JP2021118745A - Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物 - Google Patents

Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒト神経変性疾患および／または炎症性疾患を緊密に再現する改善された動物モデルを提供する。【解決手段】本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、および／または糸球体腎炎についての非ヒト動物モデルを提供する。多様な実施形態では、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤについての非ヒト動物モデルであって、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊（例えば、全コード領域の欠失）によって特徴付けられる非ヒト動物モデルが提供される。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、前記破壊を含む非ヒト動物の１または複数のニューロンに影響を及ぼす。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、前記破壊を含む非ヒト動物の脾臓、頸部リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数に影響を及ぼす。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／１６８，１７１号、２０１５年９月２５日に出願された米国仮出願第６２／２３２，６５８号、および２０１５年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／２４５，３８２号からの優先権の利益を主張し、これらの内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
参照による配列表の組込み
３２６９８＿１０１５２ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇと名付けられた、５６ｋｂの、ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表であって、２０１６年５月１９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁へと提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
神経変性疾患は、身体障害および疾患への主要な寄与因子である。特に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病ともまた称する）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、進行性のニューロン喪失および／または死によって特徴付けられる、まれな神経系障害である。老化は、神経変性疾患の最大の危険性因子とみなされているが、いくつかの遺伝子構成要素が発見されている。例えば、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子内の変異は、以前から、ＡＬＳと関連付けられている。また、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の非コード領域内の、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドの拡張リピートも、ＡＬＳおよびＦＴＤの両方と関係付けられている。現在のところ、いずれの疾患にも治癒は存在しないが、症状を管理および／または緩和するのに一助となる処置は存在する。
炎症性疾患は、免疫系の機能障害または機能不全を結果としてもたらす遺伝子変異によって特徴付けられることが多い多種多様な疾患を含む。例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および糸球体腎炎の機構は、完全には理解されていないが、いくつかの遺伝子構成要素は、患者により提示される、多様な徴候および症状と関係付けられている。このような疾患は、全身性炎症によって特徴付けられ、患者の全身において、多様な異常をもたらす。ＡＬＳおよびＦＴＤの場合と同様に、炎症性疾患のための処置は、症状を改善し、疾患の進行を緩徐化することだけを眼目とする。
大半の治療剤の開発では、多様な実験動物モデルが広範にわたり使用されているが、同定された遺伝子構成要素が疾患を引き起こす、正確な分子機構の解明をもたらすように神経変性疾患および炎症性疾患に取り組む動物モデルは、少数しか存在しない。したがって、遺伝子変異が、神経変性疾患および／または炎症性疾患を引き起こす様態については、大部分が依然として未知のままである。理想的な動物モデルは、同じ遺伝子構成要素を含有し、ヒト疾患の特徴と同様の特徴を表すことになる。種間の遺伝子の差違を踏まえると、ヒト神経変性疾患および／または炎症性疾患を緊密に再現する改善された動物モデルの開発に対する必要は、ほとんど満たされていない。当然ながら、このような改善された動物モデルは、有効な治療用薬剤および／または予防用薬剤の開発において、多大な価値をもたらす。
本発明は、神経変性疾患、神経変性障害、および神経変性状態を処置するために使用されうる、新たな治療剤と、一部の実施形態では、治療レジメンとを同定および開発するための改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系を可能とする非ヒト動物を操作することが所望されるという認識を包含する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｉｎ ｖｉｖｏ系を、炎症性疾患、炎症性障害、および炎症性状態を処置するための、新たな治療剤を同定および開発するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｉｎ ｖｉｖｏ系はまた、自己免疫疾患、自己免疫障害、および自己免疫状態を処置するための、新たな治療剤を同定および開発するためにも使用することができる。さらに、本明細書で記載される非ヒト動物であって、Ｃ９ＯＲＦ７２ポリペプチドが発現しないかまたは産生されないような、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊、および／またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座の他の形の機能的なサイレンシングを含む非ヒト動物も、例えば、ヒトにおける疾患と関連付けられているＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート、Ｃ９ＯＲＦ７２の転写および調節、ならびに／またはＣ９ＯＲＦ７２のレベルの上昇もしくは低下を目標とする治療剤の同定および開発における使用のために所望される。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、神経変性疾患、神経変性障害、および神経変性状態（例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ）についての改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系（またはモデル）を提供する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、炎症性疾患、炎症性障害、および炎症性状態についての改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系（またはモデル）を提供する。
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、および／または糸球体腎炎についての非ヒト動物モデルを提供する。多様な実施形態では、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤについての非ヒト動物モデルであって、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊（例えば、全コード領域の欠失）によって特徴付けられる非ヒト動物モデルが提供される。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、前記破壊を含む非ヒト動物の１または複数のニューロンに影響を及ぼす。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、前記破壊を含む非ヒト動物の脾臓、頸部リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数に影響を及ぼす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、以下の表現型：ＡＬＳ様表現型；脾腫；リンパ節症；糸球体腎炎；マクロファージ、単球、および顆粒球のうちの１または複数の、脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および／または血液への浸潤；Ｆ４／８０＋マクロファージの、腎臓および／または肝臓における浸潤；骨髄中のＢ細胞および／またはＴ細胞の枯渇；血液中のリンパ球の減少；ならびに血清中の１または複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２）の発現の増加、のうちの１または複数を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊（例えば、欠失）は、一部のある特定の実施形態では、レポーター遺伝子を含む核酸配列の挿入から生じる。
一部の実施形態では、そのゲノム内に、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失、すなわち、全てのＣ９ＯＲＦ７２アイソフォーム（すなわち、アイソフォームＶ１、Ｖ２、およびＶ３）をコードするゲノム配列の欠失を含む非ヒト動物が提供される。
一部の実施形態では、欠失は、非ヒト動物のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における、約２６ｋｂのゲノムセグメントの欠失である。一部の実施形態では、欠失は、少なくともエクソン２〜１１（例えば、Ｖ１のエクソン２〜１１）を全体または部分的に包含するゲノムセグメントの欠失である。一部の実施形態では、欠失は、エクソン１〜１１を含む。一部の実施形態では、欠失を有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座は、レポーター遺伝子を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子を、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターに作動可能に連結する。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターは、内因性プロモーターである。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座は、エクソン２のコード領域〜エクソン１１のコード領域を欠き、レポーター遺伝子を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子を、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターに作動可能に連結する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子を、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の、エクソン２の非コード領域（すなわち、５’ＵＴＲの一部）に作動可能に連結し、これにより、レポーター遺伝子を、非ヒト動物のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座の、エクソン１（すなわち、エクソン１ａまたはエクソン１ｂ）、および上流の調節配列（プロモーターを含む）に作動可能に連結する。具体的な実施形態では、レポーター遺伝子と、エクソン２の非コード部分との作動可能な連結を、Ｃ９ＯＲＦ７２ゲノム配列の、エクソン２〜エクソン１１のコード領域内のＡＴＧ開始コドンの直後におけるコドンからの、ターゲティングされた欠失と、ＡＴＧ開始コドンを伴わないレポーターコード配列の、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン２内の、残るＡＴＧ開始コドンの直後のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座の部位への挿入とにより達成する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の発現パターン（またはプロファイル）に類似する。
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、ｌａｃＺである。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失についてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、本明細書で記載される１または複数の表現型を発症し；一部のある特定の実施形態では、表現型は、約８週齢となった後において、検出可能である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生の間に；一部のある特定の実施形態では、約３６週齢となった後において；一部のある特定の実施形態では、約４０週齢となった後において、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤの１または複数の症状を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約３６週齢となった後において、進行性の運動欠損を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約４０週齢となった後において、下位運動ニューロン病変を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約３６週齢となった後において、体重の減少をきたす。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生の間に、運動ニューロンにおけるミトコンドリア機能不全を発症し；一部のある特定の実施形態では、ミトコンドリア機能不全は、ミトコンドリア呼吸、基底呼吸、最大呼吸、予備呼吸能、ＡＴＰ産生、およびプロトン漏出のうちの１または複数の減少によって特徴付けられ；一部のある特定の実施形態では、ミトコンドリア機能不全は、対照非ヒト動物または基準非ヒト動物からの運動ニューロンについてのミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比と比較した、ミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比の増加によって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生時の間に；一部のある特定の実施形態では、約３５週齢となった後、端点を含めて約３５〜４１週齢となった後、または端点を含めて約３５〜６０週齢となった後において、糸球体腎炎の１または複数の症状を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後において、脾腫を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後において、リンパ節症を発症する。一部の実施形態では、リンパ節症は、端点を含めて約１２〜１８週齢となった後、または端点を含めて約１８〜６０週齢となった後において、触知可能である。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、形質細胞、単球、顆粒球、およびＦ４／８０＋マクロファージのうちの１または複数の浸潤によって特徴付けられ；一部のある特定の実施形態では、浸潤は、約８週齢となった後において、検出可能であり；一部のある特定の実施形態では、浸潤は、６０週齢までに検出可能である。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後において、腎臓内および／または肝臓内のＦ４／８０＋マクロファージの浸潤をきたす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後において、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＭＣＰ−１のうちの１または複数の血清サイトカインレベルの上昇をきたす。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後の、ＩＬ−１２の血清レベルの上昇であって、基準非ヒト動物または対照非ヒト動物と比較して、約６倍またはこれを超える上昇をきたす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後、端点を含めて約３５〜４１週齢となった後、または端点を含めて約３５〜６０週齢となった後において、基底膜の肥厚、円柱形成（または硝子円柱形成）、免疫複合体の沈着、膜増殖性糸球体腎炎、間質性単核球性炎症（interstitial mononuclear
inflammation）、糸球体硬化症、好塩基性尿細管、またはこれらの組合せによって特徴付けられる腎疾患を発症する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数において、骨髄系樹状細胞集団の増加をきたす。一部の実施形態では、骨髄系樹状細胞集団は、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋として特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約８週齢となった後において；一部のある特定の実施形態では、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後において、１または複数の自己抗体の血清レベルの上昇をきたす。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約８週齢〜約６０週齢の間において、１または複数の自己抗体の血清レベルの上昇をきたす。一部の実施形態では、１または複数の自己抗体は、抗リウマチ因子（抗ＲＦ）抗体、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、抗カルジオリピン抗体、およびこれらの組合せから選択される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数において、Ｆ４／８０＋マクロファージレベルの上昇をきたす。一部の実施形態では、Ｆ４／８０＋マクロファージは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｌｙ６Ｇ−として特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数において、Ｔ細胞集団の増加をきたす。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋、ＣＤ８＋ＰＤ１＋、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋、ＣＤ４＋ＣＤ６９＋またはＣＤ４＋ＰＤ１＋として特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓内および／またはリンパ節内の、調節性Ｔ細胞集団の増加であって、調節性Ｔ細胞集団が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋として特徴付けられる増加をきたす。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、約２６週齢となった後の、脾臓内、リンパ節（例えば、頸部リンパ節または「ＣＬＮ」、および腸間膜リンパ節または「ＭＬＮ」）内、および／または血液中の、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞の増加であって、Ｔｆｈ細胞集団が、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４４＋ＩＣＯＳ＋ＰＤ−１＋Ｂｃｌ−６＋として特徴付けられる増加をきたす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、端点を含めて約８〜６０週齢となった後の、脾臓、リンパ節、および骨髄のうちの１または複数において、形質細胞集団の増加をきたす。一部の実施形態では、形質細胞集団は、ＣＤ４５＋ＣＤ１９−Ｂ２２０−ＣＤ１３８＋またはＣＤ４５＋ＣＤ１９ｉｎｔＢ２２０ｉｎｔＣＤ１３８＋として特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生の間に、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生の間に、ループス腎炎を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、増殖性糸球体腎症を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、発生の間に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と関連する、１または複数の表現型を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、自己抗体力価および血清サイトカインの上昇、リンパ節症、脾腫、ならびにえり抜きの骨髄系コンパートメントおよびリンパ系コンパートメントの拡大、またはこれらの組合せからなる群から選択される、１または複数の表現型または症状を発症する。一部の実施形態では、１または複数の表現型または症状は、８週という早期において観察される。一部の実施形態では、１または複数の表現型または症状は、端点を含めて約１８週〜約２４週の間において観察される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、単離非ヒト細胞または単離非ヒト組織が提供される。一部の実施形態では、単離細胞または単離組織は、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含む。一部の実施形態では、細胞は、ニューロン細胞またはニューロン系に由来する細胞である。一部の実施形態では、細胞は、リンパ系統または骨髄系統に由来する。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、眼、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組合せから選択される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の単離細胞から作製される不死化細胞株が提供される。
一部の実施形態では、そのゲノムが本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座、または本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における欠失を含む、非ヒト胚性幹細胞が提供される。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、齧歯動物胚性幹細胞である。一部のある特定の実施形態では、齧歯動物胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９株、Ｃ５７ＢＬ株、またはこれらの混合物に由来する。一部のある特定の実施形態では、齧歯動物胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９株とＣ５７ＢＬ株との混合物である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト胚性幹細胞の使用であって、遺伝子改変非ヒト動物を作製するための使用が提供される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含むマウスを作製するのに使用される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、ラット胚性幹細胞であり、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含むラットを作製するのに使用される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含む非ヒト胚性幹細胞を含むか、これから作製されるか、これから得られるか、またはこれから生成される非ヒト胚が提供される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト胚は、齧歯動物胚であり；一部の実施形態では、マウス胚であり；一部の実施形態では、ラット胚である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト胚の使用であって、遺伝子改変非ヒト動物を作製するための使用が提供される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト胚は、マウス胚であり、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含むマウスを作製するのに使用される。一部のある特定の実施形態では、非ヒト胚は、ラット胚であり、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含むラットを作製するのに使用される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸構築物（またはターゲティング構築物、またはターゲティングベクター）が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸構築物は、５’から３’へと、非ヒト（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の５’部分と相同なポリヌクレオチドを含む非ヒトターゲティングアーム、第１のリコンビナーゼ認識部位、リコンビナーゼ遺伝子に作動可能に連結した第１のプロモーター、選択用マーカーに作動可能に連結した第２のプロモーター、第２のリコンビナーゼ認識部位、本明細書で記載されるレポーター遺伝子、および非ヒト（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の３’部分と相同なポリヌクレオチドを含む非ヒトターゲティングアームを含む。一部の実施形態では、非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座の３’部分は、非ヒト（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン１１内の終止コドンの下流におけるゲノム配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の５’部分は、非ヒト（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン２内の開始コドンの上流におけるゲノム配列を含む。多くの実施形態では、第１のリコンビナーゼ認識部位と、第２のリコンビナーゼ認識部位とは、切出しを導くような向きである。多くの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、第１のリコンビナーゼ認識部位と、第２のリコンビナーゼ認識部位とを認識するリコンビナーゼをコードする。多くの実施形態では、第１のプロモーターは、分化細胞内のリコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動するが、未分化細胞内のリコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動しない。多くの実施形態では、第１のプロモーターは、転写的にコンピテントであり、発生的に調節されている。
一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ２３７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、Ｄｒｅ、ｒｏｘ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ（例えば、Ｆｌｐｅ、Ｆｌｐｏ）、およびＤｒｅからなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、第１のリコンビナーゼ認識部位と、第２のリコンビナーゼ認識部位とは、ｌｏｘ（例えば、ｌｏｘＰ）部位であり、リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。
一部の実施形態では、第１のプロモーターは、プロタミン（Ｐｒｏｔ；例えば、Ｐｒｏｔ１またはＰｒｏｔ５）、Ｂｌｉｍｐ１、Ｂｌｉｍｐ１（１ｋｂの断片）、Ｂｌｉｍｐ１（２ｋｂの断片）、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、およびＰａｘ３からなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、表２に掲載されるプロモーターから選択される。一部のある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７であるかまたはこれを含む。
一部の実施形態では、選択用マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＵｂＣプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ｐｇｋ１プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、およびＲＯＳＡ２６プロモーターからなる群から選択される。一部のある特定の実施形態では、選択用マーカーは、ｎｅｏｒであり、第２のプロモーターは、Ｕｂｉである。
一部の実施形態では、そのゲノムが、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む非ヒト動物を作製する方法であって、（ａ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列を欠失させるように、核酸配列を、非ヒト胚性幹細胞へと導入するステップであって、核酸が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座と相同なポリヌクレオチドを含むステップと；（ｂ）（ａ）から、遺伝子改変された非ヒト胚性幹細胞を得るステップと；（ｃ）（ｂ）の、遺伝子改変された非ヒト胚性幹細胞を使用して、非ヒト動物を作り出すステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を作製する方法は、欠失についてホモ接合性の非ヒト動物を作り出すように、（ｃ）において生み出された非ヒト動物を交配させるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、核酸配列は、本明細書で記載される核酸構築物であるか、これを含むか、またはこの中に現れる。一部の実施形態では、核酸配列は、１または複数の選択マーカーを含む。一部の実施形態では、核酸配列は、１または複数の部位特異的組換え部位を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、切出しを導くように配向させたリコンビナーゼ認識部位に挟まれた、リコンビナーゼ遺伝子と選択マーカーとを含む。一部の実施形態では、核酸配列は、選択マーカーの下流にあるレポーター遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、核酸配列は、分化細胞内のリコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動するが、未分化細胞内のリコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動しないプロモーターに作動可能に連結しているリコンビナーゼ遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、転写的にコンピテントであり、発生的に調節されたプロモーターに作動可能に連結しているリコンビナーゼ遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、配列番号５、配列番号６、または配列番号７であるかまたはこれを含むプロモーターに作動可能に連結しているリコンビナーゼ遺伝子を含む。
一部の実施形態では、そのゲノムが、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを、それが、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含むように改変し、これにより、前記非ヒト動物を作製するステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法により得ることができるか、これから生み出されるか、または作製される非ヒト動物が提供される。
一部の実施形態では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）についての非ヒト動物モデルであって、非ヒト動物が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含むゲノムを有する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失により得られる、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）についての非ヒト動物モデルであって、ここで、非ヒト動物が、発生の間に、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤの１または複数の症状を発症する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、糸球体腎炎についての非ヒト動物モデルであって、非ヒト動物が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含むゲノムを有する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失により得られる、糸球体腎炎についての非ヒト動物モデルであって、ここで、非ヒト動物が、発生の間に、糸球体腎炎の１または複数の症状を発症する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、リンパ増殖性疾患についての非ヒト動物モデルであって、非ヒト動物が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含むゲノムを有する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失により得られる、リンパ増殖性疾患についての非ヒト動物モデルであって、ここで、非ヒト動物が、発生の間に、免疫系の調節不全または機能不全の１または複数の症状を発症する、非ヒト動物モデルが提供される。
一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態を処置するための、治療剤候補を同定するための方法であって、（ａ）候補薬剤を、そのゲノムが、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む非ヒト動物へと投与するステップと；（ｂ）１または複数のアッセイを実施して、候補薬剤が、疾患、障害、または状態と関連する１または複数の徴候、症状、および／または状態に対して効果を及ぼすのかどうかを決定するステップと；（ｃ）疾患、障害、または状態と関連する、１または複数の徴候、症状、および／または状態に対して効果を及ぼす候補薬剤を、治療剤候補として同定するステップとを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態である。一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、炎症性疾患、炎症性障害、または炎症性状態である。一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態である。
一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ；カナル−スミス症候群としてもまた公知である）である。一部の実施形態では、ＡＬＰＳは、ＩＬ−１０、抗リウマチ因子（抗ＲＦ）抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、またはこれらの組合せの血清レベルの増加によって特徴付けられる。
一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、ループス腎炎である。一部の実施形態では、ループス腎炎は、メサンギウムの（mesangeal）増殖および
／または拡大によって特徴付けられる。一部の実施形態では、ループス腎炎は、１または複数の尿細管異常によって特徴付けられる。一部の実施形態では、１または複数の尿細管異常は、膨張、円柱形成、好塩基球増加、およびこれらの組合せから選択される。
一部の実施形態では、非ヒト動物における疾患、障害、または状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。一部の実施形態では、ＳＬＥは、リンパ系の過形成、Ｔ細胞の活性化、血清抗核抗体（ＡＮＡ）の上昇、ならびに心臓、肺、肝臓、皮膚、関節、神経系、および腎臓に影響を及ぼす全身性炎症のうちの１または複数によって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、炎症性疾患、炎症性障害、または炎症性状態を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、リンパ増殖性疾患、リンパ増殖性障害、またはリンパ増殖性状態を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物の、ループス腎炎を処置するための医薬の製造における使用が提供される。
一部の実施形態では、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。一部の実施形態では、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である。一部の実施形態では、炎症性疾患、炎症性障害、または炎症性状態は、糸球体腎炎である。一部の実施形態では、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態は、糸球体腎炎、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、ループス腎炎、または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態は、血清自己抗体濃度の著明な増加によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書で記載される、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態は、１または複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−αなど）の血清レベルの著明な上昇によって特徴付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、リンパ増殖性疾患、リンパ増殖性障害、またはリンパ増殖性状態は、脾臓、骨髄、リンパ節（複数可）、腎臓、または血液のうちの１または複数における、１または複数の免疫細胞の著明な増加によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書で記載される、リンパ増殖性疾患、リンパ増殖性障害、またはリンパ増殖性状態は、１または複数のリンパ球の調節解除または調節不全によって特徴付けられる。
多様な実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失は、本明細書で記載される欠失を含む。多様な実施形態では、非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座は、本明細書で記載される非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含む。多様な実施形態では、非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座は、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座（例えば、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座またはラットＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座）である。
多様な実施形態では、本明細書で記載される１または複数の表現型を、基準または対照と比較する。一部の実施形態では、基準または対照は、本明細書で記載される改変を有するか、本明細書で記載される改変とは異なる改変を有するか、または改変を有さない（例えば、野生型非ヒト動物）非ヒト動物を含む。
多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、齧歯動物であり；一部の実施形態では、マウスであり；一部の実施形態では、ラットである。
本出願で使用される「約」および「およそ」という用語は、同義語として使用される。本出願で、約／およそを伴うかまたは伴わずに使用される任意の数値は、当業者により十分に理解される、任意の通常の変動（fluctuation）を網羅とすることが意図される。
本明細書で提示される非ヒト動物、細胞、および方法の、他の特色、対象、および利点は、以下の、ある特定の実施形態の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、ある特定の実施形態を指し示すが、例示だけを目的として示されるものであり、限定を目的として示されるものではないことを理解されたい。当業者には、詳細な説明から、本発明の範囲内の、多様な変化および改変が明らかとなる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
齧歯動物であって、そのゲノム内に、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む齧歯動物。
（項目２）
前記欠失が、少なくともエクソン２〜１１の全体または部分的な欠失を含む、項目１に記載の齧歯動物。
（項目３）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座が、レポーター遺伝子を含む、前記項目のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目４）
前記レポーター遺伝子が、Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターに作動可能に連結している、項目３に記載の齧歯動物。
（項目５）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターが、内因性プロモーターである、項目４に記載の齧歯動物。
