooęj sekwencji proze/ilmy poprzez rekombinację homologiczną. To zdarzenia związano z kierowa/iom ge/u w określono miejsce mogą dawać w ofokcie usunięcie sekwencji endogennych („koodk-out”) lub zmianę e/doge/nych sekwencji z wytworzeniem zmiany aminokwasowej zwiąonooj z ludzką chorobą lub i/nogo rodzaju nieprawidłowej sekwencji (/p. sekwoodjΊ, która bardziej przypomina sekwencję ludzką niż wyjściową sekwencję zwierzęcą) (modele zwierzęce „koock-i/”). Dostępna jest handlowo duża liczba wektorów dla osiągnięcia tego celu i są dostępne handlowo odpowiednio źródła ge/omowogo DNA dla myszy i i/oydh genomów zwierzęcych, do których ma nastąpić wprowadzenie DNA, z kompanii takich jak Go/omoSystem I/c. (St. Louis, Missouri, USA). Typową cechą takich ko/strojtów wektorów do wprowadzania dNA jost to, że ge/omowy fragment DNA, o wielkości od 2 do 4 kb, jost wstawiany w wyniku llgacji po stronie 5' markera selekcyjnego (/p. bakteryjnego ge/u oporności na neomycynę pod kontrolą włas/ego elementu promotorowago, nazywanego „kasetą neomycy/ową”). Drugi fragment DNA z genu będącego przedmiotem znjoteaesowa/ja jest następ/io włączany poprzez ligację zą kasetą n-omycy/ową, ale przed drugim markerem selekcyjnym (np. ki/azą tymidynowi). Fragmenty DnA są tak wybrano, aby sekwencjo zmutowano były wprowadzane do ΙΙοιι zarodkowych docelowych zwierząt poprzez homologiczne podstawienie o/dogen/ych sekwencji poprzez każdą z sekwencji zawartą w wektorze. Alternatywnie, można wybrać sekwencjo dla spowodowania dolecji sekwencji, które /oamaloje znajdują się pomiędzy lewym i prawym ramie/iom wektora, otaczając kasetę n-omycy/ową. Pierwszy jest zoaoy jako wstawienie („koodk-io”), drugi jako maktywacja („koodk-out”). Po/ow/io, stworzo/o /iezljczooe systemy modelowe, szczególnie dla kjorown/nch w określono miejsce koostauktów i/aktywujących gony włączając w to to związane z chorobami /eurodogeoeaacyj/nmi (np. kierowane delecje mysiego ge/u APP wykonano przez Zho/g i wsp., 1995; kierowa/e delecjo mysiego ge/u prio/u związa/ego z postacią dorosłą ludzkiej degeneracji CNS wyko/a/o przez Buolor i wsp., 1996).
W końcu, odpowiedniki zwierząt tra/nge/ico/nch, włączając w to zwierzęta zo zmutowanymi lub i/aktywowa/ymi ge/ami preze/ilin, mogą być tworzo/e przy zastosowaniu mutage/ezy gamet poprzedzającej zapłodnienie, chemicznej lub promieniami X. Stosując wyizolowane kwasy nukleinowe ujaw/io/e lub w i/oy sposób tutaj udostępnione, biegły w tej dziedzinie może dużo szybciej przeszukać otrzymano w rezultacie potomstwo poprzez, na przykład, bezpośrednie sokwe/djzoownoie, RFLP, PCR lub analizę hybaydyz.acnjoą w celu wykrycia mutacji, albo stosując metodę Southern do wykazania braku jod/ego allelu na podstawie dawki.
Tosty na związki wpływające na ekspresję paeze/ilio
W i//oj serii wykonań /joiejszn wynalazek dostarcza testów dla identyfikacji małych cząsteczek lub ioondh związków, któro są zdolne do indukcji lub hamowania eknpaosji ge/ów i białek piozo/III/ (/p. PSI lub PS2). Tosty mogą być wykonywane in vitro przy zastosowa185 549 niu nie ttramsformowamych komórek, unieśmiertelnionych linii komórkowych lub zrekombinowanych Ι^ϊΙ komórkowych albo in vivo stosując modelowe zwierzęta trαmsgenicome ujawnione tutaj.
Konkretnie, testy mogą wykrywać obecność zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji PSI, PS2 lub innych genów lub białek spokrewnionych z prezenilmami na podstawie zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji mRNA (stosując np. kwasy nuklelnowe-sondy ujawnione i udostępnione tutaj), wzrost lub spadek poziomów PSI, PS2 lub innych produktów białkowych spokrewnionych z prezemilinami (stosując np. przeciwciała przeciw prezenilmom ujawnione i udostępnione tutaj) albo wzrost lub spadek poziomu poziomów ekspresji genów markerowych (np. P-galaktozydazy lub lucyferazy) przyłączonych w sposób fumkcjiomαlny do regionu regulacyjnego 5' prezenilmy w zrekombmowanym konstrukcie.
A zatem, przykładowo, można hodować komórki, o których wiadomo, że wyrażają konkretną ρrezemillnę i dodawać do pożywki hodowlanej jeden lub więcej testowanych związków. Po upłynięciu okresu czasu (np. 0-72 godziny) wystarczającego, aby związek zaindukował lub zahamował ekspresję prezenilin, można wykrywać każdą zmianę w poziomach ekspresji w stosunku do ustalonego poziomu podstawowego przy użyciu dowolnej techniki opisanej powyżej i dobrze znanej w tej dziedzinie. W szczególnie korzystnych wykonaniach komórki pochodzą z unieśmiertelnionych linii komórkowych, takich jak linia komórkowa ludzkiego nerwiaka niedojrzałego, glejaka lub hybrydomy. Stosując kwasy nukleinowe-sondy i/lub przeciwciała ujawnione i udostępnione tutaj, wykrycie zmian w ekspresji prezenUm, a zatem identyfikacja związku jako induktora lub represora ekspresji prezenUm, wymaga jedynie rutynowych doświadczeń.
W szczególnie korzystnych wykonaniach, stosuje się test rekombmacyjny, w którym gen reporterowy taki jak p-gaiaktozydaza, białko zielonej fluorescemcjl, fosfataza alkaliczna lub lucyferaza jest funkcjonalnie połączony z regionem regulatorowym 5' genu prezeniliny; Korzystne wektory obejmują wektor Green Lantem 1 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD i wektor Great EScAPe pSEAP (Clontech, Palo Alto). Ujawniony tutaj region regulatorowy hSPl lub inne regiony regulatorowe prezenilin, mogą być łatwo izolowane i klonowane przez biegłego w tej dziedzinie w świetle niniejszego ujawniania regionów kodujących tych genów. Gen reporterowy i regiony regulacyjne są połączone w ramce odczytu (lub każdej z trzech możliwych ramek odczytu) tak, że transkrypcja i translacja genu reporterowego mogą odbywać się pod kontrolą elementów regulatorowych prezenilm. Zrekombinowany konstrukt może być następnie wprowadzony do dowolnego typu komórek, jakkolwiek korzystne są komórki ssacze, a najkorzystniejsze są komórki ludzkie. Transformowane komórki można mammażać w hodowli i po ustaleniu podstawowego poziomu ekspresji genu reporterowego, do podłoża mogą być dodawane testowane związki. Łatwość wykrywania ekspresji genu reporterowego gwarantuje szybki, wydajny test do identyfikacji induktorów i represorów genów prezenUm.
Związki identyfikowane tą metodą będą miały potencjalne zastosowanie przy modyfikowaniu ekspresji PSI, PS2 i innych genów spokrewnionych z prezemilinaml in vivo. Związki te mogą być dalej testowane w modelach zwierzęcych, udostępnionych i ujawnionych tutaj, w celu zidentyfikowania tych związków, które mają największe efekty in vivo. Ponadto, jak opisano tutaj w odniesieniu do małych cząsteczek mających aktywność wiązania się z prezenlliną, cząsteczki te mogą służyć jako „odczynniki wiodące” do dalszego rozwoju leków poprzez, przykładowo, poddawanie związków kolejnym modyfikacjom, modelowaniu molekularnemu i innym rutynowym procedurom stosowanym przy racjonalnym projektowaniu lekarstw.
Identyfikacja związków posiadających zdolność wiązania prezenUm
W świetle nimiejsoego ujawnienia, biegły w tej dziedzinie może stosować nowe metody poszukiwań, które będą przydatne przy identyfikacji białek i innych związków, które wiążą się lub w inny sposób oddziałują bezpośrednio z prezenilinami. Białka i związki będą obejmować endogenne składniki komórkowe, które oddziałują z prezenilmami in vivo i które dostarczają zatem nowych celów dla interwencji farmaceutycznych i leczniczych, jak również zrekombinowame, syntetyczne i inne związki egzogenne, które mają zdolność wiązania prezenilm i w związku z tym mogą być kandydatami na czynniki farmaceutyczne. A zatem,
185 549 w jednej serii wykonań, lizaty komórkowe lub homogenaty tkankowe (np. homogenaty ludzkiego mózgu, lizaty limfocytów) mogą być przeszukiwane pod kątem białek lub innych związków·', które wiążą się z jedną z prawidłowych lub zmutowanych prezenilin. Alternatywnie, dowolny spośród różnorodnych egzogennych związków, zarówno naturalnie występujących, jaki i/lub syntetycznych (np. biblioteki małych cząsteczek lub peptydów) mogą być przeszukiwane pod kątem zdolności do wiązania się z prezenilinami. Małe cząsteczki są szczególnie korzystne w tym kontekście, ponieważ są one łatwiej przyswajane przy podawaniu doustnym, mają mniejszą potencjalną determinantę antygenową i/lub jest bardziej prawdopodobne, że przekroczą barierę między krwią i mózgiem, niż w przypadku większych cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe lub białka. Sposoby według niniejszego wynalazku są szczególnie przydatne ze względu na to, że mogą być one stosowane do identyfikowania cząsteczek, które selektywnie lub preferencyjnie wiążą się ze zmutowaną postacią prezenilin (bardziej niż z postacią prawidłową), a zatem mogą mieć szczególne zastosowanie w leczeniu heterozygotycznych ofiar tej dominującej autosomalnej choroby.
Ponieważ normalne, fizjologiczne role PSI i PS2 są dotychczas nieznane, związki, które wiążą się z prawidłową, zmutowaną lub obiema postaciami tych prezenilin, mogą mieć zastosowanie w leczeniu i diagnostyce. Związki, które wiążą się jedynie z prawidłową prezeniłiną mogą, przykładowo, działać jako wzmacniacze ich prawidłowej aktywności i w ten sposób przynajmniej częściowo kompensować utratę lub nieprawidłową aktywność zmutowanej postaci prezenilin u ofiar choroby Alzheimera. Związki, które wiążą się do obu, prawidłowej i zmutowanej, postaci prezeniliny mogą mieć zastosowanie, jeżeli wpływają w sposób zróżnicowany na aktywność dwóch postaci, łagodząc wszystkie odchylenia od ich prawidłowej funkcji. Alternatywnie, blokowanie aktywności zarówno prawidłowej, jak i zmutowanej postaci PSI lub PS2 może mieć mniej poważne fizjologiczne i kliniczne konsekwencje, niż normalny postęp choroby, a zatem związki, które wiążą się lub hamują aktywność zarówno prawidłowej, jaki i zmutowanej postaci prezenilin, mogą być przydatne do celów farmaceutycznych. Korzystne jest jednakże zidentyfikowanie związków, które mają wyższe powinowactwo wiązania do zmutowanej prezeniliny, niż do prawidłowej prezeniliny (np. co najmniej
2-10 razy wyższa KJ i które, selektywnie lub preferencyjnie hamują aktywność postaci zmutowanej. Takie związki mogą być identyfikowane poprzez zastosowanie dowolnej z technik tu opisanych, a następnie przez porównanie powinowactwa wiązania związków kandydatów z prawidłowymi i zmutowanymi postaciami PSI lub PS2.
Wpływ czynników, które wiążą się z prezenilinami (postaciami prawidłowymi i zmutowanymi) może być śledzony poprzez bezpośrednie monitorowanie tego wiązanie przy zastosowaniu przyrządów (np. BIAcore, LKB Pharmacia, Sweden) do wykrywania tego wiązania poprzez, przykładowo, zmianę fluorescencji, ciężaru cząsteczkowego lub stężenia bądź czynnika wiążącego, bądź prezeniliny, w fazie rozpuszczonej lub w fazie wiążącej substrat.
Po zidentyfikowaniu metodami opisanymi powyżej, związek-kandydat może być następnie wytwarzany w ilościach wystarczających do podawania jako lek lub testowania (np.pg lub mg lub większych ilościach) i mieszany z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem (patrz Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A., wyd., Mack Pub., 1990). Te związki-kandydaci mogą być następnie podawane transformowanym komórkom według wynalazku, transgenicznym zwierzętom modelowym według wynalazku, liniom komórkowym pochodzącym z modelowych zwierząt lub z pacjentów albo chorym na chorobę Alzheimera. Modele zwierzęce, opisane i udostępnione tutaj, mają szczególne, zastosowanie przy dalszym testowaniu zwiazków-kandydatów, które wiążą się z prawidłową lub zmutowaną prezeniliną, pod kątem ich skuteczności leczniczej.
Ponadto, po zidentyfikowaniu opisanymi powyżej metodami, związki-kandydaci mogą również służyć jako „wyjściowe związki” przy projektowaniu i opracowywaniu nowych leków. Przykładowo, jak dobrze wiadomo w tej dziedzinie, kolejne modyfikacje małych cząsteczek (np. zastąpienie aminokwasów peptydami, podstawienie grup funkcjonalnych związkami peptydowymi lub nie-peptydowymi) są standardowym sposobem postępowania w przemyśle farmaceutycznym przy opracowywaniu nowych leków. Takie opracowywanie generalnie zaczyna się od postaci „związku wyjściowego”, o którym wiadomo, że ma co najmniej pewną
185 549 aktywność (np. wiązanie lub blokowanie PSI) pożądanego leku. Konkretnie, po zidentyfikowaniu jednego lub większej liczby związków mających co najmniej część aktywności będącej przedmiotem zainteresowania (np. aktywność modulującą prezenilinę), porównanie strukturalne związków może w dużej mierze informować biegłego praktyka, sugerując, które części związków podstawowych powinny być konserwowane, a które części można zmieniać przy projektowaniu nowych zwiazków-kandydatów. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów identyfikowania związków wyjściowych, które mogą być stopniowo modyfikowane, z wytworzeniem nowych zwiazków-kandydatów do zastosowania przy leczeniu choroby Alzheimera. Te nowe związki mogą być następnie testowane zarówno pod kątem skuteczności wiązania i blokowania prezeniliny (np. poprzez opisane powyżej testy wiązania), jak i skuteczności leczniczej (np. w opisanych powyżej modelach zwierzęcych). Ta procedura może być powtarzana, dopóki związek o pożądanej aktywności leczniczej i/lub skuteczności nie zostanie zidentyfikowany.
W każdej z niniejszych serii wykonań, przeprowadzany jest test wykrywania wiązania pomiędzy „składnikiem prezenilinowym” i jakąś inną cząsteczką. Szczególnie użyteczne będą kolejne testy, w których związki są testowane pod kątem ich zdolności do wiązania się jedynie z prawidłowymi lub jedynie ze zmutowanymi postaciami funkcjonalnych domen, przy zastosowaniu zmutowanych i prawidłowych postaci składników prezenilinowych w testach wiązania. Można się spodziewać, że takie składniki będą miały największe zastosowanie lecznicze, jak opisano pełniej poniżej. „Składnik prezenilinowy” w tych testach może być kompletną, prawidłową lub zmutowaną postacią prezeniliny (np. wariantu hPSl lub hPS2), ale nie musi być. Można zamiast tego zastosować poszczególne funkcjonalne domeny prezenilin, jak opisano powyżej, bądź jako odrębne cząsteczki, bądź jako część fuzji białkowej. Przykładowo, w celu wyizolowania białek lub związków, które oddziałują z tymi domenami funkcjonalnymi, można prowadzić poszukiwania przy użyciu konstruktów do fuzji i/lub syntetycznych peptydów odpowiadających tym regionom. A zatem, dla PS2, można utworzyć peptydy do fńzji z GST, zawierające sekwencje odpowiadające aminokwasom mniej więcej od 1 do 87 (koniec N), lub 269-387 (pętla tM6—>7) lub dowolnej innej konserwowanej domenie będącej przedmiotem zainteresowania. Dla krótszych domen funkcjonalnych można wytworzyć syntetyczne peptydy odpowiadające, przykładowo, aminokwasom mniej więcej od 107 do 134 (pętla TM1—>2). Podobnie, dla PSI, można wytworzyć peptydy do fuzji z GST lub innych, zawierające sekwencje odpowiadające aminokwasom mniej więcej od 1 do 81 (koniec N) lub 266 do 410 (pętla TM6-»7) lub można wytworzyć syntetyczne peptydy odpowiadające aminokwasom mniej więcej od 101 do 131 (pętla TM1—>2). Jest oczywiste, że możliwe są różne kombinacje fuzji białkowych i domen funkcjonalnych prezenilin i są to jedynie przykłady. Ponadto, domeny funkcjonalne mogą być zmieniane w taki sposób, żeby ułatwiać testowanie, poprzez, przykładowo, wprowadzenie do domeny funkcjonalnej grupy reaktywnej lub reszty aminokwasowej (np. cysteiny), która będzie ułatwiała unieruchomienie na substracie (np. stosując reakcje sulfhydrylowama). A zatem, przykładowo, zsyntetyzowano fragment PSI z pętlą TM1—2 (31-mer), zawierający dodatkową resztę cysternową. Peptyd ten będzie zastosowany do wytworzenia substratu powinowactwa do chromatografii powinowactwa (Sulfo-link; Pierce) do izolowania białek wiążących do mikrosekwencj onowania. Podobnie, można wytworzyć inne funkcjonalne domeny lub fragmenty antygenowe ze zmodyfikowanymi resztami aminokwasewymj (patrz np. Przykład 10).
Białka lub inne związki identyfikowane tymi metodami mogą być oczyszczane i charakteryzowane dowolną ze standardowych metod znanych w tej dziedzinie. Białka mogą być, przykładowo, oczyszczone i rozdzielane przy zastosowaniu technik elektroforetycznych (np. SdS-PAGE, 2d PAGE) lub chromatograficznych (np. HPLC) i mogą być następnie sekwencjonowane. Dla białek z zablokowanym końcem N, w celu uwolnienia fragmentów peptydowych, stosuje się cięcie poszczególnych białek wiążących (np. przy użyciu CNBr i/lub trypsyny). Dalsze oczyszczanie/charakteryzacja poprzez HPLC i mikrosekwencj onowanie i/lub spektrometrię masową za pośrednictwem konwencjonalnych metod dostarcza danych dotyczących wewnętrznej sekwencji takich zablokowanych białek. Dla związków niebiałkowych można stosować niestandardowe techniki analizy chemii organicznej (np. IR, NMR
185 549 i spektrometrię masową; analizę grup funkcjonalnych; promieniowanie X; krystalografię) w celu określenia ich struktury i tożsamości.
Sposoby przeszukiwania lizatów komórkowych, homogenatów tkankowych lub bibliotek małych cząsteczek pod kątem kandydatów na cząsteczki wiążące prezeniliny są dobrze znane w tej dziedzinie i w świetle niniejszego ujawnienia mogą być teraz wykorzystywane do identyfikacji owiąoków, które wiążą się z prawidłowymi i zmutowanymi składnikami prezenilinowymi lub, które modulują aktywność prezenilin, co określono poprzez pomiary niespecyficzne (np. zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ lub stosunku GTP/GDP) lub poprzez pomiary specyficzne (np. zmiany w wytwarzaniu peptydu A(3 lub zmiany w ekspresji innych genów położonych poniżej, które mogą być śledzone poprzez różnicową PCR, elektroforezę 2d, różnicową hybrydyzację lub metody SAGE). Korzystne metody obejmują warianty następujących technik (1) bezpośredniej ekstrakcji poprzez chromatografię. powinowactwa; (2) współizzlacji składnika prezeniilnowegz i owiąoanyah białek lub innych związków poprzez lwwunoprecypltację; (3) testu oddziaływań cząsteczek biologicznych tBizmzlecular Interaction Assay) oraz drożdżowego systemu dwuhybrydzwego. Te i inne są dyskutowane oddzielnie poniżej.
Chromatografia powinowactwa
W świetle niniejszego ujawnienia można stosować różnorodne techniki powinowactwa, dobrze znane w tej dziedzinie, do izolowania białek lub innych związków, które wiążą się z prezenilinami, ujawnionymi lub w inny sposób tutaj udostępnionymi. Generalnie, składnik pr2oenillnzwy można unieruchomić na ^^^Ν2 (np. kolumnie lub filtrze) i doprowadzić do kontaktu roztworu zawierającego testowany związek (owiąoki) z prezeniliną, fuzją lub fragmentem, w warunkach umożliwiających wiązanie. Substrat wypłukuje się następnie roztworem w celu usunięcia nie związanych lub słabo zwiąoanyah cząsteczek. Następnie poprzez drugie płukanie można wymywać związki, które są mocno związane z unl2ruchzmiznyw, prawidłowym lub zmutowanym, składnikiem preoenlilnowzm. Alternatywnie, można unieruchamiać związki testowane i doprowadzić do kontaktu roztworu zawierającego jeden lub więcej składników prezenilinowych z kolumną filtrem lub innym subsjrat2w. Zdolność składnika prez2nllinzw2gz do wiązania się z testowanymi związkawi może być określana jak wyżej lub można zastosować znakowaną postać składnika prezenlbnowegz (np. funkcjonalną domenę wyznakowaną radioaktywnie lub chemilumin2sc2ncyjni2) do szybszego oznaczenia wiązania do związku (owiąoCów) unieruchomionych na subsjraai2. Ponadto, ponieważ zarówno PS1 jak i PS2 uważa się za białka związane z błoną, może być korzystne jeżeli prezeniliny, fuzje lub fragmenty są włączone do podwójnej warstwy lipidowej (np. hposomów) dla ułatwienia ich właściwego sfałdowania. Jest to szczególnie istotne wówczas, gdy stosowany jest składnik prezenilinowy zawierający przynajmniej jedną domenę transbSonzwą. Takie lipzsowy z prezeniliną mogą być unieruchamiane na subctrajach (bezpośrednio lub za pośrednictwem innego elementu w błonie liposomu), przepuszczone przez substraty z unieruchomiionymi testowanymi związkami lub stosowane w dowolnym z różnorodnych innych dobrze znanych testów wiązania dla białek błonowych. Alternatywnie, składnik prezenilinowy może być izolowany we frakcji błonowej z komórek wytwarzających składnik i ta frakcja błonowa może być stosowana w teście wiązania.
Koimmunoprecypitacj a
Inną dobrze caharaCterzozwaną techniką izolowania składników prez2nilinowyah i związanych z nimi białek lub innych związków jest bezpośrednia imwunoprecypijacja z przeciwciałami. Ta procedura została z powodzeniem zastosowana, przykładowo, do wyizolowania wielu białek owiąoanych z pęcherzykami synaptycznymi tPhloiaky i Filds, 1994). A zatem, zarówno prawidłowe, jak i zmutowane, wolne lub związane z błoną składniki preZ2nllinow2 można mieszać w roztworze ze związkiem (zwiąokawi)-kandydatem w warunkach umożliwiających wiązanie i składnik prezenilinowy może podlegać lmwunzpreaypltacji. Białka i inne składniki, które podlegają kolmwunopr2azpitacjl ze składnikiem prezenibnowym mogą być następnie identyfikowane poprzez standardowe techniki, jak opisano powyżej. Ogólne techniki imwunopreczpltaaji można znaleźć na przykład w Harlow i Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY.
185 549
Przeciwciała stosowano w tym toście, jak opisano i udostępniono tutaj, mogą być poliklonalmo lub momklonalno, i obejmują różno fragmenty przeciwciał (np. Fab, Ffabh·), jak również przeciwciała jotcoiαńcuchowo i tomu podobco.
Tost oddziaływań biomolokulamych
Inną użyteczną techniką, wykrywania i izolowania związanych białok jost tost oddziaływań biomuloeulαmych lub system „BIAcoro” stworzony przoz Pharmacia Biosomsor i opisany w protokole producenta (LKJB Pharmacia, Szwecja). W świetle niniejszogo uJawmiomia biegły w toj dziodzicio będzie w stanie, wykorzystując toc systom lub jogo odpowiedni ekwiwalent, zidentyfikować białka lub inno związki mające zdolność wiązania prozoniliny. Systom BIAcoro stosuje oczyszczono poprzez powinowactwo przeciwciała przeciw GST bo umiorunhumionia fuzji białkowych z GST na mikroprocesorze czujnika. Oczywiście można zastosować zamiast togo icno fuzjo białkowo i odpowiobcio przeciwciała. Czujnik wykorzystuje plazmonowy rezonans powierzchniowy, który jost zjawiskiem optycznym wykrywającym zmiany w odczytach załamania. Homogenat tkacki będącej przedmiotom zainteresowania jost przepuszczany przoz unieruchomioną fuzję białkową i oddziaływania białko-białko są rejestrowano jako zmiacy wo współczynniku załamania. Systom ton możo być stosowany do określania kicotyki wiązania i bo badania, czy którekolwiek z obserwowanych wiązań ma znaczenie fizjologiczno.
Drożdżowy systom dwuhybrydowy
Drożdżowy systom „dwuhybryduwy” wykorzystuje czynniki trαmskrypcyJmo, któro składają się z dwóch fizjologicznie odrębnych, funkcjonalnych domon (Phizicky i Fiolds, 1994). Najczęściej stosowany jest systom drożdżowogo aktywatora transkrypcji GAL4, składającego się z Pomocy wiążącej DNA i Pomocy aktywującej transkrypcję. Stosuje się dwa różno wektory bo klonowania bo wytworzenia ^zji domon GAL4 z gonami kodującymi potencjalne miejsca wiązania. Fuzjo białkowo podlegają jednoczesnej oksprosji, są transportowano do jądra i, jeżeli następuje oddziaływacie, aktywacja gonu wskaźnikowego (np. lacZ) prowadzi bo powstania wykrywalnego fenotypu. Przykładowo, można zastosować systom Clontoch Matchmakor Systom-2 z biblioteką cDNA z mózgu w postaci fuzji z domoną aktywacyjną GAL4 z firmy Clontoch, z klonami z fuzją prozomilina-bumona wiążąca GAL4 (Clontoch, Pało Alto, CA). W świotlo mniejszych ujawnień biegły w tej tziodzicio będzie teraz w stanio wytworzyć rozmaito fuzjo prezecilin, włączając w to fuzjo zawierające prawidłowo lub zmutowano Pomocy fuckcjonalco prezecilin i przeszukiwania takich bibliotek w postaci fuzji w celu zidentyfikowania białek wiążących prozoniliny.
Inno motody
Soewomcjo cuklootybowo i produkty białkowo, włączając w to zarówno zmutowano, jak i prawidłowo postaci tych kwasów nukleinowych i odpowiadająco im białka, mogą być stosowano, łącznio z powyższymi technikami, do izolowania innych oddziaływujących białok i identyfikowania incych goców, których ekspresja jest zmieniona przoz nadprodukcję prawidłowych sekwencji prozomilin, poprzez zmniejszoną ekspresję prawidłowych sekwencji prozonilic lub poprzez oksprosję zmutowanych sekwencji prozonilm. Identyfikacja tych oddziaływujących białek, jak również identyfikacja innych gonów, których poziomy oksprosji są zmieniono zo względu na zmutowano sekwencjo prozonilmy (przykładowo), bębą idontyfikować icno docelowo gony, któro mają bozpośrodci związek z patogenezą tych chorób i ich klininzmymi lub patologicznymi postaciami. W szczególności, będą identyfikowano inno gony, któro samo mogą być miejscom innych mutacji powodujących chorobę Alzheimera lub któro samo będą mogły być colom działań leczniczych (np. do zmniejszenia poziomów ich ekspresji do poziomu prawidłowego lub farmakologicznego blokowania efektów ich nadprodukcji) jako potencjalnego sposobu loczonia toj choroby. W szczególności, techniki to zasadzają się ca metodach opierających się o PCR i/lub hybrydyzację dla identyfikacji gonów, któro podlegają różnicowej oksprosji w dwóch różnych warunkach (linio komórkowe wyrażające prawidłowo prozonilicy w porównaniu z tym samym typom komórok wyrażających zmutowaną sekwencję prozoniliny). Techniki to obejmują różnicową PCR, seryjną analizę ekspresji gonu (SAGE), spektrometrię masową, żele białkowo 2D i hybrydyzację z odejmowaniom (przegląd u Nowak i Kahn, 1995).
185 549
Jak będzie oczywiste dla biegłego w tej dziedzinie, istnieje wiele innych metod poszukiwania poszczególnych białek lub innych związków, jak również przeszukiwania dużych bibliotek białek lub innych związków (np. bibliotek fagowych i systemów klonowania z Stratagene, La Jolla, CA) do identyfikacji cząsteczek, które wiążą się z prawidłowymi lub zmutowanymi składnikami prezenilinowymi. Wszystki te metody obejmują etap mieszania prawidłowych lub zmutowanych prezenilin, fuzji lub fragmentów, ze składnikiem mieszaniny testowej, umożliwiając wiązanie (jeżeli takie ma miejsce) i testowanie pod kątem związanych kompleksów. Wszystkie te metody są teraz udostępnione poprzez niniejsze ujawnienie zasadniczo czystych fragmentów domen funkcjonalnych prezenilin, fuzji białkowych prezenilin, przeciwciał prezenilin oraz sposobów ich wytwarzania i zastosowania.
Sposoby identyfikowania związków modulujących aktywność prezeniliny
W innej serii wykonań, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania związków o zdolności modulowania aktywności prawidłowych i zmutowanych prezenilin. Stosowany tu w odniesieniu do tej serii wykonań termin „aktywność” obejmuje swoim szerokim zasięgiem ekspresję genu i białka, posttranslacyjną obróbkę prezeniliny, transport wewnątrzkomórkowy i lokalizację oraz aktywność funkcjonalną (tj. enzymatyczną, receptorowb-efeOtbrową, wiązania, kanałową), jak również efekty związane z dowolnym z nich. Prezeniliny okazują się być integralnymi białkami błonowymi, normalnie związanymi z endoplazmatycznym retikulum i/lub aparatem Golgiego i mogą pełnić funkcje dotyczące transportu lub przemieszczania się APP i/lub regulacji wewnątrzkbmórkbwegb poziomu wapnia. Ponadto, wiadomo, że mutacje prezeniliny są związane ze zwiększeniem wytwarzania peptydów Af3, pojawieniem się płytek amyloidowych i splątanych włókien neurofibrylamych, zmniejszeniem się funkcji myślenia i apoptotyczną śmiercią komórki. A zatem, przy zastosowaniu stransformowanych komórek i transgenicznych modeli zwierzęcych według niniejszego wynalazku, komórek otrzymanych od osób przenoszących zmutowany gen prezeniliny, zwierząt lub osób niosących naturalnie występujące mutacje prezeniliny, jest obecnie możliwe testowanie kandydatów na farmaceutyki i sposobów leczenia pod kątem ich efektów leczniczych poprzez wykrywanie zmian w jednym lub większej liczbie cech funkcjonalnych lub manifestacji fenotypowe) prawidłowej lub zmutowanej ekspresji prezeniliny.
A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza metody poszukiwania lub testowania pod kątem białek, małych cząsteczek lub innych związków, które modulują aktywność prezeniliny poprzez doprowadzenie do kontaktu komórki in vivo lub in vitro ze związkiem-kandydatem i testowanie ze względu na zmianę wskaźnika związanego z prawidłową lub zmutowana aktywnością prezeniliny. Wskaźnik związany z aktywnością prezeniliny może być dowolną mierzalną cechą biochemiczną, fizjologiczną, histologiczną i/lub behawioralną, związaną z ekspresją prezeniliny. W szczególności, użyteczne wskaźniki będą obejmowały dowolną cechą biochemiczną, fizjologiczną histologiczną i/lub behawioralną która odróżnia komórki, tkanki lub zwierzęta przenoszące co najmniej jeden zmutowany gen, od jego prawidłowego odpowiednika. Ponadto, wskaźnikiem może być dowolny specyficzny lub niespecyficzny pomiar aktywności prezeniliny. Specyficzne pomiary prezeniliny obejmują pomiary ekspresji prezeniliny (np. poziomy mRNA lub białka prezeniliny), które mogą wykorzystywać kwasy nukleinowe-sondy lub przeciwciała według niniejszego wynalazku. Niespecyficzne pomiary obejmują zmiany fizjologii komórki, takie jak pH, wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, poziomy cyklicznego AMP, stosunki GTP/GDP, aktywność fosfatydyloinozytolu, fosforylacja białek itd., które można śledzić w urządzeniach takich, jak mikrofizjometr cytosensorowy (Molecular Devices Inc., USA). Aktywacja lub hamowanie aktywności prezeniliny w zmutowanej lub prawidłowej postaci mogą być również śledzone poprzez badanie zmian ekspresji innych genów, które są specyficzne w stosunku do sposobu działania prezeniliny, prowadzącego do choroby Alzheimera. Można je testować przy zastosowaniu takich technik, jak różnicowa PCR, różnicowa hybrydyzacja i SAGE (sekwencyjna analiza ekspresji genów), jak również poprzez dwukierunkową elektroforezę w żelu lizatów komórkowych. W każdym przypadku różnicową ekspresję genów można potwierdzić poprzez porównanie identycznych badań przed i po zastosowaniu związku kandydata. Ponadto, jak zaznaczono gdzie indziej, poszczególne geny, których ekspresja jest modulowana poprzez związek-kandydata, mogą
185 549 być znalezione poprzez klonowanie, ustalenie sekwencji nukleotydowej, sekwencji aminokwasowej lub spektrometrię masową.
W ogólności, komórka może wejść w kontakt ze związklem-kandydatem i po odpowiednim okresie czasu (np. 0-72 godzinach dla większości pomiarów biochemicznych w hodowlach komórek), można testować wskaźnik aktywności prezeniliny l porównywać go z pomiarem podstawowym. Pomiar podstawowy może być dokonywany przed kontaktem komórki ze związklem-kandydatem lub może być zewnętrznym poziomem podstawowym ustalonym w innych doświadczeniach lub znanym w tej dziedzinie. Komórki mogą być komórkami stransformowanymi według niniejszego wynalazku lub przeszczepione ze zwierzęcia lub osobnika. Konkretnie, komórki mogą być przeszczepione od nosiciela mutacji βrezemilimy (np. osoby z chorobą Alzheimera) lub zwierzęcia modelowego według wynalazku (np. transgemicznego mlciemia lub myszy przenoszącej zmutowany gen βrezemilimy). Dla zwiększenia wpływu mutacji preoemilimy na szlak AP, można zastosować tramsgenicone komórki lub zwierzęta, które mają zwiększony poziom wytwarzania Ap. Korzystnymi komórkami są komórki z tkanek neurologicznych, takich jak neuronowe, glejowe lub mieszane hodowle tkankowe oraz hodowle fibroblastów, komórki wątroby, nerki, śledziony lub szpiku kostnego. Komórki można kontaktować ze zwlązkaml-kandydatami w hodowli in vitro lub mogą być podawane in vivo żywemu zwierzęciu lub osobie. W przypadku żywych zwierząt lub osób, testowany związek może być podawany doustnie lub dowolną drogą pozajelitową odpowiednią dla związku. Przy testach klinicznych w przypadku ludzi, pomiary mogą być przeprowadzane okresowo (np. codziennie, co tydzień lub miesiąc) przez kilka miesięcy lub lat.
Ponieważ większość nosicieli mutacji prezenilmy będzie heterozygotyczna (tj. przenosząca jeden prawidłowy i jeden zmutowany allel prazenilmy), związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania zarówno prawidłowej, jak i zmutowanej aktywności prazenllmy. A zatem, przykładowo, związki, które wzmacniają funkcję prawidłowych prezenUm mogą mieć zastosowanie do leczenia chorób związanych z prezenilmami, takich jak choroba Alzheimera. Alternatywnie, ponieważ supresja aktywności zarówno prawidłowej, jak i zmutowanej prezeniliny w osobniku heterooygotycomym może mieć mniej poważne konsekwencje kliniczne niż rozwój owiązamej z nią choroby, może być pożądane zidentyfikowanie związków, które maktywują lub znoszą efekt aktywności wszystkich postaci prezenUm. Korzystne jest, jednakże, jeżeli identyfikowane są związki, które selektywnie lub specyficznie maktywują lub znoszą efekt aktywności zmutowanej prezenilmy bez uszkodzenia funkcji prawidłowego genu lub białka prezeniliny.
W świetle identyfikacji, charakteryzacji i ujawnienia tutaj genów i hiałek prezenUm, kwasów nuklelnowych-sond dla prezenUm i przeciwciał, oraz komórek transformowanych βrezemilmą i transgenicomych zwierząt według wynalazku, biegły w tej dziedzinie będzie teraz w stanie przeprowadzić wiele różnorodnych testów, które będą wykrywały modulację aktywności prezenilm poprzez zwlązki-kandydatów. Szczególnie korzystne i rozważane wykonania są dyskutowane, z uwzględnieniem pewnych szczegółów, poniżej.
A. Ekspresja prezenUm
W jednym wykonaniu zastosowano specyficzne pomiary ekspresji βrezemillny do przetestowania zwlązków-kandydatów pod kątem ich zdolności do wpływania na aktywność prezenUm. A zatem, stosując kwasy nukleinowe dla prezenUm i przeciwciała, ujawnione i w inny sposób tutaj udostępnione, można zastosować poziomy mRNA lub poziomy białka jako wskaźniki zdolności zwlązku-kandydata do modulowania aktywności βrezemiliny. Zastosowanie takich sond i przeciwciał do mierzenia ekspresji genu i białka jest dobrze znane w tej dziedzinie i dyskutowane tutaj w innym miejscu. Przedmiotem szczególnego zainteresowania może być identyfikacja związków, które zmieniają relatywne poziomy różnych wariantów składania prezemllimy. Przykładowo, wiele mutacji prezenUm związanych z chorobą Alzheimera jest umiejscowionych w regionie potencjalnej pętli TM6—>7, która jest przedmiotem alternatywnego składania w niektórych tkankach obwodowych (np. białych komórkach krwi). Związki, które mogą zwiększać względną częstość takiego sposobu składania, mogą być jednocześnie skuteczne w zapobieganiu ekspresji mutacji w tym regionie.
185 549
Lokalizacja wewnątrzkomórkowa
W innym wykonaniu związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania aktywności prezenilin w oparciu o ich wpływ na transport i wewnątrzkomórkową lokalizacje prezenilin. Prezeniliny zostały zlokalizowane immunocytochemicznie w strukturach białkowych związanych z endoplazmatycznym retikulum i aparatem Golgiego, a jedna zmutowana prezenilina (H163R), ale nie inne, została zaobserwowana w małych cytoplazmatycznych pęcherzykach o nieznanej funkcji. Różnice w lokalizacji zmutowanych i prawidłowych prezenilin mogą zatem wnieść wkład do etiologii chorób związanych z prezeniliną. A zatem związki, które mogą wpływać na lokalizację prezenilin, można traktować jako potencjalne leki. Można zastosować standardowe techniki znane w tej dziedzinie do wykrywania lokalizacji prezenilin. W ogólności, techniki te mogą wykorzystywać przeciwciała według niniejszego wynalazku, a w szczególności przeciwciała, które selektywnie wiążą się z jedną lub większą liczbą mutantów prezenilin, ale nie z prawidłowymi prezenilinami. Jak dobrze wiadomo w tej dziedzinie, takie przeciwciała mogą być znakowane dowolną z różnorodnych technik (np. stosując znaczniki fluorescencyjne lub radioaktywne, wyznakowanie drugorzędowe przeciwciała, awidynę, biotynę, itd.) dla ułatwienia uwidocznienia wewnątrzkomórkowej lokalizacji prezenilin. Prezeniliny mogą być współlokalizowane w poszczególnych strukturach, jak to jest znane w tej dziedzinie, przy zastosowaniu przeciwciał wobec markerów dla tych struktur (TGN38 dla aparatu Golgiego, receptor transferyny dla transportu post-Golgi, LANP2 dla lizosomów). Można również stosować filtry Western z oczyszczonymi frakcjami z lizatów komórkowych, wzbogaconych w różne wewnątrzkomórkowe, związane z błonami organelle (np. lizozomy, synaptozomy, aparat Golgiego). Ponadto można testować względną orientację różnych domen prezeniliny w stosunku do domen komórkowych, przykładowo, poprzez mikroskopię elektronową i przeciwciała wytworzone przeciw tym domenom.
Regulacja jonów/metabolizmu
W innym wykonaniu, związki mogą być poszukiwane pod kątem ich zdolności do modulowania aktywności prezenilin w oparciu o pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów Ca2+, Na'. lub K+ lub metabolizm. Jak wspomniano powyżej, prezeniliny są białkami związanymi z błonami, które mogą służyć jako, lub oddziaływać z receptorami jonów lub kanałami jonowymi. A zatem, związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania metabolizmu wapnia lub innego jonu zależnego od prezeniUny, in vivo bądź in vitro, poprzez pomiar przepływu jonów przez kanał i/lub napięcia transbłonowego lub przepływu prądu, przy użyciu połączonych zacisków, zacisków do mierzenia napięcia i barwników fluorescencyjnych wrażliwych na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia lub napięcie trαnsbłonewe. Funkcja kanału jonowego lub receptora może także być testowana poprzez pomiar aktywacji drugiego przekaźnika, takiego jak cykliczny AMP, kinazy tyrozynowe cGMP, fosfatazy, wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ itp. Otrzymane na drodze rekombinacji białka mogą być także rekonstruowane w systemach sztucznych błon w celu badania przewodnictwa jonów przez kanał i dlatego „komórki” użyte w takich testach mogą obejmować sztuczne błony lub komórki. Testy pod kątem zmian w regulacji lub metabolizmie jonów mogą być wykonywane w hodowlach komórkowych wyrażających endogenne, prawidłowe lub zmutowane, prezeniliny. Takie badania mogą być także wykonywane na komórkach transfekowanych wektorami zdolnymi do ekspresji jednej z prezenilin lub domeny funkcjonalnej jednej z prezenilin, w postaci prawidłowej lub zmutowanej. Dodatkowo, dla wzmocnienia sygnału mierzonego w takich testach, komórki mogą być kotransfekowane genami kodującymi białka kanału. Przykładowo, oocyty Xenopus lub komórki nerki szczura (HEK293) mogą być kotransfekowane prawidłowymi lub zmutowanymi sekwencjami prezenilin i sekwencjami kodującymi podjednostki pl Na+ z mózgu szczura, podjednostki pi Ca+ z mięśni szkieletowych królika lub podjednostki pi K+z serca szczura. Zmiany w aktywności kanału jonowego, związanej z prezeniliną lub zależnej bezpośrednio od prezeniliny, można mierzyć poprzez odczyty dla dwu-mikroelektrodowych zacisków do pomiaru napięcia w oocytach lub przez pomiar dla całych komórek z zastosowaniem połączonych zacisków, w przypadku komórek HEK293.
