KR102584857B1

KR102584857B1 - 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102584857B1
Application number: KR1020200123212A
Authority: KR
Inventors: 유성운; 남혜리; 안현규; 정경민
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2023-10-06
Also published as: KR20220040573A

Abstract

본 발명은 상동재조합 방법을 이용한 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Presenilin 2 유전자의 141번 아미노산이 N에서 I로 치환된 Psen2 N141I 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 동물 자체의 정상 유전자의 발현에 더해서 FAD 인간 유전자를 과발현하는 기존의 형질전환 방식의 동물 모델에 비해, 마우스의 정상 Psen2 유전자를 인간에서 보고된 치매 돌연변이와 동일한 변이를 발현하도록 치환하였고, 또 알츠하이머 환자의 돌연변이와 동일하게 이형접합 (heterozygous) 돌연변이를 도입함으로써 자연적인 발현수준을 유지하도록 하여 인간 치매를 더욱 정확하게 모델링이 가능함으로 치매 발병기전에 대한 정밀한 분석에 활용될 수 있다. 또한, LPS 복강주사를 통해 염증성 사이토카인의 발현을 통한 신경염증 유도 알츠하이머 모델을 제조함으로써 노화에 의한 치매모델과 달리 단기간 내(2개월) 치매 동물 모델을 구현할 수 있어 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Description

알츠하이머 동물모델 및 이의 용도{Animal model for Alzheimer’s disease and uses thereof}

본 발명은 상동재조합 방법을 이용한 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Presenilin 2 유전자의 141번 아미노산이 N에서 I로 치환된 Psen2 N141I 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다.

치매 (dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 정신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 약 50% 정도는 알츠하이머형 치매 (dementia of Alzheimer type)이며, 약 30% 정도는 혈관성 치매 (dementia of Vascular type), 알콜성 치매 및 파킨슨병 치매이고, 약 20% 정도는 알츠하이머형 치매 및 혈관성 치매 등 양쪽성으로 발병하는 것으로 알려져 있다.

치매의 가장 중요한 발병 형태인 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)은 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 질병 특성상 환자 본인뿐 아니라 가족의 정신적, 육체적 부담이 매우 심각한 질병이다. 알츠하이머병은 65~74세에서 10%, 75~84세에서 19%, 85세 이상에서 47%가 발병하고 해마다 발병률이 늘어나고 있으며, 우리나라에서 1995년 65세 이상으로 등록된 알츠하이머병 환자수는 241,000명으로 노인 전체 인구의 8.3%를 차지하고 있으며, 2020년에는 619,000명이 될 것으로 예측된 바 있어 커다란 사회적 문제로 떠오르고 있다. 현재까지 알츠하이머병은 예방은 물론 확립된 조기 진단 방법도 알려진 바가 없다. 또한, 치료제 역시 현재까지 개발된 것이 없으며, 단지 증상을 완화시키는 약물들만 사용되고 있을 뿐이다.

한편, 치매의 원인을 밝히고, 치료 물질을 개발하기 위해서는 임상실험을 하기 전에 실제로 실험을 행할 수 있는 치매 동물 모델의 개발이 필수적이다. 이에 알츠하이머성 치매 기전 연구를 위하여 마우스에 특정 유전자를 형질전환 시켜 제작한 동물모델에 관한 연구가 활발히 진행 중 (대한민국 공개특허 10-2018-0112558)이나, 바이러스를 이용하여 특정 유전자의 과발현을 유발시키는 동물모델은 동물 자체의 유전자 및 형질전환된 유전자가 함께 발현되는 인위적인 발병모델로서 발병 기전 연구에는 적합하지 않은바, 발병 기전을 더욱 정밀하게 분석할 수 있는 동물모델의 제조가 필요한 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 상동재조합 방법을 통해 마우스의 Psen2를 인간 AD 환자에서 가족형 AD (familial AD, FAD)를 일으킨다고 보고된 N141I로 치환시키는 경우 신경염증 유도에 의해 치매를 유발시켜 단기간 내에 마우스에서 치매를 더욱 정확하게 모델링할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 야생형의 Psen2 유전자가 Psen2 N141I로 치환된 알츠하이머 동물 모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 알츠하이머 동물 모델 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

(a) 표적화 벡터에 Psen2 N141I 돌연변이 유전자를 삽입시키는 단계;

(b) 상기 유전자가 삽입된 벡터를 숙주동물에 삽입하는 단계; 및

(c) 상기 벡터가 삽입된 숙주동물을 Cre 마우스와 교배하여 후대동물을 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

a) 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및

b) 상기 후보물질을 처리한 동물모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형의 Psen2 유전자가 Psen2 N141I로 치환된 알츠하이머 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 알츠하이머는 신경염증 유도에 의한 알츠하이머일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 Psen2 N141I 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 알츠하이머 동물 모델 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

a) 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및

본 발명은 동물 자체의 정상 유전자의 발현에 더해서 FAD 인간 유전자를 과발현하는 기존의 형질전환 방식의 동물 모델에 비해, 마우스의 정상 Psen2 유전자를 인간에서 보고된 치매 돌연변이와 동일한 변이를 발현하도록 치환하였고, 또한 알츠하이머 환자의 돌연변이와 동일하게 이형접합 (heterozygous) 돌연변이를 도입함으로써 자연적인 발현수준을 유지하도록 하여 인간 치매를 더욱 정확하게 모델링이 가능함으로 치매 발병기전에 대한 정밀한 분석에 활용될 수 있다. 또한, lipopolysaccharide (LPS) 복강주사를 통해 염증성 사이토카인의 발현을 통한 신경염증 유도 알츠하이머 모델을 제조함으로써 노화에 의한 치매모델과 달리 단기간 내 (2개월) 치매 동물 모델을 구현할 수 있어 활용도가 높을 것으로 기대된다.