（項目６）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座が、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分を含むＣ９ｏｒｆ７２ゲノム配列を欠き、レポーター遺伝子を含む、項目３から５のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目７）
前記レポーター遺伝子が、前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のエクソン１に作動可能に連結している、項目６に記載の齧歯動物。
（項目８）
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択される、項目３から７のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目９）
ラットまたはマウスである、前記項目のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目１０）
前記欠失についてホモ接合性である、項目１に記載の齧歯動物。
（項目１１）
前記欠失についてヘテロ接合性である、項目１に記載の齧歯動物。
（項目１２）
発生の間、任意選択で、約３６週齢となった後、または約４０週齢となった後において、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤの１または複数の症状を発症する、項目１から１１のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目１３）
約３６週齢となった後において、進行性の運動欠損を発症し、約４０週齢となった後において、下位運動ニューロン病変を発症し、かつ／または約３６週齢となった後において、体重の減少をきたす、項目１から１２のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目１４）
発生の間に、以下：
（ｉ）運動ニューロンにおけるミトコンドリア機能不全であって、ミトコンドリア呼吸、基底呼吸、最大呼吸、予備呼吸能、ＡＴＰ産生、およびプロトン漏出のうちの１もしくは複数の減少によって特徴付けられるか；または対照齧歯動物もしくは基準齧歯動物の運動ニューロンのミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比と比較した、ミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比の増加によって特徴付けられるミトコンドリア機能不全；
（ｉｉ）任意選択で、約３５週齢となった後、または端点を含めて約３５〜４１週齢となった後の、糸球体腎炎の１または複数の症状；
（ｉｉｉ）約８週齢となった後の脾腫；
（ｉｖ）約８週齢となった後のリンパ節症であって、任意選択で、端点を含めて約１２〜１８週齢となった後の、触知可能であるリンパ節症；
（ｖ）形質細胞、単球、顆粒球、およびＦ４／８０＋マクロファージのうちの１または複数の浸潤であって、任意選択で、約８週齢となった後の、かつ、６０週齢までに検出可能である浸潤；
（ｖｉ）約３５週齢となった後の、腎臓内のＦ４／８０＋マクロファージの浸潤；
（ｖｉｉ）約８週齢となった後の、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＭＣＰ−１のうちの１または複数の血清サイトカインレベルの増加；
（ｖｉｉｉ）約８週齢となった後の、ＩＬ−１２の血清レベルの増加であって、基準非ヒト動物または対照非ヒト動物と比較して、約６倍またはこれを超える増加；
（ｉｘ）端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、基底膜の肥厚、円柱形成、免疫複合体の沈着、膜増殖性糸球体腎炎、間質性単核球性炎症、糸球体硬化症、好塩基性尿細管、またはこれらの組合せによって特徴付けられる腎疾患；
（ｘ）端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数における、骨髄系樹状細胞集団の増加であって、任意選択で、該骨髄系樹状細胞集団が、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋として特徴付けられる増加；
（ｘｉ）約８週齢となった後の、１または複数の自己抗体の血清レベルの増加であって、任意選択で、１または複数の自己抗体が、抗リウマチ因子（抗ＲＦ）抗体、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、抗カルジオリピン抗体、およびこれらの組合せから選択される増加；
（ｘｉｉ）端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数における、Ｆ４／８０＋マクロファージレベルの増加であって、任意選択で、該Ｆ４／８０＋マクロファージが、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｌｙ６Ｇ−として特徴付けられる増加；
（ｘｉｉｉ）端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液のうちの１または複数における、Ｔ細胞集団の増加であって、任意選択で、該Ｔ細胞集団が、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋、ＣＤ８＋ＰＤ１＋、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋、ＣＤ４＋ＣＤ６９＋またはＣＤ４＋ＰＤ１＋として特徴付けられる増加；
（ｘｉｖ）端点を含めて約２８〜３５週齢となった後の、脾臓および／もしくはリンパ節における、調節性Ｔ細胞集団の増加であって、該調節性Ｔ細胞集団が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋として特徴付けられる増加；または約２６週齢となった後の、脾臓、リンパ節、および／もしくは血液における、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞の増加であって、該Ｔｆｈ細胞集団が、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４４＋ＩＣＯＳ＋ＰＤ−１＋Ｂｃｌ−６＋として特徴付けられる増加；
（ｘｖ）端点を含めて約８〜６０週齢となった後の、脾臓、リンパ節、および骨髄のうちの１または複数における、形質細胞集団の増加であって、任意選択で、該形質細胞集団が、ＣＤ４５＋ＣＤ１９−Ｂ２２０−ＣＤ１３８＋またはＣＤ４５＋ＣＤ１９ｉｎｔＢ２２０ｉｎｔＣＤ１３８＋として特徴付けられる増加；
（ｘｖｉ）自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）；あるいは
（ｘｖｉｉ）発生の間におけるループス腎炎
のうちの１または複数を発症する、項目１から１２のいずれか一項に記載の齧歯動物。
（項目１５）
そのゲノムが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む単離齧歯動物細胞または単離齧歯動物組織。
（項目１６）
項目１５に記載の単離齧歯動物細胞から作製された不死化細胞株。
（項目１７）
齧歯動物胚性幹細胞であって、そのゲノムが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む齧歯動物胚性幹細胞。
（項目１８）
項目１７に記載の胚性幹細胞から生み出された齧歯動物胚。
（項目１９）
齧歯動物のゲノムが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含む齧歯動物を作製する方法であって、
齧歯動物の該ゲノムを、それが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列の欠失を含むように改変し、これにより、該齧歯動物を作製するステップ
を含む方法。
（項目２０）
前記改変するステップを、
（ａ）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における全コード配列を欠失させるように、核酸配列を、齧歯動物胚性幹細胞へと導入するステップであって、核酸配列が、該Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座と相同なポリヌクレオチドを含むステップと；
（ｂ）（ａ）から、遺伝子改変された齧歯動物胚性幹細胞を得るステップと；
（ｃ）（ｂ）の、該遺伝子改変された齧歯動物胚性幹細胞を使用して、齧歯動物を作り出すステップと
を含むプロセスにより達成する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記核酸配列が、１または複数の選択マーカーを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記核酸配列が、１または複数の部位特異的組換え部位を含む、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
前記核酸配列が、切出しを導くように配向させたリコンビナーゼ認識部位に挟まれた、リコンビナーゼ遺伝子と選択マーカーとを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸配列が、任意選択で前記選択マーカーの下流にあるレポーター遺伝子をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記リコンビナーゼ遺伝子が、分化細胞内の該リコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動するが、未分化細胞内の該リコンビナーゼ遺伝子の発現は駆動しないプロモーターに作動可能に連結している、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記リコンビナーゼ遺伝子が、転写的にコンピテントであり、発生的に調節されたプロモーターに作動可能に連結している、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記プロモーターが、配列番号５、配列番号６、または配列番号７であるかまたはこれを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記欠失についてホモ接合性の齧歯動物を作り出すように、（ｃ）において生み出された前記齧歯動物を交配させるステップをさらに含む、項目２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記欠失が、少なくともエクソン２〜１１の全体または部分的な欠失を含む、項目１９または２０に記載の方法。
（項目３０）
前記欠失が、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座が、レポーター遺伝子を含む、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記レポーター遺伝子が、Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターに作動可能に連結している、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターが、内因性プロモーターである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座が、エクソン２〜１０を欠き、レポーター遺伝子を含む、項目３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記レポーター遺伝子が、前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のエクソン１に作動可能に連結している、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択される、項目３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記齧歯動物が、ラットまたはマウスである、項目１９から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
項目１９から３７のいずれか一項に記載の方法により得ることができる齧歯動物。
（項目３９）
齧歯動物における疾患または状態を処置するための、治療剤候補を同定する方法であって、
（ａ）候補薬剤を、項目１から１４のいずれか一項に記載の齧歯動物へと投与するステップと；
（ｂ）１または複数のアッセイを実施して、該候補薬剤が、該疾患または状態と関連する１または複数の徴候、症状、および／または状態に対して効果を有するのかどうかを決定するステップと；
（ｃ）該疾患または状態と関連する、該１または複数の徴候、症状、および／または状態に対して効果を有する該候補薬剤を、該治療剤候補として同定するステップと
を含む方法。
（項目４０）
前記疾患または状態が、神経変性疾患または神経変性状態、炎症性疾患または炎症性状態、自己免疫疾患または自己免疫状態、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、およびループス腎炎からなる群から選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ＡＬＰＳが、ＩＬ−１０、抗リウマチ因子（抗ＲＦ）抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、またはこれらの組合せの血清レベルの増加によって特徴付けられ；ループス腎炎が、メサンギウムの増殖および／もしくは拡大、または１もしくは複数の尿細管異常によって特徴付けられる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記神経変性疾患もしくは神経変性状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）であるか、前記炎症性疾患もしくは炎症性状態が、糸球体腎炎であるか、または前記自己免疫疾患もしくは自己免疫状態が、糸球体腎炎である、項目４０に記載の方法。
本明細書に含まれる図面であって、以下の図から構成される図面は、例示だけを目的とするものであり、限定を目的とするものではない。特許または出願ファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面（複数可）を伴う、本特許または特許出願公開の複製は、これを要望し、必要な手数料を支払えば、米国特許商標庁により提供される。
図１Ａ（上ボックス）は、報告されている、３つのマウスＣ９ｏｒｆ７２転写物アイソフォーム（Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３）と、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座を破壊するための標的化欠失戦略とについての概略の例示（実寸ではない）を示す図である。上流におけるマウス相同性アーム（またはマウスＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン２内の開始コドン上流におけるゲノム配列であり、この開始コドンを含むゲノム配列を含有する「ｍＨＵ」）、ｌａｃＺレポーター遺伝子（ＡＴＧ開始コドンを伴わない）、自己欠失薬物選択カセット（マウスプロタミン１（Ｐｒｍ１）プロモーターへと連結され、ｌｏｘＰ部位により挟まれた、ネオマイシン耐性遺伝子およびＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含む）、および下流におけるマウス相同性アーム（またはマウスＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン１１の終止コドンの４９ｂｐ下流におけるゲノム配列を含有する「ｍＨＤ」）を含むターゲティングベクターを作出した。相同組換えを施したら、予測される全てのマウスＣ９ｏｒｆ７２アイソフォームのＣ９ｏｒｆ７２コード配列を含む、約２６ｋｂのマウスゲノム領域（すなわち、マウスＣ９ｏｒｆ７２のエクソン２内のＡＴＧ開始コドンの直後におけるコドンから始まり、エクソン３〜１０、介在するイントロン、およびマウスＣ９ｏｒｆ７２のエクソン１１内の３’ＵＴＲの４９ｂｐに至るコード配列）を除去し；ｌａｃＺレポーター遺伝子（ＡＴＧ開始コドンを伴わない）を、マウスＣ９ｏｒｆ７２の、残る内因性ＡＴＧ開始コドンの直後に挿入した。結果として得られる改変マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座を、図１Ａ（下ボックス）に描示する。表現型解析の前に、自己欠失技術を利用して、ネオマイシンカセットを除去し、マウスＣ９ｏｒｆ７２プロモーターの制御下にある、ｌａｃＺレポーターおよび１つのｌｏｘＰ部位を残した。ネオマイシンカセットを欠失させた後における改変マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座を、図１Ａ（下ボックス）に描示する。挿入されたｌａｃＺ配列から始まり、３’ｌｏｘＰ部位へと至る、改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヌクレオチド配列を、配列番号８に示し、エクソン１ａから始まり、３’ＵＴＲへと至る、改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヌクレオチド配列を、配列番号９に示す。
図１Ｂは、野生型（ＷＴ）マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスのＣ９ｏｒｆ７２（上；３１１００４３０２１ＲＩＫとしてもまた公知である）、およびＭＯＢキナーゼ活性化因子３Ｂ（Ｍｏｂ３ｂ；下）についてのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）発現解析を示す図である。
図２Ａ〜２Ｌは、野生型（ｎ＝９）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ｎ＝１１）マウスにおいて測定されるＡＬＳ様表現型を示す図である。図２Ａ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な生存パーセント（ｙ軸）を示す図であり；図２Ｂ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な体重変化（ｙ軸；グラム単位）を示す図であり；図２Ｃ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均運動機能障害スコアを示す図であり；図２Ｄ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均振戦スコアを示す図であり；図２Ｅ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均硬直スコアを示す図であり；図２Ｆ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的なロータロッド上の最長時間（ｙ軸；秒単位）を示す図であり；図２Ｇ：例示的なオープンフィールド自発運動行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる不動状態（左；ｙ軸；秒単位）および立ち上がり時間（右；ｙ軸；秒単位）を示す図であり；図２Ｈ：例示的なキャットウォーク行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる平均歩幅長（上左、ｙ軸；センチメートル［ｃｍ］）、規則性指数パーセント（ｙ軸）で表示される肢間協調（上右）、および時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、平均起立（mean stand）（ｙ軸；秒単位）として表示される立脚期（下中）を示す図であり；図２Ｉ：６０週齢の野生型（ＷＴ、ｎ＝５）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス（ｎ＝５）に由来する、例示的な運動ニューロンについての画像、ならびに野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスについての、例示的な運動ニューロンカウント（下左）、平均面積（μｍ２単位、下中央、ｐ＜０．０００１）、および細胞体面積（細胞個数単位、下右）を示す図であり；１０例の運動ニューロンを、スライド１枚当たりの細胞体面積（群１つ当たりのスライド３枚ずつ）について測定したところ、腫脹により、低酸素症および細胞損傷が指し示され；図２Ｊ：３２〜６０週齢の野生型（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋；ｎ＝１４）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ｎ＝１７）マウスにおける、時間経過にわたる、例示的な生存パーセント（上左）、グラム単位の体重変化（上右）、時間経過にわたる平均運動機能障害スコア（下左）、時間経過にわたる平均振戦スコア（下中央）、および時間経過にわたる平均硬直スコア（下右）を示す図であり；図２Ｋ：３２〜６０週齢の野生型（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋；ｎ＝１４）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ｎ＝１７）マウスにおける、時間経過にわたる、例示的なロータロッド上の最長時間（上左）、オープンフィールド自発運動行動、例えば、時間経過にわたる不動状態（上中央）、および時間経過にわたる立ち上がり時間（上右）、キャットウォーク行動、例えば、時間経過にわたる平均歩幅長（下左）、および時間経過にわたる規則性指数パーセントで表示される肢間協調（下中央）、ならびに時間経過にわたる総移動距離（下右）を示す図であり；図２Ｌ：野生型（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋）マウス、ヘテロ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−）マウス、およびホモ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２−／−）マウスにおける、時間経過にわたる、例示的な平均運動機能障害スコア（上左）、時間経過にわたる平均振戦スコア（上中央）、時間経過にわたる平均硬直スコア（上右）、および握力（グラム単位の力）を示す図である。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図３Ａ〜３ＡＬは、野生型マウス（ｎ＝≧４）、およびＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座内に破壊を有するマウス（ｎ＝≧４）において測定された、免疫表現型解析の結果を示す図である。図３Ａ：解剖された雌野生型（ＷＴ）マウスおよび雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについての例示的な画像であって、８週（上列）および１８週（下列）の、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、腫大頸部リンパ節（矢印）を示す画像と、雌野生型（ＷＴ）マウス、雌Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（ＨＥＴ）マウス、および雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、脾臓重量（右、グラム単位）とを示す図であり；図３Ｂ：解剖された雄野生型（ＷＴ）マウスおよび雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについての例示的な画像であって、９〜１０週（上列）および１８週（下列）の、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、腫大頸部リンパ節（矢印）を示す画像と、雄野生型（ＷＴ）マウス、雄Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（ＨＥＴ）マウス、および雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、脾臓重量（右、グラム単位）とを示す図であり；図３Ｃ：３７週の雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスおよび５６週の雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについての例示的な画像であって、腫大頸部リンパ節（矢印）を示す画像を示す図であり；図３Ｄ：解剖された３０〜３５週齢の雌野生型マウス（上列）および雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウス（中央列）についての例示的な画像であって、腫大頸部リンパ節（矢印）を示す画像と、体重（グラム単位）、脾臓重量（グラム単位）、および体重に対して正規化された脾臓重量（体重％として）（下列）とを示し；野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（−／−）マウスに由来する、解剖された脾臓（下左）についての例示的な画像を示す図であり；図３Ｅ：鑑別を伴う例示的なＣＢＣデータであって、３４〜３８週齢の雄野生型（ＷＴ）マウス、雄Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（ＨＥＴ）マウス、および雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウス（細胞型は、各グラフの上方に指し示す）における、総白血球数と、多様な免疫細胞型の循環集団とを示すＣＢＣデータを示す図であり；図３Ｆ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された脾臓組織および頸部リンパ節組織についての例示的な画像であって、４倍の拡大能で、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された画像を示す図であり；図３Ｇ：Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された頸部リンパ節組織についての例示的な画像であって、６０倍の拡大能で、ヘマトキシリンおよびエオシン（青矢印：形質細胞様形状を伴う細胞；黄矢印：好中球；緑矢印：マクロファージ型細胞；赤矢印：モット細胞）により染色された画像を示す図であり；図３Ｈ：野生型（ＷＴ）雄マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）雄マウスにおける、脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液に由来する、例示的な陽性Ｂ細胞（ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ３−、Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋）のパーセントを示す図であり；図３Ｉ：特異的細胞表面抗原を発現する、多様な段階における、例示的な形質細胞であって、９〜１０週（黒色バー）、１８週（ライトグレーバー）、および５７〜６０週（ダークグレーバー）の、雄野生型（ＷＴ）マウスおよび雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスの脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液から単離された形質細胞を示す図であり；図３Ｊ：特異的細胞表面抗原を発現する、多様な段階における、例示的な形質細胞であって、８週（黒色バー）、１８週（ライトグレーバー）、および３０〜３５週（ダークグレーバー）の、雌野生型（ＷＴ）マウスおよび雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスの脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液から単離された形質細胞を示す図であり；図３Ｋ：特異的細胞表面抗原を発現する、多様な段階における、例示的な陽性骨髄系細胞であって、９〜１０週（黒色バー）、１８週（ライトグレーバー）、および５７〜６０週（ダークグレーバー）の、雄野生型（ＷＴ）マウスおよび雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスの脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液から単離された陽性骨髄系細胞のパーセントを示す図であり；図３Ｌ：特異的細胞表面抗原を発現する、多様な段階における、例示的な陽性骨髄系細胞であって、８週（黒色バー）、１８週（ライトグレーバー）、および３０〜３５週（ダークグレーバー）の、雌野生型（ＷＴ）マウスおよび雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスの脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液から単離された陽性骨髄系細胞のパーセントを示す図であり；図３Ｍ：３０〜３５週の雌野生型（ＷＴ）マウスおよび雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの、脾臓内、頸部リンパ節内、骨髄中、腎臓内、および血液中の、例示的な陽性マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、Ｌｙ６Ｇ−）細胞のパーセントを示す図であり；図３Ｎ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された脾臓についての例示的な画像であって、４倍の拡大能で、多様なマーカー（各画像の下方に指し示される）により染色された画像を示す図であり；図３Ｏ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された頸部リンパ節についての例示的な画像であって、４倍の拡大能で、多様なマーカー（各画像の下方に指し示される；矢印：ＣＤ１３８により間欠的に染色された細胞）により染色された画像を示す図であり；図３Ｐ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された脾臓および頸部リンパ節についての例示的な画像であって、４倍および６０倍の拡大能で、Ｆ４／８０により染色された画像を示す図であり；図３Ｑ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内、頸部リンパ節内、骨髄中、および腎臓内の、例示的な総細胞カウントを示す図である。細胞は、ＦＡＣＳ解析の前に、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントした。これは、目的の表面マーカーについて陽性の細胞のパーセントでデータを表示することに加えて、前記マーカーについて陽性の細胞の総数を計算するために行った。これらのカウントは、赤血球溶解の後で実施したが、ヌルマウスでは、野生型と比較して、総細胞カウントが増加したので、これらのカウントはまた、膨大な免疫浸潤（白血球）も表す。図３Ｒ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内および骨髄中の骨髄系の樹状細胞（左；ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣＩＩ＋）およびＮＫ細胞（右；ＮＫｐ４６ｍｉｄ、ＣＤ４９ｂ＋）について、例示的な陽性パーセントおよび細胞カウントを示す図であり；図３Ｓ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４５＋細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｔ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ８＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｕ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｖ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｗ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｘ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ８＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｙ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３Ｚ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３ＡＡ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４＋ＰＤ１＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３ＡＢ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの多様な組織内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞について、例示的な陽性パーセント（上列）および総細胞カウント（下列）を示す図であり；図３ＡＣ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団（上左）、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団（下左）、ＣＤ８＋ＣＤ１２７＋Ｔ細胞集団（上右）、およびＣＤ４＋ＣＤ１２７＋Ｔ細胞集団（下右）について、例示的な陽性パーセント（各対の左）および総細胞カウント（各対の右）を示す図であり；図３ＡＤ：１８週齢の雄野生型（ＷＴ）マウス、雄Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、および雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、多様なサイトカインの発現を示す、例示的なサイトカインパネル（サイトカインは、各グラフの上方に指し示す）を示す図であり；図３ＡＥ：８〜５８週齢の雄野生型（ＷＴ）マウス、雄Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、および雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、多様なサイトカインの発現を示す、例示的なサイトカインパネル（サイトカインは、各グラフの上方に指し示す）を示す図であり；図３ＡＦ：８〜３８週齢の雌野生型（ＷＴ）マウス、雌Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、および雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、多様なサイトカインの発現を示す、例示的なサイトカインパネル（サイトカインは、各グラフの上方に指し示す）を示す図であり；図３ＡＧ：野生型（ＷＴ）マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−マウス、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、血中尿素窒素（ｙ軸；ｍｇ／ｄＬ）、血中グロブリン（ｙ軸；ｇ／ｄＬ）、および血清免疫グロブリン（ｙ軸；ＩｇＧ、Ｕ／ｍＬ（左）；ｙ軸；ＩｇＭ、Ｕ／ｍＬ（右））の例示的レベル（血中尿素窒素および血中グロブリンの測定は、４５〜５６週齢の雄マウスにより行い；血清ＩｇＭ型リウマチ因子および血清ＩｇＧ型リウマチ因子の測定は、８〜５８週齢の雄マウスにより行い；Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、８週齢以降の全ての時点において、ＩｇＧ ＲＦおよびＩｇＭ ＲＦの有意な増加が観察された）を示す図であり；図３ＡＨ：雌（上列）および雄（下列）の、野生型（ＷＴ）マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、ＩｇＧ型リウマチ因子およびＩｇＭ型リウマチ因子の例示的レベルを示す図であり；血清測定は、８〜１０週齢（雄：ＷＴ ７例、Ｈｅｔ ５例、ＫＯ ９例；雌：ＷＴ ７例、Ｈｅｔ ５例、ＫＯ ８例）、１８週齢（雄：ＷＴ ９例、Ｈｅｔ ６例、ＫＯ １３例；雌：ＷＴ ５例、Ｈｅｔ １２例、ＫＯ １５例）、３０〜４１週齢（雄：ＷＴ ３例、Ｈｅｔ ４例、ＫＯ ４例；雌：ＷＴ １０例、Ｈｅｔ ９例、ＫＯ ９例）、および５４〜６５週齢（雄：ＷＴ ６例、Ｈｅｔ ９例、ＫＯ ５例）のマウスにより行い；図３ＡＩ：雌（上列）および雄（下列）の、野生型（ＷＴ）マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、循環ＩｇＧおよび循環ＩｇＭ（μｇ／ｍＬ単位、ｙ軸）の例示的レベルを示す図であり；図３ＡＪ：雌（２６〜３４週齢）（上列）および雄（２６〜３４週齢）（下列）の、野生型（ＷＴ）マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウス、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスにおける、循環自己抗体（Ｕ／ｍＬ単位、ｙ軸）の例示的レベルを示す図であり；図３ＡＫ：野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された腎臓（上）および肝臓（下）についての例示的な画像であって、１００倍および２０倍の拡大能で、それぞれ、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）または免疫組織化学検査を介するＦ４／８０（Ｆ４／８０ ＩＨＣ）により染色された画像を示す図であり；図３ＡＬ：８〜６３週齢の野生型（ＷＴ）マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスから切片化された腎臓組織についての例示的な画像であって、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ、上パネル）、ＩｇＧ（上から２番目のパネル）、ＩｇＭ（上から３番目のパネル）、ならびに補体Ｃ３（下パネル）により染色された画像を示す図である。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図４は、多様な濃度の毒素で処理された、培養野生型ニューロンにおける、生存ニューロンの、例示的な百分率であって、対照に対する百分率（ｙ軸）を示す図である。上図は、実施例４で記載される実験デザインを例示する図である。ＤＡ（ドウモイ酸；ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体アゴニスト）、ＢＭＡＡ（β−メチルアミノ−Ｌ−アラニン、１００μＭ）、ＭＫ８０１（ジゾシルピン、１０μＭ；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）、ＮＢＱＸ（２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾキノキサリン−２，３−ジオン、１０μＭ；ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体アンタゴニスト）；グルタチオン（１０μＭ、抗酸化剤）である。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。Cox, P.A.ら、２００３年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、１００巻（２３号）：１３３８０〜１３３８３頁；Murch, S.J.ら、２００４年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、１０１巻（３３号）：１２２２８〜１２２３１頁；Cox, P.A.ら、２００５年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、１０２巻（１４号）：５０７４〜５０７８頁；Erdner, D.L.ら、２００８年、Environmental Health、７巻（増刊２号）：Ｓ２頁。
図５Ａ〜５Ｄは、ＢＭＭＡ（ｎ＝５）またはＰＢＳ（対照、ｎ＝５）のｉ．ｐ．注射を投与された野生型マウスにおける、ＡＬＳ様表現型の測定を示す図である。図５Ａ：上図は、処置、体重測定、および行動研究のための実験デザインおよび時点を例示する図であり、下図は、対照マウス（黒）およびＢＭＡＡ処置マウス（グレー）における、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な体重変化（ｙ軸；グラム単位）を示す図であり；図５Ｂ：対照マウス（黒）およびＢＭＡＡ処置マウス（グレー）における、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的なロータロッド上の最長時間（ｙ軸；秒間）を示す図であり；図５Ｃ：対照マウス（黒）およびＢＭＡＡ処置マウス（グレー）における、例示的なオープンフィールド自発運動行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる不動状態（左；ｙ軸；秒単位）および立ち上がり時間（右；ｙ軸；秒単位）を示す図であり；図５Ｄ：対照マウス（黒）およびＢＭＡＡ処置マウス（グレー）における、例示的なキャットウォーク行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる平均歩幅長（上左、ｙ軸；センチメートル［ｃｍ］）、規則性指数パーセント（ｙ軸）で表示される肢間協調（上右）、および時間経過（ｘ軸；週間）にわたる平均起立（ｙ軸；秒単位）として表示される立脚期（下中）を示す図である。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。 同上 同上 同上
図６Ａ〜６Ｅは、ＢＭＭＡ（ＢＭＡＡを伴う野生型：雄３匹、雌２匹；ＢＭＡＡを伴うノックアウト：雄３匹、雌３匹）またはＰＢＳ（野生型対照：雄４匹、雌１匹；ノックアウト対照：雄５匹、雌１匹）のｉ．ｐ．注射を投与された野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、ＡＬＳ様表現型の測定を示す図である。図６Ａ：上図は、処置、体重測定、および行動研究のための実験デザインおよび時点を例示する図であり、下左図は、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な生存パーセント（ｙ軸）を示す図であり、下右図は、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な体重変化（ｙ軸；グラム単位）を示す図であり；図６Ｂ：上左図は、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均運動機能障害スコアを示す図であり、上右図は、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均振戦スコアを示す図であり、下図は、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的な平均硬直スコアを示す図であり；図６Ｃ：時間経過（ｘ軸；週間）にわたる、例示的なロータロッド上の最長時間（ｙ軸；秒間）を示す図であり；図６Ｄ：例示的なオープンフィールド自発運動行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる不動状態（左；ｙ軸；秒単位）および立ち上がり時間（右；ｙ軸；秒単位）を示す図であり；図６Ｅ：例示的なキャットウォーク行動、例えば、時間経過（ｘ軸；週間）にわたる平均歩幅長（上左、ｙ軸；センチメートル［ｃｍ］）、規則性指数パーセント（ｙ軸）で表示される肢間協調（上右）、および時間経過（ｘ軸；週間）にわたる平均起立（ｙ軸；秒単位）として表示される立脚期（下中）を示す図である。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。 同上 同上 同上 同上
