ES2784360T3 - Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72 - Google Patents

Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72 Download PDF

Info

Publication number
ES2784360T3
ES2784360T3 ES16731693T ES16731693T ES2784360T3 ES 2784360 T3 ES2784360 T3 ES 2784360T3 ES 16731693 T ES16731693 T ES 16731693T ES 16731693 T ES16731693 T ES 16731693T ES 2784360 T3 ES2784360 T3 ES 2784360T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
c9orf72
weeks
mice
rodent
age
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16731693T
Other languages
English (en)
Inventor
Amanda Atanasio
Burcin Ikiz
Guochun Gong
Michael L Lacroix-Fralish
Ka-Man Venus Lai
David M Valenzuela
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2784360T3 publication Critical patent/ES2784360T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/02—Breeding vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests

Abstract

Un roedor que comprende en su genoma una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno, en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y/o (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas.

Description

DESCRIPCIÓN
Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/168,171 presentada el 29 de mayo de 2015, la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/232,658 presentada el 25 de septiembre de 2015, y la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/245,382 presentada el 23 de octubre de 2015.
Incorporación del listado de secuencias como referencia
El listado de secuencias en un archivo de texto ASCII, denominado como 32698_10152US01_SequenceListing de 56 KB, creado el 19 de mayo de 2016, y enviado a la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos a través de EFS-Web.
Antecedentes
Las enfermedades neurodegenerativas son las principales contribuyentes a la discapacidad y la enfermedad. En particular, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS, también denominada como enfermedad de Lou Gehrig) y la demencia frontotemporal (FTD) son trastornos raros del sistema nervioso caracterizados por la pérdida y/o muerte neuronal progresiva. Aunque el envejecimiento se considera como el mayor factor de riesgo para la enfermedad neurodegenerativa, se han descubierto varios componentes genéticos. Por ejemplo, las mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa de cobre-zinc (SOD1) se han asociado durante mucho tiempo con la ALS. Además, las repeticiones de hexanucleótidos expandidas de GGGGCC dentro de una región no codificante del gen C9ORF72 se han relacionado tanto con la ALS como con la FTD. Actualmente, no existe cura para ninguna de ambas enfermedades, pero sí existen tratamientos que ayudan a controlar y/o aliviar los síntomas.
Las enfermedades inflamatorias incluyen una gran variedad de enfermedades que se caracterizan a menudo por una mutación(es) genética(s) que resulta(n) en un sistema inmunitario deteriorado o disfuncional. Aunque los mecanismos de, por ejemplo, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria intestinal y la glomerulonefritis no se comprenden completamente, varios componentes genéticos se han relacionado con los diversos signos y síntomas presentados por los pacientes. Dichas enfermedades se caracterizan por inflamación sistémica y muestran diversas anomalías en todo el cuerpo del paciente. Al igual que con la ALS y la FTD, los tratamientos para las enfermedades inflamatorias solo tienen como objetivo mejorar los síntomas y retrasar el progreso de la enfermedad.
Si bien diversos modelos de animales de laboratorio se usan ampliamente en el desarrollo de la mayoría de los agentes terapéuticos, existen pocos que aborden las enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias de manera que proporcionen la elucidación del mecanismo molecular exacto por el cual los componentes genéticos identificados provocan la enfermedad. Por lo tanto, la forma en que las mutaciones genéticas provocan enfermedades neurodegenerativas y/o inflamatorias aún es en gran medida desconocida. Los modelos animales ideales contendrían los mismos componentes genéticos y representarían características similares de la enfermedad humana. Dadas las diferencias genéticas entre especies, existe una gran necesidad insatisfecha del desarrollo de modelos animales mejorados que resuman fielmente la enfermedad neurodegenerativa y/o inflamatoria humana. Por supuesto, dichos modelos animales mejorados proporcionan un valor significativo en el desarrollo de agentes terapéuticos y/o profilácticos eficaces.
Naoki Suzuki y otros, Neuroscience, vol. 16, núm. 12, 3 de noviembre de 2013, páginas 1725-1727 describen un ratón transgénico que presenta una inserción LacZ dirigida que reemplaza a los exones 2-6 de C9orf72. S.K. Panda y otros, Genetics, vol 195, núm. 3, 26 de agosto de 2013, páginas 703-713 describen la generación de un ratón con anulación del gen C9orf72 en donde la interrupción del homólogo de ratón del gen C9orf72 se generó mediante la creación de mutaciones con desplazamiento de marco inducidas por TALEN. Alan Stepto y otros, Acta Neuropathologica, vol 127, núm. 3, 1 de marzo de 2014, páginas 377-389 proporcionan un análisis sobre si la reducción o la pérdida de la función de C9orf72 contribuye a la enfermedad y resume los resultados mediante el análisis de diversos modelos animales. Los documentos WO2013/030588 y WO2013/041577 describen métodos para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa tal como la ALS y la FTLD.
Breve descripción de la Invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un roedor que comprende en su genoma una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno, en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y/o (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas.
En otro aspecto, se proporciona una célula o tejido de roedor aislado cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno.
En otro aspecto, se proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno.
En otro aspecto, se proporciona un método para crear un roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno, el método comprende: modificar el genoma de un roedor para que comprenda la deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 del locus C9orf72 endógeno,
lo que crea de esta manera dicho roedor,
en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas.
En otro aspecto, se proporciona un método para identificar un candidato terapéutico para el tratamiento de uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas en un roedor, el método comprende:
(a) administrar un agente candidato a un roedor de la invención;
(b) realizar uno o más ensayos para determinar si el agente candidato tiene un efecto sobre uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas; e
(c) identificar el agente candidato que tiene un efecto sobre uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas como el candidato terapéutico.
La presente invención abarca el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente animales no humanos para permitir sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos y, en algunas modalidades, regímenes terapéuticos, que puedan usarse para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas. En algunas modalidades, los sistemas in vivo como se describen en la presente descripción pueden usarse para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias. En algunas modalidades, los sistemas in vivo como se describen en la presente descripción pueden usarse, además, para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias. Además, los animales no humanos descritos en la presente descripción que comprenden una interrupción en un locus C9ORF72 y/o de cualquier otra manera un locus C9ORF72 funcionalmente silenciado, de manera que un polipéptido C9ORF72 no se expresa o produce, son convenientes, por ejemplo, para su uso en la identificación y el desarrollo de agentes terapéuticos que se dirigen a una repetición de hexanucleótidos GGGGCC, transcripción y regulación de C9ORF72, y/o aumentar o disminuir los niveles de C9ORF72, que se han asociado con enfermedades en humanos. En algunas modalidades, los animales no humanos de la invención proporcionan sistemas (o modelos) in vivo mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ALS y/o FTD). En algunas modalidades, los animales no humanos de la invención proporcionan sistemas (o modelos) in vivo mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias.
La presente invención proporciona modelos animales no humanos para la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia frontotemporal (FTD) y/o glomerulonefritis. En diversos ejemplos, se proporcionan modelos animales no humanos para la ALS y/o la FTD, que se caracterizan por una interrupción (por ejemplo, una deleción de toda la región codificante) en un locus C9ORF72. En algunos ejemplos, una interrupción en un locus C9ORF72 afecta a una o más neuronas de un animal no humano que comprende dicha interrupción. En algunos ejemplos, una interrupción en un locus C9ORF72 afecta a uno o más de bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea, riñones y sangre de un animal no humano que comprende dicha interrupción.
En algunos ejemplos, una interrupción en un locus C9ORF72 de un animal no humano como se describe en la presente descripción resulta en uno o más de los siguientes fenotipos: un fenotipo similar a la ALS; esplenomegalia; linfadenopatía; glomerulonefritis; una infiltración de uno o más de macrófagos, monocitos y granulocitos en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y/o la sangre; una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón y/o el hígado; un agotamiento de las células B y/o T en la médula ósea; una disminución de linfocitos en la sangre; y un aumento en la expresión de una o más citocinas (por ejemplo, IL-17, IL-10, TNF-a e IL-12) en el suero.
En algunos ejemplos, una interrupción (por ejemplo, una deleción) en un locus C9ORF72 no humano resulta de una inserción de una secuencia de ácido nucleico que, en algunas modalidades determinadas, comprende un gen indicador.
En algunos ejemplos, se proporciona un animal no humano que comprende en su genoma una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, es decir, una deleción de una secuencia genómica que codifica todas las isoformas de C9ORF72 (es decir, isoformas VI, V2 y V3).
En algunos ejemplos, una deleción es de un segmento genómico de aproximadamente 26 kb en un locus C9ORF72 de un animal no humano. En algunos ejemplos, una deleción es de un segmento genómico que abarca al menos los exones 2-11 (por ejemplo, los exones 2-11 de V1), en su totalidad o en parte. En algunos ejemplos, una deleción incluye los exones 1-11. En algunas modalidades, un locus C9ORF72 que tiene una deleción comprende un gen indicador. En algunas modalidades, un gen indicador se une operativamente a un promotor de C9ORF72. En algunas modalidades, un promotor de C9ORF72 es un promotor endógeno.
En algunas modalidades, un locus C9ORF72 de un animal no humano descrito en la presente descripción carece de la región codificante del exón 2 hasta la región codificante del exón 11, y comprende un gen indicador. En algunas modalidades, el gen indicador se une operativamente a un promotor de C9ORF72. En algunas modalidades, el gen indicador se une operativamente a la región no codificante del exón 2 (es decir, parte de la UTR 5') de un gen C9ORF72, lo que coloca de esta manera el gen indicador en unión operativa con el exón 1 (es decir, el exón 1a o el exón 1b) y las secuencias reguladoras aguas arriba (lo que incluye el promotor) de un locus C9ORF72 de un animal no humano. En modalidades específicas, la unión operativa entre un gen indicador y la porción no codificante del exón 2 se logra mediante la deleción dirigida de una secuencia genómica C9ORF72 a partir del codón inmediatamente después del codón de inicio ATG en el exón 2 hasta la región codificante del exón 11, y la inserción de una secuencia codificante indicadora sin un codón de inicio ATG en el sitio del locus C9ORF72 inmediatamente después del codón de inicio ATG restante en el exón 2 del gen C9ORF72. En algunas modalidades, la expresión de un gen indicador se asemeja al patrón de expresión (o perfil) de un locus C9ORF72.
En algunas modalidades, un gen indicador se selecciona del grupo que consiste en p-galactosidasa (lacZ), luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), GFP potenciada (eGFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente amarilla potenciada (eYFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente azul potenciada (eBFP), DsRed y MmGFP. En algunas modalidades determinadas, un gen indicador es lacZ.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción es homocigoto o heterocigoto para una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla uno o más fenotipos como se describe en la presente descripción; en algunas modalidades determinadas, los fenotipos son detectables después de aproximadamente 8 semanas de edad.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla uno o más síntomas de ALS y/o FTD durante el desarrollo; en algunas modalidades determinadas, después de aproximadamente 36 semanas de edad; en algunas modalidades determinadas, después de aproximadamente 40 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla déficits motores progresivos después de aproximadamente 36 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una patología de las neuronas motoras inferiores después de aproximadamente 40 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una disminución en el peso corporal después de aproximadamente 36 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla disfunción mitocondrial en las neuronas motoras durante el desarrollo; en algunas modalidades determinadas, la disfunción mitocondrial se caracteriza por una disminución en una o más de respiración mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, capacidad respiratoria de reserva, producción de ATP y fuga de protones; en algunas modalidades determinadas, la disfunción mitocondrial se caracteriza por un aumento en la relación ADN mitocondrial con respecto al nuclear en comparación con la relación ADN mitocondrial con respecto al nuclear de las neuronas motoras de un animal no humano control o de referencia.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla uno o más síntomas de glomerulonefritis durante el desarrollo; en algunas modalidades determinadas, después de aproximadamente 35 semanas de edad, después de aproximadamente 35-41 semanas de edad inclusive o después de aproximadamente 35-60 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla esplenomegalia después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla linfadenopatía después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunas modalidades, la linfadenopatía es palpable después de aproximadamente 12-18 semanas de edad inclusive o después de aproximadamente 18-60 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción se caracteriza por una infiltración de una o más de células plasmáticas, monocitos, granulocitos y macrófagos F4/80+; en algunas modalidades determinadas, la infiltración es detectable después de aproximadamente 8 semanas de edad; en algunas modalidades determinadas, la infiltración es detectable hasta las 60 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón y/o el hígado después de aproximadamente 8 semanas de edad.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un nivel de citocinas en suero incrementado de una o más de IL-10, IL-12, IL-17, IFN-y, TNF-ay MCP-1 después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un nivel sérico aumentado de IL-12 después de aproximadamente 8 semanas de edad que es aproximadamente 6 veces o más en comparación con un animal no humano de referencia o control.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una enfermedad renal caracterizada por una membrana basal engrosada, formación de cilindros (o formación de cilindros hialinos), deposición del complejo inmunitario, glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, glomeruloesclerosis, túbulos basófilos o combinaciones de estas después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, después de aproximadamente 35-41 semanas de edad inclusive, o después de aproximadamente 35-60 semanas de edad inclusive.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una población aumentada de células dendríticas mieloides en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, una población de células dendríticas mieloides se caracteriza como CD45+CD11b+CD11c+MHCII+.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un nivel sérico aumentado de uno o más autoanticuerpos después de aproximadamente 8 semanas de edad; en algunas modalidades determinadas, después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un nivel sérico aumentado de uno o más autoanticuerpos entre aproximadamente 8 semanas y aproximadamente 60 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, uno o más autoanticuerpos se seleccionan entre anticuerpos anti-factor reumatoide (anti-RF), anticuerpos anti-ADNbc, anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos anti-Smith (anti-Sm), anticuerpos anti-cardiolipina, y combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un nivel aumentado de macrófagos F4/80+ en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, los macrófagos F4/80+ se caracterizan como CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una población de células T aumentada en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, las células T se caracterizan como CD8+CD44+, CD8+CD69+, CD8+PD1+, CD4+CD44+, CD4+CD69+ o CD4+PD1+. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una población de células T reguladoras aumentada en el bazo y/o ganglios linfáticos después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, y en donde la población de células T reguladoras se caracteriza como CD4+FoxP3+. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla un aumento de células T auxiliares foliculares (Tfh) en el bazo, ganglios linfáticos (por ejemplo, ganglios linfáticos cervicales o "CLN", y ganglios linfáticos mesentéricos o "MLN"), y/o sangre después de aproximadamente 26 semanas de edad, y en donde la población de células Tfh se caracteriza como CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla una población de células plasmáticas aumentada en uno o más de bazo, ganglios linfáticos y médula ósea después de aproximadamente 8-60 semanas de edad inclusive. En algunas modalidades, una población de células plasmáticas se caracteriza como CD45+CD19-B220-CD138+ o CD45+CD19intB220intCD138+.
En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS) durante el desarrollo. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla nefritis lúpica durante el desarrollo. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla glomerulonefropatía proliferativa. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla uno o más fenotipos asociados con lupus eritematoso sistémico (SLE) durante el desarrollo. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción desarrolla uno o más fenotipos o síntomas seleccionados del grupo que consiste en títulos de autoanticuerpos elevados y citocinas séricas, linfadenopatía, esplenomegalia y expansiones seleccionadas de los compartimientos mieloides y linfoides, o una combinación de estos. En algunas modalidades, se observan uno o más fenotipos o síntomas tan temprano como a las 8 semanas. En algunas modalidades, se observan uno o más fenotipos o síntomas entre aproximadamente 18 semanas y aproximadamente 24 semanas inclusive.
En algunas modalidades, se proporciona una célula o tejido no humano aislado de un animal no humano como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una célula o tejido aislado comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una célula es una célula neuronal o una célula a partir de un linaje neuronal. En algunas modalidades, una célula es de un linaje linfoide o mieloide. En algunas modalidades, una célula se selecciona de una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, un monocito y una célula T. En algunas modalidades, un tejido se selecciona de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario, y una combinación de estos.
En algunas modalidades, se proporciona una línea celular inmortalizada, que se crea a partir de una célula aislada de un animal no humano como se describe en la presente descripción.
En algunos ejemplos, se proporciona una célula madre embrionaria no humana cuyo genoma comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción o una deleción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de roedor. En algunas modalidades determinadas, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL o una mezcla de estas. En algunas modalidades determinadas, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es una mezcla de las cepas 129 y C57BL.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de una célula madre embrionaria no humana, como se describe en la presente descripción, para crear un animal no humano modificado genéticamente. En algunos ejemplos determinados, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y se usa para crear un ratón que comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos determinados, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de rata y se usa para crear una rata que comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, se proporciona un embrión no humano que comprende, se crea a partir de, o se obtiene a partir de, o se genera a partir de una célula madre embrionaria no humana que comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades determinadas, un embrión no humano es un embrión de roedor; en algunas modalidades, un embrión de ratón; en algunas modalidades, un embrión de rata.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un embrión no humano, como se describe en la presente descripción, para crear un animal no humano modificado genéticamente. En algunos ejemplos determinados, un embrión no humano es un embrión de ratón y se usa para crear un ratón que comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos determinadas, un embrión no humano es un embrión de rata y se usa para crear una rata que comprende un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, se proporciona un constructo de ácido nucleico (o constructo de direccionamiento o vector de direccionamiento) como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, un constructo de ácido nucleico como se describe en la presente descripción comprende, en dirección 5' a 3', un brazo de direccionamiento no humano que comprende un polinucleótido que es homólogo a una porción en dirección 5' de un locus C9ORF72 no humano (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o una rata), un primer sitio de reconocimiento de recombinasa; un primer promotor unido operativamente a un gen de recombinasa, un segundo promotor unido operativamente a un marcador seleccionable, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa, un gen indicador como se describe en la presente descripción, y un brazo de direccionamiento no humano que comprende un polinucleótido que es homólogo a una porción en dirección 3' de un locus C9ORF72 no humano (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o una rata). En algunas modalidades, la porción en dirección 3' de un locus C9ORF72 no humano incluye una secuencia genómica aguas abajo del codón de parada en el exón 11 de un gen C9ORF72 no humano (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o una rata). En algunas modalidades, la porción en dirección 5' de un locus C9ORF72 incluye una secuencia genómica aguas arriba del codón de inicio en el exón 2 de un gen C9ORF72 no humano (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o una rata). En muchas modalidades, los sitios de reconocimiento de recombinasa primero y segundo se orientan para dirigir una escisión. En muchas modalidades, un gen de recombinasa codifica una recombinasa que reconoce el primer y el segundo sitio de reconocimiento de recombinasa. En muchas modalidades, un primer promotor conduce la expresión de un gen de recombinasa en células diferenciadas y no conduce la expresión del gen de recombinasa en células no diferenciadas. En muchas modalidades, un primer promotor es competente transcripcionalmente y regulado por el desarrollo.
En algunas modalidades, los sitios de reconocimiento de recombinasa incluyen loxP, lox511, lox2272, lox2372, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, Dre, rox o una combinación de estos. En algunas modalidades, un gen de recombinasa se selecciona del grupo que consiste en Cre, Flp (por ejemplo, Flpe, Flpo) y Dre. En algunas modalidades determinadas, los sitios de reconocimiento de recombinasa son sitios lox (por ejemplo, loxP), y un gen de recombinasa codifica una recombinasa Cre.
En algunas modalidades, se selecciona un primer promotor del grupo que consiste en protamina (Prot; por ejemplo, Prot1 o Prot5), Blimp1, Blimp1 (fragmento de 1 kb), Blimp1 (fragmento de 2 kb), Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 y Pax3. En algunas modalidades determinadas, se selecciona un primer promotor de un promotor que aparece en la Tabla 2. En algunas modalidades determinadas, un primer promotor es o comprende la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:7.
En algunas modalidades, se selecciona un marcador seleccionable del grupo que consiste en neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicin-N-acetiltransferasa (purof), blasticidin S desaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferasa (gpt) y timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-tk).
En algunas modalidades, se selecciona un segundo promotor del grupo que consiste en un promotor UbC, promotor Ubi, promotor hCMV, promotor mCMV, promotor CAGGS, promotor EF1, promotor pgkl, promotor beta-actina y un promotor ROSA26. En algunas modalidades determinadas, un marcador seleccionable es neor y un segundo promotor es Ubi.
En algunas modalidades, se proporciona un método para crear un animal no humano cuyo genoma comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, el método comprende (a) introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula madre embrionaria no humana de manera que se elimina toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, cuyo ácido nucleico comprende un polinucleótido que es homólogo al locus C9ORF72; (b) obtener una célula madre embrionaria no humana modificada genéticamente a partir de (a); y (c) crear un animal no humano mediante el uso de la célula madre embrionaria no humana modificada genéticamente de (b). En algunas modalidades, un método para crear un animal no humano descrito en la presente descripción comprende, además, una etapa de reproducir un animal no humano generado en (c) de manera que se cree un animal no humano homocigoto para una deleción.
En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico es, comprende o aparece en un constructo de ácido nucleico como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende uno o más marcadores de selección. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende uno o más sitios de recombinación específica de sitio. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa y un marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa, cuyos sitios de reconocimiento de recombinasa se orientan para dirigir una escisión. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende, además, un gen indicador ubicado aguas abajo de un marcador de selección. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa unido operativamente a un promotor que conduce la expresión del gen de recombinasa en células diferenciadas y que no conduce la expresión del gen de recombinasa en células no diferenciadas. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa unido operativamente a un promotor que es competente transcripcionalmente y regulado por el desarrollo. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa unido operativamente a un promotor que es o comprende la SEQ ID NO:5, la SEQ ID n O:6 o la SEQ ID NO:7.
En algunas modalidades, se proporciona un método para crear un animal no humano cuyo genoma comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, el método comprende modificar el genoma de un animal no humano de manera que comprenda una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, lo que crea de esta manera dicho animal no humano.
En algunas modalidades, se proporciona un animal no humano que puede obtenerse, generarse o producirse a partir de un método como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) o demencia frontotemporal (FTD), cuyo animal no humano tiene un genoma que comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) o demencia frontotemporal (FTD), que se obtiene mediante la deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, en donde el animal no humano desarrolla uno o más síntomas de ALS y/o FTD durante el desarrollo.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de glomerulonefritis, cuyo animal no humano tiene un genoma que comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de glomerulonefritis, que se obtiene mediante la deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, en donde el animal no humano desarrolla uno o más síntomas de glomerulonefritis durante el desarrollo.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de enfermedad linfoproliferativa, cuyo animal no humano tiene un genoma que comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72.
En algunas modalidades, se proporciona un modelo animal no humano de enfermedad linfoproliferativa, que se obtiene mediante la deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, en donde el animal no humano desarrolla uno o más síntomas de desregulación o disfunción del sistema inmunitario durante el desarrollo.
En algunas modalidades, se proporciona un método para identificar un candidato terapéutico para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano, el método comprende (a) administrar un agente candidato a un animal no humano cuyo genoma comprende una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72; (b) realizar uno o más ensayos para determinar si el agente candidato tiene un efecto sobre uno o más signos, síntomas y/o condiciones asociadas con la enfermedad, trastorno o afección; e (c) identificar el agente candidato que tiene un efecto sobre uno o más signos, síntomas y/o condiciones asociados con la enfermedad, trastorno o afección como el candidato terapéutico.
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano es una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano es una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria.
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano es el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS; también conocido como síndrome de Canale-Smith). En algunas modalidades, el ALPS se caracteriza por un nivel sérico incrementado de IL-10, anticuerpos anti-factor reumatoide (anti-RF), anticuerpos antinucleares (ANA) o combinaciones de estos.
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano es la nefritis lúpica. En algunas modalidades, la nefritis lúpica se caracteriza por la proliferación y/o expansión mesangeal. En algunas modalidades, la nefritis lúpica se caracteriza por una o más anomalías tubulares. En algunas modalidades, una o más anomalías tubulares se seleccionan de dilatación, formación de cilindros, basofilia y combinaciones de estas.
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección en un animal no humano es el lupus eritematoso sistémico (SLE). En algunas modalidades, el SLE se caracteriza por una o más de hiperplasia linfoide, activación de células T, anticuerpos antinucleares (ANA) elevados en suero e inflamación sistémica que afecta el corazón, los pulmones, el hígado, la piel, las articulaciones, el sistema nervioso y los riñones.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa.
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS).
En algunas modalidades, se proporciona el uso de un animal no humano, como se describe en la presente descripción, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la nefritis lúpica.
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es la demencia frontotemporal (FTD). En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria es la glomerulonefritis. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria es glomerulonefritis, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), nefritis lúpica o lupus eritematoso sistémico (SLE).
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, como se describe en la presente descripción, se caracteriza por un aumento significativo en la concentración de autoanticuerpos en suero. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, como se describe en la presente descripción, se caracteriza por un aumento significativo en el nivel sérico de una o más citocinas (por ejemplo, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-a, etcétera).
En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa, como se describe en la presente descripción, se caracteriza por un aumento significativo en una o más células inmunitarias en uno o más de bazo, médula ósea, ganglio(s) linfático(s), riñón o sangre. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa, como se describe en la presente descripción, se caracteriza por la liberación o desregulación de uno o más linfocitos.
En diversas modalidades, una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72 incluye deleciones como se describen en la presente descripción. En diversas modalidades, un locus C9ORF72 no humano incluye un locus C9ORF72 no humano como se describe en la presente descripción. En diversas modalidades, un locus C9ORF72 no humano es un locus C9orf72 murino (por ejemplo, un locus C9orf72 de ratón o de rata).
En diversas modalidades, uno o más fenotipos, como se describen en la presente descripción, es o son como se compara con respecto a una referencia o control. En diversas modalidades, una referencia o control incluye un animal no humano que tiene una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente de una modificación como se describe en la presente descripción o no tiene modificaciones (es decir, un animal no humano de tipo silvestre).
En diversas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es un roedor; en algunas modalidades, un ratón; en algunas modalidades, una rata.
Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.
Otras características, objetos y ventajas de animales no humanos, células y métodos proporcionados en la presente descripción son evidentes en la descripción detallada de determinadas modalidades que siguen. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, si bien indica determinadas modalidades, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
El Dibujo que se incluye en la presente descripción, que se compone de las siguientes Figuras, es solamente con propósitos de ilustración y no de limitación. El archivo de la patente o la solicitud contiene al menos un dibujo a color. Las copias de esta publicación de patente o de la solicitud de patente con la (las) figura(s) a color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tarifa necesaria.
La Figura 1A, cuadro superior, muestra una ilustración esquemática, no a escala, de las tres isoformas de transcriptos de C9orf72 de ratón informadas (VI, V2 y V3) y una estrategia de deleción dirigida para la interrupción del locus C9orf72 de ratón. Se generó un vector de direccionamiento que incluye un brazo de homología de ratón aguas arriba (o "mHU", que contiene una secuencia genómica aguas arriba del codón de inicio, y lo incluye, en el exón 2 del gen C9ORF72 de ratón), un gen indicador lacZ (sin el codón de inicio ATG), un casete de selección de fármaco autoeliminable (que incluye un gen de resistencia a la neomicina y un gen de recombinasa Cre vinculado a un promotor de protamina 1 (Prm1) de ratón, flanqueado por sitios loxP), y un brazo de homología de ratón aguas abajo (o "mHD", que contiene una secuencia genómica de 49 pb aguas abajo del codón de parada del exón 11 del gen C9ORF72 de ratón). Tras la recombinación homóloga, se eliminó una región genómica de ratón de aproximadamente 26 kb, lo que incluye la secuencia codificante de C9orf72 para todas las isoformas predichas de C9orf72 de ratón (es decir, la secuencia codificante que comienza desde el codón inmediatamente después del codón de inicio ATG en el exón 2 del C9orf72 de ratón, hasta los exones 3­ 10, intrones intermedios y 49 pb de la UTR 3' en el exón 11 del C9orf72 de ratón); y el gen indicador lacZ (sin el codón de inicio ATG) se insertó inmediatamente después del codón de inicio ATG endógeno restante del C9orf72 de ratón. El locus C9orf72 modificado resultante se representa en la Figura 1A, cuadro inferior. Se empleó tecnología de autodeleción para eliminar el casete de neomicina antes del análisis fenotípico, lo que deja el indicador lacZ y un sitio loxP bajo control del promotor de C9orf72 de ratón. El locus C9orf72 de ratón modificado después de que se ha eliminado el casete de neomicina se representa en la Figura 1A, cuadro inferior. La secuencia de nucleótidos del locus C9orf72 modificado que comienza desde la secuencia lacZ insertada hasta el sitio loxP en dirección 3' se expone en la SEQ ID NO: 8; y la secuencia de nucleótidos del locus C9orf72 modificado que comienza desde el exón 1a hasta la UTR 3' se expone en la SEQ ID NO: 9.
La Figura 1B muestra el análisis de expresión por TAQMAN® de C9orf72 (arriba; también conocido como 3110043021RIK) y el activador quinasa MOB 3B (Mob3b; abajo) para los ratones de tipo silvestre (WT), C9orf72+/- (Het) y C9orf72-/- (KO).
Las Figuras 2A-2L muestran fenotipos similares a la ALS medidos en ratones de tipo silvestre (n=9) y C9orf72-/- (n=11).
