CN107920498A - 具有c9orf72基因座破坏的非人类动物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于神经退行性疾病和/或炎性疾病的非人类动物模型，所述非人类动物包含C9ORF72基因座的破坏。具体地，本文所述的非人类动物包含C9ORF72基因座的整个编码序列的缺失。还提供了鉴定可用于预防、延缓或治疗一种或多种神经退行性疾病(例如肌萎缩侧索硬化症(ALS，也称为葛雷克氏症)和额颞痴呆(FTD))、自身免疫性疾病和/或炎性疾病(例如SLE，肾小球肾炎)的治疗候选物的方法。

Description

具有C9ORF72基因座破坏的非人类动物
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请号62/168,171，2015年9月25日提交的美国临时申请号62/232,658和2015年10月23日提交的美国临时申请号62/245,382的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表的引用
本序列表是命名为32698_10152US01_SequenceListing的ASCII文本文件，大小为56kb，于2016年5月19日创建，并通过EFS-Web提交给美国专利商标局，该序列表通过引用并入本文。
背景技术
神经退行性疾病是造成残疾和疾病的重要原因。特别是，肌萎缩侧索硬化症(ALS，也称为葛雷克氏症)和额颞痴呆(FTD)是以进行性神经元丧失和/或死亡为特征的罕见神经系统疾病。尽管衰老被认为是神经退行性疾病的最大危险因素，但是已经发现了几种遗传成分。例如，铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因的突变一直与ALS相关。此外，C9ORF72基因的非编码区内GGGGCC的六核苷酸重复扩增也与ALS和FTD相关。目前，两种疾病都无法治愈，但有助于控制和/或减轻症状的治疗方法确实存在。
炎性疾病包括各种各样的疾病，这些疾病通常以导致免疫系统受损或功能失调的基因突变为特征。尽管尚未完全了解例如类风湿性关节炎、炎性肠病和肾小球肾炎的机制，但几种遗传成分已与患者所呈现的各种体征和症状相关。这类疾病以全身性炎症为特征，并在整个患者体内表现出各种异常。正如ALS和FTD，炎性疾病的治疗只是为了改善症状并减缓疾病进展。
尽管各种实验动物模型广泛用于大多数治疗剂的开发，但是很少以阐明经鉴定遗传成分引发疾病的具体分子机制的方式来处理神经退行性疾病和炎性疾病。因此，遗传突变引起神经退行性和/或炎性疾病的方式在很大程度上是未知的。理想的动物模型将包含相同的遗传成分并且表现出人类疾病的类似特点。鉴于物种间的遗传差异，对改进的动物模型的开发有大的需求但尚未满足，这种改进的动物模型几乎囊括了人类神经退行性和/或炎性疾病。当然，这种改进的动物模型在开发有效的治疗剂和/或预防剂方面提供了重要价值。
发明内容
本发明包含这样的认识，即期望将非人类动物设计为允许改进的体内系统，而用于鉴定和开发可用于治疗神经退行性疾病、障碍和病症的新的治疗剂和(在一些实施例中)治疗方案。在一些实施例中，本文所述的体内系统可用于鉴定和开发治疗炎性疾病、障碍和病症的新疗法。在一些实施例中，本文所述的体内系统还可以用于鉴定和开发用于治疗自身免疫性疾病、障碍和病症的新疗法。此外，本文所述的非人类动物包括C9ORF72基因座的破坏和/或功能沉默的C9ORF72基因座，使得C9ORF72多肽不被表达或产生，该非人类动物期望用于例如鉴定和开发针对已与人类疾病相关的GGGGCC六核苷酸重复、C9ORF72转录和调控和/或C9ORF72水平的增加或降低的治疗剂。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物为神经退行性疾病、障碍和病症(例如ALS和/或FTD)提供了改进的体内系统(或模型)。在一些实施例中，本文所述的非人动物提供用于炎性疾病、障碍和病症的改进体内系统(或模型)。
本发明提供了用于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞痴呆(FTD)和/或肾小球肾炎的非人类动物模型。在各种实施例中，提供了用于ALS和/或FTD的非人类动物模型，其特征为C9ORF72基因座的破坏(例如整个编码区的缺失)。在一些实施例中，C9ORF72基因座的破坏对包含所述破坏的非人类动物的一个或多个神经元产生影响。在一些实施例中，C9ORF72基因座的破坏对包含所述破坏的非人类动物的脾、颈部淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个产生影响。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物的C9ORF72基因座的破坏导致一种或多种以下表型：ALS样表型；脾肿大；淋巴结病；肾小球肾炎；巨噬细胞、单核细胞和粒细胞中的一种或多种浸润到脾、颈部淋巴结、骨髓和/或血液；F4/80+巨噬细胞浸润肾和/或肝；骨髓中B和/或T细胞的消耗；血液中淋巴细胞的减少；以及血清中一种或多种细胞因子(例如IL-17、IL-10、TNF-α和IL-12)表达的增加。
在一些实施例中，非人类C9ORF72基因座的破坏(例如缺失)是由核酸序列的插入引起的，在某些实施例中，核酸序列包含报告基因。
在一些实施例中，提供了一种非人类动物，该非人类动物的基因组中包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失，即编码所有的C9ORF72亚型(即亚型V1、V2和V3)的基因组序列的缺失。
在一些实施例中，所述缺失是非人类动物的C9ORF72基因座中约26kb的基因组片段。在一些实施例中，所述缺失是至少包含外显子2-11(例如V1的外显子2-11)全部或部分缺失的基因组片段。在一些实施例中，所述缺失包括外显子1-11。在一些实施例中，具有缺失的C9ORF72基因座包含报告基因。在一些实施例中，报告基因可操作地连接至C9ORF72启动子。在一些实施例中，C9ORF72启动子是内源性启动子。
在一些实施例中，本文所述的非人类动物的C9ORF72基因座缺乏外显子2的编码区至外显子11的编码区，并且包含报告基因。在一些实施例中，报告基因可操作地连接至C9ORF72启动子。在一些实施例中，报告基因可操作地连接至C9ORF72基因的外显子2的非编码区(即5'UTR的一部分)，从而将报告基因置于与外显子1(即外显子1a或外显子1b)可操作连接的位置和非人类动物的C9ORF72基因座的上游调控序列内(包括启动子)。在具体的实施例中，报告基因与外显子2的非编码部分之间的可操作连接通过以下实现：使从紧接在外显子2的ATG起始密码子之后的密码子至外显子11的编码区的C9ORF72基因组序列靶向缺失，并且将不含ATG起始密码子的报告基因编码序列插入到紧接在C9ORF72基因的外显子2的剩余ATG起始密码子之后的C9ORF72基因座位点。在一些实施例中，报告基因的表达类似于C9ORF72基因座的表达模式(或表达谱)。
在一些实施例中，报告基因选自由以下组成的组：β-半乳糖苷酶(lacZ)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed以及MmGFP。在某些实施例中，报告基因是lacZ。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物具有C9ORF72基因座中整个编码序列的纯合性缺失或杂合性缺失。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物出现如本文所述的一种或多种表型；在某些实施例中，在约8周龄后表型是可检测的。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现ALS和/或FTD的一种或多种症状；在某些实施例中，在约36周龄后出现上述症状；在某些实施例中，在约40周龄后出现上述症状。在一些实施例中，在约36周龄后，如本文所述的非人类动物出现进行性运动缺陷。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在约40周龄后出现下运动神经元异常。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在约36周龄后出现体重下降。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现运动神经元的线粒体功能障碍；在某些实施例中，线粒体功能障碍的特征在于线粒体呼吸作用、基础呼吸作用、最大呼吸作用、备用呼吸能力、ATP产生以及质子漏中的一种或多种的下降；在某些实施例中，线粒体功能障碍的特征在于：与对照或参考非人类动物的运动神经元的线粒体与核DNA的比值相比，本文所述的非人类动物的运动神经元的线粒体与核DNA的比值增大。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现肾小球肾炎的一种或多种症状；在某些实施例中，在约35周龄后，在约35-41周龄后，或者在约35-60周龄后，出现上述症状。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在约8周龄后出现脾肿大。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在约8周龄后出现淋巴结病。在一些实施例中，在约12-18周龄后，或者在约18-60周龄后，可触及淋巴结病。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物的特征在于浆细胞、单核细胞、粒细胞和F4/80+巨噬细胞中的一种或多种的浸润；在某些实施例中，在约8周龄后可检测到浸润；在某些实施例中，可在多达60周龄时检测到浸润。在一些实施例中，在约8周龄后，如本文所述的非人类动物在肾和/或肝中出现F4/80+巨噬细胞的浸润。
在一些实施例中，在约8周龄后，如本文所述的非人类动物出现IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α和MCP-1中的一种或多种的血清细胞因子水平增加。在一些实施例中，与参考或对照非人类动物相比，如本文所述的非人类动物在约8周龄后出现IL-12血清水平增加到约6倍或更多。
在一些实施例中，在约28-35周龄后，在约35-41周龄后，或者在约35-60周龄后，如本文所述的非人类动物出现以以下为特征的肾病：基膜增厚、管型形成(cast formation)(或透明管型形成)、免疫复合物沉积、膜增生性肾小球肾炎、肾间质单核细胞炎症、肾小球硬化、嗜碱小管或其组合。
在一些实施例中，在约28-35周龄后，如本文所述的非人类动物在脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个中出现髓样树突状细胞群增加。在一些实施例中，髓样树突状细胞群被表征为CD45+CD11b+CD11c+MHCII+。
在一些实施例中，在约8周龄后，如本文所述的非人类动物出现一种或多种自身抗体的血清水平增加；在某些实施例中，在约28-35周龄后出现上述症状。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物，在约8周龄至约60周龄(包括端值)之间出现一种或多种自身抗体的血清水平增加。
在一些实施例中，一种或多种自身抗体选自抗类风湿因子(抗RF)抗体、抗dsDNA抗体、抗核抗体(ANA)、抗Smith(抗Sm)抗体、抗心磷脂抗体及其组合。
在一些实施例中，在约28-35周龄后，如本文所述的非人类动物在脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个中出现F4/80+巨噬细胞水平增加。在一些实施例中，F4/80+巨噬细胞被表征为CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-。
在一些实施例中，在约28-35周龄后，如本文所述的非人类动物在脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个种出现T细胞群增加。在一些实施例中，T细胞被表征为CD8+CD44+、CD8+CD69+、CD8+PD1+、CD4+CD44+、CD4+CD69+或CD4+PD1+。在一些实施例中，在约28-35周龄后，如本文所述的非人类动物在脾和/或淋巴结中出现调节性T细胞群增加，并且其中调节性T细胞群被表征为CD4+FoxP3+。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在脾、淋巴结(例如颈部淋巴结(或“CLN”)和肠系膜淋巴结(或“MLN”))和/或血液中出现滤泡辅助T(Tfh)细胞增加，并且其中Tfh细胞群被表征为CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+。
在一些实施例中，在约8-60周龄后，如本文所述的非人类动物在脾、淋巴结和骨髓中的一个或多个中出现浆细胞群增加。在一些实施例中，浆细胞群被表征为CD45+CD19-B220-CD138+或CD45+CD19intB220intCD138+。
在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现狼疮性肾炎。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物出现增殖性肾小球肾病。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物在发育期间出现与系统性红斑狼疮(SLE)相关的一种或多种表型。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物出现选自由以下组成的组的一种或多种表型或症状：自身抗体滴度和血清细胞因子升高，淋巴结肿大，脾肿大以及髓室和淋巴室(lymphoidcompartments)的选择性扩增或其组合。在一些实施例中，早在8周时就观察到一种或多种表型或症状。在一些实施例中，在约18周至约24周(包括端值)之间观察到一种或多种表型或症状。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的分离的非人类细胞或组织。在一些实施例中，分离的细胞或组织包含本文所述的C9ORF72基因座。在一些实施例中，细胞是神经元细胞或来自神经元谱系的细胞。在一些实施例中，细胞来自淋巴或骨髓谱系。在一些实施例中，细胞选自B细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。在一些实施例中，组织选自动物脂肪、膀胱、脑、胸部、骨髓、眼睛、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子及其组合。
在一些实施例中，提供了永生化细胞系，其由如本文所述的非人类动物的分离细胞制成。
在一些实施例中，提供了非人类胚胎干细胞，其基因组包含如本文所述的C9ORF72基因座或如本文所述的C9ORF72基因座中的缺失。在一些实施例中，非人类胚胎干细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在某些实施例中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且来自129品系、C57BL品系或其混合物。在某些实施例中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且是129和C57BL品系的混合物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类胚胎干细胞的用途，即制备经基因修饰的非人类动物。在某些实施例中，非人类胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且用于制备如本文所述的包含C9ORF72基因座的小鼠。在某些实施例中，非人类胚胎干细胞是大鼠胚胎干细胞，并且用于制备如本文所述的包含C9ORF72基因座的大鼠。
在一些实施例中，提供了非人类胚胎，该非人类胚胎包括包含如本文所述的C9ORF72基因座的非人类胚胎干细胞，或者由其制得，由其获得或由其产生。在某些实施例中，非人类胚胎是啮齿动物胚胎；在一些实施例中，非人类胚胎是小鼠胚胎；在一些实施例中，非人类胚胎是大鼠胚胎。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类胚胎的用途，即制备经基因修饰的非人类动物。在某些实施例中，非人类胚胎是小鼠胚胎，并且用于制备如本文所述的包含C9ORF72基因座的小鼠。在某些实施例中，非人类胚胎是大鼠胚胎，并且用于制备如本文所述的包含C9ORF72基因座的大鼠。
在一些实施例中，提供了如本文所述的核酸构建体(或者靶向构建体或靶向载体)。
在一些实施例中，如本文所述的核酸构建体从5'至3'包括：非人类靶向臂，其包含与非人类(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)C9ORF72基因座的5'部分同源的多核苷酸；第一重组酶识别位点；可操作地连接至重组酶基因的第一启动子；可操作地连接至选择标记的第二启动子；第二重组酶识别位点；如本文所述的报告基因；以及非人类靶向臂，其包含与非人类(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)C9ORF72基因座的3'部分同源的多核苷酸。在一些实施例中，非人类C9ORF72基因座的3'部分包括非人类(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)C9ORF72基因的外显子11的终止密码子下游的基因组序列。在一些实施例中，C9ORF72基因座的5'部分包括非人类(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)C9ORF72基因的外显子2的起始密码子上游的基因组序列。在许多实施例中，第一和第二重组酶识别位点定向成指引切除。在许多实施例中，重组酶基因编码识别第一和第二重组酶识别位点的重组酶。在许多实施例中，第一启动子驱动重组酶基因在分化细胞中的表达，而不驱动重组酶基因在未分化细胞中的表达。在许多实施例中，第一启动子具有转录能力和发育调节性。
在一些实施例中，重组酶识别位点包括loxP、lox511、lox2272、lox2372、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、Dre、rox或其组合。在一些实施例中，重组酶基因选自由Cre、Flp(例如Flpe、Flpo)和Dre组成的组。在某些实施例中，第一和第二重组酶识别位点是lox(例如loxP)位点，并且重组酶基因编码Cre重组酶。
在一些实施例中，第一启动子选自由以下组成的组：鱼精蛋白(Prot；例如Prot1或Prot5)、Blimp1、Blimp1(1kb片段)、Blimp1(2kb片段)、Gata6、Gata4、Igf2、Lhx2、Lhx5和Pax3。在某些实施例中，第一启动子选自表2所示的启动子。在某些实施例中，第一启动子是SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或者包含这些序列。
在一些实施例中，选择标记选自由以下组成的组：新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。
在一些实施例中，第二启动子选自由以下组成的组：UbC启动子、Ubi启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、CAGGS启动子、EF1启动子、pgk1启动子、β-肌动蛋白启动子以及ROSA26启动子。在某些实施例中，选择标记是neor，第二启动子是Ubi。
在一些实施例中，提供了制备非人类动物的方法，该非人类动物的基因组包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失，所述方法包括：(a)将核酸序列引入到非人类胚胎干细胞中，使得C9ORF72基因座中的整个编码序列缺失，所述核酸包含与C9ORF72基因座同源的多核苷酸；(b)从步骤(a)获得经遗传修饰的非人类胚胎干细胞；以及(c)使用步骤(b)的经基因修饰的非人类胚胎干细胞来创建非人类动物。在一些实施例中，制备本文所述的非人类动物的方法还包括培育步骤(c)中产生的非人类动物的步骤，从而创建具有纯合性缺失的非人类动物。
在一些实施例中，核酸序列是如本文所述的核酸构建体，或包含所述核酸构建体，或出现在所述核酸构建体中。在一些实施例中，核酸序列包含一个或多个选择标记。在一些实施例中，核酸序列包含一个或多个位点特异性重组位点。在一些实施例中，核酸序列包含重组酶基因和侧翼为重组酶识别位点的选择标记，所述重组酶识别位点定向成指引切除。在一些实施例中，核酸序列还包含选择标记下游的报告基因。在一些实施例中，核酸序列包含与启动子可操作连接的重组酶基因，所述启动子驱动重组酶基因在分化细胞中的表达，而不驱动重组酶基因在未分化细胞中的表达。在一些实施例中，核酸序列包含与启动子可操作连接的重组酶基因，所述启动子至具有转录能力和发育调节性。在一些实施例中，核酸序列包含与启动子可操作连接的重组酶基因，所述启动子是SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或者包括这些序列。
在一些实施例中，提供了一种用于制备非人类动物的方法，该非人类动物的基因组包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失，所述方法包括修饰非人类动物的基因组，从而使其包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失，由此制备所述非人类动物。
在一些实施例中，提供了可通过本文所述的方法获得、产生或制得的非人类动物。
在一些实施例中，提供了肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞痴呆(FTD)的非人类动物模型，该非人类动物模型具有包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失的基因组。
在一些实施例中，提供了肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞痴呆(FTD)的非人类动物模型，该非人类动物模型通过C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失而获得，其中所述非人类动物在发育期间出现ALS和/或FTD的一种或多种症状。
在一些实施例中，提供了肾小球肾炎的非人类动物模型，该非人类动物模型具有包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失的基因组。
在一些实施例中，提供了肾小球肾炎的非人类动物模型，该非人类动物模型通过C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失而获得，其中所述非人类动物在发育期间出现肾小球肾炎的一种或多种症状。
在一些实施例中，提供了淋巴增殖性疾病的非人类动物模型，该非人类动物模型具有包含C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失的基因组。
在一些实施例中，提供了淋巴增殖性疾病的非人类动物模型，该非人类动物模型通过C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失而获得，其中所述非人类动物在发育期间出现免疫系统失调或功能障碍的一种或多种症状。
在一些实施例中，提供了用于鉴定治疗非人类动物的疾病、障碍或病症的治疗候选物的方法，所述方法包括：(a)将候选药剂施用于其基因组包含C9ORF72基因座中整个编码序列缺失的非人类动物；(b)进行一个或多个测定，以确定候选药剂是否对与疾病、障碍或病症相关的一种或多种体征、症状和/或病症具有作用；以及(c)鉴定作为治疗候选物对与疾病、障碍或病症有关的一种或多种体征、症状和/或病症具有作用的候选药剂。
在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是神经退行性疾病障碍或病症。在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是炎性疾病、障碍或病症。在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、障碍或病症。
在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS；也称为Canale-Smith综合征)。在一些实施例中，ALPS的特征在于IL-10、抗类风湿因子(抗RF)抗体、抗核抗体(ANA)或其组合的血清水平增加。
在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是狼疮性肾炎。在一些实施例中，狼疮性肾炎的特征在于肠系膜增生和/或扩增。在一些实施例中，狼疮性肾炎的特征在于一种或多种肾小管异常。在一些实施例中，一种或多种肾小管异常选自扩张、管型形成、嗜碱性及其组合。
在一些实施例中，非人类动物的疾病、障碍或病症是系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施例中，SLE的特征在于淋巴样增生、T细胞活化、血清抗核抗体(ANA)升高以及影响心脏、肺、肝、皮肤、关节、神经系统和肾的全身性炎症中的一种或多种。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造用于治疗神经退行性疾病、障碍或病症的药物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造治疗炎性疾病、障碍或病症的药物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造治疗自身免疫性疾病、障碍或病症的药物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造治疗淋巴增殖性疾病、障碍或病症的药物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造治疗自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)的药物。
在一些实施例中，提供了如本文所述的非人类动物的用途，即用于制造治疗狼疮性肾炎的药物。
在一些实施例中，神经退行性疾病、障碍或病症是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。在一些实施例中，神经退行性疾病、障碍或病症是额颞痴呆(FTD)。在一些实施例中，炎性疾病、障碍或病症是肾小球肾炎。在一些实施例中，自身免疫性疾病、障碍或病症是肾小球肾炎、自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)、狼疮性肾炎或系统性红斑狼疮(SLE)。
在一些实施例中，本文所述的自身免疫性疾病、障碍或病症的特征在于血清自身抗体浓度显著增加。在一些实施例中，本文所述的自身免疫性疾病、障碍或病症的特征在于一种或多种细胞因子(例如IL-10、IL-12、IL-17、TNF-α等)的血清水平显著增加。
在一些实施例中，如本文所述的淋巴增殖性疾病、障碍或病症的特征在于脾、骨髓、淋巴结、肾或血液中的一个或多个中的一种或多种免疫细胞显著增加。在一些实施例中，本文所述的淋巴增殖性疾病、障碍或病症的特征在于一种或多种淋巴细胞的反常或失调。
在各种实施例中，C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失包括如本文所述的缺失。在各种实施例中，非人类C9ORF72基因座包括如本文所述的非人类C9ORF72基因座。在各种实施例中，非人类C9ORF72基因座是鼠科动物C9orf72基因座(例如小鼠或大鼠C9orf72基因座)。
在各种实施例中，本文所述的一种或多种表型与参考或对照物进行比较。在一些实施例中，参考或对照物包括具有如本文所述的修饰、具有与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(例如野生型非人类动物)的非人类动物。
在各种实施例中，本文所述的非人类动物是啮齿动物；在一些实施例中，本文所述的非人类动物是小鼠；在一些实施例中，本文所述的非人类动物是大鼠。
如本申请中所使用的，术语“约”和“近似”被用作等同物。本申请中使用的带有或不带有约/近似的任何数字意味着涵盖相关领域的普通技术人员所了解的任何正常波动。
本文提供的非人类动物、细胞和方法的其它特征、目的和优点在以下某些实施例的详细描述中是显而易见的。然而，应当理解，尽管示出了某些实施例，但是详细描述仅仅作为说明而非限制。根据详细描述，本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
本文包括的附图(由以下图组成)仅用于说明的目的而非限制。专利或申请文件至少包含一张彩色附图。根据请求并且支付必要的费用，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开副本。
图1A(上盒式图(top box))示出了三种报告的小鼠C9orf72转录物亚型(V1、V2和V3)的示意图(未按比例)以及用于破坏小鼠C9orf72基因座的靶向缺失策略。制备了靶向载体，其包括：小鼠上游同源臂(或“mHU”，含有小鼠C9ORF72基因的外显子2的起始密码子上游的基因组序列并且包括起始密码子)，lacZ报告基因(不含ATG起始密码子)，自缺失(self-deleting)药物选择基因盒(其包括新霉素抗性基因和与小鼠鱼精蛋白1(Prm1)启动子连接的Cre重组酶基因，侧翼为loxP位点)，以及小鼠下游同源臂(或“mHD”，含有小鼠C9ORF72基因的外显子11的终止密码子下游的49bp基因组序列)。在同源重组后，去除了约26kb的小鼠基因组区域，包括所有预测的小鼠C9orf72亚型的C9orf72编码序列(即从紧接在小鼠C9orf72的外显子2的ATG起始密码子之后的密码子开始至外显子3-10的编码序列，居间内含子以及小鼠C9orf72的外显子11的49bp的3'UTR)；并且在紧接在小鼠C9orf72的剩余内源性ATG起始密码子之后插入lacZ报告基因(不含ATG起始密码子)。图1A(下盒式图)示出了所得的经修饰的小鼠C9orf72基因座。在表型分析之前，采用自缺失技术移除新霉素基因盒，使lacZ报告基因和一个loxP位点处于小鼠C9orf72启动子的控制之下。图1A(下盒式图)示出了删除新霉素基因盒后的经修饰的小鼠C9orf72基因座。SEQ ID NO：8列出了从插入的lacZ序列开始至3'loxP位点的经修饰的C9orf72基因座的核苷酸序列；SEQ ID NO：9列出了从外显子1a开始至3'UTR的经修饰的C9orf72基因座的核苷酸序列。
图1B示出了野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠的C9orf72的表达分析(上方；也称为3110043021RIK)和MOB激酶激活剂3B(Mob3b；下方)
图2A-2L示出了在野生型(n＝9)和C9orf72-/-(n＝11)小鼠中测量的ALS样表型。图2A：示例性的随时间(x轴，周)推移的存活百分比(y轴)；图2B：示例性的随时间(x轴，周)推移的体重变化(y轴，以克为单位)；图2C：示例性的随时间(x轴，周)推移的平均运动损伤评分；图2D：示例性的随时间(x轴，周)推移的平均震颤评分；图2E：示例性的随时间(x轴，周)推移的平均刚性评分；2F：示例性的随时间(x轴，周)推移的在旋转棒上的最大时间(y轴，以秒为单位)变化；图2G：示例性的随时间(x轴，周)推移的旷场运动行为，例如不动性(左边；y轴，以秒为单位)和饲育时间(右边；y轴，以秒为单位)；图2H：示例性的步台行走(catwalk)行为，例如平均步长(上方左边，y轴，厘米[cm])，随时间(x轴，周)推移的以百分比规律性指数(y轴)表示的肢体间协调性(上方右边)，以及随时间(x轴，周)推移的示为平均站立(y轴，以秒为单位)的站立阶段(下方中心)；图2I：示例性的60周龄的野生型(WT，n＝5)和C9orf72-/-小鼠(n＝5)的运动神经元的图像，示例性的野生型(WT，n＝5)和C9orf72-/-小鼠(n＝5)的运动神经元计数(下方左边)、平均面积(以m2为单位，下方中间，p<0.0001)和细胞体面积(细胞数量，下方右边)；针对每个载玻片的细胞体面积(每组三个载玻片)测量了10个运动神经元，肿胀显示缺氧和细胞损伤；图2J：示例性的32-60周龄的野生型(C9orf72+/+；n＝14)和C9orf72-/-(n＝17)小鼠随时间推移的存活百分比(上方左边)，体重变化(克)(右上)，随时间变化的平均运动损伤评分(下方左边)，随时间变化的平均震颤评分(下方中间)，以及随时间的平均刚性评分(下方右边)；图2K：示例性的32-60周龄的野生型(C9orf72+/+；n＝14)和C9orf72-/-(n＝17)小鼠随着时间推移的在旋转棒上的最大时间(上方左边)，旷场运动行为，例如随时间推移的不动性(上方中间)和随时间推移的饲育时间(上方右边)，步台行走行为，例如随时间推移的平均步长(下方左边)和随时间推移的以百分比规律性指数表示的肢体间协调性(下方中间)，以及随时间推移的总步行距离(下方右边)；图2L：示例性的野生型(C9orf72+/+)、杂合型(C9orf72+/-)和纯合型(C9orf72-/-)小鼠随时间推移的平均运动损伤评分(上方左边)，随时间推移的平均震颤评分(上方中间)，随时间推移的平均刚性评分(上方右边)和握力(以克为单位的力)。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)检验来确定统计显著性。