図７は、ＢＭＡＡで処理された野生型運動ニューロンおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ノックアウト）運動ニューロンの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生存（下左）および酸化ストレス（下右）を示す図である。上図：実験デザインについての概略を例示する図であり；生存（下左）は、１００ｍＭのＢＭＡＡで処理された野生型（対照）ニューロンおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ノックアウト）ニューロンにおける、生存ニューロンの百分率であって、野生型対照に対する百分率（ｙ軸）として表示する。１日目（下右の左）および７日目（下右の右）における酸化ストレスは、ＲＯＳ感受性プローブである、ＣｅｌｌＲＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により生成した、約４８５／５２０ｎｍの蛍光の平均光学密度として表示する。統計学的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を使用して決定した。
図８は、野生型（ＷＴ）運動ニューロンにおける、およびＣ９ｏｒｆ７２− ／−運動ニューロンにおける、例示的な生存（上左）、酸化ストレス（上中央）、ミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比（上右）、およびミトコンドリアの機能についての多様な測定値（下左〜下右）を示す図である。生存（上左）は、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋に対するパーセントとしての細胞数として表示し；１日目および７日目における酸化ストレスは、活性酸素種（ＲＯＳ；Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋に対する光学密度パーセント）として表示し；ミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比は、平均のミトコンドリアコピー数として表示し；ミトコンドリア呼吸は、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋の最初の測定値に対するパーセントとして計算される酸素消費速度として表示し；基底呼吸、ＡＴＰ産生、プロトン漏出、最大呼吸、予備呼吸能、および非ミトコンドリア呼吸は、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋対照に対するパーセントとして計算される酸素消費速度として表示する。
図９Ａ〜９Ｃは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、進行性の糸球体腎症を示す図である。図９Ａは、ヌルマウスにおいて観察される、最も著明な腎臓の変化が、膜増殖性糸球体腎炎と関連することを裏付ける、組織病理学的スコア付けについての重み付けグラフを示す図である。図９Ｂは、図９Ａで描示した重み付けグラフに対応する、個々の組織病理学スコアを示す図である。略述すると、Ｈ＆Ｅで染色した腎臓切片を、免疫介在性糸球体腎症：膜増殖性糸球体腎炎、間質性単核球性炎症、硝子円柱形成、糸球体硬化症、および好塩基性尿細管と関連する腎臓疾患の類型について、盲検法によりスコア付けした。スコアは、０＝なし、１＝最小限、２＝軽度、３＝中等度、および４＝重度である。全てのヌルマウスは、影響がより重度な動物における、さらなる疾患類型の証拠を時折伴う、最小限〜重度の膜増殖性糸球体腎炎を提示した。図９Ｃは、１４週（図９Ｃ、上）および２４週（図９Ｃ、下）の時点において、同じコホートのマウスからアッセイされた、尿中ＡＣＲの測定値が、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、年齢に伴う、アルブミン尿症の発症を指し示すことを示す図である。ヘテロ接合性マウスが、ＷＴと同等な値を提示したことは、観察された表現型の非存在と符合する。 同上 同上
図１０は、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４４＋ＩＣＯＳ＋ＰＤ−１＋Ｂｃｌ−６＋）が、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−脾臓内、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−ＣＬＮ内、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−ＭＬＮ内、およびＣ９ｏｒｆ７２−／−血液中のパーセントおよび総細胞カウントで、有意に増加したことを裏付ける図である。グラフは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（対応のないスチューデントのｔ検定による、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）、２６週の雌、遺伝子型１つ当たりのｎ＝５を表す。Ｔｆｈ細胞の増加はまた、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−骨髄（ＢＭ）中でも観察されたが、これは、有意に到達しなかった。
定義
本発明は、本明細書で記載される特定の方法および実験条件に限定されるものではない。なぜなら、そのような方法および条件は変化しうるからである。本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されたい。
他の形で規定されない限り、本明細書で使用される全ての用語および語句は、反対のことが明らかに指し示されるか、その用語または語句が使用される文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。本発明の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、特定の方法および材料について記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
「投与」は、組成物の、被験体または系（例えば、細胞、臓器、組織、生物、または関連する構成要素もしくはそれらの構成要素のセット）への投与を含む。当業者は、投与経路は、例えば、組成物が投与される被験体または系、組成物の性質、投与の目的などに応じて変動させうることを十分に理解する。例えば、ある特定の実施形態では、動物被験体（例えば、ヒトまたは齧歯動物）への投与は、気管支（気管支点滴注入を含む）投与、口腔投与、腸内投与、皮間（interdermal）投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内
投与、筋内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、クモ膜下腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、経粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管（気管内点滴注入を含む）投与、経皮投与、膣投与、および／または硝子体投与でありうる。一部の実施形態では、投与は、間欠的投与を伴いうる。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投与（例えば、灌流）を伴いうる。
「改善」は、被験体の状況の防止、低減、もしくは抑制、または被験体の状況の向上を含む。改善は、疾患、障害、または状態（例えば、放射線による損傷）の完全な回復または完全な防止を含むがこれらを要求しない。
１または複数の目的の値に適用される「およそ」は、言明される基準値と同等な値を含む。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、そうでないことが言明されるかまたはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて（このような数が、可能な値の１００％を超える場合を除き）、言明される基準値から、いずれの方向にも（大きい方向または小さい方向）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満の範囲内に収まる値の範囲を指す。
「生物学的に活性な」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであれ、ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、生物において）であれ、生体系において活性を有する任意の作用物質（agent）の特徴を含む。
例えば、生物において存在する場合に、その生物内で生物学的効果を有する作用物質を、生物学的に活性であるとみなす。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが、生物学的に活性である場合、そのタンパク質またはポリペプチドの部分であって、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有する部分は、「生物学的活性」部分と称することが典型的である。
「同等な」は、互いと同一ではありえないが、観察される差違または類似性に基づき、結論を合理的に引き出しうるように、それらの間の比較を許容する程度に十分に類似する、２つまたはこれを超える作用物質、実体、状況、条件のセットなどを含む。当業者は、文脈により、２つまたはこれを超える、このような作用物質、実体、状況、条件のセットなどを、同等であるとみなすためには、所与の任意の環境の下で、どの程度の同一性が要求されるのかを理解する。
保存的アミノ酸置換について記載する場合の「保存的」は、アミノ酸残基の、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による置換を含む。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能的特性、例えば、受容体がリガンドに結合する能力を、実質的に変化させない。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族−ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖；フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖；リシン、アルギニン、およびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖を含む。保存的アミノ酸置換基は、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンを含む。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニン走査変異誘発において使用される通り、タンパク質内の任意の天然残基の、アラニンによる置換でありうる。一部の実施形態では、Gonnet, G.H.ら、１９９２年、Science、２５６巻：１４４３〜１４４５頁において開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列（log-likelihood matrix）で、正の値を有する保存的置換を施す。一部の実施形態では、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で、負でない値を有する置換は、中程度に保存的な置換である。
「対照」は、当技術分野で理解される意味であって、それに対して結果を比較する標準である「対照」の意味を含む。変数についての結論を下すために、そのような変数を分離することにより、実験の完全性を増強するために対照を使用することが典型的である。一部の実施形態では、対照は、比較基準（comparator）を提供するために、試験反応または試験アッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」はまた、「対照動物」も含む。「対照動物」は、本明細書で記載される改変を有する場合もあり、本明細書で記載される改変とは異なる改変を有する場合もあり、改変を有さない場合（すなわち、野生型動物の場合）もある。１つの実験では、「試験」（すなわち、被験変数）を適用する。第２の実験である「対照」では、被験変数は適用しない。一部の実施形態では、対照は、履歴対照（すなわち、既に実施された試験もしくはアッセイにおけるもの、または既知の量もしくは結果）である。一部の実施形態では、対照は、印刷されるかまたは他の形で保存される記録であるかまたはこれを含む。対照は、陽性対照の場合もあり、陰性対照の場合もある。
「破壊」は、ＤＮＡ分子による（例えば、遺伝子または遺伝子座など、内因性相同配列による）相同組換えイベントの結果を含む。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮＡ配列（複数可）の挿入、欠失、置換、置きかえ、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組合せを達成しうるかまたはこれを表しうる。挿入は、全遺伝子または遺伝子の断片、例えば、内因性配列以外に由来する配列（例えば、異種配列）でありうるエクソンの挿入を含みうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、遺伝子によりコードされるタンパク質）の発現および／または活性を増加させうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少させうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）の配列を変更しうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）をトランケートまたは断片化しうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物を伸長させうる。一部のこのような実施形態では、破壊は、融合タンパク質のアセンブリーを達成しうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性ではなく、レベルに影響を及ぼしうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルではなく、活性に影響を及ぼしうる。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して有意な影響を有しえない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性に対して有意な影響を有しえない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれかに対して有意な影響を有しえない。
「〜を決定すること」、「〜を測定すること」、「〜を評価すること」、「〜を評定すること」、「〜をアッセイすること」、および「〜を解析すること」は、測定の任意の形態を含み、要素が存在するのか、存在しないのかを決定することを含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含む。アッセイすることは、相対的な場合もあり、絶対的な場合もある。「〜の存在についてアッセイすること」は、存在する何物かの量を決定することの場合もあり、かつ／またはそれが存在するのか、存在しないのかを決定することの場合もある。
「内因性遺伝子座」または「内因性遺伝子」は、本明細書で記載される破壊、欠失、置きかえ、変更、または改変の導入の前に、親生物または基準生物において見出される遺伝的座位（genetic locus）を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は、天然において見出される配列を有する。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は、野生型遺伝子座である。一部の実施形態では、基準生物は、野生型生物である。一部の実施形態では、基準生物は、操作された生物である。一部の実施形態では、基準生物は、実験室飼育生物（野生型生物であれ、操作された生物であれ）である。
「内因性プロモーター」は、天然において、例えば、野生型生物において、内因性遺伝子と関連するプロモーターを含む。
「遺伝子」は、染色体内のＤＮＡ配列であって、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、エクソン配列）および非コード配列（例えば、イントロン配列）の両方を含みうる。一部の実施形態では、遺伝子は、１もしくは複数の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、および／または例えば、遺伝子発現の１もしくは複数の側面（例えば、細胞型特異的発現、誘導性発現など）を制御するかもしくはこれらに影響を与えるイントロン配列を含みうる。明確さを目的として、本発明者らは、本出願で使用される「遺伝子」という用語は一般に、ポリペプチドをコードする核酸の部分を指し、当業者には文脈から明らかである通り、用語は任意選択で、調節配列を包含しうることについて特に言及する。この定義は、「遺伝子」という用語の、タンパク質をコードしない発現ユニットへの適用を除外することを意図するものではなく、本文書において使用される場合の用語が、大半の場合、ポリペプチドをコードする核酸を指すことを明らかにすることを意図するものである。
「異種」は、異なる供給源に由来する、作用物質または実体を含む。例えば、特定の細胞または生物において存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に言及して使用される場合、用語は、対象となるポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物が、１）人為により操作されたこと；２）人為により（例えば、遺伝子操作を介して）、細胞もしくは生物（またはその前駆体）へと導入されたこと；かつ／または３）対象となる細胞もしくは生物（例えば、対象となる細胞型または生物型）によって、天然では産生されないかもしくはそれに存在しないことを明確にする。「異種」はまた、特定の自然における細胞または生物において通常存在するが、例えば、変異、または天然では関連しない調節性エレメント（例えば、プロモーター）の制御下への配置、一部の実施形態では、非内因性の調節性エレメント（例えば、プロモーター）の制御下への配置により改変されているポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物も含む。
「宿主細胞」は、核酸またはタンパク質を導入した細胞を含む。本開示を一読した当業者は、このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の後代を指すのにもまた使用されることを理解する。ある特定の改変が、次世代において、変異または環境の影響のために生じうるため、このような後代は、実のところ、親細胞と同一でない場合もあるが、なおも、「宿主細胞」という語句の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であるかまたはこれを含む。一般に、宿主細胞は、細胞が指定される生物界にかかわらず、異種核酸または異種タンパク質を受容および／または産生するのに適する任意の細胞である。例示的な細胞は、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌の細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染性昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクァドローマなどの細胞融合体を含む。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞であり、以下の細胞：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ
Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株から選択される。一部の実施形態では、細胞、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）は、１または複数のウイルス遺伝子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、単離細胞であるかまたはこれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は、生物の一部である。
配列の比較との関連における「同一性」は、当技術分野で公知である、いくつかの異なるアルゴリズムであって、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列同一性を測定するのに使用しうるアルゴリズムにより決定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される同一性は、１０．０のギャップ開始ペナルティー、０．１のギャップ伸長ペナルティーを利用する、ＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを使用して、およびＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８年）を使用して決定する。
「〜を改善する」、「〜を増加させる」、「〜を消失させる」、または「〜を低減する」は、本明細書で記載される処置を開始する前の、同じ個体（または動物）における測定値など、ベースラインの測定値、または本明細書で記載される処置の非存在下にある１つの対照個体（または対照動物）もしくは複数の対照個体（または対照動物）における測定値と比べて指し示される値を含む。
「単離された」は、（１）それが産生された（天然においてであれ、かつ／または実験状況においてであれ）当初会合していた構成要素の少なくとも一部から分離された物質および／もしくは実体、ならびに／または（２）人為によりデザイン、作製、調製、および／もしくは製造された物質および／もしくは実体を含む。単離された物質および／または単離された実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超える他の構成要素であって、それらが当初会合していた構成要素から分離することができる。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。一部の実施形態では、物質は、それが他の構成要素を実質的に含まない場合に「純粋」である。一部の実施形態では、当業者により理解される通り、物質は、例えば、１または複数のキャリアまたは賦形剤（例えば、バッファ、溶媒、水など）など、ある特定の他の構成要素と組み合わせた後でもなお、「単離された」なおまたは「純粋」とみなすことができ；このような実施形態では、このようなキャリアまたは賦形剤を含めずに、物質の単離パーセントまたは純度を計算する。例を１つだけ示せば、一部の実施形態では、ａ）その起源もしくは派生元のおかげで、天然におけるその天然の状態ではそれに付随する構成要素の一部もしくは全部と会合しないか；ｂ）天然においてそれを産生する種と同じ種の、他のポリペプチドもしくは核酸を実質的に含まないか；またはｃ）天然においてそれを産生する種のものではない、細胞に由来する構成要素もしくは他の発現系により発現される、もしくは他の方法で細胞に由来する構成要素もしくは他の発現系と共同して発現される場合に、天然において生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーを、「単離された」とみなす。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学合成されるか、または天然においてそれを産生する細胞系と異なる細胞系において合成されるポリペプチドを、「単離された」ポリペプチドとみなす。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、ａ）天然においてそれが会合する他の構成要素；および／またはｂ）産生された当初にそれが会合していた他の構成要素から分離された程度に、１または複数の精製技法にかけられたポリペプチドを、「単離された」ポリペプチドとみなすことができる。
１または複数の「遺伝子座」は、遺伝子（または有意味な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列の特異的な場所（複数可）、または生物のゲノムの染色体上の位置を含む。例えば、「Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座」とは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、Ｃ９ＯＲＦ７２
ＤＮＡ配列、Ｃ９ＯＲＦ７２コード配列の特異的な場所、または生物のゲノムの染色体上のＣ９ＯＲＦ７２の位置であって、このような配列が存在するところについて同定される位置を指す場合がある。Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節性エレメントであって、エンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲおよび／もしくは３’ＵＴＲ、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない調節性エレメントを含みうる。当業者は、一部の実施形態では、染色体が、数百なおまたは数千の遺伝子を含有することが可能であり、異なる種間で比較する場合に、類似する遺伝的座位の、物理的な共局在化を示すことを十分に理解する。このような遺伝的座位は、シンテニーを共有したと記載されている可能性がある。
「非ヒト動物」は、ヒトではない、任意の脊椎動物を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚類、軟骨魚類（例えば、サメまたはエイ）、両生類、爬虫類、哺乳動物、および鳥類である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長動物、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯動物である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯動物である。
「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖へと組み込まれるか、またはこれへと組み込まれうる、任意の化合物および／または物質を含む。一部の実施形態では、「核酸」とは、ホスホジエステル連結を介して、オリゴヌクレオチド鎖へと組み込まれるか、またはこれへと組み込まれうる、化合物および／または物質である。文脈から明らかとなる通り、一部の実施形態では、「核酸」とは、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」とは、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるかまたはこれを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるかまたはこれを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数の天然核酸残基であるか、これらを含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数の核酸類似体であるか、これらを含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、核酸類似体は、それが、ホスホジエステル骨格を活用しないという点において、「核酸」と異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野で公知であり、骨格内に、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合を有する、１または複数の「ペプチド核酸」であるか、これらを含むか、またはこれらからなり、本発明の範囲内であるとみなされる。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、１または複数のホスホロチオエート連結および／または５’−Ｎ−ホスホルアミダイト連結を有する。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、これらを含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、挿入塩基、およびこれらの組合せ）であるか、これらを含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、「核酸」は、天然の核酸における糖と比較した、１または複数の修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡまたはタンパク質など、機能的な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、１または複数のエクソンを含む。一部の実施形態では、「核酸」を、天然の供給源からの単離、相補的な鋳型に基づく重合化による酵素的合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける）、組換え細胞内または組換え系における複製、および化学合成のうちの１つまたは複数により調製する。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはこれを超える残基の長さである。一部の実施形態では、「核酸」は、一本鎖であり；一部の実施形態では、「核酸」は、二本鎖である。一部の実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である、少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、「核酸」は、酵素活性を有する。
「作動可能に連結した」は、記載される構成要素が、それらが、それらの意図される形で機能することを可能とする関係に置かれた並置を含む。コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現を制御配列と適合的な条件下で達成するように、ライゲーションされている。「作動可能に連結した」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するように、トランスにおいて、または距離を隔てて作用する発現制御配列との両方を含む。「発現制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすために必要なポリヌクレオチド配列を含む。「発現制御配列」は、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに所望される場合、タンパク質の分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合性部位、および転写終結配列を含むのに対し、真核生物では、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含むことが典型的である。「制御配列」という用語は、それらの存在が、発現およびプロセシングに必須である構成要素を含むことを意図し、また、それらの存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含みうる。
「表現型」は、細胞または生物が表す形質（trait）または形質のクラスもしくはセッ
トを含む。一部の実施形態では、特定の表現型は、特定の対立遺伝子または遺伝子型と相関しうる。一部の実施形態では、表現型は、離散的な場合もあり；一部の実施形態では、表現型は、連続的な場合もある。
「生理学的条件」は、当技術分野で理解されるその意味であって、細胞または生物が生存および／または生殖する条件に言及する意味を含む。一部の実施形態では、用語は、天然において、生物系または細胞系にとって生じうる、外部環境または内部環境の条件を含む。一部の実施形態では、生理学的条件とは、ヒトまたは非ヒト動物の体内に存在する条件、とりわけ、手術部位に存在する条件および／または手術部位内に存在する条件である。生理学的条件は、例えば、２０〜４０℃の温度範囲、１の大気圧、６〜８のｐＨ、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気レベルでの酸素濃度、および地球上で遭遇する重力を含むことが典型的である。一部の実施形態では、実験室内の条件を、生理学的条件で操作および／または維持する。一部の実施形態では、生物内で、生理学的条件に遭遇する。
「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然において生じるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然において生じないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然において互いと個別に生じる部分（すなわち、２つまたはこれを超える異なる生物に由来する部分、例えば、ヒト部分および非ヒト部分）を含有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それが、人為の作用を介してデザインおよび／または作製されるという点で、操作されたアミノ酸配列を有する。
疾患、障害、および／または状態の発生との関連における「〜を防止する」または「防止」は、疾患、障害、および／もしくは状態を発症させる危険性を低減すること、ならびに／または疾患、障害、もしくは状態の１もしくは複数の特徴もしくは症状の発症を遅延させることを含む。防止は、疾患、障害、または状態の発症を、所定の期間にわたり遅延させた場合に完全であると考えることができる。
「基準」は、それらに対して、目的の薬剤、動物、コホート、個体、集団、試料、配列、または値を比較する、標準または対照の、薬剤、動物、コホート、個体、集団、試料、配列、または値を含む。一部の実施形態では、目的の薬剤、動物、コホート、個体、集団、試料、配列、または値についての試験または決定と実質的に同時に、基準薬剤、基準動物、基準コホート、基準個体、基準集団、基準試料、基準配列、または基準値について調べ、かつ／または決定する。一部の実施形態では、基準薬剤、基準動物、基準コホート、基準個体、基準集団、基準試料、基準配列、または基準値は、任意選択で、有形の媒体に具体化される、履歴基準である。一部の実施形態では、基準とは、対照を指す場合がある。「基準」はまた、「基準動物」も含む。「基準動物」は、本明細書で記載される改変を有する場合もあり、本明細書で記載される改変とは異なる改変を有する場合もあり、改変を有さない場合（すなわち、野生型動物の場合）もある。当業者により理解される通り、基準薬剤、基準動物、基準コホート、基準個体、基準集団、基準試料、基準配列、または基準値は、目的の薬剤、動物（例えば、哺乳動物）、コホート、個体、集団、試料、配列、または値を決定するかまたは特徴付けるのに活用される条件と同等な条件下で、決定するかまたは特徴付けることが典型的である。
「応答」は、被験体の状態の任意の有益な変更であって、処置の結果として生じるか、または処置と相関する変更を含む。このような変更は、状態の安定化（例えば、処置の非存在下で生起する増悪の防止）、状態の症状の改善、および／または状態の治癒の見込みの向上などを含みうる。「応答」は、被験体の応答を指す場合もあり、ニューロンの応答を指す場合もある。ニューロンの応答または被験体の応答は、臨床的判定基準および客観的判定基準を含む、多種多様な判定基準に従い測定することができる。被験体の運動系についての検査は、強度、腱反射、表在反射、筋肉量、協調、筋緊張、異常行動、姿勢、および歩行のうちの１または複数についての検査を含みうる。応答を評定するための技法は、臨床検査、伸展屈曲（筋伸展反射）試験、ホフマン反射試験、および／または圧迫試験を含むがこれらに限定されない。処置に対する応答を評定するための方法およびガイドラインについては、Brodal, A.、Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine、２版、New York、Oxford University Press、１９６９年；Medical Council of the U.K.、Aids to the Examination of the Peripheral Nervous System、Palo Alto、Calif.、Pendragon House、１９７８年；Monrad-Krohn, G.H.、Refsum, S.、The Clinical Examination of the Nervous System、１２版、London、H.K. Lewis & Co.、１９６４年；およびWolf, J.K.、Segmental Neurology, A Guide to the Examination and Interpretation of Sensory and Motor Function、Baltimore、University Park Press、１９８１年において論じられている。正確な応答判定基準は、ニューロンおよび／または患者の群を比較する場合に、比較される群を、応答率を決定するための同じ判定基準または同等な判定基準に基づき評定することを条件として、任意の適切な方法で選択することができる。当業者は、適切な判定基準を選択することが可能である。
文脈から理解される通り、疾患、障害、および／または状態の「危険性」は、特定の個体が、疾患、障害、および／または状態（例えば、放射線による損傷）を発症する可能性を含む。一部の実施形態では、危険性は、百分率として表される。一部の実施形態では、危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、最大１００％である。一部の実施形態では、危険性は、基準試料または基準試料の群と関連する危険性と比べた危険性として表される。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、状態、および／または事象（例えば、放射線による損傷）について公知の危険性を有する。一部の実施形態では、基準試料または基準試料の群は、特定の個体と同等な個体に由来する。一部の実施形態では、相対危険性は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれを超える。
「実質的に」は、目的の特徴または特性の、全てまたはほぼ全ての広がり（extent）または程度を呈する定性的条件を含む。生物学的技術分野の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、仮にそうなるとしても、完結に至り、かつ／もしくは完全性へと進行するか、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはまれであることを理解する。したがって、本明細書では、「実質的に」という用語を、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を記録するのに使用する。
「実質的な相同性」は、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を含む。当業者に十分に理解される通り、２つの配列は一般に、それらが、対応する位置において相同な残基を含有すれば、「実質的に相同」であるとみなされる。相同な残基は、同一の残基でありうる。代替的に、相同な残基は、適切な程度に類似する構造的特徴および／または機能的特徴を伴う、同一でない残基でありうる。例えば、当業者に周知である通り、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」アミノ酸もしくは「親水性」アミノ酸として、かつ／または「極性」側鎖もしくは「非極性」側鎖を有するアミノ酸として分類されることが典型的である。１つのアミノ酸の、同じ種類の別のアミノ酸に代えての置換は、「相同」置換とみなされうることが多い。典型的なアミノ酸の類別を下記にまとめる。
Figure 2021118745
当技術分野で周知の通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズムを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムについては、Altschul, S. F.ら、１９９０年、J. Mol.
Biol.、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁；Altschul, S. F.ら、１９９７年、Methods in Enzymology；Altschul, S. F.ら、１９９７年、Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁；Baxevanis, A.D.およびB. F. F. Ouellette（編）、Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins、Wiley、１９９８年；ならびにMisenerら（編）、Bioinformatics Methods and Protocols（Methods in Molecular Biology、１３２巻）、Humana Press、１９９８年に
おいて記載されている。相同な配列の同定に加えて、上記で言及したプログラムは、相同性の程度についての指標も提供することが典型的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える残基が、関連する範囲の残基にわたり相同であれば、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する範囲（relevant stretch）は、完全な配列である。一部の実施形態では、関連する範囲は、少
なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、またはこれを超える残基である。一部の実施形態では、関連する範囲は、完全な配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する範囲は、完全な配列に沿った不連続残基、例えば、ポリペプチドまたはその部分のフォールディングしたコンフォメーションにより一緒にされた隣接しない残基を含む。一部の実施形態では、関連する範囲は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはこれを超える残基である。
「実質的な同一性」は、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較を含む。当業者に十分に理解される通り、２つの配列は一般に、それらが、対応する位置において同一の残基を含有すれば、「実質的に同一」であるとみなされる。当技術分野で周知の通り、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズムを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムについては、Altschul, S.F.ら、１９９０年、J. Mol. Biol.、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁；Altschul, S.F.ら、１９９７年、Methods in Enzymology；Altschul, S.F.