도 1은 Psen2 N141I 유전자가 미세아교세포에서 clock-controlled 사이토카인의 생산 증가를 나타냄을 확인한 결과로서, 도 1a는 N141I 표적 삽입을 위한 모식도를 나타낸 것이고, 도 1b는 야생형, KI/+ 및 KI/KI 마우스에 Sanger 시퀀싱 크로마토그램 결과를 나타낸 것이고, 도 1c 및 도 1d는 12시간 TLR 리간드 처리 후 야생형 및 KI/+ 미세아교세포의 상층액에서 IL-6 발현 또는 TNF-α의 발현을 확인한 것이고, 도 1e는 12시간 동안 LPS 처리후 야생형 및 KI/+ 미세아교세포의 배양배지에서 40개 사이토카인의 프로테옴에 대한 ELISA를 수행한 결과이고, 도 1f는 야생형 및 KI/+ 샘플 사이토카인 수준의 상대적 변화에 대한 평균 신호를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Psen2 N141I가 미세아교세포에서 clock 유전자의 리드미컬한 발현패턴 변화를 확인한 결과로서, 도 2a는 야생형 및 KI/+ 미세아교세포 사이의 clock 유전자의 상대적인 mRNA 발현수준을 비교한 것이고, 도 2b 내지 2d는 생체 clock 유전자의 전사체 (Nr1d1, Nr1d2, Arntl, Clock, Cry, Per1, Per2, Rosa, Dbp, Csnk1a1) 발현수준을 통해 미세아교세포의 생체 clock 유전자의 전사리듬을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Psen2 N141I 유전자에 의해 면역세포에서 생체 주기 움직임의 견고성이 감소되는 것을 나타낸 결과로서, 도 3a는 1차 미세아교세포에서의 생물 발광기록을 나타낸 것이고, 도 3b는 미세아교세포에서의 주기 및 진폭을 나타낸 것이고, 도 3c는 1차 성상세포에서의 생물 발광기록을 나타낸 것이고, 도 3d는 성상세포에서 주기 및 진폭을 나타낸 것이고, 도 3e는 골수유래대식세포 (bone marrouw-derived macrophages, BMDM)에서 생물 발광기록을 나타낸 것이고, 도 3f는 BMDM에서 주기 및 진폭을 나타낸 것이다.
도 4는 Psen2 N141I 유전자가 동물의 생체 주기 행동 변화에 영향을 미치지 않음을 확인한 것으로, 도 4a는 야생형의 운동활성을 엑토그램으로 나타낸 것이고, 도 4b는 KI/+의 운동활성을 엑토그램으로 나타낸 것이고, 도 4c는 야생형 동물에 대한 주기도 피크 분석을 나타낸 것이고, 도 4d는 KI/+ 동물에 대한 주기도 피크를 나타낸 것이고, 도 4e는 야생형에서 체온에 따른 엑토그램을 나타낸 것이고, 도 4f는 KI/+에서 체온에 따른 엑토그램 결과를 나타낸 것이고, 도 4g 및 4h는 일정한 암기의 조건에서 평균 기간(h) 동안의 주기도 피크 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 Psen2 N141I가 면역세포에서 REV-ERBα를 하향 조절한다는 것을 확인한 결과로서, 도 5a는 1차 미세아교세포, 1차 성상세포 및 BMDM에서 REV-ERBα 단백질에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이고, 도 5b는 ChIP 분석에서 qRT-PCR에 의해 면역 침전된 DNA 단편 fold enrichment analysis의 평균값을 나타낸 것이고, 도 5c는 shCon 또는 shNr1d1을 발현하는 렌티 바이러스로 형질 도입된 미세아교세포의 상대적 REV-ERBα 발현 수준을 나타낸 것이고, 도 5d 및 5e는 12 시간 동안 LPS (1μg / mL) 처리 후 shNr1d1로 형질 도입 된 WT 미세 아교 세포에서 IL-6 및 TNF-α의 분비 또는 mRNA 수준을 나타낸 것이고, 도 5f는 인간 NR1D1을 과발현하는 KI/+ 미세아교세포에서의 상대적 REV-ERBα 발현 수준을 나타낸 것이고, 도 5g 및 5h는 12 시간 동안 LPS (1μg / mL) 처리 후 NR1D1 과발현 KI/+ 미세아교세포에서 IL-6 및 TNF-α의 분비 및 mRNA 수준을 나타낸 것이다.
도 6은 메틸화에 의해 KI/+ 미세아교세포에서 REV-ERBα가 억제됨을 확인한 것으로, 도 6a 및 6b는 5-Aza를 24시간동안 처리하는 경우 야생형 및 KI/+ 미세아교세포에서 Nr1d1 전사체 및 단백질 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 6c 및 6d는 5-Aza에 의해 유도된 탈메틸화에 의한 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준 또는 분비 정도를 나타낸 것이고, 도 6e는 Nr1d1 프로모터에서 CpG islands를 나타낸 것이고, 도 6f는 야생형 및 KI/+의 미세아교세포 사이의 Nr1d1 프로모터 영역에서 전체 DNA 메틸화 비율을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 KI/+ 마우스가 LPS에 반응하여 염증악화 및 기억력의 악화를 나타낸다는 것을 확인한 결과로서, 도 7a는 야생형 및 KI/+ 마우스 혈청에서 LPS 주입 여부에 따른 사이토카인 (IL-6, CXCL1, CCL2, CCL5, TNF-α)의 변화를 확인한 것이고, 도 7b는 야생형 및 KI/+ 마우스 해마에서 Iba-1 염색이미지를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 7c는 IMARIS 소프트웨어를 사용하여 Iba-1 신호의 대표적인 3D 필라멘트 이미지를 나타낸 것이고, 도 7d는 IMARIS 분석을 통해 FilamentTracker에서 추출한 dendrite 길이, 분기 수 및 Sholl 반경 분석 데이터를 나타낸 것이고, 도 7e 및 7f는 Y-maze 테스트 결과를 나타낸 것이고, 도 7g 및 7h는 T-maze 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 면역세포에서 야생형 및 KI/+의 차이를 비교한 모식도이다.

본 발명자들은 상동재조합 방법을 통해 마우스의 정상 Psen2를 인간 AD 환자에서 가족형 AD (familial AD, FAD)를 일으킨다고 보고된 N141I로 치환하는 경우 신경염증 유도에 의해 치매를 유발시켜 단기간 내에 마우스에서 치매를 더욱 정확하게 모델링할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 야생형의 Psen2 유전자가 Psen2 N141I로 치환된 알츠하이머 동물 모델을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 알츠하이머는 신경염증 유도에 의한 알츠하이머인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 “Psen2 N141I”이란 동물모델의 정상 Psen2 유전자를 인간에서 보고된 치매 돌연변이와 동일한 변이를 발현하도록 치환한 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 마우스 Presenilin 2 유전자의 141번 아미노산이 N에서 I로 치환된 것을 의미한다. 본 발명에서는 Psen2 N141I 유전자로서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 “신경염증 유도에 의한 알츠하이머”는 신경 염증반응을 인위적으로 발생시켜 유도된 치매를 의미하며, 노화에 의한 치매모델과 달리 단기간 내에 치매를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “동물 모델”이란, 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환 모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다. 본 발명에서 동물 모델은 인간을 제외한 다양한 동물에 제한되지 않으나, 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 마우스를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 “치환”이란 유전자를 삽입하기 위한 녹인 (Knock-In)을 의미하며, Psen2 N141I 유전자의 치환은 야생형의 유전자 및 삽입된 유전자가 함께 발현되는 것이 아니라 야생형의 Psen2 유전자를 인간에서 보고된 치매 돌연변이와 동일한 변이를 발현하도록 치환하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “상동재조합(Homologous recombination)”이란 유전자가 치환 삽입 벡터의 상동성 부위를 숙주동물의 대립유전자에 삽입하고, 벡터가 삽입된 숙주동물을 Cre 마우스와 교배하여 후대에 동물 모델을 제조하는 방법으로, 본 발명에서 벡터는 엑손 4 부위의 Psen2 N141I 유전자 및 Neo ^r -loxp 서열을 포함할 수 있으며, Psen2 N141I 유전자가 치환 삽입된 마우스 모델을 생성하기 위해 Cre-loxp 시스템을 사용하여 Cre 마우스와 교배될 수 있다.

본 발명은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 동물 모델을 제조하고, 사이토카인 발현, clock-controlled 유전자 발현 등을 분석함으로써 인간 PSEN2 N141I 치매 돌연변이를 재현하는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 야생형 마우스 및 Psen2 N141I가 치환 삽입된 마우스 유래 미세아교세포에서 TLR 활성화에 따른 염증반응을 확인한 결과, TLR 리간드가 야생형보다 KI/+ 미세아교세포에서 IL-6의 분비를 더 많이 유도하는 것을 확인하였으며, LPS 처리 후 ELISA-기반 사이토카인 단백질분석을 수행한 결과, KI/+ 미세아교세포에서 C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1), C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) 및 CCL5 뿐 아니라 IL-6의 분비 증가를 확인함으로써, Psen2 N141 돌연변이는 미세아교세포 및 기타 선천성 면역세포에서 생체 주기 조절 사이토카인의 활성면역 반응을 유도하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 미세아교세포 및 기타면역세포에서 Psen2 N141I 돌연변이에 의한 clock 유전자의 발현 패턴을 확인한 결과, KI/+ 미세아교세포에서 Nr1d1, Clock, Cry1, Per1 and Per2 mRNA 수준은 유의하게 감소하였으며, 반대로 Arntl 수준은 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 야생형 및 KI/+ 마우스에 특정 시간 (18:00)을 기준으로 다양한 용량의 LPS를 복강 내 (i.p.)에 주입하고 20시간 후 염증반응을 모니터링한 결과, 야생형 마우스와 비교하여 KI/+ 마우스는 테스트 된 모든 LPS 용량에서 IL-6의 순환 수준이 높게 나타나며 낮은 농도의 LPS에서 KI/+ 마우스에서 clock-controlled 사이토카인의 혈중 농도를 증가시킴으로써, 낮은 용량의 LPS는 면역반응의 과활성을 유도하고 Psen2 N141I/+ 마우스에서 IL-6을 포함하는 clock-controlled 사이토카인의 과잉 생산을 통해 기억력 결핍을 유발시키는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