Figura 2A: por ciento ilustrativo de supervivencia (eje y) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2B: cambio de peso corporal ilustrativo (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2C: puntuación de deterioro motor medio ilustrativo en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2D: puntuación de temblor medio ilustrativo en el tiempo (eje x, semanas)
Figura 2E: puntuación de rigidez media ilustrativa en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2F: tiempo máximo ilustrativo en rotarod (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2G: comportamiento locomotor en campo abierto ilustrativo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2H: comportamiento en pasarela ilustrativo, por ejemplo, longitud de zancada media (arriba a la izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (arriba a la derecha) presentada como por ciento de índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (centro inferior) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 2I: imágenes ilustrativas de neuronas motoras de ratones de tipo silvestre de 60 semanas de edad (WT, n=5) y C9orf72-/- (n=5), y un recuento de neuronas motoras ilustrativo (abajo a la izquierda), área media (abajo en el centro, p <0,0001) y área del cuerpo celular (en número de células, abajo a la derecha) para los ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72-/-; se midieron 10 neuronas motoras para el área del cuerpo celular por lámina portaobjetos (tres láminas portaobjetos por grupo), la hinchazón indicó hipoxia y daño celular;
Figura 2J: por ciento de supervivencia ilustrativo en el tiempo (arriba a la izquierda), cambio de peso corporal en gramos (arriba a la derecha), puntuación de deterioro motor medio en el tiempo (abajo a la izquierda), puntuación de temblor medio en el tiempo (abajo a la mitad) y puntuación de rigidez media en el tiempo (abajo a la derecha) en ratones de tipo silvestre de 32-60 semanas de edad (C9orf72+/+; n=14) y C9orf72r'~ (n=17);
Figura 2K: tiempo máximo ilustrativo en rotarod en el tiempo (arriba a la izquierda), comportamiento locomotor en campo abierto, por ejemplo, inmovilidad en el tiempo (arriba a la mitad) y tiempo de exploración vertical en el tiempo (arriba a la derecha), comportamiento en la pasarela, por ejemplo, longitud de zancada media en el tiempo (abajo a la izquierda) y coordinación entre extremidades presentada como por ciento de índice de regularidad en el tiempo (abajo a la mitad) y distancia total recorrida en el tiempo (abajo a la derecha) en ratones de tipo silvestre de 32-60 semanas de edad (C9orf72+l+; n=14) y C9orf72-/-(n=17);
Figura 2L: puntuación de deterioro motor medio ilustrativo en el tiempo (arriba a la izquierda), puntuación de temblor medio en el tiempo (arriba a la mitad), puntuación de rigidez media en el tiempo (arriba a la derecha) y fuerza de agarre (en gramos de fuerza) en ratones de tipo silvestre (C9orf72+/+), heterocigotos (C9orf72+/~) y homocigotos (C9orf72~'~). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA).
Las Figuras 3A-3AL muestran resultados de inmunofenotipaje medidos en ratones de tipo silvestre (n= >4) y ratones que tienen una interrupción en un locus C9orf72 (n= >4).
Figura 3A: imágenes ilustrativas de ratones hembras de tipo silvestre (WT) y C9orf72~1' diseccionados que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas) en ratones C9orf72rl~ y pesos de bazo (derecha, en gramos) en ratones hembras de tipo silvestre (WT), C9orf72+/- (HET), y C9orí72'~ (KO) a las 8 (fila superior) y 18 (fila inferior) semanas; Figura 3B: imágenes ilustrativas de ratones machos de tipo silvestre (WT) y C9orf72~l~ diseccionados que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas) en ratonesC9orf72~l~ y pesos del bazo (derecha, en gramos) en ratones de tipo silvestre (WT) machos, C9orf72+l~ (HET), y C9orf72r'~ (KO) a las semanas 9-10 (fila superior) y 18 (fila inferior);
Figura 3C: imágenes ilustrativas de ratones hembras de 37 semanas y machos de 56 semanas C9orf72 ' 1' que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas);
Figura 3D: imágenes ilustrativas de ratones hembras de 30-35 semanas de edad de tipo silvestre (fila superior) y C9orf72 1 (fila central) diseccionadas que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas) y pesos corporales (en gramos), pesos del bazo (en gramos) y peso del bazo normalizado con respecto al peso corporal (como % de peso corporal) (fila inferior); imagen ilustrativa del bazo diseccionado (abajo a la izquierda) de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72-/- (-/-);
Figura 3E: datos de CBC ilustrativos con diferencial que muestra el recuento total de glóbulos blancos y las poblaciones circulantes de diversos tipos de células inmunitarias en ratones de 34-38 semanas de edad de tipo silvestre (WT), C9orf72+l' (HET), y C9orí72'~ (KO) (el tipo de célula se indica arriba de cada gráfico);
Figura 3F: imágenes ilustrativas de tejido seccionado de bazo y ganglios linfáticos cervicales de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~ a 4x de potencia teñidos con hematoxilina y eosina;
Figura 3G: imágenes ilustrativas de tejido de ganglios linfáticos cervicales seccionados de ratones C9orf72rl~ a 60x de potencia teñidos con hematoxilina y eosina (flechas azules: células con morfología plasmacitoide; flechas amarillas: neutrófilos; flechas verdes: células de tipo macrófago; flecha roja: célula Mott);
Figura 3H: Por ciento ilustrativo de células B positivas (CD11b‘, CD11c, CD3'B220+, CD19+) del bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y la sangre en ratones machos de tipo silvestre (WT) y C9orf72r/~ (KO);
Figura 3I: células plasmáticas ilustrativas en diversos estadios que expresan antígenos específicos de la superficie celular aislados del bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y la sangre de ratones machos de tipo silvestre (WT) y C9orf72r1' (KO) a las 9-10 semanas (barras negras), 18 semanas (barras grises claras) y 57-60 semanas (barras grises oscuras);
Figura 3J: células plasmáticas ilustrativas en diversos estadios que expresan antígenos específicos de la superficie celular aislados del bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y la sangre de ratones hembras de tipo silvestre (WT) y C9orf72r1' (KO) a las 8 semanas (barras negras), 18 semanas (barras grises claras) y 30-35 semanas (barras grises oscuras);
Figura 3K: Por ciento ilustrativo de células mieloides positivas en diversos estadios que expresan antígenos específicos de la superficie celular aislados del bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y la sangre de ratones machos de tipo silvestre (WT) y C9orf72r1' (KO) a las 9-10 semanas (barras negras), 18 semanas (barras grises claras) y 57-60 semanas (barras grises oscuras);
Figura 3L: Por ciento ilustrativo de células mieloides positivas en diversos estadios que expresan antígenos específicos de la superficie celular aislados del bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y la sangre de ratones hembras de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~ (KO) a las 8 semanas (barras negras), 18 semanas (barras grises claras) y 30-35 semanas (barras grises oscuras);
Figura 3M: Por ciento ilustrativo de células macrófagos positivas (CD45+, CD11b+, F4/80+, Ly6G') en bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea, riñón y sangre de ratones hembras de 30-35 semanas de tipo silvestre (WT) y C9orf72~ /-;
Figura 3N: imágenes ilustrativas de bazo seccionado de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72r1' a 4x de potencia teñidos con diversos marcadores (indicados debajo de cada imagen);
Figura 3O: imágenes ilustrativas de ganglios linfáticos cervicales seccionados de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72~ 1 a 4x de potencia teñidos con diversos marcadores (indicados debajo de cada imagen; flecha: células teñidas intermitentemente con CD138);
Figura 3P: imágenes ilustrativas de bazo y ganglio linfático cervical seccionados de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72r'~ a potencia 4x y 60x teñidos con f4/80;
Figura 3Q: recuentos ilustrativos de células totales en bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y riñón en ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72~l~. Las células se contaron mediante el uso de un contador de viabilidad celular Cellometer Auto T4 antes del análisis FACS. Esto se hizo para calcular el número total de células positivas para marcadores de superficie de interés además de presentar los datos en por ciento de células positivas para dichos marcadores. Como estos recuentos se realizaron después de la lisis de glóbulos rojos, también son representativos de una gran infiltración inmunitaria (glóbulos blancos) ya que el recuento de células totales aumentó en ratones anulados en comparación con el tipo silvestre; Figura 3R: por ciento ilustrativo de positivas y recuentos celulares de células dendríticas mieloides (izquierda; CD11b+, CD11c+, MHCII+) y células NK (derecha; NKp46mid, CD49b+) en bazo y médula ósea para ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72~'~;
Figura 3S: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células CD45+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~;
Figura 3T: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD8+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~;
Figura 3U: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD4+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9of72rl~;
Figura 3V: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD8+CD44+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (Wt ) y C9orf72~l~;
Figura 3W: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD4+CD44+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72~l~;
Figura 3X: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD8+CD69+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (Wt ) y C9orf72-'~;
Figura 3Y: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD4+CD69+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (Wt ) y C9orf72~1';
Figura 3Z: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD8+PD1+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (Wt ) y C9of72-'~;
Figura 3AA: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD4+PD1+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~;
Figura 3AB: Por ciento ilustrativo de positivas (fila superior) y recuento de células totales (fila inferior) para células T CD4+FoxP3+ en diversos tejidos de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~;
Figura 3AC: Por ciento ilustrativo de positivas (izquierda en cada par) y recuento de células totales (derecha en cada par) para poblaciones de células T CD8+CD62L+ (arriba a la izquierda), CD4+CD62L+ (abajo a la izquierda), CD8+CD127+ (arriba a la derecha) y CD4+CD127+ (abajo a la derecha) en bazo de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~;
Figura 3AD: panel ilustrativo de citocinas que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones machos de 18 semanas de edad de tipo silvestre (WT), C9orf72¥l~ (Het), y C9orf72rl~ (KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico);
Figura 3AE: panel ilustrativo de citocinas que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones machos de 8-58 semanas de edad de tipo silvestre (WT), C9orf72+'~ (Het), y C9orf72rl~ (KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico);
Figura 3AF: panel ilustrativo de citocinas que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones hembras de 8-38 semanas de edad de tipo silvestre (WT), C9orf72+'~ (Het), y C9orf72rl~ (KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico);
Figura 3AG: niveles ilustrativos de nitrógeno ureico en sangre (eje y, mgldl), globulina (eje y, gldl) e inmunoglobulina sérica (eje y, IgG, Ulml (izquierda); eje y, IgM, Ulml (derecha)) en ratones de tipo silvestre (WT), C9orf72+l-, y C9orf72rl~ (la medición de nitrógeno ureico en sangre y globulina es en ratones machos de 45-56 semanas; la medición del factor reumatoide IgM e IgG en suero es en ratones machos de 8-58 semanas; se observó un aumento significativo en RF IgG e IgM en ratones C9orf72rl~ en todos los puntos de tiempo a partir de las 8 semanas de edad);
Figura 3AH: niveles ilustrativos de factor reumatoide IgG e IgM en ratones hembras (fila superior) y machos (fila inferior) de tipo silvestre (WT), C9orf72¥l~ (Het) y C9orf72rl~ (KO); medición en suero de ratones de 8-10 semanas de edad (machos: 7 WT, 5 Het, 9 KO; hembras: 7 WT, 5 Het, 8 KO), 18 semanas (machos: 9 WT, 6 Het, 13 KO; hembras: 5 WT, 12 Het, 15 KO), 30-41 semanas (machos: 3 WT, 4 Het, 4 k O; hembras: 10 WT, 9 Het, 9 KO) y 54-65 semanas (machos: 6WT, 9 Het, 5 KO);
Figura 3AI: niveles ilustrativos de IgG e IgM circulantes (en pglml, eje y) en ratones hembras (fila superior) y machos (fila inferior) de tipo silvestre (WT), C9orf72+l~ (Het) y C9of72-'~ (Ko );
Figura 3AJ: niveles ilustrativos de autoanticuerpos circulantes (en Ulml, eje y) en ratones hembras, 26-34 semanas de edad, (fila superior) y machos, 26-34 semanas de edad, (fila inferior) de tipo silvestre (WT), C9orf72¥l~ (Het) y C9orf72rl~ (KO);
Figura 3AK: imágenes ilustrativas de riñón (arriba) e hígado (abajo) seccionados de ratones de tipo silvestre (WT) y C9orf72'¡' a 100x y 20x de potencia, respectivamente, teñidos con hematoxilina y eosina (H-E) o F4l80 mediante inmunohistoquímica (IHC F4/80);
Figura 3AL: imágenes ilustrativas de tejido renal seccionado de ratones de 8-63 semanas de edad de tipo silvestre (WT) y C9orf72'¡' teñidos con hematoxilina y eosina (H-E, panel superior), IgG (2do panel desde arriba), IgM (3er panel desde arriba) y Complemento C3 (panel inferior). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA).
La Figura 4 muestra un porcentaje ilustrativo de neuronas vivas con respecto al control (eje y) en neuronas de tipo silvestre cultivadas tratadas con diversas concentraciones de toxinas. La parte superior ilustra el diseño experimental como se describe en el Ejemplo 4. DA (ácido domoico; agonista del receptor de AMPA/kainato), BMAA (p-metilamino-L-alanina, 100 j M), MK801 (Dizocilpina, 10 j M; antagonista del receptor NMDA), NBQX (2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoilbenzoquinoxalina-2,3-diona, 10 j M; antagonista del receptor AMPA/kainato); Glutatión (10 j M, antioxidante). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA). Cox, P.A. y otros, 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 100(23):13380-13383; Murch, S.J. y otros, 2004, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 101(33):12228-12231; Cox, P.A. y otros, 2005, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU.
102(14):5074-5078; Erdner, D.L. y otros, 2008, Environmental Health, 7 (Supl. 2):S2.
Las Figuras 5A-5D muestran la medición de fenotipos similares a la ALS en ratones de tipo silvestre administrados con inyecciones i.p. de BMMA (n=5) o PBS (control, n=5).
Figura 5A: la parte superior ilustra el diseño experimental y los puntos de tiempo para el tratamiento, la medición del peso corporal y los estudios de comportamiento, la parte inferior muestra un cambio ilustrativo del peso corporal (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones control (negro) y tratados con BMAA (gris);
Figura 5B: tiempo máximo ilustrativo en rotarod (eje y, segundos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones control (negro) y tratados con BMAA (gris);
Figura 5C: comportamiento locomotor en campo abierto ilustrativo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y; en segundos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones control (negro) y tratados con BMAA (gris);
Figura 5D: comportamiento de pasarela ilustrativo, por ejemplo, longitud de zancada media (arriba a la izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (arriba a la derecha) presentada como por ciento de índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (centro inferior) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones control (negro) y tratados con BMAA (gris). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA).
Las Figuras 6A-6E muestran la medición de fenotipos similares a la ALS en ratones de tipo silvestre y C9orf72~l~ administrados con inyecciones i.p. de BMMA (tipo silvestre con BMAA: 3 machos, 2 hembras; con anulación del gen con BMAA: 3 machos, 3 hembras) o PBS (control de tipo silvestre: 4 machos, 1 hembra; control con anulación del gen: 5 machos, 1 hembra).
Figura 6A: la parte superior ilustra el diseño experimental y los puntos de tiempo para el tratamiento, la medición del peso corporal y los estudios de comportamiento, la parte inferior izquierda muestra un por ciento de supervivencia ilustrativo (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), la parte inferior derecha muestra un cambio ilustrativo de peso corporal (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 6B: arriba a la izquierda muestra una puntuación de deterioro motor medio ilustrativo en el tiempo (eje x, semanas), en la parte superior a la derecha muestra una puntuación de temblor medio ilustrativo en el tiempo (eje x, semanas), la parte inferior muestra una puntuación de rigidez media ilustrativa en el tiempo (eje x, semanas); Figura 6C: tiempo máximo ilustrativo en rotarod (eje y, segundos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 6D: comportamiento locomotor en campo abierto ilustrativo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas);
Figura 6E: comportamiento de pasarela ilustrativo, por ejemplo, longitud de zancada media (arriba a la izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (arriba a la derecha) presentada como por ciento de índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (centro inferior) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA).
La Figura 7 muestra la supervivencia (abajo a la izquierda) y estrés oxidativo (abajo a la derecha) in vitro de neuronas motoras de tipo silvestre y C9orf72r/~ (con anulación del gen) tratadas con BMAA. Arriba, ilustración esquemática del diseño experimental; la supervivencia (abajo a la izquierda) se presenta como porcentaje de neuronas vivas con respecto al control de tipo silvestre (eje y) en neuronas de tipo silvestre (control) y C9orf72rl~ (con anulación del gen) tratadas con BMAA 100 mM. El estrés oxidativo en el día 1 (izquierda de abajo a la derecha) y el día 7 (derecha de abajo a la derecha) se presenta como densidad óptica media de fluorescencia de -485/520 nm producida por una sonda sensible a las ROS, CellROX Green (Life Technologies). La significación estadística se determinó mediante el uso de la prueba t no apareada de Student y la prueba de análisis de varianza de una vía (ANOVA).
La Figura 8 muestra supervivencia (arriba a la izquierda), estrés oxidativo (arriba a la mitad), relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear (arriba a la derecha) ilustrativas y diversas mediciones de la función mitocondrial (abajo de izquierda a derecha) en neuronas motoras de tipo silvestre (WT) y C9orf72rl~. La supervivencia (arriba a la izquierda) se presenta como el número de células como por ciento con respecto a C9orf72+l+; el estrés oxidativo en el día 1 y el día 7 se presenta como especies reactivas de oxígeno (ROS; por ciento de densidad óptica con respecto a C9orf72*l+); la relación ADN mitocondrial con respecto al nuclear se presenta como el número medio de copias mitocondriales; la respiración mitocondrial se presenta como la tasa de consumo de oxígeno calculada como por ciento con respecto a C9orf72+l+ 1ra medición; la respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de reserva y la respiración no mitocondrial se presentan como la tasa de consumo de oxígeno calculada como por ciento con respecto al control C9orf72+l+.
Las Figuras 9A-9C muestran glomerulonefropatía progresiva en ratones C9orf72'~. La Figura 9A muestra gráficos ponderados de puntuación histopatológica que demuestran que los cambios renales más significativos observados en ratones anulados se asocian con la glomerulonefritis membranoproliferativa. La Figura 9B muestra puntuaciones histopatológicas individuales correspondientes a los gráficos ponderados representados en la Figura 9A. Brevemente, las secciones de riñón teñidas con H-E se puntuaron a ciegas para las categorías de enfermedad renal asociada con la glomerulonefropatía mediada por el sistema inmunitario: glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, formación de cilindros hialinos, glomeruloesclerosis y túbulos basófilos. Puntuación de 0=ninguno, 1=mínimo, 2=leve, 3=moderado y 4=severo. Todos los ratones anulados mostraron glomerulonefritis membranoproliferativa mínima a severa con evidencia ocasional de categorías de enfermedades adicionales en animales más gravemente afectados. La Figura 9C muestra las mediciones de ACR en orina analizadas a los 14 días (Figura 9C, arriba) y 24 semanas (Figura 9C, abajo), los puntos de tiempo de la misma cohorte de ratones indican la aparición de albuminuria en ratones C9orf72r/~ con la edad. Los ratones heterocigotos mostraron valores comparables a los WT consistentes con la ausencia de un fenotipo observado.
La Figura 10 demuestra que las células T foliculares auxiliares (Tfh) (CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+) aumentaron significativamente en por ciento y el recuento de células totales en bazo, CLN, MLN y sangre C9orf72 ~'~. Los gráficos representan la media ± s.e.m. (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 por prueba t de Student no apareada), hembras de 26 semanas, n=5 por genotipo. Además, se observaron células Tfh elevadas en BM C9orf72r/~ que no alcanzó significación.
Definiciones
Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos en la presente descripción, ya que estos métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solamente para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos y frases que se usan en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación, se describirán métodos y materiales particulares.
“Adm inistración" incluye la administración de una composición a un sujeto o sistema (por ejemplo, a una célula, órgano, tejido, organismo, o componente en cuestión o conjunto de componentes de estos). Los expertos apreciarán que la vía de administración puede variar en dependencia de, por ejemplo, el sujeto o sistema a los cuales la composición se administra, la naturaleza de la composición, el propósito de la administración, etcétera. Por ejemplo, en modalidades determinadas, la administración a un sujeto animal (por ejemplo, a un ser humano o a un roedor) puede ser bronquial (lo que incluye mediante instilación bronquial), bucal, enteral, interdérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosal, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (lo que incluye mediante instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y/o vítrea. En algunas modalidades, la administración puede implicar una dosificación intermitente. En algunas modalidades, la administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un periodo de tiempo seleccionado.
"Mejoría" incluye la prevención, reducción o alivio de un estado, o mejoría del estado de un sujeto. La mejoría incluye, pero no requiere la recuperación completa o prevención completa de una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, daño por radiación).
"Aproximadamente", como se aplica en la presente descripción a uno o más valores de interés, incluye un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas modalidades, el término “aproximadamente” o ‘‘alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o sea evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).
“Biológicamente activo" incluye una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En modalidades particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se refiere típicamente como una porción “biológicamente activa”.
“ Comparable" incluye dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones razonables en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la materia comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, para considerarse comparables.
"Conservadora", cuando describe una sustitución de aminoácido conservadora, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet G.H. y otros, 1992, Science 256:1443-1445. En algunas modalidades, una sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
“ Control" incluye el significado que se entiende en la técnica de un "control" que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. En algunas modalidades, un control es una reacción o un ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Un "control" incluye, además, un "animal de control'. Un “animal de control’ puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción, o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica una "prueba" (es decir, una variable que se prueba). En un segundo experimento, el "control", no se aplica la variable que se prueba. En algunas modalidades, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados anteriormente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunas modalidades, un control es o comprende un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.
"Interrupción" incluye el resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). En algunas modalidades, una interrupción puede lograr o representar una inserción, una deleción, una sustitución, un reemplazo, una mutación con pérdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinación de estos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunas modalidades, una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunas modalidades, una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado. En algunas de dichas modalidades, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar el nivel, pero no la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar la actividad, pero no el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.
"Determinar", "m edir', "evaluar", "va lorar', "ensayar" y "analizar" incluyen cualquier forma de medición, e incluye determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayar para determinar la presencia de" puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.
"Locus endógeno' o "gen endógeno" incluye un locus genético encontrado en un organismo parental o de referencia antes de la introducción de una interrupción, deleción, reemplazo, alteración o modificación como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el locus endógeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, el locus endógeno es un locus de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo diseñado. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado genéticamente).
"Prom otor endógeno" incluye un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endógeno.
"Gen" incluye una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica para un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto polipeptídico). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto en particular). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunas modalidades particulares, un gen puede incluirtanto secuencias codificantes (por ejemplo, exónicas) como no codificantes (por ejemplo, intrónicas). En algunas modalidades, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etcétera) y/o secuencias intrónicas que, por ejemplo, pueden controlar o influir en uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, la expresión celular tipo específica, la expresión inducible, etcétera). Para mayor claridad observamos que, como se usa en la presente solicitud, el término "gene" se refiere generalmente a una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido; el término puede abarcar opcionalmente secuencias reguladoras, como quedará claro por el contexto para los expertos en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término "gen" a unidades de expresión que no codifican proteínas, sino más bien para aclarar que, en la mayoría de los casos, el término como se usa en la presente descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica polipéptidos.
"Heterólogo” incluye un agente o entidad a partir de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, un gen, o un producto génico presente en una célula u organismo en particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico en cuestión: 1) se modificó genéticamente por la mano del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de estos) a través de la mano del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo en cuestión (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo en cuestión). "Heterólogo" incluye, además, un polipéptido, gen o producto génico que está presente normalmente en una célula u organismo nativo particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, por mutación o colocación bajo el control de agentes no asociados naturalmente y, en algunas modalidades, elementos reguladores no endógenos (por ejemplo, un promotor).
"Célula huésped” incluye una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico o una proteína. Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de tal una célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero aún se incluye dentro del alcance de la frase "célula huésped'. En algunas modalidades, una célula huésped es, o comprende, una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o una proteína heterólogos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las procariotas y eucariotas (célula única o célula múltiple), células bacterianas (por ejemplo, cepas de Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcétera), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, etcétera), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectados con baculovirus, Trichoplusia ni, etcétera), células animales no humanas, células humanas, o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona de las células siguientes: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, c Os -7), célula de retina, Vero, CV1, riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3t 3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula p Er .C6®). En algunas modalidades, una célula huésped es, o comprende, una célula aislada. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un tejido. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un organismo.
"Identidad", en relación con una comparación de secuencias, incluye la identidad según se determina mediante una serie de algoritmos diferentes que se conocen en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas modalidades, las identidades como se describen en la presente descripción, se determinan mediante el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de interrupción de 10.0, una penalización por extensión de interrupción de 0.1, y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
"Mejorar", "aumentar", "e lim inar" o "reducir", incluye los valores indicados que son relativos a una medición de los valores iniciales, tal como una medición en el mismo individuo (o animal) antes de iniciar el tratamiento descrito en la presente descripción, o una medición en un individuo control (o animal) o múltiples individuos controles (o animales) en ausencia del tratamiento descrito en la presente descripción.
"A islada" incluye una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado, y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90
%, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente
95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de
aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas modalidades, los
agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96
%, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % puros.
En algunas modalidades, una sustancia es “pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas
modalidades, como comprenderán los expertos en la materia, una sustancia aún puede considerarse "aislada" o incluso
"pura", después de haberse combinado con otros determinados componentes tales como, por ejemplo, uno o más
portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etcétera); en tales modalidades, el por ciento de
aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Para proporcionar un ejemplo,
en algunas modalidades, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza
se considera “aislado" cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los
componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos
o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra
de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la
especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido que se sintetiza
químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido
"aislado". Alternativa o adicionalmente, en algunas modalidades, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas
de purificación puede considerarse un polipéptido "aislado" en la medida en que se haya separado de otros componentes
a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asoció cuando se produjo inicialmente.
"Locus" o "Loci" incluye una localización(s) específica(s) de un gen (o secuencia significativa), secuencia de ADN,
secuencia codificante de un polipéptido, o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un “locus
C9ORF72’ puede referirse a la localización específica de un gen C9ORF72, secuencia de ADN de C9ORF72, secuencia
codificante de C9ORF72, o la posición de C9ORF72 en un cromosoma del genoma de un organismo que se ha identificado
que es donde reside dicha secuencia. Un “locus C9ORF72” puede comprender un elemento regulador de un gen
C9ORF72, lo que incluye, pero no se limita a, un potenciador, un promotor, una UTR 5' y/o 3', o una combinación de
estos. Los expertos en la técnica apreciarán que los cromosomas pueden, en algunas modalidades, contener cientos o
incluso miles de genes y demostrar la colocalización física de loci genéticos similares cuando se compara entre diferentes
especies. Dichos loci genéticos pueden describirse como que tienen una sintenía compartida.
"Animal no humano” incluye cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. En algunas modalidades, un
animal no humano es un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio,
un reptil, un mamífero, y un ave. En algunas modalidades, un mamífero no humano es un primate, una cabra, una oveja,
un cerdo, un perro, una vaca, o un roedor. En algunas modalidades, el animal no humano es un roedor tal como una rata
o un ratón.
"Ácido nucle ico" incluye cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena de oligonucleótido, o que puede
incorporarse a ella. En algunas modalidades, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que es una cadena de
oligonucleótido, o que puede incorporarse a ella, mediante un enlace fosfodiéster. Como será evidente a partir del
contexto, en algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo,
nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de oligonucleótido que
comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas modalidades, un "ácido nucleico" es o comprende a RN;
en algunas modalidades, un "ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunas modalidades, un ácido nucleico es,
comprende, o consiste en uno o más residuos de ácido nucleico naturales. En algunas modalidades, un ácido nucleico
es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácido nucleico. En algunas modalidades, un análogo de ácido
nucleico difiere de un ácido nucleico en el hecho de que no utiliza una cadena con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, en
algunas modalidades, un ácido nucleico es, comprende, o consiste en uno o más "ácidos nucleicos peptídicos", que se
conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, y se consideran
dentro del alcance de la presente invención. Alternativa o adicionalmente, en algunas modalidades, un ácido nucleico
tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunas modalidades, un
“ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina,
guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). En algunas
modalidades, un “ácido nucleico” es, comprende, o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5
propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y combinaciones de estos). En
algunas modalidades, un "ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa,
ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparación con los de ácidos nucleicos naturales. En algunas
modalidades, un "ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que codifican un producto génico funcional tal como
un ARN o proteína. En algunas modalidades, un "ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunas modalidades,
un "ácido nucleico" incluye uno o más exones. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" se prepara mediante uno o
más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinantes, y síntesis química. En algunas modalidades, un “ácido nucleico" es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de largo. En algunas modalidades, un "ácido nucleico" es monocatenario; en algunas modalidades, un "ácido nucleico" es bicatenario. En algunas modalidades "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas modalidades, un "ácido nucleico" tiene actividad enzimática.
"Unidos operativamente" incluye una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión" incluye secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificantes a las que se unen. Las "secuencias de control de la expresión" incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales eficientes para el procesamiento del ARN tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando sea deseado, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias control difiere según el organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen secuencias promotoras, sitio de unión al ribosoma, y terminación de la transcripción, mientras que, en eucariotas, típicamente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término "secuencias control' está destinado a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
"Fenotipo" incluye un rasgo, o una clase o conjunto de rasgos mostrados por una célula u organismo. En algunas modalidades, un fenotipo particular puede correlacionarse con un alelo o genotipo particular. En algunas modalidades, un fenotipo puede ser discreto; en algunas modalidades, un fenotipo puede ser continuo.