ら、１９９７年、Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁；Baxevanis, A.D.およびB.F.F. Ouellette（編）、Bioinformatics: A Practical Guide to the
Analysis of Genes and Proteins、Wiley、１９９８年；ならびにMisenerら（編）、Bioinformatics Methods and Protocols（Methods in Molecular Biology、１３２巻）、Humana Press、１９９８年において記載されている。同一な配列の同定に加え
て、上記で言及したプログラムは、同一性の程度についての指標も提供することが典型的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える残基が、関連する範囲の残基にわたり同一であれば、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する範囲は、完全な配列である。一部の実施形態では、関連する範囲は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはこれを超える残基である。
「ターゲティングベクター」または「ターゲティング構築物」は、ターゲティング領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。ターゲティング領域は、標的細胞、標的組織、または標的動物における配列と同一であるかまたは実質的に同一な配列を含み、ターゲティング構築物の、該細胞、該組織、または該動物のゲノム内の位置への、相同組換えを介する組込みをもたらす。また、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用して標的とするターゲティング領域も含まれる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるターゲティング構築物は、特定の目的の核酸配列または遺伝子（例えば、レポーター遺伝子または相同遺伝子もしくは異種遺伝子）、選択用マーカー、制御配列または調節配列、およびリコンビナーゼまたは組換え誘導性（recombinogenic）タンパク質をコードする他の核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、ターゲティング構築物は、目的の遺伝子を全体または部分的に含むことが可能であり、この場合、目的の遺伝子は、内因性配列によりコードされるタンパク質と同様の機能を有するポリペプチドを全体または部分的にコードする。一部の実施形態では、ターゲティング構築物は、目的のヒト化遺伝子を全体または部分的に含むことが可能であり、この場合、目的のヒト化遺伝子は、内因性配列によりコードされるポリペプチドと同様の機能を有するポリペプチドを全体または部分的にコードする。一部の実施形態では、ターゲティング構築物は、レポーター遺伝子を全体または部分的に含むことが可能であり、この場合、レポーター遺伝子は、当技術分野で公知の技法を使用して、容易に同定および／または測定されるポリペプチドをコードする。
「トランスジェニック動物」、「トランスジェニック非ヒト動物」または「Ｔｇ＋」は、任意の非自然発生の非ヒト動物であって、非ヒト動物の細胞のうちの１または複数が、異種核酸および／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子を全体または部分的に含有する非ヒト動物を含む。一部の実施形態では、異種核酸および／または異種遺伝子を、細胞へと、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染によるなど、意図的な遺伝子操作を介する、前駆細胞への導入により、直接的または間接的に導入する。遺伝子操作という用語は、古典的な交配技法を含むものではなく、組換えＤＮＡ分子（複数可）の導入を対象とする。この分子は、染色体内に組み込むこともでき、染色体外複製ＤＮＡの場合もある。「Ｔｇ＋」という用語は、異種核酸および／もしくは異種遺伝子についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性である動物、ならびに／または異種核酸および／もしくは異種遺伝子の、単一もしくは複数のコピーを有する動物を含む。
「処置」、「〜を処置する」または「〜を処置すること」は、特定の疾患、障害、および／または状態を、部分的もしくは完全に緩和するか、改善するか、和らげるか、阻害するか、これらの発症を遅延させ、これらの重症度を低減し、かつ／またはこれらの１もしくは複数の症状、特色、および／もしくは原因の発生率を低減する物質（例えば、治療剤候補）の任意の投与を含む。一部の実施形態では、このような処置を、問題の疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈さない被験体、ならびに／または該疾患、障害、および／もしくは状態の早期徴候だけを呈する被験体へと投与することができる。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、処置を、問題の疾患、障害、および／または状態の、１または複数の確立された徴候を呈する被験体へと投与することができる。一部の実施形態では、処置は、問題の疾患、障害、および／または状態を患うと診断された被験体の処置でありうる。一部の実施形態では、処置は、問題の疾患、障害、および／または状態の発生の危険性の増加と統計学的に相関する、１または複数の感受性因子を有することが公知の被験体の処置でありうる。
「バリアント」は、基準実体との、有意な構造的同一性を示すが、基準実体と比較した、１または複数の化学的部分の存在またはレベルにおいて、基準実体と構造的に異なる実体を含む。多くの実施形態では、「バリアント」はまた、その基準実体と、機能的にも異なる。一般に、特定の実体が、基準実体の「バリアント」であると適正にみなされるのかどうかは、その、基準実体との、構造的同一性の程度に基づく。当業者に十分に理解される通り、任意の生物学的基準実体または化学的基準実体は、ある特定の特徴的構造エレメントを有する。「バリアント」とは、定義により、１または複数のこのような特徴的構造エレメントを共有する、識別可能な化学的実体である。ごく少数の例を示せば、低分子は、低分子のバリアントが、コアの構造エレメントと、特徴的ペンダント部分とを共有するが、他のペンダント部分および／またはコア内に存在する結合の種類（二重結合と対比される一重結合、Ｚ結合と対比されるＥ結合など）が異なるバリアントであるように、特徴的なコアの構造エレメント（例えば、大員環のコア）、および／または１もしくは複数の特徴的ペンダント部分を有することが可能であり、ポリペプチドは、直線状もしくは三次元空間内の、互いと比べた指定位置を有し、かつ／または特定の生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸からなる、特徴的配列エレメントを有することが可能であり、核酸は、直線状または三次元空間内の、互い（on another）と比べた指定位置を有する、複数の
ヌクレオチド残基からなる、特徴的配列エレメントを有しうる。例えば、「バリアントポリペプチド」は、アミノ酸配列の１もしくは複数の差違、ならびに／またはポリペプチド骨格へと共有結合で接続させた化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１もしくは複数の差違の結果として、基準ポリペプチドと異なりうる。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、基準ポリペプチドとの全体的な配列同一性であって、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である配列同一性を示す。代替的にまたは加えて、一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、少なくとも１つの特徴的配列エレメントを、基準ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、基準ポリペプチドは、１または複数の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、基準ポリペプチドの生物学的活性のうちの１または複数を共有する。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、基準ポリペプチドの生物学的活性のうちの１または複数を欠く。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、１または複数の生物学的活性のレベルの、基準ポリペプチドと比較した低減を示す。多くの実施形態では、目的のポリペプチドが、特定の位置における、少数の配列の変更を除き、親ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する場合、目的のポリペプチドを、親ポリペプチドまたは基準ポリペプチドの「バリアント」とみなす。バリアント内の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％より少ない残基を、親ポリペプチドと比較して置換することが典型的である。一部の実施形態では、「バリアント」は、親ポリペプチドと比較して、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つの置換残基を有する。「バリアント」は、極めて少数の（例えば、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つより少ない）、置換された機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有することが多い。さらに、「バリアント」は、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ以下の付加または欠失を有することが典型的であり、親ポリペプチドと比較して、付加または欠失を有さないことが多い。なおさらに、任意の付加または欠失は、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６残基より少ないことが典型的であり、一般に、約５、約４、約３、または約２残基より少ない。一部の実施形態では、親ポリペプチドまたは基準ポリペプチドは、天然において見出される、親ポリペプチドまたは基準ポリペプチドである。当業者により理解される通り、目的の、特定のポリペプチドの複数のバリアントは一般に、天然において見出されうるが、特に、目的のポリペプチドが、感染因子のポリペプチドである場合はそうである。
「ベクター」は、それが会合する別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を含む。一部の実施形態では、ベクターは、それらが連結された核酸の、真核細胞内および／または原核細胞内など、宿主細胞内の、染色体外複製および／または染色体外発現が可能である。本明細書では、作動可能に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。
「野生型」は、天然では、「正常」な状況または「正常」な文脈（変異体の状況または文脈、疾患の状況または文脈、変更された状況または文脈などと対比される）において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。当業者は、野生型の遺伝子およびポリペプチドが、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することが多いことを十分に理解する。
ある特定の実施形態の詳細な説明
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物が提供される。特に、本明細書で記載される非ヒト動物は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における全コード配列の欠失、すなわち、全てのＣ９ＯＲＦ７２アイソフォームをコードするゲノムセグメントの欠失（例えば、アイソフォームＶ１の、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分の欠失）を有する。本明細書で記載される非ヒト動物は、体重減少と、例えば、運動の不活発化および歩行機能障害などのＡＬＳ様運動異常とを示す。本明細書で記載される非ヒト動物はまた、約８週齢において、脾腫および／またはリンパ節症も示す。さらに、本明細書で記載される非ヒト動物は、約３５週齢において、糸球体腎炎を示す。したがって、神経変性疾患、神経変性障害、および神経変性状態を処置および／または改善するための治療剤候補を開発および同定するのに特に有用な非ヒト動物、一部の実施形態では、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、自己免疫障害および／または炎症性障害、ならびに自己免疫状態および／または炎症性状態を処置および／または改善するための治療剤候補を開発および同定するのに特に有用な非ヒト動物が提供される。特に、本明細書で記載される非ヒト動物は、レポーター遺伝子の、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座への導入であって、非ヒト動物の神経系および免疫系におけるレポーター遺伝子（すなわち、レポーターポリペプチド）の発現を結果としてもたらす導入を包含する。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、治療剤候補が、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを改善する有効性を決定するための細胞の供給源を提供する。さらに、このようなトランスジェニック非ヒト動物は、神経変性疾患、自己免疫疾患、および／または炎症性疾患、神経変性障害、自己免疫障害、および／または炎症性障害、ならびに神経変性状態、自己免疫状態、および／または炎症性状態を処置するための治療剤を開発するのに有用な動物モデル系を提供する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、非ヒト動物の細胞内の、Ｃ９ＯＲＦ７２（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチドなど）の非存在、これらの欠如、またはこれらのレベルの低下のために、ＡＬＳ様疾患および／またはＦＴＤ様疾患を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、Ｃ９ＯＲＦ７２（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチドなど）の非存在、これらの欠如、またはこれらのレベルの低下のために、糸球体腎炎を発症する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊についてホモ接合性である。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、レポーター遺伝子を全体または部分的に含み、この場合、前記レポーター遺伝子は、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターは、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターを含む。
本開示は、グローバルなＣ９ｏｒｆ７２の除去を伴う非ヒト動物系についての、包括的な表現型解析と、Ｃ９ｏｒｆ７２についての、免疫系ホメオスタシスにおける固有の役割の発見とを提示する。本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の完全な除去が、約４０週齢に始まる、下位運動ニューロン病変の発症可能性を示唆する、歩行異常と、後肢衰弱への指標とを結果としてもたらしたことを具体的に裏付ける。本明細書で記載される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−非ヒト動物が呈する免疫表現型は、Ｔ細胞の活性化の増加および形質細胞の増加を伴う、骨髄系コンパートメントおよびリンパ系コンパートメントの両方の、えり抜きの拡大増殖（expansion）からなった。好中球増加症および単球増加症は、免疫臓器内の混
合浸潤物であって、拡大増殖するが、基礎構造を完全に破壊しない混合浸潤物を結果としてもたらした。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−非ヒト動物は、骨髄系の上方調節と符合する、血清サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）および組織ＲＮＡシグネチャーの上昇を示した。例えば、基底膜の肥厚および円柱形成などの病理学的変化を随伴する腎臓疾患は、約３５週齢までに、非ヒト動物の大半において存在した。顕微鏡レベルでは、糸球体は、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体、ならびに補体Ｃ３により、免疫複合体の沈着を指し示すパターンで、強く染色された。本明細書で記載される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−非ヒト動物はまた、抗ＲＦ、ＡＮＡ、抗Ｓｍ、および抗カルジオリピンを含む、高力価の自己抗体も示したが、これは、Ｃ９ｏｒｆ７２発現の喪失が、免疫ホメオスタシスを強く破壊することを指し示した。野生型非ヒト動物またはＣ９ｏｒｆ７２＋／−（ヘテロ接合性）非ヒト動物では、免疫関連表現型特徴のうちのいずれも観察されなかった。したがって、本発明は、とりわけ、多様な疾患、障害、または状態の処置であって、部分的に、このような確立された系における、特定の表現型の非存在に起因して、確立されたｉｎ ｖｉｖｏ系の使用を介しては達成可能でない処置のために、新たな治療を開発し、かつ／または新たな治療標的を同定するための、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系の創出を提供する。
以下の節では、本発明の多様な態様について、詳細に記載する。節の使用は、本発明を限定することを意図するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用されうる。本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
Ｃ９ＯＲＦ７２
ルー・ゲーリック病ともまた称する、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とは、上位運動ニューロンおよび／または下位運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる、最も高頻度な成人発症型麻痺性障害である。ＡＬＳは、米国全体で、２０，０００人もの個体において生じ、毎年約５，０００例の新たな症例が生じている。医師であるアーノルド・ピックにちなんで、もとはピック病と称した、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）とは、脳の前頭葉または側頭葉における、進行性の細胞変性により引き起こされる障害群である。ＦＴＤは、全ての認知症症例のうちの１０〜１５％を占めることが報告されている。Ｃ９ＯＲＦ７２の２つの非コードエクソンの間の、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート拡張は、ＡＬＳおよびＦＴＤのいずれとも関係付けられている（DeJesus-Hernandez, M.ら、２０１１年、Neuron、７２巻：２４５〜２５６頁；Renton, A.E.ら、２０１１年、Neuron、７
２巻：２５７〜２６８頁；Majounie, E.ら、２０１２年、Lancet Neurol.、１１巻：３２３〜３３０頁；Waite, A.J.ら、２０１４年、Neurobiol. Aging、３５巻：１７７９
．ｅ５〜１７７９．ｅ１３頁）。しかし、このようなリピート変異が、疾患を引き起こす機構は、毒性による機能喪失を介するか、毒性による機能獲得を介するかどうかは、依然として不明なままである。例えば、ターゲティングされた低減またはノックダウンにより、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現が低減されたゼブラフィッシュは、軸索障害と、自発運動機能の欠損とを示す（Ciura, S.ら、２０１３年、Ann. Neurol.、７４巻（４２号）：１８０
〜１８７頁）が、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現が低減されたマウスは、ＡＬＳ疾患と関連する、いかなる行動学的または病理学的特色もを示さない（Lagier-Tourenne, C.ら、２０１３年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、Ｅ４５３０〜Ｅ４５３９頁）。さらに、Ｃ９ＯＲＦ７２内に６６回のリピート拡張を含有するように生み出されたノックインマウスは、それらのニューロン内に、ＲＮＡ凝集体（RNA foci）およびジペプチドタンパク質凝集
物を呈する。これらのマウスは、皮質ニューロンの喪失を示し、６カ月齢において、行動障害および運動欠損を呈した（Chew, J.ら、２０１５年、Science、５月１４日、Ｐｉｉ：ａａａ９３４４）。
Ｃ９ＯＲＦ７２内の、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピート拡張と関連する、多くの病理学的側面であって、例えば、リピート長に依存する、ＲＮＡ凝集体の形成、特異的ＲＮＡ結合性タンパク質の隔離、ならびにジペプチドリピートタンパク質の蓄積および凝集などの病理学的側面が報告されている（例えば、Stepto, A.ら、２０１４年、Acta Neuropathol.、１２７巻：３７７〜３８９頁において総説されており；また、Almeida, S.ら、２０１３年、Acta Neuropathol.、１２６巻：３８５〜３９９頁；Bieniek, K.F.
ら、２０１４年、JAMA Neurol.、７１巻（６号）：７７５〜７８１頁；van Blitterswijk, M.ら、２０１４年、Mol. Neurodegen.、９巻（３８号）：１０頁も参照されたい）。Ｃ９ＯＲＦ７２は、エンドソームへの輸送を調節することが報告されている（Farg, M.A.ら、２０１４年、Human Mol. Gen.、２３巻（１３号）：３５７９〜３５９５頁）が、Ｃ９ＯＲＦ７２の細胞内機能の多くは、依然として未知のままである。実際、Ｃ９ＯＲＦ７２は、機能が未知の、特徴付けされていないタンパク質をコードする遺伝子である。Ｃ９ＯＲＦ７２をめぐる理解の欠如にもかかわらず、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤについてのいくつかの動物モデルであって、操作細胞株を含む動物モデルが開発されている（Roberson, E.D.、２０１２年、Ann. Neurol.、７２巻（６号）：８３７〜８４９頁；Panda, S.K.ら、２０１３年、Genetics、１９５巻：７０３〜７１５頁；Suzuki, N.ら、２
０１３年、Nature Neurosci.、１６巻（１２号）：１７２５〜１７２８頁；Xu, Z.ら、２０１３年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（１９号）：７７７８〜７７８３頁；Hukema, R.K.ら、２０１４年、Acta Neuropathol. Comm.、２巻（１６６号）：４頁）。例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２のエクソン２〜６を置きかえた、ｌａｃＺ遺伝子挿入を有するトランスジェニックマウス（３１１００４Ｏ２１Ｒｉｋ）が、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ
Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔの遺伝子ターゲティングの取組みにより作製されている（Suzuki, N.ら、２０１３年、上掲の図１ｄを参照されたい；ＫＯＭＰについては、Skarnes, W.C.ら、２０１１年、Nature、４７４巻（７３５１号）：３３７〜３４２頁を参照
されたい）。これらのマウスの、脳、脊髄、精巣、および脾臓の胚中心では、Ｘ−ｇａｌ染色が観察されたが、筋肉（前腓骨筋）、心臓、肺、肝臓、および腎臓では観察されなかった。しかし、残りの、欠失させていないエクソン（すなわち、７〜１１）が、何らかの発現をもたらし、結果として、機能するのかどうかは不明である。蛍光レポーターと作動可能に連結し、周囲Ｃ９ｏｒｆ７２配列を伴わない、テトラサイクリン応答性エレメントにより制御される、８０回のＧＧＧＧＣＣリピートを含有するトランスジェニックマウス系統を使用する別の報告が、ＡＬＳ−ＦＴＤ患者において見られる封入体と類似する、ニューロンの細胞質封入体を裏付けたことから、リピート拡張自体が、疾患の一因でありうることが示唆される（Hukema, R.K.ら、２０１４年、Acta Neuropathol. Comm.、２巻（１６６号）：４頁）。これらのマウスは、ＣＮＳの細胞内の初期Ｃ９ｏｒｆ７２発現プロファイルを確立し、リピート拡張と関連する作用機構についてのある程度の理解をもたらすのには有用であったが、これらのマウスにおける、これらの構築物の特異的デザインが、Ｃ９ｏｒｆ７２に確かに帰せられうる特異的機能を指し示すのか、Ｃ９ｏｒｆ７２の機能とは関連しない、別の何物かの結果であるのかは、依然として不明のままである。
場合によって、しかし、構築物のデザインは、結果として得られるトランスジェニック動物の表現型に影響を与えうる（例えば、Muller, U.、１９９９年、Mech. Develop.、８１巻：３〜２１頁を参照されたい）。上記で記載したＣ９ｏｒｆ７２破壊マウスは、プロモーター駆動型選択カセットを伴うターゲティングベクターを活用した（Suzuki, N.
ら、２０１３年、上掲の図１ｄ；Skarnes, W.C.ら、２０１１年、上掲の図１を参照されたい）ため、提示される発現パターンが、正常Ｃ９ＯＲＦ７２発現と正確に相関するのかどうかは、明らかでない。実際、残りのエクソン７〜１１の発現が、選択カセットに関連するプロモーターにより駆動されるのか、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーター自体により駆動されるのかは、決定されていない。結果として、このようなマウスにおいて観察される表現型と、おそらくは、ｌａｃＺを介するＣ９ＯＲＦ７２発現とは、ターゲティングベクターの様相に起因して、改変されているか、または他の形で歪んでいる可能性がある。さらに、誘導性ＧＧＧＧＣＣリピート（Hukema、２０１４年、上掲）を含有するトランスジェニックマウス系統は、おそらく、このような周囲配列は、リピート配列の翻訳に影響を及ぼすと考えられることのために、ヒトフランキング配列を伴わずにデザインされた。したがって、Ｃ９ＯＲＦ７２を媒介する生物学を治療適用のために利用する、このようなｉｎ ｖｉｖｏ系は、不完全である。
本明細書で記載される通り、本開示は、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤについての非ヒト動物モデルであって、非ヒト動物がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含む非ヒト動物モデルについて具体的に記載する。特に、本開示は、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤについての齧歯動物モデルであって、齧歯動物が、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の、全てのＣ９ｏｒｆ７２アイソフォームについての全コード配列（例えば、Ｖ１の、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分）の、ｌａｃＺレポーター遺伝子の挿入を介しての欠失を含む齧歯動物モデルについて具体的に記載する。本発明者らが利用するターゲティングベクターは、薬物選択カセットの、発生依存的な方法の除去を可能とし、これにより、プロモーターが作用する如何なる可能性、または残存するエクソンの異常な発現、または選択カセット自体に由来する作用を除去する自己欠失薬物選択カセット（例えば、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号を参照されたい）を含有するようにデザインされた。本明細書で記載される通り、本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２の完全な除去を達成した。さらに、本発明者らは、ロータロッドアッセイ、オープンフィールドアッセイ、およびＣａｔＷａｌｋアッセイを使用して、６０週齢まで、これらの齧歯動物の運動行動を測定し、同じ期間を通して、神経学的欠損も測定した。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに述べると、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２ノックアウト齧歯動物のうちで、６０週齢を過ぎて生存したのは４０％に過ぎず、齧歯動物は、およそ４０週齢以降、体重の増加が止まったことを裏付ける。ロータロッド試験が、Ｃ９ｏｒｆ７２の欠失に起因する有意な変化を示さなかったのに対し、本明細書で記載される齧歯動物は、およそ５０週齢において、著明な後肢不全麻痺、運動機能障害、運動性の低下、および歩行異常を示した。さらに、本開示は、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２の遺伝子サイレンシングが、ヒト運動ニューロン疾患において見出される異常と同様な、複数の運動異常および神経学的異常を結果としてもたらすことを具体的に裏付ける。したがって、本明細書で記載される齧歯動物は、少なくとも一部の実施形態では、例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤなどの神経変性疾患を処置するための、治療剤候補を開発するための、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系を提供する。さらに、本明細書で記載される齧歯動物は、既存の動物モデルにおける欠損であって、Ｃ９ｏｒｆ７２を標的とする療法の開発には最適未満である、Ｃ９ｏｒｆ７２の欠失によって特徴付けられる欠損も克服する。
Ｃ９ＯＲＦ７２配列
マウスＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントについては、当技術分野で報告されており（例えば、Koppersら、Ann Neurol（２０１５年）；７８巻：４２６〜４３８頁；Atkinsonら、Acta Neuropathologica Communications（２０１５年）、３巻：５９頁）、また、図１Ａでも描示されている。報告されている３つのマウスＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントについてのゲノム情報はまた、ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０８１２７（Ｖ１）、ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０８１２６（Ｖ２）、およびＥＮＳＭＵＳＴ００００００８４７２４（Ｖ３）の呼称の下、Ｅｎｓｅｍｂｌウェブサイトでも入手可能である。例示的な非ヒト（例えば、齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２のｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列を、表１に明示する。ｍＲＮＡ配列については、括弧内に示される太字体は、コード配列を表示し、表示される場合の連続するエクソンは、交互の小文字と大文字により分けられている。アミノ酸配列については、表示される場合の成熟ポリペプチド配列を太字体としている。
当技術分野では、ヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントが公知である。１つのヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントは、中央および３’側コード領域の複数のエクソンを欠き、その３’末端エクソンは、バリアント３で使用されるスプライス部位（下記を参照されたい）を越えて伸長する結果として、バリアント３と比較した、新規の３’側非翻訳領域（ＵＴＲ）をもたらす。このバリアントは、有意に短いポリペプチドをコードし、そのＣ末端アミノ酸は、他の２つのバリアントによりコードされるＣ末端アミノ酸と比較して識別可能である。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１４５００５．６およびＮＰ＿６５９４４２．２において見出すことができ、参照により本明細書に組み込まれる。第２のヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアント（２）は、５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）が、バリアント３と比較して異なる。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１８３２５．４およびＮＰ＿０６０７９５．１において見出すことができ、参照により本明細書に組み込まれる。第３のヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアント（３）は、報告された３つのバリアントの中で最も長い配列を含有し、より長いアイソフォームをコードする。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２５６０５４．２およびＮＰ＿００１２４２９８３．１において見出すことができ、参照により本明細書に組み込まれる。バリアント２とバリアント３とは、同じタンパク質をコードする。
Figure 2021118745
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Ｃ９ＯＲＦ７２ターゲティングベクター、およびＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座内に破壊を有する非ヒト動物の作製
本明細書では、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物を作製するための、ターゲティングベクターまたはターゲティング構築物が提示される。
ＤＮＡ配列を使用して、ノックアウト動物（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２ ＫＯ）のためのターゲティングベクターを調製することができる。適切な宿主細胞内でポリヌクレオチド分子を複製するために、レポーター遺伝子および／または選択用マーカーをコードするポリヌクレオチド分子（例えば、インサート核酸）を、ベクター、好ましくは、ＤＮＡベクターへと挿入することが典型的である。
ポリヌクレオチド分子（またはインサート核酸）は、標的遺伝子座へと組み込むことが所望される、ＤＮＡのセグメントを含む。一部の実施形態では、インサート核酸は、１または複数の、目的のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、インサート核酸は、１または複数の発現カセットを含む。一部のある特定の実施形態では、発現カセットは、目的のポリヌクレオチド、選択マーカーおよび／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドと共に、一部のある特定の実施形態では、発現に影響を与える、多様な調節性構成要素を含む。事実上任意の目的のポリヌクレオチドを、インサート核酸内に含有させ、これにより、標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができる。本明細書で開示される方法は、標的としたＣ９ＯＲＦ７２ゲノム遺伝子座へと組み込まれる、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える目的のポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、インサート核酸内に含有される目的のポリヌクレオチドは、レポーターをコードする。一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、選択用マーカーをコードする。
一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）で挟まれるか、またはこれらを含む。一部のある特定の実施形態では、部位特異的組換え部位は、レポーターをコードするＤＮＡセグメント、および／または選択用マーカーをコードするＤＮＡセグメントを挟む。本明細書では、選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含む例示的な目的のポリヌクレオチドであって、インサート核酸内に含まれうる、目的のポリヌクレオチドについて記載する。
当技術分野では、プラスミド、ＤＮＡ構築物、および／またはターゲティングベクターの調製、ならびに宿主生物の形質転換において利用される、多様な方法が公知である。原核細胞および真核細胞の両方に適する他の発現系のほか、一般的な組換え手順については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、２版、Sambrook, J.ら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年を参照されたい。
上記で記載した通り、ノックアウト動物のためのターゲティングベクターの構築における使用のための、例示的な非ヒト（例えば、齧歯動物）Ｃ９ＯＲＦ７２の核酸配列およびアミノ酸配列を、表１に提示する。他の非ヒトＣ９ＯＲＦ７２配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいても見出すことができる。Ｃ９ＯＲＦ７２ターゲティングベクターは、一部の実施形態では、レポーター遺伝子および／または選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列であって、標的領域のフランキング配列と同一であるかまたは実質的に相同な配列（「相同性アーム」ともまた称する）であり、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムへの挿入のための配列により挟まれたＤＮＡ配列を含む。例を１つだけ示せば、欠失開始点を、第１のエクソンの上流（５’側）、第１のコードエクソン、または第１のコドンもしくは第２のコドンに設定して、インサート核酸を、内因性調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することを可能とすることができる。図１Ａは、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の全コード配列の、標的とした欠失と、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子に由来する配列を含有するカセット、およびＧ４１８耐性胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを選択するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする薬物選択カセット（Ｎｅｏ）による置きかえとを施すためのターゲティング戦略について例示する。ターゲティングベクターはまた、リコンビナーゼをコードする配列（例えば、Ｃｒｅ）であって、ＥＳ細胞特異的ｍｉＲＮＡまたは生殖細胞特異的プロモーター（例えば、プロタミン１プロモーター；Ｐｒｏｔ−Ｃｒｅ−ＳＶ４０）により調節される配列も含む。薬物選択カセットおよびＣｒｅリコンビナーゼコード配列を、Ｃｒｅを媒介する薬物選択カセットの切出しを発生依存的な方法で可能にするｌｏｘＰ（ＬＰ）リコンビナーゼ認識部位で挟む、例えば、その生殖細胞が上記で記載した破壊されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子を含有する、齧歯動物に由来する後代が、発生の間に選択用マーカー（Ｎｅｏ）を脱落させる（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、同第８，３５４，３８９号、同第８，９４６，５０５号、および同第８，９４６，５０４号を参照されたい）。これは、とりわけ、選択カセットの、分化細胞または生殖細胞からの自動的切出しを可能とする。こうして、表現型解析の前に、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２プロモーターに作動可能に連結したｌａｃＺレポーター遺伝子だけを残して、薬物選択カセットは除去される。
本明細書で記載される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の破壊は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座もしくはその部分の、インサート核酸による置きかえ、またはＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座もしくはその部分への、インサート核酸の挿入／付加を含みうる。一部の実施形態では、インサート核酸は、レポーター遺伝子を含む。一部のある特定の実施形態では、レポーター遺伝子を、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターと作動可能に連結して配置する。このような改変は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の発現を可能とする。代替的には、レポーター遺伝子を、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２プロモーターとの作動可能な連結下に置かない。
様々なレポーター遺伝子（または検出用部分）を、本明細書で記載されるターゲティングベクター内で使用することができる。例示的なレポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ＭｍＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組合せを含む。本明細書で記載される方法は、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺレポーター遺伝子の使用を利用するターゲティングベクターの構築を示すが、本開示を一読した当業者は、本明細書で記載される非ヒト動物を、レポーター遺伝子の非存在下で生み出すこともでき、当技術分野で公知の任意のレポーター遺伝子と共に生み出すこともできることを理解する。
適切な場合、レポーターポリペプチドを全体または部分的にコードする、遺伝子素材のコード領域またはポリヌクレオチド配列（複数可）は、非ヒト動物における発現について最適化されたコドンを含むように、改変することができる（例えば、米国特許第５，６７０，３５６号、および同第５，８７４，３０４号を参照されたい）。コドン最適化配列は、合成配列であり、コドンが最適化されていない親ポリヌクレオチドによりコードされる、同一なポリペプチド（または全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する、全長ポリペプチドの、生物学的に活性の断片）をコードすることが好ましい。一部の実施形態では、レポーターポリペプチド（例えば、ｌａｃＺ）を全体または部分的にコードする、遺伝子素材のコード領域は、コドン使用を、特定の細胞型（例えば、齧歯動物細胞）のために最適化するように変更された配列を含みうる。例えば、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）のゲノムへと挿入されるレポーター遺伝子のコドンは、非ヒト動物の細胞内の発現について最適化することができる。このような配列は、コドン最適化配列として記載することができる。
本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含む非ヒト動物を作製するための組成物および方法であって、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターおよびＣ９ＯＲＦ７２調節配列から、レポーター遺伝子を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法を含む組成物および方法が提供される。一部の実施形態ではまた、内因性プロモーターおよび内因性調節配列から、レポーター遺伝子を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供される。方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の全コード配列を全体または部分的に欠失させるように、本明細書で記載されるターゲティングベクターであって、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）をコードするターゲティングベクターを、非ヒト動物のゲノムへと挿入するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における、全てのＣ９ＯＲＦ７２アイソフォームについての全コード配列を欠失させるように、ターゲティングベクターを、非ヒト動物のゲノムへと挿入するステップを含む。
Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーター（例えば、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーター）に作動可能に連結したレポーター遺伝子の挿入は、比較的最小限のゲノムの改変を利用し、非ヒト動物において、Ｃ９ＯＲＦ７２特異的な方法の、レポーターポリペプチドの発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、本明細書で記載されるターゲティングベクターを構成する、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座を含む。
本明細書で記載されるターゲティングベクターを、Frendewey, D.ら、２０１０年、Methods Enzymol.、４７６巻：２９５〜３０７頁において記載されている通りに、ＥＳ細
胞へと導入し、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を宿すＥＳクローンについてスクリーニングすることができる。本明細書で開示される方法および組成物では、様々な宿主胚を利用することができる。例えば、標的とした遺伝子改変を有する多能性細胞および／または全能性細胞を、対応する生物に由来する前桑実胚期胚（例えば、８細胞期の胚）へと導入することができる。例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８／００７８０００Ａ１を参照されたい。他の場合には、ドナーＥＳ細胞を、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚へと移植することができる。宿主胚はまた、胚盤胞の場合もあり、前胚盤胞胚、前桑実胚期胚、桑実胚期胚、密集していない桑実胚期胚、または密集した桑実胚期胚の場合もある。
一部の実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（Poueymirou, W.T.