상기 실시예 결과들로부터 본 발명에 따른 Psen2 N141I 유전자를 상동재조합을 통해 치환 삽입한 동물모델에서 신경염증 반응 및 기억력 감퇴 등의 증상을 나타내는 것을 확인함으로써 치매 발병 기전 연구를 위한 동물 모델로서 적합하게 제작된 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

a) 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및

상기 예후를 확인하는 단계에서, 예후가 좋게 나타나는 후보물질을 알츠하이머 치료제로 선별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 동물실험

동물의 관리 및 사용에 대한 모든 절차는 동물관리기관 (Institutional Animal care) 및 DGIST 사용위원회 (Use Committee of DGIST)의 승인을 받아 진행하였다. 동물은 DGIST 동물시설 (DGIST animal facility)에서 12시간의 명주기, 12시간의 암주기 하에 무균환경에서 유지되었다. Psen2 ^N141I/+마우스는 상동재조합을 사용하여 생성되었다. 표적화 벡터는 엑손 4 부위의 I141 돌연변이 및 Neo ^r -loxp 서열을 포함한다. 표적화 벡터의 상동성 부위는 야생형 (WT) 대립유전자의 Psen2에 삽입되었다. Psen2 ^N141I/N141I ;loxp-Neo ^r -loxp 마우스는 Psen2 N141I 돌연변이 knock-in 마우스 모델을 생성하기 위해 Cre-loxp 시스템을 사용하여 Cre 마우스와 교배되었다. Psen2 ^N141I/+마우스를 Per2::Luc Knock-in 마우스 (Proceedings of the National Academy of Sciences 101, 5339-5346 (2004) 참조)와 교배하여 생물 발광 (bioluminescence) 기록을 사용하여 실시간으로 생물학적 주기의 역학 (circadian dynamics)을 모니터링하였다.

1-2. 세포배양

1 ~ 3일령의 신생 마우스로부터 1차 배양한 미세아교세포 및 성상세포를 수득하였다. 세포를 분리하고, 10% 열-불활성화시킨 소 태아 혈청 (HI-FBS, Hyclone) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Hyclone)이 보충된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Corning)으로 배양하였다. 1차 미세아교세포는 시험관 내에서 탭핑 (tapping)하여 12일째에 분리하였다. 미세아교세포를 제거한 후 트립신-EDTA를 처리하여 1차 성상세포를 분리하였다. 1차 미세아교세포 및 성상세포의 순도는 미세아교세포 및 성상세포 마커인 항-Iba-1 및 항-GFAP 항체로 면역 염색하여 추정하였다. 골수 유래 대식세포 (BMDM)는 6~7주령의 마우스의 대퇴골 및 경골에 의해 수득되었다.

1-3. 시약 및 항체 (Reagents and antibody)

항체로는 Santa Cruz Biotechnology의 HRP-conjugated β-Actin (sc47778); Cell Signaling Technology의 Presenilin 1 (5643) 및 REV-ERBa (13418); Wako Chemicals의 Iba-I (019-19741); BD Bioscience의 N-cadherin (610920); Abcam의 Presenilin 2 (ab51249); ThermoFisher scientific의 REV-ERBα (PA5-29865)를 사용하였다. 시약으로는 Escherichia coli 0111:B4 (L4391)의 LPS 및 dexamethasone (50-02-2)을 Sigma-Aldrich로 부터 구매하였으며, phosphate-buffered saline (PBS)에서 희석하였다; Invivogen의 mouse Toll-like receptor ligands kit (Tlrl-kit 1mw) 및 nigericin (Nig; tlrl-nig); Merk Millipore의 SR9009 (554726); Abcam의 5-azacytidine (ab142744); Promega의 D-luciferin (E1601)를 사용하였다.

1-4. qRT-PCR(Quantitative RT-PCR)

ImProm-II Reverse Transcriptase kit (Promega)를 사용하여 qRT-PCR을 위한 RNA를 분리하고, oligo dT를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 프라이머는 상업적으로 합성하였다 (Cosmo Genetech). qRT-PCR은 마우스 cDNA에 특이적인 Taq Polymerase (Invitrogen) 및 하기 표 1에 개시된 프라이머를 사용하여 실시하였다. 또한, TOPreal^TM qPCR 2 × PreMIX (SYBR Green with low ROX) (Enzynomics)를 사용하였고, CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하여 모든 프라이머에 대해 50-cycle amplification을 적용하였다. Actb는 정규화를 위한 참조 유전자로 사용되었다.

Gene	Gene reference number	5’- primer sequence -3’
Psen1	NM_001362271.1	F	CAG TCA CCT GGG GCC TCA TCG (서열번호 3)
		R	GTT GTG TTC CAG TCT CCA CTG GC (서열번호 4)
Psen2	NM_011183.3	F	GTA TGG GGC GAA GCA TGT GAT (서열번호 5)
		R	ACG CAC AGA CTT GAT AGT GGC (서열번호 6)
IL-6	NM_031168.2	F	CTG GAT ATA ATC AGG AAA TTT GC (서열번호 7)
		R	AAA TCT TTT ACC TCT TGG TTG A (서열번호 8)
Cxcl1	NM_008176.3	F	CAT GGC TGG GAT TCA CCT CA (서열번호 9)
		R	TGA GGT GAA TCC CAG CCA TG (서열번호 10)
Ccl2	NM_011333.3	F	GTC CCT GTC ATG CTT CTG GG (서열번호 11)
		R	CCC CAA GAA GGA ATG GGT CC (서열번호 12)
Ccl5	NM_013653.3	F	CCT CAC CAT ATG GCT CGG AC (서열번호 13)
		R	TGC TCC AAT CTT GCA GTC GT (서열번호 14)
Tnf	NM_013693.3	F	CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A (서열번호 15)
		R	TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC (서열번호 16)
Hes5	NM_010419.4	F	GGT ACA GTT CCT GAC CCT GC (서열번호 17)
		R	GCA GGG TCA GGA ACT GTA CC (서열번호 18)
IL-1b	NM_008361.4	F	AGG CCA CAG GTA TTT TGT (서열번호 19)
		R	GCC CAT CCT CTG TGA CTC (서열번호 20)
Nr1d1	NM_145434.4	F	TGC TGG CAT GTC CCA TGA AC (서열번호 21)
		R	GAC TGT AGG TTG TGC GGC TC (서열번호 22)
Nr1d2	NM_011584.4	F	AGC TTC CAG TCC TCG TCC TC (서열번호 23)
		R	ATC CTG ATG CCA CAT CCC CA (서열번호 24)
Arntl	NM_007489.4	F	GCT GTA CCG TCC CTG TCA AA (서열번호 25)
		R	GGT GCC TTC GTG ACT CTG AA (서열번호 26)
Clock	AF000998.1	F	TAG CAC TCC TCC CAG ACA GC (서열번호 27)
		R	CTA TCA TCC GTG TCC GCT GC (서열번호 28)
Cry	AF351609.1	F	CTC GCC TCG GTC CCT TCT AA (서열번호 29)
		R	CGG AGC TTC TCC CTT GCT TG (서열번호 30)
Per1	NM_011065.5	F	CAG TGG AGT CTG GAG GAG GG (서열번호 31)
		R	GGA GCC AGG AGC TCT GAG AA (서열번호 32)
Per2	NM_011066.3	F	GCA GAA ATG CAA AGC AGC CC (서열번호 33)
		R	GGA TGT TGG CTG GGA ACT CG (서열번호 34)
Dbp	NM_016974.3	F	GGA GCC TTC TGC AGG GAA AC (서열번호 35)
		R	AAA GGC AAA GTG CGT TCC CA (서열번호 36)
Rora	NM_013646.2	F	CGC TCG TGG CTT CAG GAA AA (서열번호 37)
		R	GGA GTC GCA CAA TGT CTG GG (서열번호 38)
Csnk1a1	NM_146087.3	F	AGT CGC CGA GAT GAC ATG G (서열번호 39)
		R	GGG TCC TGA AAA GGA TGC GG (서열번호 40)
IL-6	Promoter region	F	GGA GAG GGA GTG TGT GTC TT (서열번호 41)
		R	GTG CTG GTT TAA ATA ACA TCA (서열번호 42)
Arntl	Promoter region	F	CGA TGC GGG TTT GAC AGA TA (서열번호 43)
		R	GCA CTC ATT TCC GAA CAC AAC (서열번호 44)
Tbp	Promoter region	F	CCA CAC CCG CCA CCA GTT CG (서열번호 45)
		R	TAC AGC CCG GGG AGC ATC GT (서열번호 46)
Tnf	Promoter region	F	ACA CTT CCC AAC TCT CAA GC (서열번호 47)
		R	TTG TAG AAA GAC CAT GCC TGT (서열번호 48)