"Condiciones fisiológicas" incluye su significado conocido en la técnica que hace referencia a las condiciones en las cuales las células u organismos viven y/o se reproducen. En algunas modalidades, el término incluye las condiciones del medio externo o interno que pueden producirse en la naturaleza para un organismo o sistema celular. En algunas modalidades, las condiciones fisiológicas son las condiciones presentes dentro del cuerpo de un animal humano o no humano, especialmente las condiciones presentes en un sitio quirúrgico y/o dentro de él. Las condiciones fisiológicas típicamente incluyen, por ejemplo, un intervalo de temperatura de 20-40 °C, presión atmosférica de 1, pH de 6-8, concentración de glucosa de 1-20 mM, concentración de oxígeno a niveles atmosféricos, y gravedad similar a la presente en la tierra. En algunas modalidades, las condiciones en un laboratorio se manipulan y/o se mantienen en condiciones fisiológicas. En algunas modalidades, las condiciones fisiológicas se encuentran en un organismo.
"Polipéptido" incluye cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no está presente en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza separadas entre sí (es decir, a partir de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente en el hecho de que se diseña y/o produce mediante la acción del hombre.
"Prevenir" o "prevención", cuando se usa en relación con la ocurrencia de una enfermedad, trastorno, y/o afección, incluye reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección y/o a retrasar la aparición de una o más características o síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. La prevención puede considerarse completa cuando la aparición de una enfermedad, trastorno o afección se ha retrasado durante un periodo de tiempo predefinido.
“Referencia" incluye un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor estándar o control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, cohorte, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se somete a prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, cohorte, animal, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. En algunas modalidades, una referencia puede referirse a un control. Una "referencia" incluye, además, un "animal de referencia". Un “animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o se caracteriza en condiciones comparables a las utilizadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.
"Respuesta" incluye cualquier alteración beneficiosa en la afección de un sujeto que se produce como resultado de o se correlaciona con el tratamiento. Dicha alteración puede incluir la estabilización de la afección (por ejemplo, prevención del deterioro que habría tenido lugar en ausencia del tratamiento), la mejoría de los síntomas de la afección y/o la mejoría de las perspectivas de curación de la afección, etcétera. Puede referirse a la respuesta de un sujeto o a la respuesta de una neurona. La respuesta de la neurona o del sujeto puede medirse de acuerdo con una amplia variedad de criterios, lo que incluye criterios clínicos y criterios objetivos. El examen del sistema motor de un sujeto puede incluir el examen de uno o más de fuerza, reflejos tendinosos, reflejos superficiales, masa muscular, coordinación, tono muscular, movimientos anormales, postura y marcha. Las técnicas para evaluar la respuesta incluyen, pero no se limitan a, examen clínico, flexión de estiramiento (reflejo miotático), reflejo de Hoffmann y/o pruebas de presión. Los métodos y guías para evaluar la respuesta al tratamiento se analizan en Brodal, A.: Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine, ed. 2, Nueva York, Oxford University Press, 1969; Medical Council of the U.K.: Aids to the Examination of the Peripheral Nervous System, Palo Alto, Calif., Pendragon House, 1978; Monrad-Krohn, G.H., Refsum, S.: The Clinical Examination of the Nervous System, ed. 12, Londres, H.K. Lewisy otros, 1964; y Wolf, J.K.: Segmental Neurology, AG uidetothe Examination and Interpretation of Sensory and Motor Function, Baltimore, University Park Press, 1981. Los criterios de respuesta exactos pueden seleccionarse de cualquier manera apropiada, siempre y cuando al comparar grupos de neuronas y/o pacientes, los grupos a comparar se evalúen con base en los mismos criterios o en criterios comparables para determinar la tasa de respuesta. Un experto en la técnica podrá seleccionar los criterios apropiados.
“Riesgo", como se entenderá del contexto, de una enfermedad, trastorno y/o afección comprende la probabilidad de que un individuo en particular desarrolle una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, un daño por radiación). En algunas modalidades, el riesgo se expresa como un porcentaje. En algunas modalidades, el riesgo es de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y hasta 100 %. En algunas modalidades el riesgo se expresa como un riesgo relativo a un riesgo asociado con una muestra de referencia o grupo de muestras de referencia. En algunas modalidades, una muestra de referencia o grupo de muestras de referencia tienen un riesgo conocido de una enfermedad, trastorno, afección y/o evento (por ejemplo, un daño por radiación). En algunas modalidades una muestra de referencia o grupo de muestras de referencia son de individuos comparables con un individuo particular. En algunas modalidades, el riesgo relativo es 0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.
“ Sustancialmente” incluye la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos casi nunca, si alguna vez, llegan a completarse y/o avanzan hasta su completamiento o alcanzan o evitan un resultado absoluto. El término “sustancialmente" se usa por lo tanto en la presente descripción para captar la carencia potencial de completamiento inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.
“Homología sustancial” incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por los expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son"sustancialmente homólogas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la técnica, ciertos aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos", y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución "homóloga". Las categorías típicas de los aminoácidos se resumen más abajo.
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, lo que incluye aquellos disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y b La STP, BLAST con huecos, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Dichos programas ilustrativos se describen en Altschul, S. F. y otros, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. y otros, 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F. y otros, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., y B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener y otros (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.
132), Humana Press, 1998. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un segmento relevante de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestión es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunas modalidades, el tramo en cuestión incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo relevante incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa, por ejemplo, residuos no contiguos unidos entre sí por la conformación plegada de un polipéptido o una porción de este. En algunas modalidades, el tramo en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
“ Identidad sustancia l" incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como se apreciará por los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, lo que incluye aquellos disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Dichos programas ilustrativos se describen en Altschul, S.F. y otros, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. y otros, 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. y otros, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., y B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener y otros (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan un indicio del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente idénticas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.
"Vector de direccionamiento" o "constructo de direccionam iento" incluye una molécula de polinucleótido que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal objetivo y proporciona la integración del constructo de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de direccionamiento que se dirigen hacia el objetivo mediante el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio específicas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). En algunas modalidades, un constructo de direccionamiento como se describe en la presente descripción comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen (por ejemplo, un gen indicador o gen homólogo o heterólogo) de particular interés, un marcador seleccionable, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácido nucleico que codifican una recombinasa o proteína recombinogénica. En algunas modalidades, un constructo de direccionamiento comprende, además, un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. En algunas modalidades, un constructo de direccionamiento puede comprender un gen de interés humanizado, en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés humanizado codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por una secuencia endógena. En algunas modalidades, un constructo de direccionamiento puede comprender un gen indicador, en su totalidad o en parte, en donde el gen indicador codifica un polipéptido que se identifica y/o mide fácilmente mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica.
"Anim al transgénico", "animal transgénico no humano" o "Tg+" incluye cualquier animal no humano de origen no natural en el que una o más de las células del animal no humano contienen ácido nucleico heterólogo y/o un gen que codifica un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte. En algunas modalidades, un ácido nucleico heterólogo y/o gen se introduce en la célula, directa o indirectamente, mediante la introducción en un precursor de la célula, por medio de la manipulación genética deliberada, tal como por microinyección, o por infección con un virus recombinante. El término manipulación genética no incluye técnicas de reproducción clásicas, sino que en su lugar se dirige a la introducción de una molécula(s) de ADN recombinante. Esta molécula puede integrarse dentro de un cromosoma, o el ADN puede replicarse de manera extracromosómica. El término 'Tg+"incluye animales que son heterocigotos u homocigotos para un ácido nucleico y/o gen heterólogo, y/o animales que tienen copias simples o múltiples de un ácido nucleico y/o gen heterólogo.
“ Tratamiento”, “ trata” o “ tratar” incluye cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, un candidato terapéutico) que parcialmente o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retarda la aparición, reduce la gravedad, y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características, y/o causas de una enfermedad, trastorno, y/o afección en particular. En algunas modalidades, dicho tratamiento puede administrarse a un sujeto que no exhibe signos de la enfermedad, trastorno y/o afección en cuestión y/o de un sujeto que sólo exhibe signos tempranos de la enfermedad, trastorno, y/o afección. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, el tratamiento puede administrarse a un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección en cuestión. En algunas modalidades, el tratamiento puede ser de un sujeto que se ha diagnosticado que padece de la enfermedad, trastorno, y/o afección en cuestión. En algunas modalidades, el tratamiento puede ser de un sujeto que se conoce que tiene uno o más factores de susceptibilidad correlacionados estadísticamente con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno, y/o afección en cuestión.
“ Variante” incluye una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de uno o más restos químicos en comparación con la entidad de referencia. En muchas modalidades, una"variante” se diferencia, además, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una "variante’’ de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una "variante", por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcétera) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que se compone de una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que se compone de una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una "variante de polipéptido’’ puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etcétera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. En algunas modalidades, una "variante de polipéptido’’ muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, una "variante de polipéptido’’ no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas modalidades, una "variante de polipéptido’’ comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una "variante de polipéptido’’ carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una "variante de polipéptido’’ muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchas modalidades, un polipéptido de interés se considera una "variante” de un polipéptido parental o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del parental excepto por un pequeño número de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 % o 2 % de los residuos en la variante se sustituyen en comparación con el parental. En algunas modalidades, una "variante” tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo(s) sustituido(s) en comparación con un parental. Frecuentemente, una "variante” tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2, o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una "variante” no tiene más de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el parental. Por otra parte, cualquiera de las adiciones o deleciones son típicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2 residuos. En algunas modalidades, el polipéptido parental o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido agente infeccioso.
“ Vector” incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicar de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en la presente descripción como “vectores de expresión".
“De tipo s ilvestre ” incluye una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “norma r (por el contrario, a mutante, enfermo, alterado, etcétera). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripción detallada de ciertas modalidades
Se proporcionan animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72. En particular, los animales no humanos descritos en la presente descripción tienen una deleción de toda la secuencia codificante en un locus C9ORF72, es decir, una deleción de un segmento genómico que codifica para todas las isoformas de C9ORF72 (por ejemplo, una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de la isoforma V1). Los animales no humanos, como se describe en la presente descripción, demuestran pérdida de peso y anomalías motoras similares a la ALS tales como, por ejemplo, inactividad motora y deterioro de la marcha. Además, los animales no humanos descritos en la presente descripción demuestran esplenomegalia y/o linfadenopatía aproximadamente a las ocho (8) semanas de edad. Además, los animales no humanos descritos en la presente descripción demuestran glomerulonefritis aproximadamente a las 35 semanas de edad. Por lo tanto, los animales no humanos proporcionados son particularmente útiles para el desarrollo e identificación de candidatos terapéuticos para el tratamiento y/o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas y, en algunas modalidades, enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias y/o inflamatorias. En particular, los animales no humanos descritos en la presente descripción abarcan la introducción de un gen indicador en un locus C9ORF72 endógeno, lo que resulta en la expresión del gen indicador (es decir, un polipéptido indicador) en los sistemas nervioso e inmunitario del animal no humano. Dichos animales transgénicos no humanos proporcionan una fuente de células para determinar la eficacia de candidatos terapéuticos para mejorar la ALS y/o la FTD. Además, dichos animales transgénicos no humanos proporcionan un sistema de modelo animal útil para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas, autoinmunitarias y/o inflamatorias.
En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción desarrollan una enfermedad similar a la ALS y/o la FTD debido a la ausencia, falta o disminución del nivel de C9ORF72 (por ejemplo, ARN, polipéptido, etcétera) en células de los animales no humanos. En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción desarrollan glomerulonefritis debido a la ausencia, falta o disminución del nivel de C9ORF72 (por ejemplo, ARN, polipéptido, etcétera). En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción son heterocigotos para una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción son homocigotos para una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, los animales no humanos como se describen en la presente descripción comprenden un gen indicador, en su totalidad o en parte, en donde dicho gen indicador se une operativamente a un promotor de C9ORF72. En algunas modalidades, los promotores de C9ORF72 incluyen promotores de C9ORF72 endógenos.
La presente descripción proporciona un análisis fenotípico integral de una línea de animal no humano con ablación global de C9orf72 y el descubrimiento de un papel único para C9orf72 en la homeostasis del sistema inmunitario. La presente descripción demuestra específicamente que una ablación completa de C9orf72 resultó en anomalías de la marcha y una indicación hacia la debilidad de las extremidades posteriores que sugiere un posible inicio de la patología de las neuronas motoras inferiores que comienza aproximadamente a las 40 semanas de edad. Como se describe en la presente descripción, el fenotipo inmunitario exhibido por animales no humanos C9orf72r/~ consistió en expansiones selectas tanto en los compartimientos mieloides como linfoides, con una mayor activación de células T y células plasmáticas elevadas. La neutrofilia y la monocitosis resultaron en infiltrados mixtos en los órganos inmunitarios que se expandieron, pero no destruyeron la arquitectura básica. Los animales no humanos C9orf72r/~ demostraron citocinas séricas elevadas (por ejemplo, IL-12) y firmas de ARN tisular compatibles con regulación positiva mieloide. La enfermedad renal con cambios patológicos acompañantes tales como, por ejemplo, la membrana basal engrosada y la formación de cilindros, estaba presente en la mayoría de los animales no humanos aproximadamente a las 35 semanas de edad. A nivel microscópico, los glomérulos se tiñeron fuertemente con anticuerpos IgG e IgM y complemento C3 en un patrón que indica la deposición de complejos inmunitarios. Como también se describió en la presente descripción, los animales no humanos C9orf72~l~ demostraron un alto título de autoanticuerpos, lo que incluye anti-RF, ANA, anti-Sm y anti-cardiolipina, que indicaron que la pérdida de la expresión de C9orf72 altera profundamente la homeostasis inmunitaria. No se observó ninguna de las características del fenotipo relacionadas con el sistema inmunitario en animales no humanos de tipo silvestre o C9orf72+1' (heterocigotos). Por lo tanto, la presente invención proporciona, entre otras cosas, la creación de un sistema mejorado in vivo para el desarrollo de nuevas terapias y/o la identificación de nuevos objetivos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos o afecciones que no pueden lograrse mediante el uso de los sistemas in vivo establecidos debido, en parte, a la inexistencia de fenotipos particulares en dichos sistemas establecidos.
Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las secciones siguientes. El uso de secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.
C9ORF72
La esclerosis lateral amiotrófica (ALS), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, es el trastorno paralítico de inicio en adultos más frecuente, caracterizado por la pérdida de neuronas motoras superiores y/o inferiores. La ALS se produce en hasta 20 000 personas en los Estados Unidos con aproximadamente 5000 casos nuevos cada año. La demencia frontotemporal (FTD), originalmente denominada como enfermedad de Pick por el médico Arnold Pick, es un grupo de trastornos provocados por la degeneración celular progresiva en los lóbulos frontales o temporales del cerebro. Se informa que la FTD representa el 10-15 % de todos los casos de demencia. La expansión repetida de hexanucleótidos de GGGGCC entre dos exones no codificantes de C9ORF72 se ha vinculado tanto a la ALS como a la FTD (DeJesus-Hernandez, M. y otros, 2011, Neuron 72:245-256; Renton, A.E. y otros, 2011, Neuron 72:257-268; Majounie, E. y otros, 2012, Lancet Neurol. 11:323-330; Waite, A.J. y otros, 2014, Neurobiol. Aging 35:1779.e5-1779.e13). Sin embargo, el mecanismo mediante el cual dichas mutaciones repetidas provocan la enfermedad, ya sea a través de una pérdida o ganancia de función de toxicidad, sigue sin aclararse. Por ejemplo, el pez cebra con una expresión reducida de C9ORF72 a partir de la reducción dirigida o la anulación del gen muestra axonopatía y déficits en la función locomotora (Ciura, S. y otros, 2013, Ann. Neurol 74(42):180-187), mientras que los ratones con expresión reducida de C9ORF72 no muestran ninguna característica conductual o patológica asociada con la enfermedad de ALS (Lagier-Tourenne, C. y otros, 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. E4530-E4539). Además, los ratones con introducción de genes que se han generado para contener 66 expansiones repetidas de C9ORF72 exhiben focos de ARN y agregados de proteínas dipeptídicas en sus neuronas. Estos ratones mostraron pérdida de neuronas corticales y exhibieron déficits de comportamiento y motores a los 6 meses de edad (Chew, J. y otros, 2015, Science, 14 de mayo. Pii:aaa9344).
Se han informado muchos aspectos patológicos relacionados con las expansiones repetidas de hexanucleótidos GGGGCC en C9ORF72, como, por ejemplo, la formación dependiente de la longitud de la repetición de los focos de ARN, el secuestro de proteínas específicas de unión al ARN y la acumulación y agregación de proteínas repetidas dipeptídicas (por ejemplo, revisado en Stepto, A. y otros, 2014, Acta Neuropathol. 127:377-389; ver también Almeida, S. y otros, 2013, Acta Neuropathol. 126:385-399; Bieniek, K.F. y otros, 2014, JAMA Neurol. 71(6):775-781; van Blitterswijk, M. y otros, 2014, Mol. Neurodegen 9:38, 10 páginas). Aunque se ha informado que C9ORF72 regula el tráfico endosómico (Farg, M.A. y otros, 2014, Human Mol. Gen. 23(13):3579-3595), gran parte de la función celular de C9ORF72 es aún desconocida. En efecto, C9ORF72 es un gen que codifica una proteína no caracterizada con una función desconocida. A pesar de la falta de comprensión que rodea a C9ORF72, se han desarrollado varios modelos animales, lo que incluye líneas celulares modificadas genéticamente, para la ALS y/o la FTD (Roberson, E.D., 2012, Ann. Neurol. 72(6):837-849; Panda, S.K. y otros, 2013, Genetics 195:703-715; Suzuki, N. y otros, 2013, Nature Neurosci. 16(12):1725-1728; Xu, Z. y otros, 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 110(19):7778-7783; Hukema, R.K. y otros, 2014, Acta Neuropathol. Comm.
2:166, 4 páginas). Por ejemplo, ratones transgénicos que tienen una inserción de un gen lacZ que reemplazó a los exones 2-6 de C9orf72 (311004021Rik) se han producido por los esfuerzos de direccionamiento de genes del Proyecto Knockout Mouse (ver Figura 1d de Suzuki, N. y otros, 2013, supra; para KOMP, ver Skarnes, W.C. y otros, 2011, Nature 474(7351):337-342). Se observó tinción de X-gal en el cerebro, la médula espinal, los testículos y los centros germinales del bazo en esos ratones, sin embargo, no en el músculo (tibial anterior), corazón, pulmón, hígado y riñón. Sin embargo, no está claro si los exones no eliminados restantes (es decir, 7-11) producen alguna expresión y, en consecuencia, funcionan. Otro informe que usa una cepa de ratón transgénico que contiene 80 repeticiones GGGGCC unidas operativamente con un indicador fluorescente y controladas por un elemento de respuesta a la tetraciclina sin ninguna secuencia de C9orf72 circundante, demostraron inclusiones citoplasmáticas neuronales similares a las observadas en pacientes con ALS-FTD, lo que sugiere que la expansión de la repetición en sí misma puede ser responsable de la enfermedad (Hukema, R.K. y otros, 2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 páginas). Estos ratones han sido útiles para establecer un perfil de expresión inicial de C9orf72 en células del SNC y proporcionar cierta comprensión del mecanismo de acción asociado con la expansión de repeticiones; sin embargo, aún no está claro si el diseño específico de estos constructos en estos ratones indica funciones específicas que pueden atribuirse con confianza a C9orf72 o son el resultado de algo más, no relacionado con la función de C9orf72.
Sin embargo, en algunos casos, el diseño del constructo puede influir en el fenotipo del animal transgénico resultante (ver, por ejemplo, Muller, U., 1999, Mech. Develop. 81:3-21). Debido a que los ratones con interrupción de C9orf72 como se describió anteriormente usaron un vector de direccionamiento con un casete de selección dirigido por un promotor (ver Figura 1d de Suzuki, N. y otros, 2013, supra; Figura 1 de Skarnes, W.C. y otros, 2011, supra), no está claro si el patrón de expresión mostrado se correlaciona correctamente con la expresión normal de C9ORF72. De hecho, la expresión de los exones restantes 7-11 conducida por el promotor asociado al casete de selección o el promotor de C9ORF72 en sí mismo no se ha determinado. Como resultado, los fenotipos, y tal vez la expresión de C9ORF72 a través de lacZ, observada en dichos ratones puede modificarse o de cualquier otra manera sesgarse debido a aspectos del vector de direccionamiento. Además, una cepa de ratón transgénico que contenía una repetición inducible de GGGGCC (Hukema, 2014, supra) se diseñó sin secuencia de flanqueo humano presumiblemente debido al hecho de que se pensaba que dicha secuencia circundante afectaba la traducción de las secuencias de repeticiones. Por lo tanto, dichos sistemas in vivo que explotan la biología mediada por C9ORF72 para aplicaciones terapéuticas están incompletos.
Como se describe en la presente descripción, la presente descripción describe específicamente un modelo animal no humano para la ALS y/o la FTD, cuyo animal no humano comprende una interrupción en un locus C9ORF72. En particular, la presente descripción describe específicamente un modelo de roedor para la ALS y/o la FTD, en donde el roedor comprende una deleción de toda la secuencia codificante para todas las isoformas de C9orf72 (por ejemplo, la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de V1) de un gen C9orf72 a través de la inserción de un gen indicador lacZ. El vector de direccionamiento empleado por los presentes inventores se diseñó para contener un casete de selección de fármaco con autoeliminación (ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389), lo que permite la eliminación del casete de selección de fármaco de una manera dependiente del desarrollo, lo que elimina de esta manera cualquier posibilidad de efectos del promotor o la expresión aberrante de los exones restantes o efectos a partir del propio casete de selección. Como se describe en la presente descripción, los presentes inventores lograron la ablación completa de C9orf72. Además, los presentes inventores midieron los comportamientos motores de estos roedores mediante el uso de ensayos en rotarod, campo abierto y pasarela hasta 60 semanas de edad y déficits neurológicos durante el mismo período. Sin desear limitarse por ninguna teoría en particular, la presente descripción demuestra que solo el 40 % de los roedores con anulación del gen C9orf72 sobrevivieron después de las 60 semanas de edad y los roedores dejaron de aumentar de peso a partir de alrededor las 40 semanas de edad. Si bien las pruebas de rotarod no mostraron cambios significativos debido a la deleción de C9orf72, los roedores descritos en la presente descripción demostraron paresia significativa de las extremidades posteriores, deterioro motor, movilidad reducida y anomalías de la marcha alrededor de las 50 semanas de edad. Además, la presente descripción demuestra específicamente que el silenciamiento genético del C9orf72 murino resulta en múltiples anomalías motoras y neurológicas similares a las que se encuentran en las enfermedades de las neuronas motoras humanas. Por lo tanto, los roedores descritos en la presente descripción proporcionan, al menos en algunas modalidades, sistemas in vivo mejorados para el desarrollo de candidatos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como, por ejemplo, la ALS y/o la FTD. Además, los roedores descritos en la presente descripción superan los déficits en los modelos animales existentes caracterizados por la deleción subóptima de C9orf72 para el desarrollo de terapias dirigidas a C9orf72.
Secuencias de C90RF72
Se han informado variantes de transcriptos de C9ORF72 de ratón en la técnica (por ejemplo, Koppers y otros, Ann Neurol (2015); 78:426-438; Atkinson y otros, Acta Neuropathologica Communications (2015) 3:59), y también se representan en la Figura 1A. La información genómica de las tres variantes de transcriptos de C9ORF72 de ratón también están disponibles en el sitio web de Ensembl bajo las designaciones de ENSMUST00000108127 (V1), ENSMUST00000108126 (V2) y ENSMUST00000084724 (V3). Las secuencias de ARNm y de aminoácidos de C9ORF72 no humano ilustrativas (por ejemplo, de roedor) se exponen en la Tabla 1. Para las secuencias de ARNm, la letra en negritas contenida entre paréntesis indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, donde se indican, se separan al alternar letras mayúsculas y minúsculas. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias de polipéptidos maduros, donde se indica, están en letras negritas.
Se conocen en la técnica variantes de transcriptos de C9ORF72 humano. Una variante de transcripto de C9ORF72 humano carece de múltiples exones en las regiones codificantes central y 3', y su exón terminal 3' se extiende más allá de un sitio de empalme que se usa en la variante 3 (ver más abajo), lo que resulta en una nueva región no traducida (UTR) 3' en comparación a la variante 3. Esta variante codifica un polipéptido significativamente más corto y su aminoácido C-terminal es distinto en comparación con el que se codifica por otras dos variantes. Las secuencias de ARNm y de aminoácidos de esta variante pueden encontrarse en los números de acceso GenBank NM_145005.6 y NP_659442.2, respectivamente. Una segunda variante (2) de transcripto de C9ORF72 humano difiere en la región no traducida (UTR) 5' en comparación con la variante 3. Las secuencias de ARNm y aminoácidos de esta variante pueden encontrarse en los números de acceso de GenBank NM_018325.4 y NP_060795.1, respectivamente. Una tercera variante (3) de transcripto de C9ORF72 humano contiene la secuencia más larga entre las tres variantes informadas y codifica la isoforma más larga. Las secuencias de ARNm y de aminoácidos de esta variante pueden encontrarse en los números de acceso de GenBank NM_001256054.2 y NP_001242983.1, respectivamente. Las variantes 2 y 3 codifican la misma proteína.