图3A-3AL示出了在野生型小鼠(n＝≥4)和具有C9orf72基因座破坏的小鼠(n＝4)中测量的免疫表型分析结果。图3A：示例性的解剖雌性野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠在8周(上排)和18周(下排)的图像，显示出C9orf72-/-小鼠的颈部淋巴结肿大(箭头)以及雌性野生型(WT)、C9orf72+/-(HET)和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾重(右边，以克计)；图3B：示例性的解剖雄性野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠在9-10周(上排)和18(下排)周的图像，显示出C9orf72-/-小鼠的颈部淋巴结肿大(箭头)以及雄性野生型(WT)、C9orf72+/-(HET)和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾重(右边，以克计)；图3C：示例性的37周龄雌性和56周龄雄性C9orf72-/-小鼠的图像，显示出颈部淋巴结肿大(箭头)；图3D：示例性的30-35周龄解剖雌性野生型(上排)和C9orf72-/-(中排)小鼠的图像，显示出颈部淋巴结肿大(箭头)和体重(以克计)、脾重(以克计)以及脾重体重归一化(体重％)(下排)；示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-(-/-)小鼠的解剖脾脏(下方左边)的图像；图3E：示例性的具有差异性的CBC数据，显示出34-38周龄雄性野生型(WT)、C9orf72+/-(HET)和C9orf72-/-(KO)小鼠(细胞类型在每个图上方标出)的总白血球计数和各种免疫细胞类型的循环群体；图3F：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片脾脏和颈部淋巴结组织用苏木精和伊红染色在4x放大倍数下的图像；图3G：示例性的C9orf72+/-小鼠的切片颈部淋巴结组织用苏木精和伊红染色在60x放大倍数下的图像(蓝色箭头：具有类浆细胞形态的细胞；黄色箭头：嗜中性粒细胞；绿色箭头：巨噬细胞型细胞；红色箭头：莫特细胞)；图3H：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-(KO)雄性小鼠的脾、颈部淋巴结、骨髓和血液的阳性B细胞(CD11b-、CD11c-、CD3-、B220+、CD19+)百分比；图3I：示例性的各种阶段下的浆细胞，表达9-10周(黑色条)、18周(浅灰色条)和57-60周(深灰色条)时从雄性野生型(WT)小鼠和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾、颈淋巴结、骨髓和血液分离的特异性细胞表面抗原；图3J：示例性的各种阶段下的浆细胞，所述浆细胞表达在8周(黑色条)、18周(浅灰色条)和30-35周(深灰色条)时从雌性野生型(WT)小鼠和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾、颈淋巴结、骨髓和血液中分离的特异性细胞表面抗原；图3K：示例性的各种阶段下的阳性骨髓细胞百分比，所述骨髓细胞表达在9-10周(黑色条)、18周(浅灰色条)和57-60周(深灰色条)时从雄性野生型(WT)小鼠和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾、颈部淋巴结、骨髓和血液中分离的特异性细胞表面抗原；图3L：示例性的各种阶段下的阳性骨髓细胞百分比，所述骨髓细胞表达在8周(黑色条)、18周(浅灰色条)和30-35周(深灰色条)时从雌性野生型(WT)和C9orf72-/-(KO)小鼠的脾、颈部淋巴结、骨髓和血液中分离的特异性细胞表面抗原；图3M：示例性的30-35周龄雌性野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的脾、颈部淋巴结、骨髓、肾和血液中的阳性巨噬细胞(CD45+、CD11b+、F4/80+、Ly6G-)百分比；图3N：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片脾用各种标记物(在每个图像下方显示)染色在4x放大倍数下的图像；图3O：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片颈部淋巴结用各种标记物染色(在每个图像下方显示；箭头：用CD138间歇染色的细胞)在4x放大倍数下的图像；图3P：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片脾和颈部淋巴结用F4/80染色在4倍和60x放大倍数下的图像；图3Q：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的脾、颈部淋巴结、骨髓和肾中的总细胞计数。使用Cellometer Auto T4细胞存活计数器对细胞进行计数，以进行FACS分析。这么做是为了计算相对于目标表面标记物的阳性细胞总数，除了呈现对于所述标记物的阳性细胞的百分比数据之外。由于这些计数是在红细胞裂解之后进行的，因此与野生型相比，基因敲除小鼠的总细胞计数增大，它们也表示极大的免疫浸润(白细胞)；图3R：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的脾和骨髓中的髓样树突状细胞(左边；CD11b+、CD11c+、MHCII+)和NK细胞(右边；NKp46mid、CD49b+)的阳性百分比和细胞计数；图3S：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD45+细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3T：示例性的野生型(WT)小鼠和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD8+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3U：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD4+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3V：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD8+CD44+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3W：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD4+CD44+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3X：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD8+CD69+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3Y：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD4+CD69+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3Z：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD8+PD1+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3AA：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD4+PD1+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3AB：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的各种组织中的CD4+FoxP3+T细胞的阳性百分比(上排)和总细胞计数(下排)；图3AC：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的脾脏中的CD8+CD62L+(上方左边)、CD4+CD62L+(下方左边)、CD8+CD127+(上方右边)和CD4+CD127+T(下方右边)细胞群的阳性百分比(每对左边)和总细胞计数(每对右边)；图3AD：示例性的细胞因子组，显示出18周龄雄性野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠中的各种细胞因子的表达(在每个图的上方显示细胞因子)；图3AE：示例性的细胞因子组，显示出8-58周龄雄性野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠中的各种细胞因子的表达(在每个图的上方显示细胞因子)；图3AF：示例性的细胞因子组，显示出8-38周龄雌性野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠中各种细胞因子的表达(在每个图的上方显示细胞因子)；图3AG：示例性的野生型(WT)、C9orf72+/-和C9orf72-/-小鼠的血尿素氮(y轴，mg/dL)、球蛋白(y轴，g/dL)和血清免疫球蛋白(y轴，IgG，U/mL(左)；y轴，IgM，U/mL(右))的水平(血尿素氮和球蛋白测定基于45-56周龄雄性小鼠；血清IgM和IgG类风湿因子测定基于8-58周龄雄性小鼠；在从8周龄开始的所有时间点均观察到C9orf72-/-小鼠的IgG和IgM RF显著增加)；图3AH：示例性的雌性(上排)和雄性(下排)野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠的IgG和IgM类风湿因子的水平；血清测定：8-10周(雄性：7只WT，5只Het，9只KO；雌性：7只WT，5只Het，8只KO)、18周(雄性：9只WT，6只Het，13只KO；雌性：5只WT，12只Het，15只KO)、30-41周(雄性：3只WT，4只Het，4只KO；雌性：10只WT，9只Het，9只KO)以及54-65周(雄性：6只WT，9只Het，5只KO)龄年老小鼠；图3AI：雌性(上排)和雄性(下排)野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠中的循环IgG和IgM的水平(单位为μg/mL，y轴)；图3AJ：示例性的26-34周龄雌性(上排)和26-34周龄雄性(下排)野生型(WT)、C9orf72+/-(Het)和C9orf72-/-(KO)小鼠的循环自身抗体的水平(单位为U/mL，y轴)；图3AK：示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片肾(上)和肝(下)分别用苏木精和伊红(H&E)或F4/80(通过免疫组织化学法(F4/80IHC))染色在100x和20x放大倍数下的图像；图3AL：示例性的8-63周龄野生型(WT)和C9orf72-/-小鼠的切片肾组织用苏木精和伊红(H&E，最上组)染色、IgG(从上开始数的第二组)，IgM(从上开始数的第三组)和补体C3(最下组)的图像。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)检验来确定统计显著性。
图4示出了示例性的用不同浓度毒素处理的培养的野生型神经元的活神经元与对照物的百分比(y轴)。上图示出了如示例4所述的实验设计：DA(软骨藻酸；AMPA/红藻氨酸受体激动剂)，BMAA(β-甲氨基-L-丙氨酸，100μM)，MK801(地佐昔康，10μM；NMDA受体拮抗剂)，NBQX(2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并喹喔啉-2,3-二酮，10μM；AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂)；谷胱甘肽(10μM，抗氧化剂)。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)(单因素ANOVA检验)来确定统计显著性。Cox,P.A.等人，2003，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.100(23):13380-13383；Murch,S.J.等人，2004，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.101(33):12228-12231；Cox,P.A.等人,2005，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.102(14):5074-5078；Erdner,D.L.等人，2008，EnvironmentalHealth,7(Suppl.2):S2。
图5A-5D示出了施用腹腔注射BMMA(n＝5)或PBS(对照组，n＝5)的野生型小鼠的ALS样表型的测定结果。图5A：上图示出了治疗、体重测量和行为研究的实验设计和时间点，下图示出了示例性的对照组(黑色)与经BMAA处理的小鼠(灰色)随时间(x轴，周)推移的体重变化(y轴，以克计)；图5B：示例性的对照组(黑色)与经BMAA处理的小鼠(灰色)的(y轴，秒)随时间(x轴，周)推移的在旋转棒上的最大时间；图5C：示例性的对照组(黑色)与经BMAA处理的小鼠(灰色)随时间(x轴，周)推移的旷场运动行为，例如不动性(左边；y轴，以秒为单位)和饲育时间(右边；y轴，以秒为单位)；图5D：示例性的对照组(黑色)与经BMAA处理的小鼠(灰色)的步台行走行为，例如平均步长(左上，y轴，厘米[cm])，随时间(x轴，周)变化的以百分比规律性指数(y轴)表示的肢体间协调性(上方右边)，以及随时间(x轴，周)变化的示为平均站立(y轴，以秒为单位)的站立阶段(下中心)。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)检验来确定统计显著性。
图6A-6E示出了施用腹腔注射BMMA(BMAA野生型：3只雄性，2只雌性；BMAA敲除：3只雄性，3只雌性)或PBS(野生型对照组：4只雄性，1只雌性；基因敲除对照组：5只雄性，1只雌性)的野生型和C9orf72-/-小鼠的ALS样表型的测定结果。图6A：上图示出了治疗、体重测量和行为研究的实验设计和时间点，下方左图示出了示例性的随时间(x轴，周)推移的存活百分比(y轴)，下方右图示出了示例性的随时间(x轴，周)推移的体重变化(y轴，以克为单位)；图6B：上方左图示出了示例性的随时间(x轴，周)推移的平均运动损伤评分，上方右图示出了示例性的随时间(x轴，周)推移的平均震颤得分，下方示出了示例性的随时间(x轴，周)推移的平均刚度得分；图6C：示例性的随时间(x轴，周)推移的在旋转棒上的最大时间(y轴，秒)；图6D：示例性的随时间(x轴，周)推移的旷场运动行为，例如不动性(左边；y轴，以秒为单位)和饲育时间(右；y轴，以秒为单位)；图6E：示例性的步台行走行为，例如平均步长(上方左边，y轴，厘米[cm])，随时间(x轴，周)推移的以百分比规律性指数(y轴)表示的肢体间协调性(上方右边)，以及随时间(x轴，周)推移的示为平均站立(y轴，以秒为单位)的站立阶段(下方中心)。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)检验来确定统计显著性。
图7示出了用BMAA处理的野生型和C9orf72-/-(基因敲除)运动神经元的体外存活(下方左边)和氧化应激(下方右边)。上图为实验设计的示意图；存活率(下方左边)表示为野生型和用100mM BMAA处理的C9orf72-/-(基因敲除)神经元的活神经元与野生型对照组(y轴)的百分比。第1天(下方左边的左侧)和第7天(下方右边的右侧)的氧化应激表示为由ROS敏感探针CellROX Green(Life Technologies公司)产生的约485/520nm荧光的平均光密度。使用Student's未配对t检验和单因素方差分析(ANOVA)检验来确定统计显著性。
图8示出了示例性的野生型(WT)和C9orf72-/-运动神经元的存活率(上方左边)、氧化应激(上方中间)、线粒体与核DNA的比值(上方右边)以及线粒体功能的各种测定(下方左边至右边)。存活率(上方左边)表示为与C9orf72+/+的细胞数量百分比；第1天和第7天的氧化应激表示为活性氧类(ROS；与C9orf72+/+的光密度百分比)；线粒体与核DNA的比值表示为平均线粒体拷贝数；线粒体呼吸作用表示为与C9orf72+/+第一次测定相比的耗氧率百分比；基础呼吸、ATP产量、质子泄露、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸表示为与C9orf72+/+对照相比的耗氧率百分比。
图9A-9C示出了C9orf72-/-小鼠的进行性肾小球肾病。图9A示出了组织病理评分的加权图，其表明，在基因敲除小鼠中所观察到的最为显著的肾改变与膜增生性肾小球肾炎相关。图9B示出了与图9A中描绘的加权图对应的个体组织病理评分。简而言之，关于与免疫介导的肾小球肾病相关的肾病类别：膜增生性肾小球肾炎、肾间质单核细胞炎症、透明管形成、肾小球硬化和嗜碱性肾小管，对H&E染色的肾切片进行了盲评。得分0＝无，1＝最小，2＝轻度，3＝中等，4＝重度。所有的基因敲除小鼠显示出最小至重度膜性增生性肾小球肾炎，偶尔在受影响更严重的动物身上出现其它疾病类别的迹象。图9C示出了在同一群小鼠的14周(图9C，上方)和24周(图9C，下方)时间点测定的尿ACR测量值，显示C9orf72-/-小鼠随年龄增长而出现蛋白尿。杂合型小鼠显示出与未观察到表型的WT相当的值。
图10表明：在C9orf72-/-脾脏、CLN、MLN和血液中，滤泡辅助T(Tfh)细胞(CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+)的百分比和总细胞计数显著增加。图中呈现的是26周龄雌性小鼠的平均值±标准误差(*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001)(相对于每个基因型，n＝5)。在C9orf72-/-BM中也观察到Tfh细胞升高，但没有达到显著性。
定义
本发明不限于本文所述的具体方法和实验条件，因为所述方法和条件可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而非限制性的，因为本发明的范围由权利要求书来限定。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语和短语都包括所述术语和短语在本领域中已具有的含义，除非相反含义从使用所述术语或短语的上下文中清楚地指明或是显而易见的。现描述具体的方法和材料，尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料。本文提到的所有公开文献均通过引用并入本文。
“施用”包括将组合物施用于受试者或系统(例如施用于细胞、器官、组织、有机体或相关组件或其一套组件)。普通技术人员将会理解，施用途径可以根据例如组合物所施用于的受试者或系统、组合物的性质、施用目的等而变化。例如，在某些实施例中，对动物受试者(例如人或啮齿动物)的施用可以是经支气管(包括通过支气管滴注)、含服、肠内、皮内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、粘膜、经鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、经气管(包括通过气管滴注)、经皮、阴道和/或玻璃体内。在一些实施例中，施用可以包括按剂量间歇服用。在一些实施例中，施用可以包括至少连续施用(例如灌注)达选定的时间段。
“改善”包括状态的预防、减轻或缓解或者受试者状态的改善。改善包括但不要求完全恢复或完全预防疾病、障碍或病症(例如放射性损伤)。
“近似”：当应用于一个或多个目标值时，其包括相对于与所述参考值类似的值而言。在某些实施例中，术语“近似”或“约”是指处于所述参考值的任一方向(大于或小于)的落在25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值范围，除非另有说明或者上下文中另有明示(除；了该数字超过可能值的100％之外的情况)。
“具有生物活性的”包括在体外或体内(例如在生物体内)在生物系统中具有活性的任何药剂的特性。例如，当存在于生物体内时，在该生物体内具有生物效应的物质被认为是具有生物活性的。在具体的实施例中，在蛋白或多肽是具有生物活性的情况下，具有该蛋白或多肽的至少一种生物活性的蛋白或多肽的一部分通常被称为“具有生物活性的”部分。
“相当的”包括这样的两种或更多种药剂、实体、情况、条件集合等，即它们可能彼此不相同，但是足够相似而允许在其间进行比较，以便根据观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域的普通技术人员将会理解，在上下文中，相对于两种或更多种这样的药剂、实体、情况，条件集合等而言，同一度在任何给定的情况下均被认为是相当的。
“保守性的”：当描述保守性氨基酸置换时，包括一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。通常，保守性氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质，例如受体结合配体的能力。具有具备相似化学性质的侧链的氨基酸基团包括：脂肪族侧链，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族-羟基侧链，如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸置换基团包括：例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸，苯丙氨酸/酪氨酸，赖氨酸/精氨酸，丙氨酸/缬氨酸，谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施例中，保守性氨基酸置换可以是丙氨酸对蛋白中的任何天然残基的置换(例如在用于丙氨酸扫描突变时)。在一些实施例中，进行了保守性置换，该置换具有Gonnet,G.H.等人(1992,Science 256:1443-1445)所公开的PAM250对数似然矩阵的正值。在一些实施例中，置换是中等保守性置换，其中所述置换具有PAM250对数似然矩阵的非负值。
“对照”包括本领域所理解的“对照”的含义，即作为与结果进行比较的标准。通常，通过分离变量，对照被用于增加实验的完整性，以便围绕这些变量得出结论。在一些实施例中，对照是与试验反应或测试同时进行而提供比较结果的反应或测试。“对照”还包括“对照动物”。“对照动物”可以具有如本文所述的修饰、具有与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即野生型动物)。在一个实验中，应用了“测试”(即被测试的变量)。在第二个实验中，未应用“对照”(被测试的变量)。在一些实施例中，对照是历史对照(即先前进行的试验或测试，或者先前已知的量或结果)。在一些实施例中，对照是打印的以其它方式保存的记录或者包括所述记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
“破坏”包括与DNA分子(例如与内源性同源序列，如基因或基因座)的同源重组事件的结果。在一些实施例中，破坏可以实现或者呈现DNA序列的插入、缺失、置换、替代、错义突变或DNA序列的移码或其任何组合。插入可以包括整个基因或基因片段(例如外显子)的插入，其可以是内源性序列以外的来源(例如异源性序列)。在一些实施例中，破坏可以增加基因或基因产物(例如由基因编码的蛋白)的表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可以减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可以改变基因序列或编码的基因产物(例如编码的蛋白)。在一些实施例中，破坏可以截短或使基因或编码的基因产物(例如编码的蛋白)成片段。在一些实施例中，破坏可以扩大基因或编码的基因产物。在一些此类实施例中，破坏可以实现融合蛋白的组装。在一些实施例中，破坏可能影响基因或基因产物的水平，但不影响其活性。在一些实施例中，破坏可能影响基因或基因产物的活性，但不影响其水平。在一些实施例中，破坏可能对基因或基因产物的水平没有显著影响。在一些实施例中，破坏可能对基因或基因产物的活性没有显著影响。在一些实施例中，破坏可能对基因或基因产物的水平或活性没有显著影响。
“确定”、“测量”、“评估”、“评价”、“测定”和“分析”包括任何的测量形式，并且包括确定元素是否存在。这些术语包括定量和/或定性的确定。测定可能是相对的或绝对的。“对于存在的分析”可以确定存在的事物的量和/或确定其是否存在。
“内源性基因座”或“内源性基因”包括在引入本文所述的破坏、缺失、置换、改变或修饰之前在亲本或参考生物体中发现的遗传基因座。在一些实施例中，内源性基因座具有天然存在的序列。在一些实施例中，内源性基因座是野生型基因座。在一些实施例中，参考生物体是野生型生物体。在一些实施例中，参考生物体是工程生物体。在一些实施例中，参考生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型还是经工程改造的)。
“内源性启动子”包括例如野生型生物中与内源性基因天然相关的启动子。
“基因”包括染色体中编码产物(例如RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施例中，基因包括编码序列(即编码特定产物的序列)。在一些实施例中，基因包括非编码序列。在一些具体的实施例中，基因可以包括编码(例如外显子)和非编码(例如内含子)序列。在一些实施例中，基因可以包括例如可控制或影响基因表达(例如细胞型特异性表达、诱导型表达等)的一个或多个方面的一个或多个调控序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。为了清楚起见，我们注意到，如本申请中所使用的，术语“基因”通常是指编码多肽的核酸的一部分；该术语可以任选地包含调控序列，如本领域普通技术人员将从上下文中所明确的。
“异源性的”包括不同来源的药剂或实体。例如，当相对于存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物使用时，该术语说明相关多肽、基因或基因产物：1)由人工工程改造；2)由人工(例如通过基因工程)引入到细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)不是由相关细胞或生物体(例如相关细胞型或生物体型)天然产生的或者不存在于所述相关细胞或生物体中。“异源性的”还包括通常存在于特定的原生细胞或生物体中但已被修饰(例如，通过非天然相关的控制之下的突变或布置，在一些实施例中，通过非内源性调控元件(例如启动子))的多肽、基因或基因产物。
“宿主细胞”包括其中引入了核酸或蛋白的细胞。通过阅读本发明，技术人员将会理解，这种术语不仅指特定的目标细胞，而且还用于指这种细胞的子代。由于突变或环境影响而可能在后代中发生某些修饰，因此这种子代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然包括在短语“宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞是原核或真核细胞或者包括原核或真核细胞。通常，宿主细胞是适于接受和/或产生异源核酸或蛋白的任何细胞，而不论细胞属于何种生命界。示例性的细胞包括：原核细胞和真核细胞(单细胞或多细胞)，细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株)，分枝杆菌细胞，真菌细胞，酵母细胞(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等)，植物细胞，昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾细胞等)，非人类动物细胞，人类细胞或细胞融合体(如杂交瘤细胞或四倍体细胞)。在一些实施例中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞，并且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK细胞)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮细胞)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞以及源于上述细胞的细胞系。在一些实施例中，所述细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.细胞)。在一些实施例中，宿主细胞是分离细胞或者包括分离细胞。在一些实施例中，宿主细胞是组织的一部分。在一些实施例中，宿主细胞是生物体的一部分。
“同一性”：与序列比较有关，包括由本领域已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在一些实施例中，使用ClustalW(版本1.83；慢模式)比对法，采用开放空位罚分(open gap penalty)10.0、延伸空位罚分0.1，并且使用Gonnet相似矩阵(MACVECTORTM 10.0.2，MacVector公司，2008)来确定如本文所述的同一性。
“改善”、“增加”、“消除”或“减少”包括相对于基线测量的指示值，如在开始本文描述的治疗之前在相同个体(或动物)中的测量值，或在缺乏本文所述的治疗的情况下在对照个体(或动物)中的测量值。
“分离的”包括这样的物质和/或实体，即所述物质和/或实体已经(1)在最初产生时从与其相关的至少一些成分(无论是在自然界中还是在实验环境中)中分离；和/或(2)由人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可能是从最初与其相关的其它成分中分离的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。在一些实施例中，分离药剂的纯度是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。在一些实施例中，如果物质基本上不含其它成分，则该物质是“纯的”。在一些实施例中，如本领域技术人员所将理解的，在与诸如一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)的某些其它成分组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在这样的实施例中，在不包括此类载体或赋形剂的情况下计算物质的分离百分比或纯度。仅举一例，在一些实施例中，在以下情况下，生物聚合物如天然存在的多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：a)由于其起源或来源与本质上属于天然态的某些或所有的成分不相关；b)其基本上不含与天然产生物种相同的物种的其它多肽或核酸；或c)由来自细胞或其它表达系统的组分表达或者以其它方式与该成分相关，所述成分不属于天然产生其的物种。因此，例如，在一些实施例中，化学合成的多肽或在与天然产生其的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替换地或另外地，在一些实施例中，在已从如下其它成分中分离的意义上来说：a)本质上与之相关；和/或b)在最初产生时与之相关，已进行一种或多种纯化技术的多肽可被认为是“分离的”多肽。
“基因座”或“基因位点”包括基因(或有效序列(significant sequence))、DNA序列、多肽编码序列的特定位置或在生物体基因组的染色体上的位置。例如，“C9ORF72基因座”可以指C9ORF72基因、C9ORF72DNA序列、C9ORF72编码序列的特定位置或C9ORF72在生物体基因组的染色体(已被识别为该序列所在的位置)上的位置。C9ORF72基因座可以包含C9ORF72基因的调控元件，包括但不限于增强子、启动子、5'和/或3'UTR或其组合。本领域的普通技术人员将会理解，在一些实施例中，染色体可以包含数百甚至数千个基因，并且在不同物种之间进行比较时表现出相似遗传基因座的物理共定位。这样的基因座可以被描述为具有共有同线性(shared synteny)。
“非人类动物”包括不是人类的任何脊椎动物生物体。在一些实施例中，非人类动物是圆口类动物、硬骨鱼类、软骨鱼类(例如鲨鱼或鳐形目)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。在一些实施例中，非人类类哺乳动物是灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施例中，非人类动物是啮齿动物，如大鼠或小鼠。
“核酸”包括作为寡核苷酸链的或可被并入到寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是作为寡核苷酸链的或通过磷酸二酯键并入到寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文中可以明确的是，在一些实施例中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是RNA或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”是DNA或包含DNA。在一些实施例中，“核酸”是一个或多个天然核酸残基，包含一个或多个天然核酸残基或由这些组成。在一些实施例中，“核酸”是一种或多种核酸类似物，包含一种或多种核酸类似物或由这些组成。在一些实施例中，核酸类似物与“核酸”的不同之处在于它不使用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，“核酸”是一种或多种“肽核酸”，包含一种或多种“肽核酸”或由这些组成，肽核酸在本领域中是已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，也被认为在本发明的范围内。可替换地或另外地，在一些实施例中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺连接而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，“核酸”是一种或多种天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包含上述天然核苷或由这些组成。在一些实施例中，“核酸”是一种或多种核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧鸟嘌呤、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入的碱基及其组合)，包含上述核苷类似物或由这些组成。在一些实施例中，与天然核酸中的那些相比，“核酸”包含一种或多种经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，“核酸”具有编码功能性基因产物(如RNA或蛋白)的核苷酸序列。在一些实施例中，“核酸”包括一个或多个内含子。在一些实施例中，“核酸”包括一个或多个外显子。在一些实施例中，通过以下一种或多种方式制备“核酸”：从天然来源分离，基于互补模板通过聚合进行酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中进行增殖以及化学合成。在一些实施例中，“核酸”是的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、400、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施例中，“核酸”是单链的；在一些实施例中，“核酸”是双链的。在一些实施例中，“核酸”具有包含至少一个编码多肽的元件的核苷酸序列，或者是编码多肽的序列的补体。在一些实施例中，“核酸”具有酶活性。
“可操作连接的”包括并置，其中所描述的部件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。与编码序列“可操作连接”的调控序列以这样的方式连接，即在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作连接的”序列包括与目标基因连续的表达控制序列和以反式或以一定距离作用而控制目标基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”包括多核苷酸序列，多核苷酸序列是影响其所连接的编码序列的表达和加工所必需的。“表达控制序列”包括：合适的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；有效的RNA加工信号(如剪接和多腺苷酸化信号)；稳定细胞质mRNA的序列；增强转译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及增加蛋白分泌的序列(需要时)。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核细胞中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核细胞中，这种控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对表达和加工而言必不可少的组分，并且还可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合伴侣(fusion partner)序列。
“表型”包括性状或相对于由细胞或有机体表现出的一类或一组性状而言。在一些实施例中，特定的表型可以与特定的等位基因或基因型相关联。在一些实施例中，表型可以是离散的；在一些实施例中，表型可以是连续的。
“生理条件”包括本领域所理解的在细胞或生物体存活和/或增殖的条件下的其含义参考条件。在一些实施例中，该术语包括生物体或细胞系统天然可能发生的外部或内部环境条件。在一些实施例中，生理条件是存在于人类或非人类动物体内的那些条件，尤其是存在于手术部位处和/或手术部位内的那些条件。生理条件通常包括：例如20-40℃的温度范围，1个大气压，pH 6-8，1-20mM的葡萄糖浓度，大气水平下的氧浓度以及地球重力。在一些实施例中，实验室的条件被操控和/或维持在生理条件。在一些实施例中，在生物体内遭遇生理条件。
“多肽”包括任何氨基酸聚合链。在一些实施例中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具非天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有包含彼此独立(即，来自两种或更多种不同的生物体，例如人和非人类部分)地天然存在的部分的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列(其是通过人工作用而设计和/或产生的)。
“预防(prevent)”或“预防(prevention)”：与疾病、障碍和/或病症的发生相关，包括降低发生疾病、障碍和/或病症的风险和/或延迟疾病、障碍或病症的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、障碍或病症的发作延迟了预定的时间段时，可以认为完成预防。
“参考”包括与目标试剂、动物、同生群(cohort)、个体、群体、样本、序列或值进行比较的标准或对照药剂、动物、同生群、个体、群体、样本、序列或值。在一些实施例中，测试或确定参考药剂、动物、同生群、个体、群体、样本、序列或值，基本上与目标药剂、动物、同生群、个体、群体、样本、序列或目标值的测试或确定同时进行。在一些实施例中，参考药剂、动物、同生群、个体、群体、样本、序列或值是历史性参考，任选地体现在有形介质中。在一些实施例中，参考可以是指对照。“参考”还包括“参考动物”。“参考动物”可以具有如本文所述的修饰、具有与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。一般情况下，如本领域技术人员所将理解的，在与用于确定或表征目标药剂、动物(例如哺乳动物)、同生群、个体、群体、样品、序列或值的条件相当的条件下，确定或表征参考药剂、动物、同生群、个体、群体、样品、序列或值。
“反应(response)”包括由于治疗或与治疗相关而发生的受试者病症的任何有益的改变。这种改变可以包括稳定病症(例如防止没有治疗的情况下将会发生的恶化)、改善病症的症状和/或改善病症治愈的前景等。它可以是指受试者的反应或神经元的反应。可以根据各种各样的标准(包括临床标准和客观标准)来测量神经元或受试者反应。对受试者运动系统的检查可以包括力量、腱反射、浅反射、肌肉量、协调性、肌张力，异常运动、静止(station)和步态检查中的一项或多项。用于评估反应的技术包括但不限于：临床检查、拉伸屈曲(肌伸张反射)、霍夫曼反射和/或压力测试。在以下文献中论述了关于评估治疗反应的方法和指南：Brodal,A.:Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine，ed.2，New York,Oxford University Press,1969；Medical Council of the U.K.:Aidsto the Examination of the Peripheral Nervous System，Palo Alto,Calif.，Pendragon House，1978；Monrad-Krohn,G.H.,Refsum,S.:The Clinical Examination ofthe Nervous System,ed.12,London,H.K.Lewis&Co.，1964；以及Wolf,J.K.:SegmentalNeurology，AGuide to the Examination and Interpretation of Sensory and MotorFunction,Baltimore，University Park Press，1981。可以以任何适当的方式来选择具体的反应标准，只要在比较神经元和/或患者组时，基于确定反应速率的相同或相当标准来评估待比较的组即可。本领域的普通技术人员将能够选择适当的标准。
如从上下文中所将理解的，疾病、障碍和/或病症的“风险”包括特定的个体将发生疾病、障碍和/或病症(例如放射性损伤)的可能性。在一些实施例中，风险以百分比表示。在一些实施例中，风险为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％至高达100％。在一些实施例中，风险表示为相对于与参考样品或参考样品组相关的风险而言的风险。在一些实施例中，参考样品或参考样品组具有疾病、障碍、病症和/或事件(例如放射性损伤)的已知风险。在一些实施例中，参考样品或参考样品组来自与特定个体相当的个体。在一些实施例中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
“基本上”包括表现目标特征或性质的全部或近全范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将会理解，生物和化学现象很少会(如果有)达到完全和/或继续进行完全或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”用于捕捉许多生物学和化学现象固有的潜在缺乏的完全性。
“基本同源性”包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员所将理解的，如果两个序列在相应的位置含有同源残基，则通常认为它们是“基本同源的”。同源残基可以是相同的残基。可替换地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分为“疏水”或“亲水”氨基酸和/或分为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸置换另一个相同类型的氨基酸通常可被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类总结如下。