1-5. 효소면역 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay)

마우스의 IL-6, TNFα, IL-1β, CCL2, CXCL1, CCL3, CCL4, CXCL2 및 Proteome Profiler용 ELISA 키트 및 마우스 사이토카인 분석 패널 A 키트는 R&D 시스템에서 구입했으며 배양 배지 및 혈청에서 사이토카인을 측정하는 데 사용하였다.

1-6. 웨스턴 블랏

세포를 1% Triton X-100 용해 완충액 (1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 및 20 mM Tris-HCl 내 50 mM NaCl, pH 7.4)으로 1× protease and phosphatase inhibitors (Thermo Fisher Scientific) 및 0.1 M dithiothreitol (Sigma-Aldrich)와 함께 용해하였다. 세포 용해액을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔에서 전기영동하고, PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 상기 멤브레인에 적절한 1차 항체를 처리하여 배양하였고, 결합된 항체에 대한 종 특이적 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase)가 접합된 2차 항체를 처리하였다. 이후 단백질 밴드를 분석하기 위해 화학 발광 검출 (Chemiluminscence)을 수행하였다.

1-7. ChIP-qPCR (Chromatin immunoprecipitation-qPCR) 분석

PBS에서 0.75 % 파라포름알데히드 (PFA)를 사용하여 세포를 고정 및 단백질을 DNA에 교차 결합시켰다. 고정시킨 세포에 125mM 글리신을 첨가하여 PFA의 작용을 상쇄시켰다. 세포를 수득하고 1× 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 방사성 면역 침전 분석 완충액 (Sigma-Aldrich)에서 용해시키고 DNA를 초음파 처리하여 500-1000 bp 크기로 단편화하였다. 단백질 A-agarose/연어 정자 DNA 비드 (Millipore)를 IgG를 포함한 관심 단백질의 DNA 및 항체와 함께 배양하고 샘플을 4℃에서 회전시키면서 밤새 면역침전시켰다. 이후 용출 완충액 (10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)을 첨가하여 DNA를 용출시켰다. 입력 샘플은 RNase A (20 μg/mL) 및 Proteinase K (0.5 mg/mL)와 함께 65℃에서 하룻밤 동안 배양하여 교차 결합을 역전 시켰다. Isopropanol을 이용하여 DNA를 침전시키고 qRT-PCR을 수행하여 예상되는 DNA 결합 부위에 대한 단백질의 결합을 평가하였다.

1-8. Y-미로 분석 (Y-maze assay)

Y-maze는 공간 작업 기억을 평가하기 위해 사용되었다. 분석은 Y 형 미로의 흰색 플라스틱 팔 (plastic arms)에서 수행되었습니다. 마우스를 중앙에 놓고 5 분 동안 플라스틱 팔을 자유롭게 탐색할 수 있도록 하고 EthoVision 소프트웨어 (Noldus)로 실험을 기록하였다. 연속된 3개의 팔 엔트리의 수를 가능한 트라이어드의 수 × 100 (총 팔 엔트리 -2)로 나누어 교대 비율을 계산하기 위해 팔 엔트리의 수와 트라이어드의 수를 분석하였다.

1-9. T-미로 분석 (T-maze assay)

T-maze는 보상 교대로 공간 학습과 기억을 평가하는 데 사용되었다. 분석은 T 자형 미로의 흰색 플라스틱 팔 (plastic arms)에서 수행되었다. 마우스를 미로와 음식 보상에 익숙해지게 한 후, 두 팔에 상기 보상을 배치하고 한 팔을 차단하였다. 마우스를 기지 (base)에 위치시켰으며, 마우스는 음식 보상을 먹기 위해 오픈된 팔쪽으로 달렸다. 다음 시도에서 이전에 닫힌 팔을 열고, 마우스를 다시 기지 (base)에 위치시켰으며, 마우스는 한쪽 팔을 선택하였다. 만약 마우스가 새로 열린 팔을 선택하면 음식 보상을 먹을 수 있으며, 마우스가 이전에 방문한 팔을 잘못 선택하면 마우스는 보상을 받지 못했다. 정확한 군을 방문한 트라이어드의 수는 총 군 항목을 나눔으로써 정확한 군 항목의 백분율로 계산하였다.

1-10. 미세아교세포 변환(Microglial transduction)

shNr1d1 (22747)은 Addgene에서 구입하였다. 인간 NR1D1 cDNA를 PLJM1-EGFP 벡터로 클로닝하여 렌티 바이러스를 생성하였다. 렌티바이러스는 전달 벡터 (PLKO.1-shNr1d1 또는 PLJM1-NR1D1-EGFP), 패키징 벡터 (psPAX2, Addgene) 및 VSV-G 엔벨로프 발현 (PMD2.G, Addgene)을 사용하여 Lenti-X 293T 세포에 형질 감염시켜 생산하였다. 3일 후, 상청액을 수득하고 바이러스 농도를 위해 25,000 xg에서 2시간 동안 (Optima XPN-100, Beckman Coulter) 초원심 분리를 수행하였다. 1차 미세아교세포를 hexadimethrine bromide (8μg / mL)가 첨가된 배지에서 렌티바이러스로 감염시켰다. 24시간 후, 배지를 새로운 배양 배지로 교체하였으며, 72시간 후 형광현미경을 사용하여 eGFP 발현을 모니터링하고 세포를 사용하였다.