TABLA 1
Mus músculos C 9orp2 ARNm (NMJM1081343; SEQ 1DNÜ:1)
agcagcggcgagtggCTATTGCAAGCGTTCGGATAATGTGAGACCTGGAATGCAGTG AGACCTGGGATGCAGGG(ATGTCGACTATCTGCCCCCCACCATCTCCTGCT GTTGCC A AGACAGAGATTGCTTTAAGTGGTGA A TCACC CTTGTTGGCGG CTACCTTTGCTTACTGGGATAATATTCTTGGTCCTAGAGTAAGGCATATT TGGGCTCC AA AGA CAGACCA AGTGCTTCTCAGTGATGGA GAA ATAACTT TTCTTGCCAACCACACTCTAAATGGAGAAATTCTTCGAAATGCAGAGAG TGGGGCTATAGATGTAAAATTTTTTGTCTTATCTGAAAAAGGGGTAATTA TTG TTTC ATTA ATCTT CGAC GGAA ACTG C A ATG GAC ATCG G AGCACTTA TGGA CTATCAATTA TACTGCCGC AGA CAGAGCT G A GCTTCTACCTCCCA CITCACAGAGTGTGTGTTGACAGGCTAACACACATTATTCGA AAAGGA A GAATATGGATGCATAAGgaaagacaagaaaatgtccagaaaaltglcttggaaggcacagagaggal ggaagalcagGG I CAGAGI A l C A n CCCATGCITACTGGGGAAGTCA r I CCTG TAATGGAGCTGCTTGCATCTATGAAATCCCACACTGTTCCTGAAGACAT TCATírtagctgatacagtgctc&at&atgatgacaltggigacagctgtcacgaaggctttcttctcaaTGCCAT CAGCTCACACCTOCAGACCTGTGGCTGTTCCGTTGTAGTTGGCAGCAGT CCAGACAAAGTAAAlAAGatagiaa&aacgclglgcclulicIgácacicagcagagaggaáiiIgclc caggcIgtgtgaagcagaalrgirctttaaglacgaalcgggactctttgtgcaaggcttgctaaagGATUCAAC ACGCACTTTTGTCCTACCCTTCCGCCAAGTTATCTATGCCCCGTACCCC A C C A O G C A C A T T G A T C IG G A T G T C A A C A C T O T C A A C C A G A T G C C A C C C T GTC ATCAAC ATATTTAT A A TC A ACG CAGATACATGAGGTCAGAGCTGAC
a c c c t t c t c g a g c c c a a c t t c a g a a g a g g a c a t g c c g c a g g a c a c c a t C ATCTA C ACAG ATGAGAG CITC ACTCCTG A TITfaa la ttttcca a g a l glcltacacaga g a c M lc tf lg lg ñ a flg c c tte d lg g ^ ltf lg G T C T I’C C A T T T G A A G C G T C G C C T G T C rP C TCA GGAGTACTTTCCTTGCACAGTTOCTCCTCATTCTTCACACAAAACCCTTG ACACTAATCAAGTACATCGAGGATGATACgCflguaggggaimuugccctil&aglclLcItc ggaaecIgaagatagatctlítatilaacsigcagagggcgptcitaacalaalaatggctclagctfugaaaalLaiagoc a g ¡¿ce tacactctt tcat^U t g a gacctl t c la eac tagtgl a caa£ aac g 1 gat gt t c t a a tga ce 1111 g a )ccg tg t ggtttgptglgtctgtctcttcacagLcacwcctgctgttacaglgtcicagcftgtglgigggcacatccttcctcccgaglcctgct gcagjzacagggtaeactacacttgLcagtagaagtctgtacctgatgfcaggtgcatcgttiK^gtgüátgaetcttcctagaatá gatgtatfcm tagggccttatgittacaattalcetMgtai^ttgctgtcttttaaagatatgaatgatggaatatacacttgiiccat aacigctgaUgglttUigiUtgtungUtgtlttcuggaaacttatgattcctggUtacQtgiaccacadgaaaccclcflllagcrtt flc ag aiaaagt gt g a g i l g íicttcctg cccc tC tgtgttrtgtggtaj gtoCgat tact t ct gccacagc t aaacat tagagcatt t an ag u tgcag rtc c te ag aaaggaac tiag te Lg ac lacag a tu g Lie ugag agaagacaclgataggge agagetg tagg Lga
tatcgtgacctgtgac aa gl [tt Ltgttgg ttt a ttgtagtte tgtca aagaaagtggc a cttgt cttt ata a t Lgugccaac tttcaa ggtt aatttti'aitatttltgagecgaattaaaatgegcacctccrtgtgccrttcccaatcttggaaaatataütttcttggeagiigggieaga LtdcagjcgcccagtcacutcaLCLgaccüocctttgcacggcigccgtgtgectggcLtflgauagaügtcctLgtiaagtaLgtcii gag l acat tege tgataagatc t tlgaag agcagggaagcg te l tgee te titeet ttggtttct geet gtaetc tggtg 11 iceegtgi c aec egeateatagg aacagcag aaaaatctgaceeag tgc tattt ttctagg tgctaciatggeaa actcaagtggtctgtttc tgt tcctgtaacgttcgactatetegctagctgtgüsgtactgat(agtggagttctgtgcaac:agE^igtgtagg:Lgtataeacaaaeae aa ata tgtgtHctafttíiaa actgt ggac rtagc<i t a<aa,i agg g a ga a rat at ttatttTt taca a a ag g ga taaaaa Tgg g cecegt tcclcacccaccíigfittiagcgugiia.'iuagctttc.'tiil lelgaaaggtCflCggtggcthggeallMDaKtcaguaeaacaciica c tgacc atga t ggcttgtg aa cta actgea aggcac tccgtcatg g taj g cgagta gg t ce c acct cctagt gtgc c ge teatt g cttlacacagtagaatctlaUtgagigetaaÉtgttgtctltgcIgctiuwrtgtgttgllatagaaaaLgtaagcigtacagtgaataag t tattgaagc atgt g taaacactgttatatatjc ttt te ice tagatggggaa tt ttgaataaaataccittgaa attctgtgt
Mus mmcutus Cfc>ri7IaminoácidoíNMJHHM1343; SEQ ID NO:2) MSTICFFFSPAVAKTEIALSGESPLLAATFAYWKNILGPRVRHIWAFKTDQV LLSDGEIlTLANHTLNGEILKNAESGAlDVKJt’VLSKKGVllVSLIFDCNWNG DRSTYCLSIILPQTELSFYLFLHRVCVDRLTHIIRKCRIWMHKERQENVQK1 VLRGTRKMEnQGQSllPMLTGEVlPYMET.TjASMKSflSVPrcftlMADTVLNni) PtGDSClItXil'LLNAISSULQICGCSVWCSSAEKVNKIVRTLCLFLTPAERK CSRLCEA ESSFK Y ESG LF VQC LLK DATCSF V LPFRQ V lYI Y A PY PTTHID V D V N TYKQIV 1PPCHEHIYNQRRY MRSELT A F WR A TSKEDM AQDTIIYTDESFTPDL NIFQDVLHRDTLVKAFLDQVFHLKPGLSLRSTFLAQFLLILHRKALTLIKYIE DDTQKGKKPFKSLRNLKIDLDLT AEGDLNIIM ALAEKIKPGLHSFIFGRPFYTS VQ ERDVLMTF
Rattus norvegicus C9orf72 mRNA (NM _001007702; SEQ ID NO:3)
CGTTTGTAGTGTCAGCCATCCCAATTGCCTGTTCCTTCTCTGTGGGAGTGGTG TCTAGACAGTCCAGGCAGGGTATGCTAGGCAGGTGCGTTTTGGTTGCCTCAG ATCGCAACTTGACTCCATAACGGTGACCAAAGACAAAAGAAGGAAACCAGA TTAAAAAGAACCGGACACAGACCCCTGCAGAATCTGGAGCGGCCGTGGTTG GGGGCGGGGCTACGACGGGGCGGACTCGGGGGCGTGGGAGGGCGGGGCCG GGGCGGGGCCCGGAGCCGGCTGCGGTTGCGGTCCCTGCGCCGGCGGTGAAG GCGCAGCGGCGGCGAGTGGCTATTGCAAGCGTTTGGATAATGTGAGACCTGG GATGCAGGG(ATGTCGACTATCTGCCCCCCACCATCTCCTGCTGTTGCCA AGACAGAGATTGCTTTAAGTGGTGAATCACCCTTGTTGGCGGCTACCTT TGCTTACTGGGATAATATTCTTGGTCCTAGAGTAAGGCACATTTGGGCT CCAAAGACAGACCAAGTACTCCTCAGTGATGGAGAAATCACTTTTCTTG CCAACCACACTCTGAATGGAGAAATTCTTCGGAATGCGGAGAGTGGGGC AATAGATGTAAAGTTTTTTGTCTTATCTGAAAAGGGCGTCATTATTGTTT CATTAATCTTCGACGGGAACTGGAACGGAGATCGGAGCACTTACGGACT ATCAATTATACTGCCGCAGACGGAGCTGAGTTTCTACCTCCCACTGCAC AGAGTGTGTGTTGACAGGCTAACGCACATCATTCGAAAAGGAAGGATAT GGATGCACAAGGAAAGACAAGAAAATGTCCAGAAAATTGTCTTGGAAGG CACCGAGAGGATGGAAGATCAGGGTCAGAGTATCATCCCTATGCTTACT GGGGAGGTCATCCCTGTGATGGAGCTGCTTGCGTCTATGAGATCACACA GTGTTCCTGAAGACCTCGATATAGCTGATACAGTACTCAATGATGATGA CATTGGTGACAGCTGTCATGAAGGCTTTCTTCTCAATGCCATCAGCTCA CATCTGCAGACCTGCGGCTGTTCTGTGGTGGTAGGCAGCAGTGCAGAGA AAGTAAATAAGATAGTAAGAACACTGTGCCTTTTTCTGACACCAGCAGA GAGGAAGTGCTCCAGGCTGTGTGAAGCCGAATCGTCCTTTAAATACGAA TCTGGACTCTTTGTACAAGGCTTGCTAAAGGATGCGACTGGCAGTTTTG TACTACCTTTCCGGCAAGTTATGTATGCCCCTTATCCCACCACACACATC GATGTGGATGTCAACACTGTCAAGCAGATGCCACCGTGTCATGAACATA TTTATAATCAACGCAGATACATGAGGTCAGAGCTGACAGCCTTCTGGAG GGCAACTTCAGAAGAGGACATGGCTCAGGACACCATCATCTACACAGAT GAGAGCTTCACTCCTGATTTGAATATTTTCCAAGATGTCTTA CACA GAGA CACTCTAGTGAAAGCCTTTCTGGATCAGGTCTTCCATTTGAAGCCTGGC CTGTCTCTCAGGAGTACTTTCCTTGCACAGTTCCTCCTCATTCTTCACAG AAAAGCCTTGACACTAATCAAGTACATAGAGGATGACACGCAGAAGGGG AAAAAGCCCTTTAAGTCTCTTCGGAACCTGAAGATAGATCTTGATTTAAC AGCAGAGGGCGACCTTAACATAATAATGGCTCTAGCTGAGAAAATTAAG CCAGGCCTACACTCTTTCATCTTCGGGAGACCTTTCTACACTAGTGTCCA AGAACGTGATGTTCTAATGACTTTTTAA)ACATGTGGTTTGCTCCGTGTGTC TCATGACAGTCACACTTGCrGTTACACTüTCltAGCGCTTTGGACACATCCTT CCTCC AGG G TC C TGCCGCA GG AC A CGTTAC A CT AC ACTTGTC AG TAOAGG TC TG TACCAG ATG TCAOGTACATCGlTOTAGTGAATGTCTCTriTCCTAOACrAG ATGTACCCTCGTAGGGAClTATGITTACAACCC1-CCTAAGTACTAGTGCTG TC TTGTA A GG a t a c g a a t g a a g g g a t g t a a a c t t c a c c a c a a c t g c t g g t t g g t TTTGTTG T T IT T G T I T 1' 1'1’G A AACTTATAA TTC ATGG TTT AC ATGC ATCACA C T GAAACOCTAGTTAGCTTTTTAC AGGTA AGCIGTG AGTTGACTGCCTGTÜCCTG TGTTCTC TGGC CT GT ACO a T C rG TG g c g t g t a g g ATC a c t t t t q c a a CAA c t a AAAACTAAAGCACrrTTGTTTGCAGTTCTACAGAAAGCAACTTAGTCTGTClG C AG A T T C G lT iT lG A A AG A AG AC ATG AG A A AGCGG AGTTTT AGGTG A AGTC A G TTtTTTGG A TC TT CCTTTAT AG A CITA G TC CTTT AG ATXjTGGTC T GT ATA G AC ATGCCC A A CC ATC ATGC ATGGGC ACTO A ATATCGTG AAC TG TGCrT ATGCTTT TTGTTGGTTTATTGTACTTCTGTCAAAGAAAGTGGCATTGGTTiTTATAATTG TTC3CC A AGTTTTA AGGTTA ATTTTC ATTATTTTTG AGCCAA ATTA A AATXjTGC ACCTCCTGTGCCTTTCCCAATCTTGGAAAATArAATTTCTTGGCAGAAGGTCA G ATTTCAGGGCCC AOTC A C TTTC GTCTGA CT TCCCTTTGC ACAGTCCGCCATG GGCCTGG CTTAGAAGTTCTT G TAAACTATGCCAG AGAGTAC ATTCGCTGATA A A ATC TTCTTTGC: AG AGG AGG AG AGCTTCTTGCC1-CTTTCCTTTCATTTCTGC CTGG ACTTTGGTGTTCTCC ACGTTCCCT GC ATCCT A AGG AC AGC AGG AG A AC
tc: i r ¡ a c c c c a g m e i A i r i r :tc:t a g ít i c r i v e n n i r . n c a a a c i c a a c c c G i r r GTCTCTGTCCCTOT A ACGTTCGT ACCTTGCTGGCTGTG A AGTACTG ACTGGT A A AGCTCCGTGCTAC AGCAGTGTAGGGTATAC ACA AAC ACA AGT A AGTGTTTT A TTT A A A A CTGTGG ACTTAGC AT A A A A A GGG AG A GT AT A TTT ATTTTTT AC A AAAG GGATAAAAATG GAACCCnTCC1-CACCCACCAGATTTAGTCAGAAAAA AACATTCTATTCTGAAAGGTCACAGTGG TnTG ACATO ACACATCAGAACAA CGCACACTGTCCATGAKiGClTATGAACTCCAAGTCACTCCATCATGGTAAA TGÜ G T AG ATC’CCTGCTTG TAGTGTGCCAC ACC ATTGC TTCCC AC AGT. AG A ATC’ TT ATTTA AGTGCT A AGTGTTGTCTCTGC TG G TTT ACTCTGTTGTTTT AG AG A AT GT A AGTTGTATA GTG A AT A AGTTATTG A AGC ATGTC iT A AAC ACTGTTAT AC'A TCTTTTCTCCTAGATGGGGA ATTTGGA ATA A A ATACCTTTA A A A TTC A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
Raííus norvegicus C9orF72 aminoácido |NP 00100T703; SEQ IDNO:4) MSTICPPPSPAVAKTHIALSGESPLLAATFAYWDNJLGPRVRHIWAPKTDQVLLS DGOlTFLANHTLNGEILftNABSGAIDVKFFVLSEKGVnVSLIFDGNWNGDRSTYG LSUCPQTELSFYLPLHRVCVDRLTHURKGRlWMHKERQEAfVQKlVLEGTERMED QGQSUFMLTGHV1PVMELLASMRSHSVPEDLDIAU1VLNDDDLGDSCHEGTLLN AÍSSHLQTCGCSVVVGSSAEKVNKIVRTLCLFLTPAERKCSRLCEAESSFKYESGL FVQGLLKDATGSFVLPFRQVMYAPYPTTHIDVDVNTVKQMPPCHEHIYNQRRY MRSi:l;r Aí■ WRA i SI ;í-liMAQIyJ lIY I DES)TPPLNJJ QIWLHRDTLVKAELnQVlü LKPG LSLRSTFLAQFLLILHRKALTL1K Y1EDDTQKGKKPFKS LR N LKJDLDLTAE GDLNIIM ALAEKIKPGLHSFIFGRPFYTSVQERD VLMTF
Vectores de direccionamiento a C9ORF72 y producción de animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
En la presente descripción se proporcionan vectores de direccionamiento o constructos de direccionamiento para la producción de animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción.
Pueden usarse secuencias de ADN para preparar vectores de direccionamiento para animales con anulación del gen (por ejemplo, un KO C9ORF72). Típicamente, una molécula de polinucleótido (por ejemplo, un inserto de ácido nucleico) que codifica un gen indicador y/o un marcador seleccionable se inserta en un vector, preferentemente un vector de ADN, para replicar la molécula de polinucleótido en una célula huésped adecuada.
Una molécula de polinucleótido (o inserto de ácido nucleico) comprende un segmento de ADN que se desea integrar en un locus objetivo. En algunas modalidades, un inserto de ácido nucleico comprende uno o más polinucleótidos de interés. En algunas modalidades, un inserto de ácido nucleico comprende uno o más casetes de expresión. En algunas modalidades determinadas, un casete de expresión comprende un polinucleótido de interés, un polinucleótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador junto con, en algunas modalidades determinadas, diversos componentes reguladores que influyen en la expresión. Prácticamente cualquier polinucleótido de interés puede contenerse dentro de un inserto de ácido nucleico y de esta manera integrarse en un locus genómico objetivo. Los métodos descritos en la presente descripción, proporcionan al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más polinucleótidos de interés para integrarse en un locus genómico C9ORF72 objetivo.
En algunas modalidades, un polinucleótido de interés contenido en un inserto de ácido nucleico codifica un indicador. En algunas modalidades, un polinucleótido de interés codifica un marcador seleccionable.
En algunas modalidades, un polinucleótido de interés se flanquea por o comprende sitios de recombinación específica de sitio (por ejemplo, loxP, Frt, etcétera). En algunas modalidades determinadas, los sitios de recombinación específica de sitio flanquean un segmento de ADN que codifica un indicador y/o un segmento de ADN que codifica un marcador seleccionable. En la presente descripción se describen polinucleótidos de interés ilustrativos, lo que incluye marcadores de selección y genes indicadores que pueden incluirse dentro de los insertos de ácido nucleico.
Se conocen en la técnica diversos métodos empleados en la preparación de plásmidos, constructos de ADN y/o vectores de direccionamiento y transformación de organismos huéspedes. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, así como también para procedimientos generales de recombinación, ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., ed. por Sambrook, J. y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Como se describió anteriormente, secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de C9ORF72 no humanos (por ejemplo, de roedores) ilustrativas para su uso en la construcción de vectores de direccionamiento para animales con anulación del gen se proporcionan en la Tabla 1. Otras secuencias de C9ORF72 no humanos pueden encontrarse, además, en la base de datos GenBank. Los vectores de direccionamiento a C9ORF72, en algunas modalidades, comprenden secuencias de ADN que codifican un gen indicador y/o un marcador seleccionable, flanqueado por secuencias que son idénticas o sustancialmente homólogas a las secuencias flanqueantes de una región objetivo (también denominadas como "brazos de homología") para su inserción en el genoma de un animal no humano transgénico. Para dar solo un ejemplo, puede establecerse un punto de inicio de deleción aguas arriba (en dirección 5') de un primer exón, un primer exón codificante o el primer o segundo codón, para permitir que un inserto de ácido nucleico se una operativamente a una secuencia reguladora endógena (por ejemplo, un promotor). La Figura 1A ilustra una estrategia de direccionamiento para realizar una deleción dirigida de toda la secuencia codificante de un gen C9orf72 murino y su reemplazo con un casete que contiene una secuencia de un gen lacZ que codifica p-galactosidasa y un casete de selección de fármaco (Neo) que codifica la neomicina fosfotransferasa para la selección de colonias de células madre embrionarias (ES) resistentes a G418. El vector de direccionamiento incluye, además, una secuencia que codifica una recombinasa (por ejemplo, Cre) regulada por un miARN específico de células ES o un promotor específico de células germinales (por ejemplo, promotor de protamina 1; Prot-Cre-SV40). El casete de selección de fármaco y las secuencias que codifican la recombinasa Cre se flanquean por sitios de reconocimiento de recombinasas loxP (LP) que permiten la escisión mediada por Cre del casete de selección de fármaco de una manera dependiente del desarrollo, por ejemplo, la progenie derivada de roedores cuyas células germinales contienen el gen C9orf72 interrumpido descrito anteriormente liberará el marcador seleccionable (Neo) durante el desarrollo (ver Patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392, 8,354,389, 8,946,505 y 8,946,504). Esto permite, entre otras cosas, la escisión automática del casete de selección desde las células diferenciadas o las células germinales. Por lo tanto, antes del análisis fenotípico, el casete de selección de fármaco se elimina, lo que deja solo el gen indicador lacZ unido operativamente al promotor de C9orf72 murino.
Como se describe en la presente descripción, la interrupción de un locus C9orf72 puede comprender un reemplazo o una inserción/adición al locus C9orf72 o a una porción de este con un inserto de ácido nucleico. En algunas modalidades, un inserto de ácido nucleico comprende un gen indicador. En algunas modalidades determinadas, un gen indicador se ubica en unión operativa con un promotor de C9orf72 endógeno. Dicha modificación permite la expresión de un gen indicador impulsado por un promotor de C9orf72 endógeno. Alternativamente, un gen indicador no se ubica en unión operativa con un promotor de c9orf72 endógeno.
Puede usarse una variedad de genes indicadores (o restos detectables) en vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción. Los genes indicadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, p-galactosidasa (codificada por el gen lacZ), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), MmGFP, proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente azul mejorada (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP), Emerald, CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina, o una combinación de estos. Los métodos descritos en la presente descripción demuestran la construcción de vectores de direccionamiento que emplean el uso de un gen indicador lacZ que codifica la p-galactosidasa, sin embargo, los expertos, al leer esta descripción, comprenderán que los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden generarse en ausencia de un gen indicador o con cualquier gen indicador conocido en la técnica.
Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) un polipéptido indicador, en su totalidad o en parte, pueden modificarse de manera que incluyan codones optimizados para la expresión en el animal no humano (por ejemplo, ver las patentes de Estados Unidos núms. 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. En algunas modalidades, la región codificante del material genético que codifica un polipéptido indicador (por ejemplo, lacZ), en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del gen indicador que se insertarán en el genoma de un animal no humano (por ejemplo, un roedor) pueden optimizarse para la expresión en una célula del animal no humano. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con optimización de codones.
Se proporcionan composiciones y métodos para crear animales no humanos que comprenden una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción, lo que incluye composiciones y métodos para crear animales no humanos que expresan un gen indicador a partir de un promotor de C9ORF72 y una secuencia reguladora de C9ORF72. En algunas modalidades se proporcionan, además, composiciones y métodos para crear animales no humanos que expresan un gen indicador a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. Los métodos incluyen insertar un vector de direccionamiento, como se describe en la presente descripción, que codifica un gen indicador (por ejemplo, lacZ) en el genoma de un animal no humano de manera que toda la secuencia de codificación de un locus C9ORF72 se elimina, en su totalidad o en parte. En algunas modalidades, los métodos incluyen insertar un vector de direccionamiento en el genoma de un animal no humano de manera que toda la secuencia codificante para todas las isoformas de C9ORF72 en un locus C9ORF72 se eliminan.
La inserción de un gen indicador unido operativamente a un promotor de C9ORF72 (por ejemplo, un promotor de C9ORF72 endógeno) emplea una modificación relativamente mínima del genoma y resulta en la expresión del polipéptido indicador de una manera específica de C9ORF72 en el animal no humano. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción comprende un locus C9ORF72 que comprende un vector de direccionamiento como se describe en la presente descripción.
Los vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción pueden introducirse en células ES y tamizarse para determinar clones de ES que alberguen una interrupción en un locus C9orf72 como se describe en Frendewey, D., y otros, 2010, Methods Enzymol. 476:295-307. Puede emplearse una variedad de embriones huésped en los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Por ejemplo, las células pluripotentes y/o totipotentes que tienen la modificación genética objetivo pueden introducirse en un embrión en etapa de premórula (por ejemplo, un embrión en la etapa de 8 células) de un organismo correspondiente. Ver, por ejemplo, los documentos US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754y US 2008/0078000 A1. En otros casos, las células ES donantes pueden implantarse en un embrión huésped en la etapa de 2 células, la etapa de 4 células, la etapa de 8 células, la etapa de 16 células, la etapa de 32 células o la etapa de 64 células. El embrión huésped puede ser, además, un blastocito o puede ser un embrión preblastocito, un embrión en etapa de premórula, un embrión en etapa de mórula, un embrión en etapa de mórula no compactado o un embrión en etapa de mórula compactada.
En algunas modalidades, puede aplicarse el método VELOCIMOUSE® (Poueymirou, W.T. y otros, 2007, Nat. Biotechnol.
25:91-99) para inyectar células ES positivas en un embrión de 8 células para generar ratones heterocigotos de generación F0 completamente derivados de células ES listos para perfilar la expresión de lacZ o reproducirse hasta la homocigosidad. Métodos ilustrativos para generar animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9orf72 se proporcionan en el Ejemplo 1.
Los métodos para generar animales transgénicos no humanos, lo que incluye animales con anulación de genes y con inserción de genes, se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Por ejemplo, la generación de roedores transgénicos puede involucrar, opcionalmente, la interrupción del loci genético de uno o más genes endógenos de roedor y la introducción de un gen indicador en el genoma del roedor, en algunas modalidades, en la misma localización que el gen endógeno de roedor.
Una ilustración esquemática (no a escala) de la organización genómica de un C9orf72 de ratón se proporciona en la Figura 1A. Además, se proporciona en la Figura 1A una estrategia de direccionamiento ilustrativa para la deleción de toda la secuencia codificante de un locus C9orf72 murino mediante el uso de un gen indicador. Como se ilustra, el ADN genómico que contiene la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 murino se elimina y se reemplaza con un gen indicador y un casete de selección de fármaco flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio. El vector de direccionamiento usado en esta estrategia incluye una secuencia codificante de recombinasa que se une operativamente aun promotor que se regula por el desarrollo de manera que la recombinasa se expresa en células indiferenciadas. Los promotores ilustrativos que pueden incluirse en los vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción se proporcionan en la Tabla 2. Los promotores adecuados adicionales que pueden usarse en los vectores de direccionamiento descritos en la presente descripción incluyen aquellos descritos en las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). Tras la recombinación homóloga, toda la secuencia codificante (por ejemplo, la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11) de un locus C9orf72 murino endógeno se reemplaza por la secuencia contenida en el vector de direccionamiento. El casete de selección de fármaco se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal contienen una interrupción en el locus C9orf72, descrito anteriormente, liberarán el marcador seleccionable de las células diferenciadas durante el desarrollo (ver las patentes de Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389).
TABLA 2
Promotor prot (SEQ IDNO;S)
CC AGTAGC a g c a c c c a c g t c c a c c t t c t g t c t a g t a a t g t c c a a c a c c t c x x t
CAG TCC A A A C A CTGCTCTG C A TC C A TGTG GC TCC C ATTTAT ACC TGAAGC ACT
TGATGGGGCCTCAATGTTTTACTAGAGCCCACCCCXXTGCAACTCTGAGAOC
CTCTCG ATTTG TCTG TCACTG CCTCACTG CG G CG TrG CATAATTTCTTAAAAG
GTC A AG TTCCCTC AGC AGC ATTC TC TG AGC AGTCTG A AG A TG TCTG CTTTTC A
CA G TI CAA ATCCATGTGGCTGTTTC ACCC ACCTCtCCTGGCCTTGGGTTATCTA TC AGG ACCTAG CCT AG A AGC AGGTGTGTGGC ACTT A AC ACCT A A G CTG AGTG ACTA ACTG A ACACTC A AOTGG ATGCCATCTTTGTC ACTTCTTG ACTGTGACAC AAGCAACTCCTGATGCCAAAGCCCTGCCCACCCC1-CTCATGCCCATATTTGG ACATGGTACAGGTÜCTCACTCGCCAlGOTCTGTGAGGTOCTGGTCCTCrnGA CTTCATA ATTCCTAGGGGCC ACTAGTATCT ATA AGAOGAAG AGCGTGCTGGC TCCC AGGCC A C A GOOCACAA A A TTCC ACCTGCTC A C AGGTTGGCTGGCTCGA CCCAGGTG GTC iTOCCCTGCTCTG AGCC AGC’TCCCGGGCA AG CC AGCACC
P ro m o to r B lim p l lk l> (S L Q l ü N O :* )
íGCC ATC A rC AC ACGATGTCCIT CCTTC " [ CC AG A AG AC AG ACTGGC C JCTG A A GC A A A A CCCGCCC AGGCTC AG A ACG AGCCCC ACTA ATT ACTGCCTCC A AC A GCTTTCC ACTC ACTGCCCGC AGCCCA ACATCC CCTTTTTA ACTGGG A AGC ATT CCT ACTCTCC ATTGTACGCAC ACGCTCGG A A GCC TGGCTGTGGGTTTGGGC A TÜAGAGÜC AGGG ACAAC A A A ACC AGTATATATG ATTATA ACTTTTTCCTGTT
GTATTCAGTTAGCAGCACAAATGAAATCCTATACGTTTAATACTACAGGAGA ACCGCCJ TAC A Ar I A r n ATI TC ATI GGC A A IG A C 1 ’CC AGG ACT ACAC AGCG A AA JT’G ]’A JTCiC:ATG JGClCíí !CAAAA J ACIT I ACiCJC JTTCC [T’CGAAG J ACCFI’ CGGATCCTGTA ATTGAGAC ACCGAGTTTAGGTG ACT AGGGTTTTC TTTTG AG GAGGAGTCCCCCACCCCGC CCCGCTCTGC C GCG AC AGGAAGCTAGCG ATCC G
CjAGGACTTAGAATACAATCGTAGTGTGGGTAAACATGGAGGGCAAGCGCCT CjCAAAÍiGGAAjGTAAGAAGATTC'GCAGTCCTTGTTGAAATCCATTTGCAAACA GAGGAAGCrGCCGCGGGTCGCAGTCGGTGGGGGGAAGCCCTGAACCCCACG C1GCACGGC TGGGCl GGCC AGG TGCGGCCACGC C'CCC ATC GCGGCGGCTGGl AGC AGTG A ATC AG ACCGTCAGT ATTCCT A A AC A AC-TCTGCC CC A C G GC A CC G ACG GG C A AC. AGT AGTC ACTCC CTCC.CTC ACTCGCTCGCTCGC A CAC. AC ACT gctcjCagtdac a c tc g g c c c tc c a g t g t tg c gg a g ao g c a a g a GCAQCGCG C A CiCACCTC iTCCGC 'CCGG AGCG ACK XXGGCÍ C X iCCKK'( GTAGA A A AGG AGG ÜACCGCCG AGG 1ÜCÜCGI C AGi AC J GC 1CAGCC CÜ G CAGGG AC GCÜÜG AGG ATGTGG ACTGGGTGGAC
P ro m o to r B lim p l 2hb (SKQ ID N O :7 )
GT GGTGCTG A CTC A GC ATCGGTTA AT A A ACCC T C TGC AGG AGGCTGG ATTTC T T rT G n T A ATTATCACTTGG ACCTTTCTG AG A ACTCTT A AG A A TTGTTCATTC CiCCTTTTriTG I ITTG fTTT'GCTTTGGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTtiGTTTTTf 3G AG A CAGGGTTTCTCTGTATATAGCCCTGCiC AC A AG AGÍ: A A GCTAACAGCCTG1TJ C lT d T G G lG C l AGCGCCCCCl C J GGC AG A A AATGA A ATAAC AGGTGG ACCTAC A ACÜCCCCCCCCCCCCCCCAGTGT ATTCTACTCTTG TCCCCGGT ATA A ATTTG A TTG TTCCG A ACT AC A T A A ATTGT AG A A GG ATTTTT TAGATCC AC ATATC ATTTTCTGTG ATACCTTCC AC ACACCCCTCCCCCCC A A A AA A ATTTITCTGGÍJAA AGTTTCTTG AA AGC A A A AC AO A AGAAC A AGCCTGTC TTT ATG ATTG AGT7X3GGC.TT I' J G TTTTGCTGTGTTTC ATTTCTTC; Í 7TÍ rTA A Ai? A A ATACTCAA ATGTCCACTTC ATTGTATG ACTA AG ITGGTATC ATTAGGTTGGG
1C J GGGIG1G 1GAA JG 1 GGG 1G J GGA l CT GGA1G 1 GGG 1GGG l’G 1CIA1GCC CCGTCTG TTTAG A AT AC T AC A A A A ü A l ACC AC ATCGT A A ACTTTTGGC AG AG ATG ATTTTT A A A AATGGGCCTGGGGCTG ACCCC A AOCTGCG ATG AGGCA AG C A AG A TA AGGGG AAGACTTGAGTTTCTGTG ATCT A AA A A GTC: GCTGTG ATGG G ATGCTGGCTAT A A ATGGGCCCTTAGC AGC ATTGTTTCTGTGA ATTGGAGG A TCCCTGCTGAAGGCAAAAGACCATTGAAGGAAGTACCGCATCTGGTTTGTTT
TGTAATGAGAAGCAGGAATGCAAGGTCCACGCTCTTAATAATAAACAAACA
GGACATTGTATGCCATCATCACAGGATGTCCTTCCTTCTCCAGAAGACAGAC
TGGGGCTGAAGGAAAAGCCGGCCAGGCTCAGAACGAGCCCCACTAATTACT
GCCTCCAACAGCTTTCCACTCACTGCCCCCAGCCCAACATCCCCTTTTTAACT
GGGAAGCATTCCTACTCTCCATTGTACGCACACGCTCGGAAGCCTGGCTGTG
GGTTTGGGCATGAGAGGCAGGGACAACAAAACCAGTATATATGATTATAAC
TTTTTCCTGTTTCCCTATTTCCAAATGGTCGAAAGGAGGAAGTTAGGTCTACC
T AAGCTG AATGT ATTC AGTT AGCAGGAG AAATGAAATCCTAT ACGTTT AATA
CTAGAGGAGAACCGCCTTAGAATATTTATTTCATTGGCAATGACTCCAGGAC
TACACAGCGAAATTGTATTGCATGTGCTGCCAAAATACTTTAGCTCTTTCCTT
CGAAGTACGTCGGATCCTGTAATTGAGACACCGAGTTTAGGTGACTAGGGTT
TTCTTTTGAGGAGGAGTCCCCCACCCCGCCCCGCTCTGCCGCGACAGGAAGC
TAGCGATCCGGAGGACTTAGAATACAATCGTAGTGTGGGTAAACATGGAGG
GCAAGCGCCTGCAAAGGGAAGTAAGAAGATTCCCAGTCCTTGTTGAAATCCA
TTTGCAAACAGAGGAAGCTGCCGCGGGTCGCAGTCGGTGGGGGGAAGCCCT
GAACCCCACGCTGCACGGCTGGGCTGGCCAGGTGCGGCCACGCCCCCATCGC
GGCGGCTGGTAGGAGTGAATCAGACCGTCAGTATTGGTAAAGAAGTCTGCG
GCAGGGCAGGGAGGGGGAAGAGTAGTCAGTCGCTCGCTCACTCGCTCGCTC
GCACAGACACTGCTGCAGTGACACTCGGCCCTCCAGTGTCGCGGAGACGCAA
GAGCAGCGCGCAGCACCTGTCCGCCCGGAGCGAGCCCGGCCCGCGGCCGTA
GAAAAGGAGGGACCGCCGAGGTGCGCGTCAGTACTGCTCAGCCCGGCAGGG
ACGCGGGAGGATGTGGACTGGGTGGAC
Puede identificarse un animal no humano fundador transgénico en función de la presencia de un gen indicador (o ausencia de C9ORF72) en su genoma y/o la expresión de un indicador en tejidos o células del animal no humano (o la falta de expresión de C9ORF72). Un animal no humano transgénico fundador puede usarse después para reproducir animales no humanos transgénicos adicionales que portan el gen indicador, de esta manera se crean una serie de animales no humanos que cada uno es portador de una o más copias de un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción.