ら、２００７年、Nat. Biotechnol.、２５巻：９１〜９９頁）を適用して、陽性ＥＳ細
胞を、８細胞胚へと注入して、ｌａｃＺによる発現プロファイリングまたはホモ接合性への交配への準備のできた、完全にＥＳ細胞に由来するＦ０世代のヘテロ接合性マウスを生み出すことができる。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物を生み出すための例示的な方法を、実施例１に提示する。
当技術分野では、ノックアウトおよびノックインを含むトランスジェニック非ヒト動物を生み出すための方法が周知である（例えば、Gene Targeting: A Practical Approach、Joyner編、Oxford University Press, Inc.（２０００年）を参照されたい）。例えば、トランスジェニック齧歯動物の作出は、任意選択で、一部の実施形態では、内因性齧歯動物遺伝子と同じ場所における、内因性齧歯動物遺伝子の遺伝的座位の破壊と、レポーター遺伝子の、齧歯動物ゲノムへの導入とを伴いうる。
マウスＣ９ｏｒｆ７２のゲノム構成についての概略例示（原寸に比例してはいない）を、図１Ａに提示する。レポーター遺伝子を使用して、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の、全コード配列を欠失させるための、例示的なターゲティング戦略もまた、図１Ａに提示する。例示される通り、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分を含有するゲノムＤＮＡを欠失させ、部位特異的リコンビナーゼ認識部位で挟んだレポーター遺伝子および薬物選択カセットで置きかえる。この戦略で使用されるターゲティングベクターは、リコンビナーゼを、未分化細胞内で発現させるように、発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結した、リコンビナーゼコード配列を含む。本明細書で記載されるターゲティングベクターに含まれうる、例示的なプロモーターを、表２に提示する。本明細書で記載されるターゲティングベクターにおいて使用しうる、さらなる適切なプロモーターは、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号において記載されているプロモーターを含む。相同組換えを施したら、内因性ネズミのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の全コード配列（例えば、エクソン２のコード部分〜エクソン１１のコード部分）を、ターゲティングベクター内に含有される配列で置きかえる。薬物選択カセットは、発生依存的な方法で除去される。すなわち、生殖系列細胞が、上記で記載した、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を含有するマウスに由来する後代は、発生の間に、選択用マーカーを、分化細胞から脱落させる（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号を参照されたい）。
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トランスジェニックのファウンダー非ヒト動物は、そのゲノム内のレポーター遺伝子の存在（またはＣ９ＯＲＦ７２の非存在）、および／または非ヒト動物の組織内もしくは細胞内のレポーターの発現（またはＣ９ＯＲＦ７２の発現の欠如）に基づき同定することができる。次いで、トランスジェニックのファウンダー非ヒト動物を使用して、レポーター遺伝子を保有するさらなる非ヒト動物を交配させ、これにより、各々が本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座の１または複数のコピーを保有する一連の非ヒト動物を作り出すことができる。
トランスジェニック非ヒト動物はまた、トランス遺伝子の、調節されるかまたは方向付けられた発現を可能とする選択系を含有するように作製することもできる。例示的な系は、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（例えば、Lakso, M.ら、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：６２３２〜６２３６頁を参照されたい）と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼ系（O'Gorman, S.ら、１９９１年、Science、２５１巻：１３５１〜１３５５頁）とを含む。このような動物は、例えば、一方は、選択されるポリペプチド（例えば、レポーター遺伝子）をコードするトランス遺伝子を含有し、他方は、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）をコードするトランス遺伝子を含有する、２種のトランスジェニック動物を交尾させることによる、「二重」トランスジェニック動物の構築を介して提供することができる。
本明細書では、マウス（すなわち、全Ｃ９ｏｒｆ７２コード配列を欠失させたマウス）におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を利用する実施形態について広範に論じているが、他の、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含む非ヒト動物もまた提供される。一部の実施形態では、このような非ヒト動物は、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターに作動可能に連結したレポーターの挿入によって特徴付けられる、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含む。このような非ヒト動物は、本明細書で開示される通り、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の全コード配列を欠失させるように遺伝子改変させうる非ヒト動物であって、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ科動物（例えば、牝牛、牡牛、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含む非ヒト動物のうちのいずれかを含む。例えば、適切な、遺伝子改変できるＥＳ細胞がたやすく入手可能でない非ヒト動物には、他の方法を利用して、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、体細胞核移入（ＳＣＮＴ）を利用して、遺伝子改変されたゲノムを、適切な細胞、例えば、脱核卵母細胞へと移入するステップと、改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を、非ヒト動物において、胚を形成するのに適する条件下で懐胎させるステップとを含む。
略述すると、核移入のための方法は、（１）卵母細胞を脱核するステップと；（２）脱核卵母細胞と組み合わされる、ドナー細胞またはドナー核を単離するステップと；（３）細胞または核を、脱核卵母細胞へと挿入して、再構成細胞を形成するステップと；（４）再構成細胞を、動物の子宮へと植え込んで、胚を形成するステップと；（５）胚の発生を可能とするステップとを含む。このような方法では、卵母細胞は一般に、死亡した動物から取り出されるが、卵母細胞はまた、生存動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞は、脱核の前に、当業者に公知の様々な媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の脱核は、当業者に公知の様々な方式で実施することができる。ドナー細胞またはドナー核の、脱核卵母細胞への挿入であって、再構成細胞を形成する挿入は、融合の前における、ドナー細胞の、透明帯下へのマイクロインジェクションにより達成することが典型的である。融合は、接触／融合面を隔てたＤＣ電気パルスの印加（電気融合）により誘導することもでき、細胞の、ポリエチレングリコールなど、融合促進化学物質への曝露により誘導することもでき、センダイウイルスなどの不活化ウイルスにより誘導することもできる。再構成細胞は、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前に、融合の間に、および／または融合の後で、電気的手段および／または非電気的手段により活性化させることが典型的である。活性化方法は、電気パルス、化学的誘発ショック（chemically induced shock）、精子による貫通、卵母細胞内の二価カチオンレベルの上昇、卵母細胞内の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤によるなど）を含む。活性化させた再構成細胞または再構成胚は、当業者に公知の培地中で培養し、次いで、動物の子宮へと移すことが典型的である。例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８−００９２２４９Ａ１号、ＷＯ１９９９／００５２６６Ａ２、米国特許出願公開第２００４−０１７７３９０Ａ１号、ＷＯ２００８／０１７２３４Ａ１、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
非ヒト動物（例えば、ブタ、ウシ、齧歯動物、ニワトリなどの）ゲノムを改変するための方法は、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用して、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含むように、ゲノムを改変するステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物である。一部の実施形態では、本明細書で記載される遺伝子改変動物は、齧歯動物である。一部の実施形態では、本明細書で記載される齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書で記載される齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書で記載される遺伝子改変動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（狭義の（true）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリマウス、イワマウス、オジロラット（with-tailed rat）、マダガスカルラットおよびマダガスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科に由来する。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載される遺伝子改変齧歯動物は、狭義のマウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載される遺伝子改変マウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバーに由来する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、齧歯動物である。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載される齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、マウスである。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２（例えば、Festingら、１９
９９年、Mammalian Genome、１０巻：８３６頁；Auerbach, W.ら、２０００年、Biotechniques、２９巻（５号）：１０２４〜１０２８、１０３０、１０３２頁を参照されたい
）である系統からなる群から選択される１２９系統である。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載される遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と、前述のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるマウスは、前述の１２９系統のミックス、または前述のＢＬ／６系統のミックスである。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統と、前述の別の系統とのミックスである。
一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、ラットである。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統（Ｆ３４４、Ｆ６）、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される、２つまたはこれを超える系統のミックスである。
ラット多能性細胞および／またはラット全能性細胞は、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含む、任意のラット系統に由来しうる。ラット多能性細胞および／またはラット全能性細胞はまた、上記で列挙した、２つまたはこれを超える系統のミックスに由来する系統からも得ることができる。例えば、ラット多能性細胞および／またはラット全能性細胞は、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来しうる。ＡＣＩラット系統は、白色の腹部および足部ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを伴うブラックアグーチ（black agouti）を有することを特徴とする。このような
系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手可能である。ＡＣＩラットに由来するラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴付とする。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手可能である。ＤＡラットに由来するラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株およびＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。場合によって、ラット多能性細胞および／またはラット全能性細胞は、近交系ラット系統に由来する。例えば、２０１４年２月２０日に出願され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．２０１４／０２３５９３３Ａ１を参照されたい。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を含む非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、機能喪失を結果としてもたらす。特に、機能喪失変異は、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現の減少もしくは欠如、および／またはＣ９ＯＲＦ７２の活性／機能の減少もしくは欠如を結果としてもたらす変異を含む。一部の実施形態では、機能喪失変異は、本明細書で記載される１または複数の表現型を結果としてもたらす。Ｃ９ＯＲＦ７２の発現は、直接、例えば、本明細書で記載される非ヒト動物の細胞内または組織内のＣ９ＯＲＦ７２のレベルをアッセイすることにより測定することができる。
Ｃ９ＯＲＦ７２の発現レベルおよび／または活性は、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現レベルおよび／または活性レベルが、同じ破壊（例えば、欠失）を含まない、適切な対照細胞または対照非ヒト動物におけるＣ９ＯＲＦ７２のレベルより統計学的に低度である（ｐ≦０．０５）場合に低下することが典型的である。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２の濃度および／または活性は、同じ破壊（例えば、欠失）を欠く対照細胞または対照非ヒト動物と比べて、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはこれを超えて低下する。
他の実施形態では、サザンブロット解析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ解析、または表現型解析を含むがこれらに限定されない方法を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を有する細胞または生物であって、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現レベルおよび／または活性を低減する細胞または生物を選択する。次いで、このような細胞または非ヒト動物を、本明細書で記載される、多様な方法および組成物において利用する。
一部の実施形態では、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座を欠失させない（すなわち、無傷とする）。一部の実施形態では、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座を、異種配列（例えば、レポーター遺伝子コード配列）により、変更するか、破壊するか、欠失させるか、または置きかえる。一部の実施形態では、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の全てまたは実質的に全てを、インサート核酸で置きかえるが、一部のある特定の実施形態では、ｌａｃＺレポーター遺伝子を、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーター（例えば、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーター）と作動可能に連結しているように、置きかえは、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の全コード配列の、ｌａｃＺレポーター遺伝子による置きかえを含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子の部分（例えば、その機能断片）を、内因性非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座へと挿入する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子である。一部の実施形態では、レポーター遺伝子を、内因性Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の２つのコピーのうちの１つへと挿入し、レポーター遺伝子に関してヘテロ接合性である非ヒト動物をもたらす。一部の実施形態では、レポーター遺伝子についてホモ接合性である非ヒト動物が提供される。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物を利用する方法
本明細書で記載される非ヒト動物は、神経変性疾患、神経変性障害、および神経変性状態についての改善された動物モデルを提供する。特に、本明細書で記載される非ヒト動物は、上位運動ニューロンの症状および／または非運動ニューロンの喪失によってを特徴付けられる、例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤなどのヒト疾患への置き換える（translate）改善された動物モデルを提供する。
例えば、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、本明細書で提示される非ヒト動物において、多様な症状（または表現型）を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の欠失は、出生時において、肉眼では正常であるが、年齢が進むと、例えば、約８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、１２週齢、１３週齢、１４週齢、１５週齢、１６週齢、１７週齢、１８週齢、１９週齢、２０週齢、２１週齢、２２週齢、２３週齢、２４週齢、２５週齢、２６週齢、２７週齢、２８週齢、２９週齢、３０週齢、３１週齢、３２週齢、３３週齢、３４週齢、３５週齢、３６週齢、３７週齢、３８週齢、３９週齢、４０週齢、４１週齢、４２週齢、４３週齢、４４週齢、４５週齢、４６週齢、４７週齢、４８週齢、４９週齢、５０週齢、５１週齢、５２週齢、５３週齢、５４週齢、５５週齢、５６週齢、５７週齢、５８週齢、５９週齢、６０週齢などとなった後において、ＡＬＳ様症状を発症する、非ヒト動物を結果としてもたらす。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の欠失は、１または複数の細胞型、例えば、ニューロンおよび／またはその部分の異常な機能を結果としてもたらす。ニューロンは、感覚ニューロンまたは運動ニューロンを含む。本明細書で記載される非ヒト動物には、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤと関連する他の表現型も存在しうる。例えば、ＡＬＳ様表現型は、１または複数のニューロン、例えば、運動ニューロンおよび／または感覚ニューロンの機能障害を伴いうる。さらに、上位運動ニューロンに関与するＡＬＳ様表現型は、痙性（例えば、痙性麻痺、硬直）、反射の増加および／または異常（例えば、バビンスキー徴候）、振戦、ならびにこれらの組合せを結果としてもたらしうる。下位運動ニューロンの機能障害に関与するＡＬＳ様表現型は、筋力低下および衰弱、線維束攣縮、ならびにこれらの組合せ、ならびに／または延髄の機能障害であって、嚥下不能および舌の線維束攣縮を結果としてもたらす機能障害を結果としてもたらしうる。ＡＬＳ様症状はまた、以下の表現型：ａ）後彎；ｂ）異常な後肢クラスピング、引きずり、もしくは足指の屈曲；ｃ）運動協調および運動学習能力の欠損、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、および／もしくはオープンフィールド試験における欠損；ｄ）脊髄における運動ニューロンの喪失；ｅ）脊髄における星状細胞増加；ｆ）対照の齧歯動物と比較した体重減少；ｇ）ポリユビキチン化タンパク質の蓄積、ならびに／またはｈ）ＡＬＳ−ＴＤＩ神経学的スコア付けシステム（表３）を使用する、神経学的スコア付けの増加、のうちの１または複数も含みうる。
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したがって、少なくとも一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態（例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ）についての改善された動物モデルを提供し、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態の、１または複数の表現型（または症状）を処置、防止、および／または阻害するための治療用薬剤の開発および／または同定のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物における、１または複数の症状（または表現型）は、表３に掲載される。
本明細書で記載される非ヒト動物はまた、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態（例えば、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ）の１または複数の症状を、処置、防止、および／または阻害するための治療用薬剤を同定するためのｉｎ ｖｉｖｏ系も提供する。一部の実施形態では、治療用薬剤を、本明細書で記載される、Ｃ９ＯＲＦ７２の破壊を有し、３８週齢になった後で神経変性症状を発症する、非ヒト動物へと投与することにより、前記治療用薬剤の阻害性効果を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて決定する。
本明細書で記載される非ヒト動物はまた、炎症性疾患または自己免疫疾患、炎症性障害または自己免疫障害、および炎症性状態または自己免疫状態についての改善された動物モデルも提供する。特に、本明細書で記載される非ヒト動物は、多様な臓器（例えば、腎臓、肝臓、脾臓など）内の免疫細胞の浸潤によって特徴付けられるヒト炎症性疾患へ置き換える改善された動物モデルを提供する。加えて、本明細書で記載される非ヒト動物は、血清中の自己抗体（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭ）の存在の増加によって特徴付けられるヒト自己免疫疾患へ置き換える改善された動物モデルを提供する。
例えば、本明細書で記載されるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊は、本明細書で提示される非ヒト動物において、多様な状態（または表現型）を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の欠失は、出生時において、肉眼では正常であるが、年齢が進むと、例えば、約８週齢、９週齢、１０週齢、１１週齢、１２週齢、１３週齢、１４週齢、１５週齢、１６週齢、１７週齢、１８週齢、１９週齢、２０週齢、２１週齢、２２週齢、２３週齢、２４週齢、２５週齢、２６週齢、２７週齢、２８週齢、２９週齢、３０週齢、３１週齢、３２週齢、３３週齢、３４週齢、３５週齢、３６週齢、３７週齢、３８週齢、３９週齢、４０週齢、４１週齢、４２週齢、４３週齢、４４週齢、４５週齢、４６週齢、４７週齢、４８週齢、４９週齢、５０週齢、５１週齢、５２週齢、５３週齢、５４週齢、５５週齢、５６週齢、５７週齢、５８週齢、５９週齢、６０週齢などとなった後において、炎症性状態および／または自己免疫状態を発症する非ヒト動物を結果としてもたらす。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の欠失は、１または複数の免疫細胞型、例えば、形質細胞、単球、顆粒球および／またはマクロファージの浸潤を結果としてもたらす。本明細書で記載される非ヒト動物には、炎症性状態および／または自己免疫状態と関連する他の表現型が存在しうる。例えば、炎症性状態または自己免疫状態は、脾臓、リンパ節、腎臓、および／または肝臓のうちの１または複数の腫大を伴いうる。さらに、血液に関与する炎症性状態または自己免疫状態は、自己抗体の存在の増加を結果としてもたらしうる。肝臓に関与する炎症性状態または自己免疫状態は、肝炎を結果としてもたらしうる。
したがって、少なくとも一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物は、炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態についての改善された動物モデルを提供し、炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態の、１または複数の表現型（または症状）を処置、防止、および／または阻害するための治療用薬剤の開発および／または同定のために使用することができる。一部の実施形態では、炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態は、本明細書で記載される非ヒト動物の、１または複数の臓器内または組織内に存在する。一部のある特定の実施形態では、１または複数の臓器または組織は、脾臓、肝臓、リンパ節、腎臓、骨髄、および血液を含む。
本明細書で記載される非ヒト動物はまた、炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態の１または複数の症状を、処置、防止、および／または阻害するための治療用薬剤を同定するためのｉｎ ｖｉｖｏ系も提供する。一部の実施形態では、治療用薬剤を、本明細書で記載される、Ｃ９ＯＲＦ７２の破壊を有し、８週齢となった後で炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態を発症する非ヒト動物へと投与することにより、前記治療用薬剤の阻害性効果を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて決定する。多様な実施形態では、炎症性疾患および／もしくは自己免疫疾患、炎症性障害および／もしくは自己免疫障害、または炎症性状態および／もしくは自己免疫状態は、糸球体腎炎または肝炎であるかまたはこれを含む。
非ヒト動物には、被験治療用薬剤を、任意の簡便な経路、例えば、全身注射、長期にわたる曝露のためのポンプ、または直接的な脳内注射により投与することができる。治療用薬剤の、非ヒト動物の行動、例えば、運動行動に対する効果を、適切な対照の非ヒト動物であって、治療用薬剤を施されなかった非ヒト動物と比較して決定するように、このような動物を、行動研究に含めることができる。また、動物の脊髄、筋肉、および／もしくは脳組織についての生検もしくは解剖学的評価も実施することができ、かつ／または血液試料もしくはＣＳＰ試料も回収することができる。
本明細書で記載される非ヒト動物は、、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系およびＣ９ＯＲＦ７２の発現を欠く生物学的材料（例えば、細胞）の供給源を提供し、様々なアッセイに有用である。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２の発現および／または活性の欠如と関連する、１または複数の症状を処置、防止、および／または阻害する治療剤を開発する。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２に結合する、候補治療剤（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡなど）を同定、スクリーニング、および／または開発する。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２の活性を遮断する、候補治療剤（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡなど）をスクリーニングおよび開発する。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、本明細書で記載される非ヒト動物のＣ９ＯＲＦ７２ポリペプチド（または転写物）の、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの結合プロファイルを決定する。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２に結合する、１または複数の候補治療用抗体の１または複数のエピトープを決定する。
多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２をターゲティングする薬物の薬物動態プロファイルを決定する。多様な実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の非ヒト動物と、１または複数の対照非ヒト動物または基準非ヒト動物とを、各々、Ｃ９ＯＲＦ７２をターゲティングする、１または複数の候補薬物へと、多様な用量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、もしくは５０ｍｇ／ｋｇ、またはこれを超える）で曝露する。候補治療用抗体は、非経口投与経路および非経口でない投与経路を含む、任意の所望される投与経路を介して投与することができる。非経口経路は、例えば、静脈内経路、動脈内経路、門脈内経路、筋内経路、皮下経路、腹腔内経路、脊髄内経路、クモ膜下腔内経路、脳室内経路、頭蓋内経路、胸膜内経路、または他の注射経路を含む。非経口経路以外の経路は、例えば、経口経路、経鼻経路、経皮経路、肺経路、直腸経路、口腔経路、膣経路、眼経路を含む。投与はまた、連続注入の場合もあり、局所投与の場合もあり、埋め込み物（ゲル、膜など）からの持続放出の場合もあり、かつ／または静脈内注射の場合もある。血液は、非ヒト動物（ヒト化動物および対照動物）から、多様な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大で３０日もしくはそれ超）において単離する。本明細書で記載される非ヒト動物から得られる試料を使用して、投与した、Ｃ９ＯＲＦ７２をターゲティングする薬物の薬物動態プロファイルであって、総ＩｇＧ、抗治療用抗体応答、凝集などを含むがこれらに限定されない薬物動態プロファイルを決定するために、多様なアッセイを実施することができる。
多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２の活性（またはＣ９ＯＲＦ７２によるシグナル伝達もしくはＣ９ＯＲＦ７２媒介の相互作用）を遮断し、モジュレートし、かつ／または阻害する治療的効果と、細胞の変化の結果としての遺伝子の発現に対する効果とを測定する。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物またはこれから単離される細胞を、非ヒト動物のＣ９ＯＲＦ７２をターゲティングする薬物へと曝露し、後続の期間の後で、Ｃ９ＯＲＦ７２依存性プロセス（または相互作用）、例えば、エンドソームへの輸送、免疫ホメオスタシス、または運動ニューロンおよび／もしくは非運動ニューロンの機能に対する効果について解析する。
本明細書で記載される非ヒト動物に由来する細胞をアドホックベースで単離および使用することもでき、多世代にわたり培養で維持することもできる。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物に由来する細胞を、不死化させ（例えば、ウイルスの使用を介して）、培養で、無期限に（例えば、継代培養で）維持する。
多様な実施形態では、本明細書で記載される細胞および／または非ヒト動物を、多様な免疫化レジメンで使用して、抗原に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答）における、Ｃ９ＯＲＦ７２媒介の機能を決定する。一部の実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２に結合するか、またはその１もしくは複数の機能を遮断する候補治療剤を、本明細書で記載される非ヒト動物において特徴付ける。適切な測定は、多様な細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清免疫グロブリン解析（例えば、抗体力価）、細胞傷害作用アッセイ、リガンド−受容体間相互作用の特徴付け（例えば、免疫沈降アッセイ）、およびリガンド間相互作用の特徴付けを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、Ｃ９ＯＲＦ７２媒介の機能であって、抗原に対する免疫応答を調節する機能を特徴付ける。一部の実施形態では、抗原は、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態と関連する。一部の実施形態では、抗原は、炎症性疾患、炎症性障害、または炎症性状態と関連する。一部の実施形態では、抗原は、神経疾患、神経障害、または神経状態と関連する。一部の実施形態では、抗原は、感染因子（例えば、細菌）と関連する。一部の実施形態では、抗原は、検査抗原（例えば、オボアルブミンまたはＯＶＡ）である。一部の実施形態では、抗原は、処置を必要とする、１または複数のヒト患者が患う疾患または状態と関連する標的である。
多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を、１または複数の抗原によるチャレンジのために使用して、所与の抗原に対する特異的Ｂ細胞依存性応答を含むがこれらに限定されない免疫応答のＣ９ＯＲＦ７２依存性調節をモジュレートする、化合物または生物学的薬剤の、治療剤としての潜在的可能性を決定する。
本明細書で記載される非ヒト動物は、薬物またはワクチンの解析および試験のためのｉｎ ｖｉｖｏ系を提供する。多様な実施形態では、候補薬物または候補ワクチンを、本明細書で記載される、１または複数の非ヒト動物へと送達した後で、非ヒト動物をモニタリングして、薬物またはワクチンに対する免疫応答のうちの１または複数、薬物またはワクチンの安全性プロファイル、あるいは疾患もしくは状態、および／または疾患もしくは状態の１もしくは複数の症状に対する効果を決定することができる。安全性プロファイルを決定するのに使用される例示的な方法は、毒性、最適の用量濃度、薬物またはワクチンの有効性、および可能な危険性因子の測定を含む。このような薬物またはワクチンは、このような非ヒト動物において、改善および／または開発することができる。
ワクチンの有効性は、いくつかの方法で決定することができる。略述すると、本明細書で記載される非ヒト動物に、当技術分野で公知の方法を使用してワクチン接種し、次いで、ワクチンでチャレンジするか、またはワクチンを、既に感染させた非ヒト動物へと投与する。非ヒト動物（複数可）の、ワクチンへの応答は、ワクチンの有効性を決定するように、非ヒト動物（複数可）（またはこれから単離される細胞）をモニタリングし、かつ／または非ヒト動物（複数可）に１もしくは複数のアッセイを実施することにより測定することができる。次いで、当技術分野で公知の１もしくは複数の尺度、および／または本明細書で記載される１もしくは複数の尺度を使用して、非ヒト動物（複数可）の、ワクチンへの応答を、対照動物と比較する。
ワクチンの有効性はさらに、ウイルス中和アッセイにより決定することもできる。略述すると、本明細書で記載される非ヒト動物を免疫し、血清を、免疫後の様々な日において回収する。血清の系列希釈物を、ウイルスと共にプレインキュベートすると、その時間中に、血清中の抗体であって、ウイルスに特異的な抗体が、ウイルスに結合する。次いで、ウイルス／血清混合物を、許容細胞へと添加して、プラークアッセイまたはマイクロ中和アッセイにより、感染性を決定する。血清中の抗体が、ウイルスを中和する場合、対照群と比較して、少数のプラークまたは低量の相対ルシフェラーゼ単位が存在する。
本明細書で記載される非ヒト動物は、薬物（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２をターゲティングする薬物）の薬物動態特性および／または有効性を評定するためのｉｎ ｖｉｖｏ系を提供する。多様な実施形態では、薬物を、本明細書で記載される、１または複数の非ヒト動物へと送達または投与した後で、非ヒト動物（またはこれから単離される細胞）をモニタリングするか、またはこれについての１もしくは複数のアッセイを実施して、薬物の、非ヒト動物に対する効果を決定することができる。薬物動態特性は、動物が、薬物を多様な代謝物へと処理する方法（または毒性代謝物を含むがこれらに限定されない、１もしくは複数の薬物代謝物の存在または非存在の検出）、薬物の半減期、投与後における薬物の循環レベル（例えば、薬物の血清濃度）、抗薬物応答（例えば、抗薬物抗体）、薬物の吸収および分布、投与経路、薬物の排出および／またはクリアランスの経路を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、薬物（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２モジュレーター）の薬物動態特性および薬力学特性を、本明細書で記載される非ヒト動物において、または該非ヒト動物使用を通してモニタリングする。
一部の実施形態では、アッセイの実施は、薬物が投与される非ヒト動物の表現型および／または遺伝子型に対する効果を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイの実施は、薬物（例えば、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストなどのＣ９ＯＲＦ７２モジュレーター）について、ロット間のばらつきを決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイの実施は、本明細書で記載される非ヒト動物へと投与された薬物の効果と、基準非ヒト動物へと投与された薬物の効果との差違を決定することを含む。多様な実施形態では、基準非ヒト動物は、本明細書で記載される改変を有する場合もあり、本明細書で記載される改変とは異なる改変を有する場合（例えば、変更されているか、破壊されているか、欠失しているか、挿入されているか、改変されているなどであるか、または他の形で非機能的なＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座を有する非ヒト動物）もあり、改変を有さない場合（すなわち、野生型非ヒト動物）もある。
薬物の薬物動態特性を評定するために、非ヒト動物において（またはこれから単離される細胞において、かつ／もしくは該細胞を使用して）測定しうる、例示的なパラメータは、凝集、オートファジー、細胞分裂、細胞死、補体媒介溶血、ＤＮＡの完全性、薬物特異的抗体力価、薬物の代謝、遺伝子発現アレイ、代謝的活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質の生合成、タンパク質の分解、タンパク質の分泌、ストレス応答、標的組織の薬物濃度、非標的組織の薬物濃度、転写の活性などを含むがこれらに限定されない。多様な実施形態では、本明細書で記載される非ヒト動物を使用して、薬物（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２をターゲティングする薬物）の薬学的有効用量を決定する。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を、どのようにして作製および使用するのかについて、当業者に向けて記載するように提示されるものであり、本発明者らが、自身の発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、温度は、摂氏で表示し、圧力は、大気圧または大気圧近傍の圧力である。
（実施例１）
非ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座における破壊の作出
本実施例は、齧歯動物のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座における標的破壊について例示する。特に、本実施例は、マウスＣ９ｏｒｆ７２プロモーターとの作動可能な連結下に置かれたｌａｃＺレポーター構築物を使用する、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の全コード配列の欠失について具体的に記載する。内因性マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を作り出すための、Ｃ９ｏｒｆ７２−ｌａｃＺターゲティングベクターは、既に記載されている通りに作製した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号；Valenzuelaら、２００３年、Nature、Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁；ならびにAdams, N.C.およびN.W. Gale、Mammalian and Avian Transgeneis-New Approaches、Lois, S.P.a.C.編、Springer Verlag、Berlin Heidelberg、２００６年を参照されたい）。結果とし
て得られる改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を、図１Ａ（下ボックス）に描示する。
略述すると、マウスＲＰ２３ ＢＡＣライブラリー（Adams, D.J.ら、２００５年、Genomics、８６巻：７５３〜７５８頁）に由来する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを使用して、ターゲティングベクターを作出し、Ｆ１ハイブリッド（１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ／Ｃ５７ＢＬ６ＮＴａｃ）胚性幹（ＥＳ）細胞へと導入するのに続いて、Ｇ４１８を含有する選択培地中で培養した。薬物耐性コロニーを、電気穿孔の１０日後に採取し、既に記載されている（Valenzuelaら、上掲；Frendewey, D.ら、２０１０年、Methods Enzymol.、４７６巻：２９５〜３０７頁）通りに、適当なターゲティングのためにスクリーニ
ングした。標的としたＥＳ細胞を、密集していない８細胞期のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚へと注入して、健常な、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代のマウスであって、Ｃ９ｏｒｆ７２の欠失についてヘテロ接合性のマウスを作製する、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（DeChiara, T.M.ら、２０１０年、Methods Enzymol.、４７６巻：２８５〜２９４頁；Dechiara, T.M.、２００９年、Methods Mol. Biol.、５３０巻：３１１〜
３２４頁；Poueymirouら、２００７年、Nat. Biotechnol.、２５巻：９１〜９９頁）を
使用した。Ｆ０世代のヘテロ接合性雄を、Ｃ５７Ｂｌ６／ＮＴａｃ雌と交配させて、Ｆ１ヘテロ接合体を作出し、これを異系交配させて、表現型解析のための、Ｆ２世代のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−マウス、および野生型マウスを作製した。凍結させたＦ１ヘテロ接合性精子と、Ｃ５７Ｂｌ６／ＮＴａｃドナー雌に由来する卵母細胞とを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（fertliziation）（ＩＶＦ）を介して、Ｎ２Ｆ２
世代のマウスの第２のコホートを作出した。次いで、Ｎ２Ｆ１のヘテロ接合性子孫を異系交配させて、表現型解析のための、Ｎ２Ｆ２のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−マウス、および野生型マウスを作出した。
Ｆ２マウスおよびＮ２Ｆ２マウスについての表現型研究は、６週齢のときに開始された。マウスを、出生から６週齢まで、研究のために２０〜２３℃および４０〜６０％の湿度、１日当たり１２時間の光下で、ケージ１つ当たり２〜５匹ずつ飼育する期間に、多様な発達診査項目（発育不全（runting）、呼吸、顔面および四肢の異常、皮膚の色、姿勢、
立ち直り（righting）、ならびに開眼）について観察した。マウスを、ｃｏｂ床敷（Ｔｈｅ Ａｎｄｅｒｓｏｎｓ Ｌａｂ Ｂｅｄｄｉｎｇ）と、エンリッチメントのための綿製ネストレット（cotton nestlet）（Ａｎｃａｒｅ）とを伴う９５．６×３０９．１×１
３３．４ｍｍのケージ（Ｔｈｏｒｅｎ）内で飼育した。飼育中、マウスを、毎日２回、健康状態についてモニタリングし、通常飼料（ＬａｂＤｉｅｔ）および水を自由に摂取できるようにした。全ての動物手順は、Ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにおける推奨に緊密に準拠して実行した。プロトコールは、Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認され、苦痛を最小化するためのあらゆる努力がなされた。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）発現解析：腋窩リンパ節組織、上腕リンパ節組織、および頸部リンパ節組織、性腺脂肪パッド組織、前頭葉組織、横隔膜組織、脊髄組織、脾臓組織、および胸腺組織を、解剖直後にＲＮＡＬａｔｅｒ安定化試薬（ＱＩＡｇｅｎ）に入れ、−２０℃で保管した。組織は、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬中でホモジナイズし、クロロホルムで相分離させた。製造元の仕様に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを含有する水性相を精製した。ゲノムＤＮＡは、ＭＡＧＭＡＸ（商標）ＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して除去した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ
ＲＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、組換えリボヌクレアーゼ阻害剤、独自のヘルパータンパク質、ランダムプライマー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写した。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により増幅した。ベータ−アクチンを、内部対照遺伝子として使用して、ｃＤＮＡ入力の差違を正規化した。野生型マウスに由来する胸腺を、基準試料として使用して、試料（遺伝子型１つ当たり組織１つ当たりの雌のｎ＝５）間のｍＲＮＡの倍数差を計算した。例示的な結果を、図１Ｂに明示する。
ｌａｃＺ発現プロファイリング：マウスに、ケタミン／キシラジン（１２０／５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射を介して深く麻酔をかけ、０．２％グルタルアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド溶液を使用する心臓灌流により固定した。脳組織、胸郭組織、リンパ節組織、唾液腺組織、胸腺組織、心臓組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、胃組織、腎臓組織、腸組織、尿生殖路組織、筋肉組織、および後肢組織を解剖し、ＰＢＳ中ですすぎ、０．２％グルタルアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド溶液中で、３０分間にわたり後固定した。組織を洗浄し、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍＬ）染色液中、３７℃で、１〜２４時間にわたりインキュベートした。染色後、組織を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、５０％、７０％、および１００％のグリセロール系列により透明化した。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用するＮｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡およびＮｉｋｏｎ ＤＳ−Ｒｉ１ディジタルカメラにより、写真を撮影した。
発現プロファイリングは、胎芽１２．５日目（Ｅ１２．５）、６週、および２８週に記録した。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の、Ｅ１２．５胚（表４）、ならびに６週齢および２８週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス（表５）における相対発現プロファイルの代表的データを、下記（−＝発現なし；＋＝低度の発現；＋＋＝中程度の発現；＋＋＋＝高度の発現；ｗｔ＝野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ；ｎｄ＝決定なし）に提示する。
図１Ｂに示される通り、野生型（ＷＴ）の性腺脂肪パッド、前頭葉、および脊髄では、高レベルのＣ９ｏｒｆ７２発現が検出され、胸腺、脾臓、およびリンパ節では、低レベルであった。予測される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−（Ｈｅｔ）マウスの発現レベルは、野生型（ＷＴ）の発現レベルのおよそ半分であり、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）マウスのＣ９ｏｒｆ７２発現は、検出不能であった。被験遺伝子型のうち、近傍の遺伝子座である、Ｍｏｂ３ｂ、Ａｋ０４５９３２、およびＩｆｎｋの転写レベルには、差違が観察されなかったことから、ｌａｃＺ単独の挿入（すなわち、コード配列の除去）は、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現に影響を及ぼしたことが指し示された。
６週齢および２８週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−（ＫＯ）動物におけるｌａｃＺ染色が、脳および脊髄のほか、脾臓、精巣、および腎臓（表４および５）のいくつかの領域内の酵素活性を明らかにしたことは、図１Ｂに示されたデータと符合するが、これは、他の報告（Suzuki, N.ら、２０１３年、Nat. Neurosci.、１６巻（１２号）：１７２５〜８頁；Koppers, M.ら、２０１５年、Am. Neurol.、７８巻（３号）：４２５〜３８頁）とも符合する。さらに、他の組織内の、それほど顕著でない染色も観察された。単一ｌａｃＺ置換対立遺伝子について予測される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−組織内では、レポーター活性の強度および範囲は、より限定されていた。
まとめると、本実施例は、ネズミのＣ９ｏｒｆ７２が、神経系および免疫系の多様な組織内で発現することを裏付ける。さらに、本実施例は、少なくとも一部の組織において、発現は、動物の年齢と共に増加し、以下の実施例（下記を参照されたい）で記載される、神経学的表現型および免疫学的表現型と直接相関することを裏付ける。
Figure 2021118745
Figure 2021118745
（実施例２）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物についての行動解析
本実施例は、とりわけ、本明細書で記載される非ヒト動物（例えば、齧歯動物）が、実施例１で記載した、齧歯動物（例えば、マウス）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊から生じるＡＬＳ様症状、例えば、体重の減少および有意な運動異常などを発症することを裏付ける。
上記で記載したＣ９ｏｒｆ７２内の破壊を有するマウスについての表現型研究は、８、１８、３７週（雌）および５７〜６０週（雄）において実施した。体重は、隔週ベースで測定し、身体組成は、μＣＴスキャン（Ｄｙｎａｍｉｃ６０）により解析した。標準的な２４走査を使用して、脊椎の頸部領域塊を視覚化した。全ての動物手順は、Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールを遵守して行った。
全体的な運動機能についての評定は、盲検化された主観的スコア付けアッセイを使用して実施した。運動機能障害についての解析は、ロータロッド、オープンフィールド自発運動、およびキャットウォーク試験を使用して行った。運動機能障害スコアは、ＡＬＳ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＡＬＳＴＤＩ；Gill A.ら、２００９年、PLoS One、４巻：ｅ６４８９頁）により開発されたシステムを使用し
て測定した（was measure）。キャットウォーク試験では、被験体が、照明されたガラス製のプラットフォームを横切って歩行する間、ビデオカメラが、下方から記録する。歩幅パターン、個々の足を振り出す速度、姿勢の持続時間、および圧力など、歩行と関連するパラメータを、各動物について報告する。この試験を使用して、マウスの表現型を解析し、新規の化学的実体を、運動能に対するそれらの効果について評価する。ＣａｔＷａｌｋ
ＸＴとは、ラットおよびマウスにおける足取りおよび歩行について定量的に評定するためのシステムである。ＣａｔＷａｌｋ ＸＴは、中枢神経、末梢神経、筋肉、または骨格の異常についての、ほぼ任意の種類の実験モデルにおける、齧歯動物の自発運動能力について評価するのに使用されている。
ＣａｔＷａｌｋによる歩行解析：動物を、それらの前方がオープンエンドになっている、Ｎｏｌｄｕｓ ＣａｔＷａｌｋ ＸＴ １０の走路の始点に置く。マウスは自発的に、走路の末端へと走って、逃避しようと試みる。カメラは、記録し、システムのソフトウェアは、フットプリントを測定する。フットプリントを、足位置の異常について解析する。
オープンフィールド試験：マウスを、Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃオープンフィールドシステムに置き、６０分間にわたり評価する。装置は、赤外ビームおよびコンピュータソフトウェアを使用して、細かな動き、Ｘ＋Ｙ徘徊（ambulation）、移動距離、立ち上がりイベント数、立ち上がりに費やされる時間、および不動状態時間を計算する。
ロータロッド：ロータロッド（rotorod）試験（ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）は、マウスが、回転梁から落下するまでの待ち時間を測定する。ロータロッドは、１ｒｐｍで開始し、１８０秒間にわたり、１５ｒｐｍまで加速する実験レジメに設定する。次いで、漸増レジメに従い、落下するまでの動物の待ち時間を記録する。動物が、落下せずに梁上に乗っている時間の３つの最も長い持続時間の平均および最大を使用して、落下するまでの待ち時間について評価する。１８０秒間より長く梁上に乗っていられる動物を、無症候であるとみなす。
上位運動ニューロン機能障害は、痙性（すなわち、硬直）、反射の増加、振戦、動作緩慢、およびバビンスキー徴候として現れる。下位運動ニューロン機能障害は、筋力低下、衰弱、クラスピング、足の屈曲および引きずり、ならびに線維束攣縮として現れる。延髄機能障害は、嚥下困難、発語不明瞭、および舌の線維束攣縮として現れる。表６は、試験中の動物の、運動機能障害、振戦、および硬直と関連するスコア付け法を明示する。例示的な結果を、図２Ａ〜２Ｈに明示する。
図２Ａ〜２Ｈに示される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、例えば、体重の減少、運動の不活発化、および歩行機能障害などのＡＬＳ様表現型を示した。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、野生型対照マウスと比較した体重の減少は、約３０週齢に始まった（図２Ｂ）。さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについては、約４０週齢に始まり、ロータロッドを例外として、全ての種類の試験（図２Ｃ〜２Ｈ）において、有意な運動機能障害（例えば、後肢の有意な脆弱および正中線の外側への虚脱のほか、軽度の振戦および（nad）後肢筋肉の硬直、ｐ＜０．０００１）が観察されたことから、上位運動ニ
ューロン病変および下位運動ニューロン病変の発症が指し示された。野生型動物またはヘテロ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−）動物では、同様な欠損は、観察されなかった。
Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについてのロータロッドおよびＣａｔＷａｌｋによる歩行解析により、自発運動行動の有意な低下と、立ち上がりイベントの減少とが裏付けられたことから、後肢機能障害が指し示される。ＣａｔＷａｌｋによる歩行解析は、損なわれた肢間協調の低下および歩幅長の低減の徴候のほか、動作緩慢および後肢の引きずりも明らかにした。これらのデータは、野生型と比較した、有意な歩行異常を指し示した。 ロータロッド上の最長時間に関して、野生型マウスと、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスとの差違は観察されなかった。３６週齢という早期に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、有意かつ進行性の運動障害を示した。
別の実験では、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス（ｎ＝５、６０週齢）に由来する脊髄の腰部を、組織病理学的解析のために回収した。脊髄における運動ニューロンの総数の差違は、観察されなかった（図２Ｉ）。しかし、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−運動ニューロンの平均細胞体面積は、野生型と比較して、有意に大きかった（ｐ＜０．０００１）。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの運動ニューロンは、野生型と比較して、有意に大きな平均細胞体面積を証拠とする肥大性特徴を示した（図２Ｉ）。したがって、これらのデータは、４０週齢に始まる、下位運動ニューロン病変の発症可能性を指し示した。
同様な実験で、運動異常を、野生型（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／＋、ｎ＝１４；雌１１匹、雄３匹）およびＣ９ｏｒｆ７２−／−（ｎ＝１７；雌１２匹、雄５匹）において、３２週齢以降６０週齢まで、所与の週齢における生存動物のパーセントとして評定した。マウスは、毎週秤量し、全体的な運動機能についての評定は、盲検化された主観的スコア付けアッセイ（上記で記載した）を使用して実施した。２群のマウスに対して、それらの運動機能障害、振戦、およびそれらの後肢筋肉の硬直を調べる臨床神経学的検査を、毎週または隔月に実施した。運動機能障害について、本発明者らは、０（症状なし）〜４（マウスは、横臥位に置かれてから３０秒以内に、自身で立ち直ることができない）の、盲検化神経学的スコア付けスケール（上記で記載した）に従った。振戦および硬直について、本発明者らは、０（症状なし）〜３（重度）のスケールを伴うスコア付けシステムを創出した。全てのデータは、平均±ＳＥＭとして報告した。代表的結果を、図２Ｊに明示する。
自発運動行動については、上記で記載した自動式Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄシステム （Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロータロッド試験（Ｒｏｔａ Ｒｏｄ、ＩＩＴＣ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）、および歩行解析（ＣａｔＷａｌｋ ＸＴ １０、Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、６０分間にわたり、隔週で評価した。全てのデータは、平均±ＳＥＭとして報告した。代表的結果を、図２Ｋに明示する。
上記で記載したスコア付けスケールを使用して、本発明者らは、およそ４０週齢において、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、有意な衰弱、およびそれらの後脚の正中線の外側への虚脱のほか、軽度の振戦および後肢筋肉の硬直（Ｐ＜０．０００１）を示し始めることを観察し、このことから、上位運動ニューロン病変および下位運動ニューロン病変の発症が示唆された。さらに、全ての野生型マウスは、６０週齢を過ぎても生存したが、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスで、６０週齢において生存したマウスは、約５３％（１７匹中９匹；雌５匹、雄４匹）だけであった（図２Ｊ、上左）。およそ３６週齢以降、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、野生型マウスのコホートとは対照的に、体重の増加が止まった。
オープンフィールドアッセイから、本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、自発運動行動の、それらの野生型対応物と比較した有意な低下（Ｐ＝０．０００８）を示すことを観察した。これらのマウスはまた、立ち上がり行動の有意な減少（Ｐ＝０．０００９）も示したことから、それらの後肢の機能障害が指し示された。研究中のいかなる時間においても、マウスが回転梁上に乗っている最大時間には、野生型マウスと、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスとの間で、有意な変化は観察されなかった。ＣａｔＷａｌｋによる歩行解析から、本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、有意に損なわれた肢間協調の低下（Ｐ＝０．０００５）および歩幅長（Ｐ＝０．００１３）のほか、動作緩慢および後肢の引きずりも有することを観察した。これらのデータは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、野生型と比較して有意な歩行異常を指し示した。したがって、本実施例は、およそ３６週齢以降、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、野生型と比較して、有意かつ進行性の運動障害を示すことを裏付ける。
別の実験では、握力試験を使用して、ヘテロ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−）マウスおよびホモ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２−／−）マウスについて検査した。略述すると、握力は、神経筋機能を、前肢の最大筋力として測定するものであり、マウスが、センサーへと接続されたグリッドに加える把持により評定される。前肢の強度だけを測定する、３回にわたる試行を、連続して実行した。得られた全ての握力値は、マウスの体重に対して正規化した。握力試験は、２０週齢（運動症状の発症の前）における、１３匹の野生型マウス、７匹のＣ９ｏｒｆ７２＋／−マウス、および１８匹のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス、ならびに６０週齢における、１２匹の野生型マウス、４匹のＣ９ｏｒｆ７２＋／−マウス、および１３匹のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスに対して実施した。代表的データを、図２Ｌに明示する。
図２Ｌに示される通り、ヘテロ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−）マウスは、６０週において、いかなる有意な運動機能障害も、振戦も、硬直も示さなかった。さらに、ヘテロ接合性（Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−）マウスは、６０週において、野生型と比較した、いかなる握力の変化も示さなかった。
まとめると、本実施例は、上記で記載した非ヒト動物であって、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）の挿入から生じる内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の、全コード配列の欠失（すなわち、エクソン２〜１０）を含むゲノムを有する非ヒト動物が、測定可能な神経変性表現型を示し、したがって、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）についての有用なモデルをもたらすことを裏付ける。このような動物モデルは、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを処置するための治療剤候補を開発およびスクリーニングするための、有用なｉｎ ｖｉｖｏ系を提供する。
Figure 2021118745
（実施例３）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物についての免疫表現型解析
本実施例は、実施例１に従い作製された非ヒト動物が、一部の実施形態では、多様な免疫細胞集団の浸潤から生じる、脾腫およびリンパ節症によって特徴付けられる、免疫学的表現型を示すことを裏付ける。さらに、本実施例は、このような非ヒト動物が、腎臓における免疫細胞集団の浸潤によって特徴付けられる糸球体腎炎を発症することを具体的に裏付ける。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに述べると、本発明者らは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の産物が、免疫機能において、極めて重要な役割を果たし、本明細書で記載される非ヒト動物における、Ｃ９ＯＲＦ７２ポリペプチドの喪失が、ＡＬＳ疾患および／またはＦＴＤ疾患の顕著な機構ではないことを提起する。多様な組織を、解析のために、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスおよび野生型マウス（雌については、８、１８、および３７週齢であり、雄については、９〜１０、１８、および５７〜６０週齢の、遺伝子型１つ当たりｎ＝４〜６匹の動物）から採取した。
細胞の調製およびフローサイトメトリー解析：最大血液容量を、ＣＯ２による安楽死の直後における心臓穿刺により、ＥＤＴＡでコーティングされた試験管へと回収し、ＦＡＣＳ調製物のために、およそ２００μＬを、ヘパリンでコーティングされた試験管へと移した。脾臓、骨髄、および頸部リンパ節を採取し、２％のウシ胎仔血清（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ）とを含む、ダルベッコ１倍濃度ＰＢＳ中の単一細胞懸濁物へと解離させ、当技術分野で公知の方法を使用して濾過した。赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＢＣ溶解を、血液、脾臓、および骨髄に対して実施した。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ
Ｔ４ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、リンパ節細胞、脾臓細胞、および骨髄細胞をカウントし、脾臓については、ウェル１つ当たりの細胞およそ１０００万個、ならびにリンパ節および骨髄については、ウェル１つ当たりの細胞１００万個または最大容量を蒔いた。血液は、ウェル１つ当たりの最大容量（およそ２５０μＬ）を蒔いた。細胞を、室温で、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により処理し、スピンダウンし、氷上のブロッキング溶液（ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００の、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ ｍＡｂ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で、１５分間にわたり再懸濁させた。細胞は、氷上で３０分間にわたり、コンジュゲート抗体で染色し、洗浄し、固定し（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット）、再度洗浄した。細胞は最終的に、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎仔血清（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ）とを含む、ダルベッコ１倍濃度ＰＢＳ）中に再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＩＩまたはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析した。Ｆｏｘｐ３染色（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、製造元の仕様に従い、実施した。