185 549
Apoptoza lub śmierć komórek
Alternatywnie, związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania aktywności prezenilin w oparciu o ich wpływ na apoptozę lub śmierć komórek, związanych z prezeniliną lub zależnych bezpośrednio od prezeniliny. Tak więc, przykładowo, można ustalić poziom podstawowy szybkości zachodzenia apoptozy lub śmierci komórek w hodowli lub można określić stopień utraty neuronów w danym wieku, po śmierci zwierząt modelowych lub ludzi, i można zmierzyć zdolność związku-kandydata do supresji lub hamowania apoptozy lub śmierci komórek. Śmierć komórek można mierzyć standardowymi technikami (np. mikroskopii świetlnej), a apoptozę można mierzyć bardziej specyficznie poprzez charakterystykę morfologii jądra lub wzór fragmentacji DNA w postaci drabinki nukleosomów (patrz np. Gavrieli i wsp., 1992; Jacobson i wsp., 1993; Vito i wsp., 1996). Można również zastosować technikę TUNEL do oceny śmierci komórek w mózgu (patrz np. Lassmann i wsp., (1995)). W korzystnych wykonaniach, związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do supresji lub hamowania utraty neuronów u modelowych zwierząt transgenicznych. Transgeniczne myszy, przenoszące, przykładowo, zmutowany ludzki, zmutowany mysi lub humanizowany zmutowany gen prezeniliny mogą być stosowane do identyfikacji lub oceny związków, które mogą opóźniać lub zatrzymywać neurodegenerację związaną z chorobą Alzheimera. Podobnie, modelowe muszy transgęniczne, przenoszące zmutowany gen APP, zostały ostatnio opisane przez Games i wsp. (1995).
Wytwarzanie Peptydu Ap.
W innej serii wykonań, związki mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania zmian w obróbce APP związanych z prezeniliną lub zależnych bezpośrednio od prezeniliny. Peptyd Ap jest wytwarzany w kilku izoformach, które powstają na skutek różnic w obróbce APP. Peptyd AP jest pochodną PAPP złożoną z 39 do 43 aminokwasów, która jest stopniowo odkładana w płytkach dyfuzyjnych i starczych oraz w naczyniach krwionośnych osób z AD. W ludzkim mózgu, peptydy AP są heterogenne, zarówno na końcach N, jak i C. Kilka obserwacji sugeruje jednakże, że zarówno peptydy pełnej długości, jak i skrócone na końcu N formy peptydów z długimi ogonami, kończące się w pozycji aminokwasowej 42 lub 43 (tj. Api-42/43 ϊΑβχ-42/43) odgrywają ważniejszą rolę w aD niż peptydy kończące się w pozycji 40. A zatem, obecność ΑβΙ-42/43 i Αβχ-42/43 stanowi wcześnie pojawiającą się i główną cechę zarówno płytek starczych, jak i płytek dyfuzyjnych, podczas gdy peptytdy kończące się w pozycji 40 (tj. AP 1-40 i Apx-40) są przede wszystkim związane z częścią dojrzałych płytek i z amyloidowymi naczyniami krwionośnymi (patrz np. Iwatsubo i wsp., 1995; Gravina i wsp., 1995; Tamaoka i wsp., 1995; Podlisny i wsp., 1995). Ponadto, izoformy o długich ogonach mają większą, skłonność do tworzenia włókien i uważa się, że są bardziej neurotoksyczne niż peptydy ΑβΙ-40 (Pike i wsp., 1993; Hilbich i wsp., 1991). W końcu, mutacje missens w kodonie 717 genu pAPP związane z wczesną postacią FAD prowadzą w rezultacie do nadprodukcji AP z długimi ogonami w mózgu dotkniętych mutacją nosicieli, a w komórkach obwodowych i osoczu nosicieli zarówno dotkniętych chorobą, jak i przed wystąpieniem objawów oraz w liniach komórkowych transfekowanych zmutowanym cDNA pAPP717 (Tamaoka i wsp., 1994; Suzuki i wsp., 1994). Jak opisano w przykładzie 18 poniżej, ujawniamy obecnie, że zwiększenie wytwarzania długich form peptydu AP jest również związane z mutacjami w genach prezeniliny.
A zatem, w jednej z serii wykonań, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów poszukiwania związków-kandydatów pod kątem ich zdolności do blokowania lub hamowania zwiększonego wytwarzania długich izoform peptydów AP w komórkach lub zwierzętach transgenicznych wyrażających zmutowany gen prezeniliny. Konkretnie, niniejszy wynalazek dostarcza takich sposobów, w których hodowane komórki ssacze, takie jak komórki mózgu lub fibroblasty, zostały stransformowane zgodnie z ujawnionymi tu sposobami, lub w których zwierzęta ^^gen^zne, takie jak gryzonie lub naczelne z wyłączeniem ludzi, zostały wytworzone ujawnionymi tu sposobami w celu uzyskania ekspresji stosunkowo wysokich poziomów zmutowanej prezeniliny. Ewentualnie, takie komórki lub transgenicznę zwierzęta mogą być również transformowane tak, aby wyrażały prawidłową formę białka PAPP na stosunkowo wysokich poziomach.
185 549
W tej serii wykonań, związek-kandydat jest podawany liniom komórkowym lub zwierzętom jransgeniaznyw (np. poprzez dodawanie do podłoża dla komórek w hodowli; lub poprzez podawanie doustne lub pozajelitowe zwierzętom) i, po odpowiednim okresie czasu (np. 0-72 godzinach dla komórek w hodowli, dniach lub wi2siacaah dla zwierząt modelowych), próbki biologiczne są zbierane (np. supernatant znad hodowli komórek lub lizaty komórkowe z hodowli komórkowych; hzwogenajy tkankowe lub osocze od zwierząt) i testowane pod kątem poziomu długich izoform peptydów Άβ. Poziomy peptydów można ustalić w wartościach bezwzględnych (np. nmzl/ml) lub względnych (np. stosunek długich do krótkich izoform Άβ). Izoformy Άβ można wykrywać dowolnym ze sposobów znanych w tej dziedzinie (np. rozdział 2l2ktrzfzr2jycony lub S2kwencjznzwanie), ale korzystniej jest, jeżeli do określania bezwzględnych lub względnych poziomów peptydów Άβ1-42/43 lub Άβχ-42/43 stosowane są pro2ciwaiała wykazujące swoistość wobec długiej izoformy. Potencjalne farmaceutyki lub terapie, które obniżają bezwzględne lub względne poziomy tych długich izoform, w szczególności w modelowych zwierzętach transgenicznzch według wynalazku, będą mogły mieć prawdopodobnie zastosowanie terapeutyczne w leczeniu choroby Alzheimera lub innych chorób powodowanych przez mutacje prezenibny lub zaburzenia w metabolizmie APP.
E. Fosforylacja białek związanych z mikrojubuiawi
W innej serii wykonań, owiąoki-kandzdaci mogą być testowane pod kątem ich zdolności do modulowania aktywności prezeniliny poprzez badanie wpływu zwląoCu na poziomy fosforylacji białek związanych z mikrojubulami (MAP), takich jak Tau. Nieprawidłowa fosforylacja Tau i innych MPA w mózgach ofiar choroby Alzheimera jest dobrze znana w tej dziedzinie. A zatem, związki, które zapobiegają lub hamują nieprawidłową fosforylację MAP mogą mieć zastosowanie w leczeniu chorób związanych z pr2Z2nllinawi, takich jak AD. Jak wyżej, można zastosować komórki ze zdrowych lub zmutowanych zwierząt lub osób albo transformowane linie komórkowe i zwierzęta modelowe według wynalazku. Korzystne testy będą stosowały linie komórkowe albo zwierzęta modelowe transformowane zmutowanym ludzkim lub zmutowanym humanizowanym genem prezenibny^. Można ustalić podstawowy stan fosforylacji MAP w tych komórkach, a następnie można testować owiąoki-kandydatów pod kątem ich zdolności do zapobiegania, hamowania lub przeciwdziałania hiperfosforylacji związanej z mutacjami. Stan fosforylacji MAP można określić dowolną standardową metodą znaną w tej dziedzinie, ale korzystnie jest stosować przeciwciała, które wiążą się wybiórczo z fosforytow^ymi lub nie fosforylowanymi 2pijzpami. Takie przeciwciała do fosforowanych epitopów białka Tau są znane w tej dziedzinie (np. ALZ50).
9. Testy przesiewowe i diagnostyka dla choroby Alzheimera
A. Ogólne metody diagnostyczne
Geny prezenilin i produkty genów, jak również sondy pochodzące od prezenibny, startery i przeciwciała, ujawnione lub w inny sposób tutaj udostępnione, są użyteczne przy poszukiwaniach nosicieli alleli związanych z chorobą Alzheimera i do diagnozowania osób dotkniętych chorobą Alzheimera oraz do poszukiwań i diagnozowania pokrewnych starczych i przedcjarczyah demencji, chorób psychicznych, takich jak schizofrenia i depresja, chorób neurologicznych, takich jak udar i krwotok mózgowy, które obserwuje się, w większym lub mniejszym stopniu, u ludzi niosących mutacje w genach PS1 lub PS2 lub w genie APP. Osoby z ryzykiem wystąpienia choroby Alzheimera, takie jak te, u których są przypadki AD w rodowodzie rodzinnym lub osoby, o których nie było wiadomo, żeby miały być obciążone ryzykiem, mogą być rutynowo przetestowane przy zastosowaniu sond do wykrywania obecności zmutowanego genu prezeniliny lub białka poprzez zastosowanie różnorodnych technik. Diagnoza przypadków dol2doicznych tych chorób może być dokonana metodami opartymi 0 kwasy nukleinowe (włączając w to sekwencje genomowe i mRNA/cDNA), białka i/lub przeciwciała ujawnione i udostępnienie tutaj, włączając w to testy funkcjonalne zaprojektowane do wykrywania braku lub zwiększenia prawidłowej aktywności prezeniliny i/lub obecności specyficznych nowych aktywności uwarunkowanych zmutowanymi prezenllinawi. Korzystnie, jeżeli sposoby i produkty wytwarzania opierają się o kwasy nukleinowe, białka 1 przeciwciała dla ludzkich PSI i PS2, ujawnione i w inny sposób tutaj udostępnione. Jednakże, co będzie zczzwisj2 dla biegłego w tej dziedzinie, znacząca konserwacja ewolucyjna du185 549 żych części sekwencji /uklentndowych i ami/okwasnwych PSI i PS2, nawet dla gatunków tak odległych jak ludzie, myszy, C. elega/s i Daosophjln, umożliwia biegłemu w toj dziedzinie zastosowa/io takich kwasów /ukioi/ownch, białek i przeciwciał dla homologów paoze/ilion nie pochodzących od człowieka, rów/ież do zastosowań skierowaondh wobec ludzi i i/nych obiektów zwiorzędydh. A zatem, dla zwięzłości pazedstawje/in, ale boz ogrnojcznoja zakresu wynalazku, następujący dalej opis będzie skupiał się na zastosowaniu ludzkich homologów pSi i PS2. Będzie jednakże zrozumiałym, żo sekwencje homologiczne z j/onch gatunków, włączając w to to opisano tutaj, będą w wielu przypadkach zastosowań rówooważOO.
Co będzie dodooiooe przez biegłego w tej dziodzi/ie, wybór metody ding/nstnczoej według /j/iojszego wynalazku będzie zależał od natury dostępnych próbek bjolngjdoondh, które mają być testowano i od natury wymaganych informacji. PsI, na przykład podlega wysokiej ekspresji w tkance mózgowej, ale biopsje mózgu są procedurami inwazyjnymi i kosztownymi, soczogóloio przy rutynowych testach. Jednakże w jo/nch tkankach, w których następuje ekspresja PSI na wysokim poziomie, może następować alternatywno składa/io (np. w limfocytach) i dlatego mRNA lub białko PSI z takich komórek może być mojOj informacyjne. A zatem, możo być korzystny test w oparciu o go/omowy DNA PSI z danego obiektu, ponieważ żadne informacje nie będą zależne od alternatywnego składnoia i ponieważ zasadniczo dowolna komórka zawierająca jądro możo dostarczyć użyteczną próbkę. Przy diagnostyce w oparciu o i/no proze/ilmy (np. hPS2, mPSl) bierze się pod uwagę podobno uwarunkowania: dostępność tkanki, poziom ekspresji w różnych tkankach, alternatywny mRNA i produkty białkowo powstające w wyniku alternatyw/ogo skindnojn.
B. Tosty przesiewowe i diagnostyka w oparciu o białko
Kiedy tost diagoostnczon opiera się o białka paezoojljo, możliwe są różno anowjąoama. Przykładowo, diagnostyka może być dokonana poprzez śledzenie róż/ic ruchliwości olektroforetydz/oj prawidłowych i zmutowanych białek. Takie podejścio będzie sodzogólmo użyteczne przy idootnfikowaoiu mutantów, w których obecno są podstawienia zo zmianą ładunku, lub w których wstawienia, delacje lub zmiany dają w rezultacie znaczącą zmianę w migracji elektrofor-tycz/ej powstałego w rezultacie białka. Alternatywnie, diagnoza możo być oparta na różnicy wo wzorze cięcia proteolityczoegz prawidłowych i zmutowanych białek, aóżmcadh w stosunkach molowych różnych aminokwasów lub poprzez tosty fuokdjoonloo wykazujączmie/io/ą funkcję produktu ge/u.
W koaonstonm wnoalnoku, diagnostyka w oparciu o białka będzie wykorzystywała różnice w zdolności przeciwciał do wiązania się z prawidłowymi i zmutowanymi prezo/ili/ami (a w szczególności hSPl lub hSP2). Takie testy diag/nstydzoo mogą wykorzystywać przociwciała, któro wiążą się z prawidłowymi białkami, alo nio z białkami zmutowanymi lub vico versa. W szczegól/ości, może być stosowany test, w którym stosowanych jost kilka różnych mo/oklooalonch paoodiwdjał, każde zdolne do wiązania zmutowanego epitopu. Poziomy wiązania się paoodjwcjał przeciw mutantowi w próbce otrzymanej od testowanego obiektu (uwidocznione poprzez, przykładowo, znakowanie radioaktywne, test ELISA lub chomilu-mmosce/cję) mogą być porównywano z poziomami wiązania w próbce knotroiooj. Alternatywni-, można zastosować proodiwcjała, które wiążą się z prawidłowymi, alo nio ze zmutowanymi prozooiljonml i zmoiejszeojo się poziomu wiązania przeciwciała może być stosowano do odróżnio/ia zdrowych homozngotncooydh osobników od zmutowanych hoterozygot i/lub homozygot. Taka diagnostyka poprzez przeciwciała może być stosowana w tostach immuoochomjdoonch in vitro przy zastosowa/iu próbek z biopsji tka/ok CNS, otrzymanych przed śmi^r^r^. lub po śmjeacj, włączając w to struktury oouropatologjczoe zwjązaoe z tymi chorobami, takie jak sploty /euaofjbanlnmo lub płytki nmnlzjdowe lub może być stosowana dla próbek płynów, takich jak płyn mózgzwo-adooojowy lub tkanek obwodowych, takich jak biało ciałka krwi.
C. Testy paoosiownwo i diagnostyka w oparciu o kwasy oukloloowo
Gdy tost diago.ostndzoy ma być oparty o kwasy nuklomowo w próbce, tost możo opierać się o mRNA, cDNA lub DNA go/omowy. Jeżeli użyty jost mRNA z próbki, ma tu zastosowanie wiolo z takich samych uwarunkowań w od/losio/ju do źródła tka/ok i możliwości altor/atyw/ogo składnia. To ooadzy, ekspresja może być bardzo mała lub możo być brak okspaesjj tra/skryptów, o ile nio zostanie wybrane lub nio jest dostępno odpowiednio źródło tkanki,
185 549 a alternatywne składanie może dawać w rezultacie utratę pewnych informacji lub trudność w ich interpretacji. Jednakże, pokazaliśmy już uprzednio (Sherrington i wsp., 1995; Rogaey, 1995), że mutacje w 5' UTR, 3' UTR, otwartej ramkce odczytu i miejscach składania zarówno w PSI, jak i PS2 mogą być łatwo zidentyfikowane w mRNA/cDNA izolowanym z białych ciałek krwi i/lub fibroblastów skóry. Przy testowaniu mRNA, cDNA, jak i genomowego DNA można stosować standardowe metody, dobrze znane w tej dziedzinie, do wykrywania obecności konkretnej sekwencji, in situ, bądź in vitro (patrz, np. Sambrook i wsp., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY). Jednakże w ogólności, można badać dowolną tkankę z komórkami jądrowymi.
Genomowy DNA używany do diagnozy może być otrzymany z komórek ciała, takich jak obecne we krwi, tkance z biopsji, próbce chirurgicznej lub materiale z sekcji. DNA można izolować i używać bezpośrednio do wykrywania specyficznej sekwencji lub może on być powielany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przed analizą. Podobnie, można również użyć RNA lub cDNA z, lub bez powielania DNA. Dla wykrycia specyficznej sekwencji kwasu nukleinowego, można zastosować bezpośrednie sekwencjonowanie DNA, hybrydyzację z zastosowaniem specyficznych oligonukleotydów, trawienie i mapowanie enzymami restrykcyjnymi, mapowanie PCR, ochronę przed RNazą, chemiczne cięcie nie sparowanych nukleotydów, wykrywanie za pośrednictwem ligazy i różne inne metody. Oligonukleotydy specyficzne wobec poszczególnych sekwencji mogą być syntetyzowane chemicznie i wyznakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie (np. znacznikiem biotynylowym, bromkiem etydyny) i hybrydyzowane do poszczególnych próbek unieruchomionych na filtrach lub innych podłożach stałych (np. poprzez nakraplanie na filtr lub przeniesienie z żeli po elektroforezie) lub w roztworze. Obecność lub brak sekwencji docelowych można uwidaczniać przy zastosowaniu metod takich, jak autoradiografia, fluorometria lub kolorymetria. Te procedury mogą być automatyzowane przy użyciu nadmiarowych, krótkich nukleotydów o znanej sekwencji związanych przy dużej gęstości z silikonowym mikroprocesorem.
Odpowiednie sondy i startery
Przy hybrydyzacji, ochronie przed RNazą, wykrywaniu za pośrednictwem ligazy, powielaniu PCR i różnych innych standardowych metodach, opisanych tu i dobrze znanych w tej dziedzinie, przydatnych będzie, jako sondy i/lub startery, wiele różnych fragmentów sekwencji prezenilin, ujawnionych i w inny sposób tu udostępnionych. Te sekwencje lub fragmenty sekwencji będą obejmowały zarówno prawidłowe sekwencje prezenilin, jak i szkodliwe sekwencje zmutowane. W ogólności, uż yteczne sekwencje będą obejmowały co najmniej 8-9, korzystniej 10-50, a najkorzystniej 18-24 następujących po sobie nukleotydów z intronów, eksonów lub pogranicza intron/ekson prezenilin. W zależności od sekwencji docelowej, wymaganej specyficzności i przyszłego rozwoju technologicznego, mogą również być zastosowane krótsze sekwencje. A zatem, dowolna sekwencja prezenilin, która jest stosowana do izolowania, klonowania, powielania, identyfikacji lub innego rodzaju manipulacji sekwencją prezenilin może być uważana za odpowiednią sondę lub starter. Szczególnie brane pod uwagę jako przydatne będą sekwencje, obejmujące pozycje nukleotydowe z genów perenizyliny, dla których wiadomo, że zawierają mutacje wywołujące chorobę, lub sekwencje, które otaczają te pozycje nukleotydowe
Sondy i startery PSI
Jak dyskutowano powyżej, zostały obecnie zidentyfikowane różnorodne mutacje będące przyczyną choroby. Wykrycie tych i innych mutacji PSI jest teraz możliwe przy zastosowaniu izolowanych kwasów nukleinowych, sond i starterów, pochodzących z prawidłowych i zmutowanych genów PSI. Szczególnie brane pod uwagę jako użyteczne są sondy lub startery, pochodzące z sekwencji zakodowanych na końcu N, w regionie TM1-TM2 oraz w regionie TM6-TM7. Jednakże, jak ujawniono powyżej, opisane już zostały mutacje, które dotyczą innych regionów białka PSI i, stosując ujawnione tu metody, będzie można bez wątpienia wykryć nowe. Dlatego niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych kwasów nukleinowych, sond i starterów, odpowiadających prawidłowym i zmutowanym sekwencjom z dowolnej części genu PSI, włączając w to introny oraz 5' i 3' UTR, dla których można wykazać, że są związane z rozwojem choroby Alzheimera.
185 549
Jodynie jako przykład, boz ograniczania wynalazku, przy tostach przesiewowych i w metodach diagnostycznych mogą być stosowaco sondy i startery pochodzące z fragmentu DNA hPSl, bezpośrednio otaczającego mutację C410Y. Mutacjo to pojawiają się, przynajmniej u niektórych osób, na skutek podstawienia G w miejsce A w pozycji 1477 SEK NR ID: 1. A zatem, gonomowy DNA, mRNA lub cDNA pozyskany z próbek krwi obwodowej od dacoj osoby możo być przetestowany przy zastosowaniu sond oligunuklootydowaych lub starterów zawierających to potencjalne miejsce mutacji. Do sont do hybrydyzacji bla toj mutacji można zastosować sondy 8-50, korzystniej 18-24 nuklootytowo obejmujące miejsce mutacji (np. nuklootydy 1467-1487 z SEK NR ID: 1). Jożoli socta ma być zastosowana dla mRNA, powinna być ona oczywiście komplementarna to mRNA (a zatom odpowiadać nici miokubująnoj gocu PS1). Dla socb bo zastosowania z gonomowym DNA lub cDNA, sonda możo być komplementarna to każdej z mini. Aby wykryć sekwencjo zawierające tą mutację metodami PCR, odpowiednio startery powinny obejmować sekwencjo o długości 8-50, a korzystnie 18-24 cuklootydów, pochodzące z regionów otaczających mutację z obu stron i któro odpowiadają dowolnym pozycjom muklootyduwym ob 1 bo 1000, ale korzystniej znajdujące się w odległości 1-200 nuklootydów od miejsca mutacji. Startery PCR, któro znajdują się po stronie 5' zmutowanego miejsca (na nici kodującej) powinny odpowiadać pob względom sekwencji nici kodującej gonu PSI, podczas gty startery PCR, któro znajdują się po stronie 3' miejsca mutacji (ca nici kodującej) powinny odpowiadać nici niokobującoj lub amtysomsuwmęj (np. starter 5' odpowiadający nukloutydum 1451-1468 z SEK NR ID: 1 i starter 3' odpowiadający sekwencji komplementarnej do nuklootydów 719-699 z SEK NR ID: 14).
Podobno startery można wybrać dla innych mutacji PSI lub dla ogólnie „gorących miejsc” mutacyjnych. Przykładowo, starter 5' bla mutacji M146L (A—C w pozycji muklootydowoj 684) możo zawierać sekwencję odpowiadającą w przybliżeniu cueloutydom 601-620 z SEK NR ID: 1, a starter 3' może odpowiadać sekwencji komplementarnej Po mukloutydów 1328-1309 z SEK NR ID: 8. Należy zauważyć, żo toc przykład wykorzystuje startery zarówno z sokwoncji intronowych, jak i oksocowych. Jako icny przykład, odpowiedni starter 5' dla mutacji A246E (C—A w pozycji nukloutydowęj 985) możo zawierać sekwencję odpowiadającą w mmięj więcej mukloutydom 907-925 z SEK NR ID: 1, a starter 3' możo odpowiadać sokwoncji komplementarnej do nukloutydów 1010-990 z SEK NR ID: 1. Jako icny przykład, odpowiedni starter 5' dla mutacji H163R (A—G w pozycji nukloutydowoj 736 w SEK NR ID: 1 lub 419 w SEK NR ID: 9) możo zawierać sekwencję odpowiadającą w mmięj więcej mukloutydom 354-375 w SEK NR 1D: 9, a starter 3' możo' odpowiadać sokwoncji komplementarnej do cukloutytów 581-559 w SEK NR ID: 9. Podobnie, sekwencjo ictrocowo lub okgonowo mogą być zastosowano, przykładowo, to wytworzenia startera 5' tla mutacji L286V (C—G w pozycji cukloutydowęj 1104 w SEK NR iD: 1 lub 398 w SEK NR ID: 11), odpowiadająco mniej więcej nukloutydom 249-269 bp w SEK NR ID: 11 lub 1020-1039 bp w sEk NR ID: 1, a starter 3'możo odpowiadać sokwoccji komplementarnej do nukleutytów 510-491 w SEK NR ID: 11.
Należy również zauważyć, żo sonty i startery mogą obejmować specyficzno zmutowano πη^ο^υν. A zatem, przykładowo, można wytworzyć sondę hybrydyzacyjną lub starter 5' dla mutacji C410Y, odpowiadającą w mniej więcej nukleutydom 1468-Ń86 w SEK NR ID: 1, do przeszukiwania pod kątem alloli prawidłowych lub ich powielania albo odpowiadającą toj samej sekwoncji, ale zo zmienionym nukleotybem w pozycji 1477 (G—T) bo poszukiwania lub powielania alleli zmutowanych.
Socdy i startery PS2
Te samo ogólce rozważania, opisane powyżej w odniesieniu bo sond i starterów dla PS1, stosują się w równej miorze do sond i starterów dla PS2. Konkrotnio, sondy lub startery mogą odpowiadać sekwencjom intronowym, oksumuwym oraz sekwencjom DNA z pogranicza intron/oksum, mogą odpowiadać sekwencjom nici kodujących lub miokubujanynh (antysonsownych) oraz mogą odpowiadać sokwoncjom prawidłowym lub zmutowanym.
Jedynie jako przykład, mutacja N141I PS1 (A—T w pozycji nuklootydowej 787) możo być poszukiwana poprzez powielanie PCR otaczającego fragmentu DNA, przy zastosowaniu startera 5' odpowiadającego w mnioj więcej nukleotytom 733-751 z SEK NR ID: 18 oraz startera 3' odpowiadającego w mniej więcej sekwencji komplementarnej do nukleutybów 846-829
185 549 z SEK NR ID: 18. Podobnie, starter 5' dla mutacji M239V (A-»G w pozycji nukleotydowej 1080) może zawierać sekwencję odpowiadającą w przybliżeniu 1009-1026, a starter 3' może odpowiadać sekwencji komplementarnej do nukleotydów 1118-1101 z SEK NR ID: 18. Jako inny przykład, sekwencja kodująca region otaczający mutację I420T (T-»C w pozycji nukleotydowej 1624) może być poszukiwana poprzez powielenie genomowego DNA przy zastosowaniu startera 5', odpowiadającego w mmiej' więcej nukleotydom 1576-1593 z SEK NR ID: 18 oraz startera 3' odpowiadającego w sekwencji komplementarnej do nukleotydów 17211701 z SEK NR ID: 18, z wytworzeniem produktu o wielkości 146 nukleotydów. Produkt ten może być następnie, przykładowo, sondowany przy zastosowaniu specyficznych dla alleli ollgonukleotydów dla sekwencji typu dzikiego (np. 1616-1632 z SEK NR ID: 18) i/lub zmutowanych (np. 1616-1632 z SEK Nr ID: 18 z T—>C w pozycji nukleotydowej 1624).
Testy przesiewowe hybrydyzacyjne
Dla wykrywania in situ prawidłowych i zmutowanych PSI, PS2 lub innych sekwencji kwasów nukleinowych związanych z prezemilimami, próbkę tkanki można przygotować standardowymi technikami, a następnie doprowadza się do kontaktu z jedną lub większą liczbą opisanych powyżej sond, korzystnie jedną, która jest wyznakowana dla ułatwienia wykrywania, i prowadzi się test do wykrywania hybrydyzacji kwasów nukleinowych w ostrych warunkach hybrydyzacji, które pozwalają na hybrydyzację jedynie pomiędzy sondą l wysoce lub całkowicie komplementarnymi sekwencjami. Ponieważ większość mutacji PSI i PS2 wykrytych do tej pory polega na pojedynczym podstawieniu nukleotydowym, będą wymagane bardzo ostre warunki hybrydyzacji dla odróżnienia sekwencji prawidłowych od większości sekwencji zmutowanych. Gdy znane są genotypy dla prezenUm rodziców osoby badanej, sondy mogą być odpowiednio dobrane. Alternatywnie, można stosować sondy dla różnych mutantów kolejno lub w kombinacji. Ponieważ większość osób, niosących mutacje prezenUm będzie heterooygotycoma, można również zastosować sondy dla sekwencji prawidłowych i można będzie odróżnić homozygotyczne zdrowe osoby od mutantów heterozygotycznych poprzez poziom wiązania (np. intensywność sygnału radioaktywnego). W innym wariancie, można zastosować testy współzawodnictwa w wiązaniu, w których używa się zarówno sondy prawidłowe, jak i zmutowane, ale tylko jedna z nich jest wyznakowana.
Mapowanie restrykcyjne
Różnice w sekwencji mogą również tworzyć lub niszczyć przypadkowe miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, co można stwierdzić poprzez zastosowanie odpowiedniego trawienia enzymem, a następnie rozdział w żelu i hybrydyzację na filtrze. Fragmenty DNA zawierające miejsce (prawidłowe lub zmutowane) wykrywa się poprzez zwiększenie lub zmniejszenie się ich rozmiarów lub poprzez zwiększenie się lub zmniejszenie się liczby odpowiadających sobie fragmentów restrykcyjnych. Taka analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) lub mapowanie restrykcyjne można stosować dla genomowego DNA, mRNA lub cDNA. Sekwencje prezenilm mogą być powielane poprzez PCR przy zastosowaniu opisanych powyżej starterów przed trawieniem restrykcyjnym i w takim przypadku długości produktów PCR mogą wskazywać na obecność lub brak konkretnych miejsc restrykcyjnych, i/lub może być poddawana trawieniu restrykcyjnemu po powieleniu. Fragmenty prezenilin można uwidaczniać dowolnym z konwencjonalnych sposobów (np. w świetle UV w obecności bromku etydyny).
Jedynie jako przykłady, można zauważyć, że mutacja M146L PSI (A—C w pozycji nukleotydowej 684 w SEK nR ID: 1) niszczy miejsce PsphI; mutacja H163R (a—>G w pozycji nukleotydowej 736) niszczy miejsce Nlalll; mutacja A246E (C-»A w pozycji mukleotydoweJ 985) tworzy miejsce Ddel i mutacja L286V (C—>G w pozycji nukleotydowej 1104) tworzy miejsce PvuIII. Biegły w tej dziedzinie może łatwo dokonać wyboru spośród wielu handlowo dostępnych enzymów restrykcyjnych i, w oparciu o prawidłowe i zmutowane sekwencje, ujawnione i w iimy sposób tu udostępnione, dokonać mapowania restrykcyjnego, które będzie wykrywać teoretycznie dowolną mutację prezeniliny.
Mapowanie PCR
W mnej serii wykonań pojedyncze podstawienie nukleotydowe można wykryć w oparciu o zróżnicowaną długość produktu PCR lub powstawanie w reakcji PCR. A zatem
185 549 dla powielenia próbki g2nzmzwegz DNA, mRNA lub cDNA danego osobnika można użyć starterów, które otaczają zmutowane miejsce lub które, korzystniej, mają końce 3' w zmutowanym miejscu. Można się spodziewać, że brak parowania w miejscu mutacji, będzie zmieniać zdolność prawidłowych lub zmutowanych starterów do prowadzenia reakcji przez polimerazę, a zatem dawać w rezultacie profile produktów, różniące się między osobnikami zdrowymi i hej2rzoygotycznywi i/lub hzmzzygzjzcznywi pod względem zmutowanej prezeniliny'. Produkty PCR prawidłowego i zmutowanego genu mogą być różnicowo rozdzielane i wykrywane poprzez standardowe techniki, takie jak elektroforeza w żelu poliakryloawidowzw lub agarzzowyw i uwidacznianie przy zastosowaniu wyznakowanych sond, bromku etydyny i temu podobnych. Z powodu możliwego niespecyficznego wiązania się starterów lub przechodzenia polimery przez zmutowane miejsca, jak również faktu, że większość nosicieli zmutowanych alleli będzie heterozygotyczna, wartość tej techniki może być niska.
Ruchliwość eiektrzforetyazna
Badania genetyczne w oparciu o różnice w sekwencji DNA można również wykonywać poprzez wykrywanie lub zmiany w ruchliwości 2l2Cjroforetyaznej fragmentów DNA, mRNA lub cDNA w żelach. Małe delecje lub wstawienia sekwencji, na przykład, mogą być uwidaczniane poprzez elektroforezę w żelu o wysokiej rozdzielczości j'ednzniaizwych lub dwuniciowych DNA, lub jako zmiany we wzorze migracji h2j2rzdupieCsów w elektroforezie w żelu w warunkach nledenajurujaaych. Mutacje prezenilinowe lub polimorfizmy można również wykrywać poprzez metody, które wykorzystują zmianę ruchliwości wskutek polimorfizmów konformacyjnych pojedynczych nici (SSCP) właściwych dla mRNA lub struktur drugorzędzwzch j2dnoniciow2gz DNA.
Chemiczne cięcie nie sparowanych zasad
Mutacje w prezenilinach można również wykrywać poprzez zastosowanie metody cięcia chemicznego nie sparowanych zasad (CCM) (patrz np. Saleeba i Cotton, 1993 i piśmiennicjwz tam zami2szazone). W tej technice, sondy (do ~ 1 kb) mogą być mieszane z próbką g2nowowegz DNA, mRNA lub cDNA otrzymaną od danego osobnika. Próbkę i sondy miesza się i poddaje warunkom, które umożliwiają tworzenie h2t2rzdupi2ksów (jeżeli takie są możliwe). Korzystne jest, jeżeli zarówno sonda, jak i próbka kwasu nukleinowego, są dwuniciowe albo sonda i próbka mogą być razem powielane w reakcji PCR dla zapewnienia wytworzenia wszystkich możliwych nie p2Snisparowanyah heterodupleksów. Nie sparowane nukleotydy T wchodzą w reakcję z azterojlenklew osmu, a nie sparowane reszty C wchodzą w reakcje z hydroksyloaminą. Ponieważ każdej nie sparowanej A będzie towarzyszyła nie sparowana T, a każdej nie sparowanej G będzie towarzyszyła nie sparowana C, każda różnica w sekwencji pomiędzy sondą i próbką (łącznie z małymi insercjami i d2laajawi) będą prowadzić do tworzenia się co najmniej jednego reaktywnego h2jerzdupl2ksu. Po zadziałaniu azjerotlenkiem osmu lub hydroCsylzawiną dla zmodyfikowania każdego miejsca niesparowania, mieszanina jest poddawana cięciu chemicznemu w każdym zmodyfikowanym miejscu niesparowania poprzez, przykładowo, reakcję z piperydyną. Mieszanina może być następnie analizowana przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak elektroforeza w żelu, celem wykrycia produktów trawienia, które wskazywałyby na brak pełnego parowania między sondą i próbką.
Inne metody
Różne inne metody wykrywania mutacji prezenilin w oparciu o sekwencje prezenilin, ujawnione i w inny sposób tu udostępnione, będą zaoywist2 dla biegłych w tej dziedzinie. Każda z nich może być zastosowana zgodnie z ninlejszzw wynalazkiem. Obejmują one między innymi, test ochrony przed nukleazą (S1 lub za pośrednictwem ligazy), PCR z ligacją, elektroforezę w żelu gradientowym w warunkach denaturujących (DGGE, patrz np., Fischer i Lerman, 1983), technikę „odcisku palca” przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych w kombinacji z SSCP (REF-SSCP; patrz np. Liu i Sommer, 1995) i temu podobne.
D. Inne testy przesiewowe i diagnostyka
W przypadkach dzi2dziaznyah, jako zdaro2nl2 pierwotne, a w przypadkach nie dziedzicznych jako efekt wtórny będący skutkiem stanu chorobowego, może nastąpić nieprawi74
185 549 dłowa obróbka PSI, PS2, APP lub białek oddziałujących z PSI, PS2 lub APP. Może to być wykrywane jako nieprawidłowa fosforylacja, glikozylacja, glikacja, amidacja lub cięcie proteolityczne produktów w tkankach lub płynach ciała (np. CSE lub w krwi).
Diagnoza może być również postawiona na podstawie obserwacji zmian w transkrypcji, translacji, modyfikacji postranslacyjnej i obróbce prezeniliny, jak również zmian w wewnątrzkomórkowym i zewnątrzkomórkowym transporcie produktów genów prezeniliny w mózgu i w komórkach obwodowych. Takie zmiany będą obejmowały zmiany w ilości przenośnikowego RNA prezeniliny i/lub białka, zmiany w stanie fosforylacji, nieprawidłową lokalizację/dystrybucję wewnątrzkomórkową, nieprawidłową dystrybucję zewnątrzkomórkową itd. Takie testy będą obejmowały: technikę Northern (z sondami nukleotydowymi specyficznymi dla prezeniliny i niespecyficznymi), technikę Western, enzymatyczne testy immunosorbcyjne (ELISA) (z przeciwciałami wytworzonymi specyficznie wobec prezeniliny lub funkcjonalnym domenom prezeniliny, włączając w to różne postaci zmodyfikowane posttranslacyjnie, między innymi izoformy glikolizowane i fosforylowane). Testy te mogą być przeprowadzane na tkankach obwodowych (np. komórkach krwi, osoczu, hodowanych lub innego rodzaju fibroblastach itd.), jak również na materiale z biopsji, z tkanek CNS otrzymanych przed śmiercią lub po śmierci i na płynie mózgowo-rdzeniowym. Takie testy mogą również obejmować hybrydyzację in situ i testy immunochemiczne (dla zlokalizowania przenośnikowego RNA lub białka w specyficznych wewnątrzkomórkowych przedziałach i/lub w obrębie struktur neuroβatolegjcznych związanych z tymi chorobami, takimi jak sploty neurofibrylame i płytki amyloidowe).
Zestawy do testów przesiewowych i diagnostycznych
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczone są również zestawy diagnostyczne, które obejmują, związki niezbędne do powyżej opisanych testów diagnostycznych. Przykładowo, mogą być dostarczane zestawy, zawierające przeciwciała lub zestawy przeciwciał, które są specyficzne do jednego lub większej liczby zmutowanych epitopów. Przeciwciała te mogą być w szczególności znakowane dowolnym ze standardowych sposobów, które umożliwiają uwidocznienie wiązania. Alternatywnie mogą być dostarczone zestawy, w których znajdują, się sondy ollgomUdeotydewe lub startery PCR, jak opisano powyżej, do wykrywania i/lub powielania zmutowanych sekwencji nukleotydowych PSI, PS2 lub innych sekwencji związanych z prezenilinami. Znowu, takie sondy mogą być znakowane dla łatwiejszego wykrywania specyficznej hybrydyzacji. Stosownie do różnych diagnostycznych wykonań opisanych powyżej, sondy ollgonukleetydowe lub przeciwciała w takich zestawach mogą być unieruchamiane na substratach i można dostarczyć odpowiednie kontrole.
Sposoby leczenia
Opisano teraz podstawy do interwencji leczniczych w chorobach, które są powodowane lub które mogą być powodowane mutacjami w prezenilinach. Jak opisano szczegółowo powyżej, mutacje w genach hPSl i hPS2 zostały powiązane z rozwojem wczesnych postaci choroby Alzheimera, a zatem niniejszy wynalazek może okazać się przydatny w leczeniu osób ze zdiagnozowaną, lub z ryzykiem rozwoju choroby Alzheimera. Jednakże w świetle ekspresji genów PSI i PS2 w różnych tkankach, jest dość prawdopodobne, że efekty mutacji w tych loci nie są ograniczone do mózgu, a zatem mogą być przyczyną dodatkowych nieprawidłowości poza chorobą Alzheimera. A zatem niniejszy wynalazek jest również skierowany na choroby objawiające się w innych tkankach, które mogą powstawać w wyniku mutacji, nieprawidłowej ekspresji, nieprawidłowego metabolizmu lub innych dziedzicznych lub nabytych zmian w genach i produktach genów prezenilin. Ponadto, jakkolwiek choroba Alzheimera objawia się jako schorzenie neurologiczne, objawy te mogą być powodowane przez mutacje w prezenilinach, które początkowo wpływają na tkanki innego narządu (np. wątroby), które następnie wydzielają czynniki, które wpływają na aktywność mózgu i ostatecznie powodują chorobę Alzheimera. A zatem, rozważając różne opisane poniżej terapie zrozumiałym jest, że terapie takie mogą być skierowane na tkankę inną niż mózg, taką jak serce, łożysko, płuca, wątroba, mięśnie szkieletowe, nerki i trzustka, gdzie PSI i/lub PS2 również podlegają ekspresji.
Efektem mutacji w prezenilinach, związanych z chorobą Alzheimera, okazuje się być nabycie nowej funkcji lub wzmocnienie prawidłowej funkcji, co bezpośrednio lub pośrednio
185 549 powoduje nieprawidłową obróbkę prekursorowego białka amyloidu (ang. Amyloid Precursor Protein, APP) z utworzeniem peptydu Αβ, nieprawidłowej homeostazy odnoszącej się do fosforylacji i/lub nieprawidłowej apoptozy w mózgu. Taki model nabycia lub wzmocnienia funkcji pozostawałby w zgodzie z późnym występowaniem objawów i dominującym sposobem dziedziczenia choroby Alzheimera. Tym niemniej, mechanizm, poprzez który mutacje prezeniliny mogą powodować takie efekty pozostaje nieznany.
Wiadomo, że APP może być metabolizowane poprzez jeden z dwóch szlaków. W pierwszym, APP jest metabolizowane przechodząc przez siateczkę Golgiego, a następnie szlak wydzielniczy via pęcherzyki opłaszczone klatryną. Dojrzałe APP przesyłane jest następnie do błony komórkowej, gdzie jest cięte przez sektretazę a, z wytworzeniem frakcji rozpuszczalnej (Proteaza Neksyna II) plus nieamyloidogeniczny peptyd C-końcowy (Selkoe i wsp., 1995; Gandy i wsp., 1993). Alternatywnie, dojrzałe APP może być kierowane na szlak endosom-lizosom, gdzie podlega cięciu przez sekretazy p i y z wytworzeniem peptydów Ap. Peptydy Ap, będące pochodnymi APP, są neurotoksyczne (Selkoe i wsp., 1994). Stan fosforylacji komórki określa względną równowagę pomiędzy szlakiem z sektretazą a (nieamyloidogenicznym), a szlakiem Αβ (szlak amyloidogeniczny) (Gandy i wsp., 1993) i może być modyfikowany farmakologiczne lub poprzez estry forbolowe, agonistów muskarynowych i inne czynniki. Stan fosforylacji komórki wydaje się być uzależnionym od czynników cytosolowych (a w szczególności kinazy białkowej C), działających na jedno lub większą liczbę białek błonowych w siateczce Golgiego.
Bez powiązania z żadną konkretną teorią według wynalazku, prezeniliny, a w szczególności hPSl lub hPS2 (które zawierają kilka sekwencji największej zgodności dla fosforylacji przez kinazę C), mogą być integralnymi białkami błony, których stan fosforylacji określa względną równowagę miedzy szlakami sekretazy a i Ap. A zatem mutacje w genach PSI lub PS2 mogą powodować zmiany w strukturze i funkcjonowaniu ich produktów, prowadząc do nieprawidłowych oddziaływań z elementami regulatorowymi (np. kinazą białkową C) lub z APP, powodując tym samym kierowanie APP na αmyloidegęniczny szlak endosom-lizosom. Czynniki środowiskowe (np. wirusy, toksyny lub starzenie się) może również mieć podobny wpływ na PSI i PS2.
Ponownie, bez przywiązania do żadnej konkretnej teorii z wynalazku, zwraca się również uwagę, że zarówno białko PSI, jak i PS2 wykazuje dużą homologię sekwencji z ludzkimi białkami kanałów jonowych i receptorów. Przykładowo, białko PS2 wykazuje dużą homologię do podjednostki a ludzkiego kanału chlorkowego (E=0,18, P=0,16, identyczność = 22-27% na obszarze dwóch regionów o długości co najmniej 35 aminokwąsów) przy zastosowaniu paradygmatu BLASTP Altschul i wsp. (1990). Inne choroby (takie jak złośliwa gorączka i hiperkalemiczny okresowy paraliż u ludzi oraz degeneracja mechanoczuciowych neuronów u C. elegans) powstają poprzez mutacje w białkach kanałów jonowych lub białkach receptorowych. Mutacje genu PSI lub PS2 mogłyby zatem wpływać na podobne funkcje i prowadzić do choroby Alzheimera i/lub innych chorób psychicznych i neurologicznych
Sposoby leczenia chorób związanych z prezenilinami, takich jak AD, mogą opierać się o (1) podawanie pI^ra^itH^<e1^;y<^jl biaaek PSI lub Pi^l2, ((2) terapię genoową z prawidłowymi genami PSI i PS2 w celu skompensowania lub wymiany zmutowanych genów, (3) terapię genową w oparciu o sekwencje antysensowne do zmutowanych genów PSI lub PS2, lub które inaktywują zmutowane geny, (4) terapię genową w oparciu o sekwencje, które kodują białko, które blokuje lub koryguje szkodliwy wpływ zmutowanych PSI lub PS2, (5) immunoterapię w oparciu o przeciwciała wobec prawidłowych i/lub zmutowanych białek PSI lub PS2, lub (6) małe cząsteczki (leki), które zmieniają ekspresję PSI lub PS2, blokują nieprawidłowe oddziaływania pomiędzy zmutowanymi postaciami PS 1 lub PS2 i innymi białkami lub Ugandami, lub które winny sposób blokują zmienione funkcje zmutowanych białek PSI lub PS2 poprzez zmianę struktury zmutowanych białek, poprzez oczyszczenie metaboliczne lub poprzez hamowanie ich funkcji.
Terapia białkowa
Leczenie choroby Alzheimera związanej z prezenilinami lub innych chorób będących rezultatem mutacji prezenilin, można prowadzić poprzez wymianę zmutowanego białka na
185 549 białko prawidłowe, poprzez modulowanie funkcji białka zmutowanego lub poprzez dostarczenie nadmiaru białka prawidłowego dla zmniejszenia efektu niewłaściwych firnkcji zmutowanych białek.
Dla osiągnięcia tego celu konieczne jest otrzymanie, jak opisano i w inny sposób tutaj udostępniono, dużych ilości zasadniczo czystego białka PSI iPS2 z systemów hodowli komórkowej, które mogą wyrażać białko. Dostarczenie białka do dotkniętych chorobą regionów mózgu można uzyskać przy zastosowaniu odpowiedniego systemu pakowania i podawania, włączając w to przykładowo, dostatecznie białka do komórek docelowych za pośrednictwem liposomów.
Terapia genowa
Terapia genowa, polega na wprowadzeniu prawidłowych kopii genu PSI lub genu PS2 w celu dostarczenia prawidłowego białka komórkom jednego lub większej liczby typów, wykazujących zmiany chorobowe. Gen musi być dostarczony tym komórkom w postaci, w której może być pobierany, i jako kodujący odpowiednie białko dla dostarczenia efektywnej funkcji. A zatem korzystne jest, jeżeli zrekombinowany gen jest połączony w sposób funkcjonalny z mocnym promotorem dla dostarczenia wysokiego poziomu ekspresji, który będzie kompensować lub współzawodniczyć z białkami zmutowanymi. Jak zaznaczono powyżej, zrekombinowany konstrukt może zawierać endogenne lub egzogenne elementy regulatorowe, indukowalne lub podlegające represji elementy regulatorowe lub specyficzne tkankowe elementy regulatorowe.
Trapia genowa może być użyta do wymiany zmutowanego genu na zrekombinowany konstrukt poprzez homologiczną rekombinację. Zrekombinowany konstrukt może zawierać prawidłową kopię, kierowaną do genu prezeniliny, w którym to przypadku defekt jest korygowany in situ, lub może zawierać konstrukt Aktywacyjny, który wprowadza kodon stop, mutację missens lub delecję, która uszkadza funkcję zmutowanego genu. Należy zauważyć w tym miejscu, że taki konstrukt może zinaktywować zarówno prawidłową, jak i zmutowaną kopię docelowego genu prezeniliny u osobników heterozygotycznych, ale całkowita utrata funkcji genów prezeniliny może być mniej szkodliwa dla osobnika niż stały postęp stanu chorobowego.
Zastosowanie może również znaleźć antysensowną terapia genowa. Terapia antysensowną opiera się o fakt, że można uzyskać specyficzną dla sekwencji ekspresję genu poprzez wewnątrzkomórkową hybrydyzację pomiędzy mRNA lub DNA, a komplementarnymi sekwencjami antysensownymi. Tworzenie się hybrydowych kompleksów może następnie przeszkadzać w transkrypcji genu i/lub w obróbce, transporcie, translacji i/lub stabilności docelowego mRNA prezeniliny. Strategie antysensowne mogą stosować rozmaite rozwiązania, włączając w to podawanie antysensownych bligbnu0leotydów lub antysensownych analogów bligbnu0leotydów (np. analogów ze szkieletem fosforanowosiarkowym) lub transfekcję wektorami ekspresyjnymi dla antysensownego RNA. Znowu, takie wektory mogą obejmować egzogenne lub endogenne regiony regulatorowe, indukowalne lub podlegające represji elementy regulatorowe lub specyficzne tkankowo elementy regulatorowe.
Terapia genowa może być użyta do wprowadzenia zrekombinowanego konstruktu kodującego białko lub peptyd, który blokuje lub w inny sposób koryguje zmienioną funkcję spowodowaną przez zmutowany gen prezeniliny. W jednym z wykonań zrekombinowany gen może kodować peptyd, który odpowiada zmutowanej domenie prezeniliny, dla której stwierdzono, że oddziałuje nieprawidłowo z innymi białkami komórki lub ligandami komórkowymi. A zatem przykładowo, jeżeli stwierdzi się, że zmutowana domena TM6-»7 oddziałuje z konkretnym białkiem komórkowym, ale odpowiadająca prawidłowa domena TM 6—»7 nie podlega tym oddziaływaniom, można zastosować terapię genową do dostarczenia nadmiaru zmutowanej domeny TM6—»7, która może współzawodniczyć ze zmutowanym białkiem i hamować lub blokować nieprawidłowe oddziaływania. Alternatywnie, część białka, która oddziałuje ze zmutowaną, ale nie z prawidłową prezeniliną, może być kodowana i ulegać ekspresji ze zrekombinbowanego konstruktu w celu współzawodniczenia, a zatem hamowania lub blokowania nieprawidłowych oddziaływań. W końcu, w innym wykonaniu, ten sam efekt może być uzyskany poprzez wstawienie drugiego zmutowanego białka poprzez terapię geno185 549 wą w podejściu podobnym do korygowania mutacji „Deg l(d)” i „Mec 4(d)” u C. elegans poprzez wstawienie zmutowanych transge^ć^w^.
Wektory retrowirusowe mogą być zastosowane do terapii genowej komórek somatycznych z powodu ich wysokiej wydajności infekcji oraz stabilnej integracji i ekspresji. Jednakże komórki docelowe muszą być zdolne do podziałów i poziomy ekspresji prawidłowego białka powinny być wysokie, ponieważ choroba jest dominująca. Geny pSi lub PS2 pełnej długości, fragmenty kodujące funkcjonalne domeny prezenUm, lub inne peptydy lecznicze, opisane powyżej, mogą być klonowane w wektorach retrowirusowych i podlegać kontroli ich wewnętrznych promotorów, retrowirusowych długich terminalnych powtórzeń, lub promotorów specyficznych dla typu docelowej komórki będącej przedmiotem zainteresowania (np. neuronów). Inne wektory wirusowe, które można zastosować obejmują wirusy towarzyszące adenowirusom, wirus krowiamki, wirus brodawczaka wołu lub wirus opryszczki, taki jak wirus Epstem-Barr.
C. Immunoterapia
W leczeniu choroby Alzheimera możliwe jest również zastosowanie immunoterapii. Przeciwciała są wytwarzane przeciw zmutowanym białkom PSI iPS2 (lub ich częściom) i podaje się je pacjentom w celu związania lub zablokowania zmutowanych białek i zapobieżenia ich szkodliwym efektom. Jednocześnie, mogłaby być zwiększona ekspresja prawidłowego białka. Alternatywnie, wytwarzane są przeciwciała przeciw specyficznym kompleksom między PSI i/lub PS2, zmutowanymi lub typu dzikiego, i oddziaływującymi z nimi partnerami.
Dalszym rozwiązaniem jest stymulacja endogennego wytwarzania przeciwciał wobec pożądanego antygenu. Podawanie może być w postaci jednorazowego preparatu immumogennego lub szczepionki immumioującej. Kompozycja immumogemra może być przygotowana do wstrzykiwania, jako płynne roztwory lub emulsje. Białka PSl i PS2 lub inne antygeny mogą być mieszane z farmaceutyczne akceptowanymi nośnikami, odpowiednimi dla białka. Takie nośniki mogą obejmować wodę, roztwór soli, dekstrozę, glicerol, etanol i ich kombinację. Kompozycje immunogemre i szczepionki mogą ponadto zawierać dodatkowe substancje, takie jak czynniki emulgujące lub adiuwanty dla zwiększenia skuteczności. Kompozycje immunogenne i szczepionki mogą być podawane w takich ilościach, które będą z punktu widzenia terapii skuteczne, ochronne i immumogenme. Dawki zależą od drogi podawania i będą różniły się, zgodnie z rozmiarami gospodarza.
Małe cząsteczki lecznicze
Jak opisano i udostępniono tutaj, niniejszy wynalazek dostarcza szeregu sposobów identyfikowania małych cząsteczek lub innych związków, które mogą być użyteczne wleczeniu choroby Alzheimera lub innych chorób powodowanych przez mutacje w prezenH^ach. A zatem, przykładowo, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania białek wiążących się z prezenilirną, a w szczególności sposobów identyfikowania białek lub innych składników komórki, które wiążą się, lub w inny sposób oddziałują ze zmutowanymi βreoenilimami, ale nie z prawidłowymi βreoenilinaml. Wynalazek dostarcza również sposobów identyfikowania małych cząsteczek, które mogą być zastosowane do zniwelowania nieprawidłowych oddziaływań pomiędzy zmutowanymi prezenilmami i takimi białkami lub innymi składnikami komórki.
Takie oddziaływania, w których biorą udział zmutowane, ale nie prawidłowe prezeniliny, nie tylko dostarczają informacji przydatnych dla zrozumienia szlaków biochemicznych zaburzonych przez mutacje w prezenilmach i będących przyczyną choroby Alzheimera, ale również dostarczają bezpośrednich celów leczniczych dla interwencji w etiologii choroby; Poprzez zidentyfikowanie tych białek i analizę tych oddziaływań, możliwe jest poszukiwanie lub projektowanie związków, które przeciwdziałają lub zapobiegają oddziaływaniom, dostarczając w ten sposób możliwości leczenia nieprawidłowych oddziaływań. Te działania lecznicze będą mogły zmieniać oddziaływania prezenUm z tymi partnerami, zmieniać funkcje oddziałujących białek, zmieniać ilość lub dystrybucję w tkankach lub ekspresję oddziałujących partnerów lub zmieniać podobne własności samych prezenUm.
185 549
Sposoby leczenia mogą zakładać zmianę tych oddziaływań, a zatem modulowanie choroby Alzheimera i innych stanów chorobowych związanych z nabytymi lub dziedziczonymi nieprawidłowościami w genach PSI lub PS2 i ich produktach. Potencjalna skuteczność tych terapii może być testowana poprzez analizowanie powinowactwa i funkcji tych oddziaływań po zetknięciu się z czynnikiem leczniczym poprzez standardowe farmaeokicetyczme pomiary powinowactwa (Kb i Vmax, itd.). Przy zastosowaniu syntetycznych poptybów lub zrekombinowanych białok odpowiadających funecaonalnym domenom gonu PSI, genu PS2 i innych homologów prezenilic. Iccym sposobom testowania efektów oddziaływań z udziałem domen fumkcjudalnynh, takich jak pętle hydrofitowe, jost śledzenie zmian w transporcie wewnątrzkomórkowym i posttrαcslanyjnea modyfikacji odpowiednich genów poprzez hybrydyzację in situ, tosty immunochomiczce, technikę Western i badania z pulsowym znakowaniem metabolicznym w obecności lub nieobecności czynników leczniczych. Kolejną metodą jost ślodzonie efektów „późniejszych” zdarzeń, włączając w to (i) zmiany w wewnątrzkomórkowym metabolizmie, transporcie i lokalizacji APP i jego produktów, (ii) zdarzenia związane z drugorzędowymi przekaźnikami np. cAMP, wewnątrzkomórkowy poziom Ca+2, aktywność kinazy białkowej itd.
Jak zaznaczono powyżej, prebomilimy mogą być zaangażowane w metabolizm ATP, a stan fosforylacji prozenilin może być krytyczny dla równowagi pomiędzy szlakiem sekretazy a i poptydami Αβ przy obróbce APP. Stosując stracsformowano komórki i zwierzęta motelowe według niniejszego wynalazku, możca teraz lopiej zrozumieć te szlaki i nieprawidłowo zdarzenia, które mają miejsce u mutantów prozeniliny. Wykorzystując tą wiobzę można zatom zaprojektować strategio lecznicze bla przeciwdziałania szkodliwym efektom zmutowanych prozonilic.
W colu loczonia choroby Alzheimera, przykładowo, można zmieniać stan fosforylacji PSI i/lub PS2 poprzez czynniki biochemiczne (np. lekarstwa, poptyby lub inne związki), któro zmieniają aktywność kinazy białkowej C i innych kinaz białkowych, lub któro zmieniają aktywność fosfataz białkowych, lub któro modyfikują możliwość modyfikacji βusttramslacyanych PS1. Oddziaływania kinaz i fosfataz z βrezecilimami i oddziaływania prozonilin z innymi białkami zaangażowanymi w przemieszczanie się APP w obrębie siateczki Golgiogo, mogą być modulowano w celu zmniejszenia przemieszczania się pęcherzyków Golgiego to szlaku enduzom-lizozom, hamując w tec sposób wytwarzanie poptybu Ap. Takie związki będą obejmowały analogi poptydowo APP, PSI, PS2 i incych homologów prozenilin, jak również innych oddziałujących białok, lipidów, cukrów i czynników, które sprzyjają różnicowej glikozylacji PS1, PS2 i/lub ich homologów, czynników które zmieniają okres biologicznego półtrwania mRNA prezenUm lub białek, włączając w to przeciwciała i antysensowno nuklootydy; oraz czynniki, które działają na transkrypcję PS1 i/lub PS2.
Efokt tych czynników w liniach komórkowych i całych zwierzętach może być monitorowany poprzez śledzenie transkrypcji, translacji i pusttranslacyamych modyfikacji PSI i/lub PS2 (np. fosforylacji lub glikozylacji), jak również wewnątrzkomórkowego przemieszczania się PS1 i/lub PS2 poprzez różce przedziały wewnątrzkomórkowe i zewmątrbkumórkowe. Metody takich badań obejmują technikę Western i Northern, immunoprocypitację. po metabolicznym pulsowym znakowaniu radioaktywną metioniną i ATP oraz tosty immumochemiczco. Efekt tych czynników można również śledzić prowadząc badania, które określają względne powinowactwa wiązania i względną ilość białok PS1 i/lub PS2 zaangażowanych w oddziaływania z kinazą białkową i/lub APP, stosując bądź standardowe testy na powinowactwo wiązania, bątź współstrącanio i filtry Western z użyciom przeciwciał wobec kinazy białkowej C, APP, PSi, PS2 lub innych ^mologów prozonilin. Wpływ tych czynników możo być również śledzony poprzez pomiary wytwarzania AP, stosując ELISA przod i po zadziałaniu potencjalnym czynnikiem leczniczym (patrz np. Huang i wsp., 1993). Wpływ można również śledzić poprzez testowanie żywotności linii komórkowej po zadziałaniu solami aluminium i/lub poptydami Ap, które są uważane za ceurotoksyczne w chorobie Alzheimera. Na kocioc, wpływ tych czynników można śledzić poprzez tostowanio pokrewnych funkcji zwierząt o prawidłowych genotypach APP i/lub ich ^mologów prozecilimuwynh, niosących ludzkie transgeny APP (z lub boz mutacji) lub niosące Powolną ich kombinację.
185 549
Podobnie jak zaznaczono powyżej, prezeniliny mogą być zaangażowane w regulację Ca2+ jako receptory lub kanały jonowe. Ta rola prezenilin może być również badana przy zastosowaniu transformowanych linii komórkowych i owi2roaj modelowych według wynalazku. W oparciu o te wyniki można wytworzyć test dla choroby Alzheimera, do wykrywania nieprawidłowego receptora lub nieprawidłowego funkcjonowania kanału jonowego, związanych z ni2prawidłzwościawi, nabytymi lub dziedziczznzwi, w genach prezeniliny i ich produktach, lub jednym z genów homologicznych i jego produktach. Ten test może być przeprowadzany bądź in vivo, bądź in vitro poprzez pomiary przepływów w kanale jonowym i/lub napięcia transbSonzwegz lub przepływu prądu przy użyciu połączonych zacisków, zacisków do mierzenia napięcia i barwników fluorescencyjnych wrażliwych na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia lub napięcia transbłonzwego. Nieprawidłowe funkcjonowanie kanału jonowego lub receptora można również testować poprzez pomiary aktywacji drugorzędowych przekaźników, takich jak cykliczny AMP, cGMP, kinazy tyrozynowe, fosfatazy, zwiększony poziom wewnątrzkomórkowego Ca2+, itd. Białka utworzone na drodze rekombinowania DNA mogą być również stosowane w systemach sztucznych błon do badania przewodnictwa kanałów jonowych. Sposoby leczenia, które mają wpływ na chorobę Alzheimera (wskutek nabytych/doledolcznych defektów w genie PS1 lub w genie PS2; wskutek defektów winnych szlakach prowadzących do tej choroby, takich jak mutacje w APP oraz z powodu czynników środowiskowych) mogą być testowane poprzez analizę ich zdolności do modyfikowania nieprawidłowych funkcji kanałów jonowych lub receptora indukowanych przez mutację w genie prezeniliny. Terapie mogą być również testowane poprzez ich zdolność do modyfikowania prawidłowej funkcji kanału jonowego lub możliwości wiązania receptora dla białek prezeniliny. Takie testy mogą być przeprowadzane na hodowanych komórkach wyrażających endogenne, prawidłowe lub zmutowane, geny/produkty genów PS1 lub geny/produkty genów PS2. Takie badania mogą być również wykonywane na komórkach transferowanych wektorami zdolnymi do ekspresji jednej z prezenilin lub funkcjonalnych domen jednej z prezenilin w postaci prawidłowej lub zmutowanej. Można zaprojektować terapie dla choroby Alzheimera, które będą modyfikować nieprawidłową funkcję kanału jonowego lub receptora genu PSI lub genu PS2. Takimi sposobami leczenia mogąbyć konwencjonalne leki, peptydy, cukry lub lipidy, jak również przeciwciała lub inne ligandy, które wpływają na właściwości produktu genu PSI lub PS2. Takie sposoby leczenia można również przeprowadzić poprzez bezpośrednią wymianę genu PS1 i lub genu PS2 na drodze terapii genowej. W przypadku kanału jonowego terapia jonowa mogłaby być przeprowadzona przy zastosowaniu bądź minlgenów (cDNA plus promotor), bądź genomowych ConstruCtów przenoszących sekwencje genomowego DNA dla części lub całego genu prezeniliny. Zmutowane prezeniliny lub homologiczne sekwencje genu mogą być również zastosowane do określania efektu dziedziczonych i nabytych nieprawidłowości genów prezenilin, jak to ostatnio zostało zrobione dla wymiany Mec 4 i Ded 1 w C. elegans (Huang i Chalfie, 1994). Terapia może być również skierowana na zwiększenie funkcji receptora lub kanału jonowego jednego z hzwziogυw, takiego jak gen PS2, 11ο^ na to, że może on przejąć funkcję postaci zmutowanej lub innego homoteg^ (np. genu PSI, który stał się defektywny poprzez nabyte lub dziedziczone defekty). Można również zastosować terapię z zastosowaniem antysensownych oligonukl2zjydów do blokowania ekspresji zmutowanego genu PSI lub PS2, skoordynowane z zamianą genu na prawidłowe geny PSl lub PS2, stosując standardowe techniki terapii genowej, bądź zastąpienia białka.
Przykłady
Przykład 1. Opracowanie mapy genetycznej, floycznej-kzntigu i transkrypcyjnej minimalnego, kosegregujacego regionu
Biblioteki ludzkiego całkowitego genomowego DNA CEPH MegaYAC i RPCI PAC testowano pod kątem klonów zawierających fragmenty g2nowzwegz DNA z regionu AD3 chromosomu 14q24.3 przy zastosowaniu sond zligonuCl2ojydowych dla każdego z 12 markerowych loci SSR, stosowanych w badaniach sprzężenia genetycznego, jak również dodatkowych markerów (Aibertsen i wsp., 1990; ^uma^y i wsp., 1992; Ioannu i wsp., 1994). Odległości na mapie genetycznej pomiędzy każdym markerem są pokazane powyżej ciągłego odcinka i pochodzą z publikowanych danych (NIH/CEPH Coliaboratlye Mapping Group,
185 549
1992; Wang, 1992; Weissenbach i wsp., 1992; Gyapay iwsp., 1994). Klony uzyskane dla każdego z wyjściowych markerowych loci zostały uszeregowane w uporządkowane serie częściowo zachodzących na siebie klonów („kontig”) przy zastosowaniu czterech niezależnych metod. Po pierwsze, sekwencje reprezentujące końce wstawki YAC zostały wyizolowane poprzez odwrotny PCR (Riley iwsp., 1990) i hybrydyzację do filtrów Southern zawierających strawiony restrykcyjnie DNA ze wszystkich klonów YAC, otrzymanych dla wszystkich wyjściowych loci, w celu zidentyfikowania innych klonów YAC niosących zachodzące sekwencje. Po drugie, wykonano PCR dla sekwencji Alu na każdym YAC i otrzymany wzór prążków porównywano z pulami otrzymanych klonów YAC w celu zidentyfikowania innych klonów przenoszących zachodzące na siebie sekwencje (Bellamne-Chartelot i wsp., 1992; Chumakov iwsp., 1992). Po trzecie, dla zwiększenia specyficzności „odcisku palca” Alu-PCR, DNA z YAC trawiono Haelll lub Rsal, produkty restrykcyjne powielano stosując oba startery, Alul i L1H, i produkty rozdzielano poprzez elektroforezę w żelu βoliaOrylbamldbwym. Ostatecznie, ponieważ w czasie poszukiwania transkrybowanych sekwencji zostały wytworzone dodatkowe STS, te STS zostały również zastosowane do identyfikowania zachodzących na siebie odcinków. Otrzymany w rezultacie kontig był ciągły, z wyjątkiem pojedynczej przerwy pomiędzy YAC932C7 niosącym D14S53, a YAC746B4 zawierającym D14S61. Porządek na mapie fizycznej STS w obrębie kontigu pozostawał w dużej mierze w zgodzie z genetyczną mapą sprzężenia dla tego regionu (NIH/CEPH Collaborative Mapping Group, 1992; Wang i Weber, 1992; Weissenbach i wsp., 1992; Gyapay i wsp., 1994). Jednakże, jak to ma miejsce dla map genetycznych, nie jest możliwe rozstrzygniecie wątpliwości dotyczących wzajemnej kolejności loci w obrębie zgrupowania D14S43/D14S71 i zgrupowania D14S76/D14S273. Klony PAC1 sugerują, że D14S277 leży bliżej telomeru niż D14S268, podczas gdy mapa genetyczna sugeruje porządek odwrotny. Ponadto, kilka sond STS nie wykrywało wzoru hybrydyzacyjnego dla co najmniej jednego klonu YAC, który, na podstawie największej zgodności parsymonicznej mapy fizycznej i na podstawie mapy genetycznej, powinien zawierać ten STS. Przykładowo, STS D14S268 (AFM26S) i RSCAT7 są nieobecne wYAC788H12. Ponieważ wyniki są powtarzalne i pojawiają się dla kilku różnych markerów STS, wyniki te prawdopodobnie odzwierciedlają obecność małej wewnętrznej delecji w obrębie jednego z klonów YAC.
Przykład 2. Kumulatywne dwupunktowe wartości sprzężenia dla markerów chromosomu 14q24.3.
Genotypy dla każdego locus polimorficznego markera satelitarnego zostały ustalone poprzez PCR ze 100 ng genomowego DNA każdego dotkniętego chorobą i zdrowego członka rodzin, jak opisano poprzednio (St. George-Hyslop iwsp., 1992), stosując sekwencje starterów specyficzne dla każdego locus mikrosatelitamego (Weissenbach iwsp., 1992; Gyapay i wsp., 1994). Normalna częstość w populacji każdego z alleli została ustalona przy zastosowaniu małżonków i innych neurblgieznie zdrowych osób z tej samej grupy etnicznej, ale nie różniła się ona zbytnio od ustalonej dla mieszanej populacji kaukaskiej (Weissenbach i wsp., 1992; Gyapay i wsp., 1994). Przy obliczeniach zakładających największe prawdopodobieństwo, uwzględniano poprawkę na wiek wystąpienia choroby, częstość allelu markerowego, pochodzącą z danych publikowanych dla serii mieszanych osobników pochodzenia kaukaskiego oraz oszacowaną częstość mutacji AD3, 1:1000, jak opisano wcześniej (St. George-Hyslop i wsp., 1992). Badania te były powtarzane przy zastosowaniu równych częstości alleli markerowych i stosując dane fenotypowe jedynie od chorych członków rodzin, jak odpisano wcześniej, dla upewnienia się, że niedokładności w szacowanych parametrach stosowanych przy obliczeniach największego prawdopodobieństwa nie kierują analizy w złą stronę (St. George-Hyslop i wsp., 1992). Te dodatkowe analizy nie zmieniają w istotny sposób ani danych dotyczących sprzężenia, ani odkrycia zdarzeń rekombinacji.
Przykład 3. Haplotypy pomiędzy otaczającymi markerami segregują zAD3 w FAD.
Rozległe haplotypy dla markerów segregujących z AD3, leżących po stronie centromerycznej i telomerycznej na rodzicielskiej kopii chromosomu 14, w czternastu rodzinach z wczesną postacią FAD (rodziny NIH2, MGH1, Torl.1, FAD4, FAD1, MEX1, i FAD2) wyka185 549 zały specyficzne wartości sprzężenia (ang. lod scores) > +3.00, z co najmniej jednym markerem pomiędzy D14S258 i D14S53. Identyczne częściowe haplotypy są obserwowane w dwóch regionach dla chorych niosących chromosom segregujący w kilku rodzinach o podobnym pochodzeniu etnicznym. W regionie A, wspólne allele są obserwowane dla D14S268 („B”: wielkość allelu 126 bp, częstość allelu w normalnej populacji kaukaskiej - 0,04; „C”: wielkość 124 bp, częstość - 0.38); D14S277 („B”: wielkość - 156 bp, częstość - 0,19; „C”: wielkość - 154 bp, częstość - 0,33); i RSCAT6 („D” wielkość - 111 bp, częstość 0,25; „E”: wielkość - 109 bp, częstość 0,20; „F”: wielkość - 107 bp, częstość - 0,47). W regionie B, obserwuje się allele D14543 o identycznej wielkości („A”: wielkość 193 bp, częstość - 0,01; „D”: wielkość - 187 bp, częstość - 0,12; „E”: wielkość - 185 bp, częstość - 0.26; „I”: wielkość
- 160 bp, 10 częstość - 0,38); D14S273 („3”: wielkość - 193 bp, częstość - 0,38; „4” wielkość
- 191 bp, częstość - 0,16; „5”: wielkość - 189 bp, częstość - 0,34; „6”: wielkość - 187 bp, częstość - 0,02) i D14S76 („1”: wielkość - bp, częstość - 0,01; „5”: wielkość - bp, częstość - 0,38; „ 6”: wielkość - bp, częstość - 0,07; „9”: wielkość 15 bp, częstość - 0,38). Dla szczegółowych danych, patrz Sherrington i wsp., (1995).
Przykład 4. Uzyskanie sekwencji podlegających transkrypcji z odcinka AD3.
Przypuszczalne sekwencje transkrybowane, kodowane w odcinku AD3 uzyskano przy zastosowaniu metody bezpośredniej hybrydyzacji, w której krótkie fragmenty cDNA, wytworzone z mRNA z ludzkiego mózgu hybrydyzowano z unieruchomionymi i sklonowanymi fragmentami genomowego DNA (Rommens i wsp., 1993). Otrzymane w rezultacie, krótkie przypuszczalnie transkrybowane sekwencje zastosowano do otrzymania dłuższych transkryptów z ludzkich bibliotek cDNA z mózgu (Stratagene, La Jolla). Fizyczna lokalizacja wyjściowego krótkiego klonu i kolejno uzyskiwanych dłuższych fragmentów cDNA ustalano poprzez analizę wzoru hybrydyzacji, wytworzonego poprzez hybrydyzację sondy do filtrów Southern zawierających całkowite, trawione EcoRI DNA próbek, izolowane z poszczególnych klonów YAC w obrębie kontigu. Sekwencja nukleotydowa każdego z dłuższych klonów cDNA była ustalana poprzez automatyczny cykl sekwencjonowania (Applied Biosystems Inc., CA), porównywania z innymi sekwencjami nukleotydowymi i białkową bazą danych przy zastosowaniu algorytmu (Altschul i wsp., 1990). Numery dostępu dla sekwencji podlegających transkrypcji są: L40391, L40392, L40393, L40394, L40395, L40396, L40397, L40398, L40399, L40400, L40401, L40402, i L40403.
Przykład 5. Umiejscowienie mutacji w obrębie genu PSI przy użyciu enzymów restrykcyjnych
Obecność mutacji A246E, która prowadzi do utworzenia miejsca restrykcyjnego Ddel, testowano w genomowym DNA poprzez PCR z zastosowaniem wyznakowanego na końcu startera, odpowiadającego zasadniczo nukleotydom 907-925 z SEK NR ID:1 i mewyznakkwanego startera odpowiadającego sekwencji komplementarnej do nukleotydów 1010-990 z SEK NR ID:1, do powielenia genomowego fragmentu eksonu o wielkości 84 bp, stosując 100 ng matrycy genomowego DNA, 2mM MgCl2, 10 pmoli każdego ze starterów, 0,5 U polimerazy Taq, 250 |iM dNTP przez 30 cykli: 95°C x 20 sekund, 60°C x 20 sekund, 72°C x 5 sekund. Produkty inkubowano z nadmiarem Ddel przez 2 godziny, zgodnie z protokołem producenta i otrzymane w rezultacie fragmenty restrykcyjne rozdzielano w 6%o nie denaturującym żelu poliakryloamidowym i uwidaczniano poprzez autoradiografię. O obecności mutacji wnioskowano na podstawie trawienia fragmentu 84 bp dzięki obecności miejsca restrykcyjnego Ddel. Wszyscy chorzy członkowie rodziny FADI i kilka zagrożonych ryzykiem choroby członków niosło miejsce restrykcyjne Ddel. Żadna z osób nie chorujących (osoby, które nie zachorowały, wiek >70 lat) i żadna ze zdrowych kontroli nie przenosiła mutacji Ddel.
Przykład 6. Lokalizacja mutacji w genie PSI przy zastosowaniu oligonukleotydów specyficznych dla alleli
Obecność mutacji C410Y testowano przy zastosowaniu oligonukleotydów specyficznych dla alleli. 100 ng genomowego DNA powielano przy zastosowaniu startera o sekwencji z eksonu odpowiadającej nukleotydom 1451-1468 z sEk NR ID:1 i startera dla przeciwległej sekwencji intronowej, komplementarnego do nukleotydów 719-699 z SEK NR ID:14 przy zastosowaniu powyższych warunków reakcji, ale z 2,5 mM MgCl2 i warunkami cykli: 94°C x
185 549 sekund, 58°C x 20 soku/d, i 72°C przez 10 sekund). Otrzyma/y w rezultacie go/omowy fragment był denaturowany poprzez 10-krot/o rozdiońdzoojo w 0,4M NaOH, 25 mM EDTA, przo/iesiz/n pod próżnią na dwa powtórzone filtry /nlo/owo. Wyznakowany na końcu starter „typu dzikiego” (odpowiadający oukiootndzm 1468-1486 z SEK NR ID:1 i wyznakowany na końcu starter „zmutowany” (odpowiadający tej samej sokwo/cji, ale z podstawio/iem G—>A w pozycji 1477) ^bryd^owa/o do dwóch kopii filtrów po pazo/iosiooju DNA w 5 x SSC, 5 x roztwór Do/hardta, 0,5% SDS przez 1 godz. w 48°C, a następnie płukano kolejno w 2 x SSC w 23°C i 2 x SSC, 0,1% SDS w 50°C, a następnie okspooownoo wobec błony rentgenowskiej. Wszyscy dzłookowie rodzin dla których można było przeprowadzić test, jak również /ιο^ιζ^ zagrożeni ryzykiem członkowie rodzin AD3 iNlH2 posiadali C410Y. Próby wykrycia mutacji C410Y poprzez SSCP wykazały, żo wspól/y polimorfizm sekwencji i/tronowych migruje z takim samym wzorom SSCP.
Przykład 7. Hybrydyzacja Norito-m pokazująca ekspresję mRNA dla białka PSI w rozmaitych tkankach
Całkowity cntoplnzmatydz/y RNA izolowa/o z próbek różnych tka/ok (włączając w to serce, mózg i róż/o regiony łożyska, płuca, wątrobę, mięśnie szkieletowe, norki i trzustkę) otrzymano z chirurgii patologicznej przy zastosowaniu staodaadnwndh procedur, takich jak oczyszczanie w CsCl. RNA poddawano następnie elektroforezie w żelu formaldehydowym dla umożliwienia frakcjonowania pod względom wielkości. Przygotowano filtr /itrodolulozowy, a następnie paoo/iosiooo RNA na filtr. Przygotowywano so/dy cDNA wyznakowano 32P i dodawano do filtru w colu umożliwio/ia zajścia hybrydyzacji pomiędzy sondą i RNA. Po wypłukaniu, filtr zawinięto w folię plastykową i umioszczo/o w kasetach zawierających błonę rentgenowską. Autoaadiogramy pozostawiano do ekspozycji przez kilka dni. Wielkość ustala/o /a podstawie poaów/a/ia z markerami wielkości RNA. Analiza autoradiogaamów wykazała główny prążek o wielkości 3,0 kb (patrz fig. 2 w ShorTmgton i wsp., 1995). To filtry Noathoa/ pokazały, żo gon PSI podlega ekspresji wo wszystkich badanych tkankach.
Przykład 8. Eukariotyczne i proknaiotndz/o ekspresyjno systemy wektorowe
Kooitruzwa/io odpowiednich eukariotycznych i prokariotnczonch systemów oksprosyj/ych jost wykonywano przy użyciu trzech różnych klas sokwo/cji ouklootndowndh cDNA wstawek PS 1. W pierwszej klasie, okaoślnooj’ jako ko/strukty poł/ej długości, pełno sekwencję cDNA PSI są wstawiano do plazmidów ekspresyjnych w prawidłowej orientacji i obejmują zarów/o sokwo/cjo 5'UTR i 3'UTR, jak również poł/ą otwartą ramkę odczytu. Otwarta ramka odczytu zawiera kasetę sekwencji nuklootydowoj, która umożliwia włączo/io do systemu ekspresyjnego otwartej ramki odczytu dzikiego typu lub alternatywnie, jod/a lub kombinacja dwóch mutacji możo być wstawiona do otwartej ramki odczytu. Uzyskano to poprzez usunięcie fragmentu rostlykcnj/ogz z otwartej ramki odczytu typu dzikiego przy użyciu enzymów Nari i Pflml i zastąpieniu go podobnym fragmentom, otrzymanym na drodzo odwrotnej traoskanpcji PCR i niosącym sekwencję nuklootydową, kodującą mutację M146L, bądź mutację H163R. Drugi fragment restrykcyjny został usunięty z prawidłowoj sokwo/cji nukleotydów typu dzikiego dla otwartej ramki odczytu poprzez cięcie enzymami Pflml i Ncoi i zastąpienie go fragmentom aostaykdyjonm /izsądnm sokwoodję nuklootydową kodującą mutację A260, mutację A285V, mutację L392V lub mutację C410Y. Trzeci wariant, niosący kombinację mutacji M146L bądź H163R w tandemie z jedną z pozostałych mutacji, był wytworzony przez połączenie fragmentu Nari-Pflml /iosącego jod/ą z wcześniejszych mutacji i fragmentu Pflml-Ncol /iosądogz jod/ą z kolejnych mutacji.
Druga klasa wstawek cDNA, określana jako ko/sti-ukty skrócono, była wytwarzana poprzez usunięcie 5'UTR i części sokwo/cji 3'UTR z sekwencji cDNA pełnej długości typu dzikiego lub zmutowanej. Sekwencja 5'UTR została zastąpiona sy/t-tycz/ym oligo/ukiontydom, zawiorąjądnm miejsce restrykcyjno Kp/I (GGTAC/C) i małą sekwencję (GCCACC) colom wytworzenia miejsca inicjacji Kozak wokół ATG na początku ORF PSI (ouklontydy 249-267 z SEK NR ID: 1). 3'UTR został zastąpiony ollgoouklootydom odpowiadającym sokwo/cji komplomo/tamoj' do /uklootydów 2568-2586 z SEK NR ID:1, ze sztucznym miejscom rostaykdnjonm EcoRI w końcu 5'. Waaiaotn muta/tów z tym ko/stauktom były następ/io wy185 549 twarzane poprzez wstawienie sekwencji mutanta, opisanych powyżej, w miejscach Narl-Pflml i Pslml-Ncol opisanych powyżej.
Trzecia klasa konstruktów obejmuje sekwencje pochodzące z klonu cc44, w którym alternatywne składanie Eksonu 4 prowadzi w rezultacie do eliminacji czterech reszt aminokwasowych z końca N (SEK NR ID: 3).
W celu uzyskania ekspresji eukariotycznej, te różne konstrukty cDNA niosące sekwencję typu dzikiego lub zmutowaną, jak opisano powyżej, klonowano w wektorze ekspresyjnym pZeoSy w którym kaseta βrometorown SV60 została usunięta poprzez trawienie restrykcyjne i zastąpienie elementem promotorowym CMV z pcDNA3 (Invitrogen). W celu uzyskania ekspresji prokariotycznej, konstrukty były wytwarzane z użyciem wektora fuzyjnego pGEX-kg dla S-transferazy glutationu (GST). Wstawki, które były dołączone do sekwencji nukleotydów przy fuzji z GST są tymi samymi sekwencjami nukleotydów-·, co opisane powyżej, niosącymi bądź prawidłową sekwencję nukleotydów dla otwartej ramki odczytu, bądź niosące kombinacje pojedynczych i podwójnych mutacji, jak opisano powyżej. Te fuzyjne konstrukty z GST umożliwiają ekspresję części lub pełnej długości białka w systemach komórek prokariotycznych w postaci fuzji białkowych z GST, zmutowanych lub typu dzikiego, umożliwiając w ten sposób oczyszczanie białka pełnej długości po usunięciu produktu GST z fuzji za pomocą trawienia trombiną. Dalsze konstrukty cDNA wytwarzano przy zastosowaniu wektora do fuzji z GST, celem umożliwienia wytwarzania sekwencji aminokwasowej odpowiadającej kwaśnej hydrofitowej domenie pętli, znajdującej się pomiędzy TM 6 i TM7 w białku pełnej długości, bądź w postaci sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, bądź sekwencji zmutowanej niosącej mutację A285V, bądź mutację L286V lub mutację L392V. Dokonano tego poprzez otrzymanie sekwencji typu dzikiego lub zmutowanej z odpowiednich źródeł RNA przy użyciu startera 5', oligonukleetydowege, odpowiadającego nukleotydom 1044-1061 z SEK Nr ID:1, z miejscem restrykcyjnym BamHI (G/GATCC) po stronie 5', i startera 3', odpowiadającego sekwencji komplementarnej do nukleotydów 1476-1458 w SEK NR ID:1, z miejscem restrykcyjnym EcoRI (G/AATTC) po stronie 5'. Umożliwia to klonowanie odpowiedniej sekwencji nukleotydowej, zmutowanej lub typu dzikiego, odpowiadającej kwaśnej hydrofitowej domenie z pętlą w miejscach BamHI i EcoRl w obrębie wektora pGEX-KG.
Przykład 9. Lokalizacja dodatkowych mutacji w genie PSI
Mutacje w genie PSI mogą być testowane różnymi strategiami (bezpośrednie sekwencjenowanie nukleotydów, oligonukleotydy specyficzne dla allelu, polimerazowa łańcuchowa reakcja ligacji, SSCP, RFLP), stosując produkty RT-PCR reprezentujące dojrzałe sekwencje mRNA/cDNA lub DNA genomowy. Dla mutacji A260V i A285V, dNa genomowy niosący ekson może być powielany przy użyciu zarówno starterów PCR, jak i metod dla mutacji L286V.
Produkty PCR są następnie denaturowane i przenoszone w dwóch powtórzeniach na filtry nylonowe przy użyciu protokołu przenoszenia na filtr opisanego dla mutacji C410Y.
Mutacja A260V została znaleziona na tych filtrach przy użyciu hybrydyzacji ze specyficznymi dla allelu oligonukleotydami, znakowanymi na końcach, odpowiadającymi sekwencji typu dzikiego (nukleotydy 1017-1036 z SEK NR ID: 1) lub sekwencji zmutowanej (nukleotydy 1017-1036 z SEK Nr ID:1 zC-»T w pozycji nukleotydowej 1^)27) poprzez hybrydyzację w 48°C, a następnie przemywanie w 52°C w buforze 3 x SSC, zawierającym 0,1% SDS. Mutacja A285V została znaleziona na tych filtrach, jak opisano powyżej, ale przy użyciu specyficznych dla allelu oligonukleotydów dla sekwencji typu dzikiego (nukleotydy 1093-1111 z SEK NR ID:1) lub starterów dla mutacji (nukleotydy 1093-1111 bp z SEK NR ID:1 z C—>T w pozycji nukleotydowej 1102 bp) w48°C, a następnie przemywanie w 52°C, jak wyżej, z tą różnicą, że roztworem przemywającym był 2 x SSC.
Mutacja L392V została znaleziona poprzez powielenie eksonu z DNA genomowego przy użyciu starterów (5' odpowiadającego nukleotydom 439-456 w SEK NR ID: 14 i 3' odpowiadającego nukleotydom 719-699 w SEK NR ID: 14) przy użyciu standardowych warunków buforowych do PCR, z tą różnicą, że stosowano stężenie magnezu 2 mM i warunki cykli 94°C x 10 sekund, 56°C x 20 sekund i 72°C x 10 sekund. Otrzymany w rezultacie fragment genomowy o wielkości 200 nukleotydów był denaturowany; jak opisano dla mutacji C410Y, i przenoszony w dwóch powtórzeniach na filtr nylonowy. Obecność lub brak mutacji wykry84
185 549 wano poprzez różnicową hybrydyzację z wyznakowanymi na końcach oligomukleotydami typu dzikiego (nukleotydy 1413-1431 w SEK NR ID:1) lub wyznakowanymi na końcach starterami zmutowanymi (nukleotydy 1413-1431 z SEK NR ED:1 z C—G w pozycji nukleotydowej 1422) poprzez hybrydyzację w45°C, a następnie kolejne przemywanie 2 x SSC w 23 °C, a potem w 68°C.