Los animales no humanos transgénicos pueden producirse, además, para contener sistemas seleccionados que permitan la regulación o la expresión directa del transgén. Los sistemas ilustrativos incluyen el sistema de la recombinasa Cre/loxP del bacteriófago P1 (ver, por ejemplo, Lakso, M. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:6232-6236) y el sistema de la recombinasa FLP/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. y otros, 1991, Science 251:1351-1355). Dichos animales pueden proporcionarse mediante la construcción de animales "doble" transgénicos, por ejemplo, mediante el apareamiento de dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que comprende un polipéptido seleccionado (por ejemplo, un gen indicador) y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa Cre).
Aunque modalidades que emplean una interrupción en un locus C9ORF72 en un ratón (es decir, un ratón con la deleción de toda la secuencia codificante de C9orf72) se analizan ampliamente en la presente descripción, también se proporcionan otros animales no humanos que comprenden una interrupción en un locus C9ORF72. En algunas modalidades, dichos animales no humanos comprenden una interrupción en un locus C9ORF72 caracterizada por la inserción de un indicador unido operativamente a un promotor de C9ORF72 endógeno. Dichos animales no humanos incluyen cualquiera de aquellos que pueden modificarse genéticamente para eliminar toda la secuencia codificante de un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción, lo que incluye, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primates (por ejemplo, mono tití, mono Rhesus), etcétera. Por ejemplo, para los animales no humanos donde las células ES genéticamente modificables adecuadas no están fácilmente disponibles, pueden emplearse otros métodos para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de la transferencia nuclear de células somáticas para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.
Brevemente, los métodos para la transferencia nuclear incluyen las etapas de: (1) enuclear un ovocito; (2) aislar una célula o núcleo donante para combinarse con el ovocito enucleado; (3) insertar la célula o núcleo en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida; (4) implantar la célula reconstituida en el útero de un animal para formar un embrión; y (5) permitir que se desarrolle el embrión. En dichos métodos, los ovocitos se recuperan generalmente de animales fallecidos, aunque pueden aislarse, además, de oviductos y/u ovarios de animales vivos. Los ovocitos pueden madurarse en una variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica antes de la enucleación. La enucleación del ovocito puede realizarse de varias maneras conocidas por los expertos en la técnica. La inserción de una célula o núcleo donante en un ovocito enucleado para formar una célula reconstituida se logra típicamente mediante la microinyección de una célula donante debajo de la zona pelúcida antes de la fusión. La fusión puede inducirse por la aplicación de un pulso eléctrico de DC a través del plano de contacto/fusión (electrofusión), por la exposición de las células a sustancias químicas que promueven la fusión, tales como el polietilenglicol, o por medio de un virus inactivado, tal como el virus Sendai. Una célula reconstituida se activa típicamente por medios eléctricos y/o no eléctricos antes, durante y/o después de la fusión del donante nuclear y el ovocito receptor. Los métodos de activación incluyen pulsos eléctricos, choques inducidos químicamente, penetración de esperma, aumento de los niveles de cationes divalentes en el ovocito y reducción de la fosforilación de proteínas celulares (como por medio de inhibidores de la cinasa) en el ovocito. Las células reconstituidas activadas, o los embriones, se cultivan típicamente en un medio conocido por los expertos en la técnica y después se transfieren al útero de un animal. Ver, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2008­ 0092249 A1, el documento WO 1999/005266 A2, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2004­ 0177390 A1, el documento WO 2008/017234 A1 y la Patente de Estados Unidos Núm. 7,612,250.
Los métodos para modificar el genoma de un animal no humano (por ejemplo, un cerdo, vaca, roedor, pollo, etcétera) incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora similar a activador de la transcripción (Ta l En ) para modificar un genoma para incluir una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es un mamífero. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción, es un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En algunas modalidades, un animal modificado genéticamente descrito en la presente descripción es un roedor. En algunas modalidades, un roedor descrito en la presente descripción se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. En algunas modalidades, un roedor descrito en la presente descripción se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunas modalidades, un animal modificado genéticamente descrito en la presente descripción es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). En algunas modalidades determinadas, un roedor modificado genéticamente descrito en la presente descripción se selecciona de un ratón o rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata crestada. En algunas modalidades determinadas, un ratón modificado genéticamente descrito en la presente descripción es un miembro de la familia Muridae. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es un roedor. En algunas modalidades determinadas, un roedor descrito en la presente descripción se selecciona de un ratón y una rata. En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es un ratón.
En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/O1a. En algunas modalidades determinadas, un ratón descrito en la presente descripción es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2(ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. y otros, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). En algunas modalidades determinadas, un ratón modificado genéticamente descrito en la presente descripción es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas modalidades determinadas, un ratón descrito en la presente descripción es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas modalidades determinadas, una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente descripción es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas modalidades, un ratón descrito en la presente descripción es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas modalidades, un ratón descrito en la presente descripción es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
En algunas modalidades, un animal no humano descrito en la presente descripción es una rata. En algunas modalidades determinadas, una rata descrita en la presente descripción se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, f 344, F6, y Dark Agouti. En algunas modalidades determinadas, una cepa de rata como se describe en la presente descripción, es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, y Dark Agouti.
Una célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de cualquier cepa de rata, lo que incluye, por ejemplo, una cepa de rata ACI, una cepa de rata Dark Agouti (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD), o una cepa de rata Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. Las células pluripotentes y/o totipotentes de rata pueden obtenerse, además, a partir de cepas derivadas de una mezcla de dos o más cepas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de una cepa DA o una cepa ACI. La cepa de rata ACI se caracteriza por tener agutí negro, con patas y vientre blanco y un haplotipo RT1av1. Tales cepas están disponibles a partir de una diversidad de fuentes que incluyen los laboratorios Harían. Un ejemplo de una línea celular ES de rata de una rata ACI es una línea celular ES ACI.G1 de rata. La cepa de rata Dark Agouti (DA) se caracteriza por tener un pelaje agutí y un haplotipo RT1av1. Tales ratas están disponibles a partir de una diversidad de fuentes que incluyen los laboratorios Charles River y Harlan. Los ejemplos de una línea celular ES de rata a partir de una rata Da son la línea celular ES de rata DA.2B y la línea celular ES de rata DA.2C. En algunos casos, las células pluripotentes y/o totipotentes de ratas son de una cepa de rata endogámica. Ver, por ejemplo, el documento US 2014/0235933 A1, presentado el 20 de febrero de 2014.
Se proporcionan animales no humanos que comprenden una interrupción en un locus C9ORF72. En algunas modalidades, una interrupción en un locus C9ORF72 resulta en una pérdida de función. En particular, las mutaciones de pérdida de función incluyen mutaciones que resultan en una disminución o falta de expresión de C9ORF72 y/o una disminución o falta de actividad/función de C9ORF72. En algunas modalidades, las mutaciones de pérdida de función resultan en uno o más fenotipos como se describe en la presente descripción. La expresión de C9ORF72 puede medirse directamente, por ejemplo, al analizar el nivel de C9ORF72 en una célula o tejido de un animal no humano como se describe en la presente descripción.
Típicamente, el nivel de expresión y/o actividad de C9ORF72 disminuye si la expresión y/o nivel de actividad de C9ORF72 es estadísticamente menor (p<0,05) que el nivel de C9ORF72 en una célula control apropiada o un animal no humano que no comprende la misma interrupción (por ejemplo, deleción). En algunas modalidades, la concentración y/o actividad de C9ORF72 se reduce en al menos 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más con relación a una célula control o un animal no humano que carece de la misma interrupción (por ejemplo, deleción).
En otras modalidades, las células u organismos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72 que reduce el nivel de expresión y/o la actividad de C9ORF72 se seleccionan mediante el uso de métodos que incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Southern, secuenciación de ADN, análisis de PCR o análisis fenotípico. Dichas células o animales no humanos se emplean después en los diversos métodos y composiciones descritos en la presente descripción.
En algunos ejemplos, un locus C9ORF72 endógeno no se elimina (es decir, está intacto). En algunas modalidades, un locus C9ORF72 endógeno se altera, se interrumpe, se elimina o se reemplaza con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia codificante del gen indicador). En algunas modalidades, todo o sustancialmente todo el locus C9ORF72 endógeno se reemplaza con un inserto de ácido nucleico; en algunas modalidades determinadas, el reemplazo incluye el reemplazo de toda la secuencia codificante de un locus C9ORF72 endógeno con un gen indicador lacZ de manera que el gen indicador lacZ se une operativamente con un promotor de C9ORF72 (por ejemplo, un promotor de C9ORF72 endógeno). En algunas modalidades, una porción de un gen indicador (por ejemplo, un fragmento de función de este) se inserta en un locus C9ORF72 no humano endógeno. En algunas modalidades, el gen indicador es un gen lacZ. En algunas modalidades, un gen indicador se inserta en una de las dos copias del locus C9ORF72 endógeno, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen indicador. En otras modalidades, se proporciona un animal no humano que es homocigoto para un gen indicador.
Métodos que emplean animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
Los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas. En particular, los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en enfermedades humanas tales como, por ejemplo, ALS y/o FTD, caracterizadas por síntomas de las neuronas motoras superiores y/o pérdida de las neuronas no motoras.
Por ejemplo, una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción puede resultar en diversos síntomas (o fenotipos) en los animales no humanos proporcionados en la presente descripción. En algunas modalidades, la eliminación de un locus C9ORF72 resulta en animales no humanos que son totalmente normales al nacer, pero que desarrollan síntomas similares a la ALS al envejecer, por ejemplo, después de aproximadamente 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 53 semanas, 54 semanas, 55 semanas, 56 semanas, 57 semanas, 58 semanas, 59 semanas, 60 semanas, etcétera. En algunas modalidades, la eliminación de un locus C9ORF72 resulta en funciones anormales de uno o más tipos de células, por ejemplo, una neurona y/o una porción de esta. Una neurona incluye una neurona sensorial o una neurona motora. Otros fenotipos asociados con la ALS y/o la FTD pueden presentarse en animales no humanos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un fenotipo similar a la ALS puede implicar el deterioro de una o más neuronas, por ejemplo, neuronas motoras y/o neuronas sensoriales. Además, un fenotipo similar a la ALS que implique a las neuronas motoras superiores puede provocar espasticidad (por ejemplo, parálisis espástica, rigidez), reflejos aumentados y/o anormales (por ejemplo, signo de Babinski), temblores y una combinación de estos. Un fenotipo similar a la ALS que implique el deterioro de las neuronas motoras inferiores puede provocar debilidad y desgaste muscular, fasciculaciones y una combinación de estos, y/o deterioro del bulbar lo que resulta en una incapacidad para tragar y fasciculaciones de la lengua.
Un síntoma similar a la ALS puede comprender, además, uno o más de los siguientes fenotipos: a) cifosis; b) espasmo de las extremidades posteriores, arrastre o curvatura de los dedos; c) deficiencia en la coordinación motora y la capacidad de aprendizaje motor, deficiencia en pruebas de rotarod, pasarela y/o de campo abierto; d) pérdida de neuronas motoras en la médula espinal; e) astrocitosis en la médula espinal; f) pérdida de peso en comparación con un roedor control; g) acumulación de proteínas poliubiquitinadas y/o (h) aumento de la puntuación neurológica mediante el uso del sistema de puntuación neurológica ALS-TDI (Tabla 3).
Tabla 3.
Figure imgf000035_0001
Por lo tanto, en al menos algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ALS y/o FTD) y pueden usarse para el desarrollo y/o identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento, prevención y/o inhibición de uno o más fenotipos (o síntomas) de enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas. En algunas modalidades, uno o más síntomas (o fenotipos) en animales no humanos descritos en la presente descripción aparecen en la Tabla 3.
Los animales no humanos como se describen en la presente descripción proporcionan, además, un sistema in vivo para identificar un agente terapéutico para tratar, prevenir y/o inhibir uno o más síntomas de enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ALS y/o FTD). En algunas modalidades, se determina un efecto inhibidor de un agente terapéutico in vivo, mediante la administración de dicho agente terapéutico a un animal no humano que tiene una interrupción en C9ORF72 como se describe en la presente descripción, y desarrolla síntomas neurodegenerativos después de las 38 semanas de edad.
Los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan, además, modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias o autoinmunitarias. En particular, los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en una enfermedad inflamatoria humana caracterizada por la infiltración de células inmunitarias en diversos órganos (por ejemplo, riñón, hígado, bazo, etcétera). Además, los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en una enfermedad autoinmunitaria humana caracterizada por el aumento de la presencia de autoanticuerpos (por ejemplo, IgG e IgM) en el suero.
Por ejemplo, una interrupción en un locus C9ORF72 como se describe en la presente descripción puede resultar en diversas condiciones (o fenotipos) en los animales no humanos proporcionados en la presente descripción. En algunas modalidades, la eliminación de un locus C9ORF72 resulta en animales no humanos que son totalmente normales al nacer, pero que desarrollan afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias al envejecer, por ejemplo, después de aproximadamente 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 53 semanas, 54 semanas, 55 semanas, 56 semanas, 57 semanas, 58 semanas, 59 semanas, 60 semanas, etc. En algunas modalidades, la eliminación de un locus C9ORF72 resulta en una infiltración de uno o más tipos de células inmunitarias, por ejemplo, células plasmáticas, monocitos, granulocitos y/o macrófagos. Otros fenotipos asociados con una afección inflamatoria y/o autoinmunitaria pueden presentarse en animales no humanos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, una afección inflamatoria o autoinmunitaria puede implicar el agrandamiento de uno o más de bazo, ganglios linfáticos, riñones y/o hígado. Además, una afección inflamatoria o autoinmunitaria que involucre la sangre puede resultar en un aumento de la presencia de autoanticuerpos. Una afección inflamatoria o autoinmunitaria que afecte al hígado puede provocar hepatitis.
Por lo tanto, en al menos algunas modalidades, los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias y pueden usarse para el desarrollo y/o identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento, prevención y/o inhibición de uno o más fenotipos (o síntomas) de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria se presenta en uno o más órganos o tejidos de un animal no humano descrito en la presente descripción. En algunas modalidades determinadas, uno o más órganos o tejidos incluyen bazo, hígado, ganglios linfáticos, riñón, médula ósea y sangre.
Los animales no humanos como se describe en la presente descripción proporcionan, además, un sistema in vivo para identificar un agente terapéutico para tratar, prevenir y/o inhibir uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria. En algunas modalidades, se determina un efecto inhibidor de un agente terapéutico in vivo, mediante la administración de dicho agente terapéutico a un animal no humano que tiene una interrupción en C9ORF72 como se describe en la presente descripción, y desarrolla una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria después de las 8 semanas de edad. En diversas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria es o comprende glomerulonefritis o hepatitis.
A los animales no humanos puede administrárseles un agente terapéutico para probarlo por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante inyección sistémica, bombas para exposición a largo plazo o inyección intracerebral directa. Dichos animales pueden incluirse en un estudio de comportamiento, para determinar el efecto del agente terapéutico en el comportamiento, por ejemplo, el comportamiento motor, de los animales no humanos en comparación con los animales no humanos control apropiados que no recibieron el agente terapéutico. Además, puede realizarse una biopsia o una evaluación anatómica de la médula espinal, el músculo y/o el tejido cerebral del animal, y/o puede recolectarse una muestra de sangre o CSP.
Los animales no humanos como se describe en la presente descripción, proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que carecen de la expresión de C9ORF72 que son útiles para una variedad de ensayos. En diversas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para desarrollar terapias que tratan, previenen y/o inhiben uno o más síntomas asociados con la falta de expresión y/o actividad de C9ORF72. En diversas modalidades, los animales no humanos en la presente descripción se usan para identificar, tamizar y/o desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, ARNip, etcétera) que se unen a C9ORF72. En diversas modalidades, los animales no humanos como se describe en la presente descripción, se usan para seleccionar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, ARNip, etcétera) que bloquean la actividad de C9ORF72. En diversas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un polipéptido (o transcripto) de C9ORF72 de un animal no humano como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a C9ORF72.
En diversas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción, se usan para determinar los perfiles farmacocinéticos de un fármaco dirigido a C9ORF72. En diversas modalidades, uno o más animales no humanos descritos en la presente descripción y uno o más animales no humanos de control o de referencia se exponen cada uno a uno o más fármacos candidatos dirigidos a C9ORF72 a diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse por medio de cualquier ruta de administración deseada que incluye las rutas de administración parenterales y no parenterales. Las rutas parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras rutas de inyección. Las rutas no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de animales no humanos (humanizados y de control) en diversos puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Diversos ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los fármacos dirigidos a C9ORF72 administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de animales no humanos como se describen en la presente descripción, lo que incluye, pero no se limita a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etcétera.
En diversas modalidades, los animales no humanos como se describen en la presente descripción se usan para medir el efecto terapéutico de bloquear, modular y/o inhibir la actividad de C9ORF72 (o la señalización de C9ORF72 o las interacciones mediadas por C9ORF72) y el efecto sobre la expresión génica como resultado de los cambios celulares. En diversas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción o las células aisladas del mismo se exponen a un fármaco dirigido a C9ORF72 del animal no humano y, después de un período de tiempo posterior, se analizan para determinar los efectos sobre procesos (o interacciones) dependientes de C9ORF72, por ejemplo, tráfico endosómico, homeostasis inmunitaria o función de neuronas motoras y/o neuronas no motoras.
Las células de los animales no humanos como se describen en la presente descripción, pueden aislarse y usarse con base a fines específicos, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. En diversas modalidades, las células de un animal no humano como se describen en la presente descripción se inmortalizan (por ejemplo, por medio del uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
En diversas modalidades, las células y/o animales no humanos como se describen en la presente descripción se usan en diversos regímenes de inmunización para determinar las funciones mediadas por C9ORF72 en la respuesta inmunitaria a un antígeno (por ejemplo, una respuesta de células B). En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos que se unen, o bloquean una o más funciones de C9ORF72, se caracterizan en un animal no humano descrito en la presente descripción. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, caracterización de interacciones ligando-receptor (por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación) y caracterización de interacciones ligandoligando. En algunas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para caracterizar las funciones mediadas por C9ORF72 que regulan una respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarios. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección neurológicos. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con un agente infeccioso (por ejemplo, una bacteria). En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de prueba (por ejemplo, ovoalbúmina u OVA). En algunas modalidades, el antígeno es un objetivo asociado con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.
En diversas modalidades, los animales no humanos como se describen en la presente descripción se usan para el desafío con uno o más antígenos para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de C9ORF72 de una respuesta inmunitaria, lo que incluye, pero no se limita a, las respuestas dependientes de células B específicas a un antígeno dado.
Los animales no humanos como se describen en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. En diversas modalidades, un fármaco o vacuna candidato puede administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente descripción, seguido del monitoreo de los animales no humanos para determinar una o más de la respuesta inmunitaria frente al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección y/o uno o más síntomas de una enfermedad o afección. Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.
La eficacia de las vacunas puede determinarse en una diversidad de vías. Brevemente, los animales no humanos descritos en la presente descripción se vacunaron mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y después se desafiaron con una vacuna, o se administró una vacuna a los animales no humanos ya infectados. La respuesta de un(os) animal(es) no humano(s) a una vacuna puede medirse mediante el control de, y/o la realización de uno o más ensayos en el(los) animal(es) no humano(s) (o células aisladas de estos) para determinar la eficacia de la vacuna. Después, la respuesta de un(os) animal(es) no humano(s) a la vacuna se compara después con los animales controles, mediante el uso de una o más mediciones conocidas en la técnica y/o descritas en la presente descripción.
La eficacia de la vacuna puede determinarse, además, mediante ensayos de neutralización viral. Brevemente, los animales no humanos como se describe en la presente descripción se inmunizan y, diversos días posteriores a la inmunización se recolecta el suero. Diluciones seriadas del suero se incuban previamente con un virus durante un tiempo en el cual los anticuerpos del suero, que son específicos al virus, se unirán a estos. Después se añade la mezcla virus/suero a células permisivas para determinar la infectividad mediante un ensayo de placa o ensayo de microneutralización. Si los anticuerpos del suero neutralizan el virus, habrá menor cantidad de placas y menores unidades relativas de luciferasa en comparación con un grupo control.
Los animales no humanos descritos en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas y/o eficacia de un fármaco (por ejemplo, un fármaco dirigido a C9ORF72). En diversas modalidades, un fármaco puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos como se describen en la presente descripción, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto del fármaco sobre el animal no humano. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan a, cómo un animal procesa el fármaco a diversos metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, lo que incluye, pero no se limita a, metabolitos tóxicos), tiempo de vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, ruta de administración, rutas de excreción y/o eliminación del fármaco. En algunas modalidades, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de C9ORF72) se monitorean en o mediante el uso de los animales no humanos descritos en la presente descripción.
En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo del animal no humano al que se administra el fármaco. En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar la variabilidad lote a lote de un fármaco (por ejemplo, un modulador de C9ORF72 tal como, por ejemplo, un antagonista o un agonista). En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar las diferencias entre los efectos de un fármaco administrado a un animal no humano descrito en la presente descripción y a un animal no humano de referencia. En diversas modalidades, los animales no humanos de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción (por ejemplo, uno que tiene un locus C9ORF72 alterado, interrumpido, eliminado, insertado, modificado, etcétera o de cualquier otra manera no funcional) o puede no tener modificaciones (es decir, un animal no humano de tipo silvestre).
Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en animales no humanos (o en células aisladas a partir de estos y/o mediante el uso de éstas) para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco incluyen, pero no se limitan a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos para el fármaco, metabolismo del fármaco, arreglos de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido objetivo, concentración del fármaco en tejido que no es objetivo, actividad transcripcional y similares. En diversas modalidades, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para determinar una dosis eficaz farmacéuticamente de un fármaco (por ejemplo, un fármaco dirigido a C9o Rf72).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la técnica cómo producir y usar métodos y composiciones de la invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a ella.
Ejemplo 1. Generación de una interrupción en un locus C9ORF72 no humano
Este ejemplo ilustra una interrupción dirigida en un locus C9orf72 de un roedor. En particular, este ejemplo describe específicamente la deleción de toda la secuencia codificante de un locus C9orf72 de ratón mediante el uso de un constructo de indicador lacZ colocado en unión operativa con un promotor de C9orf72 de ratón. El vector de direccionamiento C9orf72-lacZ para crear una interrupción en un locus C9orf72 endógeno de ratón se hizo como se describió anteriormente (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos núm. 6,586,251; Valenzuela y otros, 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; y Adams, N.C. y N.W. Gale, en Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, ed. Lois, S.P.a.C., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006). El locus C9orf72 resultante modificado se representa en la Figura 1A, cuadro inferior.
Brevemente, se generó un vector de direccionamiento mediante el uso de clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de una biblioteca BAC RP23 de ratón (Adams, D.J. y otros, 2005, Genomics 86:753-758) y se introdujeron en células madre embrionarias (ES) híbridas F1 (129S6SvEvTac/C57BL6NTac) seguidas de cultivo en medio de selección que contiene G418. Las colonias resistentes a los fármacos se recogieron 10 días después de la electroporación y se tamizaron para determinar el direccionamiento correcto como se describió anteriormente (Valenzuela y otros, supra; Frendewey, D. y otros, 2010, Methods Enzymol. 476:295-307). Se usó el método VELOCIMOUSE® (DeChiara, T.M. y otros, 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; Dechiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou y otros, 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), en el que se inyectaron células ES dirigidas a embriones Swiss Webster en etapa de 8 células no compactadas, para producir ratones de generación F0 sanos totalmente derivados de células ES heterocigotos para la deleción de C9orf72. Los machos heterocigotos de la generación F0 se cruzaron con hembras C57B16/NTac para generar heterocigotos F1 que se entrecruzaron para producir ratones de generación F2 C9orj72-l~, C 9 o r f72 y de tipo silvestre para análisis fenotípicos. Se generó una segunda cohorte de ratones de generación N2F2 a través de fertilización in vitro (IVF) mediante el uso de espermatozoides heterocigotos F1 congelados y ovocitos de hembras donantes C57B16/NTac. La descendencia heterocigota N2F1 se entrecruzó para generar ratones N2F2 C9orf72r'~, C9orf72+/- y de tipo silvestre para análisis fenotípico.
Los estudios fenotípicos de ratones F2 y N2F2 comenzaron a las seis (6) semanas de edad. Se observó a los ratones desde el nacimiento por diversos hitos del desarrollo (daño fetal, respiración, anomalías faciales y de las extremidades, color de la piel, postura, corrección y apertura de los ojos) hasta las 6 semanas de edad, cuando se alojaron 2-5 por jaula en 12 horas de luz por día a 20-23 °C, y 40-60 % de humedad para el estudio. Los ratones se alojaron en jaulas de 95,6 x 309,1 x 133,4 mm (Thoren) con lecho a base de mazorca (The Andersons Lab Bedding) y un nido de algodón para enriquecimiento (Ancare). En el alojamiento, los ratones se monitorearon dos veces al día para determinar su estado de salud y tuvieron acceso a alimento concentrado normal (LabDiet) y agua a voluntad. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo en estricto cumplimiento con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud. El protocolo se aprobó por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Regeneron Pharmaceuticals (IACUC), y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Análisis de expresión por TAQMAN®: Los tejidos de ganglios linfáticos axilares, braquiales y cervicales, la almohadilla grasa gonadal, la corteza frontal, el diafragma, la médula espinal, el bazo y el timo se diseccionaron frescos en reactivo de estabilización RNALater (QIAgen) y se almacenaron a -20 °C. Los tejidos se homogeneizaron en reactivo TRIZOL® y se separaron en fases con cloroformo. La fase acuosa, que contiene ARN total, se purificó mediante el uso de miRNeasy Mini Kit (QIAgen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se eliminó el ADN genómico mediante el uso de tampón ADNasa MAGMAX™ TURBO™ y ADNasa TURBO™ (Ambion). El ARNm se transcribió inversamente en ADNc mediante el uso de la mezcla maestra SUPERSCRIPT® VILO™ (SuperScript® III RT, RNaseOUT™, inhibidor de ribonucleasa recombinante, proteína auxiliar patentada, cebadores aleatorios, MgCh, dNTP; Invitrogen de Life Technologies). El ADNc se amplificó con la mezcla maestra de expresión génica TAQMAN® (Applied Biosystems) mediante el uso del sistema de detección de secuencia ABI 7900HT (Applied Biosystems). La beta-actina se usó como un gen de control interno para normalizar las diferencias de entrada de ADNc. El timo de ratones de tipo silvestre se usó como muestra de referencia para calcular la diferencia en veces de ARNm entre muestras (n=5 hembras por tejido por genotipo). En la Figura 1B se exponen resultados ilustrativos.