如本领域所熟知的，可以使用各种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和BLASTP，空位比对BLAST(gapped BLAST)以及用于氨基酸序列的PSI-BLAST。以下文献中描述了示例性的这种程序：Altschul,S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.，215(3):403-410；Altschul,S.F.等人，1997，Methods in Enzymology；Altschul,S.F.等人，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(eds.)Bioinformatics:APractical Guide tothe Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；以及Misener等人(eds.)Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，Vol.132)，Humana Press，1998。除了鉴定同源序列之外，上述程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其更多的相应残基在残基的相关延伸段(relevant stretch)上是同源的，则两个序列被认为是基本同源的。在一些实施例中，相关延伸段是完整的序列。在一些实施例中，相关延伸段是至少9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个残基。在一些实施例中，相关延伸段包括沿着完整序列的连续残基。在一些实施例中，相关延伸段包括沿着完整序列的不连续残基，例如，通过多肽或其部分的折叠构象组合在一起的不连续残基。在一些实施例中，相关延伸段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。
“基本同一性”包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员所将理解的，如果两个序列在相应的位置含有相同的残基，则通常认为这两个序列是“基本相同的”。如本领域所熟知的，可以使用各种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和BLASTP，空位比对BLAST以及用于氨基酸序列的PSI-BLAST。以下文献中描述了示例性的这种程序：Altschul,S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.，215(3):403-410；Altschul,S.F.等人，1997，Methods inEnzymology；Altschul,S.F.等人，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(eds.)Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis ofGenes and Proteins，Wiley，1998；以及Misener等人(eds.)Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology，Vol.132)，Humana Press，1998。除了鉴定相同的序列之外，上述程序通常提供了同一性程度的指示。在一些实施例中，如果至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其更多的相应残基在残基的相关延伸段上是相同的，则两个序列被认为是基本相同的。在一些实施例中，相关延伸段是完整的序列。在一些实施例中，相关延伸段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。
“靶向载体”或“靶向构建体”包括包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、靶组织或靶动物中的序列相同或基本相同的序列，并且通过同源重组将靶向构建体整合到所述细胞、组织或动物基因组内的位置。使用位点特异性重组酶识别位点(例如loxP或Frt位点)定靶标的靶向区域也包括在内。在一些实施例中，如本文所述的靶向构建体还包含特定的目标核酸序列或基因(例如报告基因或同源或异源基因)、选择标记、控制和/或调控序列以及编码重组酶或重组蛋白的其它核酸序列。在一些实施例中，靶向构建体可以包含全部或部分目的基因，其中该目的基因编码具有与由内源序列编码的蛋白相似的功能的全部或部分多肽。在一些实施例中，靶向构建体可以包含全部或部分目标人源化基因，其中该人源化基因全部或部地分编码具有与由内源性序列编码的多肽相似的功能的多肽。在一些实施例中，靶向构建体可以包含全部或部分报告基因，其中该报告基因编码使用本领域已知的技术容易鉴定和/或测量的多肽。
“转基因动物”、“转基因非人类动物”或“Tg+”包括任何非天然存在的非人类动物，其中非人类动物的一种或多种细胞含有异源核酸和/或编码目标多肽的全部或部分基因。在一些实施例中，通过谨慎的遗传操作，例如通过显微注射或通过用重组病毒感染，通过直接或间接引入到前体细胞中而将异源核酸和/或基因引入到细胞中。术语遗传操作不包括传统培育技术，而是涉及重组DNA分子的引入。该分子可被整合到染色体内，或者可以是染色体外复制的DNA。术语“Tg+”包括相对于异源核酸和/或基因为杂合或纯合的动物，和/或具有异源核酸和/或基因的单拷贝或多拷贝的动物。
“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括这样的物质(例如治疗性候选物)的任意施用，即该物质部分地或完全缓解、改善、减轻、抑制、延缓特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或起因的发作，降低其严重性和/或减少其发生率。在一些实施例中，这种治疗可以施用于不表现出相关疾病、障碍和/或病症的征兆的受试者和/或仅表现出所述疾病、障碍和/或病症的早期征兆的受试者。可替代地或另外地，在一些实施例中，治疗可以施用于表现出相关疾病、障碍和/或病症的一个或多个已确定征兆的受试者。在一些实施例中，治疗可以是已被诊断为患有相关疾病、障碍和/或病症的受试者。在一些实施例中，治疗可以施用于已知具有与相关疾病、障碍和/或病症的发展风险增加统计相关的一个或多个易感因子的受试者。
“变体”包括与参考实体显示出显著的结构同一性的实体，但与参考实体相比，相对于一个或多个化学部分的存在或水平而言，在结构上不同于参考实体。在许多实施例中，“变体”在功能上也与其参考实体不同。通常，特定实体是否被正确视为参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性程度。如本领域技术人员所将理解的，任何生物或化学参考实体均具有某些特征性结构元件。根据定义，“变体”是共有一个或多个此类特征结构与元件的不同的化学实体。仅举几例，小分子可以具有特征性核心结构元件(例如大环核心)和/或一个或多个特征性侧链部分，使得小分子的变体是共有核心结构元件和特征性侧链部分的变体，但在其它侧链部分和/或存在的键的类型(单相对双，E对Z等)方面是不同的；多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，所述多个氨基酸具有线性空间或三维空间中相对于彼此的指定位置和/或有助于特定的生物功能；核酸可以具有特征性序列元件，所述特征性序列元件由具有线性空间或三维空间中相对于彼此的指定位置的多个核苷酸残基组成。例如，由于氨基酸序列的一个或多个差异和/或与多肽主链共价连接的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)的一个或多个差异，“变体多肽”可能与参考多肽不同。在一些实施例中，“变体多肽”显示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的整体序列同一性。可替换地或另外地，在一些实施例中，“变体多肽”不与参考多肽共有至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，“变体多肽”共有参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施例中，“变体多肽”缺少参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施例中，与参考多肽相比，“变体多肽”显示出一种或多种生物活性水平的降低。在许多实施例中，如果目标多肽具有与亲本相同的氨基酸序列但在特定位置有少量的序列改变，则目标多肽被认为是亲本或参考多肽的“变体”。通常，与亲本相比，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的残基被置换。在一些实施例中，与亲本相比，“变体”具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个置换残基。通常，“变体”具有非常少量(例如少于5、4、3、2或1个)的置换功能性残基(即参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，“变体”通常具有不超过5、4、3、2或1个的添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个残基，并且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲本或参考多肽是天然存在的多肽。如本领域普通技术人员所将理解的，目标特定多肽的多个变体通常可以在自然界中找到，特别是在目标多肽是传染性病原体(infectious agent)多肽的时候。
“载体”包括能够转运与之相关的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体能够在宿主细胞(例如真核和/或原核细胞)中进行染色体外复制和/或与其连接的核酸的表达。在本文中，能够指导可操作连接的基因的表达的载体被称为“表达载体”。
“野生型”包括具有在“正常”(与突变、患病、改变等相比)状态或环境下天然存在的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将会理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如等位基因)存在。
具体实施方式
本发明提供了具有C9ORF72基因座破坏的非人类动物。具体而言，本文所述的非人类动物具有C9ORF72基因座中整个编码序列的缺失，即缺失编码所有C9ORF72亚型的基因组区段(例如，外显子2的编码部分至亚型V1的外显子11的编码部分的缺失)。如本文所述的非人类动物表现出体重减轻和ALS样运动异常，例如运动非活动性(motor inactivity)和步态损伤。此外，本文所述的非人类动物在约八(8)周龄时表现出脾肿大和/或淋巴结肿大。此外，本文所述的非人类动物在约35周龄时表现出肾小球肾炎。因此，提供的非人类动物对于治疗和/或改善神经退行性疾病、障碍和病症以及(在一些实施例中)自身免疫性和/或炎性疾病、障碍和病症的治疗候选物的开发和鉴定尤其有用。具体而言，本文所述的非人类动物包括将报告基因引入内源性C9ORF72基因座，而使得该报告基因(即报告多肽)在非人类动物的神经和免疫系统中表达。这种转基因非人类动物提供了用于确定治疗候选物改善ALS和/或FTD的功效的细胞来源。此外，这种转基因非人类动物提供了用于开发治疗神经退行性、自身免疫和/或炎性疾病、障碍和病症的治疗剂的适用动物模型系统。
在一些实施例中，由于本文所述的非人类动物的细胞中不存在、缺乏C9ORF72(例如RNA、多肽等)或C9ORF72水平降低，因此非人类动物出现ALS和/或FTD样疾病。在一些实施例中，由于不存在、缺乏C9ORF72或者C9ORF72(例如，RNA，多肽等)水平降低，本文所述的非人类动物出现肾小球肾炎。在一些实施例中，本文所述的非人类动物具有本文所述的C9ORF72基因座的杂合性破坏。在一些实施例中，本文所述的非人类动物具有本文所述的C9ORF72基因座的纯合型破坏。在一些实施例中，如本文所述的非人类动物包含全部或部分报告基因，其中所述报告基因可操作地连接至C9ORF72启动子。在一些实施例中，C9ORF72启动子包括内源性C9ORF72启动子。
本发明提供了具有整体C9orf72去除的非人类动物系的全面表型分析以及C9orf72在免疫系统稳态中的独特作用的发现。本发明具体证实，C9orf72的完全去除导致步态异常并显示后肢无力，这表明可能在约40周龄时开始出现下运动神经元病况。如本文所述，C9orf72-/-非人类动物表所现出的免疫表型由髓室和淋巴室的选择性扩增构成，其中T细胞活化增加并且浆细胞升高。嗜中性粒细胞和单核细胞在扩增的免疫器官中发生混合浸润，但没有消除基本结构。C9orf72-/-非人类动物表现出血清细胞扩张因子(例如IL-12)升高和与髓样上调(myeloid upregulation)一致的组织RNA特征。在大部分的约35周龄的非人类动物中，存在伴有病理变化的肾脏疾病，例如基膜增厚和管型形成。在微观水平上，肾小球被IgG和IgM抗体和补体C3加重染色为一定的图案，这显示免疫复合物沉积。本文还描述道，C9orf72-/-非人类动物表现出高滴度的自身抗体(包括抗RF、ANA、抗-Sm和抗心磷脂)，这表明C9orf72表达的丧失极大地破坏了免疫稳态。在野生型或C9orf72+/-(杂合型)非人类动物中没有观察到免疫相关表型特征。因此，本发明尤其提供了用于开发新疗法和/或鉴定治疗各种疾病、障碍或病症的新治疗靶点的改进体内系统，这是通过使用已建立的体内系统所无法实现的，部分地是因为这种已建立的系统中不存在特定的表型。
在下面的章节中详细地描述了本发明的各个方面。章节的使用不意在限制本发明。每个章节可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，“或”的使用是指“和/或”，除非另有说明。
C9ORF72
肌萎缩侧索硬化症(ALS，也称为葛雷克氏症)是最常见的成人发作性麻痹症，其特征在于上和/或下运动神经元的丧失。在美国，多达20000人发生ALS，每年发生约5000例新病例。额颞痴呆(FTD)，最初在医生Arnold Pick之后被称为Pick病，是由大脑的额叶或颞叶的进行性细胞变性引起的一组疾病。据报道，FTD占所有痴呆病例的10-15％。C9ORF72的两个非编码外显子之间的GGGGCC六核苷酸重复扩增已经与ALS和FTD相关联(DeJesus-Hernandez,M.等人，2011，Neuron 72:245-256；Renton,A.E.等人，2011，Neuron 72:257-268；Majounie,E.等人，2012，Lancet Neurol.11:323-330；Waite,A.J.等人，2014，Neurobiol.Aging 35:1779.e5-1779.e13)。然而，无论是通过毒性的功能丧失还是功能获得，这种重复突变导致疾病的机制仍不清楚。例如，通过靶向减少或基因敲除而使C9ORF72表达减弱的斑马鱼表现出轴索病和运动机能缺陷(Ciura,S.等人，2013，Ann.Neurol.74(42):180-187)，而C9ORF72表达减弱的小鼠不显示出与ALS疾病相关的任何行为或病理学特征(Lagier-Tourenne,C.等人，2013，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.E4530-E4539)。此外，已经产生的包含66个C9ORF72重复扩增的基因敲入小鼠在其神经元中表现出RNA病灶和二肽蛋白聚集体。这些小鼠显示出皮质神经元丧失，并且在6月龄时表现出行为和运动缺陷(Chew,J等人，2015，Science May 14.Pii:aaa9344)。
已经有与C9ORF72中GGGGCC六核苷酸重复扩增有关的许多病理学方面的报道，例如RNA病灶的重复长度依赖性形成，特异性RNA结合蛋白的隔离(sequestration)以及二肽重复蛋白的积累和聚集(例如，参阅Stepto,
A.等人，2014，Acta Neuropathol.127:377-389；另参见Almeida,S.等人2013，Acta Neuropathol.126:385-399；Bieniek,K.F.等人2014,JAMANeurol.71(6):775–781；van Blitterswijk,M.等人，2014，Mol.Neurodegen.9:38，10页)。虽然已经报道了C9ORF72调控内体运输(Farg,M.A等人，2014，Human Mol.Gen.23(13):3579-3595)，但是C9ORF72的许多细胞功能仍然是未知的。事实上，C9ORF72是编码具有未知功能的未表征蛋白的基因。尽管关于C9ORF72了解甚少，但已经开发了用于ALS和/或FTD的几种动物模型，包括工程细胞系(Roberson,E.D.，2012，Ann.Neurol.72(6):837-849；Panda,S.K.等人，2013，Genetics195:703-715；Suzuki,N.等人，2013，Nature Neurosci.16(12):1725-1728；Xu,Z.等人，2013，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.110(19):7778-7783；Hukema,R.K.等人，2014，ActaNeuropathol.Comm.2:166,4页)。例如，通过基因敲除小鼠计划(Knockout Mouse Project)的努力，已经制备了插入有替代C9orf72(311004O21Rik)的外显子2-6的lacZ基因的转基因小鼠(参见Suzuki,N.等人，2013，supra的图1d；关于KOMP，参见Skarnes,W.C.等人，2011，Nature 474(7351):337-342)。在这些小鼠的脾、脑、脊髓、睾丸和生发中心观察到X-gal染色，但在肌肉(胫骨前肌)、心脏、肺、肝和肾中未观察到。然而，尚不清楚剩余的未缺失外显子(即7-11)是否产生任何表达而发挥作用。在另一篇报道中，使用含有80个GGGGCC重复序列的转基因小鼠品系，所述GGGGCC重复序列与由四环素反应元件控制的荧光报告基因可操作连接，而没有任何周围C9orf72序列，显示出与ALS-FTD患者中所见类似的神经元细胞质内含物，这表明重复扩增本身可能是导致疾病的原因(Hukema,R.K.等人，2014，ActaNeuropathol.Comm.2:166，4页)。这些小鼠已用于在CNS细胞中建立起始的C9orf72表达谱，并且提供对与重复扩增有关的作用机制的一些理解；然而，这些小鼠中的这些构建体的特定设计是否表明可确信地归因于C9orf72的特定功能或者是由于与C9orf72功能无关的其它因素而导致仍不清楚。
然而，在一些情况下，构建体设计可以影响所得转基因动物的表型(参见：例如Muller,U.，1999，Mech.Develop.81:3-21)。由于如上所述具有C9orf72破坏的小鼠使用了具有启动子驱动型选择基因盒的靶向载体(参见Suzuki,N.等人，2013的图1d，同上；Skarnes,WC等人，2011，同上)，因此不清楚所显示的表达模式是否与正常的C9ORF72表达正确相关。事实上，由与选择基因盒相关的启动子或C9ORF72启动子自身驱动的剩余外显子7-11的表达尚未确定。因此，在这些小鼠中观察到的表型以及可能通过lacZ的C9ORF72表达可由于靶向载体的方面而被修改或以其它方式偏离(skewed)。此外，含有可诱导的GGGGCC重复序列的转基因小鼠品系(Hukema，2014，同上)被设计为不含人类侧翼序列，这可能是由于这种周围序列被认为影响重复序列的转译。因此，这种用于治疗应用的采用C9ORF72介导型生物学技术的体内系统是不完善的。
如本文所述，本发明具体描述了用于ALS和/或FTD的非人类动物模型，所述非人类动物包含C9ORF72基因座的破坏。具体而言，本发明具体描述了用于ALS和/或FTD的啮齿动物模型，其中该啮齿动物包含通过插入lacZ报告基因而缺失C9orf72基因的所有C9orf72亚型(例如，外显子2的编码部分至V1的外显子11的编码部分)的整个编码序列。本发明人采用的靶向载体被设计为含有自缺失药物选择基因盒(参见：例如美国专利号8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有的这些文献通过引用并入本文)，这允许以发育依赖性(development-dependent)的方式除去药物选择基因盒，从而消除启动子影响或剩余外显子的异常表达或来自选择基因盒自身的影响的任何可能性。如本文所述，本发明人实现了C9orf72的完全去除。此外，本发明人在同一时期内采用旋转棒、旷场和CatWalk测定测量了这些啮齿动物直至60周龄的运动行为和神经功能缺陷。不希望受任何特定理论的约束，本发明表明，在过去的60周龄中仅有40％的C9orf72敲除啮齿动物存活，并且这些啮齿动物在40周龄时开始停止增加体重。尽管旋转棒测试没有显示由于C9orf72缺失引起的显著变化，但本文描述的啮齿动物在约50周龄时表现出显著的后肢轻瘫、运动损伤、运动性下降和步态异常。此外，本发明具体证明，鼠科动物C9orf72的遗传沉默导致多种运动和神经异常，与人类运动神经元疾病中所发现的类似。因此，至少在一些实施例中，本文所述的啮齿动物提供了用于开发治疗神经退行性疾病(例如ALS和/或FTD)的治疗候选物的改进体内系统。此外，本文所述的啮齿动物克服了用于开发C9orf72靶向疗法的具有不理想的C9orf72缺失特征的现有动物模型中存在的缺陷。
C9ORF72序列
小鼠C9ORF72转录变异体在本领域已有报道(例如：Koppers et al.,Ann Neurol(2015)；78:426-438；Atkinson et al.,Acta Neuropathologica Communications(2015)3:59)，并在图1A中显示。三种已报道的小鼠C9ORF72转录变异体的基因组信息也可以在Ensembl网站通过指定名ENSMUST00000108127(V1)、ENSMUST00000108126(V2)和ENSMUST00000084724(V3)获得。表1中列出了示例性的非人(例如啮齿动物)C9ORF72的mRNA和氨基酸序列。对于mRNA序列，括号内的粗体字表示编码序列和连续的外显子，通过交替的小写和大写字母区分(如果指出的话)。对于氨基酸序列，成熟多肽序列以粗体字体显示(如果指出的话)。
本领域已知人C9ORF72转录变异体。一种人C9ORF72转录变异体在中央和3'编码区中缺少多个外显子，其3'末端外显子延伸到突变体3所使用的剪接位点之外(见下文)，使得相对于突变体3出现了一个新的3'非翻译区(UTR)。该突变体编码的多肽明显缩短，并且相对于其它两种变异体的编码产物，其编码产物的C末端氨基酸截然不同。该突变体的mRNA和氨基酸序列可在GenBank中找到，编号分别为NM_145005.6和NP_659442.2，并在此引用。与突变体3相比，第二种人C9ORF72转录突变体(2)在5'非翻译区(UTR)存在差异。该突变体的mRNA和氨基酸序列可在GenBank找到，编号分别为NM_018325.4和NP_060795.1，在此通过引用并入本文。第三种人C9ORF72转录突变体(3)在三种已报道的突变体中序列最长，并编码较长的同种型(isoform)。该突变体的mRNA和氨基酸序列可在GenBank找到，编号分别为NM_001256054.2和NP_001242983.1，在此通过引用并入本文。突变体2和3编码相同的蛋白质。
表1---------------------------------------------
Mus muscucus C9orf72mRNA(NM_001081343；SEQ ID NO:1)
gtgtccggggcggggcggtcccggggcggggcccggagcgggctgcggttgcggtccctgcgccggcggtgaaggcgcagcagcggcgagtggCTATTGCAAGCGTTCGGATAATGTGAGACCTGGAATGCAGTGAGACCTGGGATGCAGGG(ATGTCGACTATCTGCCCCCCACCATCTCCTGCTGTTGCCAAGACAGAGATTGCTTTAAGTGGTGAATCACCCTTGTTGGCGGCTACCTTTGCTTACTGGGATAATATTCTTGGTCCTAGAGTAAGGCATATTTGGGCTCCAAAGACAGACCAAGTGCTTCTCAGTGATGGAGAAATAACTTTTCTTGCCAACCACACTCTAAATGGAGAAATTCTTCGAAATGCAGAGAGTGGGGCTATAGATGTAAAATTTTTTGTCTTATCTGAAAAAGGGGTAATTATTGTTTCATTAATCTTCGACGGAAACTGGAATGGAGATCGGAGCACTTATGGACTATCAATTATACTGCCGCAGACAGAGCTGAGCTTCTACCTCCCACTTCACAGAGTGTGTGTTGACAGGCTAACACACATTATTCGAAAAGGAAGAATATGGATGCATAAGgaaagacaagaaaatgtccagaaaattgtcttggaaggcacagagaggatggaagatcagGGTCAGAGTATCATTCCCATGCTTACTGGGGAAGTCATTCCTGTAATGGAGCTGCTTGCATCTATGAAATCCCACAGTGTTCCTGAAGACATTGATatagctgatacagtgctcaatgatgatgacattggtgacagctgtcacgaaggctttcttctcaaTGCCATCAGCTCACACCTGCAGACCTGTGGCTGTTCCGTTGTAGTTGGCAGCAGTGCAGAGAAAGTAAATAAGatagtaagaacgctgtgcctttttctgacaccagcagagaggaaatgctccaggctgtgtgaagcagaatcgtcctttaagtacgaatcgggactctttgtgcaaggcttgctaaagGATGCAACAGGCAGTTTTGTCCTACCCTTCCGGCAAGTTATGTATGCCCCGTACCCCACCACGCACATTGATGTGGATGTCAACACTGTCAAGCAGATGCCACCGTGTCATGAACATATTTATAATCAACGCAGATACATGAGGTCAGAGCTGACAGCCTTCTGGAGGGCAACTTCAGAAGAGGACATGGCGCAGGACACCATCATCTACACAGATGAGAGCTTCACTCCTGATTTgaatattttccaagatgtcttacacagagacactctagtgaaagccttcctggatcagGTCTTCCATTTGAAGCCTGGCCTGTCTCTCAGGAGTACTTTCCTTGCACAGTTCCTCCTCATTCTTCACAGAAAAGCCTTGACACTAATCAAGTACATCGAGGATGATACgcagaaggggaaaaagccctttaagtctcttcggaacctgaagatagatcttgatttaacagcagagggcgatcttaacataataatggctctagctgagaaaattaagccaggcctacactctttcatctttgggagacctttctacactagtgtacaagaacgtgatgttctaatgaccttttga)ccgtgtggtttgctgtgtctgtctcttcacagtcacacctgctgttacagtgtctcagcagtgtgtgggcacatccttcctcccgagtcctgctgcaggacagggtacactacacttgtcagtagaagtctgtacctgatgtcaggtgcatcgttacagtgaatgactcttcctagaatagatgtactcttttagggccttatgtttacaattatcctaagtactattgctgtcttttaaagatatgaatgatggaatatacacttgaccataactgctgattggttttttgttttgttttgtttgttttcttggaaacttatgattcctggtttacatgtaccacactgaaaccctcgttagctttacagataaagtgtgagttgacttcctgcccctctgtgttctgtggtatgtccgattacttctgccacagctaaacattagagcatttaaagtttgcagttcctcagaaaggaacttagtctgactacagattagttcttgagagaagacactgatagggcagagctgtaggtgaaatcagttgttagcccttcctttatagacgtagtccttcagattcggtctgtacagaaatgccgaggggtcatgcatgggccctgagtatcgtgacctgtgacaagttttttgttggtttattgtagttctgtcaaagaaagtggcatttgtttttataattgttgccaacttttaaggttaattttcattatttttgagccgaattaaaatgcgcacctcctgtgcctttcccaatcttggaaaatataatttcttggcagagggtcagatttcagggcccagtcactttcatctgaccaccctttgcacggctgccgtgtgcctggcttagattagaagtccttgttaagtatgtcagagtacattcgctgataagatctttgaagagcagggaagcgtcttgcctctttcctttggtttctgcctgtactctggtgtttcccgtgtcacctgcatcataggaacagcagagaaatctgacccagtgctatttttctaggtgctactatggcaaactcaagtggtctgtttctgttcctgtaacgttcgactatctcgctagctgtgaagtactgattagtggagttctgtgcaacagcagtgtaggagtatacacaaacacaaatatgtgtttctatttaaaactgtggacttagcataaaaagggagaatatatttattttttacaaaagggataaaaatgggccccgttcctcacccaccagatttagcgagaaaaagctttctattctgaaaggtcacggtggctttggcattacaaatcagaacaacacacactgaccatgatggcttgtgaactaactgcaaggcactccgtcatggtaagcgagtaggtcccacctcctagtgtgccgctcattgctttacacagtagaatcttatttgagtgctaattgttgtctttgctgctttactgtgttgttatagaaaatgtaagctgtacagtgaataagttattgaagcatgtgtaaacactgttatatatcttttctcctagatggggaattttgaataaaatacctttgaaattctgtgt
Mus muscucus C9orf72氨基酸(NM_001081343；SEQ ID NO:2)
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褐家鼠C9orf72mRNA(NM_001007702；SEQ ID NO:3)
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褐家鼠C9orf72氨基酸(NP_001007703；SEQ ID NO:4)
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C9ORF72靶向载体和C9ORF72基因座被破坏的非人类动物的培育
本文提供一种用于生产如本文所述的C9ORF72基因座被破坏的非人类动物的靶向载体或靶向构建体。
可用DNA序列来制备基因敲除动物(例如C9ORF72敲除)的靶向载体。通常，编码报告基因和/或选择标记的多核苷酸分子(例如插入核酸)被插入到载体中，优选DNA载体，以便在合适的宿主细胞中复制多核苷酸分子。
多核苷酸分子(或插入核酸)包含人们期望整合到靶基因座中的DNA片段。在一些实施例中，插入核酸包含一种或多种目标多核苷酸。在一些实施例中，插入核酸包含一个或多个表达盒。在一些实施例中，表达盒包含一个目标多核苷酸，该多核苷酸编码选择标记和/或报告基因，而在某些实施例中，还编码影响表达的各种调控元件。实际上，任何目标多核苷酸都可包含在插入核酸内，从而整合到目标基因座中。本文公开的方法将至少1、2、3、4、5、6或更多个目标多核苷酸整合到靶向C9ORF72基因座中。
在一些实施例中，包含在插入核酸中的目标多核苷酸编码报告分子。在一些实施例中，目标多核苷酸编码选择标记。
在一些实施例中，目的多核苷酸侧接于或包含位点特异性重组位点(例如loxP、Frt等)。在某些实施例中，位点特异性重组位点位于编码报告基因和/或编码选择标记的DNA片段的侧翼。本文描述了示例性的目的多核苷酸，包括可以包含在插入核酸内的选择标记和报告基因。
用作制备质粒的各种方法中，DNA构建体和/或靶向载体以及宿主生物体转化(transformation of host organisms)是本领域已知的。对于适用于原核细胞和真核细胞的其他表达系统，以及一般的重组方法，参见Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,ed.Sambrook，J.et al,Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989。
如上所述，表1列出了用于构建基因敲除动物的靶向载体的示例性非人类(例如啮齿动物)C9ORF72核酸和氨基酸序列。其他非人类C9ORF72序列可见于GenBank数据库。在一些实施例中，C9ORF72靶向载体包含编码报告基因和/或选择标记的DNA序列，侧接于与靶区域的侧翼序列(也称为“同源臂”)相同或基本同源的序列，以插入转基因非人类动物的基因组中。仅举一例，可在第一外显子、第一编码外显子或者第一或第二密码子的上游(5')设置敲除起始点，以允许插入核酸可操纵地连接至内源性调控序列(例如启动子)。图1A显示了靶向策略，用于制备鼠科C9orf72基因的整个编码序列的目标缺失，并替换成含有来自编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因和编码新霉素磷酸转移酶以选择G418抗性胚胎干(ES)细胞集落的药物选择盒(drug selection cassette)(Neo)的序列的盒。靶向载体还包括编码由ES细胞特异性miRNA或生殖细胞特异性启动子(例如鱼精蛋白1启动子；Prot-Cre-SV40)调节的重组酶(例如Cre)的序列。药物选择盒(drug selection cassette)和Cre重组酶编码序列的两侧是loxP(LP)重组酶识别位点，其能够以发育依赖(development-dependent)的方式进行药物选择框的Cre介导的切除，例如来源于生殖细胞中C9orf72基因被破坏的啮齿动物的后代在发育过程中脱落选择标记(Neo)(参见美国专利8,697,851、8,518,392、8,354,389、8,946,505和8,946,504，所有这些文献通过引用并入本文)。这使得选择盒能从分化的细胞或生殖细胞中自动切除。因此，在表型分析之前，药物选择盒被切除，仅留下可操纵连接至鼠C9orf72启动子(operably linked)的lacZ报告基因。
如本文所述，C9orf72基因座的破坏可包括用插入核酸置换或插入/添加至C9orf72基因座或其一部分。在一些实施例中，插入核酸包含报告基因。在一些某些实施例中，报告基因定位在与内源C9orf72启动子的可操纵连接(operable linkage)处。这样的修饰允许由内源性C9orf72启动子驱动的报告基因的表达。或者，报道基因不与内源C9orf72启动子可操纵连接。
多种报告基因(或可检测部分)可用于本文所述的靶向载体中。示例性的报告基因包括例如β-半乳糖苷酶(编码的lacZ基因)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、MmGFP、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、祖母绿(Emerald)、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、蓝宝石(Cerulean)、萤光素酶、碱性磷酸酶或其组合。本文所述的方法展示了使用编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的靶向载体的构建，然而，阅读本揭示内容的技术人员将理解，即使不使用报告基因或使用本领域已知的任何报告基因依然可培育本文所述的非人类动物。
适当时，编码全部或部分报告多肽的遗传物质或多核苷酸序列的编码区可被修饰，以囊括针对非人类动物中表达而优化的密码子(例如，参见美国专利5,670,356和5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或与全长多肽具有基本上相同活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施例中，编码全部或部分报告多肽(例如lacZ)的遗传物质的编码区可包含改变的序列，以优化特定细胞类型(例如啮齿动物细胞)的密码子使用(condon usage)。例如，待插入到非人类动物(例如啮齿动物)的基因组中的报告基因的密码子可以被优化，以在非人类动物的细胞中表达。这样的序列可被描述为密码子优化的序列。
提供了制备如本文所述的包含被破坏的C9ORF72基因座的非人类动物的组合物和方法，包括用于制备表达来自C9ORF72启动子和C9ORF72调控序列的报告基因的非人类动物的组合物和方法。在一些实施例中，还提供了用于制备表达来源于内源启动子和内源调控序列的报告基因的非人类动物的组合物和方法。这些方法包括将如本文所述的编码报告基因(例如lacZ)的靶向载体插入到非人类动物的基因组中，从而全部或部分删除C9ORF72基因座的完整编码序列。在一些实施例中，方法包括将靶向载体插入到非人类动物的基因组中，使得C9ORF72基因座处的所有C9ORF72同种型的完整编码序列缺失。
与C9ORF72启动子(例如内源C9ORF72启动子)可操纵地连接的报告基因的插入采用相对最小的基因组修饰使得报告多肽以C9ORF72特异性方式在非人类动物中表达。在一些实施例中，本文所述的非人类动物含有如本文所述的包含靶向载体的C9ORF72基因座。
如Frendewey,D.,et al.,2010,Methods Enzymol.476：295-307.中所述，本文所述的靶向载体可被导入到ES细胞中，并筛选C9orf72基因座被破坏的ES克隆。可在本文公开的方法和组合物中使用多种宿主胚胎。例如，具有靶向遗传修饰的多能和/或全能细胞可被导入到来自相应生物体的桑葚胚前期胚胎(例如8细胞期胚胎)。参见文献如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008/0078000 A1，其全部通过引用并入本文。在其他情况下，供体ES细胞可以在2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期或64细胞期植入到宿主胚胎中。宿主胚胎也可以是囊胚，或者囊胚前期胚胎、桑葚胚前期胚胎、桑葚胚期胚胎、未紧密化的桑葚胚期胚胎或紧密化的桑葚胚期胚胎。
在一些实施例中，方法(Poueymirou,W.T.et al.,2007,Nat.Biotechnol.25:91-99)可用于将阳性ES细胞注射入8细胞胚胎，以培育完全ES细胞来源的F0代杂合子小鼠进行lacZ表达谱分析或繁育纯合子。实施例1提供了用于培育C9orf72基因座被破坏的非人类动物的示例性方法。