1-11. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

마우스를 졸레틸 (zoletil)(Virbac, 50 mg / kg) 및 럼푼 (rompun) (Bayer, 10 mg / kg) 혼합물을 주사하여 마취시켰다. 이후, 마우스에 PBS를 주입 한 다음 4 % PFA를 주입하였다. 뇌를 수집하고 16 시간 동안 4 % PFA에서 후 고정시켰다. 이후, 뇌는 튜브 바닥에 가라 앉을 때까지 30 % 자당으로 옮겨져 최적의 절단 온도 화합물로 동결시켰다. 내장된 뇌는 관상 단면에서 50 μm 두께로 절단되었고 슬라이스는 PBS에 띄워놓았다. 샘플은 항원 회수(antigen retrieval)를 위해 95 ℃에서 5 분 동안 1.5 mL 튜브에서 10 mM 시트르산 나트륨 완충액 (10 mM Tri-sodium citrate dihydrate, 1 N HCl, 0.05 % Tween-20 in water)과 함께 배양되었다. 샘플을 PBS로 3 회 세척하고 5 % 정상 당나귀 혈청 및 0.01 % Triton X-100을 포함하는 PBS로 차단하였다. 슬라이스는 4 ℃에서 24 시간 동안 3 % 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에서 Iba-I 항체 (Wako, 019-19741)와 함께 배양되었다. 적절한 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 투여하고 LSM 7 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (Carl Zeiss)으로 분석하였다.

1-12. 미세아교세포 형태 분석

공 초점 이미지는 무작위로 선택된 필드의 전체 Z 축으로 측정하였다. 이후 IMARIS 소프트웨어 (버전 9.2.1, Bitplane AG)를 사용하여 공 초점 이미지에서 3D 이미지를 재구성하였다. 수상 돌기 길이, 분기 수 및 microglia의 sholl 반경의 정량화를 위해 FilamentTracer는 Iba-1 신호에 따라 수행되었다.

1-13. SCN 슬라이스 배양(SCN slice culture)

SCN 외식 편 배양은 기존에 알려진 방식에 약간의 수정을 가하여 준비하고 모니터링 하였다. Per2::Luc knock-in allele 이 있는 1주령의 야생형 (WT) 또는 Psen2 ^N141I ^/+마우스를 이용하여, 뇌를 빠르게 제거하여 식힌 후, 5 % CO₂ 및 95 % O₂를 함유하며 0.01 M HEPES 및 36 mM D-glucose가 첨가된 Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS)에 침지하였다. 뇌는 Leica VT1000 S vibratome (Leica)를 사용하여 400 μm 두께의 조각으로 절단하였다. 슬라이스를 배양 삽입 막 (Millicell-CM, Millipore)에 유지하고 37 ℃에서 배양 배지 (50 % 최소 필수 배지, 25 % GBSS, 25 % 말 혈청, 36mM 포도당 및 1× 항생제-항진균제)에 침지하였다. SCN 슬라이스는 사용되기 전에 2 주 이상 배양되었다.

1-14. 생물 발광 기록(Bioluminescence recording)

Per2::Luc 리포터 마우스에서 파생 된 세포 및 SCN 슬라이스를 사용하여 실시간으로 생체 역학을 모니터링하기 위해 세포 배양 인큐베이터가 통합된 발광계 (Kronos Dio, Atto)를 사용하여 발광을 지속적으로 측정하였다. 36 ℃에서 10분 간격으로 1분 동안 발광을 측정하고 통합하였다. 성상 세포, 미세 아교 세포 및 BMDM의 경우, 세포는 배양 배지에서 덱사메타손 (DEX, 150 nM)과 동기화하였다(synchronized). DEX 적용 15분 후, 세포를 세척하고 신선한 기록 배지 (0.3 mM D- 루시페린 (Promega)이 보충 된 배양 배지)로 교체하였다. SCN 배양은 DEX 동기화 없이 0.3 mM D- 루시페린을 포함하는 1 mL 배양 배지가있는 35 mm 페트리 접시에서 수행되었으며, 실시간 생물 발광은 cosinor 절차에 의해 분석되었다.

1-15. 행동 기록(Behaviour recording)

마우스의 운동 활동과 체온은 무선 송신기 기반 원격 측정 시스템 (Starr Life Science) 인 E-mitter를 사용하여 측정되었다. E-mitter는 복강 내 케타민 (100mg / kg) 및 자일라진 (10mg / kg) 주사로 유도된 전신 마취하에 무균 기술을 사용하여 마우스 등의 피부 아래에 이식되었다. 이식 후, 마우스는 적어도 1 주일 동안 회복되었고 규칙적인 12 시간 명암 주기로 순응되었다. 이식된 센서에서 감지된 활동 및 온도 데이터는 수신기 (ER-4000 Engergizer / Receiver)로 전송되었다. 데이터 수집 및 디지털 변환은 VitalView 소프트웨어를 사용하여 6 분마다 수행하였다 (Starr Life Science). R76에서 xsp 패키지를 사용하여 카이-제곱 주기의 분석을 수행하였다.

1-16. 메틸화 시퀀싱(Methylation sequencing)

Genomic DNA는 제조업체의 지침에 따라 MasterPureTM DNA 정제 키트 (Epicentre)를 사용하여 WT 및 KI/+ 마우스의 미세 아교 세포 10 x 10⁶ 세포에서 분리되었다. 추출 된 게놈 DNA를 TE 버퍼로 재현탁하고 형광 측정법을 사용하여 정량화하였다. gDNA의 Bisulfite 변환은 EZ DNA Methylation Lightning kit (Zymo Research)를 사용하여 수행되었다. 메틸화되지 않은 잔류 물은 중아 황산염 처리에 의해 우라실로 전환되고 시퀀싱 될 때 티민으로 분류하고, 전환으로부터 보호되는 메틸화 시토신은 시토신으로 분류하였다. Bisulfite-conversed DNA를 정제하고 EpiGnome^TM Methyl-Seq 키트 (Epicentre)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비하는 데 사용하였다. 이 절차에서 DNA는 우라실 뉴클레오티드를 읽을 수 있는 중합 효소를 사용하여 무작위 프라이밍되어 특정 서열 태그를 포함하는 DNA를 합성하였다. 오리지날 bisulfite 처리된 DNA에 대한 완성체만 시퀀싱 템플릿으로 사용되었다. 따라서 결과 Read 1은 항상 오리지날 bisulfite 처리된 가닥과 동일한 시퀀스를 의미한다.

1-17. 통계분석

데이터는 3 개 이상의 독립적인 실험이 평균 ± 평균 (SEM) 값의 표준 오차로 표시되었다. 통계 분석은 짝이 없는 t-검정, 일원 분산 분석 (ANOVA) 또는 이원 ANOVA 및 Bonferroni 사후 검정에 의해 결정되었다. GraphPad Prism을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다.

실시예 2. 생체 주기 조절 사이토카인 (Circadian clock-controlled cytokines) 반응 확인

생체 내에서 Psen2 N141I 돌연변이의 병원성 기능을 조사하기 위해, 도 1a와 같이 Psen2 N141I 대립유전자 (Psen2 ^N141I/+ and Psen2 ^N141I/N141I)를 보유한 KI 마우스를 생성하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, N에서 I (AAC 에서 ATC)로의 치환은 게놈 시퀀싱을 통해 확인하였다. 인간 알츠하이머 질환을 보다 정확하게 재현하고, 내인성 발현 수준을 유지하기 위해 이형접합 Psen2 ^N141I/+ (KI/+) 마우스를 사용하였다. Psen2 ^N141I/+ 마우스에서 유래된 KI/+ 1차 미세아교세포 내에서 PSEN2의 mRNA 및 단백질 발현 수준은 야생형 (WT) 마우스와 비슷하게 나타났으며, 이는 N141I 돌연변이가 PSEN2 발현에 영향을 미치지 않음을 나타내는 결과이다. 또한, Psen2에서 N141I 돌연변이는 PSEN1발현의 변화를 유도하지 않는 것을 확인하였다. Notch downstream으로 N-cadherin의 분획 및 Hes5의 mRNA 발현에 기초하여 γ-secretase 활성을 추정한 결과, Psen2 ^N141I/+ 마우스 유래 미세아교세포에서 γ-secretase 활성 변화가 없는 것을 확인하였다.