Perfil de expresión de LacZ: Los ratones se anestesiaron profundamente mediante inyección IP de ketamina/xilazina (120/5 mg/kg) y se fijaron por perfusión cardíaca mediante el uso de una solución de glutaraldehído al 0,2 %, paraformaldehído al 4 %. Los tejidos del cerebro, la caja torácica, los ganglios linfáticos, las glándulas salivales, el timo, el corazón, los pulmones, el hígado, el bazo, el estómago, el riñón, el intestino, los urogenitales, los músculos y de las extremidades posteriores se diseccionaron, se enjuagaron en PBS y se fijaron por 30 minutos en glutaraldehído al 0,2 %, solución de paraformaldehído al 4. Los tejidos se lavaron y se incubaron en una solución de tinción X-gal (1 mg/ml) durante 1-24 horas a 37 °C. Después de la tinción, los tejidos se lavaron, se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4 % y se aclararon en una serie de glicerol del 50 %, 70 % y 100 %. Las fotografías se tomaron con un microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 y una cámara digital Nikon DS-Ri1 mediante el uso del programa informático de imágenes NIS-Elements D (Nikon).
El perfil de expresión se registró en el día embrionario 12,5 (E12,5), 6 semanas y 28 semanas. Datos representativos del perfil de expresión relativa de p-galactosidasa (lacZ) en embriones E12,5 (Tabla 4) y de ratones de 6 y 28 semanas de edad C9orf72~l~ se proporcionan más abajo (Tabla 5) (- = sin expresión; = expresión baja; + = expresión moderada; ++ = expresión alta; wt = C57BL/6N tipo silvestre; nd = no determinado).
Como se muestra en la Figura 1B, se detectaron altos niveles de expresión de C9orf72 en la almohadilla grasa gonadal, la corteza frontal y las médulas espinales de tipo silvestre (WT), con niveles más bajos en el timo, el bazo y los ganglios linfáticos. Los ratones C9orf72+l- (Het) tenían aproximadamente la mitad del nivel de expresión del tipo silvestre (WT), como se esperaba, y los ratones C9orf72rl~ (KO) no tenían expresión detectable de C9orf72. No se observó diferencia en los niveles de transcripción de los loci cercanos Mob3b, Ak045932, y Ifnk entre los genotipos probados, lo que indica que la inserción de solamente lacZ (es decir, ablación de la secuencia codificante) afectó la expresión de C9orf72.
Consistente con los datos que se muestran en la Figura 1B, la tinción de lacZ en animales C9orf72rl~ de 6 y 28 semanas reveló actividad enzimática en varias regiones del cerebro y la médula espinal, así como también en el bazo, los testículos y los riñones (Tablas 4 y 5), lo cual es consistente con otros informes (Suzuki, N. y otros, 2013, Nat. Neurosci. 16(12):1725-8; Koppers, M. y otros, 2015, Am. Neurol. 78(3):425-38). Además, se observó una tinción menos prominente en otros tejidos. La actividad del indicador fue más limitada en intensidad y alcance en tejidos C9orf72rl~, como se esperaba para un solo alelo de reemplazo lacZ.
Tomado en conjunto, este ejemplo demuestra que el C9orf72 murino se expresa en diversos tejidos del sistema nervioso e inmunitario. Además, este ejemplo demuestra que, al menos en algunos tejidos, la expresión aumenta con la edad del animal y se correlaciona directamente con los fenotipos neurológicos e inmunológicos descritos en los siguientes ejemplos (ver más abajo).
Tabla 4.
Figure imgf000039_0001
Tabla 5.
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 2. Análisis de comportamiento de animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9orf72
Este ejemplo demuestra, entre otras cosas, que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) descritos en la presente descripción desarrollan síntomas similares a los de la ALS, tales como, por ejemplo, disminución del peso corporal y anomalías motoras significativas como resultado de una interrupción en un locus C9orf72 de roedor (por ejemplo, ratón) como se describió en el Ejemplo 1.
Estudios fenotípicos de ratones que tienen una interrupción en un locus C9orf72 como se describió anteriormente se realizaron a las 8, 18, 37 (hembras) y 57-60 semanas (machos). El peso corporal se midió cada dos semanas, y la composición corporal se analizó mediante una exploración |jCT (Dynamic 60). Se usó la exploración estándar 24 para visualizar la masa de la región cervical de la columna vertebral. Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Regeneron Pharmaceuticals.
La evaluación de la función motora general se realizó mediante el uso de ensayos de puntuación subjetiva a ciegas. El análisis del deterioro motor se realizó mediante el uso de pruebas de rotarod, locomoción en campo abierto y pasarela. La puntuación de discapacidad motora se midió mediante el uso del sistema desarrollado por el ALS Therapy Development Institute (ALSTDI, Gill A. y otros, 2009, PLoS One 4:e6489). Durante las pruebas de pasarela, los sujetos caminan a través de una plataforma de vidrio iluminada mientras una cámara de video registra desde abajo. Se informan los parámetros relacionados con la marcha, tales como el patrón de zancada, la velocidad de balanceo de la pata individual, la duración del apoyo y la presión para cada animal. Esta prueba se usa para fenotipar ratones y evaluar nuevas entidades químicas por su efecto sobre el desempeño motor. CatWalkXT es un sistema para la evaluación cuantitativa de pisadas y marcha en ratas y ratones. Se utiliza para evaluar la capacidad locomotora de los roedores en casi cualquier tipo de modelo experimental de anomalías de sistemas nervioso central, nervioso periférico, muscular o esquelético.
Análisis de la marcha por pasarela: Los animales se colocan al comienzo de la pasarela de Noldus CatWalkXT 10, con el extremo abierto frente a ellos. Los ratones corren espontáneamente hasta el final de la pista para intentar escapar. La cámara registra y el programa informático del sistema mide las huellas. Las huellas se analizan para determinar las anomalías en la colocación de las patas.
Prueba de campo abierto: Los ratones se colocan en el sistema de campo abierto de Kinder Scientific y se evalúan durante 60 minutos. El aparato usa rayos infrarrojos y un programa informático de computadora para calcular movimientos finos, deambulación X+Y, distancia recorrida, número de eventos de exploración vertical, tiempo dedicado a la exploración vertical y tiempo de inmovilidad.
Rotarod: La prueba de rotarod (IITC Life Science, Woodland Hills, CA) mide la latencia para que un ratón caiga de un rodillo giratorio. El rotarod se configura en el régimen experimental que comienza a 1 rpm y acelera hasta 15 rpm durante 180 segundos. Después, se registra la latencia de los animales hasta caer después del régimen incremental. Para evaluar la latencia hasta la caída, se usa el promedio y el máximo de las tres duraciones de tiempo más largas que los animales permanecen en el rodillo sin caerse. Los animales que logran permanecer en el rodillo más de 180 segundos se consideran asintomáticos.
El deterioro de las neuronas motoras superiores se presenta como espasticidad (es decir, rigidez), aumento de reflejos, temblor, bradicinesia y signos de Babinski. El deterioro de las neuronas motoras inferiores se presenta como debilidad muscular, desgaste, espasmo, curvatura y arrastre de los pies y fasciculaciones. El deterioro bulbar se presenta como dificultad para tragar, balbucear y fasciculaciones de la lengua. La Tabla 6 expone la metodología de puntuación relacionada con el deterioro motor, el temblor y la rigidez de los animales durante las pruebas. En las Figuras 2A-2H se exponen resultados ilustrativos.
Como se muestra en las Figuras 2A-2H, los ratones C9orf72~l~ demostraron fenotipos similares a los de la ALS, como, por ejemplo, disminución del peso corporal, inactividad motora y deterioro de la marcha. En particular, la disminución del peso corporal en los ratones C9orf72-l~ en comparación con los ratones de control de tipo silvestre comenzó aproximadamente a las 30 semanas de edad (Figura 2B). Además, con la excepción del rotarod, se observó un deterioro motor significativo (por ejemplo, debilidad significativa y colapsos de las extremidades posteriores hacia la línea media lateral, así como también temblor leve y músculos rígidos de las extremidades posteriores, p<0,0001) para los ratones C 9 o rf72 en todos los tipos de pruebas (Figuras 2C-2H) que comienza aproximadamente a las 40 semanas de edad, lo que indica el inicio de la patología de las neuronas motoras superiores e inferiores. No se observaron defectos similares en los animales de tipo silvestre o (C9orf72+l~) heterocigotos.
El análisis de rotarod y marcha en pasarela en los ratones C 9 o r f72 demostró una disminución significativa de los comportamientos locomotores y menos eventos de exploración vertical, lo que indica un deterioro de la extremidad posterior. Los análisis de la marcha por pasarela revelaron signos de deterioro de la coordinación entre las extremidades inferiores y una longitud de zancada reducida, así como también bradicinesia y arrastre de las extremidades posteriores. Estos datos indicaron anomalías significativas en la marcha en comparación con el tipo silvestre. No se observó diferencias entre ratones de tipo silvestre y C 9 o rf72 con respecto al tiempo máximo en el rotarod. Tan pronto como a las 36 semanas de edad, los ratones C9orf72rl~ demostraron déficits motores significativos y progresivos.
En otro experimento, la porción lumbar de las médulas espinales de ratones de tipo silvestre y C9orf72rl~ se recolectaron (n=5, 60 semanas de edad) para el análisis histopatológico. No se observó diferencia en el número total de neuronas motoras en las médulas espinales (Figura 2I). Sin embargo, el área media del cuerpo celular de las neuronas motoras C9orf72-l~ fue significativamente más grande en comparación con el tipo silvestre (p<0,0001). En particular, las neuronas motoras de los ratones C9orf72rl~ demostraron características hipertróficas evidenciadas por un área media significativamente mayor del cuerpo celular en comparación con el tipo silvestre (Figura 2I). Por lo tanto, estos datos indicaron un posible inicio de la patología de las neuronas motoras inferiores a partir de las 40 semanas de edad.
En un experimento similar, las anomalías motoras se evaluaron en tipo silvestre (C9of72+l+, n=14; 11 hembras, 3 machos) y C9of72-l~ (n=17; 12 hembras, 5 machos) a partir de las 32 semanas hasta las 60 semanas de edad como el por ciento de animales vivos en una semana dada. Los ratones se pesaron semanalmente y la evaluación de la función motora general se realizó mediante el uso de ensayos de puntuación subjetivos a ciegas (como se describió anteriormente). Se realizaron exámenes neurológicos clínicos semanales o bimensuales en los dos grupos de ratones para observar su deterioro motor, temblor y rigidez de los músculos de sus extremidades posteriores. Para el deterioro motor, seguimos una escala de puntuación neurológica a ciegas (descrita anteriormente) de cero (sin síntomas) a cuatro (el ratón no puede enderezarse por sí mismo dentro de los 30 segundos posteriores a colocarse sobre su lado). Para el temblor y la rigidez, creamos un sistema de puntuación con una escala de cero (sin síntomas) a tres (grave). Los datos se informaron como la media ± SEM. Resultados representativos se exponen en la Figura 2J.
Los comportamientos locomotores se evaluaron durante 60 minutos cada dos semanas mediante el uso del sistema automático de campo abierto (Kinder Scientific), prueba de rotarod (Rota Rod, IITC Life Science, Woodland Hills, CA) y análisis de la marcha (CatWalkXT 10, Noldus) como se describió anteriormente. Los datos se informaron como la media ± SEM. Resultados representativos se exponen en la Figura 2K.
Mediante el uso de las escalas de puntuación descritas anteriormente, los inventores observaron que alrededor de las 40 semanas de edad, los ratones c9orf72-l~ comenzaron a mostrar una debilidad significativa y el colapso de sus patas traseras hacia la línea media lateral, así como también un temblor leve y músculos rígidos de las extremidades posteriores (P < 0,0001), lo que sugiere el inicio de la patología de las neuronas motoras superiores e inferiores. Además, todos los ratones de tipo silvestre vivieron más de 60 semanas de edad, pero solo el 53 % de los ratones C9orf72rl~ (9 de 17; 5 hembras, 4 machos) estaban vivos a las 60 semanas de edad (Figura 2J, arriba a la izquierda). Con un inicio alrededor de las 36 semanas de edad, los ratones C9orf72-l~ dejaron de ganar peso corporal, en contraste con la cohorte de ratones de tipo silvestre.
Del ensayo de campo abierto, los inventores observaron que los ratones C9orf72-l~ muestran comportamientos locomotores significativamente disminuidos en comparación con sus contrapartes de tipo silvestre (P = 0,0008). Estos ratones mostraron, además, comportamientos de exploración vertical significativamente menores (P=0,0009), lo que indicó un deterioro de sus extremidades posteriores. No se observó ningún cambio significativo en el tiempo máximo que los ratones permanecían en un rodillo giratorio en ningún momento durante el estudio entre los ratones de tipo silvestre y C9orf72-l~. Del análisis de la marcha por pasarela, los inventores observaron que los ratones C9orf72rl~ tienen deteriorada significativamente la coordinación entre las extremidades inferiores (P = 0,0005) y longitud de zancada (P = 0,0013), así como también bradicinesia y arrastre de las extremidades posteriores. Estos datos indicaron anomalías significativas en la marcha en los ratones C9orf72~l~ en comparación con el tipo silvestre. Por lo tanto, el ejemplo demuestra que, con un inicio alrededor de las 36 semanas de edad, los ratones C9orf72-- muestran déficits motores significativos y progresivos en comparación con el tipo silvestre.
En otro experimento, los ratones (C9orf72+/-) heterocigotos y (C9orf72-/-) homocigotos se examinaron mediante el uso de una prueba de fuerza de agarre. Brevemente, la fuerza de agarre mide la función neuromuscular como la fuerza muscular máxima de las extremidades anteriores, y se evalúa mediante el agarre aplicado por un ratón en una rejilla que se conecta a un sensor. Se llevaron a cabo tres ensayos en sucesión y se midió solo la resistencia de las extremidades anteriores. Todos los valores de fuerza de agarre obtenidos se normalizaron contra el peso corporal del ratón. La prueba de fuerza de agarre se realizó en trece ratones de tipo silvestre, siete C9orf72+l- y dieciocho C9orf72-/- a las 20 semanas de edad (antes del inicio de los síntomas motores) y en doce de tipo silvestre, cuatro C9orf72+-y trece C9orf72-/- ratones a las 60 semanas de edad. Resultados representativos se exponen en la Figura 2L.
Como se muestra en la Figura 2L, los ratones heterocigotos (C9orf72+l-) no mostraron ningún deterioro motor significativo, temblor o rigidez a las 60 semanas. Además, los ratones heterocigotos (C9orf72+/-) no mostraron ningún cambio en la fuerza de agarre a las 60 semanas en comparación con el tipo silvestre.
Tomados en conjunto, este ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos anteriormente demuestran un fenotipo neurodegenerativo medible y, por lo tanto, proporcionan modelos útiles de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y/o demencia frontotemporal (FTD), cuyos animales no humanos tienen un genoma que comprende una deleción de toda la secuencia codificante (es decir, exones 2-10) de un locus C9orf72 endógeno resultante de la inserción de un gen indicador (por ejemplo, lacZ). Dichos modelos animales proporcionan un sistema in vivo útil para el desarrollo y tamizaje de candidatos terapéuticos para el tratamiento de la ALS y/o la FTD.
Tabla 6.
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 3. Análisis inmunofenotípico de animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9orf72
Este ejemplo demuestra que los animales no humanos creados de acuerdo con el Ejemplo 1 demuestran un fenotipo inmunológico caracterizado por, en algunas modalidades, esplenomegalia y linfadenopatía resultante de la infiltración de diversas poblaciones de células inmunitarias. Además, este ejemplo demuestra específicamente que dichos animales no humanos desarrollan glomerulonefritis caracterizada por la infiltración de poblaciones de células inmunitarias en el riñón. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, los presentes inventores proponen que el producto del locus C9ORF72 juega un papel crítico en la función inmunitaria y que la pérdida del polipéptido C9ORF72 en animales no humanos descritos en la presente descripción no es el mecanismo prominente de la enfermedad ALS y/o FTD. Diversos tejidos se cosecharon de ratones C9orf72-/- y de tipo silvestre para análisis (n=4-6 animales por genotipo a las 8, 18 y 37 semanas para las hembras, y 9-10, 18 y 57-60 semanas para los machos).
Preparación de las células y análisis por citometría de flu jo: Se recolectó el máximo volumen de sangre en tubos recubiertos con EDTA mediante punción cardíaca inmediatamente después de la eutanasia con CO2 y aproximadamente 200 |jl se transfirieron a tubos recubiertos con heparina para la preparación para FACS. El bazo, la médula ósea y los ganglios linfáticos cervicales se recolectaron, se disociaron en suspensiones de células individuales en PBS IX de Dulbecco con suero bovino fetal al 2 % (Stem Cell Technologies) más EDTA 2 mM (Ambion) y se filtraron mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. La lisis de glóbulos rojos (RBC) se realizó en sangre, bazo y médula ósea mediante el uso de tampón de lisis RBC (eBioscience) o tampón de lisis ACK (Life Technologies). Las células de los ganglios linfáticos, el bazo y la médula ósea se contaron mediante el uso de un contador de viabilidad celular Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience) y se colocaron en placas para aproximadamente 10 millones de células por pocillo para el bazo y I millón de células por pocillo o volumen máximo para los ganglios linfáticos y la médula ósea. La sangre se colocó en placas al volumen máximo (aproximadamente 250 j l) por pocillo. Las células se trataron con tinción LIVE/DEAD Fixable Aqua (Life Technologies) a temperatura ambiente, se centrifugaron y se resuspendieron en solución de bloqueo (AcM CD16/CD32 anti-ratón purificado, BD Pharmingen, 1:100 en tampón FACS) durante 15 minutos en hielo. Las células se tiñeron con anticuerpos conjugados durante 30 minutos en hielo, se lavaron, se fijaron (kit BD Cytofix/cytoperm) y se lavaron nuevamente. Finalmente, las células se resuspendieron en tampón FACS (PBS IX de Dulbecco con suero bovino fetal al 2 %, Stem Cell Technologies, más EDTA 2 mM, Ambion) y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSCanto II o citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences). La tinción de Foxp3 (eBioscience) se realizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Panel de tinción de células plasmáticas: CD11b (M1/70; Biolegend), CD11c (N418; Biolegend), CD3 (145-2C11; Biolegend), B220 (RA3-6B2; Biolegend), CD19 (1D3; BD Pharmingen), CD138 (281-2; BD Pharmingen) y CD45 (30-F11; BD Pharmingen). Panel de tinción de células mieloides: F4/80 (BM8; Biolegend), CD115 (AFS98; eBioscience), Ly6G (RB6-8C5; eBioscience), CD11b(M1/70; eBioscience), CD45(30-F11; BD Biosciences) y Ly6C (AL-21; BD Biosciences). Los anticuerpos contra CD8, CD25, CD62L, CD69, CD127, Pd 1 (RPMI-30), NKp46 se obtuvieron de BioLegend (San Diego, CA). El anticuerpo Foxp3 se obtuvo de eBioscience (San Diego, CA). El anticuerpo CD49b se obtuvo de BD Biosciences (San José, CA). Los datos se analizaron mediante el uso del programa informático FlowJo (Tree Star). Se realizaron recuentos para el número de células totales y por ciento de positivas para bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y riñón de hembras de 30-35 semanas de edad (tipo silvestre: n=4; C9orf72r/~ n=4) en un contador de viabilidad celular Nexelcom Bioscience Cellometer Auto 2000 con colorante de viabilidad AO/PI (naranja de acridina y yoduro de propidio). Los recuentos de células se usaron para determinar el número absoluto de poblaciones de células observadas mediante tinción de superficie y se graficaron en consecuencia.
Histología: Los tejidos se recolectaron en paraformaldehído al 4 % (PFA, Electron Microscopy Sciences) o se recolectaron después de perfusión transcardial con 50 ml de solución salina, 50 ml de PFA al 4 % en tampón de acetato a pH 6,5 y finalmente 50 ml de solución de PFA al 4 % en tampón de borato a pH 9,5. Las médulas espinales se recolectaron en una solución de sacarosa al 15 % seguido de una al 30 % en tampón de borato hasta que estas cayeron al fondo. Todos los demás tejidos se fijaron posteriormente en PFA al 4 % y se transfirieron a etanol al 70 % después de 24 o 48 horas. La inclusión en parafina, el seccionamiento y la tinción con hematoxilina y eosina (H-E) se realizaron por un laboratorio comercial de histología (Histoserv, Inc.; Germantown, MD). La inmunohistoquímica para IgM, IgG, factor de complemento C3, CD45R, CD3, CD138 y F4/80 se completó por un laboratorio comercial (Histotox Labs; Boulder, CO). El recuento de neuronas motoras y el área del cuerpo celular se cuantificaron mediante el uso de Image J. El recuento de neuronas motoras representa el promedio de tres láminas portaobjetos por animal, ratones n=5 y el área del cuerpo celular representa el promedio de tres láminas portaobjetos por animal, 10 neuronas motoras por lámina portaobjetos, ratones n=5. El factor de complemento C3 IHC se cuantificó mediante el uso de Halo.
Ensayos de hematología: Se recolectaron muestras de sangre mediante sangrados oculares retroorbitales con anestesia con isoflurano o mediante punción cardíaca después de la eutanasia por inhalación de CO2 de acuerdo con el protocolo del IACUC de Regeneron. Se realizó un recuento sanguíneo completo (CBC) con diferencial en 20 pl de sangre completa mediante el uso de Hemavet 950 (Drew Scientific Group) y el análisis de química clínica se realizó en muestras de suero mediante el uso del Sistema de Química ADVIA 1800 (Siemans Medical Solutions EE.UU.). Los ELISA se realizaron en muestras de plasma mediante el uso de lo siguiente: Kit de ELISA de factor reumatoide de IgG de ratón y kit de ELISA de factor reumatoide de IgM de ratón (Shibayagi Co., Ltd.), kit de ELISA de Ig total de ADN anti-ADNbc de ratón, kit de ELISA de Ig total de anticuerpos anti-nucleares de ratón (ANA), kit de ELISA de Ig total de ratón, Anti-Sm de ratón (Antígeno Smith), kit de ELISA de Ig total, kit de ELISA de Ig anti-cardiolipina total de ratón (Alpha Diagnostic Intl.) y kit de ELISA de ratón IgG e IgM (Abcam) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las muestras se leyeron en un lector de microplacas Spectramax M5 a 450 nm (Molecular Devices). Las muestras se analizaron por duplicado y se promediaron para determinar el valor medio. IFN-y, IL-1p, IL-2, IL-4, iL-6, IL-10, IL-12 total, IL-17, Mc P-1 y TNF-a se midieron en muestras de plasma mediante el uso de un ensayo de detección por electroquimioluminiscencia Multi-Spot® 10-plex (Meso Scale Discovery) de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se leyeron en un lector de placas Meso Sector S 600 a 620 nm (Meso Scale Discovery). Las muestras se analizaron por duplicado y se promediaron para determinar el valor medio.
Aislamiento, secuenciación y análisis de ARN: El bazo y los ganglios linfáticos cervicales se diseccionaron frescos en reactivo de estabilización RNALater (Qiagen) y se almacenaron a -20 °C. El ARN total se aisló mediante el uso del kit de aislamiento de ácido nucleico MagMAX™ (Ambion) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El ARN se cuantificó mediante el uso de un espectrofotómetro UV y la integridad del ARN se evaluó porQiaxcel (Qiagen). El ARNm poliA se purificó a partir de ARN total mediante el uso del kit de ARNm Dynabeads (Invitrogen) y las bibliotecas de Sec-ARN específicas de cadena se prepararon con el kit de preparación de biblioteca RNA-seq ScriptSeq (Illumina). Las bibliotecas de Sec-ARN se secuenciaron a una longitud de 33 pb mediante el uso del secuenciador Hiseq 2000 NGS (Illumina). Los niveles de expresión génica se derivaron de lecturas de secuenciación primarias mediante el uso de Nimbus2, un programa informático de Sec-ARN desarrollado por Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Método de análisis de orina; las muestras de orina se obtuvieron por medio de recolección al momento y la concentración de albúmina urinaria se determinó con el kit ELISA competitivo indirecto de Albuwell M (Exocell, Philadelphia, PA). La concentración de creatinina en orina se analizó mediante el uso del kit Creatinine Companion (Exocell). Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los datos obtenidos se usaron para calcular la relación albúmina/creatinina en orina (ACR).
Análisis estadístico: Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron mediante el uso del programa informático GraphPad Prism (versión 3.0). Los datos se analizaron mediante la prueba t no apareada de Student y el análisis de varianza de una vía (ANOVA). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos a valores de p <0,05 (las barras de error representan s.e.m.). En las Figuras 3A-3AL se exponen resultados ilustrativos.
Como se muestra en las Figuras 3A-3D, los ratones C9orf72r/~ desarrollaron un aumento significativo del bazo en comparación con los ratones de tipo silvestre y C9orf72+l~. Además, los ganglios linfáticos cervicales fueron progresivamente más grandes con la edad (Figuras 3A-3D). Por lo tanto, ya a las 8 semanas de edad, los ratones C9orf72-/- muestran bazos y ganglios linfáticos cervicales agrandados. Dichos aumentos fueron palpables en las regiones cervicales de todos los ratones C9orf72--, pero no en ratones de tipo silvestre o C9orf72+l-. Tras una investigación adicional, dichas masas fueron palpables a las 12 semanas de edad en ratones hembras C9orf72r1- y en ratones machos y hembras C9orf72-/- a las 18 semanas. Después de la disección, se demostró que las masas se originaron en los ganglios linfáticos cervicales, y se observó un aumento tan pronto como a las 8 semanas de edad (Figura 3A). Una disección completa también reveló ganglios linfáticos agrandados adicionales en todo el cuerpo, especialmente los ganglios linfáticos mesentéricos en ratones C9orf72-/- más viejos (>35 semanas). Las placas de Peyer también se agrandaron notablemente y la esplenomegalia fue evidente en ratones C9orf72-/- a las 8 semanas de edad (Figura 3D, abajo a la izquierda). Solo nueve de 17 ratones C9orf72-/- vivieron más de 60 semanas de edad, mientras que todos los ratones de tipo silvestre sometidos a pruebas periódicas de función neurológica sobrevivieron hasta el final del período experimental. Aproximadamene a las 18-24 semanas de edad, la esplenomegalia y la hiperplasia de los ganglios linfáticos cervicales estaban bien establecidas en todos los ratones C9orf72-/- y las curvas de peso corporal de C9orj72-/- comenzaron a aplanarse en comparación con los ratones de tipo silvestre y C9orf72+l- (por ejemplo, Figura 2B).
Los datos de CBC con diferencial de sangre completa muestran que los ratones C9orf72-~ desarrollan un aumento significativo en los neutrófilos, eosinófilos y monocitos circulantes en comparación con el tipo silvestre, mientras que demuestran una disminución significativa en los linfocitos circulantes (Figura 3E). Los datos de CBC de los ratones C9orf72-/- (por ejemplo, de 34-38 semanas de edad) también demostraron que el diferencial de glóbulos blancos circulante se alteró en comparación con los ratones de tipo silvestre. Los inventores observaron que el aumento significativo en monocitos y neutrófilos, y una disminución de linfocitos en los ratones C9orf72-/- en comparación con los ratones de tipo silvestre fueron detectables tan pronto como a las 8 semanas de edad.
La tinción con H-E reveló una población mixta de células con múltiples morfologías en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratones C9orf72-/- (Figuras 3F, 3G). Específicamente, los ganglios linfáticos cervicales observados a 4x de potencia mostraron una abundancia de células grandes y redondas caracterizadas por bordes celulares variablemente distintos y con características eosinófilas de moderadas a abundantes (Figura 3F). Ocasionalmente, se observó citoplasma espumoso en la población celular expandida. Cuando se observan a una potencia de 60x, las células dentro de los ganglios linfáticos cervicales mostraron una morfología plasmacitoide (flechas azules) entremezcladas con neutrófilos (flechas amarillas) y otros linfocitos maduros (Figura 3g ). Las células que parecían ser consistentes con macrófagos (flechas verdes) también estaban presentes, al igual que las células Mott (flecha roja intermitente; células plasmáticas anormales con inmunoglobulinas condensadas), todo lo cual indicó inflamación crónica en los ganglios linfáticos cervicales de ratones C9orf72-/- (Figura 3G).