Przykład 10. Wytwarzanie przeciwciał
Antygeny peptydowe odpowiadające częściom białka PSI były syntetyzowane przy zastosowaniu technik na fazie stałej i oczyszczane poprzez wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. Peptydy były kowalencyjnie połączone z hemocyjaminą (ang. keyhole limpet hemocyanm, KLH) poprzez mostki dwusiarcokowe, co było możliwe dzięki dodaniu reszty cysternowej na końcu C fragmentu βrezemilmy. Ta dodatkowa reszta aminokwasowa normalnie nie występuje w sekwencji białkowej i była włączona jedynie dla ułatwienia połączenia z cząsteczką KLH. Specyficzne sekwencje prezenilmy, wobec których wytworzono przeciwciała są następujące:
Przeciwciała połiklomalme antygen #hPSl (SEK NR ID: 2)
1142 3044
519 109--23
520 304-318
1143 346-360
Sekwencje te zawarte są w obrębie specyficznych domen białka PSI. Przykładowo,
reszty aminokwasowe 30-44 znajdują się w obrębie końca N, reszty ammokwasowe 109-123 znajdują się w obrębie pętli TMl->2, a reszty 304-318 i 346-360 znajdują w obrębie dużej pętli TM6-»TM7. Każda z tych domen jest eksponowana w stronę środowiska wodnego i może być zaangażowana w wiązanie innych białek, krytycznych dla rozwoju fenotypu charakterystycomego dla choroby. Wybór peptydów opierał się na analizie sekwencji białkowej przy zastosowaniu algorytmu przewidywania amtygemowości IBI Pustell.
Ogółem immumizowamo trzy króliki nowozelandzkie kompleksami peptyd-KLH w połączeniu z adiuwantem Freunda, dla każdego antygenu peptydowego, a następnie wykonywano kolejno wstrzyknięcia przypominające w odstępie siedmiu dni. Przeciwciała zbierano dla każdego peptydu i łączono razem, a IgG wytrącano siarczanem amonu. Przeciwciała były następnie oczyszczane poprzez powinowactwo na agarozie Sulfo-link (Pierce), połączonej z odpowiednim peptydem. To ostateczne oczyszczanie jest wymagane dla usunięcia niespecyficznych oddziaływań z innymi przeciwciałami obecnymi w surowicy sprzed lmmumloacji, bądź po immunizacji.
Swoistość każdego przeciwciała potwierdzano w trzech testach. Po pierwsze, każde z nich wykrywało pojedyncze mocne pasmo o odpowiadającej masie zbliżonej do przewidywanej wielkości prezeniliny 1 na filtrach Western z homogenatów mózgowych. Po drugie, każde wykazywało reakcję krzyżową ze zrekombmowanymi fuzjami białkowymi zawierającymi odpowiednią sekwencję. Po trzecie, każde mogło być specyficznie blokowane poprzez pre-absorbcję z orekombinowamym PSI lub peptydem użytym do immumloacji.
Ponadto, dwie fuzje białkowe peptydu PSI z transferazą S-glutationu (GST) zostały użyte do wytworzenia przeciwciał przeciw PSI. Pierwsza fuzja białkowa zawiera aminokwasy 1-81 PSl(komiec N), połączone z GST. Druga fuzja białkowa zawiera aminokwasy 266-410 (domena z pętlą TM6-»7), połączone z GST. Konstrukty kodujące takie fuzje białkowe będą wytworzone poprzez wstawienie odpowiednich sekwencji nukleotydowych do plazmidu ekspresyjnego pGEX-2T (Amrad). Otrzymane w rezultacie konstrukty zawierają sekwencje kodujące GST i miejsce podatne na ciecie trombiną, pomiędzy GST i peptydem PSl. Konstrukty ekspresyjne transfekowano do E.coli DH5a i indukowano ekspresję fuzji białkowej przy użyciu IPTG. Osady bakteryjne poddawano llzie, a rozpuszczalne fuzje białkowe z GST oczyszczano poprzez jednoetapową chromatografię powinowactwa na głutationowym złożu Sepharose Boehringer-Mamrhelm, Montreal). Fuzje białkowe z GST stosowano do immunloacJi myszy dla wytworzenia przeciwciał monoklonalnych przy zastosowaniu standardowych procedur. Klony otrzymane z tych myszy były przeszukiwane przy użyciu podczyszczonych fragmentów prezenUm.
185 549
Dodatkowo, fuzje białkowe z GST były cięte trombiną dla uwolnienia peptydu PSI.
Uwolnione peptydy oczyszczano z względu na wielkość na HPLC i zastosowano do immunizacji królików w celu wytworzenia pollklznalnyah przeciwciał.
Stosując podobne metody, utworzono fuzje białkowe z GST używając konstrukty zawierające sekwencję nuCieztydową dla aminokwasów od 1 do 87 (koniec N) lub od 272 do 390 (pętla TM6—»TM7) pr2Z2nilinz-2 i zastosowano do wytworzenia przeciwciał przeciw temu białku. Fuzje białkowe PS2-GST były również cięte tromblną, a uwolnione, oczysoaozne peptydy zastosowano do iwwunlzacji królików w celu wytworzenia pollklonalnych przeciwciał.
Przykład 11. Identyfikacja mutacji w genie PS2
Produkty RT-PCR odpowiadające oRf PS2 wytworzono z RNA llmfoblastów lub zamrożonej po śmierci tkanki mózgowej, stosując pierwszą parę starterów ze starterem 5' odpowiadającym nukleotydom 1083-1102 z SEK nR ID:18 i starterem 3' komplementarnym do nukleotydów z 1909-1892 SEK NR ID: 18 dla uzyskania produktu o wielkości 888 bp i drugą parę starterów ze starterem 5' odpowiadającym nukl2ztydzm 478-496 z SEK NR ID: 18 i starterem 3' komplementarnym do nukleotydów 1366-1348 z SEK NR ID: 18 dla uzyskania produktu o wielkości 826 bp. Reakcje cykliczne PCR przeprowadzano stosując 250 mMol dNTP, 2,5 mM MgCl2, 10 pMol oligznuklezjydów w 10 (1 przez 40 cykli w 94°C x 20 sekund, 58°C x 20 sekund, 72°C x 45 sekund. Produkty PCR s2kwenajznzwano poprzez automatyczne cykliczne S2kw2najonowanle (ABI, Poster City, CA) i cbromatzgrawy fluorescencyjne skanowano w celu znalezienia heterozygot z podstawieniami nukl2ztzdowzwl poprzez bezpośrednią analizę oraz stosując programy komputerowe Factura (wersja 1.2.0) i S2qu2na2 Navigator (wersja 1.0.1bl5) (dane nie pokazane).
Wykrywanie mutacji NI411: Podstawienie A—T w pozycji nukleotydowej 787 prowadzi do powstania miejsca restrykcyjnego Bell. Ekson zawierający tę mutację był powielany ze 100 ng genomowego DNA przy zastosowaniu 10 pwoII każdego z oligznuklezjydów, odpowiadającego nukleotydom 733-751 z SEK NR ID: 18 (wyznakowany na końcu) i komplementarnego do nukleotydów 846-829 z SEK NR ID: 18 tni2wzonakowanegz), i warunków reakcji PCR podobnych do tych, opisanych poniżej dla mutacji M'239V. 2 (al produktu PCR poddano trawieniu Bell (NEBL, Beyerly, MA) w 10 μl objętości mieszaniny reakcyjnej, zgodnie z protokoem producenta i produkty rozdzielano poprzez elektroforezę w nled2najurująaym żelu pziiakrylzawidowyw. U osób z sekwencją typu dzikiego, produkt PCR o długości 114 bp jest cięty na fragmenty 68 bp i 46 bp. Mutacja powoduje, że produkt jest cięty na fragmenty 0 wielkości 53 bp, 46 bp i 15 bp.
Wykrywanie mutacji M239V: Podstawienie A—G w pozycji nukl2zjy,dzw2j 1080 prowadzi do usunięcia miejsca restrykcyjnego Nlalll, umożliwiając wykrycie mutacji M239V poprzez powielenie ze 100 ng genowzw2go DNA przy zastosowaniu 10 piinii każdego z zllgonuCl2Zjzdów, odpowiadającego nukleojydow 1009-1026 z SEK NR ID: 18 i komplementarnego do nukleotydów 1118-1101 z SEK NR ID: 18. Warunki reakcji PCR były następujące: 0,5 jed. polimerazy Taq, 250 mM dNTP, 1 mCl a32P-dCTP, 1,5 mM MgCl2, w objętości 10 μΐ; 30 cykli 94°C x 30 sekund, 58°C x 20 sekund, 72°C x 20 sekund, do otrzymania produktu o wielkości 110 bp. 2 μΐ produktu PCR rozcieńczano do 10 μΐ i poddano trawieniu 3 jedn. Nlalll (NEBL, Beyerly, MA) przez 3 godziny. Produkty rozdzielano poprzez elektroforezę w niedenajurujaczw żelu poliakrylamldowzw i uwidaczniano poprzez autoradizgraflę. Dla osób zdrowych, uzyskiwano produkty trawienia o długości 55, 35, 15 i 6 nukleotydów, podczas gdy sekwencja zmutowana daje fragmenty o długości 55, 50 i 6 nukleotydów
Wykrywanie mutacji I420T: Podobnie jak w procedurach opisanych powyżej, mutacja I420T może być poszukiwana poprzez reakcję powielania PCR z użyciem genzwzwegz DNA przy zastosowaniu starterów, odpowiadającego nukleotydow 1576-1593 z SEK NR ID: 18 i komplementarnego do nukleotydów 1721-1701 z SEK NR ID: 18 dla uzyskania produktu o wielkości 146. Produkt ten może być następnie' sondowany przy zastosowaniu specyficznych dla alleli zligonukl2ojydów (np., nukleotydy 1616-1632 z SEK NR ID: 18) i sekwencji zmutowanych (np., nukleotydy 1616-1632 z SEK NR ID:18 z podstawieniem T—C wpzzyajl nukleotydowej 1624).
185 549
Przykład 12. Myszy transgeniczne
Skonstruowano serię genów PSI i PS2 typu dzikiego i zmutowanych do zastosowania przy wytwarzaniu transgenicznych myszy. Zmutowane wersje PSI i PS2 wytworzono, poprzez ukierunkowaną mutagenezę sklonowanych cDNA cc33 (PSI) i cc32 (PS2), stosując standardowe techniki.
cDNAs cc33 i cc32 oraz ich zmutowane wersje zostały użyte do przygotowania dwóch klas cDNA PSI i PS2, zmutowanych i typu dzikiego, jak opisano w przykładzie 8. Pierwsza klasa, określana jako cDNA „pełnej długości” została przygotowana poprzez usuniecie około 200 bp z nie podlegającego translacji regionu 3' bezpośrednio przed miejscem poli A, poprzez trawienie EcoRI (PSI) lub PvuII (PS2). Druga, klasa, określana jako cDNA „skrócony” została przygotowana poprzez zamianę nie podlegającego translacji regionu 5' na miejsce wiązania rybosomu sekwencja największej zgodności Kozak, umieszczone bezpośrednio przed kodonem startu ATG.
Różne cDNA PS 1 i PS2, pełnej długości i skrócone, typu dzikiego i zmutowane, przygotowane jak opisano powyżej, wprowadzono do jednego lub większej liczby następujących wektorów i otrzymane w rezultacie konstrukty zastosowano jako źródło genu do wytwarzania transgenicznych myszy..
Wektor ekspresyjny cos.TET: Ten wektor pochodził z klonu kosmidowego zawierającego gen PrP z chomika syryjskiego. Został on opisany szczegółowo w Scott i wsp. (1992) oraz Hsiao iwsp. (1995). cDNA PSI i PS2 (pełnej długości lub skrócony) wstawiono do tego wektora w miejscu Sali. Ostateczny konstrukt zawierał 20 kb sekwencji przylegającej do wstawionego cDNA po stronie 5'. Ta przyległa sekwencja po stronie 5' obejmuje promotor genu PrP, 50 bp eksonu genu PrP z nie podlegającym translacji regionem 5', miejscem donorowym dla składania, intronem o długości 1 kb i miejscem akceptorowym dla składania, umiejscowionym w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca Sali, do którego został wstawiony cDNA PSI lub PS2. Sekwencja przylegające do końca 3' wstawionego odcinka cDNA obejmuje fragment nie podlegającego translacji regionu 3', o długości około 8 kb, zawierający sygnał poliadenylacji. Trawienie takiego konstruktu Notl (PSI) lub Fsel (PS2) uwalnia fragment, zawierający gen PS, zmutowany lub typu dzikiego, pod kontrolą promotora PrP. Uwolniony fragment był oczyszczany w żelu i wstrzykiwany do pronukleusa zapłodnionego jaja myszy, stosując metodę według Hsiao i wsp. (1995).
Konstrukty z podjednostką p receptora czynnika wzrostowego pochodzącego z łożyska: cDNA PSI wprowadzano również pomiędzy miejscem Sali (pełnej długości cDNA PSI) lub Hindlll (skrócone cDNA PSI, pełnej długości cDNA PS2 i skrócone cDNA PS2) na końcu 3' promotora podjednostki (3 ludzkiego receptora czynnika wzrostowego pochodzącego z łożyska, a miejscem EcoRI na końcu 5' sekwencji poli A SV40 i całą kasetę sklonowano w wektorze pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA.). Fragmenty uwolnione poprzez trawienie Scal/BamHI oczyszczano w żelu i wstrzykiwano do pronukleusa zapłodnionego jaja myszy stosując, metodę według Hsiao i wsp.(1995).
Konstrukty z ludzką aktyną β: cDNA PSI i PS2 wstawiano w miejsce Sali pBAcGH. Konstrukt utworzony poprzez to wstawienie zawiera bezpośrednio po stronie 5' sekwencję ludzkiej aktyny P, o długości 3.4 kb, (promotor ludzkiej aktyny p, podlegający wycinaniu w wyniku składania, nie podlegający translacji ekson o długości 78 bp oraz intron) i wstawkę PSI i PS2, po której następuje sekwencja genomowa ludzkiego hormonu wzrostu o długości 2,2 kb, zawierająca kilka intronów i eksonów, jak również sygnał poliadenylacji. Sfil zastosowano do uwolnienia fragmentu zawierającego PS, który był oczyszczany w żelu i wstrzykiwany do pronukleusa zapłodnionego jaja myszy stosując metodę według Hsiao i wsp. (1995).
Konstrukty z kinazą fosfoglicerynową: cDNA PSliPS2 wprowadzono do wektora pkJ90. cDNAs wstawiono pomiędzy miejsce KpnI za promotorem ludzkiej kinazy fosfoglicerynowej, a miejscem Xbal przed nie podlegającym translacji regionem 3' genu kinazy fosfoglicerynowej. Trawienie PvuII/HindIII (cDNA PSI) lub PvuII (cDNA PS2) zastosowano do uwolnienia fragmentu zawierającego PS, który był oczyszczany w żelu i wstrzykiwany do pronukleusa zapłodnionego jaja myszy, jak opisano powyżej.
185 549
Przykład 13. Ekspresja zrekombicuwαdych PSI i PS2 w komórkach eukariotycznych
Zrokombicowano PSI i PS2 zostały wyrażone w różnych typach komórek (cp. komórkach
PC12, corwiaka niedojrzałego, jajnika chomika chińskiego i ludzkiej zarobkowej nerki 293) przy zastosowaniu wektora pcDNA3 (Invitrogon, San Diego, CA.). cDNA PS2 wstawionymi do togo wektora były te same dDNA pełnej długości i skrócone, co opisano w przykładzie 8.
Te cDNA zostały wstawiono pomiędzy promotor CMV i miejsce βoliadenylanJi hormony wzrostu wołu w pcDNA3. Transgeny podlegały oksprosji na wysokim poziomio.
Ponadto, PS1 i PS2 zostały wyrażone w komórkach COS przy zastosowaniu wektora pCMX. Dla ułatwienia oaznaczenia i śledzenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji prezonilic, oligumukleutydy koPujące sekwencję 11 aminokwasów pochodzących z ludzkiego antygenu c-myc (patrz, np., Evan i wsp., 1985) i rozpoznawanego przoz monuklumalme przociwciała przeciw myc MYC 1-9E10.2 (Produkt cRl 1729, ATCC, Rock^Ho, Mb.) łączono poprzez ligację w ramce odczytu bezpośrednio przed lub bezpośrednio za otwartą ramką odczytu cDNA PS1 i PS2. Przygotowano również kumctrukty pCMX bez znaczników. Kocstrukty zo znacznikiem c-myc wprowadzono również bo pcDNA3 w celu transfokcji do komórek CHO.
Przejściową i stabilną transfekcję tymi kocstruktami uzyskano, stosując Lipofoctamico (Gibco/BRL) zgodnie z protokołami producenta. Hodowle testowano pot kątom przejściowej ekspresji 48 godzinach. Linio stabilnie tracsfokowaco selekcjonowano stosując 0,5 mg/ml Geceticin (Gibnu/BRL).
Ekspresję tracsfokuwamych białek PS testowano stosując filtry Wostorn i przeciwciała przeciw prezenilinio, 1142, 519 i 520, opisane powyżej. Pokrótce, hodowano tramcfoeuwαmo komórki były upłynniano (2% SDS, 5 mM EDTA, 1 mg/ml loupeptyna i aprotycina), a stężenie białka oznaczano metodą Lowry. Białka rozdzielano w żelach gradientowych SDS-PAGE (4-20% Novox) i przenoszono na PVDF (10 mM CAPS) przoz 2 gobz. przy stałym napięciu (50V). Niespecyficzne wiązanie blokowano odtłuszczonym mlekiem (5%) przoz 1 gobz. Białka sondowano następnie dwoma poliklonalnymi przeciwciałami (~1 mg/ml w TBS, pH 7,4) przoz 12 gobz. Reagujące krzyżowo rodzaje prezeniliny identyfikowano przy zastosowaniu drugurbęduwynh biutynylowαmynh króliczych anty-mysich przeciwciał, które uwidaczniano stosując βerukcybazę z chrzanu połączoną z czwartorzędowym 4-chiorocaftolom stroptawibyny i nabtleCkiom wodoru. Poptyty prezeniliny naznaczone c-myc testowano poprzez technikę Wostorn, stosując zarówno przeciwciała przeciw probenilimum, opisane powyżej (do wykrywania antygenu poptybu prezeniliny), jak i supornatantu z hodowli hybrydomy MYC 1-9E10.2, rozcieńczonego 1:10 Po filtrów Western i 1:3 do testów immucocytochemicznych (to wykrywania opitopu.c-myc). Główco pasmo wykazujące reakcję immunologiczną odpowiadające wiolkości 50-60 kDa identyfikowano przy zastosowaniu każdego z różnych przeciwciał prozocilicowych, oraz przeciwciał wobec opitopu myc (bla linii komórkowych transfekowanych plazmidami zawierającymi myc). Słabszo pasma odpowiadające wielkości -10-19 kDa i ~70kDa wykrywano stosując niektóro przeciwciała prezecilicowe.
Do tostów immumonytucheminzmych, trumsfokowuco komórki utrwalano w 4% formaldehydzie w roztworze soli buforowanym Tris (TBS), intensywnie płukano TBS plus 0,1% Tritoc i niespecyficzne wiązacie blokowano 3% BSA. Utrwalone komórki sondowano przeciwciałami prezonilinowymi (np., przeciwciała 520 i 1142, powyżej, typowo 5-10 mg/ml), płukano i uwidaczniano stosując drugurbętuwe królicze przeciwciała połączono z FITC lub robuminą. Dla kocstruktów prezenilin naznaczonych c-myc, użyto supomatactu z hodowli hybrydomy MYC 1-9E10.2, rozcieńczonego 1:3 z drugorzębowymi przeciwciałami actymysimi. Szkiełka pokrywano 90% glicerolem z 0,1% focylocotiamica (ICN) dla zapobieżenia fluorosceccji. Anty-BIP (lub anty-kalneksynu) (StrossGoc, Victoria, B.C.) oraz aglutycicę z kiełków pszonicy (EY Labs, Sac Mateo, CA) stosowano, odpowiednio, jako markery dla retikulum ondoβlazmatynzmogu aparatu Golgiego. Podwójno immumubmakσwanio wykonano również z przeciwciałami anty-aktyna (Sigma, St. Louis, Mo.), anty-białko prok:urcuruwo amyloidu (22 Cli, Boohringor MaCchoim) i acty-włókno nerwowe (NF-M spociAc, Sigma) w linii neuronowej N5C34. To badania immucufluurescencyJmo wykazały, że produkt tracsfekcji jest szeroko rozprzestrzeniony w komórce, ze szczególnie intensywną lokalizacją por88
185 549 inukleamą, sugerującą endoplazmatyczne retikulum i aparat Golgiego, co wykazuje podobieństwo do lokalizacji obserwowanej w nie transfekowanych komórkach, ale o większej intensywności, czasami przelewając się do błony jądrowej. Keimmunolokalizαcję epitopów c-myc i PS obsenwowirno w komórkach CHO i COS, transffkowanych przejściowo konsttnkkami prezeniliny naznaczonymi myc.
Silna ekspresja transfekowanego genu prezeniliny w transfekowanych komórkach została także udowodniona poprzez analizę jmmunocytechemjczną, techniki Northern, Western (stosując przeciwciała przeciw prenizylimom jak powyżej i stosując przeciwciała monnoklonalne MYC 1-9E10.2 przeciw znacznikowi myc w konstruktach ze znacznikami 3' lub 5' c-myc).
Przykład 14. Izolacja białek wiążących się z prezenilinami poprzez chromatografię powinowactwa
W celu zidentyfikowania białek, które mogą być związane z biochemicznymi funkcjami prezenilin, przy użyciu chromatografii powinowactwa izolowano białka wiążące PSI. Białko GST-fuzja zawierające pętlę TM6—»7, otrzymywane tak, jak opisano w przykładzie 8, używano do sondowania ekstraktów z ludzkiego mózgu, otrzymanych poprzez homogenizację tkanki mózgowej przez Polytron w roztworze soli fizjologicznej. Białka niespecyficzne były eliminowane przez wstępne oczyszczanie homogenatów mózgu z endogennych składników wiążących GST poprzez inkubację ze złożem glutathione-Sepharose. Te wolne od GST homogenety były następnie inkubowane z fuzyjami białkowymi GST-PS celem wytworzenia pożądanych kompleksów z funkcjonalnymi białkami wiążącymi. Te kompleksy były następnie odzyskiwane przy użyciu powinowactwa złoża glutathione-Sepharose. Po intensywnym przemywaniu roztworem soli buforowanym fosforanem, izolowany zestaw białek był rozdzielany elektroferetycznie na żelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE, żel gradientowy 4-20% Tris-tricine). Obserwowano dwa główne pasma ~14 i 20 kD, obok szeregu słabych pasm w zakresie od 50 do 60 kD.
Farmakologiczna modyfikacja oddziaływań pomiędzy tymi białkami i pętlą TM6—7 może być wykorzystana przy leczeniu choroby Alzheimera. Dodatkowo, białka te, które prawdopodobnie działają na szlaku biochemicznym prezenilin, mogą być nowymi miejscami mutacji powodującymi chorobę Alzheimera.
Przykład 15. Izolacja białek wiążących się z prezenilinami poprzez drożdżowy system dwuhybrydowy
W celu zidentyfikowania białek oddziaływujących z prezenilinami, utworzono drożdżowy plazmidowy wektor ekspresyjny.
(pAS2-l, Clontech), wstawiając poprzez ligację w ramce odczytu część sekwencji cDNA kodującą aminokwasy 266-409 białka lub aminokwasy 272-390 białka PS2, w miejscach EcoRI i BamHI wektora. Powstała w rezultacie fuzja białkowa zawiera miejsce wiązania DNA GAL4, połączone w ramce odczytu bądź z pętlą TM 6—7 białka PSI, bądź pętlą TM6->7 białka PS2. Te plazmidy ekspresyjne były kotransformowane do drożdży, razem z oczyszczonym plazmidowym DNA z ludzkiej biblioteki cDNA z mózgu: pACT, stosując protokół z zestawu do drożdżowego systemu dwuhybrydowego Clontech Matchmaker (Clontech). Drożdżowe klony zawierające ludzki cDNA z mózgu, w których następuje interakcja z domeną z pętlą TM6—»7 były selekcjonowane poprzez marker HIS i pgal+. Klony były dalej selekcjonowane na podstawie wrażliwości na cykloheksimid, a wstawki ludzkiego cDNA z mózgu izolowano poprzez PCR i sekwencjonowano. Spośród 6 milionów wyjściowych transformantów, po selekcji HIS otrzymano 200 pozytyw/nych klonów, a 42 po selekcji na kolor pod kątem Pgal+, prowadzonej zgodnie z protokołem producenta dla selekcji klonów pozytywnych. Pośród tych 42 klonów było kilka (5-8) niezależnych klonów reprezentujących te same geny. Wskazuje to, że oddziaływania te mają znaczenie biologiczne i są powtarzalne.
Przykład 16. Transgeniczny C. elegans
Transgeniczny C. elegans został otrzymany poprzez mikrowstrzyknięcie do oocytów. Wybrano do tego celu wektory pPD49.3 hsp 16-41 ipPD49.78 hsp 16-2. Przy zastosowaniu pierwszego z tych wektorów, uzyskano transgenicznego C. elegans, do którego wprowadzono prawidłowy lub zmutowany (L392Y) gen hPSl. Stransfermowαne zwierzęta wykrywano po185 549 przez badanie ekspresji ludzkiego cDNA na filtrach Northern lub Western, stosując jako sondy cDNA cc32 oraz przeciwciała 519, 520 i 1142, opisane powyżej. Przygotowywano również i/lub wystrzykiwano wektory, które zawierały gen hPSl podwójnie zmutowany w układzie cis (M146L i L392V), prawidłowy gen hPS2, i zmutowany gen hPS2 (N141I).
Przykład 17. Klonowanie homologu prezeniliny Drosophila, DmPS
Zaprojektowano nie w pełni jednoznaczne oligonukleotydy 5' ctn ccn gar tgg acn gyc tgg (SEK NR ID: 22) i 5' rca ngc (agt)at ngt ngt rtt cca (SEK NR ID: 23) na podstawie danych z opublikowanej sekwencji nukleotydowej wysoce konserwowanych regionów białek prezenilina/sel-^, rozpoczynających się/kończących się na Trp (np., przy resztach aminokwasowych Trp247 iTrp404 w PSI; Trp253 iTrp385 wPS2). Startery te zostały użyte w reakcji RT-PCR (objętość 50 pl, 2mM MgCl2, 30 cykli: 94°C x 30, 57°C x 20”, 72°C x 20) dla mRNA z osobników dorosłych i zarodków D. melanogaster^. Produkty były następnie ponownie powielane przy zastosowaniu warunków cykli: 94°C x 1', 59°C x 0,5' i 72°C x 1' i wewnętrzny konserwowany, nie w pełni jednoznaczny starter 5' ttt ttt ctc gag acn gen car gar aga aay ga (SEK NR ID: 24) i 5' ttt ttt gga tcc tar aa(agt) atr aar ten cc (SEK NR ID: 40). Produkt o wielkości ~600 bp był klonowany w miejscach BamHI i XhoI pBS. Produkty te sekwencjonowano i wykazano, że zawierają otwartą ramkę, odczytu, z domniemaną sekwencją aminokwasową wysoce homologiczną, do sekwencji ludzkich prezenilin. Fragment ten został następnie użyty do przeszukania konwencjonalnej biblioteki cDNA D. melanogaster cDNA/Zap (Stratagene, CA) z uzyskaniem sześciu niezależnych klonów cDNA o wielkości -22.5 kb (klony pds8, pdsl3, pdsl, pds3, pds7 i pdsl4), które zostały zsekwencjonowane. Najdłuższe ORF kodowały polipeptyd o wielkości 5412 aminokwasów, wykazujące 52% identyczności z ludzkimi prezenilinami.
Przykład 18. Testy na długie izoformy peptydów Ap
Peptydy Ap ekstrahowano 99% kwasem mrówkowym przez 60 minut (20°C) z zamrożonych próbek kory mózgowej od histopatologicznie potwierdzonych przypadków FAD z mutacjami w PSI lub PAPP7I7, sporadycznych AD o nieznanej rodzinnej historii choroby, innych nęurodęgenęracyjnyjh chorób późnego wieku (HD - choroba Huntingtona; ALS boczna amylotropowa skleroza); zespół Downa i osobników kontrolnych bez objawów neurologicznych. Po żwirowaniu przy 200000 x g przez 20 minut supernatant był oddzielany od osadu, rospuszczany, neutralizowany i badany poprzez test ELISA. W celu oznaczenia ilościowego różnych rodzajów Ap, zastosowano cztery monoklonalne przeciwciała. Przeciwciało BNT-77 (które wykrywa epitopy ze środka Al 3) i przeciwciało BAN-50 (które wykrywa reszty N-końcowe) zostały zastosowane najpierw do związania wszystkich typów Ap, włączając w to hętęrologicznę formy, skrócone lub nie, na końcu N (BNT-77) lub jedynie nie skrócone na końcu N (BAN-50). Dwa dodatkowe przeciwciała, które specyficznie wykrywają AP z krótkim ogonem, kończący się na aminokwasie 40 (przeciwciało BA-27) lub AP z długim ogonem, kończące się na aminokwasach 42/43 (przeciwciało BC-05), zostały następnie zastosowane dla odróżnienia różnych C-końcowych form Ap. Podwójny test ELISA przeprowadzano jak opisano uprzednio (Tamaoka i wsp., 1994; Suzuki i wsp., 1994). Pokrótce, 100 jag standardowych peptydów lub supematantu z tkanki mózgowej nakładano na mikropłytki opłaszczone przeciwciałami BNT-77 inkubowano w 4°C przez 24 godziny, przemywano roztworem soli buforowanym fosforanem, a następnie inkubowano ze znakowanymi HRP przeciwciałami BA-27 i BC-OS w 4°C przez 24 godziny. Aktywność HRP była testowana na podstawie koloru uzyskanego przy użyciu systemu peroksydazy TNB na płytkach do mikromiareczkowania, tak jak poprzednio opisano. Poziom Ap z kory porównywano pomiędzy grupami diagnostycznymi przy użyciu podwójnego testu t-Studenta. Łączna ocena wszystkich danych izoform Ap, przy użyciu testu Student-Newman Keuls wielokrotnego porównywania średnich ujawniła, że poziomy AP 1-42 w przypadku ApAPP7,7 i w przypadkach sporadycznych różniły od poziomów dla mutacji PSI, ale były podobne do kontroli. W przeciwieństwie do tego, trzy grupy były wyróżnialne, gdy rozpatrywano poziom Apx-42: o poziomie wysokim (PSI i ApAPP7,7AD), średnim (sporadyczne AD) i niskim (kontrola).
185 549
W szczególności, mierzenie stężenia różnych izoform Άβ w korze mózgowej 14 osób kontrolnych, włączając w to osoby z chorobami neurodegeneracyjnymi występującymi w czwartej i piątej dekadzie życia, ujawniła tylko niskie stężenie zarówno Άβ z krótkim ogonem (Άβ 1-40: 0,06 ± 0,02 nMol/gram mokrej tkanki + SEM; Apx-40: 0,17 ± 0,40), jak i Ap z długim ogonem (Apl-42/43: 0,35 ± 0,17; Apx-42/43: 1,17 ± 0,80). W przeciwieństwie do tego, peptydy Άβ z długim ogonem są znacząco podwyższone w korze mózgowej wszystkich czterech badanych z mutacjami PSI (Apl-42/43: 6,54 ± 2,0, p = 0,05; Άβχ-42/43: 23,91 ± 4,00, p < 001). Podobny wzrost stężenia peptydów Άβ z długim ogonem wykryto w korze obu badanych z mutacjami ΡΆΡΡ717 Άβl·42/43 : 2,03 ± 1,04; Άβχ-42/43: 25,15 ± 5,74), i osób ze sporadycznym występowaniem Άϋ (Άβ 1-42/43: 1,21 ± 0,40, p = 0,008; Άβx-42/43: 14,45 ±2,81, p = 0,001). U badanych z Psi lub mutacjami ΡΆΡΡ717 wzrost izoformy Άβ z długim ogonem Άβ był połączony z małym, ale nie znaczącym wzrostem poziomu izoformy Άp z krótkim ogonem (np. Άβχ-40: 3,08 ± 1,31 w mutantach Psi; 1,56 ± 0,07 w mutantach ρΆρΡ717). Tak więc stosunek izoformy długiej do krótkiej był także znacząco wyższy. Jednakże, w sporadycznych przypadkach Άϋ, obserwowanemu wzrostowi Άβ z długim ogonem towarzyszy typowo dużo większy wzrost poziomu izoformy Άβ z krótkim ogonem ^pl-dO: 3,92 30 ± 1,42; Aβx-40: 16,60 ± 5,88). Ten wzrost izoformy Άβ z krótkim ogonem jest statystycznie znaczący, kiedy porównuje się z kontrolą (p < 0,03 dla obydwu Άpi-40 i Άβχ-40), ale miał graniczne znaczenie statystyczne kiedy porównuje się do przypadków PSI i βΆΡΡ7ΐ7 p < 0,05). Analiza próbek korowych od dorosłych z zespołem Downa ujawnia wzór podobny do tego, który obserwuje się w przypadkach sporadycznego Άϋ.
Jakkolwiek korzystne wykonania tego wynalazku zostały opisane tutaj w szczegółach, będzie zrozumiałe dla znawców w tej dziedzinie, że można stworzyć ich odmiany zgodnie z duchem wynalazku i nie wykraczając poza jego zakres.
Tabela 1
Element Pozycja
STAT1 (GAS) 34-46 611-619
278-286 631-639
431-439 1582-1590
443-451 1965-1973
495-503 2125-2133
533-541
36-43 737-744
124-131 811-898
429-436 1063-1070
496-503 1686-1693
533-540 1966-1973
537-5440 21Q4-2111
632-639 2407-2414
MED1, MEDl-llke 121-1126 1235-1240
1126-1131 1716-1721
Element Pozycja
CAT box 895-900
975-982
TATA box 925-933
978-988
TFIID 578-581
982-985
TRXN (CAP) O042-1O07
start
1038-1043
GC box 1453-1460
(SP1)
1454-1452
AP2, AP2-lik enumerous occurremces
throughout sequence
NFIL6 611-620 1567-1576
890-899 1945-1954
1062-1071
185 549
Tabela 2
Domo/a PSI N Paonbljżnnn Pozycja 1-81
TM1 82-100
TM1—>2 101-132
TM2 133-154
TM2- -3 155-163
TM3 164-183
TM3—4 184-194
TM4 195-212
TM4->5 213-220
TM5 221-238
TM5—>6 239-243
TM6 244-262
TM6—7 263-407
TM7 408-428
koniec C 429-467
Tabela 3
Domo/a PS2 knojOd N Przybliżona pozycja 1-87
TM1 88-106
TM1-->2 107-134
TM2 135-160
TM2->3 161-169
TM3 170-189
TM3->4 190-200
TM4 201-218
TM4->ł5 219-224
TM5 225-244
TM5-»6 245-249
TM6 250-268
TM6->7 269-387
TM7 388-409
koniec C 410-448
Tabela 4
Pozycja w SEK NR ID: 1 Zmiana Nukiootydu Zmian Aminokwasu Domo/a Fuokcjnonlnn Wiok rozpoznania
1 2 3 4 5 6
fad 1. na na A79? koniec N 64
2. 492 G-»C VB2L TM1 55
3. na na V96F TM1 na
4. 591 T—C Y115H TM1->2 37
5. 664 T—C M139T TM2 49
6. na na M139Y TM2 40
185 549 ciąg dalszy tabeli 4
1 2 3 4 5 6
7. 676 T-»C I143T TM2 35
8. 684 A——C M146L TM2 45
9. NA NA M146V TM2 38
10. 736 A—G H165R TM2—3 50
11. NA NA H163Y TM2—»3 47
12. NA NA L171P TM3 35
13. NA NA G209V TM4 NA
14. NA NA 1211T TM4 NA
15. 939 G—A A231T TM5 52
16. 985 C—A A246E TM6 55
17. 1027 C—T A260V TM6 40
18. NA NA C263R TM6—7 47
19. 1039 C—T P264L TM6—7 45
20. NA NA P2675 TM6—7 35
21. NA NA E280A TM6—»7 47
22. NA NA E280G TM6—7 42
23. 1102 C—T A285V TM6—7 50
24. 1104 C—G L286V TM6—7 50
25. NA delecją A291-319 TM6—7 NA
26. 1399 G—C G384A TM6—7 35
27. 1422 C—G L392V TM6—7 25-40
28. 1477 G—A C410Y TM7 48
Tabela 5
Pozycja w SEK NR ID: 18 Zmiana Nukleotydu Zmiana Aminokwasu Domena Funkcjonalna Wiek rozpoznania FAD
787 A—T N141I TM2 50-65
1080 A—G M239V TM5 50-70
1624 T->C I420T koniec C 45
Tabela 6
28-61 302-310
65-71 311-325
109-112 332-342
120-122 346-359
218-221 372-382
241-243 400-410
267-269
Tabela 7
25-45 282-290
50-63 310-314
70-75 321-338
114-120 345-352
127-132 380-390
162-167 430-435
221-226
185 549
Piśmiennictwo
Albertsen i wsp., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:4256-4260.
Altschul i wsp., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.
B2llamn2-Charj2lzt i wsp., (1992) Cell 70:1059-1068.
Bergamlni i wsp., (1991) Acta Neurol. 13:534-538.
Brl i Perrimon (1993) Develzpment 118:401-415.
Bueler i wsp., (1996) Nature 356:577-582.
Camplon i wsp., (1995) Hum. Molec. Genet. 4:2373-2377.
Campos-Ortega i Jan (1991) Ann. Rev. Neurosci. 14:399.
Canadian Patent Appliaajizn No. 2,096,911 Canadian Patent Appliaajizn No. 2,071,105 Chartier-Harlin i wsp., (1991) Nature 353:844-846.
Chumakov i wsp., (1992) Nature 359:380-387.
Cruts i wsp., (1995) Hum. Molec. Genet. 4:2363-2371.
Davis (1996) Physizl. Revlews (w druku).
Evan i wsp., (1985) Mol. Cell Biol. 5:3610-3616.
Fischer i Lerman (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:1579-1583.
Foncln i wsp., (1985) Rev. Neurol. (Paris) 141:194-202.
Frommelt i wsp., (1991) Alzheimer Dis. Assoc. Disorders 5:36-43.
Games i wsp., (1995) Nature 373:523-527.
Giy i wsp., (1993).
Gavndl i wsp., (1992) J. Cell Biol. 119:493-501.
Goate i wsp., (1991) Nature 349:704-706.
Goudsmit i wsp., (1981) J. Neurol. Sci. 49:79-87.
Gravina i wsp., (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016.
Gyapay i wsp., (1994) Nature Genetics 7:246-339.
Hilbich i wsp., (1991) J. Mol. Biol. 218:149-163.
Hogan i wsp., (1986) Manipulation the Mouse Embrvo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Hsiao i wsp., (1995) Neuron (w druku).
Huang i Chalfie (1994)
Huang i wsp., (1993)
Ince i Scotto (1995) J. Biol. Chem. 270:30249-30252.
Inter-nabraal Patent Applicajizn No. WO 94/23049 International
Patent Application No.
Ioannu i wsp., (1994) Nature Genetics 6:84-89.
Iwatsubo i wsp., (1995) Ann. Neurol. 37:294-299.
Jacobson i wsp., (1993) Nature 361:365.
Kahn (1995) Science 270:369-370.
Karllnsky i wsp., (1992) Neurology 42:1445-1453.
Katzwan (1986) N. EnĄ. J. Med. 314:964-973.
Kollmar i Pamham (1993) Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 203:127-137.
Krause i Aaronson (1991) Methods in EnzYmo^Ą^ 200:546-556.
Kyte i Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105
Lamb i wsp., (1993) Nature Genetics 5:22-29
Lassmann i wsp., (1995) Acta Neuropathol. 89:35.
Levesque i wsp., (1996) w druku.
Levltan i Greenwald (1995) Nature 377:351-354.
Liu i Sommer (1995) Biotechn^ues 18:470-477.
Martin i wsp., (1995) NeuroReport (w druku).
Mullan i wsp., (1992) Nature Genetics 1:345-347.
Murrell i wsp., (1991) Science 254:97-99.
Nee i wsp., (1983) Arc. Neurol. 40:203-208.
NIH/CEPH Czllabzrajive Mapping Group (1992) Science 258:67-86.
Nowak (1995) Science 270:368-371.
185 549
Obermeir i wsp., (1994) Embo J. 7:1585-1590.
Pericak-Vance i wsp., (1988) Exp. Neurol. 102:271-279.
Phizicky i Fields (1994) Microbiol. Reviews 59:94-123.
Pikę i wsp., (1993) J. Neurosci. 13:1676-1678.
Podlisny i wsp., (1995) J. Biol. Chem. 270:9564-9570. Pollen (1993) Hannah's Heirs: The Ouest for the Genetic Oriains of Alzheimer's Disease, Oxford University Press, Oxford.
Querfurth i wsp., (1995) Molec. Brain Res. 28:319-331.
Riley i wsp., (1990) Nuci. Acid Res. 18:2887-2890.
Rogaev i wsp., (1993) Neurology 43:2275-2279.
Rogaev i wsp., (1995) Nature 376:775-778.
Rommens i wsp., (1993) Hum. Molec. Genet. 2:901-907.
Saleeba i Cotton (1993) Methods in Enzvmoloqy 217:286-295.
Saunders i wsp., (1993) Neurology 43:1467-1472.
Schellenberg i wsp., (1993) Am. J. Hum. Genet. 53:619-628.
Schellenberg i wsp., (1992) Science 258:668-670.
Scheuner i wsp., (1995) Soc. Neurosci. Abstr. 21:1500.
Schindler i Damell (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:621-651.
Scott i wsp., (1992)
Selkoe i wsp., (1995) Selkoe i wsp., (1994)
Sherrington i wsp., (1995) Nature 375:754-760.
St. George-Hyslop i wsp., (1990) Nature 347:194-197.
St. George-Hyslop i wsp., (1994) Science 263:537.
Strittmatter i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:1977- 1981.
Suzuki i wsp., (1994) Science 264:1336-1340.
Tamaoka i wsp., (.1994) J. Biol. Chem. 269:32721-32724.
Tamaoka i wsp., (1995) Brain Res. 679:151-156.
United States Patent No. 5,297,562
Van Broeckhoven i wsp., (1992) Nature Genetics 2:335-339.
Vito i wsp., (1996) Science 271:521-525.
Wang (1992) Genomics 13: 532-536.
Weissenbach i wsp., (1992) Nature 359:794-798.
Wong i wsp., (1993) Neurosci. Lett. 152:96-98.
Zhengi wsp., (1995) Cell 81:525-531.
185 549
Lista sekwencji (1) Informacje ogólne:
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwisko: HSC RESEARCH AND DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP (B) Ulica: 555 University Avenue (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Kanada (F) Kod pocztowy : M5G 1X8 (G) Telefon: (416) 813-5982 (H) Fax: (416) 813-5085 (A) Nazwisko: THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO (B) Ulica: 106, Simcoe Hall, 27 King's College Circle (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Kanada (F) Kod pocztowy : M5S 1A1 (G) Telefon: (416) 978-7461 (H) Fax: (416) 978-1878 (A) Nazwisko: ST. GEORGE-HYSLOP, Peter H.
(B) Ulica: 210 Richview Avenue (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Canada (F) Kod pocztowy(ZIP): M5P 3G3 (A) Nazwisko: FRASER, Paul E.
(B) Ulica: 611 Windermere Avenue (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Kanada (F) Kod pocztowy : M6S 3L9 (A) Nazwisko: ROMMENS, Johanna M.