培育转基因非人类动物(包括敲除和敲入)的方法在本领域中为公知技术(参见例如Gene Targeting:APractical Approach,Joyner,ed.,Oxford University Press,Inc.(2000))。例如，转基因啮齿类动物的产生可能涉及破坏内源性啮齿动物基因的基因座，或者将报告基因导入啮齿动物基因组中，在一些实施例中，导入到与内源性啮齿动物基因相同的位点。
图1A是小鼠C9orf72的基因组组织的示意图(未按比例)。图1A还提供了使用报告基因删除鼠C9orf72基因座完整编码序列的示例性靶向策略。如图所示，含有鼠C9orf72基因座外显子2编码部分至外显子11的基因组DNA被敲除，并被报告基因和药物选择盒取代，所述药物选择框侧接了特异性重组酶识别位点。该策略所用的靶向载体包括与受发育调控的启动子可操纵性连接的重组酶编码序列，使得重组酶在未分化的细胞中表达。表2中列出了可囊括于本文所述的靶向载体中的示例性启动子。可用于本文所述靶向载体中的合适启动子还包括在美国专利号8,697,851、8,518,392和8,354,389中描述的那些，所有这些通过引用并入本文)。同源重组后，内源性鼠C9orf72基因座的整个编码序列(例如，从外显子2编码部分至外显子11编码部分)被包含在靶向载体中的序列取代。药物选择盒以发育依赖的方式被去除，即生殖细胞系C9orf72基因座被破坏的小鼠的子代的选择标记将在发育期间从分化的细胞中脱落(参见美国专利8,697,851、8,518,392和8,354,389，其全部通过引用并入本文)。
表2
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Prot启动子(SEQ ID NO:5)
CCAGTAGCAGCACCCACGTCCACCTTCTGTCTAGTAATGTCCAACACCTCCCTCAGTCCAAACACTGCTCTGCATCCATGTGGCTCCCATTTATACCTGAAGCACTTGATGGGGCCTCAATGTTTTACTAGAGCCCACCCCCCTGCAACTCTGAGACCCTCTGGATTTGTCTGTCAGTGCCTCACTGGGGCGTTGGATAATTTCTTAAAAGGTCAAGTTCCCTCAGCAGCATTCTCTGAGCAGTCTGAAGATGTGTGCTTTTCACAGTTCAAATCCATGTGGCTGTTTCACCCACCTGCCTGGCCTTGGGTTATCTATCAGGACCTAGCCTAGAAGCAGGTGTGTGGCACTTAACACCTAAGCTGAGTGACTAACTGAACACTCAAGTGGATGCCATCTTTGTCACTTCTTGACTGTGACACAAGCAACTCCTGATGCCAAAGCCCTGCCCACCCCTCTCATGCCCATATTTGGACATGGTACAGGTCCTCACTGGCCATGGTCTGTGAGGTCCTGGTCCTCTTTGACTTCATAATTCCTAGGGGCCACTAGTATCTATAAGAGGAAGAGGGTGCTGGCTCCCAGGCCACAGCCCACAAAATTCCACCTGCTCACAGGTTGGCTGGCTCGACCCAGGTGGTGTCCCCTGCTCTGAGCCAGCTCCCGGCCAAGCCAGCACC
Blimp1启动子1kb(SEQ ID NO:6)
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Blimp1启动子2kb(SEQ ID NO:7)
GTGGTGCTGACTCAGCATCGGTTAATAAACCCTCTGCAGGAGGCTGGATTTCTTTTGTTTAATTATCACTTGGACCTTTCTGAGAACTCTTAAGAATTGTTCATTCGGGTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTGGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTTGGAGACAGGGTTTCTCTGTATATAGCCCTGGCACAAGAGCAAGCTAACAGCCTGTTTCTTCTTGGTGCTAGCGCCCCCTCTGGCAGAAAATGAAATAACAGGTGGACCTACAACCCCCCCCCCCCCCCCCAGTGTATTCTACTCTTGTCCCCGGTATAAATTTGATTGTTCCGAACTACATAAATTGTAGAAGGATTTTTTAGATGCACATATCATTTTCTGTGATACCTTCCACACACCCCTCCCCCCCAAAAAAATTTTTCTGGGAAAGTTTCTTGAAAGGAAAACAGAAGAACAAGCCTGTCTTTATGATTGAGTTGGGCTTTTGTTTTGCTGTGTTTCATTTCTTCCTGTAAACAAATACTCAAATGTCCACTTCATTGTATGACTAAGTTGGTATCATTAGGTTGGGTCTGGGTGTGTGAATGTGGGTGTGGATCTGGATGTGGGTGGGTGTGTATGCCCCGTGTGTTTAGAATACTAGAAAAGATACCACATCGTAAACTTTTGGGAGAGATGATTTTTAAAAATGGGGGTGGGGGTGAGGGGAACCTGCGATGAGGCAAGCAAGATAAGGGGAAGACTTGAGTTTCTGTGATCTAAAAAGTCGCTGTGATGGGATGCTGGCTATAAATGGGCCCTTAGCAGCATTGTTTCTGTGAATTGGAGGATCCCTGCTGAAGGCAAAAGACCATTGAAGGAAGTACCGCATCTGGTTTGTTTTGTAATGAGAAGCAGGAATGCAAGGTCCACGCTCTTAATAATAAACAAACAGGACATTGTATGCCATCATCACAGGATGTCCTTCCTTCTCCAGAAGACAGACTGGGGCTGAAGGAAAAGCCGGCCAGGCTCAGAACGAGCCCCACTAATTACTGCCTCCAACAGCTTTCCACTCACTGCCCCCAGCCCAACATCCCCTTTTTAACTGGGAAGCATTCCTACTCTCCATTGTACGCACACGCTCGGAAGCCTGGCTGTGGGTTTGGGCATGAGAGGCAGGGACAACAAAACCAGTATATATGATTATAACTTTTTCCTGTTTCCCTATTTCCAAATGGTCGAAAGGAGGAAGTTAGGTCTACCTAAGCTGAATGTATTCAGTTAGCAGGAGAAATGAAATCCTATACGTTTAATACTAGAGGAGAACCGCCTTAGAATATTTATTTCATTGGCAATGACTCCAGGACTACACAGCGAAATTGTATTGCATGTGCTGCCAAAATACTTTAGCTCTTTCCTTCGAAGTACGTCGGATCCTGTAATTGAGACACCGAGTTTAGGTGACTAGGGTTTTCTTTTGAGGAGGAGTCCCCCACCCCGCCCCGCTCTGCCGCGACAGGAAGCTAGCGATCCGGAGGACTTAGAATACAATCGTAGTGTGGGTAAACATGGAGGGCAAGCGCCTGCAAAGGGAAGTAAGAAGATTCCCAGTCCTTGTTGAAATCCATTTGCAAACAGAGGAAGCTGCCGCGGGTCGCAGTCGGTGGGGGGAAGCCCTGAACCCCACGCTGCACGGCTGGGCTGGCCAGGTGCGGCCACGCCCCCATCGCGGCGGCTGGTAGGAGTGAATCAGACCGTCAGTATTGGTAAAGAAGTCTGCGGCAGGGCAGGGAGGGGGAAGAGTAGTCAGTCGCTCGCTCACTCGCTCGCTCGCACAGACACTGCTGCAGTGACACTCGGCCCTCCAGTGTCGCGGAGACGCAAGAGCAGCGCGCAGCACCTGTCCGCCCGGAGCGAGCCCGGCCCGCGGCCGTAGAAAAGGAGGGACCGCCGAGGTGCGCGTCAGTACTGCTCAGCCCGGCAGGGACGCGGGAGGATGTGGACTGGGTGGAC
基于非人类动物基因组中存在报告基因(或C9ORF72缺失)和/或在其组织或细胞中表达报告基因(或缺乏C9ORF72表达)来鉴定转基因非人类动物。然后可以用转基因非人类动物繁殖更多携带报告基因的非人类动物，从而培育出一系列携带一个或多个本文所述的C9ORF72基因座拷贝的非人类动物。
还可培育包含可调控或定向表达转基因的选定系统(selected systems)的转基因非人类动物。示例性的系统包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如Lakso,M.etal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6232-6236)和酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP/Frt重组酶系统(O'Gorman,S.et al,1991,Science 251:1351-1355)。可以通过构建“双”转基因动物来培育这样的动物，例如通过两个转基因动物交配，一个转基因动物包含编码一种选定的多肽的转基因(例如报告基因)，另一个包含编码重组酶的转基因(例如Cre重组酶)。
尽管在本文中广泛讨论了C9ORF72基因座被破坏的小鼠(例如，整个C9orf72编码序列缺失的小鼠)的实施例，但也提供了包含被破坏的C9ORF72基因座的其他非人类动物的例子。在一些实施例中，此类非人类动物的C9ORF72基因座被破坏，破坏特征在于可操纵地连接至内源C9ORF72启动子的报告分子的插入。这些非人类动物包括任何可被遗传修饰以敲除C9ORF72基因座的整个编码序列的动物，例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、恒河猴)等。又如，对于那些不容易获得适合的可遗传修饰的ES细胞的非人类动物，可用其他方法来获得包含遗传修饰的非人类动物。这些方法包括，例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导多能细胞)，并使用体细胞核转移(SCNT)将遗传修饰的基因组转移至合适的细胞(例如去核的卵母细胞)，在合适的条件下在非人类动物中孕育修饰的细胞(例如修饰的卵母细胞)以形成胚胎。
简而言之，核移植包括以下步骤：(1)卵母细胞去核；(2)分离供体细胞或将与去核卵母细胞结合的细胞核；(3)将该细胞或细胞核植入去核卵母细胞以形成重组细胞；(4)将重组细胞植入动物的子宫中以形成胚胎；和(5)让胚胎发育。在这些方法中，卵母细胞通常从死亡的动物中取出，尽管它们也可以从活的动物的输卵管和/或卵巢分离。在去核之前，卵母细胞可以在本领域技术人员已知的各种培养基中培养成熟。卵母细胞的去核可以通过本领域技术人员已知的各种方式进行。通常在融合之前将供体细胞显微注射到透明带，以此将供体细胞或细胞核插入去核卵母细胞来形成重组细胞。融合可以通过在接触/融合平面上施加DC电脉冲(电融合)，通过将细胞暴露于促融合化学物质(如聚乙二醇)，或通过灭活病毒(如仙台病毒)来实现。在核供体和受体卵母细胞融合之前、期间和/或之后，重组细胞通常通过电和/或非电手段活化。激活方法包括电脉冲、化学诱导的休克、精子穿透、增加卵母细胞中二价阳离子水平，以及减少卵母细胞的细胞蛋白磷酸化(通过激酶抑制剂)。通常在本领域技术人员已知的培养基中培养活化重组细胞或胚胎，然后转移到动物的子宫中。参见如美国专利申请2008-0092249A1、WO1999/005266A2，美国专利申请2004-0177390A1、WO2008/017234A1和美国专利7,612,250，其均通过引用并入本文。
用于修饰非人类动物(例如猪、牛、啮齿动物、鸡等)基因组的方法包括，例如使用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)来修饰基因组，使得如本文所述其C9ORF72基因座被破坏。
在一些实施例中，本文所述的非人类动物是哺乳动物。在一些实施例中，本文所述的非人类动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科(Dipodoidea or Muroidea)。在一些实施例中，本文描述的基因修饰动物是啮齿动物。在一些实施例中，本文所述的啮齿类动物选自小鼠，大鼠和仓鼠。在一些实施例中，本文所述的啮齿动物来自鼠总科(Muroidea)。在一些实施例中，本文描述的基因修饰动物选自丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如鼠类仓鼠(mouse-like hamster))、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠(New Worldrats and mice)、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠(true mice and rats)、沙鼠、棘鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀援小鼠(climbing mice)、岩鼠(rock mice)、带尾大鼠(with-tailed rats)、马达加斯加大鼠和小鼠(Malagasy rats and mice))、帚尾鼠科(Platacanthomyidae)(例如带刺榛睡鼠(spiny dormice)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在某些实施例中，本文所述的遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠和大鼠(true mice and rats)(鼠总科(Muroidea))、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在某些实施例中，本文所述的基因修饰小鼠来自鼠科。在一些实施例中，本文所述的非人类动物是啮齿动物。在某些实施例中，本文所述的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施例中，本文所述的非人类动物是小鼠。
在一些实施例中，本文所述的非人类动物是啮齿动物，为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系小鼠。在某些实施例中，本文所述的小鼠为129系，选自由129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SIV1m)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing et al.,1999,Mammalian Genome 10:836；Auerbach,W.et al.,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032)构成的组。在某些实施例中，本文所述的基因修饰的小鼠是前述129品系和C57BL/6品系的混合。在某些实施例中，本文所述的小鼠是上述129品系的混合，或上述BL/6品系的混合。在某些实施例中，如本文所述的混合129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施例中，本文所述的小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，本文所述的小鼠是BALB品系与另一种上述品系的混合。
在一些实施例中，本文所述的非人类动物是大鼠。在某些实施例中，本文描述的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley(SD)品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠(Dark Agouti，DA)。在某些实施例中，如本文所述的大鼠品系是选自Wistar、LEA、SD、Fischer、F344、F6和DA中的两种或更多种品系的混合。
大鼠多能和/或全能细胞可以来自任何大鼠品系，包括例如ACI、DA、Wistar、LEA、SD或Fischer大鼠品系(如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠多能干细胞和/或全能细胞也可以从上述两种或更多种品系的混合品种中获得。例如，大鼠多能和/或全能细胞可以来自DA或ACI品系。ACI大鼠品系的特征是具有黑刺，腹部和脚部为白色，RT1av1单体型。这些品系可以从各种来源获得，包括Harlan实验室。来自ACI大鼠的大鼠ES细胞系的实例是ACI.G1大鼠ES细胞。黑暗刺鼠(DA)大鼠品系的特点是外覆有刺，并具有RT1av1单体型。这样的大鼠可以从多种来源获得，包括Charles River和Harlan实验室。来自DA大鼠的大鼠ES细胞系的例子是DA.2B大鼠ES细胞系和DA.2C大鼠ES细胞系。在一些情况下，大鼠多能干细胞和/或全能细胞来自近交大鼠品系。参见例如2014年2月20日提交的U.S2014/0235933A1，其全部内容通过引用并入本文。
本文提供了C9ORF72基因座被破坏的非人类动物。在一些实施例中，C9ORF72基因座的破坏导致功能丧失。特别地，功能缺失突变包括导致C9ORF72表达降低或缺乏和/或C9ORF72活性/功能降低或缺乏的突变。在一些实施例中，功能丧失突变导致如本文所述的一种或多种表型。可以直接测量C9ORF72的表达，例如通过测定如本文所述的非人类动物的细胞或组织中的C9ORF72水平。
通常，如果C9ORF72的表达水平和/或活性水平显著低于在合适的对照细胞或不包含相同破坏(例如敲除)的非人类动物中的C9ORF72的水平(p≤0.05)，则C9ORF72表达水平和/或活性降低。在一些实施例中，相对于缺乏相同破坏(例如敲除)的对照细胞或非人类动物，C9ORF72的浓度和/或活性降低了至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在其他实施例中，使用包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析等方法来选择因C9ORF72基因座被破坏而C9ORF72表达水平和/或活性降低的细胞或生物。然后将这种细胞或非人类动物用于本文所述的各种方法和组合中。
在一些实施例中，内源性C9ORF72基因座没有被删除(即完整)。在一些实施例中，内源性C9ORF72基因座被异源序列(例如报告基因编码序列)改变、破坏、敲除或置换。在一些实施例中，全部或基本上全部的内源性C9ORF72基因座被插入核酸置换；在一些实施例中，置换包括用lacZ报告基因替代内源性C9ORF72基因座的完整编码序列，使得lacZ报告基因与C9ORF72启动子(例如内源性C9ORF72启动子)可操纵性地连接。在一些实施例中，将报告基因的一部分(例如其功能片段)插入到内源性非人类C9ORF72基因座中。在一些实施例中，报告基因是lacZ基因。在一些实施例中，将报告基因插入内源性C9ORF72基因座的两个拷贝之一中，培育出相对于报告基因而言杂合的非人类动物。在一些实施例中提供了相对于报告基因纯合的非人类动物。
采用C9ORF72基因座被破坏的的非人类动物的方法
如本文所述的非人类动物提供改善的神经退行性疾病、障碍和病症动物模型。具体而言，如本文所述的非人类动物提供了改善的模拟人类疾病动物模型，例如ALS和/或FTD这类以上运动神经元症状和/或非运动神经元丢失为特征的疾病。
例如，如本文所述的C9ORF72基因座的破坏可能导致本文提供的非人类动物的各种症状(或表型)。在一些实施例中，C9ORF72基因座的缺失导致在出生时非常正常的非人类动物，但是在成长后，例如约8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、48周、49周、50周、51周、52周、53周、54周、55周、56周、57周、58周、59周、60周等，出现ALS样症状。在一些实施例中，C9ORF72基因座的敲除导致一种或多种细胞类型(例如神经元和/或其一部分)功能异常。神经元包括感觉神经元或运动神经元。与ALS和/或FTD相关的其他表型可以存在于本文所述的非人类动物中。例如，ALS样表型可能涉及一个或多个神经元，例如运动神经元和/或感觉神经元的损伤。此外，涉及上运动神经元的ALS样表型可能导致痉挛状态(例如痉挛性瘫痪、僵直)、反射增加和/或反射异常(例如巴宾斯基征)、震颤及其组合。涉及下运动神经元受损的ALS样表型可能导致肌无力和消瘦、束颤，及其组合，和/或致使无法吞咽和舌头束颤的延髓损害。类ALS症状还可以包括一种或多种以下表型：a)后凸畸形；b)不正常的后肢抱茎、拖拽或脚趾卷曲；c)运动协调性和运动学习能力不足，旋转棒、猫道和/或旷场试验表现不佳；d)脊髓中的运动神经元损失；e)脊髓中的星形细胞增生；f)与对照啮齿动物相比体重减轻；g)聚泛素化蛋白的聚集和/或(h)使用ALS-TDI神经学评分系统(表3)评估时得分增加。
表3
因此，在至少一些实施例中，本文所述的非人类动物提供改善的神经退行性疾病、障碍或病症(例如ALS和/或FTD)动物模型，并且可用于开发和/或鉴定用于治疗、预防和/或抑制神经退行性疾病、障碍或病症的一种或多种表型(或症状)的药物。在一些实施例中，本文所述的非人类动物中的一种或多种症状(或表型)在表3中列出。
如本文所述的非人类动物还提供一种体内系统，用于鉴定用以治疗、预防和/或抑制神经变退行性疾病、障碍或病症(例如ALS和/或FTD)的一种或多种症状的药物。在一些实施例中，药物的抑制作用通过给具有本文所述的C9ORF72破坏且在38周龄后出现神经退行性症状的非人类动物施用所述药物来测定其。
如本文所述的非人类动物还提供改善的炎症性或自身免疫性疾病、障碍和病症动物模型。具体而言，如本文所述的非人类动物提供了改善的模拟人类炎症疾病的动物模型，其特征为各种器官(例如肾、肝、脾等)中的免疫细胞浸润。另外，如本文所述的非人类动物提供改良的模拟人类自身免疫性疾病的动物模型，其特征为血清中自身抗体(例如IgG和IgM)增加。
例如，如本文所述的C9ORF72基因座的破坏可能导致本文提供的非人类动物的各种症状(或表型)。在一些实施例中，C9ORF72基因座的敲除导致在出生时非常正常的非人类动物，在成长后，例如约8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周周、46周、47周、48周、49周、50周、51周、52周、53周、54周、55周、56周、57周、58周、59周、60周等，出现炎症和/或自身免疫病症。一些实施例中，C9ORF72基因座的敲除导致一种或多种免疫细胞类型，例如浆细胞、单核细胞、粒细胞和/或巨噬细胞的浸润。与炎症和/或自身免疫病症相关的其他表型可以存在于本文所述的非人类动物中。例如，炎症或自身免疫病症可能涉及脾脏、淋巴结、肾脏和/或肝脏中的一种或多种的增大。此外，涉及血液的炎症或自身免疫病症可能导致自身抗体增加。涉及肝脏的炎症或自身免疫病症可能导致肝炎。
因此，在至少一些实施例中，如本文所述的非人类动物提供改善的炎症和/或自身免疫性疾病，障碍或病症动物模型，并且可用于开发和/或鉴定用于治疗、预防和/或抑制炎症和/或自身免疫疾病、障碍或病症的一种或多种表型(或症状)的药物。在一些实施例中，炎症和/或自身免疫性疾病、障碍或病症存在于本文所述的非人类动物的一个或多个器官或组织中。在某些实施例中，一种或多种器官或组织包括脾脏、肝脏、淋巴结、肾脏、骨髓和血液。
如本文所述的非人类动物还提供一种体内系统，用于鉴定用于治疗、预防和/或抑制炎症和/或自身免疫性疾病、障碍或病症的一种或多种症状的药物。在一些实施例中，对药物的抑制作用在体内检测，通过给本文所述的C9ORF72被破坏且8周龄后出现炎症和/或自身免疫性疾病、障碍或病症的非人类动物施用所述药物来检测。在各种实施例中，炎症和/或自身免疫性疾病、障碍或病症是或包含肾小球肾炎或肝炎。
非人类动物可以通过任何方便的途径给予待测试药物，例如通过全身注射、长期暴露用泵或直接脑内注射。这样的动物可作行为研究，通过与未接受药物的合适的非人类动物对照组相比，确定药物对非人类动物的行为例如运动行为的作用。还可以进行动物脊髓、肌肉和/或脑组织的活组织检查或解剖评估，和/或采集血液或CSP样本。
如本文所述的非人类动物提供了C9ORF72表达缺乏的改善的体内系统和生物材料来源(例如细胞)，其可用于多种试验。在各种实施例中，本文所述的非人类动物用于开发治疗、预防和/或抑制与C9ORF72表达缺乏和/或活性相关的一种或多种症状的药物。在各实施例中，本文所述的非人类动物用于鉴定、筛选和/或开发能结合C9ORF72的候选药物(例如，抗体、siRNA等)。在各实施例中，本文所述的非人类动物用于筛选和开发阻断C9ORF72活性的候选药物(例如，抗体、siRNA等)。在多个实施例中，本文所述的非人类动物用于确定如本文所述的非人类动物的C9ORF72多肽(或转录物)的拮抗剂和/或激动剂的结合特征。在一些实施例中，本文所述的非人类动物用于确定一种或多种结合C9ORF72的候选治疗性抗体的表位。
在多个实施方式中，使用本文所述的非人类动物来确定靶向C9ORF72的药物的药代动力学概况。在各实施例中，将本文所述的一种或多种非人类动物和一种或多种对照或参照的非人类动物分别以各种剂量(例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更多)暴露于一种或多种C9ORF72靶向的候选药物。候选治疗性抗体可以通过任何期望的施用途径给药，包括肠胃外和非肠胃外施用途径。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、透皮、肺部、直肠、口腔、阴道、眼部。还可以通过连续输注、局部施用、缓释植入物(凝胶、膜等)和/或静脉内注射施用。在不同的时间点(例如0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或至多30天)分离非人类动物(人源化和对照)的血液。使用从本文所述的非人类动物获得的样品可以进行各种测定(包括但不限于总IgG、抗治疗性抗体应答、凝集等)，以确定施用的C9ORF72靶向药物的药代动力学概况。
在多个实施方式中，由于细胞改变，如本文所述的非人类动物用于测定阻断、调节和/或抑制C9ORF72活性(或C9ORF72信号传导，或C9ORF72介导的相互作用)的治疗效果和基因表达的效果。在多个实施例中，将如本文所述的非人类动物或从其分离的细胞暴露于非人类动物的C9ORF72靶向药物，在随后的一段时间后，分析其对C9ORF72依赖的过程(或相互作用)的影响，例如内体运输、免疫稳态或运动神经元和/或非运动神经元功能。
如本文所述的来自非人类动物的细胞可以被分离并在特定情况下使用，或者在培养基中维持多代。在多个实施例中，来自如本文所述的非人类动物的细胞被永生化(例如，通过使用病毒)，并且始终维持在培养基中(例如连续培养)。
在多个实施例中，如本文所述的细胞和/或非人类动物用于各种免疫方案中，以确定对抗原的免疫应答(例如，B细胞应答)中C9ORF72介导的功能。在一些实施例中，结合或阻断C9ORF72的一种或多种功能的候选药物在本文所述的非人类动物被描述。合适的测量包括各种细胞测定、增殖测定、血清免疫球蛋白分析(例如抗体滴度)、细胞毒性测定、配体-受体相互作用的鉴定(例如免疫沉淀测定)和配体-配体相互作用的鉴定。在一些实施例中，本文所述的非人类动物用于描述C9ORF72介导的对抗原的免疫应答的调节功能。在一些实施例中，抗原与自身免疫性疾病、障碍或病症相关。在一些实施例中，抗原与炎性疾病、障碍或病症相关。在一些实施例中，抗原与感染源(例如细菌)结合。在一些实施例中，抗原是测试抗原(例如，卵清蛋白或OVA)。在一些实施例中，抗原是与一种或多种需要治疗的人类患者遭受的疾病或病症相关的靶标。
在各种实施例中，用一种或多种抗原对如本文所述的非人类动物进行攻毒，以确定化合物或生物制剂对调节免疫应答的C9ORF72-依赖性调控的治疗潜力，包括但不限于，对给定抗原的特异性B细胞依赖性应答。
如本文所述的非人类动物提供用于分析和测试药物或疫苗的体内系统。在各种实施例中，给本文所述的一种或多种非人类动物施用候选药物或疫苗，随后监测非人类动物以确定针对药物或疫苗产生的一种或多种免疫应答、药物或疫苗的安全性概况，或对疾病或病情和/或疾病或病情的一种或多种症状的效用。用于确定安全性概况的示例性方法包括检测毒性、最佳剂量浓度、药物或疫苗的效力以及可能的危险因素。这样的药物或疫苗可以在这样的非人类动物中得到改善和/或开发。
疫苗的效力可以以多种方式确定。简而言之，使用本领域已知的方法对本文所述的非人类动物进行疫苗接种，然后用疫苗攻毒或将疫苗给予已感染的非人类动物。非人类动物对疫苗的反应可以通过监测非人类动物(或从其中分离的细胞)和/或对其进行一种或多种试验来测定，来确定疫苗的效力。然后使用本领域已知和/或本文所述的一种或多种方法，将非人类动物对疫苗的反应与对照动物进行比较。
疫苗的效力可以进一步通过病毒中和试验来确定。简而言之，免疫本文所述的非人类动物，并在免疫后的不同天收集血清。连续稀释的血清与病毒孵育，在此期间血清中的病毒特异性抗体将与病毒结合。然后将病毒/血清混合物加入允许细胞，通过空斑试验或微量中和试验来确定感染性。如果血清中的抗体中和病毒，那么与对照组相比，斑块或相对萤光素酶活性单位较少。
本文所述的非人类动物提供用于评估药物(例如C9ORF72靶向药物)药代动力学性质和/或功效的体内系统。在各种实施例中，给予如本文所述的一种或多种非人类动物药物，接着监测非人类动物(或从其中分离的细胞)或对其进行一种或多种试验，以确定药物对非人类动物的作用。药代动力学性质包括但不限于动物如何将药物加工成各种代谢物(或检测一种或多种药物代谢物是否存在，包括但不限于毒性代谢物)、药物半衰期、给药后的药物循环水平(例如药物的血清浓度)、抗药物反应(例如抗药物抗体)、药物吸收和分配、给药途径、药物排泄和/或清除途径。在一些实施例中，药物(例如C9ORF72调节剂)的药代动力学和药效学性质在本文所述的非人类动物中或通过这些动物的使用来进行监测。
在一些实施例中，试验包括测定对施药的非人类动物的表型和/或基因型的影响。在一些实施例中，试验包括确定药物(例如C9ORF72调节剂，例如拮抗剂或激动剂)的批次间变异性。在一些实施例中，试验包括测定施用药物在本文所述的非人类动物和对照动物间的效果差异。在各种实施例中，对照非人类动物可以具有如本文所述的修饰，具有与本文所述修饰的不同修饰(例如，具有改变、破坏、删除、插入、修饰等或其他非功能性的C9ORF72基因座)或不修饰(即野生型非人类动物)。
可以在非人类动物(和/或使用从其中分离的细胞)中测量的用于评估药物的药代动力学性质的示例性参数包括但不限于凝集、自噬、细胞分裂、细胞死亡、补体介导的溶血、DNA完整性、药物特异性抗体滴度、药物代谢、基因表达阵列、代谢活性、线粒体活性、氧化应激、吞噬作用、蛋白质生物合成、蛋白质降解、蛋白质分泌、应激反应、靶组织药物浓度、非目标组织药物浓度、转录活性等。在各种实施例中，本文所述的非人类动物用于确定药物(例如C9ORF72靶向药物)的药学有效剂量。
实施例
以下实施例是为了向本领域普通技术人员描述构建和使用本发明的方法和组合的，而非限制发明的范围。除非另有说明，温度以摄氏度表示，压力为大气压或接近大气压。
实施例1.在非人类C9ORF72基因座中产生破坏
该实例阐述了啮齿动物C9orf72基因座的靶向破坏。特别地，该实例具体描述了利用与小鼠C9orf72启动子可操纵连接的lacZ报告基因构建体敲除小鼠C9orf72基因座的整个编码序列。用于破坏内源性小鼠C9orf72基因座的C9orf72-lacZ靶向载体采用如前所述的方法制备(参见例如美国专利No.6,586,251；Valenzuela et al.,2003,NatureBiotech.21(6):652-659；and Adams,N.C.and N.W.Gale,in Mammalian and AvianTransgenesis–New Approaches,ed.Lois,S.P.a.C.,Springer Verlag,BerlinHeidelberg,2006)。所得到的修饰C9orf72基因座在图1A底部的框中显示。
简而言之，使用细菌人工染色体(BAC)克隆构建靶向载体，该克隆来自小鼠RP23BAC文库(Adams,D.J.et al.,2005,Genomics 86:753-758)，将载体导入到F1杂合子(129S6SvEvTac/C57BL6NTac)胚胎干(ES)细胞，然后在含有G418的选择培养基中培养。在电穿孔后10天挑取抗药性菌落并如前所述筛选正确的靶向(Valenzuela et al.,supra；Frendewey,D.et al.,2010,Methods Enzymol.476:295-307)。使用法(DeChiara,T.M.et al.,2010,Methods Enzymol.476:285-294；Dechiara,T.M.,2009,Methods Mol.Biol.530:311-324；Poueymirou et al.,2007,Nat.Biotechnol.25:91-99)，其中将靶向ES细胞注射到未紧密化的8细胞阶段的Swiss Webster胚胎中，以产生健康的完全ES细胞来源的F0代小鼠，这些小鼠为C9orf72缺失的杂合子。F0代杂合子雄性与C57Bl6/NTac雌性杂交产生F1杂合体，所述F1杂合体杂交产生F2代C9orf72-/-、C9orf72+/-和野生型小鼠，进行表型分析。使用冷冻的F1杂合子精子和来自C57B16/NTac供体雌性的卵母细胞，通过体外受精(IVF)产生第二批N2F2代小鼠。然后将N2F1杂合后代杂交产生N2F2C9orf72-/-，C9orf72+/-和野生型小鼠，进行表型分析。
F2和N2F2小鼠的表型研究开始于6周龄。观察从小鼠出生到6周龄时的各发育里程碑(发育障碍(runting)、呼吸、面部和肢体异常、皮肤颜色、体态、纠正和睁眼)，每个笼子饲养2-5只，每天光照12小时，温度为20-23℃，湿度为40-60％。小鼠被安置在95.6×309.1×133.4毫米的笼子(Thoren)，笼内铺有垫料(The Andersons Lab Bedding)和棉花(Ancare)。饲养期间，每日两次监测小鼠的健康状况，小鼠可随意进食(LabDiet)和饮水。所有的动物操作都严格按照国家卫生研究院“实验动物护理和使用指南”中的建议进行。议定书由Regeneron制药机构动物关怀和使用委员会(IACUC)批准，并尽可能减少动物痛苦。
表达分析：腋窝、臂和颈部淋巴结、性腺脂肪垫、额皮质、膈膜、脊髓、脾脏和胸腺组织被切割且放置在RNALater稳定试剂(QIAgen)中于-20℃储存。将组织在试剂中匀浆并用氯仿进行相分离。根据制造商的说明书，使用miRNeasy Mini试剂盒(QIAgen)纯化含有总RNA的水相。使用MAGMAXTM TURBOTM DNase缓冲液和TURBOTMDNA酶(Ambion)去除基因组DNA。使用VILOTM Master Mix(IIIRT、RNaseOUTTM、重组核糖核酸酶抑制剂、专有的辅助蛋白、随机引物、MgCl2、dNTPs；Invitrogen by Life Technologies)把mRNA逆转录成cDNA。使用ABI 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，用TAQMAN Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)扩增cDNA。使用β-肌动蛋白作为内部对照基因来标准化cDNA输入差异。使用来自野生型小鼠的胸腺作为对照样品来计算样品之间mRNA的倍数差异(n＝5，每个基因型每个组织5只雌性)。图1B中给出了示例性的结果。
LacZ表达谱：小鼠经IP注射氯胺酮/甲苯噻嗪(120/5mg/kg)深度麻醉，使用0.2％戊二醛、4％多聚甲醛溶液通过心脏灌注进行固定。解剖脑、肋骨、淋巴结、唾液腺、胸腺、心脏、肺、肝、脾、胃、肾、肠、泌尿生殖器、肌肉和后肢组织，在PBS中漂洗，并在0.2％戊二醛、4％多聚甲醛溶液中再固定30分钟。洗涤组织并在37℃下在X-gal(1mg/mL)染色溶液中温育1-24小时。染色后洗涤组织，在4％多聚甲醛中再固定，并在一系列50％、70％和100％的甘油中澄清。用Nikon SMZ1500立体显微镜和使用NIS-Elements图像软件(Nikon)的NikonDS-Ri1数码相机拍摄照片。
在胚胎的第12.5天(E12.5)、第6周和第28周记录表达谱。以下提供了E12.5胚胎(表4)、6周龄和28周龄的C9orf72-/-小鼠(表5)中β-半乳糖苷酶(lacZ)的相对表达谱的代表性数据(–为无表达；+为低表达；++为中表达；+++为高表达；wt＝野生型C57BL/6N；nd为未测定)。
如图1B所示，在野生型(WT)性腺脂肪垫、额皮质和脊髓中检测到高水平的C9orf72表达，在胸腺、脾脏和淋巴结中表达水平较低。如预期，C9orf72+/-(Het)小鼠的表达水平约为野生型(WT)的一半，而C9orf72-/-(KO)小鼠没有可检测到的C9orf72表达。观察到，在所测试的基因型中临近基因座Mob3b、Ak045932和Ifnk的转录水平没有差异，这表明插入lacZ(即编码序列消除)仅影响C9orf72的表达。
与图1B所示的数据一致，6周和28周龄的C9orf72-/-(KO)动物中的lacZ着色揭示了脑和脊髓的几个区域以及脾、睾丸和肾中的酶活性(Suzuki,N.et al.,2013,Nat.Neurosci.16(12):1725-8；Koppers,M.et al.,2015,Am.Neurol.78(3):425-38)。此外，观察到在其他组织中不太显著的染色。在C9orf72+/-组织中，报告基因活性(reporteractivity)在强度和范围方面更加有限，如所预期的单个lacZ替代等位基因结果。
综合起来，这个实施例证明了鼠C9orf72在神经和免疫系统的各种组织中表达。此外，该实施例证明了至少在一些组织中，表达随着动物年龄而增加，并与以下实施例中描述的神经学和免疫学表型直接相关(见下文)。
表4
表5
实施例2.在C9orf72基因座中具有破坏的非人类动物的行为分析
本实施例尤其证明，本文所述的非人类动物(例如啮齿动物)发展出ALS样症状，例如由于啮齿类动物C9orf72基因座(例如小鼠)被破坏(如实施例1所述)，导致体重减轻和显著的运动异常。
如上所述C9orf72被破坏的小鼠，其表型研究在8周龄、18周龄、37周龄(雌性)和57-60周龄(雄性)时进行。每两周测量一次体重，并通过CT扫描(Dynamic 60)分析身体组成。使用标准24次扫描来显示脊柱颈部区域的实体部分。所有的动物操作都是按照Regeneron制药机构动物关怀和使用委员会批准的方案进行的。
使用主观盲评分试验来评估总体运动功能。使用旋转杆、旷场运动和步态测试进行运动损伤分析。运动障碍评分使用由ALS治疗发展研究所(ALSTDI,Gill A.et al.,2009,PLoS One 4:e6489)开发的系统测量。在步态测试期间，摄影机从下方拍摄，拍摄对象走过照明玻璃平台。报告每个动物的步态相关参数，如步幅模式、单独的爪摆动速度、站姿持续时间和压力。这个测试用于评估新的化学实体(chemical entities)对表型小鼠运动性能的影响。CatWalk XT是一种定量评估大鼠和小鼠脚步和步态的系统。它用于评估啮齿动物几乎任何类型的中枢神经、周围神经、肌肉或骨骼异常实验模型的运动能力。
CatWalk步态分析：将动物放置在Noldus CatWalk XT 10跑道的起始处，其开放端位于它们前面。小鼠自发跑到跑道尽头试图逃跑。摄像机记录足迹，并由系统软件测量。分析足迹，以确定位置异常。
旷场测试：将小鼠置于Kinder Scientific开放式野外系统中并评估60分钟。该设备使用红外光束和计算机软件来计算精细运动、X+Y行走、行进距离、直立事件的数量、直立时间和不动时间。