다음으로, Psen2 N141I 돌연변이의 기능적 결과를 탐구하기 위해, Psen2 N141I 돌연변이가 Toll-like receptors (TLR)의 활성화에 따른 면역세포의 염증기능에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 야생형 (WT) 또는 KI/+ 마우스에서 유래된 1차 미세아교세포를 각각 TLR1/2에 대해 N-palmitoyl-S-dipalmitoylglyceryl Cys-Ser-(Lys)₄(Pam₃CSK₄), TLR2에 대해 Listeria monocytogenes의 heat-killed preparation (HKLM), TLR3에 대해 고분자의 polyinosine-polycytidylic acid (Poly (I:C) HMW) 또는 저분자의 polyinosine-polycytidylic acid (Poly (I:C) LMW), TLR4에 대해 Esherichia coli O111:B4로부터 정제된 lipopolysaccharide (LPS), TLR5에 대해 Salmonella typhimurium의 flagellin (ST-FLA), TLR6에 대해 Pam2CGDPKHPKSF (FSL-1), TLR7에 대해 HIV-1 long terminal repeat에서 유래된 20-mer single strand RNA (ssRNA), TLR9에 대해 올리고뉴클레오티드를 포함하는 메틸화되지 않은 CpG dinucleotides (ODN1826)으로 처리하였다.

다음으로, 염증 반응을 확인하기 위해 배지에서 종양 괴사인자-α (TNF-α) 및 IL-6의 방출을 측정한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이 TLR 리간드는 야생형보다 KI/+ 미세아교세포에서 IL-6의 분비를 더 많이 유도하는 것을 확인하였다. 그러나, 도 1d에 나타낸 바와 같이 돌연변이 의존적 효과는 TNF-α방출에는 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 선천적 면역 세포로 확장하고 미세아교세포와 유사한 방식으로 IL-6의 발현 수준을 측정한 결과, 1차 성상세포 및 BMDM에서 TLR 리간드들에 의해 야생형 (WT)에 비해 KI/+ 세포에서 IL-6은 더 많은 발현이 나타나고, TNF-α는 그렇지 않은 결과를 나타냈다. 상기 결과로부터 선천성 면역세포 사이에서 Psen2 N141I 돌연변이에 의해 IL-6의 분비가 선택적으로 증가하는 것이 일반적인 반응임을 유추할 수 있다.

다음으로, 근본적인 메커니즘을 파악하기 위해 대표적인 염증 유도제인 LPS에 대한 미세아교세포의 반응을 분석하였다. Psen2 N141I 돌연변이에 영향을 받는 사이토카인의 스펙트럼을 분석하기 위해, 야생형(WT) 및 KI/+ 미세아교세포에 LPS 처리 후 ELISA-기반 사이토카인 단백질분석을 수행하였다. 먼저 40개의 표적 중 13개의 사이토카인을 검출하고, 도 1e 및 1f에 나타낸 바와 같이 KI/+ 미세아교세포에서 C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1), C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) 및 CCL5 뿐 아니라 IL-6의 분비 증가를 확인하였다. 또한, 도 1g에 나타낸 바와 같이 상기 사이토카인의 전사수준은 야생형(WT)에 비해 KI/+ 미세아교세포에서 유의하게 상향조절되는 것을 확인하였다. 상기 분비가 증가된 4개의 사이토카인 (CXCL1, CCL2, CCL5, IL-6)의 경우 일주기 리듬(circadian rhythm)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 한편, 야생형과 KI/+ 미세아교세포에서 LPS처리에 의한 TNF-α의 분비 및 이의 mRNA 발현은 동등한 수준으로 변화되었다.

또한, IL-1β은 또 다른 주요 사이토카인으로 선천성 면역세포의 NLRP3 inflammasome과 같은 inflammasome 복합체를 통해 방출되는 것으로 알려져 있다. Nigericine(Nig) 처리로 LPS 프라이밍된 미세아교세포를 자극하여 NLRP3 inflammasome 활성화를 유도하였으며, 야생형 및 KI/+ 미세아교세포 사이에서 유사한 양의 IL-1β가 방출되고 유사한 전사 수준을 나타내는 것을 확인하였다. TNF-α 및 IL-1β의 경우 생체 리듬(circadian rhythm)과 독립적인 것으로 알려져 있다.

상기 결과들로부터, Psen2 N141 돌연변이는 미세아교세포 및 기타 선천성 면역세포에서 생체 주기 조절 사이토카인의 활성면역 반응을 유도하는 것을 확인하였다.

실시예 3. 미세아교세포 및 기타 면역세포에서 Psen2 N141I 돌연변이에 의한 clock 유전자의 발현 패턴 확인

미세아교세포는 clock 분자를 내재하고 있어 세포 발진기 역할이 가능하다고 알려져 있으며, Psen2 N141I 돌연변이가 clock-controlled 사이토카인의 더 많은 생산을 유도하기 때문에, 야생형 및 KI/+ 미세아교세포에서 대표적인 clock 유전자의 발현 수준을 측정하여 KI/+ 미세아교세포의 KI/+ 과활성이 생체주기 변화와 관련이 있는지 확인하였다. 그 결과 도 2a에 나타낸 바와 같이, KI/+ 미세아교세포에서 Nr1d1, Clock, Cry1, Per1 and Per2 mRNA 수준은 유의하게 감소하였으며, 반대로 Arntl 수준은 증가하는 것을 확인하였다.

다음으로, 세포 동기화 후 미세아교세포에서 clock 유전자의 고유진동을 분석하였다. 1 차 미세아교세포를 100 nM 덱사메타손 (DEX)에 2시간 동안 노출시켜 혈청 쇼크를 모방하여 세포의 clock 리듬을 동기화하고, DEX가 없는 상태에서 48시간 동안 추가로 4시간마다 샘플링하여 clock 유전자의 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 2b 내지 2d에 나타낸 바와 같이 KI/+ 미세아교세포에서 Nr1d1의 움직임이 심하게 저감되었으며, 다른 유전자들은 약간 이동하거나 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 Psen2 N141 돌연변이가 미소아교세포의 내재된 clock 리듬을 손상시킬 수 있음을 유추할 수 있다.

Psen2 야생형 및 KI/+ 유전자형 미소아교세포의 일일 움직임의 견고성을 비교하기 위해, Per2::Luc 마우스에서 파생된 1차 미세아교세포에서 KI/+ (Per2::Luc;Psen2 ^N141I/+) 또는 야생형 litter mates (Per2::Luc;Psen2 ⁺ ^/+)와 교차시킨 생체 clock 움직임을 모니터링하였다. 루시퍼라제 (Luc) 유전자가 내인성 마우스 Per2 유전자의 3 '말단에 프레임 내 융합된 Per2::Luc 리포터 마우스는 SCN과 말초 조직 모두에서 강력한 생체 리듬을 나타냈으며, 야생형 미세아교세포 배양은 3일 동안 움직임을 유지하였다. 또한, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이 KI/+ 미세아교세포 배양은 같은 기간동안 리드미컬한 변화를 나타냈으나 2일 동안만 지속되었으며, 이후 진폭이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

나아가, 1차 성상세포 및 BMDM으로 확장하여 생체 움직임 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 3c 내지 3f에 나타낸 바와 같이, 유사한 기간동안 야생형 (WT)에 비해 KI/+ 면역 세포의 진폭이 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, Psen2 ^N141I/+마우스에서 파생된 면역세포는 리드미컬하지만 지속가능한 자율 생체 clock을 사용하지 않는 것을 유추할 수 있다.

실시예 4. Psen2 ^N141I/+ 마우스에서 central clock 리듬 확인

상기 실시예 3의 결과로부터 Psen2 N141I KI/+ 면역세포가 동일한 주기의 생체 리듬을 나타내지만 낮은 진폭으로 인해 야생형 세포보다 더 빨리 약화됨을 확인하였다. 상기 결과가 central clock의 변화와의 유사성을 조사하였다. Per2::Luc;Psen2 ^N141I/+ 및 Per2::Luc;Psen2 ⁺ ^/+ 마우스에서 이식 연구를 위한 SCN 조직을 수득하였으며, 도 3g 내지 3h에 나타낸 바와 같이, Psen2 돌연변이가 central 움직임을 변경하지 않았음을 확인하였다.

이에 더하여, SNC clock 리듬 결과를 바탕으로, 동물의 운동 활동에서 정상적인 생체 행동을 분석하였다. 구체적으로, 14일 동안 12시간/12시간, 명/암 조건 하에서 엑토그램을 통해 마우스의 리드미컬한 움직임 활동을 기록한 결과, 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 KI/+ 마우스에서 명/암 조건을 처리한 환경과 일정하게 암조건을 유지한 환경에 따른 운동의 기간 및 진폭에 차이가 없음을 확인하였다. 또한, 도 4c 내지 4h에 나타낸 바와 같이 운동에 따른 진폭, 체온에 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, Psen2 ^N141I/+ 마우스가 central clock 리듬 및 동물의 생체 행동을 유지시키는 것을 확인하였다.

실시예 5. KI/+ LPS 처리 미세아교세포에서 REV-ERBα 하향조절에 의한 사이토카인 반응 악화 확인

LPS에 대한 반응으로 과민 반응 면역 활동을 매개하는 REV-ERBα의 역할을 확인하였다. 그 결과, 도 2 및 도 5a에 나타낸 바와 같이 REV-ERBα의 단백질 수준은 Nr1d1 mRNA 발현 수준의 감소와 일치하며, 야생형 (WT) 보다 KI/+ 미세아교세포에서 훨씬 더 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, REV-ERBα는 Psen2 ^N141I/+ 마우스 유래 성상세포 및 BMDM에서 하향조절되었다. 이는, Psen2 N141I 돌연변이가 여러 선천성 면역세포 유형의 REV-ERBα 수준에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

이에 더하여, ChIP (chromatin immunoprecipitation) 분석을 수행한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 REV-ERBα가 IL-6의 프로모터에는 직접 결합 할 수 있지만 Tnf 유전자에는 결합할 수 없음을 확인하였다. 또한, Arntl 인트론 및 비특이적 TATA 상자 결합 단백질 (Tbp) 프로모터를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하여 IL-6 프로모터에 대한 REV-ERBα 결합을 확인하였다.

나아가, ChIP-qPCR 분석을 수행한 결과 도 0에 나타낸 바와 같이 REV-ERBα가 IL-6의 근위 RORE ((A / G) GGTCA) 프로모터 부위에 직접 결합하고 결합 수준이 KI/+ 미세아교세포에서 유의하게 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 REV-ERBα의 하향조절이 LPS에 대한 IL-6의 반응을 증가시키는 것에 대한 기초가 될 수 있음을 시사한다.

이에, REV-ERBα의 하향조절에 따른 반응을 확인하기 위해, 도 5c에 나타낸 바와 같이 야생형 미세아교세포의 Nr1d1유전자를 Nr1d1-표적 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입하여 녹다운시켰다. 그 결과 도 5d 및 5e에 나타낸 바와 같이, Psen2 N141I 돌연변이와 유사한 방식으로, 야생형 미세아교세포에서 Nr1d1 유전자 발현의 억제는 LPS에 대한 반응으로 TNF-α가 아닌 IL-6의 분비 증가 및 발현을 증가시키고 염증반응을 강화한다는 것을 확인하였다.

다음으로, KI/+ 미세아교세포에서 REV-ERBα 과발현의 영향을 확인한 결과, 도 5g 및 5h에 나타낸 바와 같이 KI/+ 미세아교세포에서 인간 NR1D1의 렌티 바이러스 과발현은 LPS에 대한 IL-6의 과도한 흥분 반응을 조절하고 IL-6 반응을 야생형 수준으로 되돌리는 것을 확인하였다. 이는 도 5d, 5e, 5g 및 5h에 나타낸 바와 같이 미세아교세포에서 REV-ERBα 발현을 조절함으로써 분비 및 전사 수준에 영향을 미치지 않는 TNF-α의 반응과 대조적인 것임을 확인하였다. 상기 결과는 Psen2 N141I 돌연변이가 미세아교세포에서 REV-ERBα의 하향 조절을 통해 LPS에 대한 반응으로 IL-6으로 표시되는 clock-controlled 사이토카인을 상승시킨다는 것을 시사한다.

이에 더하여, REV-ERBα의 하향 조절과 과다 활성 면역 반응 사이의 관계를 확인하기 위해 LPS 처리 전에 잘 알려진 REV-ERBα 작용제 SR9009로 미세아교세포를 처리하였다. 그 결과, 야생형 미세아교세포에서 SR9009 처리는 LPS 기반 상향 조절 및 IL-6의 분비를 효과적으로 감소시켰으며, 용량 및 시간 의존적 방식으로 TNF-α의 발현을 조절하지는 않는 것을 확인하였다. 그러나, KI/+ 미세아교세포에서 REV-ERBα의 수준이 감소함에 따라 SR9009의 효능은 크게 감소했으며 최고 용량 테스트 인 20 mM을 제외하고는 거의 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 Psen2 N141I 돌연변이에 의한 REV-ERBα 하향조절이 미세아교세포에서 과도하게 흥분된 면역반응을 초래했음을 시사한다.

실시예 6. KI/+ 미세아교세포에서 Nr1d1 프로모터의 과메틸화 확인

프로모터 메틸화가 REV-ERBα 발현과 관련이 있는지 여부를 조사하기 위해 5-azacytidine (5-Aza)을 사용하여 KI/+ 미세아교세포를 탈메틸화하고 qRT-PCR에 의해 Nr1d1 전사체 수준을 결정하였다. 5-Aza로 KI/+ 미세 아교 세포를 24시간 동안 처리한 결과 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이 Nr1d1 mRNA와 단백질 수준이 확인되었고, 이후 IL-6 발현 및 분비가 감소하였으며, 야생형과 비슷한 수준으로 TNF-α의 발현 또는 분비에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 6c 내지 6d를 종합적으로 분석한 결과, 동일한 용량의 5-Aza는 야생형 미세아교세포에서 Nr1d1 수준을 변경하거나 IL-6 및 TNF-α의 발현 및 분비에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

나아가, www.urogene.org/methprimer에서 예측 알고리즘을 사용하여 Nr1d1 프로모터에서 CpG islands를 검색하고 야생형 및 KI/+ 미세아교세포의 전체 게놈 DNA 메틸화 분석을 수행하여 예측된 CpG islands에서 메틸화 수준을 추정하였다. 도 6e에 나타낸 바와 같이 메틸화 시퀀싱 및 시토신 분석의 차등 메틸화는 Nr1d1 프로모터의 많은 CpG islands이 야생형과 비교하여 KI/+ 미세아교세포에서 과메틸화됨을 확인하였다. 또한, 도 6f에 나타낸 바와 같이 전사 시작 부위 상류의 Nr1d1 ~ 2 kbp의 전체 메틸화 비율은 야생형 보다 KI/+ 미세아교세포에서 유의하게 높게 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, Nr1d1 유전자에서 프로모터의 DNA과 메틸화가 KI/+ 미세아교세포에서의 발현을 방해하는 데 중요하다는 것을 유추할 수 있다.

실시예 7. LPS에 의한 반응으로 Psen2 ^N141I/+ 마우스에서의 염증악화 및 기억력 결핍 확인

Psen2 ^N141I/+ 마우스에서 파생된 미세아교세포의 면역 반응이 악화됨에 따라 동물이 염증 및 인지 기능저하를 나타내는 경향이 있음을 확인하기 위하여, 다양한 LPS 농도를 갖는 야생형 및 KI/+ 마우스 간의 면역 반응을 비교하였다. 마우스의 면역반응은 활성이 시작될 무렵부터 몇 시간 내에 최고조에 달하는 경향을 나타내는바, 야생형 및 KI/+ 마우스에 18:00 기준으로 다양한 용량의 LPS를 복강 내 (i.p.)에 주입하고 (Zeitgeber 시간 11:00, 07:00에 점등) 20시간 후 염증반응을 모니터링하였다. 그 결과, 도 7a와 같이 야생형 마우스와 비교하여 KI/+ 마우스는 테스트 된 모든 LPS 용량에서 IL-6의 순환 수준이 높았으며 유전자형 간의 차이는 낮은 용량에서 더 두드러지게 나타나는 것을 확인하였으며, TNF-α의 혈중 농도는 모든 용량에서 유전자형간에 동일하게 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 도 7b에 나타낸 바와 같이 가장 낮은 용량은 (0.35 mg / 체중 kg)은 야생형에서 염증을 일으키지 않았지만 KI/+ 마우스에서 IL-6와 CXCL1, CCL2 및 CCL5와 같은 clock-controlled 사이토카인의 혈중 농도를 증가시키는 것을 확인하였다.

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또한, 미세아교세포의 형태는 그 기능과 밀접한 관련이 있으며, 미세아교세포의 활성화는 모양 변화와 연관되는 것을 특징으로 하며, microgliosis가 Nrd1d1 ^-/- 마우스에서 발생하는 것으로 보고된 바, clock-controlled 사이토카인의 증가된 생산이 미세아교세포의 형태에 반영되는지 여부를 확인하기 위해, 면역 조직화학분석을 통해, 미세아교세포 특이적 마커인 Iba-1에 대항되는 항체를 사용하여 야생형 및 KI/+ 마우스의 해마에서 미세아교세포의 모양을 조사하였다. 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 해마에 있는 미세아교세포는 고도로 분파된 과정을 가진 작은 세포체를 가지고 있으며, 사이토카인 방출 유도가 없는 것과 일치하여 저용량의 LPS는 형태를 변경하지 않은 반면, LPS 주입이 없는 경우에도 KI/+ 마우스의 해마 미세아교세포는 더 짧은 둥근 모양의 확대 된 체세포를 보였으며, 이러한 형태학적 특징은 LPS 주입에 의해 더욱 향상되는 것을 확인하였다. 이에 더하여, 도 7c에 나타낸 바와 같이 미세아교세포의 조직학적 공초점 이미지를 3D 형태로 재구성하고 IMARIS 소프트웨어를 사용하여 다양한 형태학적 매개변수를 측정하였다. 그 결과, 각 미세아교세포의 총 수상 돌기 길이와 수상 돌기 말단 지점은 KI/+ 마우스 및 LPS 주입에 의해 훨씬 더 감소되는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 형태학에 기초하였을 때 microglial 활성화는 KI/+ 마우스에서 분명하게 나타나고 가벼운 LPS 주입에 의해 추가로 유도됨을 확인하였다.

나아가, KI/+ 마우스의 공간 학습능력 및 기억 능력을 검사하기 위해, LPS 주입 20시간 후 Y-maze 테스트를 수행하였다. 그 결과, 도 7e 및 7f에 나타낸 바와 같이, Y-maze에서 팔 교대는 LPS 주입 KI/+ 마우스 그룹에서만 유의하게 감소한 반면, 팔 항목의 총 수는 모든 그룹에서 동일하여 정상적인 운동 기능을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 더하여, 학습 기억력을 추가적으로 분석하기 위해서 LPS 주입 20시간 후 음식 보상을 통한 T-maze 테스트를 수행하였다. 그 결과, 도 7g 및 7h에 나타낸 바와 같이 Y-maze 테스트와 유사한 방식으로 LPS를 주입한 KI/+ 마우스에서만 올바른 팔 입력 성공률이 크게 감소했하는 것을 확인하였다. 또한, KI/+ 마우스는 24 시간 동안 LABORAS에 의해 운동 활동 및 기타 행동을 측정했을 때이 낮은 용량의 LPS에서 자발적인 가정 케이지 행동에서 질병 행동을 개발하지 않았거나 야생형 마우스와 다르지 않게 나타났다. 따라서 유전형 간에 기저 활성 패턴에 대한 차이는 없는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 낮은 용량의 LPS는 면역반응의 과활성을 유도하고 Psen2 ^N141I/+ 마우스에서 IL-6을 포함하는 clock-controlled 사이토카인의 과잉 생산을 통해 기억력 결핍을 유발하는 반면 동일한 용량의 LPS는 야생형 마우스에게는 무해하다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

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Artificial Sequence <220> <223> Hes5 F <400> 17 ggtacagttc ctgaccctgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hes5 R <400> 18 gcagggtcag gaactgtacc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b F <400> 19 aggccacagg tattttgt 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b R <400> 20 gcccatcctc tgtgactc 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr1d1 F <400> 21 tgctggcatg tcccatgaac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr1d1 R <400> 22 gactgtaggt tgtgcggctc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr1d2 F <400> 23 agcttccagt cctcgtcctc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr1d2 R <400> 24 atcctgatgc cacatcccca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arntl F <400> 25 gctgtaccgt ccctgtcaaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arntl R <400> 26 ggtgccttcg tgactctgaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clock F <400> 27 tagcactcct cccagacagc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clock R <400> 28 ctatcatccg tgtccgctgc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry F <400> 29 ctcgcctcgg tcccttctaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cry R <400> 30 cggagcttct cccttgcttg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per 1 F <400> 31 cagtggagtc tggaggaggg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per 1 R <400> 32 ggagccagga gctctgagaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per 2 F <400> 33 gcagaaatgc aaagcagccc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per 2 R <400> 34 ggatgttggc tgggaactcg 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dbp F <400> 35 gagccttctg 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promoter region R <400> 44 gcactcattt ccgaacacaa c 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbp promoter region F <400> 45 ccacacccgc caccagttcg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbp promoter region R <400> 46 tacagcccgg ggagcatcgt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF promoter region F <400> 47 acacttccca actctcaagc 20 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF promoter region R <400> 48 ttgtagaaag accatgcctg t 21

Claims

하기의 단계를 포함하는, 신경염증 유도에 의한 알츠하이머 동물 모델 제조방법:
(a) 표적화 벡터에 Psen2 N141I 돌연변이 유전자를 삽입시키는 단계;
(b) 상기 유전자가 삽입된 벡터를 숙주동물에 삽입하는 단계;
(c) 상기 벡터가 삽입된 숙주동물을 Cre 마우스와 교배하여 후대동물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 후대동물에 LPS를 0.35 mg/kg의 농도로 처리하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 동물 모델은 생체 주기 조절 사이토카인 (Circadian clock-controlled cytokines)의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 동물 모델 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 생체 주기 조절 사이토카인은 CXCL1, CCL2, CCL5 및 IL-6로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 동물 모델 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 동물 모델은 REV-ERBα 단백질의 발현이 감소된 것을 특징으로 하는, 동물 모델 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 동물 모델은 공간 학습능력 및 기억 능력이 감소된 것을 특징으로 하는, 동물 모델 제조방법.
제1항의 제조방법으로 제조된 알츠하이머 동물 모델.
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하기의 단계를 포함하는, 신경염증 유도에 의한 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법:
a) 제1항의 제조방법으로 제조된 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 후보물질을 처리한 동물모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계.
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