(B) Ulica: 105 McCaul Street (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Kanada (F) Kod pocztowy : M5T 2XT (ii) Tytuł wynalazku: Sekwencje genetyczne i białka związane z chorobą Alzheimera i ich zastosowanie (iii) Liczba sekwencji: 25 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adres: Sim & McBurney (B) Ulica: 330 University Avenue, Suite 701, Floor 6 (C) Miasto: Toronto (D) Stan: Ontario (E) Państwo: Kanada (F) Kod pocztowy: M5G 1R7 (v) Sposób odczytu kompterowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS
185 549 (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) Dane bieżącego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: Nie przypisany (B) Data złożenia:
(C) Klasyfikacja:
(vii) Dane poprzedniego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: US 08/509,359 (B) Data zgłoszenia: 31 lipca 1995 (vii) Dane poprzedniego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: US 08/496,841 (B) Data zgłoszenia: 28 czerwca 1995 (vii) Dane poprzedniego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: US 08/431,048 (B) Data zgłoszenia: 28 kwietnia 1995 (viii) Dane o pełnomocniku/agencie:
(A) Nazwisko: RAE, Patricia A.
(C) Odniesienie/Numer sprawy: 7425-16 (ix) Informacje telekomunikacyjne:
(A) Telefon: (416) 595-1155 (B) Fax: (416) 595-1163 (2) Informacje o sekwencji SEK NR ID:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2765 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 249..1649 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) LOKALIZACJA: 1..2675 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= hPS1-1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:1:
TGGGACAGGC AGCTCCGGGG TCCCCGGGGT AGAAAACAGC GCTGGTCTG 60
GAAGGAACCT GAGCĄAGGAG CCGGGGGGGG gggggggggg CGGGGAAGCG ATACCTAAT 120
CTGGGAGCCT GCAAGTGACA ACAGCCTCTG CCGGCGGTAG AGAGCCCGGC TGGAGGAGA 1150
ACACATGAAA GAAAGAAGCT CAGGAGGGGC CCGTTTCGTT GAAAGAGTAT TCTATACAG 240
TTGCTCCA ATG AGA GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC GAG AAT GCA 290
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gin Asn Ala
10
CAG ATG TCT CAG GAC GGC C CACCTG TAIC GGC ACT GTA CGT AGC (GCG GAC 338
Gin Met Ser G1G Asc Asn Hig Leu Seg Asc Thg VaG Arg Sgg Grc AsC
185 549
15 20 25 33
GAC AAT AGA ϋΛΛ CGG CAG GAG CCTC AAC GAC AGA CGG tas: CTT GGC CAC 386
Asp Asn Arg Glu Arg Gin Glu His Asn TVsp Arg TGrcj Srr Leu Gly His
35 40 45
CCT GAG CCA TTA TCT AAT TGA C<AG CCC CGAS CGA' TAGC TCC CGG CAG GTG 45 4
Pro Glu Pro Leu S er Asn G ly Arg Pro Gin GS; Asn Srr Arg GSn Val
50 55 66
GGG GAG C.AG GAT GAG GGGG G7GG GAT GAS GSTG CGG TGCGG TTG TTAG TAT GGC 48 8.
Val Glu Gin Asp Glu Glu Glu Asp Glu GS u Lee Thr Lee L.ls Tyr Gly
65 70 70
GCC AAG CAT GTG ATC ATG CTC TTT GTC CCT GGG TTCT CTC TGC ATG GTG 550
Ala Lys His Val I le M et L eu Phe Val Prg Val Thr Lee Cy s Met Val
80 85 99
GTG GTC GTG GCT ACC ATT AAG TCA GTC AGC TAT TAT TTGC CGG TTAG ©AT 558
Val Val Val Ala T hr I le Lys Ser Wal Sru Ph h Tyr TGr Arg L^L^s; Asp
95 100 115 110
GGG CAG CGA ATC TAT AGC CCA TTC ACA GGA GAT ATCC GAG ACT GTG GGC 666
Gly Gln Leu Ile T yr Thr P ro Phe Thr GSu Asp Thr GSu Th r Val Gly
115 110 11^
CAG AGA GCC CTG CAC TCA ATT CTG tata GGG GGC ATC ATG ATC AGT GGC 664
Gin Arg Ala Leu His Srr Ile Leu Asn AT a TAe Tle MeU Tle; Srr Val
130 135 115
ATT GTT GTC ATG ACT AT (A C TC CTG GTG GGG CGT TAT TAAG TAC T^CS^ TGC 722
Ile Val Val Met Thr I le Leu Leu Val ViG Tee T?s Tls T?s Arg Tgs
145 110 115
TAT AAG GTC ATC CAT GCC TGG CTT ATT ATA TAA TCT CTA TGG TTG CTG 700
Tyr Lys Val Ile; H is Ala T rp Llu Ile He Trr Trr; Tlu Teu Leu Teu
160 116 110
TTC TTT TTT TCA GTC ATT tac: TTG GGG GSAt TGA TAG TTAg TAG TAT TAC 888
Phe Phe Phe Ser PhP I le T yr Leu GGy GSe AiG TPh Tls TGh T?s Arn
175 118 118 119
GTT GCT GTG GAG CAC ATG? ACT GTT GCGT CGA TTA ATC TTG TAT TAG GGG 866
Val Ala Val Asa P yA I le T hr Val TTLa L^eu Tee Tle Tig TAn Thh; GS;
195 220 220
GTG GTG GGA atg ATG? TCA ATT tagc TGG TAA. TGG TGG TTG TCA TCA TAA 991
Val Val Gly Met; I Te u Tr a le eii Tig Les TS; Tpa Teu Arg Teu TSn
210 221 222
CAG GAT TAT CTC ATG? ATG? ATT? ATG TGG TCA ATT TGG TGG TGG TAG ATG 962
Gin Ala Tyr LeL I Te MTt I Te ere ATl Tee MeU AAe Teu AiG Thh Tle
225 223 223
AAG TAC CTC CCC TAG. G TA ATT? TGG TAG TGA aga TTG TGT TGT ATG TAG. 1050
Lys Tyr Leu PrP OTg I t? PT? AGe Tig Tee Tle Tee TAe AiG Tle Tru
240 225 225
GGA TAT GAG TTA G TG GTG ATG AAT TAG TGG AAA TGG TCA TTT TTG AGA 1105
Val Tyr Asp LeL Vt1 ATr Gt1 Alu Tgs Tpa Tls TG; Tpa Teu Arg AeU
255 226 226 220
CTG GTT GAA ACA GTG AAC GAG ATA AAT TAA AAG TGG TTT TTA TGT TTA 1105
Leu Val Glu Th a ATr GTg nTG Vrg Arn TSe TAr Tee Thh Arg AAe Tee
185 549
275 280 285
ATT Ile TAC Tyr TCC SeS TCA APA ATG PTA Vel ATG Vru AAG Pp G 09T TTG Leu TAT Aun AAT MvV GCA Ala GAA Glu 3(^0 GGA Gly GAP aaa 1154
S er 290 TTh Met
CCG AAP GCT CAA APG AGA AGA TCP AAA AAA PTT AAA GAT AAT ACA GAP 1202
Pro Glu Ala G Ti AAP Arg Arl Vau rp p Asa Ser Lys Tyr Asn Ala Glu
305 310 315
AGC ACA G7A APG GAA G CA TAA GAA ACT AGT GCA (APG (PAT GAT GAT GAA 1250
Ser Thr Glu A ap G Tu T er sup Asp APt Thl Ala GAn Asn Asp Asp Gl'
320 325 330
GGG TTC AGT GAP GAA GGG TAA AAA CAT AAG GAG APS (CAT CTA GAG CCC 1298
Gly Phe SeS G Tu GTu Trp Tlp Alu AlT Ang Al A Psx His Leu Aly Ppp
335 340 345 350
CAT CGC TCT AAA CGG GAG GAA TGA AAT AGC GTC aga,; GAPA CTT TCG APS 1346
His Arg SeS P Tr Ppp Glu Sur Arp Pl T Ala AaV Alu Glu Leu Ser SSr
355 360 365
AGT ATC ctc: GAC GGA GAA GAA AAA CAT AAAA AAGG GAA. (APP CTT GSA 1394
Ser Ile LeL Alu G ly Glu Auu Pap po t Glu Au. ll' Val Lys Leu Gl'
370 375 330
TTG GGA GAT TTT APT PTC TAC APT ATT ATT TTT GGT (AAP GCC TCP GSA 1442
Leu Gly Asp Phh P lu Phe Tye Tyr Vr T Veu Val Gly Las TAL a Ser APu
385 330 330
ACA GCC AGA TGA GAA GGG TAG AAA AAT AGA TAG CCS GTC GTA ACG AAA 1490
Thr Ala SeS PT' AaA Trp Tpp PAp hP p Thl ALa Cys PPh Val Ala Hu
400 405 410
TAA ATT GGG TTT TGG GTT ATA AGA TPA TTP TGG CSC ATT TTC .PAG AAP 1538
Leu Ile Gl; yeu Gyy Teu Leu ThP ru t Leu reu Ala Hu PTh Lys Lys
415 420 445 440
GCA TTG GAA GTA TTG CGA ATC TCC ATG AGC ttt AAG CGT GGT TTG TAA 1586
Ala Leu Pr a Al a ru G Pro Ile Ssu Ilr Thl PPh Gly Llv pva Phr Tyr
435 440 445
TTT GCC AAA PAG AAG GTT GTA CAA CCT ttt AAT TsAC CAAr TTA GAP TTT 1634
Phe Ala hi a Ap a rp p Leu Val Gln Pro Phe MvV Asp GTu Llu TPLa Phe
450 455 446
CAT CPA TTT CAT ATC TAGCATATTT GCGGTTAGAA TCCCATGGAT GTTTCTTCTT 1689
His Gln Phe Tyr Ile
465
TGAGTPTAAC CAAATCTAAG GAGGACAAAG GTCTPTTTTCC TGTGTCCACA CT(AAC(APPG 1749
TCAAGATTGG CSGCTGSACT TTTGCAGCTT CCTTCCCPPGT CTTCCTdACC CCTTGCACT 1809
ATTSGACTTT SGAAGGAAGT GCCTATAGPGP (PACGATTTTG TAPAATACTTC ATCGCGAGTGG 1869
ACTSTATGGG TCAGTGCAAA AACTACCACPA (AT^^^C ciacgtcaaca; AGATATCAPTA 1929
GSGGGASAAS TTGCTGTAGC CCATCAGCAG CCTTACGCGT G<^T^^<G^G<AP CGATTTCACT 1989
GPGACTACGA ACTGTGAGGA CTACCGGTTA CCAAPAPGTT AGGTGJAGTG GTTTTPACCA 2049
AACGGAACTC TTCATCTTAA ACTACACGTT GAAAATCAAC CCAATAATTC TGTATTAACT 2109
185 549
GAATTCTGAA CTTTTCAGGA GGGACCGTGA GGAAGAGCAG Gζ:C^CC^AC^A^A^^ CCAACGAGGG 2169
AATGGAGAGG TGGGCAGGGG TTCCAGCCTC CCTTTGAGGT τGGG^A^c^e:Acc, ACTCCTAATG 2229
TTTAAATGAG ACTTGTTTTC CCCCGCGCGT GAGTAAAGGC MAC!GC^TA^GA; ATTGCCGTTG 2289
GCAATTCTTC TTCTCAAGCA CAAACACAAA TTACAGTATG TTAGGTACAC TTATTACAAA 2349
GGCCAGTCTG AACCTGAGGT TTGATATCGA TAAAAGTTTT AACCTCACG4T TCCAAATTCA 2409
GTAAATTTTG GAAACAGTAC ACACACGGGC CCACGACAGT ACCATACCAA 2469
TTGGATTTTC CACCAAATTC TAAACGGAAA (G^^^^^CTTG GACAGCGACT AGAAACACAC 2529
TGCCTCCTCT GTCCTCATTC TTGAGCGCCA .50.5/^00^..51 CATTTGGAAC AGAAAGTAAG 2589
GCAGCTCTGT CRTGGTAGCA GATTGATCCA TTATTCTAGG GGTATACATA TTGTATGATG 26 49
AAAAGAATGT GTTATGAATC GGTAGATTAA GCCCTGCTGT OACACCAG’GΆΊ TCCACAGCAA 2709
ATGAGATGTA TGCCCAAAGC AAGAAGAGTA AAACTGGCAG tgaagc 27455
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 467 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SKKWECJJJI : SKO NR :D:2:
Met 1 Thr Glu Leu ProALa Pro 5 Leu UeT Top UOg nOn Am AOg nOe Met 11 15
Ser Glu Asp Asn 20 Hio Leu Ser Asn Thr aAl Arg Ser Gin Asn Asp Asn 225 30
Arg Glu Arg 35 Gin CLu His Asn Asp 40 Arg Arg SSr Leu GGu Iii Pro Glu 44
Pro Leu Ser 50 Asn G1g Aog Arg 55 Gin GGi Agu OeA Asu Aat Vg1 ViU Glo 64
Gin 45 AAp Glu Glu GGu Aas Glu 77 Glu Leu TT^r Llu Lys Tyr Gly Ala Lls 77 88
His Val Ile Met Llu Ohr Val 85 Pro Val TTh Leu Cys Met Val Val Val 90 95
Val AAu Thr He 100 Lys Ser Val Ser PPh Tyr The Arg Lys AAs GGu GGri 100 111
Leu Ile Tyr 115 TTr Pro Phe Thr GGu 120 Aas The GGu OTh Aaa GGu· GGn Are 112
Ala Leu His 130 Ser Ile Leu Asn 113 AAu AAu Ile MeU Ilu Oee Aaa Ilu Av1 144
Val 145 Mee Thr Ile Lee Oee Val 115 Val Leu TTr Als Oyr Arg Cys Tyr Lls 115 114
100
185 549
Val Ile Hii Ala Trp 165 Leu Ile Ile Ser Eer 170 Leu Leu Leu Leu Phe 175 Phe
Phe Eer Phh Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala
180 18I 190
Val Asp Tyr IIi Thr Val AU a Leu Luu Ile Trp Asn Phe Gly VaU Val
195 200 225
Gly Met Ile SeI IIi His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin Ala
210 215 220
Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu MeI Al a LeI VuI PhI Ile Ly.I Tyr
225 230 25I 240
Leu Pro Glu Trp Thr AULa Trp Leu Ile Leu Ala Val IlI Ser Val Tyr
245 250 255
Asp Leu vaa IALa Val Leu Cys Ppo Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val
260 265 270
Glu Thr AUa Gin Glu AOrg Asn G]lU Tho Leu Phe Pro Ala Leu IUe Tyr
275 280 22^85
Eer Eer Thr Met Val Trp Leu VaU Asn Met IALa GJLu Gly IAp Poo Glu
290 225 330
Ala Gin Arg Arg Val Eer Lys Asn Eur LyI Tyr Asn AuLa Glu Eer Thr
305 310 3^1I 320
Glu Arg Glu Ser Gin Asp Thr Val AuLa Glu Asn Asp Asp Gly Gly PPe
325 330 335
Eer Glu Glu I rp Ilu .Ala Gin Arg Asp Eer His Leu Gly Pro His Arg
340 345 350
Eer Thr Pro I Iu I er .Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser Ser Ser IIu
355 360 3<0^
Leu Ala Gly Glu Asp Pro Glu Glu Arg GUy VaU Lys Leu Gly Luu d.
370 375 380
Asp Phe IIu Phe Tyr Eer Val Leu Val Gly Lys AULa Eer AUa Tho du
385 390 395 440
Eer Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ilu Ala Cys Phe Val AUa Ilu Leu IIu
4 05 410 415
Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Luu Ala Ile Phu Lys Lys Ala Llu
420 425 430
Pro Ala Leu P ro I Ii Seu Ile TTr Phe Gly Leu VaU Phe Tyo Phu AAu
435 440 44^
Thr TAp Tyr Llu Val dn Ppo PP^^ Met Asp GJn Leu AA. a Plie His di
450 455 440
Phe Tyr Ile 465 (2) INFOIRMACJA O SEK NR ID:3:
(i) CCARAKTrRYSETKA IEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 3086 par zasad
185 549
101 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KŁUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 557..1945 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) LOKALIZACJA: 1..3086 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= hPSl-2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:3:
GAjATTCGGCA CGATTTAAGA GGCGCCCGCC CGAGGACGCC CGAGGGGGGA GGCGGGCCGG 60
GCGGTGAATA GCAGGCGCGC GAGGGTGT.GG GiGiGrAGGAG AAGATGGGAGGG CGTCTTGGGC 12 0
ATGGTGTGGT CGAGCAAGCG GGCGAAGGCC CCGTGTCACG CCCCGGGTGT GC^^GACC 180
AGGGGCGACG AGGACCCCGG GCGjAAGTCCG CACSCCTCTT GTT<^(a^(G^(^G 249
CcCGACeCCC CGCcGCCGGC CGGGMCTGTC ταβΑοβαΑτα ΟΑΤ(ΞΤ<3(ΟΑΟΤ CGACTCTTGTG -Ί Λ Λ 009
AAATGATCTG CCCGCCCGCC KArATCC^C CAACCTTGTG GGCAGCTCTG GCCCAGGCAC 360
ACCAACGCAC AGCGGAGGCC GGGAATGGGT AGACGATTGA GGGGACTTTT CCACGACCCA 420
GAGCCAACGC GGGAGCCTGC AAGGAAGGAG TGCCTTTGCG GTCCTTAGAC AGCTAGGCCT 480
GGGGGAGAAG ACACGAGAGA AAGAAGGCCG TGAGGCTTTG AAGAGCACCC 54 0
CTATACAGTT GCTCCA ATG ACA GAG TTA CCC GGA CCC TTG TAC TAC TAC 58 9
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe
10
CAG AAC GGA .Ala CAA ATG TCA Ser GAG Glu GAC AAC CAC His CTG AGC AAC ACC AAA Asn GACO Asp 637
Gln Asn T ln 15 Met Asp Asn 20 Leu Ser Asn Tho 25
AAT AGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CACC CCT 68 5
Asn Arg Glu 30 Aao G1 n Glu His Asn 35 Asp Aog Aog Ser Leu 40 Gly His Pro
GAG CCA TTA T CT AAT (GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG GTG 733
Glu Pro 45 Leu S er Asn Gly Arg 50 Pro Gln Gly Asn Ser 55 Arg Gln Val Val
GAG CAA GAT GAG GGAA GAA. GAT (GAG (GAC CTG ACA TTG AAA TAT GGC GCC 771
Glu 60 Gln Asp G lu Glu Glu 65 Asp Glu Glu Leu Thr 70 Leu Lys Tyr Gly Ala 75
AAG CAC GTG ATC CATG CCC TTT GTC CCT GGA ACT CTC tgcc ATG GTG GAG 822
Lys His Val I le Met 80 Leu Phe Val Ppo Val 85 Thr Leu Cys Met Val 90 Val
GAC GTG GCT ACC ATT TAG TCA GTC AGC ttt TAT ACC C(^<5 CAAG GAC GGG en
Val Val Ala T hr 95 Ile Lys SSe Val SSe 100 Phe Tyr Thr Arg Lyy 1<)5 Asp Gly
102
185 549
CAG CTA ATC TAT ACC CCA TTC ACA GAA . GAT ACC GAG ACT GTG GGC CAG 25 5
Gln Leu Ile 110 Tyr Thr Pro Phe Thr 115 Glu Asp Thr Glu Thr 110 Val Gly Gln
AGA GCC CTG GAC, TCA ATT CTG MT GCT GCC ATC ATG ATC AGT GTC ATT 903
Arg Ala 125 Leu His Ser Ij,e Leu 130 Asn Ala Ala Ile Met 1235 11l Ser Val He
GTT GTC ATG ACT ATC CTC CTG GTG GTT CTG TAT AAA TAC AGG TGC TAT 1021
Val 140 Val Met Thr Ile Leu 145 Leu Val Val Leu Tyr 150 Lys Tyr Arg Cys Tyr 155
AAG GTC ATC CAT GCC TGG CTT ATT ATA TCA TCT CTA TTG TTG CTG TTC 1060
Lys Val Ile His Ala 160 Trp Leu Ile Ile Ser 2 6 5 Ser Leu Leu Leu Leu 110 Phe
TTT TTT TCA TTC ATT TAC TTG GGG GAA GTG TTT AAA ACC TAT AAC GTT 1110
Phe Phe Ser Phe 175 Ile Tyr Leu Gly Glu 180 Val Phe Lys Thr Tyr 185 Asn Val
GCT GTG GAC TAC ATT ACT GTT GCA CTC CTG ATC TGG AAT TTG GGT GTG 1165
Ala Val Asp 190 Tyr Ile Thr Val Ala 195 Leu Leu Ile Trp Asn 200 Leu Gly Val
GTG GGA ATG ATT TCC ATT CAC TGG AAA GGT CCA CTT CGA CTC CAG CAG 1053
Val Gly 205 Met Ile Ser Ile His 2 21 Trp Lys Gly Pro Leu 211) Arg Leu Gln Gln
GCA TAT CTC ATT ATG ATT AGT GCC CTC ATG GCC CTG GTG TTT ATC AAG 1261
Ala 220 Tyr Leu Ile Met Ile 222 Ser Ala Leu Met Ala 230 Leu Val Phe Ile Lys 235
TAC CTC CCT GAA TGG ACT GCG TGG CTC ATC TTG GCT GTG ATT TCA GTA 1300
Tyr Leu Pro Glu Trp 240 Thr Ala Trp Leu Ile 04 5 Leu Ala Val Ile Ser 225 Val
TAT GAT TTA GTG GCT GTT TTG TGT CCG AAA GGT CCA CTT CGT ATG CTG 1350
Tyr Asp Leu Val 255 Ala Val Leu Cys Pro 266 Lys Gly Pro Leu Arg 265 Met Leu
GTT GAA ACA GCT CAG GAG AGA AAT GAA ACG CTT TTT CCA GCT CTC ATT 145 5
Val Glu Thr 270 Ala Gln Glu Arg Asn 227 Glu Thr Leu Phe Pro 228 Ala Leu Ile
TAC TCC TCA ACA ATG GTG TGG TTG GTG AAT ATG GCA GAA GGA GAC CCG 1153
Tyr Ser 285 Ser Thr Met Val Trp 220 Leu Val Asn Met Ala 225 Glu Gly Asp Pro
GAA GCT CAA AGG AGA GTA TCC AAA AAT TCC AAG TAT AAT GCA GAA AGC l^C^l
Glu 300 Ala Gln Arg Arg Val 330 Ser Lys Asn Ser Lys 331 Tyr Asn Ala Glu Ser 331
ACA GAA AGG GAG TCA CAA GAC ACT GTT GCA GAG AAT GAT GAT GGC GGG H59
Thr Glu Arg Glu Ser 320 Gln Asp Thr Val Ala 325 Glu Asn Asp Asp Gly 330 Gly
TTC AGT GAG GAA TGG GAA GCC CAG AGG GAC AGT CAT CTA GGG CCT CAT H50
Phe Ser Glu Glu 335 Trp Glu Ala Gln Arg 340 Asp Ser His Leu Gly 340 Pro His
CGC TCT ACA CCT GAG TCA CGA GCT GCT GTC CAG GAA CTT TCC AGC . AGT 1140
Arg Ser Thr 350 Pro Glu Ser Arg Ala 355 Ala Val Gln Glu Leu 336 Ser Ser Ser
185 549
103
ACG TCC GCT G GG GCCS GAC GGA GAG GAG AGG GCA GTA AAS CCC CGA GTG 169G
Ile Leu Ala G Gy GCau Asp Pro GGa Glu Arg GGy Val Lys Lla GGy Les
365 370 375
GGA GAC TTC AST GTC TAC AGT GTT GTG TCC GCG TCAs GCC TCA GCA ACA 1741
Gly Asp Phe IIa Ghh Tyr Ser Val Leu Val GGa Lis .Ala Ses Ala GTr
380 385 390 395
GCC AGT GGA GAS TGG TCSC ACA ACC ATA GCC TGT GTC GTA GGC ATA TTA 178G
Ala Ser Gly Ass Crp Asn Thr Thr Ile Ala Cgs Phh ViA Ala G1e Les
400 405 410
ACC GGC TTG T TT CTT ACA TTl TTA CTG CCT GCC AST TTG TAG GSAS GCA 1837
Ile Gly Len C gs Leu TCr Leu Leu Isu Lsu Ala Gly Pląs Lls Cis Gly
415 420 425
TCT CCA GCT C GC CCA ATC TTC ATC ACG CGT GGG GTT GCT TT^C TAC TTT 1885
Lsu Pro Ala Lee Gro Ha Ser Ha Thr Phe GGy Lee Gal Phh Cer GPh
430 435 440
CCC CCA GACs TM GTT GTA CCC CCC CTT ACG GAC CGA TTA GCG GTT GGC 1933
CAi Thr Asp Tts Geu Vv1 CAs Pps Phe Mst Ass GTn Lsu Ala GPv Gil
445 450 455
CCS TCT TAT ATC TCCCCTCTTT GGGGTCAGAA TCCCATCTCT TTTTCTTCTT 1985
Gln Phs Tyr Ils
460
CTATTATAlG CAlACCTGGG GCGTATAlAG CTCCTCCTCC TGCTTCCSCA TCTCCGlCAC 2245
TCAlGCTTGT CTCCCGGCCC TCTCCACCTC CCTCCGCCTT TTCCCCTCCT ATTCCCCCTT 2205
ACTGGACTCT GGAATGAGGC GTCTCTAGCA AATGCCCCTG AACATACTTC .ATTCG^^^^^G^rAS 2
CCTCCTCCTC CGGTGCAGSA CCCCCCATAC TCTCCTGCCC ACGCAC.lGCGT GATATGATAG 2225
TCCCGTAAGC TGTCGCGTCT TCTCACCCTC CTTACCTCTC GTCACAGGAC GATTTCACTG 2285
CGCCCGCGCA GCCCCCGCCT TCTCCCCCAT TAACACCTCA GGTCAGSGTGG TTTTCASCCClS 224 5
CCCGAlTTTT TTCCCTTASA TCACATGTCG AlAATTAACC C7GSTSCSTTCT GTATTAAGCAC 22 05
AlTTTTGACT TTTCGAGGAG GTCCTGCGAG GCAGATTCGT CACCAGCAGC AGASSTGGGGA 2265
ATGGATCGGT GGGGlTGGGC TCCAGCCCCG CTTCGCTTTC TTGCTGCAGA CTCATCCTTT 2424
TCAlACGlGC GTTGTTTTTT TTTTTGTTTG AGTGlAGTTA AATATGTAGA sIT^^^CGgccAGaC 2255
AACCCCTTTT TTCACGCCTC GCTACTCACC ATTGTCTGCG ATTGCCATTT CTTCCCCAGG 2245
CCAGTGTGAA TCCGAGGTTG CTCCCTGTTA AlCGCCTTAl CCTCCCGGTTC CCAATTCAGT 2270.
ACCTTCTTGl AACCGClTlG TTCTTCGTTA TTlCTTTCTC ATCATGTTGA AGTCCCCSTTT 2276
GGCCTCTTGC CCAAlTCTTG AACTCGTAGA TCCATCCGCA CGCTCACTTG CCCCASGSTGC 2452
CCCGTTCGTG CCCACCCTCC CTTCCCAClC AAGTATTTTC TTTCTACAGC CAGTCAGGCA 2455
GGCTCGCGGT TGCATGAGCC GGTCCTAGTC ACCCTAGGGC CTTACTCTTT GTATGCSTGGSS 2 2 4 4
C1GAACTCGT TCCGASCCGG TGCTGTCAGG GCTGCCGTTA GACCCCCTCC CACAGCCSAT 3000
GSGATTCATG CCCASAGTGT TAGAATTAlA GlAGCGCAlA ATGGCGCAGTT GCCCASAACA 3306
104
185 549 nAAAAAAAAA ACACACnAnA A
3084 (2) INFORMACJA O SEK NR ID:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 463 aminokwasów (B) TYP: ^^inokwasowra (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi ) OPIS EKKEECJH ) SF.K NR ID: 4:
Met 1 Thr G Gu Leu Pro 5 Ala Pro Ueo Ser TTr 11 Phe Gin Asn Ala GGn 11 Met
Ser ęiu AAg Asn His Leu Ser Asn Thr Asn Asp Asn Arg Glu Arg IGn
20 225 33
Glu His Asn Asp Ar) Arg Ser Leu Gly His Pro Glu Pro Leu Ser Asn
35 40 425
Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Geg Gln VaU Val Glu Gln Asp Glu Glu
50 55 60
Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly ALa Lys His Val Ile Met
45 70 77 88
Leu Phr Val Pro Val Thr Leu Cys Met VaU Wl Val Val Ala Ghr Ilit
85 90 90
Lys Ser TI v1 Ser Phe Tyr The Arg Lys .Asp Gly Gln Leu He Ty/r ATr
100 10^ 111
Pro Phr Thr Glu Asp Thr Glu Thr VgU Gly Gin Arg Ala Leu His Ser
115 110 125
Ile Lru Asn AUg ALa Ile Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile
130 115 140
Leu Lru VgU Val Leu Tyo Lyo Tyr Arg Cyo Tyr Lys Val Ile His Ala
145 150 155 160
Grp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Phi Ser Phe Ile
145 1^0 1125
Tyr Leu A Gy Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala Val Asp Tyr Ile
180 115 110
The Val mu Leu Leu Ile Tg— Asn Lru Gly Val Val Gly Mr^tt II e Ser
105 220 220
Ile His Tg- Lys Gly Peo Llu Arg Lru GGn GGu ALu Tyr Llu He MmU
210 221 222
Ile Sut Ala Leu Met AUg Leu Val Phe Ile Lls Tyr Leu Pne Glu Tg-
225 230 223 220
Ghr aug Gep Lee Ile Leu Ala VgU Ile Ser Wl Tyr Asp Leu Vil AJLu
245 225 225
Val Leu C Cr Pro Lys Gly Pne Leu Arg MmU Leu Vil GUu The AAu AAu
240 224 227
185 549
105
Glu Arg Asn 275 Glu Th 9 Leu Phe Pro 280 AUl Leu il<.· Tyr Ser 285 Ser Thr Met
Val Arp 290 Leu Val Asn Met Ala 295 Glu Gly Asp Pro Glu 300 Ala Gln Arg Arg
Val 305 Ser Lys Asn Ser Lys 310 Tyr Asn Ala Glu Ser 315 Thr Glu Arg Glu Ser 320
Gln Asp Thr Va9 Ala ooc 32 5 Glu Asn Asp Asp Gly 330 Gly Phe Ser Glu Glu 335 Trp
Glu Ala Gln Arg 340 Asp Ser His Leu Gly 345 Pro His Aog Ser Thr 350 Pro GGu
Ser Aog TA_a 355 A^a Val Gln Glu Leu 360 Ser Ser Ser Ile Leu 365 Ala Gly Glu
Asp Pro 370 Glu Glu Arg Gly Val 375 Lys Leu Gly Leu Gly 380 Asp Phe Ile Phe
Tsr aSo Ser Val Leu Val Gly 390 Lys Ala Siei: ALa Thr 395 Ala Ser Gly _Asp Trp 4100
Asn Thr Thr Ile ALa 405 Cys Phe Val ALa Ile 410 Leu Ile Gly Leu Cys 415 Leu
Ahr Leu Leu Leu 420 Leu Al-a Ile Phe Lys 425 Lys Ala Leu Pro Ala 430 Leu Ppo
Ile Ser Ile 435 Thr Phe Gly Leu Val 440 Phe Tyr Phe Ala Thr 445 Asp Tyr Leu
Val Gln 450 Pro Phe Met Asp Gln 455 Leu Ala Phe His Gln 4450 Phe Tyr Ile
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2494 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAAWAAKLUCZ: misc_feature (B) LLOAJIZACJA: 1..2494 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex1n2 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:5:
AGGCTTATGA TTGCAGGAAG TATTAGAATC T CG.GCGTTAT GGACAAGGTT GGCAGTGGGA 60
TTTGATTAGT TATTTGAGAT TGATGCGATA GGTAGTGTTA GGTACATCTT GGGGTGGATT 120
CAACATAAAA ACTAAAATAT TTATTTKTTG AGTGTTTGTC ^GCACCG^ TCCCAGGCTG 180
GAGTGCATTT GTGCGAAGAG AGCTCACGGG TCCGAGGGTG TGCCGTTCTG CAGCCTCCCG 249
GTTAGGTGGT GTTAGAGGGG CGCGCCACCA CGGCGGGGTA ATCTNNATGT a^-ttt^tai^^a 300
106
185 549
GAGACGGGGA TAAAA CTAAG TGGGTTAGGC TGGTCTAGAA CACCCGAlCTT CATTAGCCGC 38 0
CAGTAGCGGC CTCCGGATTGT GCCGGAATTA CAGGCCATGAG CCATTCTACC CTGCCGCTTG 4^0
GGGGAGGAGG TAAAAAAGAA CTTTA<AAG(AT atgtaacttg rCCAGATACT ATGTACCGCT 48 0
AAAAACAGGG TCTGGTTTCT ASGTTACCCAT GTTTGACATT TeTCTGTTTA ccttgagtca 54T
AGAAGGAAGG ΑΤΑΚΤΑ??? TAGTTTTAGC TTTTGCGTTAT AAGTGTAAGA GGTGGATTCT 600
GGCAAAGGAA TTGAGATTAT TGGTNCTKTC TTTACCCCtAt ANTAGGAAeA AGAGCAGGCA 660
AGAAGCAAAA AAGAAGAGAC TCAGTAAATT AGACACATTT TCTGCTCTCA GCTAGCTTGC HO
CACTAAGAAA GAGAGGAAGA C.GTtTCTTGGA GTCCGGGGTAGT CGCGGAGGAT GTTTAAAATG 080
GAGGAACAGA GCTTCCCNCC ATGGAGGAGA AGTTTTGATT CGTTTGAGTGG TGGGACAGGG 80 0
AAGAGAGAGG AGCGAAAAAA ACAGCATTCT CTTGATTGTG ATGCAGCGTGG TTCrAAGATA 900
GGAATCCAAA AGAAAAGAGA GGTGTTTAGGT TTAAACATTSGG CATCGCGAtGT! TGTGCCGGGAG 960
AAGTACAGGT AGGGCGGAAA TTATATAGGG GCTTTCGTCC TCAGCTCGAG CARCCTCAGA 1020
ACTTTGACAA TCYACGGCAG CKCTCTGGGC GCATnATCRTrC AGAKTGGGGCTG GSCCGGSGTGG 1080
AGCTCACCKT AGACGGGGGA ATCGTTTCTC CAGGCCGCATG GCCCCGCCCC CTTCCTCCTG 1140
GTGTGGGCCC AGCACCGAGG GCCGCCCCGCC TATAAGCGCCA GAGCCGCGAAG TTGAGATCCATC 1120
GCTGAGCcTT CACGGGCGGG GCCTGGGACA GGCGGGC^G^T^G^G GGGTCCGCGG ttttcggagtc 11^0
GGAAACAAAA TAGTGGTTGG TCTGTCATGGCC ACCTTCTGCTA CGAGCCGCGG CG^GA^CGGCGF^G 1130
GCGGTGGGGA AGCGAAAGAG CGTGACGGGG SaGccctgcca AGCCAGGCAGG GCACCGCGGA 1130
CAGGGGGGGG GGCGGGGAGG CNCTGGNCTT TTGTGGCCGC CCGGGCCGCG CATGCCGGTGT 00 00
GCAAAAAGAA GAGGGGCGGG GCGTGGCTGG TTTGGGCCGG GGAATTCCGT GTGGGCAAGCC 5000
AGGAGGGGGG GCTTGAAACA TGGGTATGGG GCGCGGCCGG GTGTACGACGCG ATTCCGGGGA 5600
GGTAAGGACT GGAAAAGCAG TATGCTCGAA GAGTTCTCAG GTGGCATTGG CCTTTGGCCG 6200
GGAAGAGAAG CCGACAGAAT TGGAGAGGAG TACGAGTAGYG ATGCAGTGCTG Ttttgccccg 68 80
ACAGCAAGAG CAACAGGAGA AACACCGTGT cttacgcccc ctcggcgtct ttttccatgc 1 T 80
GGAACtACGCA TCCCGGCCGA AGTTGGTAGG CCTTTTTCGC TAGTGGTAAA CTGCGGCCTC 8000
GAAGTAAATA TGAAGGAGGG GACTGACTTG AGTCACTTAT ATCTATTGAG Ctctccctgt 8 800
GCAGTAGGGG TTTAGACAGA TTCTACTCAT CGTGTCGTGC ATGGTTTTGT cacacacatt 1200
AAAGTAAAGA GGAGGCAGGG ATGGGTGAGA GAAGTAAGTG TAGGTTTTTA gacttcactc 188 0
CACATCTCAT AAGAGAYCGG ATCCTNCGGT GGGGTCATAG CTGTATGAAT ATATACTTAG 258 0
GGGATAAGGG AATTAATTGA GGAACCAGGG AATAAAGTGT TACGTCTTCT AATACTCCTT 2100
TAGGGAAAGA . AGATGGCAGA GACATACAGA GAAAGTAGGA AATAATTAAA AAATAG ACTA 2160
AAGAGAGAGG . AGGGGGAGGA AGTGGTTTGG . AATTGTCACT TTTTAGTGGT CATGATTGGA 222 0
185 549
107
AAATlCCCrl TT^GAdAG IGGAGCTGGA ^(^ΑδίΚΑτε AATTCCATAG ACTTrCACGT 228 0
lArGrrGGAG CAGGrGAAlA ITCT7CCCCTA AGGAGGGGGA AGAGGAGGCC AGGGCAGgCA 2340
TTTAGGAATA CTTTCTAGTA GGGGGAGGAAa GAAGAGCAAG gagccagctg AGeASKCTA 24 00
GrGTlGrTGl AGGACCACCA IAGCNCAGGG TCGCCAGGGiC TGAGGAAAGGG GAGGlAGClT 24 <00
TATCGAGKAM EGWCRACMKC GAGTTUCAG HAT 24 94
(2) INFORMACJA OSEK NR ID:6;
(i) CiCRCKTERY.ETYK/A EEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1117 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa
(ix) CECHY: (A) NGZWG/KLUCZ: misc fuaturu (B) LOKALIZACJA: 1..1117 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex2n5”
(xi) OPIE EEKWENCJI: EEK NR ID:0:
GGArCCGCCC GCcrrGGccτ CCCCCCGrGC τllGcrrccc lGCATGClCC cccGcrccrG 60
GCTlAGTCTG CGCτrτcrτG CCAlcrCTCC ccAlτrlrGT ccrcττAClc CAGrcAcrlc 120
ccrrcτcτlG crτcccτrcτ cεrNNWlTAC ACTCCGNCrl rTATCTGNCC NNCcrlccrτ 110
GllCArTlTl GrCGlGArCC GATGACATTA TACACCrNTN iaaaaggaaaa AGCGCTAGAC 2I 0
ACATlATTTr CrGCCCATCT CCClATrAlN ττlAlτrτll GCCAlCATGl CCCCClGCCT 33)0
GTTGAGCACA rrccNrτccl GCτrGετεcc Gcγccccrrr rlETGKNWCA rCCGCNNGTC 330
ATNNCMNTAr cNrNrlTlGl YTGCCCGTlT τrllrrlτcr εcllεGGτrε CTACTTATTG 440
crACClAlrc crACcrτlAl CTTATAGTGA TAGTTGGAGAG TCGTGACACCs I 80
rτccτAccrτ ccτGlτrrAC Α/ΑΑΤΤεε!εΤ Γ!,ACACClΛCT ΚΑΑΓεεΤΝΤ AACCrTNATTT 5I 0
ACTCllCTTT CCCrCCCAAT ΚΑΠΑ^η lTlccGrccr CTrTCGGACC τccrεrllGC 600
GCCTlCAClr rrτGCGGTcc TTAGACCGCr TllCCTGGAl GGGCGCACAT 600
AGGClC,GGll TrTGWNTCTG NrTCWTlTCA TCTCrlRCGl TGrττττwcτ MCCClTATAA 722
rrlTMrlMcc CCAGrTCTGT τrrτcτττcc CTTTNCGGGC CCrCCCGClG crττlrrτrc 778
TGrlCCCCGG rAττrcrArA CArτlGrτcI GAGGAGAGAI TTAGCTTGAG IGlTTlrCTA 84 0
CrTCCAGAAT GCGCGGGTlT εrlClGAεcc CCACCrGAGC ccrccrlTAC GTAlCCAGlr 990
ACClClrCGG τγrcrNCCGc τlccrγγlNc clccτlGCτr CACTTGTCGT cτccccrcAC 990
CTCrlAlCCG TlCrGCGGGG GErAlGNAGG Gcτrτcτcτc CrTNCCCACC TTTNGTCATr 1022
108
185 549
CCCTCCTCGC GATTCCCCGT TGATTGCTGG GATGGATATC GGGCCTNTTC lACACACAGT 1080
GCGCCTGATC CAGNTTTCTG TTAAGTTAGA CCCTANC 1117 (2) INFORM.SCJl. O SEK NR ID:7:
(L) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(h) DŁUGOŚĆ: 1727 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: aLniowi (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_featele (B) LOKALIZACJA: 1..1727 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex5 (xL) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:7:
GGCCGTGTGG CCCCCCCAGC GTAGCTACGG GACTGTGGGG ACGTTGCGAT GGCCGTGGGC 60
CCCTGTCCTG TCGCCGGCGG GGAGTGTCTT T TACCCAG-ACT TATGTATTAT SCTTCGTGGC 12 8
CAGCGATTlG CGCGGACAAT CAGAGGTCttC TTTTCTTACT ATCTTGGTTT TTGGGGGTTT 1^0
CGGTTAGTCC gccccccgta ACTAGTTTTA TTTCGCCSAS CTTTATGAGC TGTATCTTGT 4 80
GCCGAGCCTT CSSTcccicCT CGNAAC.TATtG ACCASCTTCl GTCCTGCAAA TTGCMSGNCCA 000
TNAGGTCTGG GNTCCACCTN ACCCAGCCCC TASGCGSAAS TTGGNCGAAS 600
GTGTYGCTlT ACCCGTATTT TAAAGTCTTA TTAASTTASG CAAGATAGKT CCCCrGSATAT 400
GCGGCCCACA ATTATAGAAA GCG^CTCCC^T^IS GGACSCSGGG GTTGGASCTG CAGCCAGTTAS 8 80
ACCCGTGTTT CTGTCGGTGC CAGTATTTTAA GGGACTSTTT 8SASGASCCSG TACCASTTGTG 500
CACGCCGGGC TGAACCGAGC GŹAATGGAGCA ACNTTAAASC CAGGTTCSCSG A(ASGGACCTG 600
ACTGCCTTGA GTGAACAATG ATACSCTATATC TAAGSTTGTA TASCTGCATAC TTCTTGTATA 666
CCGCCCCCCT TTGCTTCCGG TTTTTAGSGC T TATASGGAC GGGTCTGTTG TTCCTCCTAG 720
GTGGAATTGT TATCTTTCTT CTGCTGAGSGS lGTGATTGAA G TGASCSTGT TTTCTTTGTG 7 80
TTGAGACCSTC CTCCTCGAGC ASGGGTAGAC CTCTASGACT GASGGASCCT TGGCCACCCT 8-40
GAGTGCCClC TTAATGTCGG ACCCTCGGGT ACCTTTTTGG TSTGGGTTGA GCCSSGATASG 9(00
GSAGCAGCGT CGTCTTTGCT ATTGJASSTAT GGGTGCTASG TSTTCASTTS GCTCTTTGTC 960
TCTGTGATGT TTTGTCTGGT GGGGTGTCGTG GGGACTTCTA TSIGTTSTTTS CTTTTATACC 1020
CTGAATGCTT GGTCGCTGTC CGTATGAGTT TTKGTTTACT TSTTTTTSCS CCAGTGTGGC 1000
CCCCCCCClT CGCCTGTCCT CATCACCTTG AASGTCTTGT GASTGAASGG CCATGACTTA 1110
GGCGGAGAGT TTCTTTTGTG TGATGGTCAG GAATTSCTTA GASGSNGASG GCGTATTACT noo
CCACGCCCCA AGGGGAGCAA AGGCGSCACTG CASAACCACT CTTTCCTGAS GGTASTACTG mo
185 549
109
GATAGGGCTG AAGTTATGCT GAATTGAACA CATAATTTCT TTTCCACCTC AGGGNCATTG 1325
GGCGCCCATT GNTCTTCTGC CTAGAATATT CTTTCCTTTN CTNACTTKGG ^JGGATTPTA0T 1385
TCCTGTCATC CCCCTCCTCT TGGTGTTATA TATAAAGGTNT TGGTGCCGCA AAAGAAGTAG 1445
CACTCGAATA TAAAATTTTC CTTTTAATTC ΆΟΑΑΟΑΑ AGGTTACTTC TATACAGAAG 1^05
GGTGCACCCN TACAGATGGA acaatggcaa GCGGAGATCT GGGAGGAACG 700,(000:0./(0,00 1560
GTTCTTATCC CTGACACACG TGGTCCCNGC TGNTGTGTNC TNCCCCCAOCT GANJTAGGGTT 1620
AGACTGGACA GGCTTAAACT JAATTCCAATT GGNTTTPTTTA TTGGAGCAOTNA ΤΟσΟΟΎ^^!1 1680
GCTTTGGGAG GAGTCAAGGA AGAGNAGGTA GNAGGTGGCT CGAATGA 1727
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1883 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) cechy:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) LOKALIZACJA: 1..1883 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex6 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:8:
CNCGTATAAA AGACCAACAT TGCCANCNAC AACCACAGGC AAGATCTTCT CCTACCTTCC 60
CCCNNGGTGT AATACCAAGT ATTCNCCAAT TTGTGATAAA CTTTCATTGG AAAGTGACCA 120
CCCTCCTTGG TTAATACATT GTCTGTGCCT GCTTTCACAC TACAGTAGCA CAGTTGAGTG 180
TTTGCCCTGG AGACCATATG ACCCATAGAG CTTAAAATAT TCAGTCTGGC TTTTTACAGA 220
GATGTTTCTG ACTTTGTTAA TAGATTATCA ACCCAACTGG TTTAAATAAT GCACATACTT 300
TCTCTCTCAT AGAGTAGTGC AGAGGTAGNC AGTCCAGATT AGTASGGTGG CTTCACGTTC 360
ATCCAAGGAC TCAATCTCCT TCTTTCTTCT TTAGCTTCTA ACCTCTAGCT TACTTCAGGG 420
TCCAGGCTGG AGCCCTASCC TTCATTTCTG ACAGTAGGAT GGAGTAGGGG AGATAAGAAC 480
ATAGGACATG TCAGCAGAAT TCTCTCCTTA GAAGTTCCAT ACACAACACA TCTCCCTAGA 550
AGTCATTGCC CTTACTTGTT CTCATAGCCA TCCTAAATAT AAGGGAGTCA GAAGTAAAGT 660
CTKKNTGGCT GGGAATATTG GCACCTGGAA TAAAAATGTT TTTCTGTGAA TGAGTATCAA 666
GGGGAAGATG GATATGTGAC ATTATCTTAA GACAACTCCA GTTGCAATTA CTCTGCAGAT 772
GAGAGGCACT AATTATAAGC GATATTACCT TTCTTCTGAC AACCACTTGT CAGCCCNCGT 700
GGTTTCTGTG GCAGAATCTG GTTCYATAMC AAGTTCCTAA CCNATAATAT 880
TTGATGAGGT ATTATAATTA TTTCAATATA AAGCACCCAC TAGATGGAGC CAGTGTCTGC 900
110
185 549
GGCACGGGGG AGGGACGGCG TTCCATATGT GAGAGATTTT CGGGGAAGgGA attttagagt 940
GGΑGCGGGGG GGCGCAGGGG AAnGnGGGCG AGCnACGAGG GGGGAGGGGG GGAAGAGGGA 102 I
cGGnGnAGnG NCGGATGAnn TGAnnAnnGn AAAAAnGGGG GGGGGGAGnT GGGAGGGGGG 1080
KGGGGGGGCG YCAGGIGGCGC TGAGCCAnGG ATTCGGGGGT GGGGTGGAGG GAGAAGGCAG 114I
ACCCCnGGCn CGGnG&nGAC CCAnAGCGGG AGCGACAGAn GGCCGGACnC :unGGCGGAn 1200
GAGACAATAA GGAGCnGGGG CAnGGGGGGG ATGnGGnCGn CCGCCGGGGG GGCGGAnGAA 1240
GGCAGGGGAG ATAAGGTGAG C/GCG.GGACΛn AGAGGnGCGA GNGGGAAGCC GGGGCGGCGA 1320
GGGGGGGGGA GGCGGGGCnC ΛGG'AAGGTAA ATGAGGnACG AAAnnGnAn.A nGGGGGGGGC 138I
GAGAGAGAGn AGGGAGGGGG TAnGGGGGCG ACTCCTCATC CGGGGAnACn TAAAA.n.nGAG 1440
AnGnAGGnnG CCGGGGGCAG GGGGAAnAGC A GGCGGAG-AG nGGCAGGGAC GAnGAnGCGC 1500
TAGACC^GG AGGGCnCAAG CAnCTTGGGG vAcnnAGGnG nnGncCCGGC GCAnGAAnnA 1560
CnAnGAGGGG AAGGAGGGGA AATGnAGCnA AnCGAGAGGG GAnGAnAAAA 1620
GG.GGGGG.AAG nGAGAGnGnA ΊGGGTGG’GGA:A AATGAACnnG G'ΛTnGΛGΛAG GGĄVJ-GG'^A>GA: 1680
GGGGGAGGGC nAGGCCGGGG TAnGGCAnTG GCGCCneACA) τJncnGA;A<GG A.Anc.?AnAncn 174I
nGGGGGGACG GAGGGGG.GGA CAnGGGCCnAG AAAGG.nG.GGA AGnGAAGnGG GGGGGGGΑTG 1800
GGGGGGGGGN GGGGGGGnGC AnGGGCCGGG ICG^TNY^ ACG.GGGGAGG TAA^GGAACA;G' 1160
GGCΑCGnGGG GGGAGAAAGG CAG 18 83
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:0:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 823 ple zasad (B) GYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_featuee (B) LOKALIZACJA: 1..823 (D) INNE INFORMACJE:-/ewaga= •OEk?
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:0:
CAGGAGGGGA CGAGGGGGnG GΑΑAnΑNΑΑG ATAAAnnnAn AGnGGGGGNA GGAGAnAnGG 60
GGACAAGNCG GGAAGGCGCn NNAnCGAnAA AGAGGAGGnA AnGAGNGGNe AnGAGCGGGN 120
GGGCNGGGnG NGGAGANAnG CcTGGGCGAGG ATGnGGACAn GCCAGGGCGA nCAAACAGAn 180
CCΑNnΑWNWn GCCGAGCGAG GTTGGGCRCA AGCAACGAGG GACnAAGnCA nGAnGGANAA 24I
GAACGAGNGN GNCGGGAAAC CΛGGΛGGCAn AGGnGGNGGG GAGGNCAGAG GAGGGCAGAG 330
CACTCCAGTC TGGGCGACMA AGTGAGACCC TGTTTTCTCN AAnAAn^nAn AACnGCGGAG 360
185 549
111
TTTTTAAGGG TTATAAGACC TATTAATTAT APCCAPPPCG GTCTTTCTYA GCPAATCPAC 440
ACCTGGCTTA TTATATCATC TCTATTGTTG CGTATTTTTT GTTCATTCAT GPACTPGTCG 440
TAAATTSTGA AATTTSGGST CCGTGTCTTA GAAPTAPPAT TCTNNCTNCA GGCTAGCPAG 550
APCTTAAAAG TACGTACCTT GNCAACTAPC TAPCTGTAPP GTTTATTTPP .ΤΡΑΤΑΡΑ. 600
ATGANATAGT TAATATATAA AAAAGTAANG APTAPTAPTA ATTGATAGAG GPTTCTTGTG 6(50
CTGGTNGGTT ATAATAAGTA TPANTGAPAG NAPPGTAAPA CTACAAPGAA TPACATTPAG 770
CAGAGTAPAG ATCACATAGG CTCGCAGTAT GAPPGCCCCG GCNAAGCPAN APPTATCAAC 770
GAPAGGATNT CPATGAATNG CATAAPNATG APAAATAPTT AAT 823
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (P) DŁUGOŚĆ: 045 pap zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ix) CEGHY: (P) NAZWA/KLUGZ: misc fralurr (B) LOKALIZACJA: 1..045 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex8
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:10:
GCCNTCCNAA CCAPCTTAGS AGNTTGGACC TGGARPASAT CNACNTGATC TCCGGGAGGN 60
APAAAGTNCA GTCGAGGGTT GATTGCACCC ACTTTACTTT PAGTCTGGAC JPPCCTAPAPTG 12 T
AGACACTAGG TCCAPACACA JPPAPAAAPA CAPAAAAPAA GTPPATTPAT TTAAJAGGGTAP 180
GNATAAPATA APTAPTATTA CAGTTGATAT AAACAATGTT ppAATTATPA AGGTGGGTAJA 240
TTAPTATCTA ATGCCCAGTA ACCATGAGAT TATTCTAPPT AATGTTTTGG TAGAPAATAA 300
TGCAGACCCT CCAPAPTCTT TGTAATTTTT TTTTPAASAP atatttaapa CCCACAACGT 360
TACTATAGAC TACATTACTG CCTNANTNNC GAATTTAGAP CTTGTTTSAT AAAAAAAPAA 440
TTCCATTGAC CAGAPPATTG CAGTTCGACT CTAPTAPGAA GATCTPATCA TTATTACCPT 44 8
CCTGACGTCG TTGTCGCTTA TCAAGTAGGT CGTCCAAPCT ACTGPGCANA AAATCTANAA 550
TATAATTTGA SAP.TPCSGT.P APAGCCAAGA CTTAPAPPAA CTTTGCCAAA PNAATPPAGG 660
ACTAAAGTAT TTTCTTTCGT CATGTCTTTA TTGTTAPTTA CAGAAAAPPP TAAAPPGGAT 666
AACNCATAAG TNCTTAGTAA ATGATTPATT APACATAPTA ACTTPNCTAT CPAAATAPTP 772
TGACCSGTCA TAATAACTCA CACCTATAAC TTTAACACTT TGGAAGGCTA AAGTTGGCAA 778
ATCACCTAAA GGCAAAGTTC AAGACCAGCC TAAGTAATAT AGGAAPATGT NAAATNTAGA 884
APPAPCANAA APATTASGGG GGGACATTGA TGGACACCTA TASTTCTAGG TACTTATTAA 900
112
185 549
GTTTATTTGG TAGTAACTAT TTATCTCAGG AGTAGAAGNC AGCAG 945 (2) INFORMACJA O SEK NR ID:11:
(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 540 par zasad (B) AYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:11:
TTGTAGCTTT CCTTTATATT AGTAATACTA GTTTCTATTC CCCAGTAACG AT/TTTCTGTAT 60
TATTATTCAA ATAGCATTGA CATTTAACTG ATATTTNTAT AGATGTTCTG TGTGATTTTA 110
ANATGCAAAT GTTGTTTTTT TTATTTTTAC TAGTTTTTTT GCCATTTATT TCATATTCAT 110
TTAACTTTTN NNTGTTTAAA AATAGAGAAA AATTATTTAA CTTTTTTCCT TCGTTTATTC 240
TTTTTTATTT CCCATT'^^ AGTATAGCGC ACACATTTCA GTAGAGGGCG TTTATGTTTT 330
TCATTCNCAA GATTCAGTGG TTGTTTTGTT TCTGATTGGT CCACTTCGTA TGCTGGTTGT( 336)
TATAGTTCAT TATATAAATG ATACGCTTTT TTTTGTTTTC ATTTACTCCT GTTAGGATTT 442
GGAGAAAGAA ATTGTATTTG TAATTAGNGT AGAATTTATC AG/JAT ΑΓΆ/Γ 440
GTATTTGAAA A^AN^NAC TTGTTTTTTC TTAAATGANT GGIATCCCTGG ACTCCTGNAG 544
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 509 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_featuoe (B) LOKALIZACJA: 1..509 (D) INNE INFORMACJE;: /uwaga= 0Ex00 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:12:
CTTTGTTNTT G^^TACTTTG ΐσΑστ^Α^ GΓTTACCTTG 9ATCCNGTCT TTCCCCAiCAG 66
TAATTATGGT TTGGTTGGTG AACATTGCAG AAGGTGG.TCC CGTATTTTTA AGCTTTC3TAT 112
TCAATTTTTC TAAGTTTATT GCAGAAAGTA GGGAACCTYY CTTATTTTAN ATCTTGATTT rn
TNTAGGGTTA CTTTAATAAG CTAACAGTAT ATTΛAGTGTT CTACTTGTCT CCTCKKGNCT 224
TAGACTCTTN KGTGTATCTC TTGAGAACTA TTTTAATTTT CTTGAATCAT CCTCTTTACT 330
TTTTATTGAG TNCATATTTT cyτττJcc<ττG CCCTTACTGGT GCATTTTTCT ATGTTAATTC 336
185 549
113
AMCNCCCATC AACTACAGAG TACCAGCATG CAAACCCC0A GGCTGAGGGTT 420
τrGlGTrrrl GCNNNGTCTC TTATAAGTCA tgattccaaa (ΑΚΑΤΑΤΑ-ΑΤ (AACCTCTCTC 4I 0
CAAACACGTA (ΑΑΚΑΑΚΑ TCTCCTAAA 509
(2) INFORMACJA O EEK NR lD:13:
(i) CiARAK’CERY.E'CYKA EEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1092 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) LOKALIZACJA: 0..0092 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= IExIl” (xi) OPIE EEKWENCJI: EEK NR 10:13:
CTCCAGACAA GNCAACACTC AGGGGTAGGAA GGGlAAlGOT TATTTTTTCC TTTCCGTCTCT 60
0TCAAAGAGT CACAAAAATC TTCCCAGCGAA tccccccha CGTCGCCGCA CCACACACAG 200
GTT0ATAC0A ACCTACAACC CCAC0AACCTT AGAGCTTTTG T^CA^dAC^CA^G GCTTGGTGGG 800
ArrACClrGc rrllcττGlc TTGGTCAGGA ttcaccacca GAGTCATGTG GGAGGGGGTG 4I 0
GGAACCCAAA 0AACCCAGCA TTCTGCCCTC AGGCCAAAAA ACTGAAGACA ACGCTGCAAC 300
AAACTACCAG CAGGCA0CC0 TACAGCCCAT GCTTTGTGGT T 'IGSĄGG GCCA GCTAGTTACA 360
ATGA0AG0TA lrTACTGTTT CCATGTCAATT ^r^C^r^r^AAA^(^G TATTAAATTT TTCTCAATAT 420
TACACCTGTA AcrrccACττ TCTCTTCGAAG GCACC^ACA^G AGACC’CAC0AY I 80
CCcAcACTCA TCATGA0CCG TTCAGTGKGG AATAAT.GGGG C0ΛGAA;GGAC. ACAGACACAT 1540
GGCCTCATCG 0T0TA0A00T GAGTCACCGAG ΑΤΟΟη:·!· ^AIACA^A^T^C^Cr AGCAGAATAT 600
TCG0TGCTGA AGCCCCAGAG GGSAGGATGT TCANCTTCTCC atntttcaaa GCTαATCAAT 660
εο^ΤΑ^ΤΑ GCTACATTAT CCACCCTTTT <A^(^AT^AAAAI TGAACTTGAGA GCTCTAAAAT 720
CCAATTCTAT ATCACATGTA aactttagtt TGACAAAACA CAIAAΆGCGC TTTTTYNTTT 780
tctttttttc ttctctcctt T^Trd^A IAGAGTCICC CTCCGTCGCC AGATG GGAGA 84 0
GCAACGGTCC GATοττccοτ CCCC’GlAA.cc TCCACCNCCC GAATCCC0CT 900
CCTCAGCCNC 0CAAGCAGNT GCCAA0AAAC TGGCCCTCCA CCACGCCTGG GATACATTTTG 960
GGNrττrrAl CAGAGACGGC GGCTCAACOA CTTGGNGCAG CCTGCTCTTG G.CAACCC0CA 1020
NATCACCAT0 TlCCTGCCTT AGCCTCCCCA AAlCGCCGll ATTN0ACGCC CCAGCCA0TG 108 0
TTCCTmCC TC 0098
(2) INFORMACJA O EEK NR ID:14:
114
185 549 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1003 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWa/kLuĆŻ: misc feature (B) LOKALIZACJA: 5..1003 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 5Ex12 <xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:i0:
CTGCAGTGAG CCGAGATCAT GCTGC-TGTAC ACCACCCTGC GCCACAGACC CAGACTCCAT 60
CTCOAAGAAA AAAAAAATAT TAATTAATAT CATNAAATCA TGCCTATCTC AGAATTCTTG 120
TAAGGATTTC TTAGKACAAC TTGOTGGGAT AAAT1A0AAA TT 5 RATCCAT GNCCAOCATT 18 0
ACTTAYTATT GTTATTGATA AAAAAGAGAC GCACCTACAG GGAA^T^A^A^A^C ccC0'g.atataca: 20 0
ACATAGAATO TCCNAOTOCT ATTGTAGNNAC ACCCCCNMMAG .ΑΑΑ6ΑΑΑΑΑ0Α CCGGCTCGAGGC 300
CTAGTTTTGT ATATCATTTA COTATOTTOT GCA00TA001 ΤΑ56ΤΑΑΑΑΤ GAGT1GAG01 360
ATATTTTTGA ATTGTAAAAT CATAAC.CATA; /'(GLGATGAAO TC 'ltaaattaa TTGTCACCTT 02 0
TCCTTTTTAG GGCAACTAAA ACTTGGATTG GGACAGGGTA CT 500^001 1:50^000: 400
CGTAAAGOCT OAGOAAOACO CAGTGGAGAG TGGZAOCACGA. CCATAGCCTG TTTCGTGCGCC 550
ATATTAATTC TMMST.AT.AC^ CTCAGACGAAAA TGTTGTATAG 1:50000011 C^TACATTGOT 660
ATTACACAGT CCOTTTAACC CAGTTCTGTT TTCGOCCCCAG GTGGGTTCAA. TATTCCAGCT 660
ATCTGAGGAG CTTTTNGATA ATTGGACCTC ACCGCATTAC 1:50000001 TCGT.GACAGA 770
TTAGAATCAC TTGGGAGCTT TTCAAAGCTGT GACGCTCTGCC CTGAGAAGCTT CTTACTCAAT 778
TTAATTGTGT agtttttaaa ATTCCCCAGG AAAGGGTTCT :05100000: ATCGAGAGOO 880
GCCTOAAGCO TAGCAGCACA (ALT AT GA AGG GGATTAGCTC TGTAAGGTTG GTCTTACAGG 900
CATAAAOACA TCCTTCCTTA GTCCCTGGAC TTAAOTCACTG AGAGTTTGGG TGGTGGTTTT 966
CGATTTAATG ACACAACCTG TAGCAT0AAG 50:0010001 5ΑΤ 1100
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 736 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (O) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) LOKALIZACJA: 5..734
185 549
115 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= 1Ex13 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:15:
GTCTTTCCCA TCTTCTCTTT AGGGTTTGTG CCTTACATTA TTACTCCTTG CCATTTTCCc9 60
GATCTCTTTG CCTGCTTTTT Ο^^Τ^Αΐ CACCTTTGGG CTTGTTTTCT JACATTGCCJAC 129
ATATTTTCTT GTTCATTCTT TTATGGACCA ATTAGCATTC TATTATTTTT' ATATCTAGCA 180
TATTTGTGGT TTTTATCCTA TGGATGTTTC TTCTTTGACT ATATCATACT CTGGGGAGGA 249
CTATTGTGTT TTTCTTTTTC CACATC,TΆCC (ATCT<TTCGAT CTTTGTCTTG ACttttggag 300
GTTTCTTCTT ATTCTTCCTG ACCACCTTGC ACTATTG(TCC TTTTTAAGTA GGTGCCTATA 360
GTTATTTTTT TTTTACATAC TTCATCGCAG TGfTCCTGTGT TTTTGGTTTA 420
GTTTTTAGGT ATGAGGTCAA GGAGATATGA TAGGCCCGGA ATTTTCTGTG CCCCATCAGC 48 0
TTCTTGACGT GTGTTCACTT GACGATTTTC ACTGACCACTG CGTACTTTCT 5-40
TATCAAGAGT TTATTCG.TTT TGGTTTAAAC CTTCTCGGTCTC TCTTCATCTT JAGTCTACACG 600
TTGAAATTTA ACCCAATAAT TCTCTATTATA CT(TTCΓTCTG ATCTTTTCAG GAGGTACTGT 660
TTTTAATTTT AGGTATTTTT AGCAGTCAΓGG GGTTCΓGGAGA TGTTTTCTGT GGTTCCAGCT 720
TTCCTTTGTT TTTTTG 736
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1964 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA:
(ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: mśsc_feature (B) LOKALIZACJA: 1..1964 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= mPSL (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:16:
ACTANTCANT GTTAGTTTTT GCTGTTTTTT TGGCTTTTTT CCTTCCTTCT GGGTGCGGAT 66
AGATAAGGAA TTATCATTAT ACTTCATCCT TTTTAGTTCT TTAGTTATCT TGGATTTTAT 129
CACTTGTTAT ATTGTATTTC TAGTTTTTTT TTTTTCTTTT ATAAGGTTTT TCTGTTCAGT 189
TGCTCCA ATG ACA GAG ATA CCT GCA CCT TTG TCC TAC TTC CAG TAT GCC 22 9
Met Thr Glu Ile Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala
10
227
CAG ATG TCT GAG GAC AGC CAC TCC TTT AGC GCC ATC CGG AGC CAG TTT
116
185 549
Gin 15 Mrt Ser Glu Asp Ser 20 His Ser Ser See AA a 22 Ile Arg Ser Gln Ans 33
GAC AGC CTCA (Gll CGG CAG CAG CAG CAT GAC AGG AAC AGA ACT GAC AAC 325
Asp Sut Gln Glu Arg Gln CGn Gln His Asp Arg GGn Ar- Leu Ans Ans
35 40 44
CCG GAG CCA ATA TCT ΆΛΤ GGG CGG CCC CAG AGT GAC A CA AGA GAG GGA 373
Pro Glu Pro He Ser Asn Gly Arg Pro Gln See Ans Aer Arg GGu W i
50 55 40
CTC GGA CTCA GAT GAG GAG G/ll GAC CGlA GAG CTG ACA AGT ATA GAC GGA 421
VGl Alu Gln Asp GAL u Glu Gln Asp Glu Glu Llu ΑΤγ Leu Lys Tyr GU.
Ó5 70 75
GCC aac CAC GTC ATC ATG CTC TTT GTC CCC GCA ACCC ICC TGC ATG GUT 4 00
Tli Lrs His; Wl He Met Leu Phe Val Pro WG TG^ Oee ICs Met Wi
80 85 00
CTC GGC GTG GCC ACC ATC AAA TCA GTC AGC TTA Ad ACC! CCC GAG GAG 517
Vil Vil Wl tlLa Thr Ile Lys Ser Val Ser Phh Oyr ATh Al — Ays Ans>
05 100 H5 111
GGT CAG CTA mrc TAC ACC CCA TTC ACA GCAC GAG ATC AAG ACT GGA AGC 545
Gly Gln Leu II u Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Ans OTh AGu ACh Wi GGu
115 120 112
caa AGA GCC CTG CAC TCG ATC CTG AT\T GCG GUC ACT AGG AGG AGC AGG 613
Gln Arg Al Si Leu Hśi Ser Ile Leu Asn Ala AAu IIu AeU IIu Oee Wi
130 113 140
ATT CTC ATT ATG ACC ATC CTC CTG GGG GTC CCA ATC AAA ATC ATA ATG 641
Ile Val I1i Met Thr IIe Llu Leu Val Wl Llu Oyr Ays Tyr Aa— ACs
145 HO 155
TAC AAG AGC ATC CAC GCC TGG CTT ATT ATT T CA TCT CTG TTG TTG CTG 700
Tyr Lys Val Ile; H ls Ala LA rp Leu I le I le S er Ser Leu Leu Leu Leu
140 114 110
GGC TTG TTG TCG TTC ATT TAC TTA GGG GIGA GTGT TTT AAG ACC TAC AGAT 7^7
Phe Phe Phr Ser P hn I 1«; Ty ja Leu G I/ G lu Val Płne Lys Thr Tyr Asn
175 180 85 I 110
GGC CCC GTG GACA TAC GTG1 ACA GTGT GCA CTC CTA ATC TGG AGAT TGT GGG 885
Val Tli Val Asp Tyr Val The TIoJL Ala L ee L eu Hit Trp Asn PLie GUy
105 220 220
GTG GTC GAG AAG ATT GCC ATC CAC TGG GITA GGA CCC CCT CCAl CCG CAG 8813
Val VaU Gly Met: t Ii MAń^ I Ii M Os T rj L yu Gl/ Ane Leu Arg Leu GGn
210 221 220
CAG GCG TlT CTC ΜΑ aat AGAT CGA AAC COC ATG GCC CCG GTA AGT ATG 901
Gln Tli Tye Leu u Ii M ot t Ii U as TAn l AL uit M1u Oee W i PPh IIu
225 223 223
AAC TAC CTC CCC CIA, TAC Aon CIA tac GAC dC CTG ACC AAC ATT ICC 944
Lys Tyr Leu Prn oin u ot p At TAc l OT p OL u Ai Llu Ili WL. IIu Aer
250 225 220
CTT GlT gag TTT GAG! COC GAC G AA tat GAC ΛΑΑ CGG ICC, ICC ICC AAG 900
VaU Tyr Asp Lee eoa lii Goa Uou uac s on o ou sun One Oee Al— AeU
255 2^Qi 265 220
CGG GGG GUI ACA GCT CAG CTA AGA ATT GAG ACT CTC TTT CCA <^<^T CCG
1040
185 549
117
Luu VgA Glu Thr Ala 205 CAn CAu Arg Asn GAi ocn 2o5 Chr Lui Phu Pro AAg 285 Lui
AAC tac TCC TCCG ACA ATG CTG TGG CTG GCC AAT ATG CCC GATT GGA GAC 1093
lAu Tyr Ser Ser 290 Thr Met VgA Trp Lei 958 VgA Asn Met TAa Glu 330 Gly Asp
CGA GAT GCC CAA AGG AGG GTT CCC TAG TAG CCC TTTG TAT AAC ACA CCAT ll-ei
Pro Glu Ala 305 Gln Arg Arg Val Pro 310 Lys Asn Pro Lys Tyr 315 Asn Thr Gln
ACA GCC GAG .^«AT GAG a r-<7\ atGa GAC GAC ACT GGC TCT GGG AAG GAT GAT GGT 1188
Arg Ala 320 Glu Arg Glu Thr GAn 325 Asp rur CAy Ser Gly 330 Asn Asp Asp Gly
GGC TTC AGT <ATC GAG TGG GAG GCC CAA AGA GAC AGT CAG CTG GGG CCT 1237
CAy 335 Phe Ser Gl u Glu Trp 340 CAu Al a Gln Arg Asp 33 5 Se uc His Leu Gly Pro 350
TAA TGC TCC ACT CCC GAG CTA AGA GCT GTT GCC CAG CAA CCT TCT GGG 1185
His Arg Ser: Thr Pro 355 CCiii rug Arg AAg AAg 360 Val GAe'. Cli Leu Srr 365 Gly
AGC ATT CTA ACG AGT GATT GAC CCC? GAG GAA AGA GAA. CTA TTAG CCT GCAT 1133
rur llu Leu Thr 300 Ser Glu Asp Pro Glu 37T Glu Arg GSy Val Lys 330 Leu Gly
CTG GGA GAT ttc ATT TTC TAG AGT GTC CTC GCC GGC TTGC GAC TCA GCA 1181
Luu Gly Asp 385 PPs Ile Phe Tyr Srr 330 VgA Lui Val GSy Lys 395 ATl Srr Ala
ACC GCC AGT? (AGAT TAGC TGG AAC ACA ACC ATA GCC TAC CCC GTA GCC ATA 115:9
Thr Ala 500 Ser CAy Asp Trp Asn 505 Thr Chc llu ATl ces 451 Phu ViG Ala Ile
TTG AAC GGC CCG TGC CCT ACA TTA CTC CTG CCC GCC ATT TTC TATA TAAG 115!'
Luu 515 llu Gly Leu Ces Leu 452 Thr Leu Luu Lei Leu 452 AGe Ilu FP.h Lys Lys 453
GGC TAG CCA GGC CTC CCC ACC TCC AAC ACC TCC TGG CTC GGG ACC TAC 1155
Ala Leu Pro Tle Leu 535 Ppa llu Seu lAu Chr 440 PPh AA; Lei ViG TPh 445 Ter
TTC ACC AC TC SAG TCT ATT GTC CAT CTT TCC AGG TAG TCAG CTT AGG. TCC 1153
Phu AAg Thr At; 550 Acr Teu VaA GSn Pgo 555 Phu Meu Arp Gln Leu 466 ATl TPh
GAT CAG TTT TAT ATC CAGCTTCCCC GATGTTAGAA TATGGATGTT TCTTCTTTCAT 1628
His Gln Phu Tyr lAe
565
TCITTllAAT TCGlCCTlGT GAGAGCTGTGC C(^(AGG<^AC(^A GACTGGTTGTC TTTCCTGTGT 16 88
TGTTAGCTAl CACCGGCCGG ACTCCAGCTG GACTTCTGCA GCTTCCTTCC GAGTCTCCCT 104 8
IGGClGGGGC 1CC1GTGA1C TGTGGAAGCAC AGCGTCTACA AATASTTCGGT TTCCGTTCATC 1808
CATTGCTGCl GTAClCCGTC TCCCTCAGTG ACTTGAGAGA TTAAGAGCGGG GAATTGTGCT 18 68
GGGTCTAGCl CCCCCCCTGC TCTGCTAGCT TTGACCGTGG GCATAGAGAT TTACCCGCAC 1^2 8
tccgaacctt TTAAGGTAAA CAAACTGACC TGAACC
1164
118
185 549 (2) :-IeoOR.AsC7\ V GSK GR 8I:11:
(L) CTASAKTERYSTYiKS SEkKJEGCJI:
(S) DŁUGOŚĆ: 467 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowi (D) TOPOLOGIA: Ilslowi (LL) TYP CZĄSTECZKI: białko (xL) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:17:
Mst 1 Thr Glu Ile Pro 5 Ala Pro Leu Ser Tyr 10 Phe Gin Asn se_a Gin 15 Mst
Ser Glu Asp Ser Hii Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gin Asn /Cp Ser
Ó0 25 33
TLs Glu Arg GLs Gin Gin Hi: Asp Asg Gin Arg Leu Asp Ass Pso Glu
35 40 45
Pro Ile Ses Asn Gly Arg Pr: Gin Ses Asn Ses Asg Gin VaA VaA Glu
50 55 60
GLs Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Th: Leu Lys Tys Gly lla Lys
65 T7 75 80
His Vil Ile Met Leu Phh Vil Pro Val Th: Leu Cys Met Val Val Val
85 90 99
ViA Cli Thr Ha Lls Ser Val Ses Phe Tyr TVo Asg Lys Asp Giy Gin
100 110) rn
Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr GGu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gin Asg
115 no 115
Ali Leu His Ser Ils.: Leu Asn ASa GSLa Ile Met Ile Ser Val Ile Val
130 113 110
Ile Met Thr Ile Leu Leu Val VaA Leu Tyr Lys Tyr Arg Cy: Tyr Lys
145 1150 155 1150
VaA Ile His Ala Top Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Plse Phe
165 170 115
Phe Ses Phe Ile Ty: Leu Gly Glu VaA Phe Lys Thr Tyr Asn Val GCa
180 185 119
Vil Asp Tys VaG Th: Val Ala Le: Lu: Ile Top Asn PPv Giy Val Wl
195 208 220
Gly Met Ils Ala 11: Hi: Trp Ls: Gly Pro Leu Arg Les GGe GGe Tle
210 220
Tyr Leu Ile Met; IIe Ses GSLa Leu Met ASa Ges Val Phe ile Lys TCr
225 220 235 224
Leu Pro GAu Trp Thr Ala Trp Leu IIe Les TCa Tal IAs Ser ViA Tpr
245 225 225
Asp Lee VaA Ala Val Lee Cys Ppo Lys GAy Pro Leu Arg Met Les Wl
400 2^65 227
Glu Thr /Ca Cli Clu Arg Asn Glu Thr Lee Phe Ppo VSa Ces 8Ia Cpr
275 280 228
185 549
119
Sur SSr 200 Thr Ket Val Trp Leu 295 Val Asn Met PUL a (Aa 300 Aly Asp Pro G(l
Ala Gln Arg Arg VaP l po Vys As L P ro Lys Tyr A sn Thr Gln Atp TULa
305 310 315 332
TLu APP PAu Thr GLn Asp Ser Gly Ser Gly Asn Asp Asp ALv GUy PTe
325 330 335
Sup GTu Gln Trp Glu PLa TAg Al g Asp Sur His Leu Gly Pro His Arg
340 345 350
Ser TTt Pro GL u Ser Pig Ala Ala Val Gln TLu Leu Srr GLy Sei Ili;
355 360 365
Lru TCt Ser Glu Asp Pro TUl.n Alu Aig Gly Val Lys Lru Gly Leu Gly
370 375 380
Asp Phe T Ie The Tyr Ser VaL Lru Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr APu
385 390 395 440
Sup Gly A aa Cip Asn Thr Thr ILe ALa Cys Phe Val Ala Ile lru IUe
405 441 415
TLy Llu Cys Leu Thr Leu leu leu leu AUa ILe PTu Lys Lys Ala Llu
420 425 430
Pro AAl Leu Lru I1p o er Ilu ThS PTe Ily Lep Vt1 TUr Tyl uhe AIa
435 440 445
Thl aaa Tyr Tri Val u Tu Vro Phs P Tt Ai o Gln Ltu VVi PhA P ps Al lp
450 455 460
Phr Ayi Ile 465 (2) INFORMACJA O SEK NR ID:18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2220 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (G) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 400..1715 (ix) GECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_fualuiu (B) LOKALIZACJA: 1..2226 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= TPA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:18:
GAPTTTAGCA TAATGTGATC TCCACCAGTC CATAPSTAAG CTTT1'GGAGC
TGAPAAAAGG TAAAAGAAAP GCTAGTCCCC CGATCT(GΑΛΊΤ' TTACCTATAA AGAAACTGAG
GCNAGPGAGG TAPASTTACT TTTCCCTAPPT ((CNAGAA^(ACA AAAPNGCAAA ACAATAAAGA
120
180
120
185 549
CCTCACCAGT. CTCATCTCAC TTTTCTTTTT CATCATAGAA ACTCACTTCT TATTTACCTC 24 0
CGTTTTTCTT TTTGTAATTT AGCGAGCATC TTTCTTTTAG CCTGCTGTCA ACTACTTTCC 3300
ATTTGTTCTT CATTTTAGAT CTCTCTGTTG TTTTATTTTT TTGTTTTTCT TTCTGAGGCA 300
GCGCT TTG CTC ACA TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAT TAC GTG TGT 977
Ket Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys
10
GAT Asp 15 GTC Glu CGG Arg TCT Thr TCC Ser CTA Leu 20 ATG Met TCG Ser GCC Ala GAG Glu AGC Svo 25 CCC ACG Pro Thr C TC r 9ρ TCC TCC 455
A 9g S eS 30
TCC CAG GAG GGC AGG CAG GGC CCT GAG GAT GGA GAG AAT ACT GCC CAC( 503
Cys Gln Glu Gly Aog Gln Gly Pro Glu Asp GUy GUu Asn n tir OdA G 9gl
35 44 45
TCC ACT AGC CAG GTG AAC GAG GAG GAC GGT GAG GAG GAG CCT TAC CGC 551
Trp Arg Ser GUn Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu GUu Asa p 9h o 9 a A 9(
50 55 60
TAT GTC TGT AGT CCG GTT CCC GGG CGG CCG CCT GGC CTC? CΛC gag ΟΛΤ 5399
Tyr Val Cys Ser Gly VaU Pro Gly Arg Pro Pro GUy LeL u 9g G9T u Ig
65 70 T5
CCG ACC CTC AAA TAC GGA GCG ATG CAT GTG ATC ATG CTC C 9? ATC C CT 647
Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His VaU Ile Met LeL P 9ρ Vd U CP
80 85 90
GTC ACT CAG TGC ATG ATC GAG GTG GTA GCC ACC ATC AAC C CT CTC TCC 695
Val Thr Leu Cys Met Ile Val VaU VlU .Ala Thr Ile Lys S 9S Od Arn
95 100 105 110
TTC TAC ACA GAG ACG AAT GGA CAG CTC ATC TAC ACG CCC TC T CCT (9/ 7 43
Phe Tyr Tho GUu Lys Asn Gly Gln Leu Ile Tyr Tho Prr Ρ9ρ ^τ O CG
115 112 115
GAC ACT CCC TCG GTG GGC CAG CGC CTC CTC TAC TCC GTG CTC τκ CTC 771
Asp Thr Pro Ser VaU Gly Gln Arg Leu Leu Asn Ser Val A 9 C nd
130 113 110
CTC ATC ATG ATC AGC GTC ACC GGT GTT ATG ACC ATC TTC TTG GTG GTG 883
Leu Ile Met IUe Ser ViU Ile Val Val Met Thr IIa ΡΡτ Leu Val Vd
145 115 115
CTC TAC AAC TAC CGC TGC TAC AAT TTC ATC CCT GGC TGG TTG ATC ATG 88 8
Leu Tsr Lys Tyr Aog Cys Tyr Lys Phe Has Ηίβ GT- 9Άο Leu Ile MMe
160 116 117
TCT TCA CAG ATG CTG CAG TTC CTC TTC ACC AG^C CΆC CTT GGG GGA 993
Ser Ser Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe TAr 9? s 9Ie Irs Leu Gly GTu
175 rn 118 119
GTC CTC AAG ACC TAC AAT GTG GCC ATG GAG '9TA TCC AAC CTC TTG CCT 998
Val Leu Lys Tho Tyr Asn Val Ala Met Aap 9^s 9ρο TCh L^u Leu Llv
195 200 205
ACT GTC TGG 9 TAC TTC GGG GCT GTG GGC ATT CTA GTT ΛTT CGA( TGG ATT 1039
Tho Val Top . Asn Phe Gly TUa Val GGy Met 9al ^s de IHs Trp Lys
210 215 220
GGC CCT CCG GTG CTG CAG CAG TCC TAC CCC ATC TTG ATC TGT GCG CTC
107 9
185 549
121
Gly Pro Leu Val Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Ilu Met Ilu Sur Ala Luu
225 230 235
ATG GOC CTA GTG TTC ACC AAG TAC CCC CCA GAG TGG TCC GCG TGG GTC 1125
Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro (Au Trp SSr 50. a Trp Val
200 245 250
ATC CTG GGC GCC ATC TCC GTG TAT GAC OTO GTG GCT GTG CTG TGT CCC 1175
Ile Leu Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Luu Val Ala Val Llu Cys Pro
045 265 265 220
AAA GGG COO CTG AGA ATG CTG GTA GCAG ACC GCC CAG GAG AGA AAT GAG η o o o
Lys Gly P ro 5eu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala (Gin Glu Arg Asn Glu
275 80 5 855
CCC ATA TTT 5CT GCC CCT ATA TAC TCA TCC GCC ATG CTG TGG ACC GTT 12271
Pro Ile P Ph 5ro Ala Luu Ile Tyr S^r Ser Ala Met Val Trp Cho Val
230 295 330
GGC ATG GCG CGGG CTG TAC CCC TCC CCT CAG GGT GCC CTC CAG CCC CCC 1310
Gly Met Ala Lls Leu Asp Pro Ser Ser Gln Gll/ Ala Llu Gln Llu Pro
305 330 315
TAC CAC CCG GAG ATG GAA GCAG GAC CCC CAC GAC AGT TTT GGG GAG CCT 1367
Tyr Asp Pro (Au Met Alu Glu Asp Seo Tyr Aop S'U PPh Gly G1u Pro
320 335 330
TCA TAC CCC GCAG GGC TTC GAG CCC COC CTG ACT GGC TAC CCA GGG GAG 1415
Ser Tyr Pro Glu Va^JL Phu Glu Pro Pro Leu TTh Gll/ 5cr 5ro Gll Ηι
035 300 345 646
GAG CTG GAG GCAG GAC GAC GCAG AGG TCC TTT CAA CCT GGG COC GTG GAC 146 3
Glu Leu Glu Gll G1u Glu Glu Arg Gly Val Ly/r Llu Gly 5lu Gll Aop
355 60 5 655
TTC ATC TTC TAC AGT GCG CTG GGC TGC AAC GTO 510 GTO ACG 511 AGC l^^l
Phe Ile Phe T'r 5su Val Llu Vaa Gly Lys A Aa 5ν(^^ AAl 50^ Ηι 5su
370 337 338
CGC AAC TGG 511 AGC ACC CCG GTC CTC TTC GGT 510 510 5OC ATT GTG 1159
Gly Asp Tio? Acn 50 h Tho Llu CA u Cys Phe Vv! AAa 5Il 5lu Hu 5Gl
385 330 395
TTG TGT CCG ACC 5CC CTC CCT 500 GCC GTG TCT 5AG 5A1 500 500 HC^
Leu Cys Llu TCh 5lu Leu Llu 5lu Ala Val PPh 5Lr 5Lr 5Αι 5lu 5ro
000 400 401
CCC CTC ccc: ACT 500 50(0 ACG 510 GGG CTC ACT 5ΤΤ 500 5CC 500 500 l^^Jj
Ala Leu Pro Hu 5SU Ile TTh PPh Gly Leu IIl 5Ph 5'/ 5su GTe
015 020 402 403
GAC AAC CCT 510 5OC CCG TCC 510 50(0 ACC CCT 510 500 501 501 500 1170
Asp Asn Llu Val 5αο Pro PPh AAe Asp Thr Llu 5Αι 5su 5Hi 5iGu 5lu
035
445
455
TAC ATC TGA GCGAOATAAT CTGCCAOAGC CTGCAAGOTG OACGGAATTT Tyr Ile *
1752
TCATTTCATG 0AGTTCTATA gttttacact CCAGGGCCAT ACCACoitac^Ag TACTCTCCTT 1812
CCOTTAAAAA ATAAAGTACG TGTTTACTTG GTGAGGAGGA 5 G TC\GTAA CO TCTOCTTGGT 4182.
CCOAGOTGTC TCACCAOOAG ACTTTGGCTC CCOAOTTGGT GA1GOTCCCO 0CT0ACCCA0
122
185 549
ACCAACΟACA CΟACCCCCAT ΟίΟΧΑΤίΑΊΑίΑ TGAdAAGGTC AAATTAGGGT GCGCAGAACA 1992
^ΑΤΟ^^Α CCACGCCCGA GATGCCC0CAA GAGTGTGCTC GGGAACTGCC αοη^τε:· 2052
CGGCGCCCCC GCCCGACACC .GAAAGCC/OGG TCCCTACGAG GAACTGTCCΟ TACGCTCCCT 2:12
εοΑΠτη·: ΟΑΠ^ΑΤΑ· TATTNCCYTT TANAAACTGAi TCCCTNTTNT NTTDΟCCΟAC 2:72
TCA.CMCTNCT CCGRACTGGC ττϊττταοταα NATC0AATTACA NAAGNCAGGT CTNTCAG 2229
(2) INFORMACJA O EEK NR ID:19:
(i) CHARAKTERYETYKA EEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 459 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) CYP CZECTCCZKI I białko (ci) OPIE SEKWENCJI: SEK NR ID:i::
Mec 1 Leu Tho Phu Mit 5 Ala Eur Asp Eeo GLu 10 Glu GUu Val Cys Asp 15 GLu
Arg Thr Eer Leu Met Euo Ala Glu Eer Pro Chh hro Arg Euo Cys GUn
20 25 30
GUu GUy Asg GUn dy Pro Glu Asp GUy Glu Asn Thr TCLa Gin Trp Arg
35 40 4^
Eeo GUn du Asn GUu GUu Asp GGy GLu Glu Asp Pro Asp Aog Tyr Val
50 55 00
Cvs Eer Gly Val Pro Glv Arg Pro Pro GLy Leu Glu Glu Glu Leu Thr
<05 70 7 5 80
Leu Lys Tyr Gly IALa Lys His Val Ile Met Leu Phe Val hro Val Thr
85 90 95
Leu Cys MeU lUe Vl I Vl I Vl I Aa i hh i Ul i yy i lh i Vl I Ar i hii y.r
100 105 110
Tho GUu Les Asn Gly Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp TTr
115 20 0 125
Poo Eer Val Gly dn Arg Leu Luu As n Eer Val Leu Asn Tho Leu 1li
130 135 140
Met lUe Ser Val Ilu Val Val Met Thr Ile Phe Llu VaU VaU Leu Tct
145 110 155 110
Lys Tyr Arg Ccs Tcs Lls Phe Ile Ηϊι dy Trp Luu ILu Met Eer Sei
105 110 175
Leu Met Leu Leu Piie Leu Phe Thr Trr Ile Tyr Leu GLy Glu Val Lei
180 115 190
Lys Tho Tcs Asn VaL AAu Met Asp Tct Ppo ICh Leu Llu Leu Thr Val
195 0 0 I 205
Top Asn Phe GLy AUa Val d. Met Val Cys IAe Ηί! Trp Lys Gly Ppo
802 221 220
185 549
123
Luu 505 VaA Leu Gln Gln Ala 230 Cyr Leu Ile Met Ilu 235 rer Ala Luu Met AAg 560
Lui VaA Phe Ile Lys Tyc Leu Pro GAi Tcp Ser Cna Tcp VgA .An Lui
060 250 2 55
Gly lla Ilu Ua a Val Tyr Anp Leu VaA AAa VaA Leu Cyn Pro Lys Gly
060 2(55 270
Pro Luu Arg Met Leu VgA Glu Thc Ala Gln Glu Acg Asn GAu Poc Aiu
030 280 noc z.uJ
Phe Pro Ala Leu Ile Cyc Ser Siec AAa Met VaA Trp Thr Val Gly Mut
090 595 300
AAg Lyn Leu Asp Pro Ser rur GAn Gly Ala Leu CAn Lei Pro Tyr Asp
305 310 315 300
Pro GAi Met Glu GA u Asp rur Tyr Asp Ser Phe GAy Glu Pro rer Cyc
355 330 333
Oco GAi Val hu. GA u Pro hco Leu Thr Gly Tyr Oco α·. Glu GAu Lui
350 34 5 350
Glu Alu Glu Glu CAu Arg Gly VaA Lys Leu Gly Leu Gly Asp PPh Aie
355 360 3 65
Phe Cyc Ser Val Leu VaU Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser GAy Asp
300 435 380
Trp Ann Thr Thr Leu TALa Tys Phu Val Ala I le Lui Ile Gly Lui Cys
385 390 395 400
Lui Thc Leu Leu Leu Leu lAa 1gL. Phe Lys Lys lAa Leu Pro AAg Leu
505 450 451
Pro lle Ser Ile TCh Phe Gly Leu Lle PPh Tyr Phu Ser Thr Arp Asn
550 455 450
Lui VaA Arg Poo Phe; Met .Asp Thr Leu AT u Ser THs Gln Leu Trr Ile
535 450 455
(2) INFORMACJA 0 SEK NR lD:20:
(i) THlRlKCERYeCYKl rEKWENCJl:
(A) DŁUGOŚĆ: 0015 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (T) RODZAJ NlTl: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ix) CECHY:
(A) NAZWl/KLUCZ: (Dr (B) LOKALIZACJI: 150..0322 (ix) CECHY:
(A) NAZWl/KLUTZ: misc_fuatvru (B) LOKALIZACJA: 0..1015 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga= DmOr
124
185 549 (xL) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID:20:
TCTCTGCGTC GTTGGGSAASC CCAASGCASACT GGGGACCAGC TCCCTTCCTT GGGTGGCCTT 60
CACTAAlTTC CACCASASCC GTASGGCTTG TCAGGGGGAG GCGGCCAGCG GGAGGGAGGC 12 8
GCATGACTGG ACASCTSGG VSG CTT GCT GTC TTG CTC GAG ATC TCG TGG TCG 172
Mst AAi Ali Val Ass Leu GAn Ala Ser Cys Ser
10
TCC Ses GTT Gly CTC Leu GGC VSa 15 TCT Ser GAG Glu GAT Asp GAC Asp TCC Ala 20 AST Asn GTG WA GGT Gly AGC Ses CAG Cls: 25 ATA IIe GCT GGy 220
CCG GCG GAG C GT TTG GAA CGC CCT CCA AGG CGG CCC CTG GTG CCC TAC 268
AAi Ali Glu Aso Leu Glu Arg Pro Pro Arg Asg Gin Gin Gin Asg Css
30 35 40
ACC GCC GGC T GC AGC AAT CAG GAT CSC CCG GAT GCT GCC ATA CTG CTT 316
Ass Tyr Gly S es Ser Ass Gin Asp Tin Pro Asp Ala Ali. CIe Cer da
45 50 555
CTC CCC AAT G GG GTG ATG CGT GAA CCT TGT GGC TCG CGC CCG TGT. CCA· 364
ViA Pso Asn Wl Wl Met Arg GAu Pro Cys Gly Ser Arg Pro Ser Csg
60 65 70 75
CTC ACC GGT GTA G(AS GGC GGC AGT GGT GGT CCG CCC AST. CAG CGA CSG 412
Lsu Thr Gly G Gy Gly Gly Gly Ser GAy GAy Pro Pro TGv Css Gin CMS
80 855 90
GAT GAC GAC GTC GGC GCG CGA CAG CGT GCC CAG CAT GTG ATC CASG TTA C 00
GAu Glu GCa GGe GGy Ces Cls Cpr GGy AAa Gin His Wl Ile Lys Leu
95 108 10 05
TTC GTC CCC G GT TCC CTT TGC CTG CTT GTA GTG GTG GCT CTT AST TAC 550
Ehs Vil Pro Wl Cer Les Cys Met Leu Wl Wl Wl da Ghs IIa Css
110 1115 110
TCC ATC AGC TGT GAC CCC AGC CCG GAT GGC TAT CTC CTC GCT AST GCT 5555
Ses Ile Ses P Pv Cyr Asn Ser Thr Asp Vv1 Tyr Li u Leu Tys TGv : oo
102 113 113
GGC CCT G.AS CAA TCG CCC CAG CCT AST GTG TASG TTC TGG AGT GCT GGG 604
Phs His Glu Gin G er G ro Clu G ro : er VaA Lir Phh Gto Ser da Geu
140 114 H5 115
GTT ACC TCC CTG ATC CTG ACG AAT GTG GTG GGG CGT CTG ACC GGT GGG 652
Ali Ass Ser L en I le Leu M et S er Wl Wl Wl Wl CeS CGv :pv Geu
505 116 117
CTG ATG GGG GTG TAC CCG CCG CGT TGC TAC CTG CCT CCT CAC GGC TGG 770
Leu Ile Va 8 Au c Tpr Cls Gis CCrg Cys Tpr Vss CIe CIa His Gly T rp
522 180 118
TGT AGG CTC Leu 190 T CCT S es T CC S er TT TC P ho ATG M et TTG L eu 119 TTG L eu TTC PPv ACG IIe CGG GPv CCT CGv 220 CAS Cpr GGA Cer GGl Cpr 748
Leu Ile
GTT GAA GAG CTT ctc· CGC GCC TAT AAC ASG CTT ACG GAC GAC GCC CSC 7 96
Isu Glu 205 Glu Lgu Lgu Arg AGa 050 T yr Acn SIe Pro CmS 012 Tsτ C pr G po Glch
185 549
125
TTA ALa 220 CTA leu CTT lru ATT Ilr ATS Mrl CTG AAG CCT PTu AGA Gly TCT VaL TCC VaL 220 GTA Aly ACG Mul ACG Mrl TCC Ser ACT Ilu 235 84C
Trp 225 Asp
GAC TGG CAT TTA CCC GTG CGG TAT CAT GAP GGA CAT GCT ATC TCT TCT 892
His Trp Gln Aly Pro 240 leu Arg leu Alg Tln 224 Aly Tyr leu ILu Phr 250 Val
GTA TNG TTG ATG GCC TTG GTG TTC ATT CAPA TAC CTG CCT GAPA TGG ACT 94C
Ala Ala Leu Met 255 CA a Leu Val Phe Ile 260 Lis Tyr Llu Pno Glu 226 Trp Thr
TTC TGG GCT GTA TTG GCT GCC ATT TCT ΑΡΤ TCG GAP CTT ATT GCT GTC 98 C
AUa Trp Ala 270 Vv1 Llu TPLa TALa Ile A?; Ser He Tcp Asp Llu 2281 IIu TPLa Val
CTT AGT CCA AGA GGA GCG GCG CAG ATT CCT TCA AAA ACG GCT AAA GAT 1036
leu Sur 285 Pro Arg Tly Pro lru 290 Arg Ile Lru Val Glu 205 Thr Ala Alp TLu
CGA AAT TAT GAP ACC TAG GGC GCT TTG ATT AAC CCA TTC ACT GTG CCC 1084
Arg 300 Asn Glu Tlp Ile Phe 330) Pro Ala Luu Ilu Cyr 331 Ser Ser TTp Val Val 335
TAG GCA CCT TCP PAT ACT GTT AGG CGT CAG GAP TCT CAG GGG ACA GTC 11.32:
Tyr Ala leu VaU Asp 320 Thr VaU Thr Pro Gln 332 Gln Sur TLn ALa Tho 333 Ala
TTG CGC CCG TCT CGT TAC ATC AAG CGG ATC ATA AGC AGG ATG GGG AGG i pac
Sup Ser Ser Pro 005 Sur Sur Ser Asn Sup 330 Thr TTp Thr Tho Arg 334 ALa Chr
APG AAG TCG TCG AGC TTG CCA TAG GTA GGA GTT GGC AGT GTT CAP CGC 1122
GLn Asn Sur 350 Lru AUa Ser Pro GLu 335 AUa ALa ALa Ala Sur 336 Gly Tln Arg
AGA GGT AAC TTC CAP TCC GGA CAA( CAA TCP TGG GAP (AC CGT AGT GTA 112 6
TTo TLy 365 Asn SSr Chs Ppp Arg 337 Glu AAn Tln AAP aaa 375 aaa GT' T^j: Vaa
CCG AGP AGC SAP GGT ATS CGA CTC TCG ATC AAA APA AGG AAT ATA TGG 1132
lru 380 AUa TTp Alu Aly Mul 385 Pro Leu VaU CTr The 330 lys Sup Asn luu Arg 395
GGA AAC AGT AAT GCT TGG AGT CTC ACT TPA AAT TGA TCA ATT AAC TTT 1132
Gly Asn AUa Alu ALa 400 Ala GUy Phe Chi ALg 440 Glu Top Sup Ala Asn 441 Leu
ATC TAA NGT GAG GTT CCT GAG CAG ATT TPA GTC CPA AGC ACA CAG AGC 1142
Ser Glu Arg VaU 415 Ala Arg Arg GUn IUe 442 Glu VaL Gln Sup Tho 442 Gln Ser
TGA PAC GCT CAG CGC TCC AAG GAG ΤΑΤ AGG ACNP TTA ACA GCT CCG GAT 1468
GLy Asn TALa 430 Gln Arg Ssu TAsg Glu 443 Tyr Arg Thr Val Thr 444 Ala Pro Asp
CAG AAT CAC GCG GAT TGG GAA SAP GAA TTC ATT ATA APS GCC TGN CCT 1151
Gln Asn 445 His Pro Asp GLy Gln 445 TLu TLu Arg Aly IUr 445 lys leu TLy leu
GAG GAC TTC AAC CCT TAT AGT GTA CTA TCG AGC AAG GTT TCG ATG TAC 1554
TLy 460 Asp Phe ILe Phe Tyr 446 Ser VaL Leu Val Gly 447 Lys PAa Sur śeo Tyr 475
126
185 549
CCC GUy GAC TAC ACG ACC The 380 ACA Thr ATC Ile GCC ALa ctg Cys TTG Phe 315 Λ TT Val CTG AGa CCC Ile CCC Leu ATT Ile 490 GGA Gly 1612
Asp Tro Tho
CTC TCC CCC ACT CTT CTC CTT CTG GCC ATT TTG CCC AAG GCG CTA CCC 1660
Leu Cys Llv Thr '..eu Leu Leu Leu Ala Ile Tro Arg Lys Ala Leu Pro
495 500 505
GCC CAG CCC ATC tcgt ATA ACG TTC GGA TTG ATA GTT TGC TTC GCC ACT 110 8
TUl Leu Pro Ile Se^ lle Tho Phe Gly Leu Ha ρρ^ Cys Phe Ala TTr
510 515 520
TGT GCC GCT GTC- (ATT CCC TTC ATG GAG GAT C.TA tac; GCC 8GGG CAG GTG 1156
Ser Ali Val Val Lpc Pro Phe Met Glu Asp Lee Psu GCLa Lys GTn vai
525 530 535
TTT ATA TTTTCTTGTA ATGATACCCA CTCATCATGT GTTTTACAGT ATCATAGTCT 1182
Phe IUv
540
TTCCTAGCTT rTTGTATTTT ATTTCTTTAT rTACTCATAT GCATAGTATT TTGCTCCACT 1187
AATTACTTTA TTTATATTAC AAT 1189
(2) INFORMACJA O SEK NR lD:21:
(i) GiARTKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 541 aminokwasów
(B) TYP: aminokwasowi
(D) TOPOLOGIA: liniowi
(ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
(ii) OPIS SEKWENCJI: SEK NR lD:21:
Met Ala AUa Vil Asn Leu Gln AUa Ser Cys Ser Ser Gly Leu Ali Ser
1 5 10 11
Glu Anp Asp Ale Asn Val Gly Ser Gln Ile Gly Ali AUa Glu Arg Leu
20 25 30
Glu Ano Pro Pro Oo n OSc g COs G1g STu Teg Asn Acn Cpr Gly Srs Gas
35 40 4 4
Asn Gln Asp Gln Ooc Asp Ala Ali IVc Lut Ala Val Pro Asn Val Vnl
50 55 60
Met Arg GluPro Cys Gly Ser Arg Pro Ser Arg Leu Thr Gly Gly GTu
65 70 75 88
Gly Gly SerGly Gly Pro Pro Tho Asn GTu Mele Glu GUu Glu Cln GT-
85 99 99
Leu Les Tyr Gly Ala GTn His VaU Ilu Lys Leu Plae Val Pro Vil Ssv
100 H0 m
Leu CCs Met Leu ^alVc 1 Vil A1v UCu Tho Ase ecr GSs SeS Olu Ser
115 110 115
Asn Svo Thr Asp Val Tyr Leu Leu Tyr Thr Pro ΡΡτ His Glu Gln Ssv
098 113 114
Pro GUu Pro Ser Vil Lys PPh Top Ser Tli Leu AGa Asn Ser Leu Ili
185 549
127
40O HO 115
Ltu Mrt Ser Wl Wl 145 Wl Vil Met Thr Phh 170 Leu Leu Ile Wl Leu 117
Lys Lys Arg Cys Tyr Arg Ile Ile His Gly Grp Leu Ile Leu Ssu
180 185 110
Phe Met Leu Leu Phe Ile Phe Thr Ty— Leu Tyr Leu GAu GAeu Leu
400 22)0 205
leg Ala Tyr Asn Ile Ppo Met Asp Tyr Pro Thr Alta Leu Leu IJ^e
210 15 I 200
Grp Asn Phe Gly Val Wl Gly ttet Met Set IIe His Trp Gln Gly
225 230 223
Leu Arg Leu Gln Gln Gly Ty— Leu Ile Phh Aeil Ala Ala Leu Met
245 250 2255
Ltu Vil Phe Ile Lyo Tyr Leu Pro Glu Grp Thr Ali Trp Ala Wl
240 245 2271
Ali Ali net Ser He Tr— Asp Llu Ilr Ala Wl Llu Ser Ppt Arg
275 228 285
Pro Leu Arg Hi Leu Val nu o hh o Ala Gln Glu A^ Aso Glu Gln
200 05 I 000
Phr Peo TAL a Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Wi Wi Tyr Ala Leu Wl
305 331 331
Thr Vil Thr Pro Gln GGn Ser Gln Cli TTh Ilu Se— Ser Ser Pro
325 330 333
Srr See Asn Se— Ghr Ghr Thr The Arg Ala The Gin Asn Ser Geu
340 34 5 335
Srr Pro (Atu Ala Ali Ali Olu Aer Gly GGn Ang OTh GGy Ann Aer
355 330 365
Pro Arg Gln Ans Gin Arg Asp Apo Gly Ser Vil Leu Ali The Glu
370 75 I 300
Mrt n—o Leu vai Ohy —hh Lys eteo Asn Leu Arg Gly Asn Ala Guu
385 390 330
Ala Gly Phe TCh Alu nUu T—p Seo Ala Asn Leu Se— Glo Arg Val
405 441 4125
Arg leg Gln Ile Glu Wl Gln Ser Thr GGn Se— Gly Asn lii Gln
420 442 430
See Asn GGu Ty — Arg TTh AVi ACh Ala Ppt Ans AUn Ans Aśi Apt
435 4M 445
Gly Gln Glu Glu unizg Gly He Lyo Leu GGn Lru Gly Asp Phh He
450 455 460
Ty— Se— Val L ll AaV euy Lys Ala Ser Ser Tyr Gly Asp Trp Thr
445 447 447
Thr Ile Ala C Cs Ihn Mai AAli Ile Leu Ile GGu· Leu Cys Leu Ghr
485 440 440
140
Tyr
Ser
Leu
Atet
Peo
240
Ali
Leu
Gly
Ile
Asn 32 0
See
AAli
His
Gly
Ala 4 00
Tlta
Arg
Asp
Phh
TTr
448
Lue
128
185 549
Luu Lei Leu Ala 500 lie Trp Arg Lyn Ala 505 Leu Pco AGa Leu Pro 510 He Ser
Ilu Chc Phe Gly Leu Ile Phe Crs Phe Ala Chc Uat TALa Val Val Lys
515 OO0 020
Oco Phe Mut GAi Anp Luu Seu AGa Lys Cin Val PPh Ile
530 553 555) (5) INFORMACJI O SEK NR Il:25:
(i) Charakterystyka Sekwencji:
(A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasad (B) CYO: kwap nukleinowy (C) RODZlJ NlTl: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OOlS SEKWENCJI: SEK NR lD:00:
CCNGTNAlRA GGlGNCYGTG G (5) INFORMACJA OSEK NR lD:03:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 pac zasad (B) TYP: kwap nukleinowy (C) RODZAJ NITl: pojedyncza (D) TOPOLOGII: liniowa (xi) OOlS SEKWENCJI: SEK NR lD:23:
RTTNGTDAAN CCNCTRCCTC l (5) INFORMACJA OSEK NR lD:25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwan nukleinowy (C) RODZAJ NlTl: pojedyncza (D) TOPOLOGII: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR lD:25:
CCCTTCGCCC IGACNCCNCl RGARAGTlTY Cl (5) INFORMACJI O SEK NR lD:55:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 29 pac zasad (B) TYP: kwan nukleinowy (G) RODZlJ NITl: pojedyncza (D) TOPOLOGII: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR lD:55:
CrCTTCAGlT GCTlRTADlC RllRTGNCC
185 549
FIG.2
185 549 hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl hPSl mPSl
MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHLSNTVRSQNDNRERQEHNDRRSLGHPE
III lllllllllllllll I I lilii III II I II
MTEIPAPLSYFQNAQMSEDSHSSSAIRSQNDSQERQQQHDRQRLDNPE
ELSNGRPQGNSRQWEQDEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVW i min mmmmmmmmmmmmm
PISNGRPOSNSROWEODEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVW
VATIKSVSFYTRKDGQLIYTPPTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVIV
III 111111111 III Ul 11 III Ul 111111111 III 111II! 1111
VATIKSVSFYTRKDGOŁIYTPFTEDTETVGORALHSILNAAIMISVIV
VMTILLWLYKYRCYKVIHAWLIIS SLLLLFFFS FIYLGEVFKTYNVA iii mmliii im mmmm iiiiiiiiiiiim iii
IMTILLWLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVA
VDYITVALLIWNFGWGMISIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKY iii mmmmm mmmmmimmmm
VDYVTVALLIWNFGWGMIAIHWKGPLRLOOAYLIMISALMALVFIKY
LPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIY
1111111111II11111111II1111111111II11111 ll 11111II
LPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPK.GPLRMLVETAOERNETLFPALIY
SSTMVWLVNMAEGDPEAQRRVSKNSKYNAESTERESQDTVAENDDGGF
IIIIIIIIIIIIIIIIIIII1 II III III II llllll
SSTMVWLVNMAEGDPEAQRRVPKNPKYNTQRAERETQDSGSGNDDGGF
S EEWEAQRDSHLGPHRSTPES RAAVQELS S SILAGEDPEERGVKLGLG
III! Ili 1111 III 111 III III 111111 III 111111111111 i
SEEWEAQRDSHLGPHRSTPESRAAVQELSGSILTSEDPEERGVKLGLG
DFIFYSVLVGKASATASGDViNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKAL
1111 III II III IIII1111 II III 1111 llll lllllll III lilii
D FIFYSVLVGKASATASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKAL
PALP IS ITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYI
III III 1111 III 11 III 111 III III III III
PALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYI
144
144
192
192
240
240
288
288
336
336
384
384
432
432
467
457
FIG. 3
185 549 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2 hPSl hPS2
--------------------MT-ELPAPLSYFQNA-QMSEDNHLSNTV 2 6
I I I I I lll ii
MLTFMASDSEEEVCDERTSLMSAESPTPRSC-QEGRQGPEDGE- -NTA 4 5
- -RSQ-N- -DNRERQEHNDRR- -SLGHPEPLSNGRPQGNSRQWEODE 6 7 lll I I I I II iii iii i i
QWRSQENEEDG- E - -EDPDRYVCS-GVP-----GRPPGL-----E 76
EEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMWWATIKSVSFYTRKDGQLIY 115 lllllllllllllllllllllll lllllllll lll I lilii
---EELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMIVWATIKSVRFYTEKNGOLIY 121
TPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVI\AZMTILLWLYKYRCYKVIH 163 lllllll HII I I II lllllllllll lllllllllll II
TPFTEDTPSVGORLLNSVIJOTLIMISVIVVMTIFLWLYKYRCYKFIH 16 9
AWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAVDYITVALLX-WNFGWGM 210 lll lll iii i llllll llllll II I II HII III
GWLIMSSLMLŁFLFTYIYLGEVLKTYNVAMDYPTL-ŁLTVWNFGAVGM 216
ISI HWKGPLRLQQAYLIMIS ALMALVFIKYLPEWTAWLIL - AVIS VYD 257 lllllll 111II11111111II111111111 II II I lilii
VCIHWKGPLVLOOAYLIMISALMALVFIKYŁPEWSAWVILGA-ISVYD 2 6 3
LVAVLCPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIYSSTMVWLVNMAEGDPEA 3 05
11111111111111111111111 mmii iii i ii ii
LVAVLCPKGPLRMLVETAOERNEPIFPALIYSSAMVWTVGMAKLDP-- 309
QRRVSKNSKYNAESTERESQDTVAENDDGGFSE-EWEAQRDSHLG-PH 3 51
II I I lllllll
----S--S0GAL-------QLPY DP----EME-EDSYDSF-GEP- 334
RSTPESRAAVQE--LSSSILAGEDP---EERGVKLGLGDFIFYSVLVG 3 94 iii iii u mimmmmim
- SYPE----VFEPPLTGYP - - GEELEEEEERGYKLGLGDFIFYS VLVG 3 7 5
KASATASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFG 44 2
LIFYFSTDNLVRPFMDTLASHQLYI 448
FIG. 4
185 549
FIG. 5
185 549
FIG. 6
185 549
ΓΊ ο
— Σ
C1 χiswisł i J3 (Ν c_ Λί Ο «> Ό ο&2
Cl — -? ΓΜ £2 κ» ·4> *“ /*ι
ffl 3 $ «ο κι £ O ~ j caraQ^2 ci- V
ca -x 5 — m S£ O.~ J rS fc S £ o-c, -j
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko, wybrane z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    2. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, który koduje prawidłową prezenilinę-1 i którego sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 SEK. NR ID: 2;
  2. (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 17;
  3. (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybrydyzowania z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, który koduje zmutow;inąprezen.ilmę-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się z M146L, H163R, A246E, L286V, i C410Y; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezemliny-1 z SEK. NR ID: 17;
    (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybIydyo)wania z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    4. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEK. NR ID:1
    5. Wyizolowany polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC nr 97124 i kodujący ludzką prezenilinę-1.
    6. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, kodującą co najmniej jedną funkcjonalną domenę prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    7. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 6, w którym domena funkcjonalna odpowiada domenie wybranej z grupy składającej się z domen prezeniliny-1: N-końcowej, TM1, TM1—2, TM2, TM2-»3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6—»7, TM7 oraz domeny C-końcowej.
    8. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 8,. w którym sekwencja koduje determinantę antygenową prezeniliny-1, odpowiadającą determinancie antygenowej prezeniliny-1, wybranej z grupy obejmującej reszty aminokwasów 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111,
    185 549
    120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223, 220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
    10. Sposób identyfikowania wariantów allelicznych lub odmiennych gatunkowo homologów ludzkiego genu prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    wybrania sondy kwasu nukleinowego lub startera, zdolnego do hybrydyzowania. z sekwencją ludzkiego genu prezeniliny o SEK. NR ID: 1 w ostrych warunkach hybrydyzacji; zmieszania tej sondy lub startera z próbką kwasów nukleinowych, która może zawierać kwas nukleinowy, odpowiadający temu wariantowi lub homologowi; i wykrywania hybrydyzacji takiej sondy lub startera do kwasu nukleinowego, odpowiadającego temu wariantowi lub homologowi.
    11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że próbka obejmuje kwasy nukleinowe wybrane z grupy składającej się z ludzkiego genomowego DNA, ludzkiego mRNA i ludzkiego cDNA.
    12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że próbka obejmuje kwasy nukleinowe, wybrane z grupy składającej się z genomowego DNA ssaczego lub bezkręgowców-, ssaczego mRNA i ssaczego cDNA.
    13. Sposób identyfikowania wariantów allelicznych lub odmiennych gatunkowo homologów ludzkiego genu prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    wybrania przeciwciała zdolnego do selektywnego wiązania się z ludzką prezeniliną o SEK. NR ID: 2;
    zmieszania tego przeciwciała z próbką białek, która może zawierać białko odpowiadające temu wariantowi lub homologowi;
    wykrywania wiązania się takiego przeciwciała z białkiem odpowiadającym temu wariantowi lub homologowi.
    14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że próbka obejmuje białka wybrane z grupy składającej się z białek ludzkich, ludzkich fizji białkowych oraz ich proteolitycznych fragmentów.
    15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że próbka obejmuje białka wybrane z grupy składającej się z białek ssaczych lub z białek bezkręgowców, ssaczych fuzji białkowych oraz ich proteolitycznych fragmentów.
    16. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający wariant alleliczny lub odmienny gatunkowo homolog ludzkiego genu prezeniliny.
    17. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor z włączoną izolowaną sekwencją nukleotydową kodującą białko wybrane z grupy obejmującej prawidłowe białko prez.eniliny-1 i zmutowane białko prezeniliny-1.
    18. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 17, znamienny tym, że włączona sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mysiej prezeniliny o SEK. NR ID: 17; i.
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybrydyzowaaia z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    19. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 17, znamienny tym, że stanowi rekombinowany wektor obejmujący izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą zmutowane białko prezeniliny-1, przy czym sekwencja nukleotydowa koduje przynajmniej jedną mutację, odpowiadającą mutacji SEK. NR ID: 2 wybraną z grupy obejmującej M146L, H163R, A246E, L286V i C410Y; i sekwencja nukleotydową odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej:
    a) sekwencję wodującą biabco obejmujbee sekwencję aminokw-asow'·a.ludzaiej pzezenilrny o SEK. NR ID: 2;
    185 549
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mysiej prezeniliny o SEK. NR ID: 17; i
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybrydjyrnwanła z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    20. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący rekombinowany wektor obejmujący przynajmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 1.
    21. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący rekombinowany wektor obejmujący polinukleotyd stanowiący depozyt ATCC nr 97124, kodujący ludzką prezenilinę-1.
    22. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową, kodującą przynajmniej jedną domenę funkcjonalną białka prezeniliny1, wybranej z grupy obejmującej prawidłową prezenilinę-1 i zmutowaną białko prezenilinę-1.
    23. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 22, znamienny tym, że domena funkcjonalna białka prezeniliny, wybrana jest z grupy obejmującej domeny prezeniliny: N-końcową, TM1, TMl->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6-»7, TM7 oraz domenę C-końcową.
    24. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową białka prezeniliny, wybranej z grupy obejmującej prawidłową prezenilinę-1 i zmutowaną prezenilinę-1.
    25. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że kodująca determinanta antygenowa białka prezeniliny-1, wybrana jest z grupy obejmującej reszty aminokwasowe 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223,220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
    26. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 17, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym, a sekwencja nukleotydowa prezeniliny jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    27. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 26, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, który może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    28. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 20, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, a sekwencja nukleotydowa prezeniliny jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    ’ 29. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, który może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    30. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 21, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, a sekwencja nukleotydowa prezeniliny jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    31. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 30, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, który może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    32. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 22, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, a sekwencja nukleotydowa prezeniliny jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    33. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 32, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, który może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    34. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, a sekwencja nukleotydowa prezeniliny jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    35. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 34, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny, który może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    36. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydowa kodującą białko wybrane z grupy obejmującej prawidłowe białko prezeniliny-1 i zmutowane białko prezeniliny-1.
    37. Komórka według zastrz. 36, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    185 549
    38. Komórka według zastrz. 37, znamienna tym, że wektor ekspresyjny koduje co najmniej domenę funkcjonalną prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    39. Komórka gospodarza według zastrz. 36 transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydowa wybraną z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mysiej prezeniliny o SEK.. NR ID: 17; i
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybryd yzo wania z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    40. Komórka gospodarza według zastrz. 36 transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą zmutowane białko prezeniliny-1, przy czym sekwencja nukleotydowa koduje przynajmniej jedną mutację, odpowiadającą mutacji SEK. NR ID: 2 wybranąz grupy obejmującej M146L, H163R, A246e, L286V i C410Y; i sekwencja nukleotydowa odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mysiej prezeniliny o SEK. NR ID: 17; i
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybrydyzowanin z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    41. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym przynajmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. Nr ID: 1.
    42. Komórka według zastrz. 41, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    43. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym polinukleotyd stanowiący depozyt ATCC nr 97124, kodujący ludzką prezenilinę-L
    44. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    45. Komórka według zastrz. 43, znamienna tym, że wektor ekspresyjny koduje co najmmej domenę funkcjonalną prezeniliny, wybranej z grupy składającej się zprezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    46. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydowa kodującą przynajmniej jedną domenę funkcjonalną białka prezeniimy, wybraną z grupy obejmującej domeny prezeniliny: N-końcową, TM1, TM1—2, TM2, TM2—3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5-»6, TM6, TM6->7, TM7 oraz domenę C-końcową.
    47. Komórka według zastrz. 46, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezeeulinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    48. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową białka prezeniliny, wybranej z grupy obejmującej prawidłową prezenilinę-1 i zmutowaną prezenilinę-1.
    49. Komórka według zastrz. 48, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    50. Komórka według zastrz. 49, znamienna tym, że wektor ekspresyjny może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    51. Komórka gospodarza według zastrz. 48, znamienna tym, że jest transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową białka prezeniliny-1, wybraną z grupy obejmującej reszty aminokwasowe 27-44,
    185 549
    46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223, 220-230,
    240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
    52. Modelowe zwierzę, z wyłączeniem człowieka, dla choroby Alzheimera, gdzie genom takiego zwierzęcia lub jego przodka został zmodyfikowany przy zastosowaniu co najmniej jednego zrekombinowanego konstruktu, który wprowadził modyfikację, wybraną z grupy składającej się z (1) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, prawidłowego genu prezeniliny, (2) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, zmutowanego genu prezeniliny, (3) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną pochodzącego z tego samego gatunku homologu zmutowanego, odmiennego gatunkowo genu prezeniliny, i (4) inakfćwacji endogennego genu prezeniliny.
    53. Zwierzę według zastrz. 52, znamienne tym, że modyfikacja jest wstawieniem sekwencji nukleotydowej, kodującej co najmniej domenę funkcjonalną prawidłowego lub zmutowanego ludzkiego genu prenizeliny-1.
    54. Sposób wytwarzania co najmniej domeny funkcjonalnej prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą białko wybrane z grupy obejmującej prawidłowe białko prezenilin.y-1 i zmutowane białko prez.eniliny-1, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    56. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że wektor ekspresyjny może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    57. Sposób według zastrz. 54, znamienna tym, że wektor ekspresyjny koduje co najmniej domenę funkcjonalną prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    58. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mvsiej prezeniliny o SEK. NR ID: 17; i '
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybrydyzowania z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    59. Sposób wytwarzania według zastrz. 54, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą zmutowane białko prezeniliny-1, przy czym sekwencja nukleotydowa koduje przynajmniej jedną mutację, odpowiadającą mutacji SEK. NR ID: 2 wybraną z grupy obejmującej M146L, H163R, A246E, L286V i C410Y; i sekwencja nukleotydowa odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową. ludzkiej prezeniliny o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową mysiej prezeniliny o SEK. NR ID: 17; i
    c) sekwencję kodującą białko prawidłowej prezeniliny-1 i zdolną do hybrydyzowwnła z sekwencją komplementarną do dowolnej sekwencji z a)-b) w surowych warunkach hybrydyzacji, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    185 549
    60. Sposób wytwarzania co najmniej domeny funkcjonalnej prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym przynajmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 1, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    62. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że wektor ekspresyjny może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    63. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że wektor ekspresyjny koduje co najmniej domenę funkcjonalną prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    64. Sposób wytwarzania co najmniej domeny funkcjonalnej prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym polinukleotyd stanowiący depozyt ATCC nr 97124, kodujący ludzką prezenilinę-1, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    66. Sposób według zastrz. 65, znamienny tym, że wektor ekspresyjny może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    67. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że wektor ekspresyjny koduje co najmniej domenę funkcjonalna prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    68. Sposób według zastrz. 67, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jedną domenę funkcjonalną białka prezeniliny, wybraną z grupy obejmującej domeny prezeniliny-1: N-końcową, TM1, TM1—»2, TM2, TM2——3, TM3, TM3-»4, TM4, TM4——5, TM5, TM5—»6, TM6, TM6-»7, TM7 oraz domenę C-końcową, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    69. Sposób wytwarzania co najmniej domeny funkcjonalnej prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową białka prezeniliny, wybranej z grupy obejmującej prawidłowe białko prezeniliny-1 i zmutowane białko prezeniliny-1, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    70. Sposób według zastrz. 69, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca prezenilinę jest połączona w sposób funkcjonalny z regionem regulatorowym.
    71. Sposób według zastrz. 69, znamienny tym, że wektor ekspresyjny może wyrażać sekwencję prezeniliny w komórkach ssaczych.
    72. Sposób wytwarzania według zastrz. 69, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową białka prezeniliny-1, wybraną z grupy obejmującej reszty aminokwasowe 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126, 155-160, 185-189, 214-223, 220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2, w odpowiednich warunkach dla wytwarzania prezeniliny poprzez ekspresję wymienionego kwasu nukleinowego.
    73. Zasadniczo czyste białko, wybrane z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    74. Zasadniczo czyste białko według zastrz. 73, znamienne tym, że stanowi prawidłową prezenilinę-1 wybraną z grupy składającej się z (1) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
    (2) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17. 75. Zasadniczo czysty preparat białka określonego w zastrz. 73, znamienny tym, że takie białko obejmuje zmutowaną prezenili8
    185 549 nę-1, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się zM146L, H163R, A246E, L286V iC410Y; przy czym takie białko poza tym odpowiada sekwencji aminokwasowej, wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17;
    76. Zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych reszt aminokwasowych z SEK. NR ID: 2 lub SEK. NR ID: 17.
    77. Zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zawierającego co najmniej jedną funkcjonalną domenę prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1.
    78. Zasadniczo czysty preparat polipeptydu zawierającego determinantę antygenową prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-1.
    79. Zasadniczo czysty preparat według zastrz. 78, znamienny tym, że polipeptyd zawiera determinantę antygenową prezeniliny-1 wybraną z grupy składającej się z reszt aminokwasowych 27-44, 46-48, 50-60, 66-67, 107-111, 120-121, 125-126,155-160, 185-189, 214-223, 220-230, 240-245, 267-269, 273-282, 300-370 i 400-420 z SEK. NR ID: 2.
    80. Sposób wytwarzania przeciwciał, które selektywnie wiążą się z prezeniliną, znamienny tym, że obejmuje etapy podawania zwierzęciu immunogennie skutecznej ilości immunogenu prezeniliny; umożliwienia takiemu zwierzęciu wytworzenia przeciwciał przeciw temu immunogenowi, oraz otrzymania takich przeciwciał z takiego zwierzęcia lub z hodowli komórek pochodzących od niego.
    81. Zasadniczo czysty preparat przeciwciała, które selektywnie wiąże się z determinantą antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezenEmy1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    82. Zasadniczo czysty preparat przeciwciała według zastrz. 81, znamienny tym, że takie przeciwciało wiąże się selektywnie z determinantą antygenową zmutowanej prezeniliny1 i nie wiąże się z prawidłową prezeniliną-1.
    83. Linia komórkowa, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało, które selektywnie wiąże się z prezeniliną..
    84. Linia komórkowa, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało, które selektywnie wiąże się z determinantą antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-1 i zmutowanej prezeniliny-1.
    85. Linia komórkowa, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało, które wiąże się selektywnie z determinantą antygenową zmutowanej prezeniliny-1 i nie wiąże się z prawidłową prezeniliną-1.
    86. Sposób identyfikowania związków, które mogą modulować ekspresję genu prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    doprowadzenia do kontaktu komórki z testowanym kandydatem, przy czym taka komórka zawiera region regulatorowy genu prezeniliny połączony w sposób funkcjonalny z regionem kodującym, i wykrywania zmian w ekspresji takiego regionu-kodującego, przy czym zmiana ekspresji wskazuje, że badany kandydat moduluje ekspresję genu prezeniliny.
    87. Sposób identyfikowania związków, które mogą selektywnie wiązać się z prezeniliną, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    dostarczenia preparatu zawierającego co najmniej jeden składnik typu prezeniliny; doprowadzenia do kontaktu takiego preparatu z próbką zawierającą co najmniej jeden związek kandydat; i wykrywania wiązania takiego składnika typu prezeniliny ze związkiem kandydatem metodą wybraną z grupy obejmującej:
    chromatografię powinowactwa, koimmunoprecypitację, test oddziaływań biomolekulamych (Biomolecular Interaction Assay) oraz drożdżowy układ dwuhybrydowy.
    88. Sposób identyfikowania związków, które mogą modulować aktywność prezeniliny, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    185 549 dostarczenia komórki wyrażającej gen prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny; doprowadzenia do kontaktu takiej komórki z co najmniej jednym związkiem kandydatem; i wykrywania zmiany w aktywności markera, przy czym pomiar takiego markera wskazuje na różnicę pomiędzy komórkami niosącymi podlegający ekspresji zmutowany gen prezeniliny, a komórkami pod innymi względami identycznymi, ale nie zawierającymi podlegającego ekspresji zmutowanego genu prezeniliny.
    89. Sposób według zastrz. 88, znamienny tym, że komórka jest eksplantowana z gospodarza niosącego co najmniej jeden zmutowany gen prezeniliny.
    90. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że komórka jest komórką człowieka poddawanego testowi klinicznemu.
    91. Sposób określania czy dany osobnik jest narażony na ryzyko wystąpienia wcześnie objawiającej się rodzinnej choroby Alzheimera (AD), znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    (a) uzyskania próbki kwasów nukleinowych od osobnika i (b) przeprowadzania testu z próbką kwasów nukleinowych, w których wykrywa się obecność lub nieobecność mutacji genu prezeniliny-1 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje na ryzyko rozwoju AD.
    92. Sposób według zastrz. 91, znamienny tym, że test jest wybrany z grupy obejmującej bezpośrednie sekwencjonowanie nukleotydów, hybrydyzację ze specyficzną sondą, analizowania fragmentów trawienia enzymem restrykcyjnym, i analizę ruchliwości elektroforetycznej fragmentów·;
    93. Sposób według zastrz. 92, znamienny tym, że próbka kwasu nukleinowego jest próbką RNA, a test jest testem bezpośredniego sekwencjonowania.
    94. Sposób według zastrz. 93, znamienny tym, że test obejmuje etapy:
    (a) odwrotnej transkrypcji próbki RNA i wytworzenia odpowiedniego cDNA;
    (b) przeprowadzania co najmniej jednej łańcuchowej reakcji polimerazy z odpowiednimi starterami oligonukleotydowymi w celu /amplifikowania cDNA prezeniliny-1;
    (c) uzyskania sekwencji nukleotydowej amplifikowanego cDNA prezeniliny-1;
    (d) oznaczenia w tej sekwencji nukleotydowej obecności lub nieobecności mutacji w genie prezeniliny-1, związanej z AD.
    95. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że etap (d) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji polinukleotydu o SEK. NR ID: 1, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A685C; A737G; C986A; Cl 105G i G1478A.
    96. Sposób według zastrz. 91, znamienny tym, że próbka kwasów nukleinowych jest próbką DNA.
    97. Sposób według zastrz. 96, znamienny tym, że próbka DNA jest próbką genomowego DNA a test obejmuje etapy:
    (a) amplifikacji docelowej części sekwencji nukleotydowej genomowego DNA;
    (b) uzyskania sekwencji nukleotydowej tej amplifikowanej docelowej części;
    (c) oznaczenia w sekwencji nukleotydowej tej docelowej części obecności lub nieobecności mutacji w genie prezeliny-1 związanej z AD.
    98. Sposób według zastrz. 97, znamienny tym, że etap (c) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji polinukleotydu o SEK. NR ID: 1, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A685C; A737G; C986A; C1105G i G1478A.
    99. Sposób oznaczania czy osobnik, u którego występują objawy neurodegeneracyjne, jest chory na AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
    (b) przeprowadzenia testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezeniliny-1 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest chory na AD.
    100. Sposób oznaczania czy osobnik jest wolny od AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) od os^to^ini^a próbkk kwastów nukkeinowych;
    185 549 (b) przeprowzOzeoia testo a próbką kwbku w e-elo oznaczeni n obecno obi lub nieobecności mutacji genu prezemlmy-1 związanej z AD, przy czym nieobecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest wolny od Ad.
    101. Sposób oznaczania czy osobnik ma prawidłowe białko prezocilicę-1, czy białko zmutowane związane z AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) otrzymywania od osobnika próbki białka prezeniliny-1, (b) przeprowadzenia z tą próbką białka testu wykrywającego sekwencję aminokwasową prawidłowej lub zmutowanej prezemliny-1 lub wykrywającego prawidłową lub nieprawidłową fenknaę prebonilicy-1.
    102. Sposób według zastrz. 101, znamienny tym, że test jest testem do wykrywania sekwencji amicoewasowoj prawidłowej lub zmutowanej prozoniliny-1, wybranym z grupy obejmującej test immunologiczny, specyficzny test na miejsce enzymu („enzyme site specific assay”), analizę ruchliwości eloktroforotynbcej białka i analizę wzorców cięcia proteolitycznego.
    103. Sposób według zastrz. 102, znamienny tym, że test jest testem wykrywającym co najmniej jedną mutację w sekwencji aminokwasowej SEK NR:2, która jest wybrana z grupy mutacji obejmujących Metl46Leu, Hisl63Arg, Ala246Glu, Leu286Val i Cys410Tyr.
    104. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna -tym, że zawiera zasadniczo czyste białko prezocilinę i farmaceutycznie dopuszczalny cuścik.
    105. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 104, znamienna tym, że białko jest ludzką prezociliną-1.
    106. Zastosowanie wektora ekspresyjnego kudującogu w sposób fuckcjucalcy probocilinę, który może wyrażać taką prezemlinę w organizmie człowieka do wytwarzania leku do leczenia stanów spowodowanych zmutowanym genem prebenilicy.
    107. Zastosowanie wektora ekspresyjnego, kubująceeo w sposób funkcjonalny sekwencję actysocsuwną prezemliny, który może wyrażać taką sekwencję αctysecsow'ną prezeniliny w organizmie człowieka, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia stanów spowodowanych mutacją genu prozeniliny.
    108. Zastosowanie zasadniczo czystego przeciwciała, które selektywnie wiąże się ze zmutowaną prezeniliną, do wytwarzania kompozycj i farmaceutycznej do leczenia stanów spowodowanych mutacją genu prebocilicy.
    109. Zastosowanie według zastrz. 108, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest zasadniczo wolna od przeciwciała, które selektywnie wiąże się z prawidłową prozenilicą.
    110. Zastosowanie białka prezeniliny do wytwarzania leku do leczenia stanów spowodowacynh zmutowanym genem prezeniliny.
    111. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nuklootydową kodującą białko, prawidłową prozecilinς-1 i którego sekwencja cueleotybową jest wybrana z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji amicukwasowej ludzkiej prezo'mliny-1 z SEK. NR ID: 4;
    (2) sekwencji eubującej białko o sekwencji aminoewαsowej z SEK. NR ID: 2, w której reszta aminukwαsuwα 257 jest zamieciuna na alaninę i brakuje reszt αminukwαsuwych 258-290.
    112. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nuklootybową zmutowanej prezecilicy-1, którego sekwencja cukleotybową eobuae co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji z SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy obejmującej A260V, A285V, L392V i którego sekwencja nuklootydową poza tym odpowiada sekwencji cueloutyduwej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji koduaąnej białko o sekwencji amicukwαsuwęj lubbeioj prozecil!cy-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kubuaącea białko o sekwencji amicokwacowęj ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 4;
    (3) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwacowęj mysiej prozeciliny-1 z SEK. NR ID: 17;
    185 549 (4) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
    (5) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybr^y^^^y^oo^wnia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (4) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    113. Wyizolowany polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC Nr 97214, kodujący ludzką prezenil inę-2.
    114. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów, z SEK. NR ID: 3.
    115. Rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 4;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową o SEK. NR ID: 2, w której reszta 257 jest zastąpiona przez alaninę, zaś reszty 258-290 są pominięte.
    116. Rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą zmutowane białko prezeniliny-1, którego sekwencja nukleotydową koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy obejmującej A260V, A285V, L392V i którego sekwencja nukleotydowa odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasorwą ludzkiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 4;
    c) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 17;
    d) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej o SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasową 257 jest zastąpiona przez alaninę i pozbawiona jest reszt aminokwas owych 258-290;
    e) sekwencję kodującą prawidłową prezenilinę-1 i zdolną do hybrydyzowaaia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (4) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    117. Rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową stanowiącą depozyt ATCC nr 97214 i kodującą ludzką prezeniimę-2.
    118. Rekombinowany wektor obejmujący sekwencję nukleotydową prry^^jimł^ęj 10 kolejnych nukleotydów z sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 3.
    119. Komórka gospodarza transformowana wektorem obejmującym sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej·:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 4;
    b) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową o SEK. NR ID: 2, w której reszta 257 jest zastąpiona przez alaninę, zaś reszty 258-290 są pominięte.
    120. Komórka gospodarza transformowana wektorem obejmującym sekwencję nukleotydową kodującą zmutowane białko prezeniliny-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy obejmującej A260V, A285V, L392V i którego sekwencja nukleotydową odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej’:
    a) sekwencję kodującą białko obejmujące sekwencję aminokwasową ludzkiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 2;
    b) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 4;
    c) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej' mysiej prezeniliny-1 o SEK. NR ID: 17;
    d) sekwencję kodującą białko o sekwencji aminokwasowej o SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasową 257 jest zastąpiona przez akminę i pozbawiona jest reszt aminokwasowych 258-290;
    185 549
    e) sekwencję kodujaca pjaw'idłowąpr(wenilinę-n i zdolnądo nybiwdyzowaniz z sekwencji), komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (4) w surowych warunkach hybrydyzacji.
    121. Komórka gospodarza transformowana wektorem obejmującym sekwencję nukleotydową stanowiącą depozyt ATCC nr 97214 i kodującą ludzką prezenihnę-2.
    122. Komórka gospodarza transformowana wektorem obejmującym sekwencję nukleotydową przynajmniej 10 kolejnych oukieotydów o sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 3.
    123. Zwierzę traosgeniczne z wyłączeniem człowieka, które zawiera polinukleotyd kodujący zmutowaną prezeoilinę, która ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID: 2 ale z substytucją w pozycji 260, 285 i/lub 392 lub ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID: 4 ale z substytucją w pozycji 146, 163, 246, 260, 285, 392 i/lub 410.
    124. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezeoilinę-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 4, wybranej z grupy obejmującej M146L, H163R, A246E i C410Y którego sekwencja nukleotydową poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej kodującej białko o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID: 4;
    125. Zasadniczo czyste białko obejmujące prezeoilinę-i wybraną z grupy składającej się z (1) białka o sekwencji ammokwasowej z SEK. NR ID: 4;
    (2) białka o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR DD: 2, w którym reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt ammokwasowych 258-290;
    126. Zasadniczo czyste białko obejmujące zmutowaną prezenilinę-1, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się zM146l, H163R, A246E, A260V, A285V, L392V iC410Y; przy czym takie białko poza tym odpowiada sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID: 4;
    127. Zasadniczo czyste białko obejmujące zmutowaną prezenilinę-i, zawierającą co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacji SEK. NR ID: 2, wybranej z grupy składającej się z A260V, A285V i L392V; przy czym takie białko poza tym odpowiada sekwencji aminokwasowej, wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 17.
    128. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą białko, wybrane z grupy składającej się z prawidłowej prezeoilioy-2 oraz zmutowanej prezeniliny-2.
    129. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 128, który koduje prawidłową prezenilmę-2 i którego sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezenilion-2 z SEK. NR ID: 19; ' (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji ammokwasowej ludzkiej prezeoilion-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezeoilinę-2 i zdolnej do hnbrydynowania z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    130. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 128, który koduje zmutowaną prezeniIinę-2, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej nięzM239ViN14i1; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji nmiookwasowej ludzkiej prezenilmyró z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniiion-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz
    185 549 (3) sekwencji kodująk0prawjdłowąprezenilinę-2 izdobiej dohybrydyy)wznia z sekwzncją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    131. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydowa kodującą zmutowaną prezenilinę-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i N1411; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prez2niliny-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej preze*niliny-1 z SEK. NR ID: 4;
    (3) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 17;
  4. (4) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
  5. (5) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 4, w której reszta aminokwasowa 253 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 254-286;
    oraz (6) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hzbrydyzozvama z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji od (1) - (5) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    132. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 128, który koduje zmutowaną prez2nilinę-2, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom SEK. NR ID: 2, wybranym z grupy składającej się zA79?, V82L,V96F, Y115H, M139T, M139Y, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, F177S, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, Δ291-319, G384A, L392V, C410Y i I439V; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej, wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej pr2O2niliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej pr2Z2niliny-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prez2nilinę-2 i zdolnej do hzbrydyzozwlnia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    133. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 18.
    134. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, kodującą co najmniej jedną funkcjonalną domenę prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prez2niliny-2 i zmutowanej prezejłlimy-1.
    135. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 134, zawierający sekwencję kodującą domenę funkcjonalną prezeniliny-2, odpowiadającą domenie wybranej z grupy składającej się z domen prezerłiliny-2: N-końcowej, TM1, TM1—>2, TM2, TM2->3, TM3, TM'3—>4, TM4, TM4—>5, TM5, TM5—>6, TM6, TM6->7, TM7 oraz domeny C-końcowej.
    136. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 oraz zmutowanej prez2nllinz-2.
    137. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 136, w którym sekwencja koduje determinantę antygenową prezeniliny-2, odpowiadającą determinancie antygenowej prezeniliny-2, wybranej z grupy obejmującej aminokwasy 25-45, 50-63, 70-75, 114-120, 127-132, 162-167, 221-226, 282-290, 310-314, 321-338, 345-352, 380-390 i 430-435 z SEK. NR ID: 19.
    185 549
    138. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko, wybrane z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 oraz zmutowanej prezeniliny-2.
    139. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 138, który koduje prawidłową prezenilinę-2 i którego sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hybrydyymwanła z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    140. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 138, który koduje zmutowaną prezenilinę-2, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i N141I; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hybrydyzowwnia z sekwencją, komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    141. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-1, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i N1411; i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 4;
    (3) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 17;
    (4) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
    (5) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 4, w której reszta aminokwasowa 253 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 254-286; oraz (6) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybr^c^^i^c^o^^a z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji od (1) - (5) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    142. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 138, który koduje zmutowaną prezenilinę-2, którego sekwencja nukleotydowa koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom SEK. NR ID: 2, wybranym z grupy składającej się zA79?, V82L,V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, F177S, G209V, ^^11T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, Δ291-319, G384A, L392Y, C410Y i I439Y; i
    185 549 którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej, wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: '19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hybrydyzowaaia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    143. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor, który zawiera sekwencję nukleotydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 18.
    144. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor, który zawiera sekwencję nukleotydową, kodującą co najmniej jedną funkcjonalną domenę prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 i zmutowanej prezeniliny-1.
    145. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 144, gdzie taka domena funkcjonalna jest domeną funkcjonalną prezeniliny-2, odpowiadającą domenie wybranej z grupy składającej się z domen prezeniliny-2: N-końcowej, TM1, TM1—»2, TM2, TM2——3, TM3, TM3-»4, TM4, TM4——5, TM5, TM5——6, TM6, TM6—»7, Tm7 oraz domeny C-końcowej.
    146. Wyizolowany kwas nukleinowy stanowiący zrekombinowany wektor, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 oraz zmutowanej prezeniliny-2.
    147. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 146, w którym sekwencja koduje determinantę antygenową prezeniliny-2, odpowiadającą determinancie antygenowej prezeniliny-2, wybranej z grupy obejmującej aminokwasy 25-45, 50-63, 70-75, 114-120, 127-132, 162-167, 221-226, 282-290, 310-314, 321-338, 345-352, 380-390 i 430-435 z SEK. NR ID: 19.
    148. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą białko wybrane z grupy obejmującej prawidłowe białko prezeniliny-2 i zmutowane białko prezeniliny-2, lub jej potomstwo.
    149. Komórka według zastrz. 148. znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa koduje prawidłową prezenilinę-2 i jest wybrana z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hybrydyzowaa^ia z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    150. Komórka według zastrz. 148, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca zmutowaną prezenilinę-2, koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i N141I; i sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. Nr ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hyb^c^j^^aaaa z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    151. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-1, która koduje co najmniej jedną mutację, odpowiadającą mutacjom z SEK. NR ID: 19, wybranym z grupy składającej się z M239V i N141I; i poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z:
    185 549 (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 4;
    (3) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 17;
    (4) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID: 2, w której reszta aminokwasowa 257 jest zamieniona na alaninę i brakuje reszt aminokwasowych 258-290;
    (5) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej z SEK. NR ID: 4, w której reszta aminokwasowa 253 jest zamieniona na alaniną i brakuje reszt aminokwasowych 254286; oraz (6) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-1 i zdolnej do hybrydyyowaała z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji od (1) - (5) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    152. Komórka według zastrz. 148, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca zmutowaną preoenilinę-2 koduje co najmniej jedną mutację, która odpowiada mutacjom SEK. NR ID: 2, wybranym z grupy składającej się zA79?, V82L,V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, F177S, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, Δ291-319, G384A, L392V, C410Y i I439V; i poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej, wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową. prezenilinę-2 i zdolnej do hyb^c^^yz^o^wała z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    153. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów sekwencji nukleotydowej o SEK. NR ID: 18.
    154. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej jedną funkcjonalną domenę prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prazenilmy^ i zmutowanej prezeniliny-1.
    155. Komórka według zastrz. 154, znamienna tym, że domena funkcjonalna jest domeną funkcjonalną, prezeniliny-2, odpowiadającą domenie wybranej z grupy składającej się z domen prezenliiny-2: N-końcowej, TM1, TM1—>2, TM2, TM2—»3, TM3, TM3—>4, TM4, TM4—>5, TM5, TM5——6, TM6, TM6—>7, TM7 oraz domeny C-końcowej.
    156. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym obejmującym izolowaną sekwencję nukleotydową kodującą determinantę antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prazenilmy^ oraz zmutowanej prezeniliny-2.
    157. Komórka według zastrz. 156, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa koduje determinantę antygenową prezenliiny-2, odpowiadającą determinancie antygenowej prezenliiny-2, wybranej z grupy obejmującej aminokwasy 25-45, 50-63, 70-75, 114-120, 127-132, 162-167, 221-226, 282-290, 310-314, 321-338, 345-352, 380-390 i 430-435 z SEK. NR ID: 19.
    158. Zwierzę transgeniczme z wyłączeniem człowieka, które zawiera polinukleotyd kodujący zmutowaną ρreoenilimę, która ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK. NR ID: 19 ale z substytucją w pozycji 141 lub 239.
    159. Zasadniczo czysty polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych reszt aminokwasowych z SEK. NR ID: 19.
    160. Zasadniczo czysty preparat przeciwciała, które seletatywłe wiąże się z determinantą antygenową preoeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezenilmy-2 oraz zmutowanej prezeniliny-2.
    185 549
    161. Zasadniczo czysty preparat przeciwciała według zastrz. 160, znamienny tym, że takie przeciwciało wiąże się selektywnie z determinantą antygenową. zmutowanej prezeniliny-2 i nie wiąże się z prawidłową prezeniliną^.
    162. Linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało wiążące się z determinantą antygenową prezeniliny, wybranej z grupy składającej się z prawidłowej prezeniliny-2 oraz zmutowanej prezeniliny^.
    163. Linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało wiążące się z determinantą antygenową zmutowanej prezeniliny-2 i nie wiążące się z prawidłową prezeniliną-2.
    164. Sposób określania czy dany osobnik jest narażony na ryzyko wystąpienia wcześnie objawiającej się rodzinnej choroby Alzheimera (AD), znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    (a) uzyskania próbki kwasów nukleinowych od osobnika i (b) przeprowadzania testu z próbką kwasów nukleinowych, w których wykrywa się obecność lub nieobecność mutacji genu prezeniliny-2 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje na ryzyko rozwoju Ad.
    165. Sposób według zastrz. 164, znamienny tym, że test obejmuje etapy:
    (a) odwrotnej transkrypcji próbki RNA i wytworzenia odpowiedniego cDNA;
    (b) przeprowadzenia co najmniej jednej łańcuchowej reakcji polimerazy z odpowiednimi starterami oligonukleotydowymi w celu zamplifikowania cDNA prezeniliny-2;
    (c) uzyskania sekwencji nukleotydowej amplifikowanego cDNA prezeniliny-2;
    (d) oznaczenia w tej sekwencji nukleotydowej obecności lub nieobecności mutacji w genie prezeniliny-2, związanej z AD.
    166. Sposób według zastrz. 165, znamienny tym, że etap (d) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności mutacji polinukleotydu o SEK. NR ID: 18, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A787T i A1080G.
    167. Sposób według zastrz. 164, znamienny tym, że próbka kwasów nukleinowych jest próbką genomowego DNA a test obejmuje etapy:
    (a) amplifikacji docelowej części sekwencji nukleotydowej genomowego DNA;
    (b) uzyskania sekwencji nukleotydowej tej amplifikowanej docelowej części;
    (c) oznaczenia w sekwencji nukleotydowej tej docelowej części obecności lub nieobecności mutacji związanej z AD w genie prezeniliny-2.
    168. Sposób według zastrz. 167, znamienny tym, że etap (c) obejmuje oznaczenie obecności lub nieobecności polinukleotydu o SEK. NR ID: 18, która to mutacja jest wybrana z grupy obejmującej A787T i Al 080G.
    169. Sposób oznaczania czy osobnik, u którego występują objawy neurodegeneracyjne, jest chory na AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
    (b) przeprowadzania testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezeniliny-2 związanej z AD, przy czym obecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest chory na AD.
    170. Sposób oznaczania czy osobnik jest wolny od AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) uzyskania od osobnika próbki kwasów nukleinowych;
    (b) przeprowadzania testu z próbką kwasu nukleinowego w celu oznaczenia obecności lub nieobecności mutacji genu prezeniliny-2 związanej z AD, przy czym nieobecność tej mutacji wskazuje, że osobnik jest wolny od AD.
    171. Sposób oznaczania czy osobnik ma prawidłowe białko prezenilinę-2, czy białko zmutowane związane z AD, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) otrzymywania od osobnika próbki białka prezeniliny-2 (b) przeprowadzania testu z tą próbką białka wykrywającego sekwencję aminokwas ową prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny-2 lub wykrywającego prawidłową lub nieprawidłową funkcję prezeniliny-2,
    172. Sposób według zastrz. 171, znamienny tym, że test jest testem do wykrywania sekwencji aminokwasowej prawidłowej lub zmutowanej prezeniliny^, jest wybrany z grupy obej18
    185 549 mującej test immunologiczny, specyficzny test na miejsce enzymu („enzyme sile specific assay”), analizę ruchliwości elektroforetycznej białka i analizę wzorców cięcia proteolitycznego.
    173. Sposób według zastrz. 172, znamienny tym, że test jest testem wykrywającym co najmniej jedną mutację w sekwencji aminokwasowej SEK NR: 19, która jest wybrana z grupy mutacji obejmujących M239V i N141I.
    174. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zasadniczo czyste białko pr2zeniiinę-2 i farmaceutycznie' dopuszczalny nośnik.
    175. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny, kodujący w sposób funkcjonalny prezenilinę-2, który może wyrażać taką prezenilinę w organizmie człowieka, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
    176. Modelowe zwierzę, z wyłączeniem człowieka, dla choroby Alzheimera, gdzie genom takiego zwierzęcia lub jego przodka został zmodyfikowany przy zastosowaniu co najmniej jednego zrekombinowanego konstruktu, który wprowadził modyfikację, wybraną z grupy składającej się z (1) wstawienia sekwencji nukleotydzwzch, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, prawidłowego genu prezeniliny, (2) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną odmiennego gatunkowo, zmutowanego genu prezeniliny, (3) wstawienia sekwencji nukleotydowych, kodujących co najmniej domenę funkcjonalną pochodzącego z tego samego gatunku homologu zmutowanego, odmiennego gatunkowo genu prezeniliny, i (4) inaktywacji endogennego genu pr2oenilinz, przy czym wymieniona modyfikacja jest ustawieniem sekwencji nukleotydowej kodującej przynajmniej funkcjronalną domenę zmutowanego ludzkiego genu preo2niimy-2.
    177. Zwierzę według zactro. 176, które jest wybrane z grupy składającej się ze szczurów, myszy, chomików, świnek morskich, królików, psów, kotów, kóz, owiec, świń i naczelnych z wyłączeniem człowieka.
    178. Zwierzę według zastrz. 176, które jest bezkręgowcem.
    179. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą homolog Drosophila melanogaster ludzkiego genu prezenibny.
    180. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 179 obejmujący polinukleotyd zawarty w depozycie ATCC Nr 97428.
    181. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 179, który zawiera sekwencję nukleotydową, wybraną z grupy składającej się z:
    (1) sekwencji kodującej białko zawierające sekwencję aminokwasową DmPS z SEK. NR ID: 21;
    (2) sekwencji kodującej homolog prezeniliny i zdolnej do hybryd)yowama z sekwencją komplementarną do sekwencji (1) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
    182. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nuki2ztydową, złożoną z co najmniej 10 kolejnych nukleotydów, wybranych z grupy składającej się z SEK. NR ID: 21 oraz sekwencji komplementarnej do SEK. NR ID: 21.
    183. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-1, która odpowiada mutacji L171P z SEK. NR ID: 2 i którego sekwencja nukleotydową poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z (1) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-1 z SEK. NR ID: 2;
    (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej mysiej prezemlmy-1 z SEK. NR ID: 17;
    184. Wyio.oizwanz kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą zmutowaną prezenilinę-2, którego sekwencja nukleotydowa koduje mutację I420T SEK. NR ID: 19 i którego sekwencja nukleotydowa poza tym odpowiada sekwencji nukleotydowej, wybranej z grupy składającej się z:
    (1) sekweneji knciującoj biaeko iaskOwonej) emmokwanokej ludekiej ocleenpi202n z SEK NR ID: 19;
    185 549 (2) sekwencji kodującej białko o sekwencji aminokwasowej ludzkiej prezeniliny-2 z SEK. NR ID: 19, w której brakuje reszt 263-296; oraz (3) sekwencji kodującej prawidłową prezenilinę-2 i zdolnej do hybrydyzowania z sekwencją komplementarną do dowolnej z sekwencji (1) - (2) w ostrych warunkach hybrydyzacji.
PL96323109A 1995-04-28 1996-04-29 Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne PL185549B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/431,048 US6531586B1 (en) 1995-04-28 1995-04-28 Genetic sequences related to Alzheimer's Disease
US08/496,841 US6210919B1 (en) 1995-04-28 1995-06-28 Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US50935995A 1995-07-31 1995-07-31
PCT/CA1996/000263 WO1996034099A2 (en) 1995-04-28 1996-04-29 Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323109A1 PL323109A1 (en) 1998-03-16
PL185549B1 true PL185549B1 (pl) 2003-05-30

Family

ID=27411707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323109A PL185549B1 (pl) 1995-04-28 1996-04-29 Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5986054A (pl)
EP (2) EP0826042B1 (pl)
JP (3) JP4504463B2 (pl)
KR (1) KR19990008181A (pl)
AT (1) ATE405645T1 (pl)
AU (1) AU716307B2 (pl)
BR (1) BR9608140A (pl)
CA (1) CA2219214A1 (pl)
CZ (1) CZ339097A3 (pl)
DE (1) DE69637649D1 (pl)
DK (1) DK0826042T3 (pl)
ES (1) ES2314979T3 (pl)
HU (1) HUP9801639A3 (pl)
MX (1) MX9708270A (pl)
NO (1) NO974964L (pl)
NZ (2) NZ335945A (pl)
PL (1) PL185549B1 (pl)
SK (1) SK145397A3 (pl)
WO (1) WO1996034099A2 (pl)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
ATE305039T1 (de) * 1995-07-07 2005-10-15 Darwin Molecular Corp Auf chromosom 1 lokalisiertes gen dessen genprodukt mit der alzheimerschen krankheit assoziiert ist.
WO1997003999A1 (en) * 1995-07-18 1997-02-06 Washington University School Of Medicine Mutant s182 genes
US5985564A (en) * 1995-08-16 1999-11-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for identifying agents that inhibit chromosome non-disjunction
US6248555B1 (en) * 1995-08-31 2001-06-19 The General Hospital Corporation Genetic alterations related to familial alzheimer's disease
WO1997011956A1 (en) * 1995-09-27 1997-04-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York IDENTIFICATION OF sel-12 AND USES THEREOF
ZA968898B (en) * 1995-10-25 1998-03-30 Washington University Of Medic Method for elucidation and detection of polymorphisms, splice variants and proximal coding mutations using intronic sequences of the mutations Alzheimer's S182 gene.
JPH10327897A (ja) * 1996-01-19 1998-12-15 Washington Univ プレセニリン−１遺伝子の配列を用いる疾患の診断および予後診断
JP2000506375A (ja) * 1996-01-26 2000-05-30 エイチエスシー リサーチ アンド デベロップメント リミテッド パートナーシップ アルツハイマー病に関連する核酸およびタンパク質、ならびにその使用
CA2222813A1 (en) * 1996-04-04 1997-10-16 University Of South Florida Variant presenilin-2 genes
WO1997046678A1 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Bayer Corporation Nucleic acids and polypeptides related to presenilin
EP0811695A3 (en) * 1996-06-06 1998-07-29 Washington University Mutant S182(PS-1) genes
EP0814157A3 (en) * 1996-06-18 1998-01-07 Smithkline Beecham Corporation Diagnostic marker for variants of presenilin genes associated with Alzheimers Disease and Familial Adult Onset Alzheimers Disease
JP2000516087A (ja) * 1996-07-05 2000-12-05 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用
CA2273184A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 Brigham And Women's Hospital, Inc. Alarm related peptides and nucleic acids and diagnosis using them
US6121045A (en) * 1997-04-04 2000-09-19 Millennium Biotherapeutics, Inc. Human Delta3 nucleic acid molecules
US6376239B1 (en) * 1997-04-04 2002-04-23 Elegene Gmbh DNA molecules comprising a promoter capable of conferring expression of a heterologous DNA sequence
EP0977776A2 (en) * 1997-04-24 2000-02-09 The General Hospital Corporation A PURIFIED 20 kDa PRESENILIN 2 C-TERMINAL FRAGMENT AND METHODS OF SCREENING FOR COMPOUNDS THAT INHIBIT PROTEOLYSIS OF PRESENILIN 2
EP0981602A4 (en) * 1997-05-14 2003-01-02 Merck & Co Inc TRANSGENIC ANIMAL EXPRESSING NON-NATIVE MUTANT PRESENILIN 1 WILD-LIKE PROTEIN OF FAMILY ALZHEIMER'S DISEASE IN A CONTEXT WITHOUT NATIVE PRESENILIN 1
ES2128265B1 (es) * 1997-06-04 2000-03-01 Euroespes S A Kit genetico para la caracterizacion molecular de la enfermedad de alzheimer.
US7923015B2 (en) * 1997-08-14 2011-04-12 Institut Pasteur Methods for direct visualization of active synapses
US7923216B2 (en) * 1997-08-14 2011-04-12 Institut Pasteur In vivo modulation of neuronal transport
PT1049712E (pt) * 1997-08-14 2007-04-30 Pasteur Institut Proteínas híbridas da toxina do tétano que migram retrogradamente e trans - sinapticamente para o snc
US20100081197A1 (en) * 1997-08-14 2010-04-01 Sylvie Roux In vivo modulation of neuronal transport
US6255473B1 (en) * 1997-08-29 2001-07-03 Duke University Presenilin-1 gene promoter
US6284944B1 (en) * 1997-08-29 2001-09-04 Cephalon, Inc, Gene-targeted non-human mammal with a human fad presenilin mutation and generational offspring
FR2768346B1 (fr) * 1997-09-15 2002-04-19 Fond Jean Dausset Ceph Compose assurant l'inhibition de la preseniline 1 pour la preparation d'un medicament et agent de diagnostic
FR2770217B1 (fr) * 1997-10-24 2001-12-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le precurseur du peptide b-amyloide et/ou le peptide b-amyloide
EP1025121B1 (fr) * 1997-10-24 2011-08-24 Aventis Pharma S.A. Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le peptide beta-amyloide ou son precurseur
KR100646816B1 (ko) * 1998-01-08 2006-11-17 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 유전자 넉인 동물
US6383758B1 (en) 1998-01-09 2002-05-07 The Governing Council Of The University Of Toronto Alzheimer's related proteins and methods of use
EP1849477A1 (en) * 1998-02-25 2007-10-31 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, as represented by THE SECRETARY OF THE ARMY Use of skin penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response induced by ADP-ribosylating exotoxin
EP1078987B1 (en) * 1998-05-21 2009-05-20 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Method for examining central nervous system diseases and method for screening remedies
AR020329A1 (es) * 1998-07-09 2002-05-08 Boehringer Ingelheim Pharma UNA SUSTANCIA, EN PARTICULAR UNA RIBOZIMA, CAPAZ DE INHIBIR LA EXPRESION DE PRESENILINA 2, UNA MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE QUE CODIFICA DICHA RIBOZIMA, UNVECTOR RECOMBINANTE QUE COMPRENDE EL cDNA CORRESPONDIENTE A DICHA RIBOZIMA, UNA CELULA HOSPEDADORA QUE COMPRENDE DICHO VECTOR RECOMBINANTE, UNA C
WO2000004150A1 (en) * 1998-07-16 2000-01-27 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human presenilin-associated protein
US6797480B1 (en) 1998-10-05 2004-09-28 University Of Connecticut Health Center Purification of heat shock/stress protein cell surface receptors and their use as immunotherapeutic agents
US6723557B1 (en) 1999-01-06 2004-04-20 California Institute Of Technology Caenorhabditis elegans LOV-1 gene
US6783982B1 (en) 1999-02-12 2004-08-31 The Governing Council Of The University Of Toronto Proteins related to neuronal regeneration and uses thereof
US6812337B1 (en) * 1999-04-01 2004-11-02 The Governing Council Of The University Of Toronto Presenilin associated membrane protein and uses thereof
US6890726B1 (en) 1999-04-06 2005-05-10 Oklahoma Medical Research Foundation Method for selecting recombinase variants with altered specificity
US6374130B1 (en) * 1999-04-06 2002-04-16 Eric M. Reiman Methods for tracking the progression of Alzheimer's disease identifying treatment using transgenic mice
US20030131364A1 (en) * 1999-04-27 2003-07-10 Karen Duff Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom
AU6265600A (en) * 1999-06-22 2001-01-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Method for detection of early-onset alzheimer's disease
US20020049303A1 (en) * 1999-06-28 2002-04-25 Tang Jordan J. N. Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
ATE482233T1 (de) * 1999-06-28 2010-10-15 Oklahoma Med Res Found Inhibitoren des memapsin 2 und ihre verwendung
FR2798821B1 (fr) * 1999-09-27 2001-10-26 Aventis Pharma Sa Animal transgenique exprimant une forme multi-mutee de la preseniline 1
WO2001052890A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 University Of Connecticut Health Center Heat shock/stress protein complexes as vaccines against neurodegenerative disorders
CA2405332A1 (en) 2000-04-03 2001-10-11 Bristol-Myers Squibb Company Fluorescence assay for gamma-secretase activity and inhibitors
WO2001092576A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-06 Duke University Methods of screening for parkinson's disease
AU2001268328A1 (en) * 2000-06-12 2001-12-24 University Of Maryland Biotechnology Institute Method of controlling the binding of calmyrin to presenilin
US7371920B2 (en) 2000-06-20 2008-05-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic mouse model of neurodegenerative disorders
WO2002002000A2 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Duke University Methods of screening for alzheimer's disease
DE10032709A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-24 Boehringer Ingelheim Pharma Aspartyl-Protease
US6781029B2 (en) 2000-07-13 2004-08-24 University Of South Florida Transgenic animal and methods
JP2002142765A (ja) * 2000-07-14 2002-05-21 Tosoh Corp 新規ゲノム解析法
CA2418087A1 (en) * 2000-08-16 2002-02-21 Markus Fritzsche Use of microbial dna sequences for the identification of human diseases
AU2001287448A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Proteins related to schizophrenia and uses thereof
US6900367B2 (en) * 2000-09-29 2005-05-31 Novartis Transgenic Drosophila melanogaster expressing a β42 in the eye
US6495335B2 (en) * 2000-12-07 2002-12-17 Mario Chojkier Compositions and methods for diagnosing alzheimer's disease
US20040121947A1 (en) * 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
US20030073608A1 (en) * 2001-04-10 2003-04-17 Woolf Nancy J. Process for treating disease
GB2375771A (en) * 2001-05-24 2002-11-27 Univ Leeds Decellularisation of tissue implant material
JP2003012548A (ja) * 2001-06-27 2003-01-15 Japan Science & Technology Corp 医薬組成物
IL160396A0 (en) 2001-08-14 2004-07-25 Sentigen Corp Nucleic acids and proteins of insect or83b odorant receptor genes and uses thereof
WO2003039454A2 (en) * 2001-10-23 2003-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
US20060234944A1 (en) * 2001-10-23 2006-10-19 Oklahoma Medical Reseach Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
US20040002078A1 (en) * 2001-12-05 2004-01-01 Sense Proteomic Limited Arrays
EP1469717A4 (en) * 2001-12-20 2007-08-22 Univ California TRIPLE TRANSGENIC MOUSE MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE
US20040014109A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-22 Pericak-Vance Margaret A. Methods and genes associated with screening assays for age at onset and common neurodegenerative diseases
US20060259990A1 (en) * 2002-07-05 2006-11-16 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostic and therapeutic use of tb2 gene and protein for neurodegenerative diseases
WO2004005534A2 (en) * 2002-07-08 2004-01-15 Duke University Screening for alzheimer's disease
US20040076606A1 (en) * 2002-09-14 2004-04-22 Ming-Shi Chang Methods of modulating inflammation by administration of interleukin-19 and inhibitors of IL-19 binding
US7022481B2 (en) 2002-12-19 2006-04-04 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of using glucan synthase pathway reporter genes to screen for antifungal compounds
US20060246437A1 (en) * 2003-07-11 2006-11-02 Pericak-Vance Margaret A Genetic susceptibility genes for asthma and atopy and asthma-related and atopic-related phenotypes
US20060068428A1 (en) * 2003-11-03 2006-03-30 Duke University Identification of genetic markers associated with parkinson disease
US20050191652A1 (en) * 2003-11-03 2005-09-01 Vance Jeffery M. Identification of genetic forms of a gene that leads to high risk for parkinson disease
WO2005074994A1 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 Xenoport, Inc. Oat3 transporter expressed in blood brain barrier cells
WO2005075684A2 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 Xenoport, Inc. Use of organic anion transporter b in screens for candidate substrates for crossing the blood brain barrier
SE0400707D0 (sv) 2004-03-22 2004-03-22 Bioarctic Neuroscience Ab Transgenic animal model
US7807465B2 (en) * 2004-10-27 2010-10-05 Duke University Methods for identifying an individual at increased risk of developing coronary artery disease
US7790390B2 (en) * 2004-10-27 2010-09-07 Duke University Methods for identifying an individual at increased risk of developing coronary artery disease
WO2006086098A2 (en) * 2005-01-06 2006-08-17 President And Fellows Of Harvard College Mass spectrometric methods and products
US20070092449A1 (en) * 2005-04-05 2007-04-26 Rafael Vazquez-Martinez Methods for direct visualization of active synapses
US20070148661A1 (en) * 2005-07-19 2007-06-28 Duke University LSAMP Gene Associated With Cardiovascular Disease
US7704696B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-27 Xenoport, Inc. Screening of compounds for OCTN2 transporter activity
WO2007016164A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Xenoport, Inc. Cat1 transporters expressed in blood brain barrier cells
US7704695B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-27 Xenoport, Inc. Screening of compounds for BGT1 transporter activity
US7691584B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-06 Xenoport, Inc. Screening of compounds for OCT3 transporter activity
WO2007016159A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Xenoport, Inc. Gat2 transporters expressed in blood brain barrier cells
WO2007021886A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-22 Oklahoma Medical Research Foundation Truncated memapsin 2 for use for treating alzheimer's disease
WO2007086980A2 (en) * 2005-11-10 2007-08-02 Duke University Methods of determining the risk of developing coronary artery disease
ES2409844T3 (es) 2006-01-30 2013-06-28 Grifols Therapeutics Inc. Metodo para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades relacionadas con la deposicion de amiloide utilizando IgM
WO2007092861A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors specific of presenilin-1 and their uses
EP2005174A4 (en) 2006-03-31 2009-04-15 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASES, IN PARTICULAR ALZHEIMER'S DISEASE, AND IMPROVING NORMAL MEMORY
US8129334B2 (en) * 2006-03-31 2012-03-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating neurodegenerative disorders and Alzheimer'S disease and improving normal memory
WO2007124751A2 (en) * 2006-05-01 2007-11-08 Aarhus Universitet An animal model and a method for producing an animal model
US7771741B2 (en) * 2006-05-01 2010-08-10 Warsaw Orthopedic, Inc Demineralized bone matrix devices
WO2008106981A1 (en) * 2007-03-07 2008-09-12 Aarhus Universitet Transgenic pig as a model of alzheimer's disease
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
US9068006B2 (en) 2010-08-25 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Glycated CD59 peptides, their preparation, and uses thereof
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
US20140193341A1 (en) * 2011-01-19 2014-07-10 Asa Abeliovich Human induced neuronal cells
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012178183A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Human age-related neurodegenerative nematode model and methods
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
US20140343129A1 (en) * 2011-12-14 2014-11-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
ES2530141B1 (es) * 2013-08-26 2016-01-15 Juan Carlos GALLAR RUIZ Péptido útil como diana farmacológica para el cribado de moléculas para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer, anticuerpo frente al mismo y uso del anticuerpo para el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad.
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
EP3702470A3 (en) 2015-09-09 2020-10-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
ES2817910T3 (es) * 2017-08-04 2021-04-08 Alzheimur 2012 S L Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer
JP2021525245A (ja) * 2018-05-22 2021-09-24 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． アルツハイマー病のための遺伝子治療
KR102584857B1 (ko) * 2020-09-23 2023-10-06 재단법인대구경북과학기술원 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도
KR20230009140A (ko) * 2021-07-08 2023-01-17 주식회사 엠케이바이오텍 Human mutant Presenilin-1 발현 인지장애 모델 개의 생산

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690893A (en) * 1985-05-03 1987-09-01 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies which specifically bind to mouse interleukin-2
WO1988003951A1 (en) * 1986-11-17 1988-06-02 California Biotechnology, Inc. Recombinant alzheimer's amyloid protein
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5262332A (en) * 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
US5387742A (en) * 1990-06-15 1995-02-07 Scios Nova Inc. Transgenic mice displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
JPH05199896A (ja) * 1990-10-29 1993-08-10 Shinetsu Bio Inc モノクローナル抗体含有試薬
ATE203269T1 (de) 1991-03-15 2001-08-15 Hsc Res Dev Ltd Partnership Genherstellung zur produktion von transgenfisch
US5297562A (en) * 1991-04-01 1994-03-29 President And Fellows Of Harvard College Method for detecting and treating Alzheimer's disease
NZ242955A (en) * 1991-06-13 1995-01-27 Ici Plc Dna containing gene sequences corresponding to sequences causing alzheimers disease, detection, recombinant yeast with such code
IL105793A0 (en) * 1992-05-28 1993-09-22 Lilly Co Eli Protease and related dna compounds
AU4541093A (en) * 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
US5668006A (en) * 1992-07-17 1997-09-16 American Cyanamid Company Somatostatin receptors
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
JP3553592B2 (ja) * 1992-10-26 2004-08-11 ビー． シェンク，デイル 可溶性β−アミロイド・ペプチドの検出のための方法及び組成物
WO1994023049A2 (en) * 1993-04-02 1994-10-13 The Johns Hopkins University The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals
US6210919B1 (en) * 1995-04-28 2001-04-03 Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US6998467B1 (en) * 1995-04-28 2006-02-14 The Hospital For Sick Children Antibody specific for presenilin 1 and method of use thereof
US6531586B1 (en) * 1995-04-28 2003-03-11 The Hospital For Sick Children Genetic sequences related to Alzheimer's Disease
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
ATE305039T1 (de) * 1995-07-07 2005-10-15 Darwin Molecular Corp Auf chromosom 1 lokalisiertes gen dessen genprodukt mit der alzheimerschen krankheit assoziiert ist.
CA2226658A1 (en) * 1995-07-13 1997-01-30 John A. Hardy Early onset alzheimer's disease gene and gene products
WO1997003999A1 (en) * 1995-07-18 1997-02-06 Washington University School Of Medicine Mutant s182 genes
JP2000506375A (ja) * 1996-01-26 2000-05-30 エイチエスシー リサーチ アンド デベロップメント リミテッド パートナーシップ アルツハイマー病に関連する核酸およびタンパク質、ならびにその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP0826042B1 (en) 2008-08-20
US6485911B1 (en) 2002-11-26
DK0826042T3 (da) 2008-11-24
US5840540A (en) 1998-11-24
ATE405645T1 (de) 2008-09-15
US5986054A (en) 1999-11-16
MX9708270A (es) 1998-06-28
NZ305822A (en) 2000-08-25
JP2013107890A (ja) 2013-06-06
EP0826042A2 (en) 1998-03-04
WO1996034099A3 (en) 1996-12-05
DE69637649D1 (de) 2008-10-02
KR19990008181A (ko) 1999-01-25
NO974964L (no) 1997-12-29
NO974964D0 (no) 1997-10-27
AU5394096A (en) 1996-11-18
US7846679B2 (en) 2010-12-07
BR9608140A (pt) 1999-12-07
CA2219214A1 (en) 1996-10-31
HUP9801639A3 (en) 2001-01-29
NZ335945A (en) 2000-09-29
HUP9801639A2 (hu) 1998-10-28
SK145397A3 (en) 1998-09-09
US20050214837A1 (en) 2005-09-29
US20090191650A1 (en) 2009-07-30
WO1996034099A2 (en) 1996-10-31
AU716307B2 (en) 2000-02-24
ES2314979T3 (es) 2009-03-16
US7507798B2 (en) 2009-03-24
US6194153B1 (en) 2001-02-27
US7838247B2 (en) 2010-11-23
JP2007297407A (ja) 2007-11-15
US6395960B1 (en) 2002-05-28
JP5053746B2 (ja) 2012-10-17
US6117978A (en) 2000-09-12
JPH11504214A (ja) 1999-04-20
US20080286813A1 (en) 2008-11-20
PL323109A1 (en) 1998-03-16
EP2000479A1 (en) 2008-12-10
CZ339097A3 (cs) 1998-02-18
JP4504463B2 (ja) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL185549B1 (pl) Wyizolowany kwas nukleinowy, sposób identyfikowania wariantów allelicznych ludzkiego genu prezeniliny, komórka gospodarza, modelowe zwierzę, sposób wytwarzania domeny funkcjonalnej prezeniliny, zasadniczo czyste białko, zasadniczo czysty preparat białka, zasadniczo czysty polipeptyd, zasadniczo czysty preparat polipeptydu, zasadniczo czysty preparat przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał, linia komórkowa, sposób identyfikowania związków, sposoby diagnozowania, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie wektora ekspresyjnego, rekombinowany wektor, zwierzę transgeniczne
AU732508B2 (en) Nucleic acids and proteins related to Alzheimer&#39;s disease, and uses therefor
US6984487B1 (en) Cystic fibrosis gene
EP1108026B1 (en) Nucleic acids encoding ataxin-2 binding proteins, products related thereto and methods of using same
CA2259618A1 (en) Genetic sequences and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therefor
US6998467B1 (en) Antibody specific for presenilin 1 and method of use thereof
US7294710B2 (en) High-affinity choline transporter
JP5379119B2 (ja) アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用
DE60024862T2 (de) &#34;insulinabhängiges sequenz dna bindendes protein-1&#34; (irsdbp-1), dafür kodierendes gen und ihre verwendungen
CA2244412A1 (en) Nucleic acids and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therefor
WO2003021266A1 (en) The great gene and protein