旋转棒：旋转棒测试(IITC Life Science，Woodland Hills，CA)测量小鼠从旋转棒落下的延迟时间。旋转棒被设置为从1rpm开始，并在180秒内加速至15rpm。然后记录随转速增加，动物落下的延迟时间。动物停留在旋转棒上而没有落下的三个最长持续时间的平均值和最大值被用于评估落下的延迟时间。能够停留180秒以上的动物被认为是无症状的。
上运动神经元损伤表现为痉挛状态(即僵直)、反射增强、震颤、运动徐缓和巴宾斯基征。下运动神经元损伤表现为肌肉无力、消瘦、抱握、腿卷曲和拖地，以及震颤。延髓损伤表现为吞咽困难、说话含糊及舌头自发性收缩。表6中列出了测试过程中动物出现运动损伤、震颤和僵直相关的评分方法。示例性的结果在图2A-2H中给出。
如图2A-2H所示，C9orf72-/-小鼠表现出ALS样表型，例如体重减轻、运动不活跃和步态受损。具体而言，与野生型对照小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的体重降低开始于约30周龄(图2B)。此外，除了旋转棒测试外，大约40周龄开始C9orf72-/-小鼠在所有类型的测试中(图2C-2H)均观察到显著的运动损伤(例如，显著的虚弱和后肢朝侧向中线折叠，以及轻度震颤和后肢肌肉僵直，p<0.0001)，这提示了上、下运动神经元异常状态的发生。在野生型或杂合(C9orf72+/-)动物中未观察到类似缺陷。
C9orf72-/-小鼠的旋转棒测试和CatWalk步态分析中自发活动和直立事件显著降低，表明后肢损伤。CatWalk步态分析揭示了肢体协调性和步幅下降的迹象，以及运动迟缓和后肢拖动。这些数据表明与野生型相比，这些小鼠的步态异常显著。在转动的最大时间方面，没有观察到野生型和C9orf72-/-小鼠之间的差异。早在36周龄时，C9orf72-/-小鼠就表现出显著的、渐进的运动缺陷。
在另一实验中，收集来自野生型和C9orf72-/-小鼠(n＝5，60周龄)脊髓的腰部用于组织病理学分析。观察到脊髓中运动神经元的总数没有差异(图2I)。然而，C9orf72-/-运动神经元的平均细胞体面积明显大于野生型(p<0.0001)。具体而言，C9orf72-/-小鼠的运动神经元被证明具有肥厚性特征，表现为相对于野生型具有明显更大的平均细胞体面积(图2I)。因此，这些数据表明下运动神经元病理变化可能从40周龄开始出现。
在类似的实验中，评估野生型(C9orf72+/+,n＝14；11只雌性,3只雄性)和C9orf72-/-(n＝17；12只雌性，5只雄性)小鼠运动异常的情况，从32周龄至60周龄，以给定周数内活体动物百分数表示。小鼠每周称重，并使用主观评分盲评(如上所述)来评估整体运动功能。每周或每两个月对两组小鼠进行临床神经检查，查看它们的运动损伤、后肢肌肉的震颤和僵直。对于运动损伤，我们采用了从0(没有症状)到4(小鼠在其侧面30秒内不能自行回正)的盲评神经评分量表(如上所述)。对于震颤和僵直，我们创建了一个从0(无症状)到3(严重)的评分系统。所有数据以平均值±SEM报道。代表性的结果如图2J所示。
使用如上所述的自动化的旷场系统(Kinder Scientific)、旋转杆测试(RotaRod，IITC Life Science，Woodland Hills，CA)和步态分析(CatWalk XT 10，Noldus)，每两周评估60分钟内的自发运动行为。所有数据以平均值±SEM报道。代表性的结果如图2K所示。
使用上述评分量表，发明人观察到，大约在40周龄时，C9orf72-/-小鼠开始表现出明显的虚弱，后腿向外侧中线折叠，以及轻度震颤和后肢肌肉僵直(P<0.0001)，提示上下运动神经元异常情况出现。此外，所有野生型小鼠存活到60周龄以上，但只有～53％的C9orf72-/-小鼠(17只中有9只存活；5只雌性，4只雄性)在60周龄时还存活(图2J，左上角)。从大约36周龄开始，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的体重停止增加。
在旷场测试中，发明人观察到C9orf72-/-小鼠与野生型对照相比，运动行为显著减少(P＝0.0008)。这些小鼠也表现出显著较少的直立行为(P＝0.0009)，这表明其后肢受损。在野生型和C9orf72-/-小鼠之间，在研究期间的任意时间，小鼠留在旋转棒上的最大时间没有显著变化。在CatWalk步态分析中，发明人观察到C9orf72-/-小鼠具有显著降低的肢体间协调(P＝0.0005)和步幅长度(P＝0.0013)，以及运动迟缓和后肢拖动。这些数据表明C9orf72-/-小鼠与野生型相比步态异常显著。因此，该实施例证明从大约36周龄开始，C9orf72-/-小鼠与野生型相比表现出显著的、渐进的运动缺陷。
在另一个实验中，使用握力测试来检查杂合(C9orf72+/-)和纯合(C9orf72-/-)小鼠。简而言之，抓握强度作为前肢的最大肌肉力量用来测量神经肌肉功能，通过小鼠施加到与传感器连接的网格上的抓握力来评估。三项试验连续进行，只测量前肢力量。获得的所有握力值相对于小鼠体重归一化。13只野生型、7只C9orf72+/-和18只C9orf72-/-小鼠在20周龄时(运动症状出现之前)进行握力测试，12只野生型、4只C9orf72+/-和13只C9orf72-/-小鼠在60周龄时进行握力测试。代表性数据如图2L所示。
如图2L所示，杂合子(C9orf72+/-)小鼠在60周龄时未显示任何显著的运动损伤、震颤或僵直。此外与野生型相比，杂合子(C9orf72+/-)小鼠在60周龄时没有显示出握力的任何差异。
综上所述，本实施例证明，上述非人类动物表现出可测量的神经退行性表型，并因此为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和/或额颞痴呆(FTD)提供了有用的模型，所述非人类动物具有由报告基因(例如lacZ)的插入而导致的内源性C9orf72基因座整个编码序列(即，外显子2-10)被敲除的基因组。这样的动物模型为用于治疗ALS和/或FTD的药物开发和筛选提供了有用的体内系统。
表6
实施例3.C9orf72基因座被破坏的非人类动物的免疫表型分析
本实施例证明了根据实施例1制备的非人类动物表现出免疫学表型，其特征在于在一些实施例中由各种免疫细胞群浸润引起的脾肿大和淋巴结病。此外，本实施例特别证明了这种非人类动物患有肾小球肾炎，其特征为肾脏被免疫细胞群浸润。希望不受任何特定的理论限制，本发明人提出C9ORF72基因座产物在免疫功能中起关键作用，并且本文所述的非人类动物中C9ORF72多肽的丧失并不是罹患ALS和/或FTD的主要机制。从C9orf72-/-和野生型小鼠中获取各种组织用于分析(n＝4-6只动物/基因型，8、18和37周(雌性)，9-10、18和57-60周(雄性))。
细胞制备和流式细胞分析：用CO2安乐死处理后，立即通过心脏穿刺将尽量多的血液收集到EDTA包被的管中，并将大约200μL转移到肝素涂覆的管中用于FACS制备。取脾脏、骨髓和颈部淋巴结，在含有2％胎牛血清(Stem Cell Technologies)和2mM EDTA(Ambion)的Dulbecco's 1X PBS中解离成单细胞悬浮液，并使用本领域已知的方法过滤。使用RBC裂解缓冲液(eBioscience)或ACK裂解缓冲液(Life Technologies)对血液、脾脏和骨髓上进行红细胞(RBC)裂解。使用Cellometer Auto T4细胞活力计数器(Nexcelom Bioscience)对淋巴结、脾脏和骨髓细胞进行计数，每孔接种约1000万个脾脏细胞，100万或尽可能多的淋巴结和骨髓细胞。血液以每孔最大体积(约250μL)铺板。室温下将细胞用LIVE/DEADFixable Aqua染色剂(Life Technologies)处理，离心沉降，并重新悬浮于封闭溶液(纯化的抗小鼠CD16/CD32mAb，BD抗体：FACS缓冲液为1：100)中冰浴15分钟。细胞与偶联抗体一并在冰上染色30分钟，洗涤，固定(BD Cytofix/cytoperm试剂盒)，并再次洗涤。最后将细胞重悬浮于FACS缓冲液(具有2％胎牛血清的Dulbecco's 1X PBS，Stem Cell Technologies，加入2mM EDTA，Ambion)中，并在BD FACSCanto流式细胞仪II或LSRFortessa流式细胞仪(BDBiosciences)上进行分析。根据制造商的说明，进行Foxp3染色(eBioscience)。
血浆细胞染色：CD11b(M1/70；Biolegend)、CD11c(N418；Biolegend)、CD3(145-2C11；Biolegend)、B220(RA3-6B2；Biolegend)、CD19(1D3；BD Pharmingen)、CD138(281-2；BD Pharmingen)和CD45(30-F11；BD Pharmingen)。(BM8；Biolegend)、CD115(AFS98；eBioscience)、Ly6G(RB6-8C5；eBioscience)、CD11b(M1/70；eBioscience)、CD45(30-F11；BD Biosciences)和Ly6C(AL-21；BD Biosciences)。从BioLegend(San Diego，CA)获得抗CD8、CD25、CD62L、CD69、CD127、PD1(RPMI-30)、NKp46的抗体。从eBioscience(San Diego，CA)获得Foxp3抗体。CD49b抗体获自BD Biosciences(San Jose，CA)。使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。在Nexelcom Bioscience Cellometer Auto 2000上用含有AO/PI死活细胞鉴定染料(吖啶橙和碘化丙啶)对30-35周龄雌性(野生型：n＝4；C9orf72-/-：n＝4)的脾脏、颈部淋巴结、骨髓和肾脏进行总细胞计数，计算阳性率。使用细胞计数来确定通过表面染色观察到的细胞群的绝对数量，并相应绘图。
组织学：将组织收集到4％多聚甲醛(PFA，Electron Microscopy Sciences)中或用50mL盐水、pH6.5的50mL 4％PFA的乙酸盐缓冲液、最后用pH9.5的50mL 4％PFA的硼酸盐缓冲液经心脏灌注，然后收集组织。脊髓被收集到含15％蔗糖的硼酸盐缓冲液中，而后被收集到含30％蔗糖的硼酸盐缓冲液中，直到它们沉降。将所有其他组织固定在4％PFA中，24或48小时后转移至70％乙醇中。由商业化的组织学实验室(Histoserv,Inc.；Germantown,MD)进行石蜡包埋、切片及苏木精和曙红(H&E)染色。由商业化实验室(Histotox Labs；Boulder，CO)完成IgM、IgG、补体因子C3、CD45R、CD3、CD138和F4/80的免疫组织化学检测。运动神经元细胞计数和胞体面积使用Image J量化。运动神经元计数为每只动物的三张切片的平均值(n＝5只小鼠)，胞体面积为每只动物的三张切片的平均值，每张切片10个运动神经元(n＝5只小鼠)。用Halo定量补体因子C3IHC。
血液学测定：根据Regeneron IACUC方法，在异氟烷麻醉下通过眼球采血或通过吸入CO 2安乐死后经心脏穿刺采集血液样品。使用Hemavet 950(Drew Scientific Group)对20μL全血进行全血细胞计数(CBC)，使用ADVIA 1800化学系统(Siemans MedicalSolutions USA)在血清样品上进行临床化学分析。使用以下产品对血浆样品进行ELISA分析：小鼠IgG类风湿因子ELISA试剂盒、小鼠IgM类风湿因子ELISA试剂盒(Shibayagi Co.，Ltd。)、小鼠抗dsDNA总Ig ELISA试剂盒、小鼠抗核抗体(ANA)Ig ELISA试剂盒、小鼠抗-Sm(Smith Antigen)总Ig ELISA试剂盒、小鼠抗心磷脂总Ig ELISA试剂盒(Alpha DiagnosticIntl)、IgG和IgM小鼠ELISA试剂盒(Abcam)。样品在450nm下用Spectramax M5微孔板读数器(Molecular Devices)读数。对样品进行重复分析并取平均值。根据制造商的说明书，使用Multi-10-PLEX电化学发光检测分析(Meso Scale Discovery)检测血浆样品中IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12总量、IL-17、MCP-1和TNF-α，在Meso Sector S600酶标仪上在620nm处读取(Meso Scale Discovery)。对样品进行重复分析并取平均值。
RNA分离、测序和分析：取新鲜脾脏和颈部淋巴结放置于RNALater稳定剂(Qiagen)中，于-20℃储存。按照制造商的说明，使用MagMAX TM核酸分离试剂盒(Ambion)分离总RNA。使用紫外分光光度计定量RNA，并通过Qiaxcel(Qiagen)评估RNA完整性。使用DynabeadsmRNA试剂盒(Invitrogen)从总RNA中纯化PolyA mRNA，并用ScriptSeq RNA-seq文库制备试剂盒(Illumina)制备链特异性RNA-Seq文库。使用Hiseq 2000NGS测序仪(Illumina)对RNA-Seq文库进行测序，测定的序列长度为33bp。使用由Regeneron Pharmaceuticals Inc开发的RNA-Seq软件Nimbus2从原始测序读取中获知基因表达水平。
尿分析方法：尿样通过采集标本获得，尿液白蛋白浓度用Albuwell M间接竞争性ELISA试剂盒(Exocell，Philadelphia，PA)测定。使用肌酸酐伴侣试剂盒(Exocell)测定尿肌酸酐浓度。根据制造商的说明进行测定，并将获得的数据用于计算尿白蛋白与肌酸酐比率(ACR)。
统计分析：使用GraphPad Prism软件(版本3.0)进行统计和图形分析。数据使用两个独立样本t检验(Student's unpaired t-test)和单因素方差分析(ANOVA)进行分析。结果在p值<0.05时被认为是统计学显著的(误差线表示为s.e.m)。示例性的结果在图3A-3AL中列出。
如图3A-3D所示，与野生型和C9orf72+/-小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的脾脏增大显著。此外，随着年龄增长，颈部淋巴结逐渐变大(图3A-3D)。因此，早在8周龄时，C9orf72-/-小鼠就存在脾肿大和颈部淋巴结肿大。在所有C9orf72-/-小鼠的颈部区域，这种肿大是可触知的，但野生型或C9orf72+/-小鼠不存在这种情况。经进一步研究，这些肿块在12周龄的雌性C9orf72-/-小鼠，18周龄的雌性和雄性C9orf72-/-小鼠中可被触知。解剖后，该肿物被证明源于颈部淋巴结，而早在8周龄时就观察到肿大(图3A)。全身解剖显示还存在其它肿大的淋巴结，最显著的是老年C9orf72-/-小鼠(>35周)的肠系膜淋巴结。在8周龄时，C9orf72-/-小鼠的派伊尔斑也显著扩大，并且出现脾肿大(图3D，左下方)。17只C9orf72-/-小鼠中只有9只寿命超过60周龄，而所有进行周期性神经功能测试的野生型小鼠存活至实验期末。在大约18-24周龄时，所有C9orf72-/-小鼠中的脾肿大和颈部淋巴结增生已被充分证实，并且与野生型和C9orf72+/-小鼠相比，C9orf72-/-体重曲线开始变的平坦(例如，图2B)。
具有全血差异的CBC数据显示，与野生型相比，C9orf72-/-小鼠的循环嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞显著增加，同时循环淋巴细胞显著降低(图3E)。来自C9orf72-/-小鼠(例如34-38周龄)的CBC数据也证实，与野生型小鼠相比，其循环白细胞差异改变。发明人观察到，与野生型小鼠相比，早在8周龄就可检测到C9orf72-/-小鼠中单核细胞和嗜中性粒细胞显著增加，而淋巴细胞减少。
H&E染色揭示了在C9orf72-/-小鼠的脾和颈部淋巴结中具有多种形态的混合细胞群(图3F、3G)。具体而言，以4x镜观察颈部淋巴结显示大量的圆形细胞，其特征在于多变的独特的细胞边界，且显示出中等至丰富的嗜酸性特征(图3F)。有时，在肿大的细胞群中观察到泡沫状细胞质。当以60x镜观察时，颈部淋巴结内的细胞呈现出与嗜中性粒细胞(黄色箭头)和其他成熟淋巴细胞混合在一起的浆细胞样形态(蓝色箭头)(图3G)。似乎是巨噬细胞(绿色箭头)的细胞，还有Mott细胞(间歇性的，红色箭头；含有凝聚免疫球蛋白的异常浆细胞)也被观察到，所有这些都表明C9orf72-/-小鼠颈部淋巴结出现慢性炎症(图3G)。
在C9orf72-/-小鼠中观察到脾脏和淋巴结的增大表明了瘤形成或免疫失调疾病进程，这以前在ALS-FTD患者中没有被报道过。C9orf72-/-淋巴组织的组织病理学分析(即对8-60周龄小鼠的淋巴结和脾切片进行苏木精和曙红(H&E)染色)证实了肿大的淋巴结的基本细胞组织被保留。此外，IHC染色证实了皮层中B细胞(CD45R+)以及淋巴结之间和副皮质区中T细胞(CD3+)的存在。然而，肿大的皮层和髓质由这样的细胞群构成，这一细胞群大部分由大而圆的细胞组成，其具有多变的独特的细胞边界，并且具有由嗜酸性和泡沫状的细胞质包围的单个圆形核。脾脏中也存在类似的细胞浸润，主要位于红髓内，这也导致脾肿大，由此增加了C9orf72-/-小鼠的脾重量。还观察到存在丰富的含有核周空晕的浆细胞样细胞(与浆细胞形态一致)，同时偶尔存在Mott细胞。在野生型和C9orf72+/-(杂合子)小鼠中未观察到类似的混合浸润。
大的圆形细胞群没有被CD45R、CD3或CD138染色，但对F4/80(一种巨噬细胞系标记物)呈强烈阳性反应。由于细胞质高度空泡化，IHC信号主要在细胞膜上，在细胞质中没有。与此相反，WT和杂合子对照的F4/80染色特征为细胞质和细胞膜膜染色，这恰恰是巨噬细胞的特征，其总F4/80信号比在C9orf72-/-小鼠中观察到的更强烈(见下文，例如图3P)。
8-60周龄小鼠其它器官的H&E和IHC分析显示，某些C9orf72-/-小鼠中存在散发性胸腺髓质增生和骨髓局灶性纤维化和/或骨髓增生。更为常见的是，在基因敲除型小鼠(null mice)的肝脏和肾脏中发现大量树突细胞的存在。这些细长、角形的细胞呈F4/80+，且在形态上类似于典型的树突细胞(DC)，尽管其尺寸更大且数量更多。与野生型相比，早在8周时，它们在C9orf72-/-肝脏中就更明显，尽管没有相关的肝脏疾病的证据。在8周时我们还观察到C9orf72-/-肾中F4/80+细胞的增加，且随着年龄变得更加显著。DC主要位于外侧髓质内，在那里它们在致密斑和相邻小管附近形成聚集体，并在与淋巴细胞相关的肾小球周围形成明显的套囊(cuff)。我们注意到随着小鼠老化，肾脏中的混合白细胞浸润越来越多，到35-60周龄时，伴随有不同程度的免疫介导的肾小球疾病。在受检查的任意动物中没有观察到脑或脊髓组织中有炎症迹象。因此，脾脏和淋巴结是C9orf72-/-小鼠免疫病理发生的主要部位，肾脏有继发进行性肾小球疾病的迹象。
如图3H，C9orf72-/-雄性小鼠在颈部淋巴结内CD11b-CD11c-CD3-B220+CD19+B细胞的数量增加，同时相对于野生型，在脾、骨髓和血液中这种B细胞的百分比相当或减小。与野生型相比，在C9orf72-/-雄性小鼠脾、颈部淋巴结和骨髓中，转换为浆细胞(B220mid/lowCD19mid /low)和成熟浆细胞(B220low/-CD19low/-CD45+CD138mid/+)的B细胞似乎随着年龄增加而增加(图3I)。
根据所检查的器官(例如颈部淋巴结)，雌性C9orf72-/-小鼠中B细胞(CD45+CD19+)的百分比与野生型相比未改变或降低。与野生型相比，在C9orf72-/-雌性小鼠脾脏、淋巴结和骨髓中，转变为浆细胞/浆母细胞(CD45+CD19intB220intCD138+)和成熟浆细胞(CD45+CD19-B220-CD138+))的B细胞的百分比增加(图3J)。我们没有观察到血液中这些细胞类型在C9orf72-/-和对照小鼠之间的任何一致的差异。综上所述，这些数据显示了C9orf72-/-小鼠中的适应性免疫应答的进展。
如图3K和3L所示，在老龄化的雄性和雌性C9orf72-/-小鼠脾脏中观察到嗜中性粒细胞(CD11b+Ly6G+Ly6C+)百分比增加。这种增加在9-18周龄间的C9orf72-/-雄性小鼠和任意年龄的C9orf72-/-雌性小鼠的颈部淋巴结都能观察到。在大多数时间点，骨髓和血液中的粒细胞群也显著增加。在至少一次测试中，与野生型相比，C9orf72-/-小鼠中的炎性单核细胞(CD11b+、CD115+、Ly6Glow/-、Ly6Chigh)在脾脏、颈部淋巴结、骨髓和血液中显著增加(图3K和3L，中间)。随着时间的推移，观察到在C9orf72-/-小鼠的脾脏、骨髓和血液中常驻单核细胞(resident monocytes)(CD11b+CD115+Ly6Glow/-Ly6Cmid/-)也有类似的增加，在颈部淋巴结则降低(分别见图3K和3L，底行)。如图3M所示，与野生型相比，在C9orf72-/-小鼠脾脏，颈部淋巴结、肾脏和骨髓中观察到F4/80+巨噬细胞的增加。
对野生型和C9orf72-/-小鼠的脾脏和颈部淋巴结进行了CD45R、CD3和CD138表达的组织病理学分析(图3N、3O)。用4x和60x镜观察切片。C9orf72-/-小鼠的脾丧失了正常滤泡形态(图3N)。白髓区扩大、发育不良、边界不清。观察到大量浅粉红色细胞质(血浆样细胞)细胞的积聚。CD138染色与野生型小鼠没有显著差异，且在白髓中央的一些增殖细胞没有被CD45R、CD3或CD138染色。野生型小鼠的脾脏显示出基本正常的形态，其中白髓区域由中央T细胞(抗CD3IHC)组成，边缘由一圈B细胞(抗CD45R IHC)包围，且浆细胞的CD138染色最浅(图3N，左边)。
在颈部淋巴结中，C9orf72-/-小鼠出现了淋巴组织岛(island of lymphoidtissues)，其散布在具有单个核和丰富的嗜酸性细胞质的大量聚集的圆形细胞中(图3O)。这些细胞取代了正常的结构，但仍保持相对正常的B细胞和T细胞区域(在CD3和CD45R染色切片的中心明显)。异常细胞用CD3、CD138(图3O右下图中的箭头)和CD45R间歇性地染色，但是对这三种标记基本是阴性的。野生型小鼠显示正常的淋巴结形态(图30，右边)。在T细胞(CD3)区周围有发现CD45R免疫染色(B细胞)，CD138很少染色髓质细胞。
还在野生型和C9orf72-/-小鼠的脾脏和颈部淋巴结中进行了F4/80表达背景下的组织病理学分析(图3P)。用4x和60x镜观察切片。C9orf72-/-小鼠显示F4/80染色阳性(巨噬细胞)，这与在H&E染色中观察到的大的泡沫细胞浸润相关(如上所述)。在C9orf72-/-小鼠脾脏的红髓中也观察到细胞外F4/80染色。与野生型相比，8-58周龄的C9orf72-/-小鼠其F4/80+细胞数量随着年龄增加，在C9orf72-/-淋巴结中增加。
在检查的所有C9orf72-/-小鼠组织中，总CD45+(白细胞共同抗原)细胞计数增加，这与所观察到的免疫浸润一致。然而，与野生型相比，测定的CD45+占总细胞群的百分比不变或降低(图3S)。采用特异性抗体板(Specific antibody panels)来确定白细胞亚群内的稳态是否改变。与野生型相比，C9orf72-/-小鼠的淋巴结、脾脏和骨髓中的嗜中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6CintCD115-)和总单核细胞(CD45+CD11b+CD115+)的百分比可变地增加(图3K和3L)。另外在脾脏、淋巴结、肾脏和血液中观察到F4/80+巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-)的增加(图3M)。有趣的是，尽管在C9orf72-/-小鼠的组织中有更多的细胞F4/80染色呈阳性，但总体信号强度低于野生型小鼠，这表明F4/80IHC分布更广泛但浓度更低(图3P)。Ly6G和Ly6C染色显示，在C9orf72-/-小鼠脾脏、淋巴结、肾脏和血液中炎性单核细胞(CD45+CD11b+CD115+Ly6G-Ly6Chi)的百分比增加。
对30-35周龄的雌性大鼠上进行额外的FACS分析，30-35周龄是感兴趣的特定时间点，因为这时大多数基因敲除型小鼠(null mice)已经发展出肾脏病理状态但仍然存活。如图3Q所示，通过流式细胞术对整个组织进行总细胞计数，结果显示C9orf72-/-小鼠中不同区室的绝对细胞计数显著增加。使用流式细胞术采用各种标志物对髓样树突状细胞、NK细胞和T细胞(图3R-3AC)计数，同样显示增加。与野生型相比，C9orf72-/-小鼠中的髓样树突状细胞(CD45+CD11b+CD11c+MHCII+)的百分比和总细胞计数增加，而NK细胞(NKp46+CD49b+)部分则减少(图3R)。野生型和C9orf72-/-小鼠组织中的CD45+(白细胞共同抗原；染色所有白细胞)细胞的百分比相当，然而总细胞计数显著增加，这表明免疫细胞显著浸润(图3S)。用T细胞特异性标记物CD4+(辅助性T细胞群)和CD8+(细胞毒性T细胞群)染色显示T细胞群百分比降低(图3T-3AC)。如IHC所示，分子谱分析和CBC结果显示，在淋巴细胞群中观察到的减少可能反映髓细胞比例的增加。
如上所示，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠中CD45+CD8+和CD45+CD4+细胞的百分比总体上减少，这可能是骨髓细胞比例增加的结果，与基因标志数据(gene signaturedata)一致。相反，这些T细胞群体的总细胞计数在C9orf72-/-小鼠中增加。这反映了淋巴组织总体肿大和可见的明显的免疫渗透。基于其它表面活化标志物的表达，进一步细分CD8+和CD4+T细胞群(图3V-3AC)。对于CD8+T细胞，与野生型相比，C9orf72-/-小鼠的早期激活和效应记忆T细胞标记物CD69和CD44的百分比显著增加(图3V和3X)。此外，与野生型相比，在C9orf72-/-小鼠中观察到表达PD-1(一种在活化的细胞中上调的共抑制受体，其对抑制免疫系统起重要作用)的T细胞的百分比增加(图3Z)。尽管CD69表达降低，但颈部淋巴结中CD44和PD-1的表达增加(图3V-3AA)。对于CD4+T细胞，与野生型相比，C9orf72-/-小鼠的CD44和PD1在脾，淋巴结，肾和血中的百分比显著增加，在骨髓中其值与野生型相当(图3U、3W、3AA)。脾脏、颈部淋巴结和肾脏中的CD69表达百分比增加(图3Y)。伴随活化的T细胞的增加，与野生型相比，C9orf72-/-小鼠的脾脏和淋巴结中CD4+FoxP3+调节性T细胞的百分比增加(图3AB)。另外，脾隔室中CD62L和CD127表达降低(图3AC)，CD62L和CD127在初始或中央记忆T细胞上表达，且一旦T细胞被激活就被下调。测定结果显示C9orf72-/-小鼠中细胞计数也存在显著增加，且具有不同的显著性。
细胞因子组的数据(图3AD、3AE和3AF)显示，血清中的细胞因子在8-58周龄的C9orf72-/-小鼠内升高。特别是在18周龄时，与野生型相比，雄性C9orf72-/-小鼠血清中IL-17、IL-10、TNF-α和IL-12(总)水平显著增加(图3A)。对于这些相同的细胞因子，与C9orf72+/-小鼠相比，在C9orf72-/-小鼠中观察到显著升高的水平。这些数据表明，这些小鼠中巨噬细胞被系统激活。在所有分析的雄性小鼠(8-58周龄)中，C9orf72-/-小鼠的IFN-γ、IL-10、IL-12(总)、IL-17和TNF-α的循环水平显著高于野生型小鼠。与野生型小鼠相比，在8-38周龄的雌性C9orf72-/-小鼠中，IL-10、IL-12(总)、IL-17、TNF-α和MCP-1的循环水平显著增加，IFN-γ也有增加的趋势。与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的IL-12(总)增加约6倍。IL-10、IL-17a和TNF-α也升高，尽管程度较轻。IL-1β、IL-2或IL-4的水平没有变化，并且与野生型相比，一些C9orf72-/-小鼠中的IL-6增加，但这种差异没有显著性。趋化因子MCP-1水平在雌性而不是雄性C9orf72-/-小鼠中显著增加(图3AE和3AF)，并且在雄性和一些雌性中，IFN-γ显著增加(图3AE和3AF)。因此，与野生型小鼠相比，促炎细胞因子总体水平的改变早在8周时便在C9orf72-/-小鼠中观察到。
如图3AG-3AK所示，衰老的C9orf72-/-小鼠发展出更严重的肾小球肾炎。该结果在H&E染色以及肝脏和肾脏的F4/80IHC中得到证实(图3AK)。例如，8周龄的C9orf72-/-肝上通过IHC增加的F4/80染色显示巨噬细胞的浸润增加，而在38周龄的雌性小鼠肾中观察到大的F4/80+巨噬细胞浸润(图3AK)。通过血清化学观察到的血尿素氮的升高与C9orf72-/-小鼠的肾脏疾病相关，而血清球蛋白含量升高则提示炎症。小鼠正常的血液尿素氮范围为8-33mg/dL，而球蛋白水平通常为1-4g/dL(参见例如Zaias,J.et al.,2009,J.Am.Assoc.Lab.Animal Sci.48(4):387-390)。
对肾脏的进一步分析揭示了存在大的F4/80+单核细胞，其具有在35-41周龄C9orf72-/-小鼠的肾小球周围出现的大量的树突细胞的特征(图3AK)。通过H&E染色观察到35-60周龄的C9orf72-/-小鼠肾脏出现轻度至中度的肾小球肾炎(图3AK)。在受影响较严重的动物中，肾小球增大，细胞增多，并显示出肾小球系膜增殖和白细胞浸润。免疫介导疾病的表现是多样的，观察到毛细血管壁增厚和一些肾小球壁层上皮细胞增生，而另一些表现出肾小球膜连同非细胞嗜酸性透明物质扩张、与肾小球硬化和不同程度的肾周纤维化表现一致。有趣的是，在用刚果红染色时，这些区域没有呈现淀粉样蛋白沉积阳性。肾小管改变包括皮质和髓质管扩张，以及透明蛋白质性管和变性/再生的肾小管的出现。在野生型小鼠中没有观察到这种变化。血清化学组测试揭示，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠中升高的血液尿素氮(例如图3AG)和降低的血清白蛋白与肾组织学结果中发现的肾小球过滤功能受损是一致的。
为了进一步评价在基因敲除型小鼠(null mice)中观察到的肾病的严重程度，对H&E染色的肾切片在膜增生性肾小球肾炎、间质单核炎症、玻璃体形成、肾小球硬化和嗜碱性小管、与免疫介导的肾小球病变有关的肾脏疾病的种类方面进行盲评。如图9A所示，组织病理学评分结果的加权图表明，在基因敲除型小鼠(null mice)中观察到的最显著的肾改变与膜增生性肾小球肾炎有关。个体组织病理学评分(图9B)显示，所有基因敲除型小鼠(null mice)表现出最小至重度膜增生性肾小球肾炎，并且在受影响更严重的动物中偶然出现其他疾病类别。得分0＝无，1＝最小，2＝轻度，3＝中等，4＝严重。同一群小鼠在14周(图9C，上图)和24周(图9C，下图)测定的尿ACR结果表明，C9orf72-/-小鼠随着年龄的增加出现白蛋白尿。杂合子小鼠与WT的尿ACR值相当，与没有观察到的表型一致。
而且，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠通过ELISA显示出增加的总IgG和IgM自身抗体水平，提示自身免疫性疾病(图3AI)，且与血清化学检测观察到的血清球蛋白水平升高相对应(图3AG，上面)。另外，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的血清ELISA显示循环双链DNA(dsDNA)抗体、抗核抗体(ANA)、抗-Smith抗体和抗心磷脂抗体的水平显著升高。ANA是结合细胞核内含物的自身抗体。抗dsDNA抗体是特异性结合双链DNA的一类ANA抗体，抗心磷脂抗体针对线粒体膜的磷脂组分。
此外，C9orf72-/-小鼠早在8周龄就表现出循环类风湿因子(RF)抗体的显著增加(图3AH)。增加的血清球蛋白和自身抗体含量可提示各种疾病状况中的任何一种，例如骨髓疾病、自身免疫疾病、慢性炎症、肝脏疾病、肾脏疾病和感染等。仅举一例，系统性红斑狼疮红斑狼疮(SLE)的特征在于产生针对许多细胞膜和细胞内抗原的高滴度的自身抗体。例如，针对小核核糖核蛋白(snRNP)的核心单位的抗Sm抗体是SLE的特异性标记。
狼疮患者中增加的自身抗体滴度与滤泡辅助性T细胞(Tfh)增加的循环频率正相关(Xu,H.et al.Cell Immunol 295,46–51(2015))。通过FACS分析脾脏、宫颈LN、肠系膜淋巴结和血液中的这种特定细胞群(CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+)，结果显示与对照相比，C9orf72-/-组织中Tfh细胞群显著增加(图10)。在C9orf72-/-BM中也观察到增多的Tfh细胞，但不显著(图10)。总的来说，这些观察结果支持了在没有C9orf72表达的情况下发生类似于人SLE的免疫应答的观点。
浆细胞和转化B细胞/浆母细胞的肿大可能与特定的肿瘤如多发性骨髓瘤和浆细胞瘤以及自身免疫性病症有关。C9orf72-/-小鼠脾脏和淋巴结肿大，免疫浸润明显，浸润细胞对于B细胞标志物(CD45R)是阴性的，是具有泡沫状巨噬细胞特征的F4/80+。虽然这些细胞的数量很大，它们占据了被认为适合该细胞系的组织区域，但并没有消除这些组织的基本结构。此外，有丝分裂指数低，只观察到罕见的有丝分裂。因此不太可能是肿瘤。然而，在这些组织中存在浆细胞群，偶有Mott细胞，存在肾小球肾炎迹象，表明C9orf72-/-小鼠具有自身免疫性。如上所示，与野生型和C9orf72+/-(杂合)小鼠(图3AH)相比，C9orf72-/-小鼠的IgG和IgM型抗RF效价都显著升高。此外，在8周龄开始C9orf72-/-小鼠中血清总IgG和IgM水平显著升高(图3AG和3AI)，这与血清化学图谱一致，表明C9orf72-/-小鼠中球蛋白升高。
据报道，肾小球基底膜的自身抗体，或肾小球毛细血管内的可溶性免疫复合物的沉积，随后的补体结合和炎症会导致肾病(免疫介导的肾小球肾炎)。为了确定观察到的总免疫球蛋白和自身抗体水平的增加是否引发肾小球性肾炎，在8-63周龄C9orf72-/-和野生型小鼠的肾切片上进行IHC以获得总IgG和IgM(图3AL)。如本文所述，C9orf72-/-小鼠在血清和组织学水平都显示出肾小球肾炎的清晰迹象。具体来说，与野生型小鼠相比，C9orf72-/-小鼠的肾在所有检查的时间点表现出增强的IgG免疫染色。此外，在8周时，C9orf72-/-肾在髓质和皮质的脉管系统和肾小管上皮中显示弥散、强烈的IHC信号。与肾小球肾炎病理的发病相关联，38周时观察到肾小球IgG和IgM染色的显著增强。IgG和IgM染色也经常与鲍曼囊的顶层有关。偶尔在肾小囊腔和/或近端肾小管内观察到IgG染色，表明肾小球滤过功能受损(即渗漏超过再吸收能力)。在病重动物的肾小管上皮细胞中存在强烈的IgG染色，与大量IgG的重吸收一致。对于IgM，观察到相似但不太强烈的染色的频率更低。与野生型相比，硬化肾小球中的染色减少，这与这些单位的血流受损相对应(即血管袢已被基质或肾小球系膜细胞替代)。然而，与野生型相比，保留清晰血管袢的肾小球倾向于出现升高的IgG。在高放大倍数下经常观察到与血管膜相关的IgG和IgM的细粒沉积物和/或线性染色，提示免疫复合物沉积。
补体因子C3沉积通常与肾中基底膜上的免疫球蛋白沉积有关。与野生型相比，补体因子C3的IHC显示C9orf72-/-小鼠的肾小球簇中染色增加(图3AL)。颗粒状和线性染色在肾小球囊内脏层的膜上最显著，显著地勾勒出毛细管袢和足细胞。
对脾脏和颈部淋巴结(8-10周和35周野生型和C9orf72-/-小鼠)进行分子谱分析的基因标记数据提示了巨噬细胞、单核细胞和粒细胞群体的浸润。还观察到T&B细胞的消耗，这可能反映存在的髓细胞比例增加。全局分层分析(Global hierarchical analyses)主要根据性别和年龄而不是基因型来初步分选大脑样本，这表明该组织中的分析差异是由样本的生物学基础和基因型造成的。对于年龄和性别，只有C9orf72表达在脑组织中始终不同。相反，脾脏和淋巴结样本基于基因型聚集，年龄和性别是次要的，这表明这些器官的转录组差异是C9orf72表达变化的结果。此外，与野生型相比，在早期和晚期，对于雄性和雌性都有超过100个与免疫功能相关的基因座在C9orf72-/-小鼠中表现出显著的表达差异。C9orf72-/-小鼠的脾脏和淋巴结基因标记提示骨髓浸润，同时淋巴细胞印迹(lymphocyticfootprint)减少，与CBC数据(见上文)一致，证实了由于髓样细胞增多和淋巴细胞减少之间的平衡，品系间总白细胞计数是相当的。在biosets比较中，最强的分析匹配是针对免疫反应特征、各种炎症的小鼠模型和人类传染病。如本实施例所示，免疫分型数据表明，C9orf72基因座(C9orf72-/-)被破坏的小鼠早在8周龄就出现脾肿大和淋巴结肿大。具体而言，CBC数据显示C9orf72-/-小鼠的循环单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增加，并且在8周时开始血液中的淋巴细胞减少。此外，雄性(58周)和雌性(37周)的C9orf72-/-小鼠随着年龄的增长，颈部淋巴结逐渐变大。该实施例还特别证明了C9orf72-/-小鼠随着年龄的增长而发展出肾小球肾炎(例如，肾中F4/80+巨噬细胞浸润)和自身免疫性疾病(例如，显著升高的IgM和IgG自身抗体水平)。因此，该实施例具体描述了如实施例1中所述的C9orf72基因座被破坏性的啮齿类动物在大约8周龄时在外周和循环中表现出可检测的异常。具体而言，C9orf72缺失导致慢性全身性免疫应答，这种应答导致炎症细胞因子升高并且在几个区室中发生髓样扩张。
实施例4.向C9orf72基因座被破坏的非人类动物施用神经毒素
该实验证明向本文所述的非人类动物施用各种毒素可加重观察到的ALS样表型各个方面的状况。具体来说，这个实施例明确证明了向C9orf72-/-小鼠施用各种毒素轻度加剧ALS样运动表型，并增强运动神经元的氧化应激，但不影响这些小鼠不活动性和步态异常的增加。这个实施例还证明了C9orf72-/-小鼠的运动神经元发生显著的线粒体功能障碍。
简而言之，在8天时间内培养小鼠胚胎干细胞并分化成运动神经元。第一天，将预先冷冻的小鼠胚胎干细胞解冻并加入到含有5mL胚胎干细胞培养基(ES培养基：具有15％FBS、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％核苷、0.1％β-巯基乙醇、1％丙酮酸钠、10000单位/mL的LIF的DMEM)的15mL falcon管中。然后将管以800rpm离心5分钟。吸出上清液并将细胞悬浮在10mL ES培养基中。然后将细胞接种在涂覆有10mL 0.1％明胶的T75烧瓶上，并在37℃孵育30分钟以促进其附着于烧瓶底部。然后将细胞温育过夜。第二天用新鲜培养基替换培养基，以使细胞存活。
第二天，从烧瓶中吸出培养基。用10mL PBS洗涤烧瓶，然后加入5mL胰蛋白酶以从烧瓶底部分离细胞。细胞在37℃孵育5分钟。通过在显微镜下检查烧瓶，确认细胞分离。将分化培养基(10mL DFNK培养基：44％advanced DMEM/F12、44％神经基质、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺、0.1％β-巯基乙醇、10％敲除血清替代物)加入烧瓶以阻止胰蛋白酶反应。将烧瓶中的溶液收集到falcon管中，并以800rpm离心5分钟。吸出上清液并将细胞悬浮在12mLDFNK培养基中。然后将细胞铺在细胞培养皿中，并置于37℃的培养箱中过夜。第二天，将细胞溶液转移到falcon管中，以500rpm离心2分钟。吸出上清液并将细胞悬浮在12mL DFNK培养基中。然后将细胞铺在新的细胞培养皿中并置于培养箱中过夜。第二天，收集培养基中的培养基并转移到falcon管中。然后将管以500rpm离心2分钟，然后吸出上清液。将细胞悬浮于36mL DFNK培养基中，以终浓度为1μM的维甲酸和0.25μM的smoothened拮抗剂进行运动神经元分化。培养基分到三个培养皿中，每培养皿12mL。