形質細胞染色パネル：ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（１Ｄ３；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１３８（２８１−２；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびＣＤ４５（３０−Ｆ１１；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。骨髄性細胞染色パネル：Ｆ４／８０（ＢＭ８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１５（ＡＦＳ９８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｙ６Ｇ（ＲＢ６−８Ｃ５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＬｙ６Ｃ（ＡＬ−２１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１２７、ＰＤ１（ＲＰＭＩ−３０）、ＮＫｐ４６に対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。Ｆｏｘｐ３抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。ＣＤ４９ｂ抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。データは、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して解析した。３０〜３５週齢の雌（野生型：ｎ＝４；Ｃ９ｏｒｆ７２−／−：ｎ＝４）の脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および腎臓について、ｐｅｒｅｎｔ陽性細胞数および総細胞数の計数を、Ｎｅｘｅｌｃｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｕｎｔｅｒ上で、ＡＯ／ＰＩ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム）により実施した。細胞カウントを使用して、表面染色により観察される細胞集団の絶対数を決定し、これに従いグラフ化した。
組織学：組織を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと採取するか、または５０ｍＬの食塩液、ｐＨ６．５の酢酸緩衝液中４％のＰＦＡ ５０ｍＬ、および最後にｐＨ９．５のホウ酸緩衝液中４％のＰＦＡ溶液５０ｍＬによる経心臓灌流の後で回収した。脊髄を、それらが流れ落ちるまで、ホウ酸緩衝液中１５％のスクロース溶液に続く、ホウ酸緩衝液中３０％のスクロース溶液へと回収した。他の全ての組織は、４％のＰＦＡ中で後固定し、２４または４８時間後に、７０％のエタノールへと移した。パラフィン包埋、切片化、ならびにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、商用の組織学検査所（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ，Ｉｎｃ．；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）が実施した。ＩｇＭ、ＩｇＧ、補体因子Ｃ３、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３、ＣＤ１３８、およびＦ４／８０についての免疫組織化学検査は、商用の検査所（Ｈｉｓｔｏｔｏｘ Ｌａｂｓ；Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）が遂行した。運動ニューロン細胞カウントおよび細胞体面積は、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して定量した。運動ニューロンカウントは、ｎ＝５匹のマウス、動物１匹当たりスライド３枚の平均を表し、細胞体面積は、ｎ＝５匹のマウス、スライド１枚当たりの１０個の運動ニューロン、動物１匹当たりのスライド３枚の平均を表す。補体因子Ｃ３のＩＨＣは、Ｈａｌｏを使用して定量した。
血液学アッセイ：血液試料を、イソフルラン麻酔下の眼窩後方採血を介してまたはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ ＩＡＣＵＣプロトコールに従う、ＣＯ２の吸入による安楽死の後における心臓穿刺により回収した。鑑別を伴う全血算（ＣＢＣ）は、Ｈｅｍａｖｅｔ ９５０（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ）を使用して、２０μＬの全血液に対して実施し、臨床化学検査は、ＡＤＶＩＡ １８００ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍａｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ）を使用して、血清試料に対して実施した。ＥＬＩＳＡは、以下：Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ｆａｃｔｏｒ ＥＬＩＳＡ ＫｉｔおよびＭｏｕｓｅ ＩｇＭ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ｆａｃｔｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（株式会社シバヤギ）、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ Ｔｏｔａｌ Ｉｇ ＥＬＩＳＡキット、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｎｕｃｌｅａｒ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＮＡ）Ｔｏｔａｌ Ｉｇ ＥＬＩＳＡキット、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｓｍ（Ｓｍｉｔｈ Ａｎｔｉｇｅｎ）Ｔｏｔａｌ Ｉｇ ＥＬＩＳＡキット、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ Ｔｏｔａｌ Ｉｇ ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ．）、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭマウスＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を、製造元の仕様に従い使用して、血漿試料に対して実施した。試料は、４５０ｎｍとするＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で読み取った。試料は、二連で解析し、平均値について平均した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、全ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−αは、製造元の仕様に従い、Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）１０プレックス電気化学発光検出アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、血漿試料で測定し、６２０ｎｍとするＭｅｓｏ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ ６００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で読み取った。試料は、二連で解析し、平均値について平均した。
ＲＮＡの単離、配列決定、および解析：脾臓および頸部リンパ節を、解剖直後にＲＮＡＬａｔｅｒ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）に入れ、−２０℃で保管した。全ＲＮＡは、製造元の仕様に従い、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離した。ＲＮＡは、ＵＶ分光光度計を使用して定量し、ＲＮＡの完全性は、Ｑｉａｘｃｅｌ（Ｑｉａｇｅｎ）により評価した。ＰｏｌｙＡ
ｍＲＮＡは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡから精製し、鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ
ＲＮＡ−ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により調製した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、Ｈｉｓｅｑ ２０００ ＮＧＳシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、３３ｂｐの長さへと配列決定した。遺伝子発現レベルは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．により開発されたＲＮＡ−Ｓｅｑソフトウェアである、Ｎｉｍｂｕｓ２を使用して、生のシーケンシングリードから得た。
検尿方法；尿試料は、スポット回収を介して得、尿中アルブミン濃度は、Ａｌｂｕｗｅｌｌ Ｍ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）により決定した。尿中クレアチニン濃度については、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎキット（Ｅｘｏｃｅｌｌ）を使用してアッセイした。アッセイは、製造元の指示に従い実施し、得られたデータを使用して、尿中アルブミン対クレアチニン比（ＡＣＲ）を計算した。
統計学的解析：統計学的解析およびグラフ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０）を使用して実施した。データは、対応のないスチューデントのｔ検定および一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して解析した。結果は、ｐ値＜０．０５（誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す）のときに、統計学的に有意であると考えた。例示的な結果を、図３Ａ〜３ＡＬに明示する。
図３Ａ〜３Ｄに示される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２＋／−マウスと比較して、有意な脾臓の腫大を発症した。さらに、頸部リンパ節も、年齢と共に、徐々に大きくなった（図３Ａ〜３Ｄ）。したがって、８週齢という早期に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、脾臓および頸部リンパ節の腫大を示す。このような腫大は、全てのＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの頸部領域内で触知可能であったが、野生型マウスまたはＣ９ｏｒｆ７２＋／−マウスでは触知可能でなかった。さらに調査すると、このような塊は、雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、１２週齢までに触知可能であり、雄および雌両方のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスでも、１８週齢までに触知可能であった。解剖すると、塊は、頸部リンパ節に由来することがわかり、腫大は、８週齢という早期に観察された（図３Ａ）。全解剖はまた、老齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス（＞３５週齢）において、全身にわたるさらなるリンパ節腫大、最も顕著には、腸間膜リンパ節腫大も明らかにした。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、８週齢までに、パイエル板もまた、とりわけ腫大しており、脾腫が明らかであった（図３Ｄ、下左）。１７匹のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス中、６０週齢を過ぎて生存したのが、９匹だけであったのに対し、定期的な神経機能試験にかけられた全ての野生型マウスは、実験期間の終了時まで生存した。全てのＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、約１８〜２４週齢において、脾腫および頸部リンパ節の過形成が、十分に確立され、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−についての体重曲線は、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２＋／−マウスと比較して、平坦化し始めた（例えば、図２Ｂ）。
全血液についての、鑑別を伴うＣＢＣデータが示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、循環好中球、循環好酸球、および循環単球の、野生型と比較して有意な増加を呈する一方で、循環リンパ球の有意な減少を示す（図３Ｅ）。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウス（例えば、３４〜３８週齢）からのＣＢＣデータはまた、循環白血球鑑別が、野生型マウスと比較して変更されることも裏付けた。本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、野生型マウスと比較した、単球および好中球の有意な増加、ならびにリンパ球の有意な減少が、８週齢という早期に検出可能であることを観察した。
Ｈ＆Ｅ染色は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓および頸部リンパ節における、複数の形状を伴う細胞の混合集団を明らかにした（図３Ｆ、３Ｇ）。具体的には、４倍の拡大能で調べた頸部リンパ節は、可変で明瞭な細胞輪郭によって特徴付けられ、中程度〜豊富な好酸球性特徴を伴う、豊富な大型の球形細胞を示した（図３Ｆ）。膨張した細胞集団内では、時折、泡沫状の細胞質が観察された。６０倍の拡大能で調べたところ、頸部リンパ節内の細胞は、好中球（黄矢印）および他の成熟リンパ球と混合された、形質細胞様の形状（青矢印）を示した（図３Ｇ）。モット細胞（間欠的；赤矢印；凝縮した免疫グロブリンを含む異常な形質細胞）と同様、マクロファージ（緑矢印）と符合すると考えられる細胞もまた存在したが、これらの全ては、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの頸部リンパ節における慢性炎症を指し示した（図３Ｇ）。
Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおいて観察される、脾臓およびリンパ節の腫大は、ＡＬＳ−ＦＴＤ患者においてこれまで報告されていない、新生物性疾患または免疫調節不全性疾患のプロセスを指し示した。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−リンパ系組織についての組織病理学的解析（すなわち、８〜６０週齢のマウスに由来するリンパ節切片および脾臓切片の、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色）は、リンパ節腫大の基礎細胞構成が保存されていることを確認した。さらに、ＩＨＣ染色は、皮質内のＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋）の存在、ならびに濾胞間および副皮質帯内のＴ細胞（ＣＤ３＋）の存在も確認した。しかし、大半が可変で明瞭な輪郭と、好酸球性で泡沫状の細胞質で取り囲まれた単一の球形核とを伴う、大型の球形細胞からなる細胞集団による、皮質および髄質の節状構造の膨張も存在した。同様な細胞浸潤物はまた、脾臓内にも存在し、主に赤脾髄内に位置したが、これは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける脾臓構造を膨張させ、結果として、脾臓重量を増加させた。また、形質細胞の形状と符合する核周囲ハローを含有する、豊富な形質細胞様細胞が、時折のモット細胞と共に存在することも記述された。野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２＋／−（ヘテロ接合性）マウスでは、同様な混合浸潤物が観察されなかった。
大型の球形細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３、またはＣＤ１３８では一貫して染色されず、マクロファージ系統のマーカーである、Ｆ４／８０について強く陽性であった。ＩＨＣシグナルは、細胞膜上では優勢であったが、高度に空胞化した細胞質のために、細胞質内では希薄であった。これに対し、ＷＴおよびヘテロ接合性対照におけるＦ４／８０染色は、マクロファージについて予測される、細胞質および膜性の染色パターンの特徴を示し、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおいて観察されるＦ４／８０シグナルよりはるかに強力な、全体的なＦ４／８０シグナルを有した（下記、例えば、図３Ｐを参照されたい）。
８〜６０週齢のマウスに由来するさらなる臓器についてのＨ＆Ｅ解析およびＩＨＣ解析は、ある特定のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、散在的な胸腺髄質の過形成、ならびに限局性骨髄線維症および／または骨髄性過形成を明らかにした。より一般的な観察は、ヌルマウスの肝臓および腎臓において見出される樹状細胞の顕著な集団の存在であった。これらの細長い角張った細胞は、Ｆ４／８０＋であり、サイズが大きく、数も多いが、形状的には、典型的な樹状細胞（ＤＣ）に似ていた。これらの細胞は、関連する肝疾患の証拠はなかったが、８週という早期におけるＣ９ｏｒｆ７２−／−肝臓内で、野生型と比較して際立った。本発明者らはまた、８週における、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−腎臓内のＦ４／８０＋細胞の増加も観察したが、これは、年齢と共により顕著となった。ＤＣは、外髄質内に主に局在化したが、ここで、ＤＣは、緻密斑および隣接する細管の近傍において、糸球体の周囲の、リンパ球と関連する顕著なカフと共に、凝集物を形成した。本発明者らは、マウスの老化に応じた、腎臓内の混合白血球の浸潤物の増加であって、３５〜６０週齢までに十分に確立される、様々的な程度の免疫介在性糸球体疾患を随伴する増加を記述した。いかなる被験動物においても、脳組織内または脊髄組織内の炎症の証拠は観察されなかった。したがって、脾臓およびリンパ節は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける免疫病変の主要な部位であり、腎臓における続発性の進行性糸球体疾患の指標となった。
図３Ｈに示される通り、雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、野生型と比較して、頸部リンパ節内のＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ−ＣＤ３−Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の数の増加を示す一方で、脾臓内、骨髄中、および血液中のこれらの同じＢ細胞の同等な百分率または百分率の低下を示す。形質細胞へと移行しているＢ細胞（Ｂ２２０ｍｉｄ／ｌｏｗＣＤ１９ｍｉｄ／ｌｏｗ）および成熟形質細胞（Ｂ２２０ｌｏｗ／−ＣＤ１９ｌｏｗ／−ＣＤ４５＋ＣＤ１３８ｍｉｄ／＋）は、年齢と共に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−雄マウスの脾臓内、頸部リンパ節内、および骨髄中で、野生型と比較して増加すると考えられた（図３Ｉ）。
雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）の百分率は、被験臓器（例えば、頸部リンパ節）に応じて、野生型と比較して、変化しないかまたは低減された。雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、脾臓内、リンパ節内、および骨髄中の、形質細胞／形質芽細胞へと移行しているＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９ｉｎｔＢ２２０ｉｎｔＣＤ１３８＋）および成熟形質細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９−Ｂ２２０−ＣＤ１３８＋）の百分率の、野生型と比較した増加を示す（図３Ｊ）。本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスと、対照マウスとの間で、血液中のこれらの細胞型の、いかなる一貫した差違も観察しなかった。まとめると、これらのデータは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、適応的免疫応答の進展を裏付けた。
図３Ｋおよび３Ｌに示される通り、雄および雌のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内では、これらが老齢になるにつれて、好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋）の百分率の増加が観察された。増加はまた、９〜１８週の間の雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスおよび全ての被験時点における雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの頸部リンパ節内でも観察された。顆粒球集団もまた、骨髄および血液中で、大半の時点で様々な有意性で増加した。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、脾臓、頸部リンパ節、骨髄、および血液について、炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１５＋、Ｌｙ６Ｇｌｏｗ／−、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ）が、試験の少なくとも１つの時点において、野生型と比較して、有意に増加した（図３Ｋおよび３Ｌ、中央列）。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内、骨髄中、および血液中ではまた、時間経過にわたる、常在単球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１５＋Ｌｙ６Ｇｌｏｗ／−Ｌｙ６Ｃｍｉｄ／−）の、同様な増加も観察されたが、頸部リンパ節内では、減少が示された（それぞれ、図３Ｋおよび３Ｌ、下列）。図３Ｍに示される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓内、頸部リンパ節内、腎臓内、および骨髄中では、Ｆ４／８０＋マクロファージ集団の、野生型と比較した増加が観察された。
野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの、脾臓および頸部リンパ節ではまた、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３、およびＣＤ１３８の発現の文脈における組織病理学的解析も実施した（図３Ｎ、３Ｏ）。切片を、４倍および６０倍の拡大能で調べた。脾臓内では、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、正常な濾胞性形状の喪失を示した（図３Ｎ）。白脾髄領域は、腫大し、不明瞭な輪郭を伴う、異形成性であった。豊富なライトピンクの細胞質を伴う細胞（形質細胞様細胞）の蓄積が観察された。ＣＤ１３８染色は、野生型マウスと顕著には異ならず、白脾髄の中央部において増殖している細胞の一部は、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３、またはＣＤ１３８で染色されなかった。野生型マウスの脾臓は、白脾髄領域が、縁のＢ細胞（a rim of B cells）（抗ＣＤ４５Ｒ ＩＨＣ）で囲まれた中央のＴ細胞（抗ＣＤ３ ＩＨＣ）から構成される、本質的に正常な形状を示し、形質細胞についてのＣＤ１３８染色は、最小限であった（図３Ｎ、左）。
頸部リンパ節において、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、単一の核と、豊富な好酸球性細胞質とを有する、球形細胞の大型の凝集物の間に散在する、島状のリンパ系組織を示した（図３Ｏ）。これらの細胞は正常構造を置きかえたが、比較的正常なＢ細胞領域およびＴ細胞領域は残存した（ＣＤ３およびＣＤ４５Ｒの染色切片の中央部において明らかである）。異常細胞は、ＣＤ３、ＣＤ１３８（図３Ｏの下右画像内の矢印）、およびＣＤ４５Ｒで間欠的に染色されたが、一般には、３つのマーカー全てについて陰性であった。野生型マウスは、正常なリンパ節形状を示した（図３Ｏ、右）。ＣＤ４５Ｒ免疫染色（Ｂ細胞）は、Ｔ細胞（ＣＤ３）帯を取り囲む周縁部内で見出され、ＣＤ１３８が髄質内の細胞を染色することはまれであった。
野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの、脾臓および頸部リンパ節ではまた、Ｆ４／８０発現の文脈における組織病理学的解析も実施した（図３Ｐ）。切片を、４倍および６０倍の拡大能で調べた。データは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける陽性Ｆ４／８０染色（マクロファージ）であって、Ｈ＆Ｅ染色で観察された、大型の泡沫状の細胞浸潤物（上記で記載した）と相関する陽性Ｆ４／８０染色を裏付けた。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける脾臓の赤脾髄内ではまた、細胞外のＦ４／８０染色も観察した。Ｆ４／８０＋細胞数は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおいて、８〜５８週で年齢と共に増加し、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−リンパ節で、野生型リンパ節と比較して増加した。
総ＣＤ４５＋（一般的な白血球抗原）細胞カウントは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスに由来する全ての被験組織で増加し、これは、観察された免疫浸潤と符合した。しかし、アッセイされた総細胞集団と比較した、ＣＤ４５＋の百分率は、野生型と比較して変化しないかまたは低減された（図３Ｓ）。特異的な抗体パネルを利用して、白血球サブセット内のホメオスタシスが変更されたのかどうかを決定した。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスのリンパ節、脾臓、および骨髄では、好中球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６ＣｉｎｔＣＤ１１５−）百分率と、総単球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１５＋）百分率とは、野生型と比較して様々に増加した（図３Ｋおよび３Ｌ）。脾臓、リンパ節、腎臓、および血液では加えて、Ｆ４／８０＋マクロファージ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋Ｌｙ６Ｇ−）の増加も観察された（図３Ｍ）。興味深いことに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスに由来する組織内では、多くの細胞が、Ｆ４／８０で陽性に染色されたが、全体的なシグナルは、野生型マウスにおいて観察されるシグナル未満の強度であり、これは、Ｆ４／８０ ＩＨＣプロファイルがより広範囲であるが、それほど濃縮されていないことを示している（図３Ｐ）。Ｌｙ６Ｇ染色およびＬｙ６Ｃ染色は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓、リンパ節、腎臓、および血液の、炎症性単球（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１５＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃｈｉ）の百分率の増加を明らかにした。
ヌルマウスの大半は、腎病変を発症していたが、依然として生存可能であったので、特定の目的の時点である、３０〜３５週齢の雌について、さらなるＦＡＣＳ解析を行った。図３Ｑに示される通り、全組織について実施された総細胞カウントは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける多様なコンパートメントについてのフローサイトメトリーにより、絶対細胞カウントの有意な増加を裏付けた。このような増加の実体（identity）は、骨髄系樹状細胞、ＮＫ細胞、およびＴ細胞についての多様なマーカーを利用するフローサイトメトリーを使用して決定した（図３Ｒ〜３ＡＣ）。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、骨髄系樹状細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋）が、パーセントおよび総細胞カウントで、野生型と比較して増加したのに対し、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋ＣＤ４９ｂ＋）画分は減少した（図３Ｒ）。ＣＤ４５＋（白血球共通抗原；全ての白血球を染色する）細胞のパーセントは、野生型マウスの組織と、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの組織との間で同等であるが、総細胞カウントは、有意に増加し、これから、有意な免疫細胞の浸潤が指し示される（図３Ｓ）。Ｔ細胞特異的マーカーである、ＣＤ４＋（ヘルパーＴ細胞集団）およびＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ細胞集団）による染色は、Ｔ細胞集団の百分率の低下を裏付けた（図３Ｔ〜３ＡＣ）。ＩＨＣ、分子プロファイリング、およびＣＢＣの結果により示される通り、観察された、リンパ球集団の減少は、骨髄系細胞の比率の増加を反映しうる。
上記で示した通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＣＤ４５＋ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞の百分率が、野生型マウスと比較して、全体的に低減されたが、これは、骨髄系細胞の比率の増加の帰結であって、遺伝子シグネチャーデータと符合する帰結である可能性があった。これに対し、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、これらのＴ細胞集団の総細胞カウントは増加した。これは、リンパ系組織の、全体としての拡大と、観察された、明白な免疫浸潤とを反映した。さらなる表面活性化マーカーの発現に基づき、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団をさらに細分化した（図３Ｖ〜３ＡＣ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、それぞれ、早期活性化マーカーおよびエフェクターメモリーＴ細胞マーカーである、ＣＤ６９およびＣＤ４４の百分率の、野生型と比較した有意な増加が観察された（図３Ｖおよび３Ｘ）。さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、活性化細胞上で上方調節され、免疫系の下方調節において重要な役割を果たす共阻害性受容体である、ＰＤ−１を発現するＴ細胞の百分率の、野生型と比較した増加が観察された（図３Ｚ）。頸部リンパ節は、ＣＤ４４およびＰＤ−１の発現の増加を示したが、ＣＤ６９の発現は減少した（図３Ｖ〜３ＡＡ）。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞について、脾臓、リンパ節、腎臓、および血液における、ＣＤ４４およびＰＤ１の百分率の、野生型と比較して有意な増加が観察されたが、骨髄での値は、野生型と同等であった（図３Ｕ、３Ｗ、３ＡＡ）。脾臓、頸部リンパ節、および腎臓では、ＣＤ６９の発現パーセントは、様々な有意性で増加した（図３Ｙ）。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、活性化Ｔ細胞の増加と同時に、脾臓内およびリンパ節内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞の百分率の、野生型と比較した増加が観察された（図３ＡＢ）。また、脾臓コンパートメントも、ナイーブメモリーＴ細胞上またはセントラルメモリーＴ細胞上で発現し、Ｔ細胞が活性化したら下方調節されるＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の発現の低減を示した（図３ＡＣ）。また、細胞カウントの測定も、様々な有意性で、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける有意な増加を示した。
サイトカインパネルからのデータ（図３ＡＤ、３ＡＥ、および３ＡＦ）は、８〜５８週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの血清中のサイトカインの上昇を裏付けた。特に、１８週齢において、雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの血清中のＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２（全）のレベルは、野生型と比較して有意に上昇した（図３ＡＤ）。これらの同じサイトカインについて、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、レベルの、Ｃ９ｏｒｆ７２＋／−マウスと比較した有意な上昇が観察された。これらのデータは、これらのマウスにおける、マクロファージの全身性活性化を指し示した。解析された全ての雄マウス（８〜５８週齢）において、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（全）、ＩＬ−１７、およびＴＮＦ−αの循環レベルの、野生型マウスと比較した有意な増加を示す。８〜３８週齢の雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（全）、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびＭＣＰ−１の循環レベルの、野生型マウスと比較して有意な増加のほか、ＩＦＮ−γの増加傾向も観察された。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＩＬ−１２（全）は、野生型マウスと比較しておよそ６倍増加した。また、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７ａ、およびＴＮＦ−αも、より小さな程度ではあるが、上昇した。ＩＬ−１β、ＩＬ−２またはＩＬ−４のレベルの変化は観察されず、一部のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＩＬ−６の、野生型と比較した増加があったが、この差違は、有意性には到達しなかった。ケモカインであるＭＣＰ−１のレベルは、雌Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは有意に増加したが、雄Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスではそうでなく（図３ＡＥおよび３ＡＦ）、ＩＦＮ−γは、雄では有意に増加したが、雌では、一部がわずかな増加を示した（図３ＡＥおよび３ＡＦ）。したがって、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、８週という早期において、炎症促進性サイトカインレベルの、野生型マウスと比較した全体的な増加が、様々な有意性で観察される。
図３ＡＧ〜３ＡＫに示される通り、老化Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、重症度が増大した糸球体腎炎を発症する。この結果は、肝臓および腎臓における、Ｈ＆Ｅ染色およびＦ４／８０ ＩＨＣにより確認された（図３ＡＫ）。例えば、８週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−肝臓におけるＩＨＣによるＦ４／８０染色の増加が、マクロファージの浸潤の増加を裏付ける一方で、３８週齢の雌マウスの腎臓で、大型のＦ４／８０＋マクロファージ細胞浸潤が観察された（図３ＡＫ）。血清化学検査による血中尿素窒素の増加が、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける腎疾患と相関する一方で、血清グロブリン含量の増加は、炎症性状態を指し示した。マウスにおける正常血中尿素窒素が、８〜３３ｍｇ／ｄＬの範囲であるのに対し、グロブリンレベルは、通常１〜４ｇ／ｄＬの範囲である（例えば、Zaias, J.ら、２００９年、J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci.、４８巻（４号）：３８７〜
３９０頁を参照されたい）。
腎臓についてのさらなる解析は、樹状細胞の特徴を有する、大型のＦ４／８０＋単核細胞であって、３５〜４１週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの糸球体の周囲に方向づけられた（oriented）多数が存在するＦ４／８０＋単核細胞を明らかにした（図３ＡＫ）。Ｈ＆Ｅ染色により、３５〜６０週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの腎臓内の、軽度〜中程度の糸球体腎炎を観察した（図３ＡＫ）。影響がより重度な動物では、糸球体は、腫脹し、細胞過形成性であり、メサンギウムの増殖および白血球の浸潤を示した。免疫介在性疾患の発現は、多様であり、一部の糸球体では、毛細血管壁の肥厚と、壁側上皮の増殖とが観察される一方で、他の糸球体は、無細胞性の好酸球性硝子様物質を伴うメサンギウムの拡大であって、糸球体硬化症および様々な程度の糸球体周囲線維症と符合する拡大を示した。興味深いことに、これらの領域は、Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄを染色しても、アミロイド沈着について陽性とならなかった。尿細管の変化は、尿細管皮質および尿細管髄質の拡張と、変性／再生を伴う、硝子様タンパク質性円柱および尿細管性好塩基球増加の存在とを含んだ。野生型マウスでは、このような変化は観察されなかった。血中尿素窒素の上昇（例えば、図３ＡＧ）と、血清アルブミンの低下とを明らかにする血清化学パネルは、糸球体濾過の機能障害であって、野生型マウスと比較した、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、腎臓の組織学所見と相関する機能障害と符合した。
ヌルマウスにおいて観察される腎疾患の重症度をさらに測定するために、Ｈ＆Ｅ染色された腎臓切片を、免疫介在性糸球体腎症と関連する腎臓疾患の類型である、膜増殖性糸球体腎炎、間質性単核球性炎症、硝子円柱形成、糸球体硬化症、および好塩基性尿細管について、盲検法によりスコア付けした。図９Ａに示される通り、組織病理学的スコア付けの結果についての重み付けグラフは、ヌルマウスにおいて観察される、最も有意な腎臓の変化が、膜増殖性糸球体腎炎と関連することを裏付ける。個々の組織病理学スコアを表示し（図９Ｂ）て、全てのヌルマウスが、影響がより重度な動物における、さらなる疾患類型の証拠を時折伴う、最小限〜重度の膜増殖性糸球体腎炎を提示することを示す。スコアは、０＝なし、１＝最小限、２＝軽度、３＝中等度、および４＝重度である。１４週（図９Ｃ、上）および２４週（図９Ｃ、下）の時点において、同じコホートのマウスからアッセイされた、尿中ＡＣＲの測定値は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、年齢に伴う、アルブミン尿症の発症を指し示す。ヘテロ接合性マウスが、ＷＴと同等な値を提示したことは、観察された表現型の非存在と符合する。
Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスはまた、ＥＬＩＳＡにより、総ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体のレベルの、野生型マウスと比較した増加も示したが、これは、自己免疫疾患を指し示し（図３ＡＩ）、血清化学検査により観察される、血清グロブリンレベルの増加（図３ＡＧ、上パネル）に対応する。加えて、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスについての血清ＥＬＩＳＡは、循環二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および抗カルジオリピン抗体のレベルの、野生型マウスと比較した有意な上昇も指し示した。ＡＮＡとは、細胞核の内容物に結合する自己抗体である。抗ｄｓＤＮＡ抗体とは、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する、ＡＮＡ抗体の種類であり、抗カルジオリピン抗体は、ミトコンドリア膜のリン脂質成分を指向する。
さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、８週齢という早期において、循環リウマチ因子（ＲＦ）抗体の有意な増加を示した（図３ＡＨ）。血清グロブリンおよび自己抗体含量の増加は、多様な疾患状態、例えば、骨髄障害、自己免疫疾患、慢性炎症性状態（複数可）、肝疾患、腎疾患、感染症などのうちのいずれか１つを指し示しうる。例を１つだけ示せば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、多くの細胞膜抗原および細胞内抗原に対する、高力価の自己抗体によって特徴付けられる。例えば、低分子核リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）のコアユニットを指向する抗Ｓｍ抗体は、ＳＬＥについての特異的マーカーである。
ループス患者における自己抗体力価の増加は、循環濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞の頻度の増加と正に相関する（Xu, H.ら、Cell Immunol、２９５巻、４６〜５１頁（２０１５年））。脾臓、頸部ＬＮ、腸間膜ＬＮ、および血液におけるこの特異的細胞集団（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４４＋ＩＣＯＳ＋ＰＤ−１＋Ｂｃｌ−６＋）についての、ＦＡＣＳ解析による精査は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−組織内のＴｆｈ細胞集団の、対照と比較した有意な増加を明らかにした（図１０）。Ｔｆｈ細胞の上昇はまた、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−ＢＭでも観察されたが、これは、有意性に到達しなかった（図１０）。まとめると、これらの観察は、Ｃ９ｏｒｆ７２発現の非存在下では、ヒトＳＬＥと同様な免疫応答が生じるという概念を裏打ちする。
形質細胞、および移行しているＢ細胞／形質芽細胞の拡大は、多発性骨髄腫および形質細胞腫などの特異的新生物のほか、自己免疫状態とも関連しうる。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの脾臓およびリンパ節は、腫大し、とりわけ、免疫浸潤物が明白であったが、浸潤細胞は、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ４５Ｒ）について陰性であり、かつ、Ｆ４／８０＋であり、泡沫状マクロファージの特徴を有した。これらの細胞の集団は、大きかったが、これらの組織の局所的領域であって、それらの系統について適切であると考えられる領域を占有し、これらの組織の基礎構造を完全に破壊しなかった。加えて、有糸分裂指数は小さく、まれな有糸分裂だけが観察された。したがって、新生物の可能性は小さいと考えられた。しかし、これらの組織内では、糸球体腎炎の証拠である形質細胞、および時折のモット細胞の集団が存在し、これは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける自己免疫を指し示した。上記で示した通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、ＩｇＧ型抗ＲＦ力価およびＩｇＭ型抗ＲＦ力価の両方が、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２＋／−（ヘテロ接合性）マウスと比較して有意に上昇した（図３ＡＨ）。さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスでは、８週齢以降、ＩｇＧおよびＩｇＭの総血清レベルが有意に上昇した（図３ＡＧおよび３ＡＩ）が、これは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおけるグロブリンの上昇を示す血清化学パネルと符合した。
糸球体基底膜に対する自己抗体、または糸球体の毛細管内の可溶性免疫複合体の沈着に続く、補体の結合および炎症は、腎臓疾患（免疫介在性糸球体腎炎）を引き起こすことが報告されている。総免疫グロブリンレベルおよび自己抗体レベルの、観察される増加が、糸球体腎炎に寄与するのかどうかを決定するために、ＩＨＣを、８〜６３週齢のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスおよび野生型マウスからの腎臓切片に対して、総ＩｇＧおよびＩｇＭについて実施した（図３ＡＬ）。本明細書で記載される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、血清レベルおよび組織学レベルのいずれにおいても、糸球体腎炎の明確な証拠を示す。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスからの腎臓は、全ての被験時点における、ＩｇＧ免疫染色の、野生型マウスと比較した増加を示した。さらに、８週において、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−腎臓は、血管系、ならびに髄質および皮質の尿細管上皮において、びまん性の、極めて強いＩＨＣシグナルを示した。糸球体腎炎の病変の発症と相関して、糸球体のＩｇＧおよびＩｇＭ染色の顕著な増加が、３８週までに観察された。また、ＩｇＧおよびＩｇＭの両方についての染色も、ボウマン嚢の壁側層と、高頻度で関連した。ＩｇＧについての染色が、尿腔および／または腎臓の近位尿細管内で時折観察されたことから、糸球体濾過機能の障害（すなわち、再吸収能を超える漏出）が指し示された。重度の疾患を有する動物における尿細管上皮細胞では、極めて強いＩｇＧ染色が存在したことは、豊富なＩｇＧの再吸収と符合した。同様であるが、それほど強くない染色が、ＩｇＭについて、それほど頻繁でなく観察された。硬化性糸球体における染色は、野生型と比較して少ないが、これは、これらの構造単位（すなわち、血管ループが、マトリックスまたはメサンギウム細胞で置きかえられている）への血流機能障害と符合した。しかし、明瞭な血管ループを保持する糸球体は、野生型と比較して、ＩｇＧを増加させる傾向があった。血管膜と関連する、微細な顆粒状沈着物ならびに／またはＩｇＧおよびＩｇＭの線状の染色が、高倍率下、高頻度で観察されたが、これは、免疫複合体の沈着を示唆する。
補体因子Ｃ３の沈着は一般に、腎臓における基底膜上の免疫グロブリン沈着物と関連する。補体因子Ｃ３についてのＩＨＣは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの糸球体係蹄（glomerular tuft）内の染色の、野生型と比較した増加を明らかにした（図３ＡＬ）。顆粒状および線状の染色は、糸球体嚢の臓側板の膜上で最も顕著であり、毛細血管ループおよび蛸足細胞を顕著に描写していた。
脾臓および頸部リンパ節（８〜１０週および３５週の野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウス）における分子的プロファイリングからの遺伝子シグネチャーデータは、マクロファージ、単球、および顆粒球の細胞集団の浸潤を指し示した。存在する骨髄系細胞の比率の増加を反映しうる、Ｔ細胞およびＢ細胞の枯渇もまた観察された。グローバル階層分析は、脳試料を、遺伝子型ではなく、主に、性別（ｇｅｎｄｅｒ）および年齢で分離したことから、この組織におけるプロファイリングの差違が、試料の基礎的生物学および遺伝子型に起因することが指し示された。脳組織内では、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現だけが、年齢および性別（ｇｅｎｄｅｒ）の両方全体にわたって、一貫して異なった。これに対し、脾臓およびリンパ節に由来する試料は、遺伝子型に基づいてクラスタリングし、年齢および性（ｓｅｘ）は、二次的なものに過ぎないことから、これらの臓器におけるトランスクリプトーム差違は、Ｃ９ｏｒｆ７２発現の変化の結果であったことが指し示された。さらに、免疫機能と関連する１００を超える遺伝子座は、早期および後期の時点の、雄および雌の両方について、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、野生型と比較して有意な発現の差違を示した。Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける脾臓およびリンパ節の遺伝子シグネチャーは、リンパ球フットプリントの同時的な減少を伴う、骨髄系の浸潤を指し示したが、これは、骨髄系細胞の上昇と、リンパ球の減少との間のバランスのために、株の間で同等な総白血球数を示すＣＢＣデータ（上記を参照されたい）と符合した。バイオセットの比較では、最も強力なプロファイリングのマッチは、多様な炎症性状態およびヒト感染性疾患のマウスモデルである、免疫応答シグネチャーに対するマッチであった。本実施例において示される通り、免疫表現型解析データは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座内に破壊を有するマウス（Ｃ９ｏｒｆ７２−／−）が、８週齢という早期において、脾腫およびリンパ節症を発症することを裏付けた。特に、ＣＢＣデータは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、循環単球、循環好中球、および循環好酸球の増加のほか、８週で始まる、血中リンパ球の減少も示した。雄（５８週齢）および雌（３７週齢）のＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスではまた、頸部リンパ節も、老化と共に、徐々に大きくなる。本実施例はまた、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、年齢が進むにつれて、糸球体腎炎（すなわち、Ｆ４／８０＋マクロファージの、腎臓内の浸潤）および自己免疫疾患（すなわち、ＩｇＭ自己抗体レベルおよびＩｇＧ自己抗体レベルの有意な上昇）を発症することも具体的に裏付ける。したがって、本実施例は、実施例１で記載した、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する齧歯動物が、約８週齢という早期の末梢および循環において、検出可能な異常を示すことについて具体的に記載した。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２の除去は、慢性の全身性免疫応答であって、いくつかのコンパートメント内の、炎症性サイトカインの上昇と、骨髄系の拡大とを結果としてもたらす免疫応答をもたらす。
（実施例４）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物への、神経毒素の投与
この実験は、本明細書で記載される非ヒト動物への多様な毒素の投与が、観察されるＡＬＳ様表現型の側面を増悪しうることを裏付ける。特に、本実施例は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスへの多様な毒素の投与が、ＡＬＳ様運動表現型を軽微に増悪させ、運動ニューロンに対する酸化ストレスを増加させるが、これらのマウスの不活発化および歩行異常の増大に影響を及ぼさないことを具体的に裏付ける。本実施例はまた、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの運動ニューロンが、有意なミトコンドリア機能不全を発症することも裏付ける。
略述すると、マウス胚性幹細胞を、８日間で、培養し、運動ニューロンへと分化させる。１日目に、あらかじめ凍結させたマウス胚性幹細胞を解凍し、５ｍＬの胚性幹細胞培地（ＥＳ培地：１５％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のグルタミン、１％の非必須アミノ酸、１％のヌクレオシド、０．１％のβ−メルカプトエタノール、１％のピルビン酸ナトリウム、および１００００単位／ｍＬのＬＩＦを伴うＤＭＥＭ）を含む１５ｍＬのファルコンチューブへと添加する。次いで、チューブを、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離する。上清を吸引し、細胞を、１０ｍＬのＥＳ培地中に懸濁させる。次いで、細胞を、０．１％のゼラチン１０ｍＬでコーティングされたＴ７５フラスコに蒔き、３７℃で３０分間にわたりインキュベートして、フラスコの底部への付着を容易とする。次いで、細胞を、一晩にわたりインキュベートする。翌日、生存のために、培地を、新鮮培地と交換する。
翌日、培地を、フラスコから吸引する。フラスコを、１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次いで、５ｍＬのトリプシンを添加して、細胞を、フラスコの底部から剥離させる。細胞を、３７℃で５分間にわたりインキュベートする。剥離は、フラスコを、顕微鏡下で点検することにより確認する。トリプシン反応を停止させるために、分化培地（１０ｍＬのＤＦＮＫ培地：４４％のＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、４４％のNeurobasal、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のグルタミン、０．１％のβ−メルカプトエタノール、１０％のノックアウト血清代替物）を、フラスコへと添加する。溶液を、フラスコから、ファルコンチューブへと回収し、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離する。上清を吸引し、細胞を、１２ｍＬのＤＦＮＫ培地中に懸濁させる。次いで、細胞を、細胞培養ディッシュ内に蒔き、３７℃で一晩にわたり、インキュベーターに入れる。翌日、細胞を伴う溶液を、ファルコンチューブへと移し、５００ｒｐｍで２分間にわたり遠心分離する。上清を吸引し、細胞を、１２ｍＬのＤＦＮＫ培地中に懸濁させる。次いで、細胞を、新たな細胞培養ディッシュ内に蒔き、一晩にわたり、インキュベーターに入れる。次の日、培地をディッシュから回収し、ファルコンチューブへと移す。次いで、チューブを、５００ｒｐｍで２分間にわたり遠心分離し、次いで、上清を吸引する。細胞を、運動ニューロンの分化のために、最終濃度１μＭのレチノイン酸と、最終濃度０．２５μＭのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアンタゴニストを含む３６ｍＬのＤＦＮＫ培地中に懸濁させる。培地を、ディッシュ１枚当たり１２ｍＬずつ、３ディッシュにわたり分割する。
３日後、形成される胚様体（ＥＢ）を解離させる。まず、ＥＢを回収し、ファルコンチューブへと移す。次いで、細胞を、５００ｒｐｍで２分間にわたり遠心分離し、上清を吸引する。次いで、細胞を、４ｍＬのＰＢＳ−グルコースで洗浄する。次に、化学的解離のために、４ｍＬのトリプシンを、細胞へと添加し、５分間にわたりインキュベートする。次いで、１ｍＬのウマ血清を添加して、トリプシン反応を停止させる。ＥＢを、５分間にわたり静置し、上清を吸引する。２ｍＬのＰＢＳ−グルコース−ＤＮアーゼを添加し、細胞を、１０回にわたり、機械的に解離させる。細胞を、５分間にわたり静置し、解離した細胞を、別個のチューブへと移す。２ｍＬのＰＢＳ−グルコース−ＤＮアーゼを、解離していない細胞へと添加し、機械的解離を反復する。細胞を、５分間にわたり静置し、次いで、解離した細胞を、別個のチューブへと移す。解離した細胞を、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離し、次いで、上清を吸引する。解離した細胞を、５ｍＬの胚性幹細胞運動ニューロン培地（ＥＳＭＮ培地：Neurobasal、２％のＢ２７、２％のウマ血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．２５％のグルタミン、０．０１％のβ−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ）中に懸濁させる。細胞を、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離する。上清を吸引し、細胞を、ＥＳＭＮ培地中に懸濁させる。次いで、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動式細胞カウンター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞をカウントし、５０万個〜１００万個の細胞を、各６ウェルプレート内のウェル１つ当たり２ｍＬのＥＳＭＮ培地と共に蒔く。細胞を、ＥＳＭＮ（対照）中、または０．１〜１００μＭ濃度のＢＭＡＡを含むＥＳＭＮ中で維持する。細胞カウントは、０．４％のトリパンブルーを使用し、２０μｍ超の平均細胞直径設定（運動ニューロン）を使用して数えた。例示的な結果を、図４に明示する。
別の実験では、野生型マウスに、１週目に始まる６週間にわたる毎週の、ＢＭＡＡ（５００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照）のｉ．ｐ．注射を施した（図５Ａ、上）。体重測定は、最大６週間にわたる各週、１４週目、および１８週目に記録した。ロータロッド、オープンフィールド自発運動、およびキャットウォーク試験（上記で記載した）を介する、運動機能障害についての解析は、実験の開始時（０週目；１０週齢）、最大６週間にわたる隔週、１４週目、および１８週目に記録した。例示的な結果を、図５Ａ〜５Ｄに明示する。
野生型マウスについて、データは、ＢＭＡＡが、ＡＭＰＡ／カイナイト（kainite）受
容体媒介経路を介して、培養された野生型運動ニューロンを、用量依存的に死滅させることを裏付けた。さらに、ＢＭＡＡの毎週の注射（ｉ．ｐ．）は、野生型マウスにおいて、ＡＬＳ様表現型を誘導しなかった（図５Ａ〜５Ｄ）。同様な結果は、１００ｍｇ／ｋｇのＢＭＡＡを使用する場合にも観察された。
別の実験では、老齢（すなわち、３２週齢）の野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスに、６週間にわたる毎週の、ＢＭＡＡ（５００ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（対照）のｉ．ｐ．注射を施した。体重測定値は、０日目（すなわち、３２週）に始まる、最大３８週間にわたり各週記録した。また、ロータロッド、オープンフィールド自発運動、およびキャットウォーク試験（上記で記載した）を介する、運動機能障害についての解析も、実験の開始時（０週目；１０週齢）、および最大３８週間にわたる隔週に記録した。表６は、試験中の動物の、運動機能障害、振戦、および硬直と関連するスコア付け法を明示する。例示的な結果を、図６Ａ〜６Ｅに明示する。データは、Ｃ９ｏｒｆＦ７２−／− マウスへのＢＭＡＡの投与が、ＡＬＳ様運動表現型を軽微に増悪させるが、これらのマウスの不活発化および歩行異常の増加に影響を及ぼさないことを裏付けた。
別の実験では、Ｃ９ｏｒｆＦ７２−／−マウスに由来する運動ニューロンを、上記で記載した（図７もまた参照されたい）通りに培養し、センス鎖リピートを含有するＲＮＡを選択的に標的とし、全体的なＣ９ｏｒｆ７２発現に影響を及ぼさずに、センス配向性のＲＮＡ凝集体を低減するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。処理に続いて、１００ｍＭのＢＭＡＡを添加した。培養された運動ニューロンの生存および酸化ストレスは、１日目および７日目に測定した。略述すると、蒔いた胚性幹細胞由来の運動ニューロン（上記で記載した）の酸化ストレスは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣｅｌｌＲＯＸ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｇｒｅｅｎ試薬を、５μＭの最終濃度で使用し、３７℃で３０分間にわたりインキュベートして、細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを測定することにより評定した。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで３回にわたり洗浄し、標準的なマイクロプレート蛍光光度法を使用して、蛍光を測定した。例示的な結果を、図７に明示する。データは、Ｃ９ｏｒｆＦ７２−／−運動ニューロンの、ＢＭＡＡへの曝露が、酸化ストレスの増加を引き起こすことを裏付けた。
別の実験では、ミトコンドリア機能を、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおいて決定した。略述すると、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＤＮＡ単離により、胚性幹細胞由来の運動ニューロン（上記で記載した）の、ミトコンドリアＤＮＡ対核ＤＮＡ比を測定した。ＤＮＡの純度および量は、製造元の仕様に従い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＮｏｖａＱＵＡＮＴマウスミトコンドリア対核比キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して評定した。Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒを活用して、胚性幹細胞由来の運動ニューロンのミトコンドリア呼吸を評定した。ＸＦｅ９６
Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、１２の測定値について、野生型マウスの最初の測定値に対する酸素消費速度パーセントを記録した。最初の３つの測定値の平均は、基底呼吸を表し、オリゴマイシン（１μＭ）を添加した後における、次の３つの測定値は、プロトン漏出を表し、基底呼吸とプロトン漏出との差違は、ＡＴＰ産生を表し、ＦＣＣＰ（１μＭ）を添加した後における、次の３つの測定値は、最大呼吸を表し、最大呼吸と基底呼吸との差違は、予備呼吸能を表し、ロテノン／アンチマイシンＡ（０．５μＭ）を添加した後における、最後の３つの測定値は、非ミトコンドリア呼吸を表した。全てのデータは、少なくとも３つの独立の実験から回収したものであり、平均±ＳＥＭとして報告する。スチューデントのｔ検定は、野生型マウスの値を、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスの値と比較する統計学的解析のために実施したものであり、＊をＰ≦０．０５とし、＊＊をＰ≦０．０１とし、＊＊＊をＰ≦０．００１とした。例示的な結果を、図８に明示する。
かつての報告は、ＡＴＰの枯渇が、病理学的な細胞肥大をもたらすＮａ＋の細胞内蓄積を結果としてもたらすことを裏付けている（Liang D.ら、２００７年、Neurosurg. Focus、２２巻（５号）：Ｅ２頁）。図８に示される通り、野生型マウスおよびＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスの幹細胞から分化させた運動ニューロンを使用したところ（上記で記載した；また、Wichterle H.ら、２００２年、Cell、１１０巻（３号）：３８５〜９７頁も
参照されたい）、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、ＡＴＰの欠損および／または細胞膜の損傷に起因する、Ｎａ−Ｋ ＡＴＰアーゼポンプの不全を示した。これに対し、野生型ニューロンまたはＣ９ｏｒｆ７２−／−ニューロンにおいて、生存および酸化ストレスの差違は観察されなかった（図８、上）。興味深いことに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスに由来する運動ニューロン（図８、上右）では、野生型運動ニューロンと比較した、ミトコンドリアＤＮＡの、核ＤＮＡに対して量が多いこと（図８、上右）のほか、ミトコンドリア呼吸速度の有意な減少（図８、下左）も観察された（Ｐ＜０．０００１）。さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−運動ニューロンにおいて、基底呼吸、ＡＴＰ産生、最大呼吸、プロトン漏出、および予備呼吸能の全てが、野生型と比較して有意に低度であった（図８、下右）。したがって、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスからの運動ニューロンは、細胞の損傷および肥大をもたらす可能性がある、ミトコンドリアの有意な機能不全を示す。
本実施例は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、ＡＬＳ様運動障害を示すことを具体的に裏付ける。さらに、本実施例は、ＢＭＡＡが、ＡＭＰＡ／カイニン酸媒介グルタミン酸興奮毒性経路内の運動ニューロンを死滅させる一方で、ＢＭＡＡへの曝露が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける疾患を誘発するのに十分なわけではないことも強調する。なおさらに、ＢＭＡＡへの曝露は、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおけるＡＬＳ疾患表現型を、軽微に増悪するに過ぎない。したがって、本明細書で提示されるデータは、少なくとも一部の実施形態では、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおけるＣ９ｏｒｆ７２タンパク質の喪失が、ＡＬＳ−ＦＴＤ疾患の顕著な機構ではないことを示唆する。
まとめると、本開示は、実施例１に従い作製されたＣ９ｏｒｆ７２−／−マウスが、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の完全な除去を示すことを具体的に裏付ける。さらに、本明細書で記載される通り、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、例えば、有意な運動障害と、免疫系およびミトコンドリア機能の破壊とによって特徴付けられるいくつかの識別可能な表現型を、発生を通して生じさせる。例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスは、血清自己抗体濃度の有意な増加と、多様な免疫細胞の、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓、および血液への浸潤とによって特徴付けられる自己免疫表現型を生じさせる。興味深いことに、本明細書で記載される免疫表現型解析データは、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子産物が、免疫系のホメオスタシスおよびニューロンの健康において、極めて重要な役割を果たすことを例示する。特に、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける脾腫およびリンパ節症は、８週齢という早期から６０週齢を通じて進行する、形質細胞、単球、顆粒球、および最も顕著にはＦ４／８０＋マクロファージを含む、いくつかの細胞集団の浸潤の結果である。サイトカインパネルおよび分子プロファイリングデータは、Ｃ９ｏｒｆ７２−／−マウスにおける、Ｔｈ１／マクロファージ活性化経路の増進を強く示唆する。したがって、本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２の文脈では、ハプロ不全が、ＡＬＳ−ＦＴＤ病変の主要な原因である可能性は低いことを具体的に裏付け、グローバルなＣ９ｏｒｆ７２の除去を伴う非ヒト動物についての包括的な表現型解析において、Ｃ９ｏｒｆ７２の、免疫機能およびホメオスタシスにおける新規の役割を提示する。
均等物
こうして、本発明の少なくとも１つの実施形態の、いくつかの態様について記載してきたが、当業者には多様な変更、改変、および改善にたやすく想到されることを、当業者であれば十分に理解されたい。このような変更、改変、および改善は、本開示の一部であることを意図し、本発明の精神および範囲内にあることを意図するものである。したがって、上掲の記載および図面は、例だけを目的とするものであり、本発明は、以下の特許請求の範囲により詳細に記載される。
特許請求の範囲における、「第１の」、「第２の」、「第３の」など、序数用語の使用であって、特許請求の範囲の要素を改変する使用は、それ自体、１つの特許請求の範囲の要素の、別の要素に対する、いかなる優先性、先行性、もしくは順序を含意するものでも、方法の行為を実施する時間的な順序を含意するものでもなく、ある特定の名称を有する、１つの特許請求の範囲の要素を、同じ名称を有する（序数用語の使用を除き）別の要素から識別して、特許請求の範囲の要素を識別する標識としてだけ使用するものである。
本明細書および本特許請求の範囲における冠詞である「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、反対のことが明確に指し示されない限りにおいて、複数形の指示対象を含むと理解されたい。反対のことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、群の１または複数のメンバーの間の「または」を含む、特許請求の範囲または記載は、群のメンバーのうちの１つ、１つを超えるメンバー、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて利用されるか、または他の形でこれに当てはまれば満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて利用されるか、または他の形でこれに当てはまる実施形態を含む。本発明はまた、１つを超えるまたは全ての群のメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて利用されるか、または他の形でこれに当てはまる実施形態も含む。さらに、そうでないことが指し示されない限りにおいて、または禁忌もしくは矛盾の生じることが当業者に明らかとならない限りにおいて、本発明は、１または複数の限定、要素、条項、記載用語などを、列挙された請求項のうちの１または複数から、同じ基本請求項（または、妥当な場合、他の任意の請求項）に従属する別の請求項へと導入する場合の、全ての変化、組合せ、および順列を包含することも理解されたい。要素を、一覧（例えば、マーカッシュ群または類似のフォーマットによる）として提示する場合、要素の各亜群もまた開示され、任意の要素（複数可）を群から除外しうることも理解されたい。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特色などを含むと称する場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特色などからなるか、またはこれらから本質的になることを理解されたい。簡便さを目的とすると、本明細書では、これらの実施形態が、あらゆる場合において、言葉通りに、具体的に明示されているわけではない。また、本発明の任意の実施形態または態様は、具体的な除外が、本明細書で列挙されるのかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明示的に除外されうることも理解されたい。
当業者は、本明細書で記載されるアッセイまたは他のプロセスにおいて得られる値に帰せられる、典型的な標準偏差または標準誤差を十分に理解する。
本発明の背景について記載し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される、刊行物、ウェブサイト、および他の参照素材は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
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