El agrandamiento observado de bazos y ganglios linfáticos en los ratones C9orf72-/- indicó un proceso de enfermedad de desregulación inmunitaria o neoplásica, que no se había informado previamente en pacientes con ALS-FTD. El análisis histopatológico en los tejidos linfoides C9orf72-/- (es decir, la tinción de secciones de ganglios linfáticos y bazo de ratones de 8-60 semanas de edad con hematoxilina y eosina (H-E)) confirmó que se conservaba la organización celular básica de los ganglios linfáticos agrandados. Además, la tinción por IHC confirmó la presencia de células B (CD45R+) en la corteza y células T (CD3+) entre los folículos y en la zona de la paracorteza. Sin embargo, hubo una expansión de la arquitectura ganglionar cortical y medular por una población celular que consistía principalmente de células redondas grandes con bordes variablemente distintos, y con un solo núcleo redondo rodeado de citoplasma eosinófilo y espumoso. Un infiltrado celular similar también se presentó en el bazo, ubicado predominantemente dentro de la pulpa roja, lo que expandió la arquitectura esplénica y, como resultado, los pesos esplénicos en ratones C9orf72-/-. Además, se observó que se presentó una abundancia de células plasmocitoides que contenían halos perinucleares, consistente con la morfología de las células plasmáticas, junto con células Mott ocasionales. No se observaron infiltrados mixtos similares en ratones de tipo silvestre y C9orf72+l- (heterocigotos).
La población de células grandes y redondas no se tiñó consistentemente con CD45R, CD3 o CD138, pero fue fuertemente positiva para F4/80, un marcador del linaje de macrófagos. La señal por IHC fue predominante en la membrana celular pero escasa en el citoplasma debido al citoplasma altamente vacuolado. Por el contrario, la tinción con F4/80 de controles heterocigotos y WT fue característica del patrón de tinción citoplasmática y membranosa esperado para los macrófagos, con una señal general F4/80 más intensa que la observada en ratones C9orf72-/- (ver más abajo, por ejemplo, Figura 3P).
Los análisis por H-E e IHC de órganos adicionales de ratones de 8-60 semanas de edad revelaron hiperplasia medular esporádica del timo y fibrosis focal de la médula ósea y/o hiperplasia mieloide en determinados ratones C9orf72-/-. Una observación más común fue la presencia de una población prominente de células dendríticas encontradas en el hígado y los riñones de ratones anulados. Estas células de alargadas a angulares eran F4/80+ y morfológicamente se parecían a las células dendríticas (DC) típicas, aunque de mayor tamaño y más numerosas. Estas eran más pronunciadas en hígado C9orf72-/- tan pronto como a las 8 semanas en comparación con el tipo silvestre, aunque no hubo evidencia de enfermedad hepática asociada. Además, observamos un aumento en células F4/80+ en riñón C9orf72-/- a las 8 semanas que se volvió más prominente con la edad. Las DC se ubicaron principalmente dentro de la médula externa, donde formaron agregados en la vecindad de la mácula densa y los túbulos adyacentes, junto con manguitos prominentes alrededor de los glomérulos en asociación con linfocitos. Observamos el aumento de infiltrados de leucocitos mixtos en el riñón a medida que los ratones envejecían, acompañados de grados variables de enfermedad glomerular mediada por el sistema inmunitario que estaba bien establecida entre las 35-60 semanas de edad. No se observó evidencia de inflamación en el tejido del cerebro o de la médula espinal en ninguno de los animales examinados. Por lo tanto, el bazo y los ganglios linfáticos fueron los principales sitios de patología inmunitaria en ratones C9orf72/- con indicaciones de enfermedad glomerular progresiva secundaria en el riñón.
Como se muestra en la Figura 3H, los ratones C9orf72r1- machos demuestran un número creciente de células B CD11b-CD11c-CD3-B220+CD19+ en los ganglios linfáticos cervicales, mientras que muestran porcentajes comparables o disminuidos de estas mismas células B en el bazo, la médula ósea y la sangre en comparación con el tipo silvestre. Las células B que están en transición a células plasmáticas (B220medi°/baj°CD19medio/baj°) y células plasmáticas maduras (B220baj°/-CD19bajo/- CD45+CD138medio/+) parecieron aumentar con la edad en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales y la médula ósea de ratones machos C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figura 3I).
El porcentaje de células B (CD45+CD19+) no se modificó o se redujo en ratones hembras C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre, en dependencia del órgano examinado (por ejemplo, ganglios linfáticos cervicales). Los ratones hembras C9orf72-/- demuestran porcentajes crecientes de células B en transición a células plasmáticas/blastos plasmáticos (CD45+CD19intB220intcDl38+) y células plasmáticas maduras (CD45+CD19-B220-CD138+) en bazo, ganglios linfáticos y médula ósea en comparación con el tipo silvestre (Figuras 3J). No observamos diferencias consistentes entre ratones C9orf72-/- y controles en estos tipos de células en la sangre. Tomados en conjunto, estos datos demostraron una respuesta inmunitaria adaptativa avanzada en ratones C9orf72-/-.
Como se muestra en las Figuras 3K y 3L, se observaron porcentajes crecientes de neutrófilos (CD11b+Ly6G+Ly6C+) en el bazo de ratones machos y hembras C9orf72-/- a medida que envejecían. Además, se observaron aumentos en los ganglios linfáticos cervicales de ratones machosC9orf72-/- entre 9-18 semanas y ratones hembras C9orf72-/- en todos los puntos de tiempo examinados. Las poblaciones de granulocitos también aumentaron en la médula ósea y la sangre con una significación variable en la mayoría de los puntos de tiempo. Los monocitos inflamatorios (CD11b+, CD115+, Ly6Gbajo/-, Ly6Calto) se incrementaron significativamente en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre para bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre durante al menos un punto de tiempo de prueba (Figuras 3K y 3L, fila central). Aumentos similares de monocitos residentes (CD11b+CD115+Ly6Gbaj°/-Ly6Cmedi°/-) en el tiempo también se observaron en ratones C9orf72-/- en bazo, médula ósea y sangre, con disminución observada en los ganglios linfáticos cervicales (Figuras 3K y 3L, fila inferior, respectivamente). Como se muestra en la Figura 3M, se observó el aumento de las poblaciones de macrófagos F4/80+ en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, riñón y médula ósea en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre.
El análisis histopatológico en el contexto de la expresión de CD45R, CD3 y CD138 se analizó, además, en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratones de tipo silvestre y C9orf72-/- (Figuras 3N, 3O). Las secciones se observaron a 4x y 60x de potencia. En el bazo, los ratones C9orf72-/- demostraron una pérdida de la morfología folicular normal (Figura 3N). Las áreas de pulpa blanca estaban agrandadas y displásicas con bordes mal definidos. Se observó acumulación de células con abundante citoplasma de color rosa claro (células similares a plasma). La tinción con CD138 no difirió marcadamente de los ratones de tipo silvestre y algunas de las células proliferativas en el centro de la pulpa blanca no se tiñeron con CD45R, CD3 o CD138. Los bazos de ratones de tipo silvestre demostraron una morfología esencialmente normal con áreas de pulpa blanca compuestas de células T centrales (IHC anti-CD3) rodeadas por un borde de células B (IHC anti-CD45R), y la tinción para CD138 para células plasmáticas fue mínima (Figura 3N, izquierda).
En los ganglios linfáticos cervicales, los ratones C9orf72-/- demostraron islas de tejidos linfoides dispersos entre grandes agregados de células redondas con un solo núcleo y abundante citoplasma eosinófilo (Figura 3O). Estas células reemplazaron la arquitectura normal, pero permanecieron áreas de células B y células T relativamente normales (evidentes en el centro de las secciones teñidas con CD3 y CD45R). Las células anormales se tiñeron intermitentemente con CD3, CD138 (flecha en la imagen inferior derecha de la Figura 3O) y CD45R, pero fueron generalmente negativas para los tres marcadores. Los ratones de tipo silvestre mostraron una morfología normal de los ganglios linfáticos (Figura 3O, derecha). Se encontró inmunotinción con CD45R (célula B) en la periferia alrededor de zonas de células T (CD3) y células teñidas escasamente con CD138 en la médula.
El análisis histopatológico en el contexto de la expresión F4/80 se analizó, además, en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratones de tipo silvestre y C9orf72-/- (Figura 3P). Las secciones se observaron a 4x y 60x de potencia. Los datos demostraron tinción F4/80 positiva (macrófagos) en ratones C9orf72-/-, que se correlaciona con el gran infiltrado celular espumoso observado en la tinción con H-E (descrito anteriormente). Además, se observó tinción extracelular F4/80 en la pulpa roja del bazo en ratones C9orf72-/-. El número de células F4/80+ aumentó con la edad de 8-58 semanas en ratones C9orf72r/-, y se incrementó en ganglios linfáticos C9orf72-/- en comparación con los ganglios linfáticos de tipo silvestre.
Los recuentos de células totales CD45+ (antígeno leucocitario común) aumentaron en todos los tejidos examinados de ratones C9orf72-/-, lo que fue consistente con la infiltración inmunitaria observada. Sin embargo, los porcentajes CD45+ en comparación con las poblaciones de células totales analizadas no cambiaron o se redujeron en comparación con el tipo silvestre (Figura 3S). Se emplearon paneles de anticuerpos específicos para determinar si se alteró la homeostasis dentro de los subconjuntos de leucocitos. Los porcentajes de neutrófilos (CD45+CD11b+Ly6G+Ly6CintCD115) y monocitos totales (CD45+CD11b+CD115+) aumentaron de forma variable en los ganglios linfáticos, el bazo y la médula ósea de ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figura 3K y 3L). Se observó además aumento en macrófagos F4/80+ (CD45+CD11b+F4/8o+Ly6G-) en el bazo, ganglios linfáticos, riñones y sangre (Figura 3M). Curiosamente, aunque más células se tiñeron positivamente con F4/80 en tejidos de ratones C9orf72--, la señal general fue menos intensa que la observada en ratones de tipo silvestre, lo que indica un perfil de IHC F4/80 más extendido, pero menos concentrado (Figura 3P). La tinción de Ly6G y Ly6C reveló un mayor porcentaje de monocitos inflamatorios (CD45+CD11b+CD115+Ly6G-Ly6Chi) en bazo, ganglio linfático, riñón y sangre de ratones C9orf72-/-.
Se realizó un análisis FACS adicional en hembras de 30-35 semanas de edad, un punto temporal de interés específico ya que la mayoría de los ratones anulados han desarrollado patología renal, pero permanecieron viables. Como se muestra en la Figura 3Q, el recuento de células totales realizado en tejido total demostró un aumento significativo en el recuento absoluto de células por citometría de flujo para diversos compartimentos en ratones C9orf72-/-. La identidad de dichos aumentos se determinó mediante el uso de citometría de flujo al emplear diversos marcadores para células dendríticas mieloides, células NK y células T (Figuras 3R-3AC). Las células dendríticas mieloides (CD45+CD11b+CD11c+MHCII+) se incrementaron en por ciento y recuento de células totales en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre, mientras que la fracción de células NK (NKp46+CD49b+) disminuyó (Figura 3R). El por ciento de células CD45+ (antígeno leucocitario común; tiñe todos los glóbulos blancos) es comparable entre tejidos de ratones de tipo silvestre y C9orf72-/-, sin embargo, los recuentos de células totales aumentaron significativamente, lo que indica una infiltración significativa de células inmunitarias (Figura 3S). La tinción con marcadores específicos de células T CD4+ (población de células T auxiliares) y CD8+ (población de células T citotóxicas) demostró porcentajes disminuidos de poblaciones de células T (Figuras 3T-3AC). Como lo muestra la IHC, el perfil molecular y los resultados de CBC, las disminuciones observadas en las poblaciones de linfocitos pueden reflejar el aumento en la proporción de células mieloides.
Como se muestra anteriormente, los porcentajes de células CD45+CD8+ y CD45+CD4+ se redujeron en general en ratones C9orf72-/- en comparación con los ratones de tipo silvestre, lo que probablemente fue una consecuencia del aumento en la proporción de células mieloides consistente con los datos de la firma genética. Por el contrario, el recuento de células totales para estas poblaciones de células T aumentó en ratones C9orf72-/-. Esto reflejaba la gran expansión de tejido linfoide y la infiltración inmunitaria manifiesta observada. Las poblaciones de células T CD8+ y CD4+ se subdividieron adicionalmente en función de la expresión de marcadores de activación de superficie adicionales (Figuras 3V-3AC). Para las células T CD8+, un porcentaje significativamente mayor de los marcadores de activación temprana y memoria efectora de células T CD69 y c D44, respectivamente, se observó en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figuras 3V y 3X). Además, se observó un aumento en el porcentaje de células T que expresan PD-1, un receptor coinhibidor que se regula positivamente en las células activadas y juega un papel importante en la regulación negativa del sistema inmunitario, en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figura 3Z). Los ganglios linfáticos cervicales demostraron una mayor expresión de CD44 y PD-1, aunque la expresión de CD69 disminuyó (Figuras 3V-3AA). Para las células T CD4+, se observaron aumentos significativos en el porcentaje de CD44 y PD1 en bazo, ganglios linfáticos, riñones y sangre en ratones C9orf72r1- en comparación con el tipo silvestre, con valores comparables al tipo silvestre en la médula ósea (Figuras 3U, 3W, 3AA). El porcentaje de expresión de CD69 aumentó en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales y el riñón con una significación variable (Figura 3Y). Concomitante con el aumento de células T activadas, se observaron mayores porcentajes de células T reguladoras CD4+FoxP3+ en bazos y ganglios linfáticos en ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figura 3AB). Además, el compartimento esplénico demostró una expresión reducida de CD62L y CD127 (Figura 3AC), que se expresan en células T vírgenes o de memoria central y se regulan negativamente una vez que se activan las células T. Las mediciones del recuento de células también demostraron aumentos significativos en ratones C9orf72-/- con significación variable.
Los datos de los paneles de citocinas (Figuras 3AD, 3AE y 3AF) demostraron citocinas elevadas en el suero de ratones C9orf72-/- de 8-58 semanas de edad. En particular, a las 18 semanas de edad, los niveles de IL-17, IL-10, TNF-a e IL-12 (total) aumentaron significativamente en el suero de ratones machos C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre (Figura 3AD). Para estas mismas citocinas, se observaron niveles elevados significativos en ratones C9orf72~-~ en comparación con los ratones C9orf72+/-. Estos datos indicaron la activación sistémica de macrófagos en estos ratones. En todos los ratones machos analizados (8-58 semanas de edad), los ratones C9orf72-/- demuestran un aumento significativo en los niveles circulantes de IFN-y, IL-10, IL-12 (total), IL-17yTNF-aen comparación con los ratones de tipo silvestre. En ratones hembras C9orf72-/- de 8-38 semanas de edad, se observó un aumento significativo en los niveles circulantes de IL-10, IL-12 (total), IL-17, TNF-a y MCP-1, así como también una tendencia creciente de IFN-y, en comparación con los ratones de tipo silvestre. La IL-12 (total) se incrementó aproximadamente 6 veces en ratones C9orf72-/- en comparación con los ratones de tipo silvestre. La IL-10, la IL-17a y el TNF-a también se elevaron, aunque en menor medida. No se observaron cambios en los niveles de IL-1p, IL-2 o iL-4, y aunque hubo un aumento de IL-6 en algunos ratones C9orf72-/- en comparación con el tipo silvestre, esta diferencia no alcanzó significación. Los niveles de la quimocina MCP-1 aumentaron significativamente en hembras, pero no en ratones machos C9orf72-/- (Figuras 3AE y 3AF), e IFN-y aumentó significativamente en los machos y algunas hembras demostraron un ligero aumento (Figuras 3AE y 3AF). Por lo tanto, el aumento general de los niveles de citocinas proinflamatorias se observó tan temprano como a las 8 semanas en ratones C9orf72-/- con significación variable en comparación con los ratones de tipo silvestre.
Como se muestra en las Figuras 3AG-3AK, los ratones C9orf72-/- en envejecimiento desarrollan una mayor gravedad de la glomerulonefritis. Este resultado se confirmó en la tinción de H-E e IHC con F4/80 en hígado y riñón (Figura 3AK). Por ejemplo, el aumento de la tinción F4/80 por IHC en hígado C9orf72-/- de 8 semanas de edad demostró una mayor infiltración de macrófagos, mientras que se observó una gran infiltración de células macrófagos F4/80+ en el riñón de ratones hembras de 38 semanas de edad (Figura 3AK). El aumento del nitrógeno ureico en sangre por la química sérica se correlacionó con la enfermedad renal en ratones C9orf72--, mientras que el aumento en el contenido de globulina sérica indicó una condición inflamatoria. El nitrógeno ureico en sangre normal en ratones varía de 8-33 mg/dl, mientras que los niveles de globulina varían normalmente de 1-4 g/dl (ver, por ejemplo, Zaias, J. y otros, 2009, J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 48(4):387-390).
Un análisis posterior de los riñones reveló células mononucleares grandes F4/80+ que tenían características de células dendríticas presentes en grandes cantidades orientadas alrededor de los glomérulos de ratones C9orf72-/- de 35-41 semanas de edad (Figura 3AK). Se observaron grados leves a moderados de glomerulonefritis en riñones de ratones C9orf72-/- de 35-60 semanas de edad mediante tinción con H-E (Figura 3AK). En los animales más gravemente afectados, los glomérulos estaban agrandados, hipercelulares y mostraban proliferación mesangeal e infiltración leucocítica. La manifestación de la enfermedad inmunomediada fue diversa con el engrosamiento observado de las paredes capilares y la proliferación del epitelio parietal en algunos glomérulos, mientras que otros mostraron expansión del mesangio con un material hialino eosinofílico acelular, consistente con glomeruloesclerosis y un grado variable de fibrosis periglomerular. Curiosamente, estas áreas no resultaron positivas para la deposición amiloidetras la tinción con rojo Congo. Los cambios tubulares incluyeron dilatación tubular cortical y medular y la presencia de cilindros proteicos hialinos y basofilia tubular con degeneración/regeneración. Dichos cambios no se observaron en ratones de tipo silvestre. Un panel de química sérica que reveló niveles elevados de nitrógeno ureico en sangre (por ejemplo, Figura 3AG) y disminución de la albúmina sérica fue consistente con una filtración glomerular alterada que se correlacionó con los hallazgos histológicos renales en ratones C9orf72-/- en comparación con los ratones de tipo silvestre.
Para medir más profundamente la gravedad de la enfermedad renal observada en ratones anulados, las secciones de riñón teñidas con H-E se puntuaron a ciegas para determinar glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, formación de cilindros hialinos, glomeruloesclerosis y túbulos basófilos; categorías de enfermedad renal asociadas con glomerulonefropatía mediada por el sistema inmunitario. Como se muestra en la Figura 9A, los gráficos ponderados de los resultados de la puntuación histopatológica demuestran que los cambios renales más significativos observados en ratones anulados se asocian con la glomerulonefritis membranoproliferativa. Las puntuaciones individuales de histopatología se representan (Figura 9B) para mostrar que todos los ratones anulados muestran glomerulonefritis membranoproliferativa mínima a severa con evidencia ocasional de categorías de enfermedades adicionales en animales más gravemente afectados. Puntuación de 0=ninguno, 1=mínimo, 2=leve, 3=moderado y 4=severo. Las mediciones de ACR en orina analizadas en los puntos de tiempo de 14 semanas (Figura 9C, arriba) y 24 semanas (Figura 9C, abajo) de la misma cohorte de ratones indican la aparición de albuminuria en ratones C9orf72-/- con la edad. Los ratones heterocigotos mostraron valores comparables a los WT consistentes con la ausencia de un fenotipo observado.
Además, los ratones C9orf72-/- demostraron niveles aumentados de autoanticuerpos IgG e IgM totales por ELISA en comparación con los ratones de tipo silvestre, lo que indicó una enfermedad autoinmunitaria (Figura 3AI) y corresponde a niveles aumentados de globulina en suero observados por la química sérica (Figura 3AG, panel superior). Además, el ELISA en suero de los ratones C9orf72r/- indicó niveles significativamente elevados de anticuerpos de ADN bicatenario (ADNbc), anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos anti-Smith (anti-Sm) y anticuerpos anti-cardiolipina circulantes en comparación con los ratones de tipo silvestre. Los ANA son autoanticuerpos que se unen al contenido del núcleo celular. Los anticuerpos anti-ADNbc son un tipo de anticuerpo ANA que se une específicamente al ADN bicatenario y los anticuerpos anti-cardiolipina se dirigen contra los componentes fosfolípidos de la membrana mitocondrial.
Además, los ratones C9orf72r/- demostraron un aumento significativo en los anticuerpos contra el factor reumatoide (RF) circulantes a las 8 semanas de edad (Figura 3AH). El aumento en el contenido de globulina sérica y autoanticuerpos puede indicar una cualquiera de diversas enfermedades y afecciones, por ejemplo, trastorno de la médula ósea, enfermedad autoinmunitaria, afección(es) inflamatoria(s) crónica(s), enfermedad hepática, enfermedad renal, infecciones, etcétera. Para dar solo un ejemplo, el lupus eritematoso sistémico (SLE) se caracteriza por altos títulos de autoanticuerpos contra muchas membranas celulares y antígenos intracelulares. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Sm, que se dirigen contra unidades centrales de ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPpn), son un marcador específico para el SLE.
El aumento de los títulos de autoanticuerpos en pacientes con lupus se correlaciona positivamente con una mayor frecuencia de células T foliculares auxiliares circulantes (Tfh) (Xu, H. y otros, Cell Immunol 295, 46-51 (2015)). La examinación de esta población celular específica (CD4 CXCR5 CD44 ICOS PD-1 Bcl-6 ) en bazo, ganglios linfáticos cervicales, ganglios linfáticos mesentéricos y sangre por análisis FACS reveló un aumento significativo de las poblaciones de células Tfh en tejidos C9orf72-/- en comparación con los controles (Figura 10). Además, se observaron células Tfh elevadas en médula ósea C9orf72-/- que no alcanzó significación (Figura 10). Colectivamente, estas observaciones respaldan la noción de que se produce una respuesta inmunitaria similar al SLE humano en ausencia de expresión de C9orf72.
Las expansiones en células plasmáticas y las células B/plasmablastos en transición pueden asociarse con neoplasias específicas, tales como mieloma múltiple y plasmacitoma, así como también con afecciones autoinmunitarias. El bazo y el ganglio linfático de ratones C9orf72-/- se agrandaron y un infiltrado inmunitario fue notablemente obvio, sin embargo, las células infiltrantes fueron negativas para los marcadores de células B (CD45R) y fueron F4/80+ con características de macrófagos espumosos. Si bien la población de estas células era grande, ocupaban áreas regionales de estos tejidos considerados apropiados para el linaje, y no destruían la arquitectura básica de estos tejidos. Además, el índice mitótico era bajo, con solo escasas mitosis observadas. Por lo tanto, la neoplasia parecía poco probable. Existió, sin embargo, una población de células plasmáticas y células Mott ocasionales presentes en estos tejidos, y evidencia de glomerulonefritis, lo que indicó autoinmunidad en ratones C9orf72rl~. Como se muestra anteriormente, los títulos anti-RF de tipo IgG e IgM se elevaron significativamente en ratones C9orf72rl~ en comparación con el tipo silvestre y ratones C9orf72+l~ (heterocigotos) (Figura 3AH). Además, los niveles séricos totales de IgG e IgM se elevaron significativamente en ratones C9orf72rl~ a partir de las 8 semanas de edad (Figuras 3AG y 3AI) lo que fue consistente con los paneles de química sérica que mostraban globulina elevada en ratones C9orf72-l~.
Se ha informado que los autoanticuerpos contra la membrana basal glomerular, o la deposición de complejos inmunitarios solubles dentro de los capilares glomerulares, seguido por fijación del complemento e inflamación, provocan enfermedad renal (glomerulonefritis inmunomediada). Para determinar si el aumento observado en los niveles de inmunoglobulina total y autoanticuerpos contribuía a la glomerulonefritis, se realizó IHC en cortes de riñón de ratones C9orf72-l~ y de tipo silvestre de 8-63 semanas de edad para IgG e IgM totales (Figura 3AL). Como se describe en la presente descripción, los ratones C9orf72-l~ demuestran una clara evidencia de glomerulonefritis tanto a nivel sérico como histológico. En particular, los riñones de los ratones C9orf72-l~ demostraron un aumento de la inmunotinción de IgG en comparación con los ratones de tipo silvestre en todos los puntos de tiempo examinados. Además, a las 8 semanas, los riñones C9orf72rl~ mostraron una señal por IHC difusa e intensa en la vasculatura y el epitelio tubular de la médula y la corteza. Correlacionado con el inicio de la patología de la glomerulonefritis, se observó un marcado aumento en la tinción glomerular de IgG e IgM a las 38 semanas. La tinción para IgG e IgM también se asoció con frecuencia con la capa parietal de la cápsula de Bowman. Se observó ocasionalmente tinción para IgG en el espacio urinario ylo dentro de lostúbulos renales proximales, lo que indica una función de filtración glomerular alterada (es decir, una filtración que excede la capacidad de resorción). La tinción intensa con IgG estaba presente en las células epiteliales de los túbulos en animales con enfermedad grave, consistente con la reabsorción de IgG abundante. Se observó una tinción similar pero menos intensa para IgM con menos frecuencia. La tinción en los glomérulos escleróticos disminuyó en comparación con el tipo silvestre, lo que fue consistente con el flujo sanguíneo deteriorado a estas unidades (es decir, los bucles vasculares se habían reemplazado por matriz o células mesangeales). Sin embargo, los glomérulos que mantuvieron los bucles vasculares claros tendieron a aumentar la IgG en comparación con el tipo silvestre. Los depósitos granulares finos ylo la tinción lineal de IgG e IgM asociados con las membranas vasculares se observaron con frecuencia con gran aumento y sugieren un depósito de inmunocomplejos.
El depósito del factor C3 del complemento se asocia comúnmente con depósitos de inmunoglobulina en las membranas basales del riñón. La IHC para el factor C3 del complemento reveló un aumento de la tinción en mechones glomerulares de ratones C9orf72-l~ en comparación con el tipo silvestre (Figura 3AL). La tinción granular y lineal fue más prominente en las membranas de la capa visceral de la cápsula glomerular, lo que delineó prominentemente los bucles capilares y los podocitos.
Datos de firma genética a partir de perfiles moleculares en bazo y ganglios linfáticos cervicales (ratones de tipo silvestre y C9orf72rl~ de 8-10 y 35 semanas) indicaron infiltración de poblaciones celulares de macrófagos, monocitos y granulocitos. Además, se observó el agotamiento de las células T y B, lo que puede reflejar el aumento en la proporción de células mieloides presentes. Los análisis jerárquicos globales separaron principalmente las muestras de cerebro por género y edad, en lugar de por genotipo, lo que indica que las diferencias de perfil en este tejido se debieron a la biología básica de las muestras y el genotipo. Solamente la expresión de C9orf72 fue consistentemente diferente en el tejido cerebral de todas las edades y géneros. Por el contrario, las muestras de bazo y ganglios linfáticos se agruparon según el genotipo, con la edad y el sexo solo secundarios, lo que indicó que las diferencias de transcriptoma en estos órganos fueron el resultado de cambios en la expresión de C9orf72. Además, más de 100 loci asociados con la función inmunitaria demostraron diferencias de expresión significativas en ratones C9orf72rl~ en comparación con el tipo silvestre para machos y hembras en los puntos de tiempo temprano y tardío. Las firmas genéticas de bazo y ganglios linfáticos en los ratones C9orf72~l~ indicaron infiltración mieloide con una disminución simultánea en la huella linfocítica, consistente con los datos de CBC (ver anteriormente) que demuestran recuentos de leucocitos totales comparables entre cepas debido a un equilibrio entre las células mieloides elevadas y la disminución de linfocitos. En una comparación de los bioconjuntos, las coincidencias de perfil más fuertes fueron a firmas de respuesta inmunitaria, modelos de ratones de diversas afecciones inflamatorias y enfermedades infecciosas humanas. Como se muestra en este ejemplo, los datos de inmunofenotipaje demostraron que los ratones que tienen una interrupción en un locus C9Orf72 (C9orf72rl~) desarrollan esplenomegalia y linfadenopatía a las 8 semanas de edad. En particular, los datos de CBC mostraron un aumento en monocitos, neutrófilos y eosinófilos circulantes en ratones C9orf72rl~, así como también disminución de linfocitos en la sangre a partir de las 8 semanas. Además, los ganglios linfáticos cervicales aumentan progresivamente con la edad en ratones machos (58 semanas) y hembras (37 semanas) C9orf72rl~. Este ejemplo demuestra específicamente, además, que los ratones C9orf72~l~ desarrollan glomerulonefritis (es decir, infiltración de macrófagos F4l80+ en el riñón) y enfermedad autoinmunitaria (es decir, niveles elevados significativos de autoanticuerpos IgM e IgG) a medida que envejecen. Por lo tanto, este ejemplo describe específicamente que los roedores que tienen una interrupción en un locus C9orf72 como se describe en el Ejemplo 1 demuestran anomalías detectables en la periferia y la circulación tan pronto como a las 8 semanas de edad. En particular, la ablación de C9orf72 conduce a una respuesta inmunitaria sistémica crónica que produce citocinas inflamatorias elevadas y expansión mieloide en varios compartimentos.