3天后，形成的胚状体(EB)被分离。首先，EB被收集并转移到falcon管中。然后将细胞以500rpm离心2分钟，吸出上清液。然后用4mL PBS-葡萄糖洗涤细胞。接下来，将4mL胰蛋白酶添加到细胞中进行化学分离，并孵育5分钟。然后，加入1mL马血清以终止胰蛋白酶反应。EB放置五分钟，吸出上清液。加入2mL PBS-葡萄糖-DNA酶，并将细胞机械分离十次。细胞沉降5分钟，分离的细胞转移到单独的管中。将2mL的PBS-葡萄糖-DNA酶添加到未分离的细胞中并重复机械分离。细胞沉降五分钟，然后分离的细胞转移到单独的管中。分离的细胞以800rpm离心5分钟，然后吸出上清液。将分离的细胞悬浮于5mL胚胎干细胞运动神经元培养基(ESMN培养基：神经基质、2％B27、2％马血清、1％青霉素/链霉素、0.25％谷氨酰胺、0.01％γ-巯基乙醇、10ng/mL BDNF、10ng/mL CNTF、10ng/mL GDNF)。将细胞以800rpm离心5分钟。吸出上清液并将细胞悬浮在ESMN培养基中。然后使用Countess自动细胞计数器(LifeTechnologies)对细胞进行计数，并且在每个六孔板中每孔接种50万至1百万个细胞，并加入2mL ESMN培养基。细胞保存在ESMN(对照)或ESMN和BMAA(浓度为0.1-100μM)中。使用0.4％台盼蓝，设置平均细胞直径>20μm(运动神经元)，进行细胞计数。示例性的结果在图4中给出。
在另一个实验中，野生型小鼠每周腹膜内给药，从第1周开始注射BMAA(500mg/kg)或PBS(对照)，持续六周(图5A，顶部)。每周记录体重，直至第6周、第14周和第18周。在实验开始时(第0周，10周龄)记录旋转杆、旷场运动和步态测试(如上所述)结果，每隔一周测试一次，直至第6周、第14周和第18周。示例性结果在图5A-5D中列出。
对于野生型小鼠，数据证实BMAA通过AMPA/海鞘质受体介导的途径以剂量依赖性方式杀死培养的野生型运动神经元。此外，每周注射(i.p.)BMAA并不会在野生型小鼠中诱导出ALS样表型(图5A-5D)。当使用100mg/kg BMAA时观察到类似的结果。
在另一个实验中，每周对高龄(即32周龄)野生型和C9orf72-/-小鼠腹膜内给药BMAA(500mg/kg)或PBS(对照)，持续六周。从第0天(即32周)开始每周记录体重，直到38周。在实验开始时(第0周，10周龄)，后每隔一周至38周，通过旋转杆、旷场运动和步态测试(如上所述)进行运动损伤分析。表6列出了测试过程中动物的运动损伤、震颤和僵直有关的评分方法。示例性的结果在图6A-6E中给出。数据表明，BMAA给药轻度加剧C9orf72-/-小鼠的ALS样运动表型，但不会影响这些小鼠不活动和步态异常的增加。
在另一个实验中，如上所述培养来自C9orf72-/-小鼠的运动神经元(也参见图7)，并用反义寡核苷酸处理，反义寡核苷酸选择性靶向含有有义链重复的RNA，并减少有义指向的RNA聚焦，而又不影响总体C9orf72表达。接着加入100mM BMAA进行处理。在第1天和第7天检测培养的运动神经元的存活和氧化应激。简言之，通过使用Life Technologies的CellROX Oxidative Stress Green试剂(5μM的最终浓度)测量细胞中活性氧种类(ROS)水平，并于37℃孵育30分钟，来评估胚胎干细胞衍生的运动神经元(如上所述)的氧化应激。温育后，将细胞用PBS洗涤三次，并使用标准微孔板荧光测定法测量荧光。示例性结果列于图7中。数据证明C9orf72-/-运动神经元暴露于BMAA导致氧化应激增强。
在另一个实验中，测定野生型和C9orf72-/-小鼠中的线粒体功能。简言之，使用DNAzol试剂(Invitrogen)通过分离DNA来测量胚胎干细胞衍生的运动神经元(如上所述)的线粒体与细胞核DNA的比率。使用Nanodrop2000分光光度计(Thermo Scientific)和NovaQUANT小鼠线粒体与核比率试剂盒(Novagen)，根据说明书计算得DNA的纯度和数量。用Seahorse Biosciences XFe96分析仪来评估胚胎干细胞衍生的运动神经元的线粒体呼吸。使用XFe96细胞外通量分析仪记录野生型小鼠的12次测量对首次测量的耗氧率百分比。前三次测量的平均值代表基础呼吸，添加寡霉素(1μM)后三次测量代表质子泄漏，基础呼吸和质子泄漏之间的差值代表ATP产量，加入FCCP(1μM)的三次测量代表最大呼吸，最大和基础呼吸的差值表示备用呼吸能力，加入鱼藤酮/抗霉素A(0.5μM)后的最后三次测量代表非线粒体呼吸。所有数据从至少三个独立的实验中收集，并以平均值±SEM报告。对野生型小鼠与C9orf72-/-小鼠进行统计学分析，其中*为P≤0.05，**为P≤0.01，***为P≤0.001。示例性的结果在图8中给出。
先前的报道已证明ATP消耗引发细胞内Na+的积累，导致病理性细胞肥大(LiangD.et al.,2007,Neurosurg.Focus 22(5):E2)。如图8所示，使用野生型和C9orf72-/-小鼠的干细胞(如上所述；也参见Wichterle H.等人，2002，Cell 110(3)：385-97)分化的运动神经元(如上所述；另参见Wichterle H.et al.,2002,Cell 110(3):385-97)，C9orf72-/-小鼠由于ATP的缺乏和/或细胞膜的破坏而表现出Na-K ATP酶泵的失效。相反，在野生型或C9orf72-/-神经元中没有观察到存活和氧化应激的差异(图8，上方)。有趣的是，与野生型运动神经元相比，在来自C9orf72-/-小鼠的运动神经元(图8，右上方)中观察到更大的线粒体与核DNA比值，而且线粒体呼吸率显著更低(P<0.0001)(图8左下方)。此外，与野生型相比，C9orf72-/-运动神经元的基础呼吸、ATP产量、最大呼吸、质子泄漏和备用呼吸能力均显著降低(图8，右下)。因此，来自C9orf72-/-小鼠的运动神经元表现出显著的线粒体功能障碍，这可能导致细胞损伤和肥大。
本实施例具体证明了C9orf72-/-小鼠存在ALS样运动缺陷。此外，这个例子强调，尽管BMAA通过AMPA/海人酸介导的谷氨酸兴奋性毒性通路杀死运动神经元，但暴露于BMAA不足以在体内诱导疾病。此外，暴露于BMAA仅轻度加重C9orf72-/-小鼠的ALS-疾病表型。因此，本文提供的数据表明，至少在一些实施例中，C9orf72-/-小鼠中C9orf72蛋白的损失不是ALS-FTD疾病的主要机制。
综上所述，本文公开的内容具体证明，根据实施例1制备的C9orf72-/-小鼠其C9orf72基因座被完全敲除。此外，如本文所述，C9orf72-/-小鼠在整个发育过程中形成了几种不同的表型，其特征在于例如显著的运动缺陷，免疫系统和线粒体功能的破坏。例如，C9orf72-/-小鼠发展出自身免疫表型，其特征在于血清中自身抗体浓度的显著增加，以及各种免疫细胞向脾脏、淋巴结、骨髓、肾脏和血液中渗透。有趣的是，本文描述的免疫分型数据说明，C9orf72基因产物在免疫系统内稳态和神经元健康中起关键作用。具体而言，C9orf72-/-小鼠中的脾肿大和淋巴结肿大是包括浆细胞、单核细胞、粒细胞以及F4/80+巨噬细胞(最显著的)在内的多种细胞群渗透的结果，这种情况始于8周龄并持续到60周龄。细胞因子组和分子谱分析数据强烈提示，C9orf72-/-小鼠中Th1/巨噬细胞活化途径增加。因此，本公开文本具体证明了，对于C9orf72而言，单倍剂量不足不太可能是ALS-FTD病理的主因，并且在C9orf72全敲除的非人类动物的综合表型分析中提供了C9orf72在免疫功能和体内稳态中所起的新作用。
对应语
已经描述了本发明的至少一个实施例的几个方面，本领域的技术人员应该理解，本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进为本公开的一部分，并且落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例，且本发明通过所附权利要求详细描述。
在权利要求中使用诸如“第一”，“第二”，“第三”等序数词语以修饰权利要求的要素，本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个权利要求要素有任何优先次序、优先级或者次序，或者方法施行的时间顺序，而仅用作标签来区分具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但是用作序数词使用)，以区分权利要求要素。
相反，除非有明确指出，否则说明书和权利要求书中的冠词“一”和“一个”应理解为包括复数指示物。如果一个，多于一个或所有的组成员存在于，用于或以其他方式与给定的产品或过程有关，则包括一个或多个组成员之间的“或”的权利要求或描述被认为是满足的，除非指出相反或从上下文中明显看出。本发明包括这样的实施例，其中该组正好一个成员存在于，用于或以其他方式与给定的产品或过程有关。本发明还包括其中多于一个或整个组成员存在于，用于或以其他方式与给定的产品或过程相关的实施例。此外，应该理解的是，本发明包括所有的变化，组合和排列，其中来自一个或多个列出的权利要求的一个或多个限制，元素、从句、描述性术语等被引入到另一个权利要求中，相同的基础权利要求(或相关的任何其他权利要求)，除非另外指出，或者除非对于本领域的普通技术人员来说显而易见会出现矛盾或不一致。在元素以列表的形式呈现的情况下(例如马库什式或类似的格式)，应该理解的是，元素的每个子组也被公开，并且可以从组中移除任何元素。应该理解，通常，在本发明或本发明的方面被称为包括特定元件、特征等的情况下，本发明的某些实施例或本发明的方面包括或基本上由这样的元件、特征等组成。为了简单化，这些实施例在每个情况下都没有在这里用很多的词语具体地阐述。还应该理解的是，本发明的任何实施例或方面可以明确地从权利要求中排除，而不管在说明书中是否列举了特定的排除。
本领域技术人员将认识到归因于在本文所述的分析或其他过程中获得的值的典型的偏差或误差标准。
本文引用的用于描述本发明的背景和提供关于其实践的附加细节的出版物，网站和其他参考材料通过引用并入本文。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 具有C9ORF72基因座破坏的非人类动物
<130> 32698 (10152-US01)
<150> 62/168,171
<151> 2015-05-29
<150> 62/232,658
<151> 2015-09-25
<150> 62/245,382
<151> 2015-10-23
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3198
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 1
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ttgcttactg ggataatatt cttggtccta gagtaaggca tatttgggct ccaaagacag 300
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tgtttacaat tatcctaagt actattgctg tcttttaaag atatgaatga tggaatatac 1860
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tgattcctgg tttacatgta ccacactgaa accctcgtta gctttacaga taaagtgtga 1980
gttgacttcc tgcccctctg tgttctgtgg tatgtccgat tacttctgcc acagctaaac 2040
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gaccatgatg gcttgtgaac taactgcaag gcactccgtc atggtaagcg agtaggtccc 3000
acctcctagt gtgccgctca ttgctttaca cagtagaatc ttatttgagt gctaattgtt 3060
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gaagcatgtg taaacactgt tatatatctt ttctcctaga tggggaattt tgaataaaat 3180
acctttgaaa ttctgtgt 3198
<210> 2
<211> 481
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr
20 25 30
Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys
35 40 45
Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn
50 55 60
His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile
65 70 75 80
Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser
85 90 95
Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu
100 105 110
Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His
115 120 125
Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile
130 135 140
Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu
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Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu
165 170 175
Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Lys Ser
180 185 190
His Ser Val Pro Glu Asp Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp
195 200 205
Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile
210 215 220
Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr
245 250 255
Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe
260 265 270
Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr
275 280 285
Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro
290 295 300
Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro
305 310 315 320
Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu
325 330 335
Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr
340 345 350
Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln
355 360 365
Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val
370 375 380
Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile
405 410 415
Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn
420 425 430
Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile
435 440 445
Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe
450 455 460
Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr
465 470 475 480
Phe
<210> 3
<211> 3435
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 3
cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac 60
agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc 120
cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc 180
ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc 240
gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg 300
cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg 360
gatgcaggga tgtcgactat ctgcccccca ccatctcctg ctgttgccaa gacagagatt 420
gctttaagtg gtgaatcacc cttgttggcg gctacctttg cttactggga taatattctt 480
ggtcctagag taaggcacat ttgggctcca aagacagacc aagtactcct cagtgatgga 540
gaaatcactt ttcttgccaa ccacactctg aatggagaaa ttcttcggaa tgcggagagt 600
ggggcaatag atgtaaagtt ttttgtctta tctgaaaagg gcgtcattat tgtttcatta 660
atcttcgacg ggaactggaa cggagatcgg agcacttacg gactatcaat tatactgccg 720
cagacggagc tgagtttcta cctcccactg cacagagtgt gtgttgacag gctaacgcac 780
atcattcgaa aaggaaggat atggatgcac aaggaaagac aagaaaatgt ccagaaaatt 840
gtcttggaag gcaccgagag gatggaagat cagggtcaga gtatcatccc tatgcttact 900
ggggaggtca tccctgtgat ggagctgctt gcgtctatga gatcacacag tgttcctgaa 960
gacctcgata tagctgatac agtactcaat gatgatgaca ttggtgacag ctgtcatgaa 1020
ggctttcttc tcaatgccat cagctcacat ctgcagacct gcggctgttc tgtggtggta 1080
ggcagcagtg cagagaaagt aaataagata gtaagaacac tgtgcctttt tctgacacca 1140
gcagagagga agtgctccag gctgtgtgaa gccgaatcgt cctttaaata cgaatctgga 1200
ctctttgtac aaggcttgct aaaggatgcg actggcagtt ttgtactacc tttccggcaa 1260
gttatgtatg ccccttatcc caccacacac atcgatgtgg atgtcaacac tgtcaagcag 1320
atgccaccgt gtcatgaaca tatttataat caacgcagat acatgaggtc agagctgaca 1380
gccttctgga gggcaacttc agaagaggac atggctcagg acaccatcat ctacacagat 1440
gagagcttca ctcctgattt gaatattttc caagatgtct tacacagaga cactctagtg 1500
aaagcctttc tggatcaggt cttccatttg aagcctggcc tgtctctcag gagtactttc 1560
cttgcacagt tcctcctcat tcttcacaga aaagccttga cactaatcaa gtacatagag 1620
gatgacacgc agaaggggaa aaagcccttt aagtctcttc ggaacctgaa gatagatctt 1680
gatttaacag cagagggcga ccttaacata ataatggctc tagctgagaa aattaagcca 1740
ggcctacact ctttcatctt cgggagacct ttctacacta gtgtccaaga acgtgatgtt 1800
ctaatgactt tttaaacatg tggtttgctc cgtgtgtctc atgacagtca cacttgctgt 1860
tacagtgtct cagcgctttg gacacatcct tcctccaggg tcctgccgca ggacacgtta 1920
cactacactt gtcagtagag gtctgtacca gatgtcaggt acatcgttgt agtgaatgtc 1980
tcttttccta gactagatgt accctcgtag ggacttatgt ttacaaccct cctaagtact 2040
agtgctgtct tgtaaggata cgaatgaagg gatgtaaact tcaccacaac tgctggttgg 2100
ttttgttgtt tttgtttttt gaaacttata attcatggtt tacatgcatc acactgaaac 2160
cctagttagc tttttacagg taagctgtga gttgactgcc tgtccctgtg ttctctggcc 2220
tgtacgatct gtggcgtgta ggatcacttt tgcaacaact aaaaactaaa gcactttgtt 2280
tgcagttcta cagaaagcaa cttagtctgt ctgcagattc gtttttgaaa gaagacatga 2340
gaaagcggag ttttaggtga agtcagttgt tggatcttcc tttatagact tagtccttta 2400
gatgtggtct gtatagacat gcccaaccat catgcatggg cactgaatat cgtgaactgt 2460
ggtatgcttt ttgttggttt attgtacttc tgtcaaagaa agtggcattg gtttttataa 2520
ttgttgccaa gttttaaggt taattttcat tatttttgag ccaaattaaa atgtgcacct 2580
cctgtgcctt tcccaatctt ggaaaatata atttcttggc agaaggtcag atttcagggc 2640
ccagtcactt tcgtctgact tccctttgca cagtccgcca tgggcctggc ttagaagttc 2700
ttgtaaacta tgccagagag tacattcgct gataaaatct tctttgcaga gcaggagagc 2760
ttcttgcctc tttcctttca tttctgcctg gactttggtg ttctccacgt tccctgcatc 2820
ctaaggacag caggagaact ctgaccccag tgctatttct ctaggtgcta ttgtggcaaa 2880
ctcaagcggt ccgtctctgt ccctgtaacg ttcgtacctt gctggctgtg aagtactgac 2940
tggtaaagct ccgtgctaca gcagtgtagg gtatacacaa acacaagtaa gtgttttatt 3000
taaaactgtg gacttagcat aaaaagggag actatattta ttttttacaa aagggataaa 3060
aatggaaccc tttcctcacc caccagattt agtcagaaaa aaacattcta ttctgaaagg 3120
tcacagtggt tttgacatga cacatcagaa caacgcacac tgtccatgat ggcttatgaa 3180
ctccaagtca ctccatcatg gtaaatgggt agatccctcc ttctagtgtg ccacaccatt 3240
gcttcccaca gtagaatctt atttaagtgc taagtgttgt ctctgctggt ttactctgtt 3300
gttttagaga atgtaagttg tatagtgaat aagttattga agcatgtgta aacactgtta 3360
tacatctttt ctcctagatg gggaatttgg aataaaatac ctttaaaatt caaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa aaaaa 3435
<210> 4
<211> 481
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 4
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr
20 25 30
Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys
35 40 45
Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn
50 55 60
His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile
65 70 75 80
Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser
85 90 95
Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu
100 105 110
Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His
115 120 125
Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile
130 135 140
Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu
145 150 155 160
Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu
165 170 175
Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Arg Ser
180 185 190
His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp
195 200 205
Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile
210 215 220
Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr
245 250 255
Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe
260 265 270
Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr
275 280 285
Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro
290 295 300
Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro
305 310 315 320
Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu
325 330 335
Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr
340 345 350
Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln
355 360 365
Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val
370 375 380
Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile
405 410 415
Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn
420 425 430
Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile
435 440 445
Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe
450 455 460
Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr
465 470 475 480
Phe
<210> 5
<211> 680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸-蛋白启动子
<400> 5
ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca 60
aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa 120
tgttttacta gagcccaccc ccctgcaact ctgagaccct ctggatttgt ctgtcagtgc 180
ctcactgggg cgttggataa tttcttaaaa ggtcaagttc cctcagcagc attctctgag 240
cagtctgaag atgtgtgctt ttcacagttc aaatccatgt ggctgtttca cccacctgcc 300
tggccttggg ttatctatca ggacctagcc tagaagcagg tgtgtggcac ttaacaccta 360
agctgagtga ctaactgaac actcaagtgg atgccatctt tgtcacttct tgactgtgac 420
acaagcaact cctgatgcca aagccctgcc cacccctctc atgcccatat ttggacatgg 480
tacaggtcct cactggccat ggtctgtgag gtcctggtcc tctttgactt cataattcct 540
aggggccact agtatctata agaggaagag ggtgctggct cccaggccac agcccacaaa 600
attccacctg ctcacaggtt ggctggctcg acccaggtgg tgtcccctgc tctgagccag 660
ctcccggcca agccagcacc 680
<210> 6
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸-Blimp1启动子 1kb
<400> 6
tgccatcatc acaggatgtc cttccttctc cagaagacag actggggctg aaggaaaagc 60
cggccaggct cagaacgagc cccactaatt actgcctcca acagctttcc actcactgcc 120
cccagcccaa catccccttt ttaactggga agcattccta ctctccattg tacgcacacg 180
ctcggaagcc tggctgtggg tttgggcatg agaggcaggg acaacaaaac cagtatatat 240
gattataact ttttcctgtt tccctatttc caaatggtcg aaaggaggaa gttaggtcta 300
cctaagctga atgtattcag ttagcaggag aaatgaaatc ctatacgttt aatactagag 360
gagaaccgcc ttagaatatt tatttcattg gcaatgactc caggactaca cagcgaaatt 420
gtattgcatg tgctgccaaa atactttagc tctttccttc gaagtacgtc ggatcctgta 480
attgagacac cgagtttagg tgactagggt tttcttttga ggaggagtcc cccaccccgc 540
cccgctctgc cgcgacagga agctagcgat ccggaggact tagaatacaa tcgtagtgtg 600
ggtaaacatg gagggcaagc gcctgcaaag ggaagtaaga agattcccag tccttgttga 660
aatccatttg caaacagagg aagctgccgc gggtcgcagt cggtgggggg aagccctgaa 720
ccccacgctg cacggctggg ctggccaggt gcggccacgc ccccatcgcg gcggctggta 780
ggagtgaatc agaccgtcag tattggtaaa gaagtctgcg gcagggcagg gagggggaag 840
agtagtcagt cgctcgctca ctcgctcgct cgcacagaca ctgctgcagt gacactcggc 900
cctccagtgt cgcggagacg caagagcagc gcgcagcacc tgtccgcccg gagcgagccc 960
ggcccgcggc cgtagaaaag gagggaccgc cgaggtgcgc gtcagtactg ctcagcccgg 1020
cagggacgcg ggaggatgtg gactgggtgg ac 1052
<210> 7
<211> 2008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸-Blimp1启动子 2kb
<400> 7
gtggtgctga ctcagcatcg gttaataaac cctctgcagg aggctggatt tcttttgttt 60
aattatcact tggacctttc tgagaactct taagaattgt tcattcgggt ttttttgttt 120
tgttttggtt tggttttttt gggttttttt tttttttttt tttttggttt ttggagacag 180
ggtttctctg tatatagccc tggcacaaga gcaagctaac agcctgtttc ttcttggtgc 240
tagcgccccc tctggcagaa aatgaaataa caggtggacc tacaaccccc cccccccccc 300
ccagtgtatt ctactcttgt ccccggtata aatttgattg ttccgaacta cataaattgt 360
agaaggattt tttagatgca catatcattt tctgtgatac cttccacaca cccctccccc 420
ccaaaaaaat ttttctggga aagtttcttg aaaggaaaac agaagaacaa gcctgtcttt 480
atgattgagt tgggcttttg ttttgctgtg tttcatttct tcctgtaaac aaatactcaa 540
atgtccactt cattgtatga ctaagttggt atcattaggt tgggtctggg tgtgtgaatg 600
tgggtgtgga tctggatgtg ggtgggtgtg tatgccccgt gtgtttagaa tactagaaaa 660
gataccacat cgtaaacttt tgggagagat gatttttaaa aatgggggtg ggggtgaggg 720
gaacctgcga tgaggcaagc aagataaggg gaagacttga gtttctgtga tctaaaaagt 780
cgctgtgatg ggatgctggc tataaatggg cccttagcag cattgtttct gtgaattgga 840
ggatccctgc tgaaggcaaa agaccattga aggaagtacc gcatctggtt tgttttgtaa 900
tgagaagcag gaatgcaagg tccacgctct taataataaa caaacaggac attgtatgcc 960
atcatcacag gatgtccttc cttctccaga agacagactg gggctgaagg aaaagccggc 1020
caggctcaga acgagcccca ctaattactg cctccaacag ctttccactc actgccccca 1080
gcccaacatc ccctttttaa ctgggaagca ttcctactct ccattgtacg cacacgctcg 1140
gaagcctggc tgtgggtttg ggcatgagag gcagggacaa caaaaccagt atatatgatt 1200
ataacttttt cctgtttccc tatttccaaa tggtcgaaag gaggaagtta ggtctaccta 1260
agctgaatgt attcagttag caggagaaat gaaatcctat acgtttaata ctagaggaga 1320
accgccttag aatatttatt tcattggcaa tgactccagg actacacagc gaaattgtat 1380
tgcatgtgct gccaaaatac tttagctctt tccttcgaag tacgtcggat cctgtaattg 1440
agacaccgag tttaggtgac tagggttttc ttttgaggag gagtccccca ccccgccccg 1500
ctctgccgcg acaggaagct agcgatccgg aggacttaga atacaatcgt agtgtgggta 1560
aacatggagg gcaagcgcct gcaaagggaa gtaagaagat tcccagtcct tgttgaaatc 1620
catttgcaaa cagaggaagc tgccgcgggt cgcagtcggt ggggggaagc cctgaacccc 1680
acgctgcacg gctgggctgg ccaggtgcgg ccacgccccc atcgcggcgg ctggtaggag 1740
tgaatcagac cgtcagtatt ggtaaagaag tctgcggcag ggcagggagg gggaagagta 1800
gtcagtcgct cgctcactcg ctcgctcgca cagacactgc tgcagtgaca ctcggccctc 1860
cagtgtcgcg gagacgcaag agcagcgcgc agcacctgtc cgcccggagc gagcccggcc 1920
cgcggccgta gaaaaggagg gaccgccgag gtgcgcgtca gtactgctca gcccggcagg 1980
gacgcgggag gatgtggact gggtggac 2008
<210> 8
<211> 8388
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的C9ORF72基因座的从lacZ至3'loxP位点的多核苷酸序列
<400> 8
ggtaccgatt taaatgatcc agtggtcctg cagaggagag attgggagaa tcccggtgtg 60
acacagctga acagactagc cgcccaccct ccctttgctt cttggagaaa cagtgaggaa 120
gctaggacag acagaccaag ccagcaactc agatctttga acggggagtg gagatttgcc 180
tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc 240
gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc 300
aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt 360
tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt 420
atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac 480
ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa 540
aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat 600
atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa 660
atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag 720
gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg 780
cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag 840
cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg 900
agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg 960
ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg 1020
ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct 1080
ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag 1140
aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg 1200
tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg 1260
ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg 1320
cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa 1380
tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc 1440
cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg 1500
atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa 1560
aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg 1620
atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt 1680
ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac 1740
ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc 1800
tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa 1860
caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa 1920
tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag 1980
ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa 2040
ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg 2100
caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt 2160
ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc 2220
accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag 2280
tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc 2340
gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt 2400
gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg 2460
ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg 2520
tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt 2580
ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg 2640
attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg 2700
ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca 2760
ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg 2820
cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc 2880
tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc 2940
acatggctga atatcgacgg tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg 3000
tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt 3060
caaaaataat aataaccggg caggggggat ctaagctcta gataagtaat gatcataatc 3120
agccatatca catctgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 3180
aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 3240
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 3300
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cccccggcta 3360
gagtttaaac actagaacta gtggatcccc gggctcgata actataacgg tcctaaggta 3420
gcgactcgag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgcat ggcctccgcg 3480
ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga 3540
cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg 3600
ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt 3660
gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc 3720
ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa 3780
ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt 3840
gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct ggccggggct 3900
ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt 3960
agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cagcaaaatg 4020
gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga ggtcgttgaa 4080
acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt cgctaatgcg 4140
ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt 4200
ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg 4260
ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac 4320
ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt 4380
ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc 4440
cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg gttttatgta 4500
cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg 4560
tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt 4620
ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag 4680
acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag 4740
gaactaaacc atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 4800
ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 4860
cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 4920
cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 4980
cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 5040
gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 5100
catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 5160
ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 5220
tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 5280
caaggcgcgc atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 5340
gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 5400
ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 5460
cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 5520
cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat ccgctgtaag tctgcagaaa 5580
ttgatgatct attaaacaat aaagatgtcc actaaaatgg aagtttttcc tgtcatactt 5640
tgttaagaag ggtgagaaca gagtacctac attttgaatg gaaggattgg agctacgggg 5700
gtgggggtgg ggtgggatta gataaatgcc tgctctttac tgaaggctct ttactattgc 5760
tttatgataa tgtttcatag ttggatatca taatttaaac aagcaaaacc aaattaaggg 5820
ccagctcatt cctcccactc atgatctata gatctataga tctctcgtgg gatcattgtt 5880
tttctcttga ttcccacttt gtggttctaa gtactgtggt ttccaaatgt gtcagtttca 5940
tagcctgaag aacgagatca gcagcctctg ttccacatac acttcattct cagtattgtt 6000
ttgccaagtt ctaattccat cagacctcga cctgcagccc ctagtcgagc gccagtagca 6060
gcacccacgt ccaccttctg tctagtaatg tccaacacct ccctcagtcc aaacactgct 6120
ctgcatccat gtggctccca tttatacctg aagcacttga tggggcctca atgttttact 6180
agagcccacc cccctgcaac tctgagaccc tctggatttg tctgtcagtg cctcactggg 6240
gcgttggata atttcttaaa aggtcaagtt ccctcagcag cattctctga gcagtctgaa 6300
gatgtgtgct tttcacagtt caaatccatg tggctgtttc acccacctgc ctggccttgg 6360
gttatctatc aggacctagc ctagaagcag gtgtgtggca cttaacacct aagctgagtg 6420
actaactgaa cactcaagtg gatgccatct ttgtcacttc ttgactgtga cacaagcaac 6480
tcctgatgcc aaagccctgc ccacccctct catgcccata tttggacatg gtacaggtcc 6540
tcactggcca tggtctgtga ggtcctggtc ctctttgact tcataattcc taggggccac 6600
tagtatctat aagaggaaga gggtgctggc tcccaggcca cagcccacaa aattccacct 6660
gctcacaggt tggctggctc gacccaggtg gtgtcccctg ctctgagcca gctcccggcc 6720
aagccagcac catgggaacc cccaagaaga agaggaaggt gcgtaccgat ttaaattcca 6780
atttactgac cgtacaccaa aatttgcctg cattaccggt cgatgcaacg agtgatgagg 6840
ttcgcaagaa cctgatggac atgttcaggg atcgccaggc gttttctgag catacctgga 6900
aaatgcttct gtccgtttgc cggtcgtggg cggcatggtg caagttgaat aaccggaaat 6960
ggtttcccgc agaacctgaa gatgttcgcg attatcttct atatcttcag gcgcgcggtc 7020
tggcagtaaa aactatccag caacatttgg gccagctaaa catgcttcat cgtcggtccg 7080
ggctgccacg accaagtgac agcaatgctg tttcactggt tatgcggcgg atccgaaaag 7140
aaaacgttga tgccggtgaa cgtgcaaaac aggctctagc gttcgaacgc actgatttcg 7200
accaggttcg ttcactcatg gaaaatagcg atcgctgcca ggatatacgt aatctggcat 7260
ttctggggat tgcttataac accctgttac gtatagccga aattgccagg atcagggtta 7320
aagatatctc acgtactgac ggtgggagaa tgttaatcca tattggcaga acgaaaacgc 7380
tggttagcac cgcaggtgta gagaaggcac ttagcctggg ggtaactaaa ctggtcgagc 7440
gatggatttc cgtctctggt gtagctgatg atccgaataa ctacctgttt tgccgggtca 7500
gaaaaaatgg tgttgccgcg ccatctgcca ccagccagct atcaactcgc gccctggaag 7560
ggatttttga agcaactcat cgattgattt acggcgctaa ggtaaatata aaatttttaa 7620
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttaggat gactctggtc 7680
agagatacct ggcctggtct ggacacagtg cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc 7740
gcgctggagt ttcaataccg gagatcatgc aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg 7800
tcatgaacta tatccgtaac ctggatagtg aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag 7860
atggcgattg atctagataa gtaatgatca taatcagcca tatcacatct gtagaggttt 7920
tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa 7980
ttgttgttgt taaacctgcc ctagttgcgg ccaattccag ctgagcgtga gctcaccatt 8040
accagttggt ctggtgtcaa aaataataat aaccgggcag gggggatcta agctctagat 8100
aagtaatgat cataatcagc catatcacat ctgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 8160
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 8220
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 8280
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 8340
tctggatcct cgacataact tcgtataatg tatgctatac gaagttat 8388
<210> 9
<211> 17210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的C9ORF72基因座的从外显子1a至3'UTR的多核苷酸序列
<400> 9
cgtttgtagt gacagccatc ccaattgccc tttccttcta ggtggaaagt ggtgtctaga 60
cagtccaggg agggtgtgcg agggaggtgc gttttggttg cctcagctcg caacttaact 120
ccacaacggt gaccaaggac aaaagaagga aacaagactg cagagatccg caccggggag 180
ccctgcagat tctgggtctg ctgtggactg ggggcgggac tgcgactggg cgggcctggg 240
ggcgtgtccg gggcggggcg gtcccggggc ggggcccgga gcgggctgcg gttgcggtcc 300
ctgcgccggc ggtgaaggcg cagcagcggc gagtgggtga gtgagacgcg cgggcggagg 360
ggggctgctg ccacggtcgg ctcgcgggcc ggccggctcc gggtaccagc ggggtttttt 420
tctccttcga ggtgaactcc tccctgtccc ccgggcgaaa gagcccttgg ccttgcagga 480
gttgcggggg ccgcggcggt gcggagggga tggggatggg cctcatcttt gctgtccgcc 540
cgcgctcccc gatcccgacc cggagcgtct cccgggccct tgagggaacc ctccgggagt 600
acggcgagcg cggcccccac cgccacaagc ctgggcccca ggggcctggc ccggcgacag 660
ctggtgggtc ctgcgaccca gtcaggtctc ccgagggtcc ccgcccggga ggagaaagcg 720
ccggtgggat ggagtaagga cggacagaac aacacgcagg caggatttcg cagaagtttg 780
caaggagtgc ggatgcccac ttacatgggc tgctactctt accaggttgt tccccagttc 840
tgtgggacgt gacctggttg cctcacagct ccgcggttgt acagacttat taaaggaagt 900
gaccattgtg acttgggcat cacttgactg atggtaatca gttgcagaga gagaagtgca 960
ctgattaagt ctgtccacac agggtctgtc tggccaggag tgcatttgcc tgggagggat 1020
tggttgcgct ttctggtgtg gggactatta ggctcttgta gagttttgtc ccggcagatg 1080
gataaatttc ttgttacact gttcccgttc gtcaccagtt gagaaaaacg ggtacacagt 1140
ctgtctcagt agtactttta ctttatatta agggcccaaa agggactgga aaatacttta 1200
agatagaatc gttagtccac ttggaaaact taaaatatga gagagagagg ggggggggag 1260
agagagagag agagagagag agaaaggaag gaagaaggag gaagaggagg aggaaagaga 1320
ttgagattat gttaataata tggaatcaga atatttgaaa tatagtaagc gtcccctcag 1380
ttaaagagga cattccagga ggcccccagt atagcctgaa atctcaggaa acgcctacat 1440
acacccatcg tgtggatata ggtgttttcc cttcattaca tttcatacac agatgttaaa 1500
gtttagaaag taggcacaat aagagattac aaataactga taataaagtc gagccattgc 1560
agctgctctg taaaagtcct gtgaatgtga tcgctttgtg tttcaaagta acttactgta 1620
cttcacccct gttaagcaaa acaagattca cctgaacgca ggcaccttgg taccttggca 1680
gacaccagat ctgataacca agaggatgga gaagtagtgg cagacagtgt ggagagcatg 1740
aatatgctag acaaaagggt gaatcataac ctaggagcag aaagcaggta tttcatcatc 1800
ctccacagta aaaacctatg tcacgtaaaa aacctacaag tagtttttct tttactcttt 1860
ttgaatgaaa gcttgctaca ggcactgaaa gttaaaataa tctgtggatc aggaggaaca 1920
ggggttttct gtctgagtca ctgctgacta gcacctcagt gaccattggc actgtgggaa 1980
accccagagt cagttggaaa cttcgaaact aaaggtgacg gtgttcttat ttcatagaac 2040
acaaaaaata agaggggtta cagcctgcgc tgcagactgg acattcaaca agcatttaaa 2100
tttctgggag acaaatgtaa atataacttt aaaagttggt aaaatactct gtttggctat 2160
gttggccatc caatgtttgc ttttagaaaa tgactgaatg gataaaacgt ctatcttttg 2220
agcctgccct agacccccat gttgagtgaa tactgtccaa gtgttaggtt agccggcctg 2280
agaaacttgg atctaggcaa gatggcacag tcctggtgtc atgagtatgc atgtgagttt 2340
tggctgaaat tgaacatttg tagagaatga caaaggctgg tctggcaagt agtccactgt 2400
ctttacagtg gtcttggtta gttcctgttt ggctgagagg gctggttgat ggctgtcctg 2460
cccctcttcc cacaagtgga agccttatgg tataattctt gatcacagta gcagtaggca 2520
aatgaacttc ctcaaagcag cctggaaagc tgattttttt ttctttcttt ctcttttttt 2580
tttttttttc acaaggttaa agaaaaaaca aagggcttca aatgtgccag tctgctaaca 2640
gtgttaacat gtttattaac ataaataaac tttattagtt tttggaagta ttggttaagc 2700
cctcgtgacc cctgaactcg gtttatagag tgatgagtcg tagcctcact ctggtttgga 2760
ctctggcttc tctcagaaga ctctgtggct aatgttaacc ttctgaagta gccagaaaac 2820
atataagcaa aagtctgtga ggttgaaatg aattttttgg ccacatttgt atatgggttc 2880
ccaccaatgc taacttcagg tgttagtaat atcagactca cagcttccct gattacactt 2940
cgctataaga ctttattttt taggtcatag gaatttcccc tttttcatga ttcctaaatc 3000
atgaaataac atagtctaaa aatacggtat tcctgaaata aacaatttct aagttttaag 3060
ctgcgtgcta ttctgaacag tctgatgccc tcttgtagct tttactgtgt cctaccccgg 3120
gcatggttga ttcctttgtc caaacatctg tctgttgtat ccacactgga ttgcaccacc 3180
tgcgtgctag tcagtcactc agacatttta gttataaggt agcttatatt tactccttat 3240
tttatttaat aatggcctca tagcaaggcg gtaatgatac tggtaatttg ggtttgctta 3300
agaggagcca tgaagtagtt ttaaatgaaa aggtgaaaat tcccactata gtttggaggg 3360
ggaggctata ctggtactac tacgattcac ggtaagacta aatcttctgt gaaattatga 3420
aggagaaaaa gttacactgg tctggtcttg ctgttggatt aattttatag ttataaccac 3480
tgtacatgat aaataaccct aaaacaatga atttgtaggt ggatggcata atctgaaaac 3540
catgttctga gcagttgatg gcagcaggct gtgctggaag tgttaggcat atttatagat 3600
ttcagcccaa gttctgaaga ggctggagag atggctcagt ggttaagagt gcttgctatt 3660
gcagaggacc taggttcctc tacaggcacc aggcaagcgt gggacacact gagatacata 3720
cagacaaaac ataaaattaa ataaattgtg cataataata ctagtaatat atgagtaaaa 3780
taaggataaa tacacatcat aattaaataa ataaattgta aagttcccta gaagtgaggg 3840
tcaccaagcc attcacaaga tggctgcgct gatgcaggga tatatgtgaa ctagaaaaag 3900
gtcaaactta acagagaagt tccaaggcat gctactgcag gcttggctag catgcttgac 3960
ctgcagaaat gctgacggcc actgggaggt tttcacaaat gaggaattag aagaactttt 4020
tttactaatc tccagaaaaa aaaaagggaa gaagaaactg aagcagcctg tgatgtggac 4080
cagaaacgca gtgacagtaa catgtgtgac attgcaaagg catgaaagga cagagctgtg 4140
gaatacagac ctcaggtgga gctcagcata gagtcattcg gggattatgc ctgctgcagc 4200
aacaaaagga tgagctcaaa agagacaccg acttctgaat gcagtgggtg tttgttttgt 4260
tttgtttcaa atgaattggg cagaaaactt tccagctgtg gaagcttctg aaccgtccct 4320
tgctgctgac atctaagcgt ccgctgtgtc ccagctcagt gatctagggt cttccaaaca 4380
gatggtccgg tgctgagcac tttgaatctc aatcctgagt ttctaccacg cctttggcca 4440
tttaattccc agataaaaga cacatacaac ctttatattt ataataaacc ttagtcagca 4500
caagagctga gcaaatatct gtcctctatg ctattatatc tattacccag ccaataaccc 4560
cattctataa tttgctgtgc ttcatctggg ctgctcttaa cttcagtcag ccagcccacg 4620
tggccattat tttaagattt ttttacccca tagtgtcttc tcactttact ttacattttt 4680
ctctctctcc tcatggttct cctctgaccc caagcctagg aaccctaaac cccacccatg 4740
tctcttctgc ccatctattg gctgtaggca tctttattca ccaatcagga taacttggag 4800
gcaaggttaa gtagtctcct gggtctaggt gctgtctctg ggagcaacca gtatttagca 4860
tagcaaaaga ccagacctcc acaatgatca ctctgaccat cggggcagaa ggcacctact 4920
agcctgtgcc actcacctca ctttgttgaa tcacatctta tcctgtagtg tgtatcactg 4980
cctgttatca caggaaaaag tgagtcccat caaataagat gtttcagaaa gagaccatgt 5040
tcatataatt atcattctgg taagctttta atggttatat tttgttatta atctctttgt 5100
tcctattttg caaattatac cttacagtaa atatatatgc atccaatggg gtctttgaat 5160
tcctccccgg ggagtaggag gactctttga ggatgggctg catttaaagc taaacaacgc 5220
aacatgacct ttagtcctta tagatagcct agagatgaga ctaaataaaa gaaatggtat 5280
ataatgcttt aagtttccca atcagcttaa aagcttttcc tataaatctt taagattatg 5340
ctctggggct caatactgct tcaagaaggg cttttctttt gtatttagaa ttattcacct 5400
ttttaaacaa aaggagaaaa tggaatagaa atatgtttgc aacataattt tatgactatg 5460
tgtttatttc gcgtgttctg tgggcctgca gtttgctgct gttaatgagg acaacagtgg 5520
caccaataca gtttccactc agattacatt ctctgttccc tttctgaaag ctgccctctc 5580
cactgggccc aaaagagtca gtatcttaaa caagctgtac aacttagata accatggtct 5640
cttcagacta gttaattgac atatattaaa aagtaaatag taccaaagtg aatttctgaa 5700
attaaaaatg aacatttaaa aactctaggt aaactattcc ttagagttaa gtgttttgcc 5760
aagttctgta atcataatat gatagaaacg ctcactcagc attctaaata tagaagttac 5820
tccttcgcat gacactctaa ttcttgataa ggtggagaaa gagagagaga gagggggaga 5880
gacagaaaat atggtggttc aaggaccatt tgagggaatt agttatgttc ttccgtcctc 5940
tgtggatctt aggggttgaa tacagtcatt gagctcggtg gatggctgtc ctgttgaaag 6000
gtctgcccag cagagcaaat agactttttt atttacatgg acatccgttt gtgactaatc 6060
taatgttcac tcccaaagta atcacacaga cagagaggta gcttccttca gtactcttac 6120
cttacatgaa tcctaccatt ttgttatttt ttttccactt taaatctttg attatgtgtt 6180
tttaattaga aaatttgcat acaaatttcc atacagtatg tagaattgac tgtgtttgaa 6240
tgggtgaaga tccacatgtg taaccctagc tctggactgg ctctgagctt gtttgctctt 6300
ctcttttgtg ttctgagtaa ctgaaactct ttcattttag cagcttagta tgcgcccttc 6360
acattgctgt gctgcctgct gcactaacat tactcctttg cttatgttcc ccttcctgat 6420
tcagtgtcat tttaagcagt agtactggac ctcagtacct tagccggagc tcactgaggt 6480
gacagggctg aggctctgct gctgtctttt gagcttacct ctttttaatg ttttatggta 6540
tttctgctgc caggtttggg ggttttgttt tgttttgttt tttgtttttt gtttttttta 6600
attttctagg aacacctaga aaacacaaac taggaaactt aaaagagcag cgtcttgttc 6660
cctgcgttct agaaagtcca agcctaatgc cagtgtcatg gttgtcagga acatgagcct 6720
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tggtactctc tctgtccacg gtcagcatcc cagtccctgc cctttatctt tgtgcagccg 6840
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gcagtcattg gattagagcc catccttccc tcggatggcc catttgacct aattttacgt 6960
atttgtaact aaggtcccat ttacttacac agggccctcc ccttcctgtt ttgttcttta 7020
gctgaaatgg tttggagacc aaatatccaa tcattacaat tgtgcacaag ctatgttcat 7080
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gcagggatgg gtaccgattt aaatgatcca gtggtcctgc agaggagaga ttgggagaat 7320
cccggtgtga cacagctgaa cagactagcc gcccaccctc cctttgcttc ttggagaaac 7380
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cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta cgatgcgccc 7560
atctacacca acgtgaccta tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc cacggagaat 7620
ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca ggaaggccag 7680
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gtcggttacg gccaggacag tcgtttgccg tctgaatttg acctgagcgc atttttacgc 7800
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gacggcacgc tgattgaagc agaagcctgc gatgtcggtt tccgcgaggt gcggattgaa 8280
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atgaagcaga acaactttaa cgccgtgcgc tgttcgcatt atccgaacca tccgctgtgg 8460
tacacgctgt gcgaccgcta cggcctgtat gtggtggatg aagccaatat tgaaacccac 8520
ggcatggtgc caatgaatcg tctgaccgat gatccgcgct ggctaccggc gatgagcgaa 8580
cgcgtaacgc gaatggtgca gcgcgatcgt aatcacccga gtgtgatcat ctggtcgctg 8640
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gatccttccc gcccggtgca gtatgaaggc ggcggagccg acaccacggc caccgatatt 8760
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gatgaaaacg gcaacccgtg gtcggcttac ggcggtgatt ttggcgatac gccgaacgat 9060
cgccagttct gtatgaacgg tctggtcttt gccgaccgca cgccgcatcc agcgctgacg 9120
gaagcaaaac accagcagca gtttttccag ttccgtttat ccgggcaaac catcgaagtg 9180
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gatggtaagc cgctggcaag cggtgaagtg cctctggatg tcgctccaca aggtaaacag 9300
ttgattgaac tgcctgaact accgcagccg gagagcgccg ggcaactctg gctcacagta 9360
cgcgtagtgc aaccgaacgc gaccgcatgg tcagaagccg ggcacatcag cgcctggcag 9420
cagtggcgtc tggcggaaaa cctcagtgtg acgctccccg ccgcgtccca cgccatcccg 9480
catctgacca ccagcgaaat ggatttttgc atcgagctgg gtaataagcg ttggcaattt 9540
aaccgccagt caggctttct ttcacagatg tggattggcg ataaaaaaca actgctgacg 9600
ccgctgcgcg atcagttcac ccgtgcaccg ctggataacg acattggcgt aagtgaagcg 9660
acccgcattg accctaacgc ctgggtcgaa cgctggaagg cggcgggcca ttaccaggcc 9720
gaagcagcgt tgttgcagtg cacggcagat acacttgctg atgcggtgct gattacgacc 9780
gctcacgcgt ggcagcatca ggggaaaacc ttatttatca gccggaaaac ctaccggatt 9840
gatggtagtg gtcaaatggc gattaccgtt gatgttgaag tggcgagcga tacaccgcat 9900
ccggcgcgga ttggcctgaa ctgccagctg gcgcaggtag cagagcgggt aaactggctc 9960
ggattagggc cgcaagaaaa ctatcccgac cgccttactg ccgcctgttt tgaccgctgg 10020
gatctgccat tgtcagacat gtataccccg tacgtcttcc cgagcgaaaa cggtctgcgc 10080
tgcgggacgc gcgaattgaa ttatggccca caccagtggc gcggcgactt ccagttcaac 10140
atcagccgct acagtcaaca gcaactgatg gaaaccagcc atcgccatct gctgcacgcg 10200
gaagaaggca catggctgaa tatcgacggt ttccatatgg ggattggtgg cgacgactcc 10260
tggagcccgt cagtatcggc ggaattccag ctgagcgccg gtcgctacca ttaccagttg 10320
gtctggtgtc aaaaataata ataaccgggc aggggggatc taagctctag ataagtaatg 10380
atcataatca gccatatcac atctgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 10440
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 10500
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 10560
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc 10620
ccccggctag agtttaaaca ctagaactag tggatccccg ggctcgataa ctataacggt 10680
cctaaggtag cgactcgaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatatgcatg 10740
gcctccgcgc cgggttttgg cgcctcccgc gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc 10800
cacgtcagac gaagggcgca gcgagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc 10860
ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg 10920
acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga 10980
aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg 11040
attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc 11100
gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg 11160
gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc 11220
aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc 11280
agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga atggaagacg cttgtgaggc gggctgtgag 11340
gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc 11400
gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg 11460
acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc ggtttgtcgt ctgttgcggg ggcggcagtt 11520
atggcggtgc cgttgggcag tgcacccgta cctttgggag cgcgcgccct cgtcgtgtcg 11580
tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg cagggtgggg ccacctgccg gtaggtgtgc 11640
ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg gttcgggcct agggtaggct ctcctgaatc 11700
gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg 11760
ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt 11820
tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa 11880
tatgtaattt tcagtgttag actagtaaat tgtccgctaa attctggccg tttttggctt 11940
ttttgttaga cgtgttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga 12000
caaggtgagg aactaaacca tgggatcggc cattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 12060
tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 12120
ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 12180
cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 12240
cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 12300
gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 12360
gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 12420
cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 12480
tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 12540
cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgatgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 12600
ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 12660
gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 12720
gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 12780
gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaggggatc cgctgtaagt 12840
ctgcagaaat tgatgatcta ttaaacaata aagatgtcca ctaaaatgga agtttttcct 12900
gtcatacttt gttaagaagg gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga 12960
gctacggggg tgggggtggg gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt 13020
tactattgct ttatgataat gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca 13080
aattaagggc cagctcattc ctcccactca tgatctatag atctatagat ctctcgtggg 13140
atcattgttt ttctcttgat tcccactttg tggttctaag tactgtggtt tccaaatgtg 13200
tcagtttcat agcctgaaga acgagatcag cagcctctgt tccacataca cttcattctc 13260
agtattgttt tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagcccc tagtcgagcg 13320
ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca 13380
aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa 13440
tgttttacta gagcccaccc ccctgcaact ctgagaccct ctggatttgt ctgtcagtgc 13500
ctcactgggg cgttggataa tttcttaaaa ggtcaagttc cctcagcagc attctctgag 13560
cagtctgaag atgtgtgctt ttcacagttc aaatccatgt ggctgtttca cccacctgcc 13620
tggccttggg ttatctatca ggacctagcc tagaagcagg tgtgtggcac ttaacaccta 13680
agctgagtga ctaactgaac actcaagtgg atgccatctt tgtcacttct tgactgtgac 13740
acaagcaact cctgatgcca aagccctgcc cacccctctc atgcccatat ttggacatgg 13800
tacaggtcct cactggccat ggtctgtgag gtcctggtcc tctttgactt cataattcct 13860
aggggccact agtatctata agaggaagag ggtgctggct cccaggccac agcccacaaa 13920
attccacctg ctcacaggtt ggctggctcg acccaggtgg tgtcccctgc tctgagccag 13980
ctcccggcca agccagcacc atgggaaccc ccaagaagaa gaggaaggtg cgtaccgatt 14040
taaattccaa tttactgacc gtacaccaaa atttgcctgc attaccggtc gatgcaacga 14100
gtgatgaggt tcgcaagaac ctgatggaca tgttcaggga tcgccaggcg ttttctgagc 14160
atacctggaa aatgcttctg tccgtttgcc ggtcgtgggc ggcatggtgc aagttgaata 14220
accggaaatg gtttcccgca gaacctgaag atgttcgcga ttatcttcta tatcttcagg 14280
cgcgcggtct ggcagtaaaa actatccagc aacatttggg ccagctaaac atgcttcatc 14340
gtcggtccgg gctgccacga ccaagtgaca gcaatgctgt ttcactggtt atgcggcgga 14400
tccgaaaaga aaacgttgat gccggtgaac gtgcaaaaca ggctctagcg ttcgaacgca 14460
ctgatttcga ccaggttcgt tcactcatgg aaaatagcga tcgctgccag gatatacgta 14520
atctggcatt tctggggatt gcttataaca ccctgttacg tatagccgaa attgccagga 14580
tcagggttaa agatatctca cgtactgacg gtgggagaat gttaatccat attggcagaa 14640
cgaaaacgct ggttagcacc gcaggtgtag agaaggcact tagcctgggg gtaactaaac 14700
tggtcgagcg atggatttcc gtctctggtg tagctgatga tccgaataac tacctgtttt 14760
gccgggtcag aaaaaatggt gttgccgcgc catctgccac cagccagcta tcaactcgcg 14820
ccctggaagg gatttttgaa gcaactcatc gattgattta cggcgctaag gtaaatataa 14880
aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttaggatg 14940
actctggtca gagatacctg gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag 15000
atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg agatcatgca agctggtggc tggaccaatg 15060
taaatattgt catgaactat atccgtaacc tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc 15120
tgctggaaga tggcgattga tctagataag taatgatcat aatcagccat atcacatctg 15180
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 15240
tgaatgcaat tgttgttgtt aaacctgccc tagttgcggc caattccagc tgagcgtgag 15300
ctcaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa aataataata accgggcagg ggggatctaa 15360
gctctagata agtaatgatc ataatcagcc atatcacatc tgtagaggtt ttacttgctt 15420
taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg 15480
ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 15540
caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 15600
cttatcatgt ctggatcctc gacataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattgc 15660
tagcgtgtct cagcagtgtg tgggcacatc cttcctcccg agtcctgctg caggacaggg 15720
tacactacac ttgtcagtag aagtctgtac ctgatgtcag gtgcatcgtt acagtgaatg 15780
actcttccta gaatagatgt actcttttag ggccttatgt ttacaattat cctaagtact 15840
attgctgtct tttaaagata tgaatgatgg aatatacact tgaccataac tgctgattgg 15900
ttttttgttt tgttttgttt gttttcttgg aaacttatga ttcctggttt acatgtacca 15960
cactgaaacc ctcgttagct ttacagataa agtgtgagtt gacttcctgc ccctctgtgt 16020
tctgtggtat gtccgattac ttctgccaca gctaaacatt agagcattta aagtttgcag 16080
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gcagagctgt aggtgaaatc agttgttagc ccttccttta tagacgtagt ccttcagatt 16200
cggtctgtac agaaatgccg aggggtcatg catgggccct gagtatcgtg acctgtgaca 16260
agttttttgt tggtttattg tagttctgtc aaagaaagtg gcatttgttt ttataattgt 16320
tgccaacttt taaggttaat tttcattatt tttgagccga attaaaatgc gcacctcctg 16380
tgcctttccc aatcttggaa aatataattt cttggcagag ggtcagattt cagggcccag 16440
tcactttcat ctgaccaccc tttgcacggc tgccgtgtgc ctggcttaga ttagaagtcc 16500
ttgttaagta tgtcagagta cattcgctga taagatcttt gaagagcagg gaagcgtctt 16560
gcctctttcc tttggtttct gcctgtactc tggtgtttcc cgtgtcacct gcatcatagg 16620
aacagcagag aaatctgacc cagtgctatt tttctaggtg ctactatggc aaactcaagt 16680
ggtctgtttc tgttcctgta acgttcgact atctcgctag ctgtgaagta ctgattagtg 16740
gagttctgtg caacagcagt gtaggagtat acacaaacac aaatatgtgt ttctatttaa 16800
aactgtggac ttagcataaa aagggagaat atatttattt tttacaaaag ggataaaaat 16860
gggccccgtt cctcacccac cagatttagc gagaaaaagc tttctattct gaaaggtcac 16920
ggtggctttg gcattacaaa tcagaacaac acacactgac catgatggct tgtgaactaa 16980
ctgcaaggca ctccgtcatg gtaagcgagt aggtcccacc tcctagtgtg ccgctcattg 17040
ctttacacag tagaatctta tttgagtgct aattgttgtc tttgctgctt tactgtgttg 17100
ttatagaaaa tgtaagctgt acagtgaata agttattgaa gcatgtgtaa acactgttat 17160
atatcttttc tcctagatgg ggaattttga ataaaatacc tttgaaattc 17210

Claims (42)

1.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组中包含C9orf72基因座中整个编码序列的缺失。
2.根据权利要求1所述的啮齿动物，其中所述缺失至少包含外显子2-11全部或部分地缺失。
3.根据前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述C9orf72基因座包含报告基因。
4.根据权利要求3所述的啮齿动物，其中所述报告基因可操作地连接至C9orf72启动子。
5.根据权利要求4所述的啮齿动物，其中所述C9orf72启动子是内源性启动子。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的啮齿动物，其中所述C9orf72基因座缺少包含外显子2的编码部分至外显子11的编码部分的C9orf72基因组序列，并且包含报告基因。
7.根据权利要求6所述的啮齿动物，其中所述报告基因可操作地连接至所述C9orf72基因座的外显子1。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因选自由以下组成的组：lacZ、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed以及MmGFP。
9.根据前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
10.根据权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是纯合性缺失。
11.根据权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是杂合性缺失。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的啮齿动物，其中任选地在约36周龄后或者在约40周龄后，所述啮齿动物在发育期间出现ALS和/或FTD的一种或多种症状。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物在约36周龄后出现进行性运动缺陷，在约40周龄后出现下运动神经元异常，和/或在约36周龄后出现体重下降。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物在发育期间出现以下一项或多项症状：
(i)运动神经元的线粒体功能障碍，其中所述线粒体功能障碍的特征在于线粒体呼吸作用、基础呼吸作用、最大呼吸作用、备用呼吸能力、ATP产生和质子漏中的一种或多种的下降；或者特征在于：相比于对照或参考啮齿动物的运动神经元的线粒体与核DNA的比值，所述啮齿动物的运动神经元的线粒体与核DNA的比值增大；
(ii)任选地在约35周龄后或者在约35-41周龄后，肾小球性肾炎的一种或多种症状；
(iii)在约8周龄后，脾肿大；
(iv)在约8周龄后，淋巴结病，其中任选在地约12-18周龄后所述淋巴结病可被感知到；
(v)浆细胞、单核细胞、粒细胞和F4/80+巨噬细胞中的一种或多种的浸润，其中任选地在约8周龄和多达60周龄后可检测到所述浸润；
(vi)在约35周龄后，F4/80+巨噬细胞浸润到肾内；
(vii)在约8周龄后，IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α和MCP-1中的一种或多种的血清细胞因子水平升高；
(viii)与参考或对照非人类动物相比，在约8周龄后，血清IL-12水平增加到约6倍或更多；
(ix)在约28-35周龄后，以以下为特征的肾病：基膜增厚、管型形成、免疫复合物沉积、膜增生性肾小球肾炎、肾间质单核细胞炎症、肾小球硬化、嗜碱小管或其组合；
(x)在约28-35周龄后，脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个中的髓样树突状细胞群增加，其中任选地所述髓样树突状细胞群被表征为CD45+CD11b+CD11c+MHCII+；
(xi)在约8周龄后，一种或多种自身抗体的血清水平增加，其中任选地所述一种或多种自身抗体选自抗类风湿因子(抗RF)抗体、抗dsDNA抗体、抗核抗体(ANA)、抗Smith(抗-Sm)抗体、抗心磷脂抗体及其组合；
(xii)在约28-35周龄后，脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个中的F4/80+巨噬细胞水平增加，其中任选地所述F4/80+巨噬细胞被表征为CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-；
(xiii)在约28-35周龄后，脾、淋巴结、骨髓、肾和血液中的一个或多个中的T细胞群增加，其中任选地所述T细胞群被表征为CD8+CD44+、CD8+CD69+、CD8+PD1+、CD4+CD44+、CD4+CD69+或CD4+PD1+；
(xiv)在约28-35周龄后，脾和/或淋巴结中的调节性T细胞群增加，并且其中所述调节性T细胞群被表征为CD4+FoxP3+；或者在约26周龄后，脾、淋巴结和/或血液中的滤泡辅助T(Tfh)细胞增加，并且其中所述Tfh细胞群被表征为CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+；
(xv)在约8-60周龄后，脾、淋巴结和骨髓中的一个或多个中的浆细胞群增加，其中任选地所述浆细胞群被表征为CD45+CD19-B220-CD138+或CD45+CD19intB220intCD138+；
(xvi)自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)；或
(xvii)发育期间的狼疮性肾炎。
15.一种分离的啮齿动物细胞或组织，其基因组包含C9orf72基因座中整个编码序列的缺失。
16.一种由权利要求15所述的分离的啮齿动物细胞制备的永生化细胞系。
17.一种啮齿动物胚胎干细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞的基因组包含C9orf72基因座中整个编码序列的缺失。
18.一种由权利要求17所述的胚胎干细胞产生的啮齿动物胚胎。
19.一种制备啮齿动物的方法，所述啮齿动物的基因组包含C9orf72基因座中整个编码序列的缺失，所述方法包括：
修饰啮齿动物的基因组，使得所述基因组包含C9orf72基因座中整个编码序列的缺失，从而制备所述啮齿动物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述修饰通过包括以下步骤的过程来实现：
(a)将核酸序列引入到啮齿动物胚胎干细胞中，使得C9orf72基因座中的整个编码序列缺失，所述核酸序列包含与C9orf72基因座同源的多核苷酸；
(b)从步骤(a)获得经基因修饰的啮齿动物胚胎干细胞；以及
(c)使用步骤(b)的所述经基因修饰的啮齿动物胚胎干细胞创建啮齿动物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸序列包含一个或多个选择标记。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述核酸序列包含一个或多个位点特异性重组位点。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸序列包含重组酶基因和侧接了重组酶识别位点的选择标记，所述重组酶识别位点定向成指引切除。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列还包含任选地位于所述选择标记下游的报告基因。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述重组酶基因可操作地连接至启动子，所述启动子驱动所述重组酶基因在分化细胞中的表达，而不驱动所述重组酶基因在未分化细胞中的表达。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述重组酶基因可操作地连接至具有转录能力和发育调节性的启动子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述启动子是SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQID NO：7或者包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，还包括培育步骤(c)中产生的啮齿动物的步骤，从而创建具有纯合性缺失的啮齿动物。
29.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述缺失至少包含外显子2-11全部或部分地缺失。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述缺失包括外显子2的编码部分至外显子11的编码部分。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述C9orf72基因座包含报告基因。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述报告基因可操作地连接至C9orf72启动子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述C9orf72启动子是内源性启动子。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述C9orf72基因座缺少外显子2-10并且包含报告基因。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述报告基因可操作地连接至所述C9orf72基因座的外显子1。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：lacZ、萤光素酶、GFP、eGFP、CFP、YFP、eYFP、BFP、eBFP、DsRed和MmGFP。
37.根据权利要求19-36中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
38.一种通过权利要求19-37中任一项所述的方法可获得的啮齿动物。
39.一种鉴定用于治疗啮齿动物疾病或病症的治疗候选物的方法，所述方法包括：
(a)将候选药剂施用于根据权利要求1-14中任一项所述的啮齿动物；
(b)进行一种或多种测定，以确定所述候选药剂是否对与所述疾病或病症相关的一种或多种体征、症状和/或病症具有作用；以及
(c)鉴定作为所述治疗候选物对与所述疾病或病症相关的一种或多种体征、症状和/或病症具有作用的所述候选试剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：神经退行性疾病或病症，炎性疾病或病症，自身免疫性疾病或病症，系统性红斑狼疮(SLE)，自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)以及狼疮性肾炎。
41.根据权利要求40所述的方法，其中ALPS的特征在于IL-10、抗类风湿因子(抗RF)抗体、抗核抗体(ANA)或其组合的血清水平增加；其中狼疮性肾炎的特征在于肾小球系膜增生和/或扩增，或者特征在于一种或多种肾小管异常。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩侧索硬化症(ALS)或额颞痴呆(FTD)，其中所述炎性疾病或病症是肾小球肾炎，或者其中所述自身免疫性疾病或病症是肾小球肾炎。
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