Ejemplo 4. Administración de neurotoxinas a animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9orf72 Este experimento demuestra que la administración de diversas toxinas a animales no humanos descritos en la presente descripción puede exacerbar aspectos del fenotipo similar a la ALS observado. En particular, este ejemplo demuestra específicamente que la administración de diversas toxinas a ratones C9orf72~l~ exacerba levemente el fenotipo motor similar a la ALS y aumenta el estrés oxidativo en las neuronas motoras, pero no afecta el aumento de la inactividad y las anomalías de la marcha en estos ratones. Este ejemplo demuestra, además, que las neuronas motoras de los ratones C9orf72-l~ desarrollan disfunción mitocondrial significativa.
Brevemente, las células madre embrionarias de ratón se cultivan y diferencian en neuronas motoras, durante un período de ocho días. El primer día, las células madre embrionarias de ratón previamente congeladas se descongelan y se añaden a un tubo falcon de 15 ml con cinco ml de medio de células madre embrionarias (medio ES: DMEM con 15 % de FBS, 1 % de pen.lestrp., 1 % de glutamina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de nucleósidos, 0,1 % de p-mercaptoetanol, 1 % de piruvato de sodio y LIF a 10000 unidadeslml). A continuación, el tubo se centrifuga durante cinco minutos a 800 rpm. El sobrenadante se aspira y las células se suspenden en 10 ml de medio ES. Después, las células se colocan en un matraz T75 que se recubre con 10 ml de gelatina al 0,1 % y se incuba durante 30 minutos a 37 °C para facilitar la unión al fondo del matraz. A continuación, las células se incuban durante la noche. Al día siguiente, el medio se intercambia con medio fresco para sobrevivir.
Al día siguiente, el medio se aspira del matraz. El matraz se lava con 10 ml de PBS y después se añaden 5 ml de tripsina para separar las células del fondo del matraz. Las células se incuban durante cinco minutos a 37 °C. El desprendimiento se confirma mediante la comprobación del matraz con un microscopio. Se añade al matraz medio de diferenciación (10 ml de medio DFNK: 44 % de DMEMIF12 avanzado, 44 % de neurobasal, 1 % de pen.lestrp., 1 % de glutamina, 0,1 % de p-mercaptoetanol, 10 % de reemplazo de suero con genes anulados) para detener la reacción con tripsina. La solución del matraz se recolecta en un tubo falcon y se centrifuga durante cinco minutos a 800 rpm. Se aspira el sobrenadante y las células se suspenden en 12 ml de medio DFNK. A continuación, las células se colocan en placas de cultivo celular y se ponen en una incubadora durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, la solución con las células se transfiere a un tubo falcon y se centrifuga durante dos minutos a 500 rpm. Se aspira el sobrenadante y las células se suspenden en 12 ml de medio DFNK. A continuación, las células se colocan en placas de cultivo celular nuevo y se ponen en una incubadora durante la noche. Al día siguiente, se recolecta el medio del plato y se transfiere a un tubo falcon. Después el tubo se centrifuga durante dos minutos a 500 rpm y a continuación se aspira el sobrenadante. Las células se suspenden en 36 ml de medio DFNK, con ácido retinoico a 1 pM y antagonista suavizado a una concentración final de 0,25 pM, para la diferenciación de neuronas motoras. El medio se divide en 12 ml por plato en los tres platos.
Después de tres días, los cuerpos embrioides (EB) que se forman se disocian. Primero, los EB se recolectan y se transfieren a un tubo falcon. Después se centrifugan las células durante dos minutos a 500 rpm y se aspira el sobrenadante. Las células se lavan después con 4 ml de PBS-glucosa. A continuación, se añaden 4 ml de tripsina a las células para la disociación química y se incuban durante cinco minutos. A continuación, se añade 1 ml de suero de caballo para detener la reacción con tripsina. Los EB se asientan durante cinco minutos y se aspira el sobrenadante. Se añaden 2 ml de PBS-glucosa-ADNasa y las células se disocian mecánicamente diez veces. Las células se asientan durante 5 minutos y las células disociadas se transfieren a un tubo separado. Se añaden 2 ml de PBS-glucosa-ADNasa a las células no disociadas y se repite la disociación mecánica. Las células se asientan durante cinco minutos y después las células disociadas se transfieren a un tubo separado. Las células disociadas se centrifugan durante cinco minutos a 800 rpm y después se aspira el sobrenadante. Las células disociadas se suspenden en 5 ml de medio de neuronas motoras de células madre embrionarias (medio ESMN: neurobasal, 2 % de B27, 2 % de suero de caballo, 1 % de pen.lestrp., 0,25 % de glutamina, 0,01 % de p-mercaptoetanol, BDNF 10 nglml, CNTF 10 nglml, GDNF 10 nglml). Las células se centrifugan durante cinco minutos a 800 rpm. Se aspira el sobrenadante y las células se suspenden en medio ESMN. Después, se cuentan las células mediante el uso de un contador automático de células Countess (Life Technologies) y se colocan en placa de 0,5 a 1 millón de células con 2 ml de medio ESMN por pocillo en cada placa de seis pocillos. Las células permanecen ya sea en ESMN (control) o ESMN con BMAAa concentraciones de 0,1-100 pM. Los recuentos de células se tomaron mediante el uso de azul tripán al 0,4 % mediante el uso de un ajuste de diámetro celular promedio de >20 pm (neuronas motoras). En la Figura 4 se exponen resultados ilustrativos.
En otro experimento, a los ratones de tipo silvestre se les administraron inyecciones i.p. semanales de BMAA (500 mglkg) o PBS (control) durante seis semanas a partir de la semana 1 (Figura 5A, arriba). Las mediciones de peso corporal se registraron cada semana hasta las 6 semanas, en la semana 14 y en la semana 18. El análisis del deterioro motor a través de rotarod, locomoción en campo abierto y pruebas de pasarela (como se describió anteriormente) se registraron al comienzo del experimento (semana 0, 10 semanas de edad), cada dos semanas hasta 6 semanas, en la semana 14 y en la semana 18. En las Figura 5A-5D se exponen resultados ilustrativos.
Para ratones de tipo silvestre, los datos demostraron que BMAA mata neuronas motoras de tipo silvestre cultivadas de una manera dependiente de la dosis a través de la vía mediada por el receptor AMPAlkainita. Además, las inyecciones semanales (i.p.) de BMAA no indujeron un fenotipo similar a la ALS en ratones de tipo silvestre (Figuras 5A-5D). Se observaron resultados similares al usar 100 mglkg de BMAA.
En otro experimento, a ratones de tipo silvestre y C9orf72-l~ envejecidos (es decir, 32 semanas) se les administraron inyecciones i.p. semanales de BMAA (500 mglkg) o PBS (control) durante seis semanas. Las mediciones de peso corporal se registraron cada semana hasta 38 semanas a partir del día cero (es decir, 32 semanas). El análisis del deterioro motor a través de pruebas de rotarod, locomoción en campo abierto y de pasarela (como se describió anteriormente) también se registraron al comienzo del experimento (semana 0, 10 semanas de edad) y cada dos semanas hasta 38 semanas. La Tabla 6 expone la metodología de puntuación relacionada con el deterioro motor, el temblor y la rigidez de los animales durante las pruebas. En las Figuras 6A-6E se exponen resultados ilustrativos. Los datos demostraron que la administración de BMAA a ratones C9orf72rl~ exacerba levemente el fenotipo motor similar a la ALS, pero no afecta el aumento de la inactividad y las anomalías de la marcha de estos ratones.
En otro experimento, las neuronas motoras de ratones C9orf72rl~ se cultivaron como se describió anteriormente (ver también la Figura 7) y se trataron con oligonucleótidos antisentido que se dirigen selectivamente a los ARN que contienen repeticiones de cadena sentido y reducen los focos de ARN orientado en sentido sin afectar la expresión general de c9orf72. El tratamiento se siguió por la adición de BMAA 100 mM. La supervivencia y el estrés oxidativo de las neuronas motoras cultivadas se midieron en los días 1 y 7. Brevemente, se evaluó el estrés oxidativo de las neuronas motoras derivadas de células madre embrionarias colocadas en placa (descritas anteriormente) mediante la medición de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células mediante el uso del reactivo CellROX Oxidative Stress Green de Life Technologies a una concentración final de 5 pM e incubación durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se midió la fluorescencia mediante el uso de una fluorometría de microplaca estándar. En la Figura 7 se exponen resultados ilustrativos. Los datos demostraron que la exposición de las neuronas motoras C9orf72rl~ a BMAA aumenta el estrés oxidativo.
En otro experimento, la función mitocondrial se determinó en ratones de tipo silvestre y C9orf72rl~. Brevemente, la proporción de ADN mitocondrial con respecto a nuclear de neuronas motoras derivadas de células madre embrionarias (descrita anteriormente) se midió por aislamiento de ADN mediante el uso del reactivo ADNzol (Invitrogen). La pureza y la cantidad de ADN se evaluaron mediante el uso del espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) y el kit de relación mitocondrial con respecto a nuclear de ratón NovaQUANT (Novagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El analizador Seahorse Bioscience XFe96 se usó para evaluar la respiración mitocondrial de las neuronas motoras derivadas de células madre embrionarias. El por ciento de la tasa de consumo de oxígeno para la primera medición de ratones de tipo silvestre se registró para 12 mediciones mediante el uso del analizador de flujo extracelular XFe96. La media de las primeras tres mediciones representó la respiración basal, las siguientes tres después de la adición de oligomicina (1 pM) representaron la fuga de protones, la diferencia entre la respiración basal y la fuga de protones representó la producción de ATP, las siguientes tres mediciones después de la adición de FCCP (1 pM) representaron la respiración máxima, la diferencia entre la respiración máxima y la respiración basal representaron la capacidad respiratoria de reserva y las tres últimas después de la adición de rotenonalantimicina A (0,5 pM) representaron la respiración no mitocondrial. Todos los datos se recolectaron de al menos tres experimentos independientes y se informan como media ± SEM. La prueba t de Student se realizó para el análisis estadístico al comparar valores de ratones de tipo silvestre con ratones C9orf72-l~ con * para P < 0,05, ** para P < 0,01 y *** para P < 0,001. En la Figura 8 se exponen resultados ilustrativos.
Informes anteriores han demostrado que el agotamiento de ATP produce acumulación intracelular de Na+, lo que conduce a hipertrofia celular patológica (Liang D. y otros, 2007, Neurosurg. Focus 22(5):E2). Como se muestra en la Figura 8, el uso de neuronas motoras diferenciadas a partir de células madre de ratones de tipo silvestre y C9orf72rl~ (descritos anteriormente; ver también Wichterle H. y otros, 2002, Cell 110(3):385-97), los ratones C9orf72rl~ demostraron una falla en la bomba de Na-K ATPasa debido a la falta de ATP ylo el compromiso de la membrana celular. Por el contrario, no se observaron diferencias en la supervivencia y el estrés oxidativo en las neuronas de tipo silvestre o C9orf72-l~ (Figura 8, arriba). Curiosamente, se observó una mayor cantidad de ADN mitocondrial con respecto al nuclear en las neuronas motoras de ratones C9orf72rl~ (Figura 8, arriba a la derecha), así como también una tasa de respiración mitocondrial significativamente más baja (P < 0,0001) en comparación con las neuronas motoras de tipo silvestre (Figura 8, abajo a la izquierda). Además, la respiración basal, la producción de ATP, la respiración máxima, la fuga de protones y la capacidad respiratoria de reserva fueron significativamente menores en neuronas motoras C9orf72-l~ en comparación con las de tipo silvestre (Figura 8, abajo a la derecha). Por lo tanto, las neuronas motoras de los ratones C9orf72-l~ demuestran una disfunción mitocondrial significativa que probablemente conduce a daño celular e hipertrofia.
El presente ejemplo demuestra específicamente que los ratones C9orf72-l~ muestran déficits motores similares a la ALS. Además, este ejemplo resalta que mientras BMAA mata las neuronas motoras en una vía de excitotoxicidad de glutamato mediada por AMPAkainato, la exposición a BMAA no es suficiente para inducir la enfermedad in vivo. Además, la exposición a BMAA solo exacerba levemente el fenotipo de la enfermedad de ALS en ratones C9orf72rl~. Por lo tanto, los datos presentados en la presente descripción sugieren que, al menos en algunas modalidades, la pérdida de la proteína C9orf72 en ratones C9orf72-l~ no es el mecanismo prominente de la enfermedad ALS-FTD.
Tomados en conjunto, la presente descripción demuestra específicamente que los ratones C9orf72rl~ creados de acuerdo con el Ejemplo 1 demuestran la ablación completa del locus C9orf72. Además, como se describe en la presente descripción, los ratones C9orf72-l~ desarrollan varios fenotipos distintos a lo largo del desarrollo caracterizados por, por ejemplo, déficits motores significativos y una interrupción en el sistema inmunitario y la función mitocondrial. Por ejemplo, los ratones C9orf72rl~ desarrollan un fenotipo autoinmunitario caracterizado por un aumento significativo en la concentración de autoanticuerpos en suero y la infiltración de diversas células inmunitarias en el bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea, los riñones y la sangre. Curiosamente, los datos de inmunofenotipado descritos en la presente descripción ilustran que el producto génico C9orf72 desempeña un papel fundamental en la homeostasis del sistema

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un roedor que comprende en su genoma una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno, en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y/o (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas.
  2. 2. El roedor de conformidad con la reivindicación 1, en donde el locus C9orf72 comprende un gen indicador.
  3. 3. El roedor de conformidad con la reivindicación 2, en donde el gen indicador se une operativamente a un promotor de C9orf72, en donde opcionalmente el promotor de C9orf72 es un promotor endógeno.
  4. 4. El roedor de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el gen indicador se une operativamente al exón 1 del locus C9orf72.
  5. 5. El roedor de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el gen indicador se selecciona del grupo que consiste en lacZ, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), GFP mejorada (eGFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente azul mejorada (eBFP), DsRed y MmGFP.
  6. 6. El roedor de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es una rata o un ratón.
  7. 7. El roedor de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y/o demencia frontotemporal (FTD) durante el desarrollo, opcionalmente después de aproximadamente 36 semanas de edad o después de aproximadamente 40 semanas de edad.
  8. 8. El roedor de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor desarrolla déficits motores progresivos después de aproximadamente 36 semanas de edad, desarrolla una patología de las neuronas motoras inferiores después de aproximadamente 40 semanas de edad, y/o desarrolla una disminución en el peso corporal después de aproximadamente 36 semanas de edad.
  9. 9. El roedor de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor desarrolla uno o más de las siguientes:
    (i) disfunción mitocondrial en neuronas motoras, en donde la disfunción mitocondrial se caracteriza por una disminución en uno o más de respiración mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, capacidad respiratoria de reserva, producción de ATP y fuga de protones; o caracterizada por un aumento en la relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear en comparación con la relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear de las neuronas motoras de un roedor control o de referencia;
    (ii) uno o más síntomas de glomerulonefritis, opcionalmente después de aproximadamente 35 semanas de edad o después de aproximadamente 35-41 semanas de edad inclusive;
    (iii) esplenomegalia después de aproximadamente 8 semanas de edad;
    (iv) linfadenopatía después de aproximadamente 8 semanas de edad, en donde opcionalmente la linfadenopatía es palpable después de aproximadamente 12-18 semanas de edad inclusive;
    (v) una infiltración de uno o más macrófagos, monocitos y granulocitos en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales, la médula ósea y/o la sangre; y/o una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón y/o el hígado, en donde opcionalmente la infiltración es detectable después de aproximadamente 8 semanas de edad y hasta 60 semanas de edad;
    (vi) una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón después de aproximadamente 35 semanas de edad;
    (vii) un mayor nivel de citocinas en suero de una o más de IL-10, IL-12, IL-17, IFN-g, TNF-a y MCP-1 después de aproximadamente 8 semanas de edad;
    (viii) un nivel sérico aumentado de IL-12 después de aproximadamente 8 semanas de edad que es aproximadamente 6 veces o más en comparación con un animal no humano de referencia o control;
    (ix) enfermedad renal caracterizada por una membrana basal engrosada, formación de cilindros, deposición del complejo inmunitario, glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, glomeruloesclerosis, túbulos basófilos, o combinaciones de estos, después de aproximadamente 28-35 semanas de edad, inclusive;
    (x) un aumento de la población de células dendríticas mieloides en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñones y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, en donde opcionalmente la población de células dendríticas mieloides se caracteriza como CD45+CD11b+CD11c+MHCII+;
    (xi) un nivel sérico aumentado de uno o más autoanticuerpos después de aproximadamente 8 semanas de edad, en donde opcionalmente se seleccionan uno o más autoanticuerpos entre anticuerpos anti-factor reumatoide (anti-RF), anticuerpos anti-ADNbc, anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos anti-Smith (anti-Sm), anticuerpos anticardiolipina y combinaciones de estos;
    (xii) un nivel aumentado de macrófagos F4/80+ en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, en donde opcionalmente los macrófagos F4/80+ se caracterizan como CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-;
    (xiii) un aumento de la población de células T en uno o más de bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñones y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, en donde opcionalmente la población de células T se caracteriza como CD8+CD44+, CD8+CD69+, CD8+PD1+, CD4+CD44+, CD4+CD69+ o CD4+PD1+; (xiv) un aumento de la población de células T reguladoras en el bazo y/o ganglios linfáticos después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, y en donde la población de células T reguladoras se caracteriza como CD4+FoxP3+; o un aumento de las células T foliculares auxiliares (Tfh) en el bazo, los ganglios linfáticos y/o la sangre después de aproximadamente 26 semanas de edad, y en donde la población de células Tfh se caracteriza como CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+;
    (xv) un aumento de la población de células plasmáticas en uno o más de bazo, ganglios linfáticos y médula ósea después de aproximadamente 8-60 semanas inclusive, en donde opcionalmente la población de células plasmáticas se caracteriza como CD45+CD19-B220-CD138+ o CD45+CD19intB220intCD138+;
    (xvi) síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS); o
    (xvii) nefritis lúpica.
  10. 10. Una célula o tejido de roedor aislado cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno.
  11. 11. Una línea celular inmortalizada creada a partir de la célula de roedor aislada de conformidad con la reivindicación 10.
  12. 12. Una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno.
  13. 13. Un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de conformidad con la reivindicación 12.
  14. 14. Un método para crear un roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 de un locus C9orf72 endógeno, el método comprende:
    modificar el genoma de un roedor para que comprenda la deleción de la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 del locus C9orf72 endógeno, lo que crea de esta manera dicho roedor, en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la modificación se logra mediante un proceso que comprende:
    (a) introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula madre embrionaria de roedor para que la porción codificante del exón 2 hasta la porción codificante del exón 11 del locus C9orf72 endógeno se elimina, cuya secuencia de ácido nucleico comprende un polinucleótido que es homólogo al locus C9orf72;
    (b) obtener una célula madre embrionaria de roedor modificada genéticamente a partir de (a); y
    (c) crear un roedor mediante el uso de la célula madre embrionaria de roedor modificada genéticamente de (b), en donde opcionalmente la secuencia de ácido nucleico comprende uno o más marcadores de selección y en donde opcionalmente la secuencia de ácido nucleico comprende uno o más sitios de recombinación específica de sitio.
  16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa y un marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa, cuyos sitios de reconocimiento de recombinasa se orientan para dirigir una escisión, en donde opcionalmente la secuencia de ácido nucleico comprende además un gen indicador que está opcionalmente aguas abajo del marcador de selección, en donde opcionalmente el gen recombinasa se une operativamente a un promotor que impulsa la expresión del gen de recombinasa en células diferenciadas y no impulsa la expresión del gen recombinasa en células indiferenciadas.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el gen de recombinasa se une operativamente a un promotor que es transcripcionalmente competente y regulado por el desarrollo, en donde opcionalmente el promotor es o comprende la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el locus C9orf72 comprende un gen indicador, en donde opcionalmente el gen indicador se une operativamente aun promotor de C9orf72, y en donde opcionalmente el promotor de C9orf72 es un promotor endógeno.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, el gen indicador se une operativamente al exón 1 del locus C9orf72.
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, en donde el gen indicador se selecciona del grupo que consiste en lacZ, luciferasa, GFP, eGFP, CFP, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed y MmGFP.
  21. 21. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14-20, en donde el roedor es un ratón o una rata.
  22. 22. Un método para identificar un candidato terapéutico para el tratamiento de uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas en un roedor, el método comprende
    (a) administrar un agente candidato a un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; (b) realizar uno o más ensayos para determinar si el agente candidato tiene un efecto sobre uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas; e
    (c) identificar el agente candidato que tiene un efecto sobre uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas como el candidato terapéutico.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde el uno o más síntomas de (i) desregulación o disfunción del sistema inmunitario y (ii) anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en enfermedades de las neuronas motoras humanas se seleccionan del grupo que consiste en una enfermedad o afección neurodegenerativa, una enfermedad o afección inflamatoria, una enfermedad o afección autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico (SLE), síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS) y nefritis lúpica opcionalmente en donde ALPS se caracteriza por un nivel sérico aumentado de IL-10, anticuerpos anti-factor reumatoide (anti-RF), anticuerpos antinucleares (ANA) o combinaciones de estos; en donde la nefritis lúpica se caracteriza por proliferación y/o expansión mesangeal, o por una o más anomalías tubulares y en donde opcionalmente la enfermedad o afección neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ALS) o demencia frontotemporal (FTD), en donde la enfermedad o afección inflamatoria es glomerulonefritis, o en donde la enfermedad o afección autoinmunitaria es la glomerulonefritis.
ES16731693T 2015-05-29 2016-05-26 Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72 Active ES2784360T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562168171P 2015-05-29 2015-05-29
US201562232658P 2015-09-25 2015-09-25
US201562245382P 2015-10-23 2015-10-23
PCT/US2016/034304 WO2016196185A1 (en) 2015-05-29 2016-05-26 Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2784360T3 true ES2784360T3 (es) 2020-09-24

Family

ID=56194557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16731693T Active ES2784360T3 (es) 2015-05-29 2016-05-26 Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72

Country Status (15)

Country Link
US (2) US10285388B2 (es)
EP (2) EP3302048B1 (es)
JP (3) JP6619822B2 (es)
KR (2) KR102190661B1 (es)
CN (1) CN107920498A (es)
AU (2) AU2016270587B2 (es)
BR (1) BR112017025507A2 (es)
CA (1) CA2986048C (es)
ES (1) ES2784360T3 (es)
HK (1) HK1248465A1 (es)
IL (2) IL255385A0 (es)
MX (1) MX2017015369A (es)
RU (2) RU2725737C2 (es)
SG (1) SG10201911257YA (es)
WO (1) WO2016196185A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018007840A (es) * 2015-12-23 2019-05-02 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica y/o la degeneracion lobar frontotemporal.
JP7026678B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２座位中にヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する非ヒト動物
AU2017394032B8 (en) 2017-01-21 2020-10-22 Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co., Ltd. Use of paeoniflorin-6'-o-benzenesulfonate in treatment of sjögren's syndrome
CN107693542B (zh) * 2017-09-05 2020-03-10 中山大学附属第三医院 一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用
CN109452229B (zh) * 2018-11-19 2021-10-22 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 狗源化pd-1基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2020131632A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
CN113046390B (zh) * 2020-03-09 2024-01-09 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Csf1r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
WO1999005266A2 (en) 1997-07-26 1999-02-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
SI1802193T1 (sl) 2004-10-19 2014-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopek za generiranje miši, homozigotne za genetsko modifikacijo
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
JP2008307007A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
DK3064599T3 (en) 2008-02-15 2019-04-08 Synthetic Genomics Inc METHODS IN VITRO FOR COMBINING AND COMBINATORY CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES
US8470594B2 (en) * 2008-04-15 2013-06-25 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying agents that affect the survival of motor neurons
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
WO2011020005A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. miRNA-REGULATED DIFFERENTIATION-DEPENDENT SELF-DELETING CASSETTE
KR20120050485A (ko) 2009-08-14 2012-05-18 레비비코르 인코포레이션 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지
EP3202914B2 (en) * 2011-08-31 2023-06-28 The University of Manchester Method for treating a neurodegenerative disease
WO2013041577A1 (en) * 2011-09-20 2013-03-28 Vib Vzw Methods for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration
DK2847335T3 (en) 2012-04-25 2018-08-13 Regeneron Pharma NUCLEASED MEDIUM TARGETING WITH LARGE TARGET VECTORS
EP2906697A4 (en) 2012-10-15 2016-06-22 Ionis Pharmaceuticals Inc METHODS OF MONITORING C9ORF72 EXPRESSION
FI2906696T4 (fi) 2012-10-15 2023-03-18 Menetelmiä c9orf72:n ilmentymisen moduloimiseksi
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3561050B1 (en) 2013-02-20 2021-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
ES2888250T3 (es) 2013-04-16 2022-01-03 Regeneron Pharma Modificación direccionada del genoma de rata
KR102251168B1 (ko) 2013-10-25 2021-05-13 셀렉티스 고 반복 모티프를 포함하는 dna 서열에 대한 효율적이고 특이적인 표적화를 위한 희소-절단 엔도뉴클레아제의 설계
AU2014362248A1 (en) 2013-12-12 2016-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders
EP3750907A3 (en) 2014-03-18 2021-04-28 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
CA2953499C (en) 2014-06-23 2023-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
HUE041584T2 (hu) 2014-06-26 2019-05-28 Regeneron Pharma Célzott genetikai módosítások és alkalmazási módszerek és készítmények
AU2015349692B2 (en) 2014-11-21 2021-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide RNAs
KR102313073B1 (ko) 2014-12-05 2021-10-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
BR112017013104A2 (pt) 2014-12-19 2018-05-15 Regeneron Pharma métodos para modificar um locus genômico alvo em uma célula, para intensificar a recombinação homóloga em um locus genômico alvo em uma célula e para produzir uma geração f0 de um animal não humano.
US10793855B2 (en) 2015-01-06 2020-10-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016174056A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 Genethon Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders
DK3289076T3 (da) 2015-05-01 2022-01-17 Prec Biosciences Inc Præcis sletning af kromosomale sekvenser in vivo
CA3035810A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 University Of Massachusetts Detection of gene loci with crispr arrayed repeats and/or polychromatic single guide ribonucleic acids
MX2018007840A (es) 2015-12-23 2019-05-02 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica y/o la degeneracion lobar frontotemporal.
WO2017178590A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Université de Lausanne Treatment and/or prevention of dna-triplet repeat diseases or disorders
WO2018022480A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer
JP7026678B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２座位中にヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する非ヒト動物
WO2018078134A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Genethon Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophy
WO2018078131A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Genethon Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophy
EP3592365A4 (en) 2017-03-10 2021-01-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System TREATMENT OF ENDOTHELIAL CORNEAL DYSTROPHY OF FUCHS
JP7327803B2 (ja) 2017-05-09 2023-08-16 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）を処置する方法
AU2018355343A1 (en) 2017-10-24 2020-05-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of rare diseases
BR112020025306A2 (pt) * 2018-06-18 2021-03-09 Denali Therapeutics Inc. Proteínas de fusão compreendendo progranulina

Also Published As

Publication number Publication date
RU2725737C2 (ru) 2020-07-03
AU2021201827B2 (en) 2023-11-09
CN107920498A (zh) 2018-04-17
CA2986048C (en) 2021-10-26
US10285388B2 (en) 2019-05-14
WO2016196185A1 (en) 2016-12-08
SG10201911257YA (en) 2020-01-30
RU2017145143A (ru) 2019-07-02
KR20180012323A (ko) 2018-02-05
JP2018518165A (ja) 2018-07-12
JP2019201671A (ja) 2019-11-28
JP2021118745A (ja) 2021-08-12
JP6884831B2 (ja) 2021-06-09
AU2016270587A1 (en) 2017-11-30
US20160345547A1 (en) 2016-12-01
HK1248465A1 (zh) 2018-10-19
NZ737000A (en) 2021-02-26
AU2016270587B2 (en) 2020-12-24
KR102377189B1 (ko) 2022-03-22
EP3302048B1 (en) 2020-02-19
MX2017015369A (es) 2018-07-06
EP3302048A1 (en) 2018-04-11
IL286176A (en) 2021-10-31
US20190216062A1 (en) 2019-07-18
RU2020115485A (ru) 2020-06-11
CA2986048A1 (en) 2016-12-08
KR20200140934A (ko) 2020-12-16
US11547101B2 (en) 2023-01-10
JP6619822B2 (ja) 2019-12-11
AU2021201827A1 (en) 2021-04-22
BR112017025507A2 (pt) 2018-08-07
KR102190661B1 (ko) 2020-12-14
EP3689139A1 (en) 2020-08-05
IL255385A0 (en) 2017-12-31
RU2017145143A3 (es) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2784360T3 (es) Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
US20190119337A1 (en) Methods of treating mitochondrial disorders
US20210392865A1 (en) Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception
JP2019509059A (ja) 変異型キヌレニナーゼ遺伝子を有する非ヒト動物
KR20210005074A (ko) 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
RU2778405C2 (ru) Способы защиты плодов свиней от инфицирования вирусом
NZ737000B2 (en) Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus