CN107693542B - 一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法。利用小鼠的树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA 12小时后，通过尾静脉注射到小鼠体循环内来诱导小鼠系统性红斑狼疮的方法。本发明通过检测小鼠体内自身抗体水平的升高，小鼠淋巴组织的增生肿胀，以及后期小鼠肾脏的肾小球炎症性状改变等指标，对小鼠系统性红斑狼疮疾病进行评价。该种方法可以在2周内诱导出小鼠系统性红斑狼疮，且诱导成模率高达100％，是一种迅速、简洁、高效、免疫细胞和免疫原明确的系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，能够为探究系统性红斑狼疮疾病的机制以及寻求新的有效的治疗方法提供便利。

Description

一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及动物疾病模型的构建方法，尤其涉及一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
系统性红斑狼疮是一种常见的以多系统的器官组织慢性炎症性损害为特征的自身免疫病，其病因和发病机制尚不完全清晰，目前认为可能由遗传，炎症，激素和环境等因素综合作用，引起机体免疫稳态失衡，调节紊乱，抗原抗体复合物，补体复合物沉积血管引起免疫反应以及血栓形成最终导致局部或全身组织器官损害。
系统性红斑狼疮暂不能治愈，目前的治疗方法主要是细胞免疫抑制剂和糖皮质激素，虽然糖皮质激素和能免疫抑制剂可有效缓解系统性红斑狼疮病情，但是患者仍被疾病的药物的毒副作用、高复发率和高死亡率而广受困扰。
目前系统性红斑狼疮小鼠模型有自发系统性红斑狼疮症状模型如(NZB/NZW)F1代小鼠，MRL/lpr小鼠，BXSB/Yaa小鼠，这些小鼠基因背景不同于正常小鼠，在系统性红斑狼疮疾病机制以及治疗的探究中有一部分局限性。除此之外还有诱导的小鼠系统性红斑狼疮模型，如同种异体淋巴细胞诱导的小鼠系统性红斑狼疮模型，活化淋巴细胞来源DNA皮下免疫诱导的小鼠系统性红斑狼疮模型。但同种异体淋巴细胞诱导的小鼠系统性红斑狼疮模型需要将亲代鼠的T淋巴细胞注射到纯系鼠杂交的F1代上，对小鼠来源要求较高。活化淋巴细胞来源DNA皮下免疫诱导的小鼠系统性红斑狼疮模型是目前较常见的诱导系统性红斑狼疮疾病模型，但是其在主动免疫性、特异性方面存在缺陷，且持续时间较短，对系统性红斑狼疮疾病机制的研究仍然存在一定的局限性。
骨髓来源的树突状细胞顾名思义就是将骨髓细胞特异性地诱导分化为专职抗原提成细胞--树突状细胞，树突状细胞是功能最强大的抗原呈递细胞,它具树突状结构,具有活跃地摄取、处理抗原的能力,并高表达主要组织相容性复合体M小时CⅠ、Ⅱ类分子和CD80、CD86等共刺激分子,能有效地向T细胞呈递抗原、激发初次细胞免疫应答。
发明内容
本发明的目的是提供一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用，本发明提供的系统性红斑狼疮动物模型的构建方法具有迅速、简洁、高效、免疫细胞和免疫原明确的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)提取处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA；
(2)制备小鼠骨髓单细胞悬液；
(3)树突状细胞的诱导分化；
(4)树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA；
(5)将步骤(4)中制得的体外包被有处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的树突状细胞注射到小鼠体内；
(6)监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况。
优选地，所述树突状细胞来源于骨髓。
骨髓来源的树突状细胞是将骨髓细胞特异性地诱导分化为专职抗原提成细胞--树突状细胞，收集诱导后的树突状细胞，在体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA，使其构成BMDCs-ALD-DNA，其中BMDCs为骨髓来源的树突状细胞，ALD-DNA为处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA。当骨髓来源的树突状细胞捕获抗原后经尾静脉转输入小鼠体内，诱导小鼠体内免疫系统激活，触发小鼠系统性红斑狼疮症状。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(2)中，制备小鼠骨髓单细胞悬液的方法为：处死小鼠，分离小鼠的股骨和胫骨各两根，剪断骨骺端，吹散骨髓细胞，离心，裂解红细胞后，用完全培养基重悬，得到小鼠骨髓单细胞悬液。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(3)中，树突状细胞的诱导分化的方法为：向步骤(2)中得到的小鼠骨髓单细胞悬液中添加重组细胞因子，进行细胞诱导分化培养，换液，待树突状细胞成熟后进行收集，检测树突状细胞的阳性率。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述重组细胞因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)，且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的工作浓度为50ng/ml，白细胞介素4的工作浓度为2.5ng/ml。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(4)中，树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的方法为：将步骤(3)中经过诱导分化的树突状细胞树突状细胞与步骤(1)中处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA共孵育12小时，收集共孵育后的细胞，经过洗涤后置于冰上保存，
所述处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的工作浓度为5μg/ml。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(5)中，注射方法为：用PBS重悬树突状细胞后，尾静脉注射到小鼠体内，每只小鼠注射的细胞数目为5×105,注射体积为200μL。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：对小鼠进行眼眶取血分离血清，ELISA检测小鼠血清中自身抗体水平。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：对小鼠进行蛋白尿的测定，观测小鼠肾脏有无病损。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠淋巴组织脾脏和颈部淋巴结分别进行观察并称重。
优选地，系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染色，观察小鼠炎症症状的改变。
另外，本发明还提供系统性红斑狼疮动物模型在系统性红斑狼疮机制研究的和治疗方面的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明由于利用了树突状细胞包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA,所以明确了诱导系统性红斑狼疮动物模型的细胞。
(2)采用本发明方法构建的系统性红斑狼疮模型，小鼠诱导成模率高达100％。
(3)采用本发明方法构建的系统性红斑狼疮模型，小鼠发病迅速，转输细胞第2周时即可检测到小鼠体内抗双链DNA抗体的产生，并随着时间的延长自身抗体水平升高。
(4)采用本发明方法构建的系统性红斑狼疮模型，小鼠发病迅速高效，成模第2周便可对小鼠进行治疗或者其他干预，为系统性红斑狼疮机制研究的和治疗提供便利。
附图说明：
图1：系统性红斑狼疮动物模型的构建方法简图
图2：小鼠骨髓细胞经诱导后树突状细胞的阳性率图；
图3：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠体内的抗双链DNA抗体的水平图；
图4：转输BMDCs-ALD-DNA后小鼠体内自身抗体水平与转输的细胞数目的关系图；
图5：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠的蛋白尿水平图。
图6：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠的脾脏和淋巴结的外观图；
图7：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠的脾脏重量图；
图8：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠的淋巴结重量图；
图9：转输BMDCs-ALD-DNA后小鼠脾脏肿胀程度与转输的细胞数目的关系图；
图10：转输BMDCs-ALD-DNA后小鼠淋巴结肿胀程度与转输的细胞数目的关系图；
图11：转输BMDCs-ALD-DNA或者对照组物质后小鼠肾脏组织的切片染色结果图；
图12：转输BMDCs-ALD-DNA或者巨噬细胞系P388D1-ALD-DNA后小鼠体内的抗双链DNA抗体的水平图。
具体实施方式
实施例1系统性红斑狼疮动物模型的构建方法及其应用的一种实施例，其中构建方法简图如图1所示，具体步骤如下：
1、提取处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA，方法如下：
1)二氧化碳窒息法处死C57BL/6小鼠，无菌取脾脏，先放在置于冰上的PBS中，直到所有的小鼠准备完毕；在60mm2平皿中用无菌玻片研磨脾脏，制成单细胞悬液；
2)将悬液通过筛网(去除颗粒结缔组织)后收集于50ml离心管里，4℃1500rpm离心5分钟，弃上清；
3)加入3ml的红细胞裂解液ACK，室温静置3分钟后，1500rpm离心5分钟，弃上清；
4)用10ml完全培养基RMPI-1640重悬脾脏细胞，铺在100mm2培养皿中，加入ConA至终浓度为5μg/ml，于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中培养；
5)6天后收集存活的脾脏细胞(主要为淋巴细胞)提取DNA，细胞收集于1.5mL EP管中；
6)每5×105细胞中加入200μL的细胞裂解液(含有蛋白酶K)，对细胞进行消化；
7)70℃孵育5分钟；
8)在涡旋震荡上震荡混匀15秒，直到未见明显团块；
9)在离心管中加入200μL苯酚液，在涡旋震荡上震荡混匀15秒，14000rpm离心5分钟；
10)用移液枪吸上层白色物质入新EP管，加入等体积的氯仿，在涡旋震荡上震荡混匀15秒，14000rpm离心5分钟；
11)再次用移液枪吸上层白色物质入新管，加入10％体积的3mol的醋酸钠，再加入2倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒；
12)用灭菌过的回形针挑出絮状物在70％乙醇中洗两遍后放入新的EP管，打开EP管盖置于室温自然蒸发水份；
13)加入无菌水溶解DNA，用Nanodrop测DNA浓度，将DNA存放在4℃冰箱以备用。
2、制备小鼠骨髓单细胞悬液，制备方法如下：
(1)小鼠骨髓的提取：二氧化碳窒息法处死小鼠后，用酒精对小鼠消毒，分离小鼠的股骨和胫骨各两根放在冰上的PBS中，用灭菌后的剪刀剪断两端骨骺端，用1毫升注射器吹出骨髓细胞并吹散，离心，4℃1500rpm，5分钟，去上清；
(2)小鼠骨髓红细胞的裂解：小鼠的骨髓细胞用2ml ACK裂解2分钟，用10ml PBS终止裂解，离心4℃1500rpm，5分钟，去上清，用完全培养基RPMI-1640重悬细胞制备得到小鼠骨髓单细胞悬液；
取小鼠骨髓需要在无菌超净台操作，从小鼠处死到将小鼠骨髓细胞吹成单细胞悬液要在10分钟之内完成，所有过程尽量在冰上完成；ACK红细胞裂解液在裂解骨髓细胞中红细胞时需要严格控制在2分钟以内，以免骨髓中非红细胞受到影响；细胞培养箱中培养的温度为37℃、二氧化碳含量为5％。
3、树突状细胞的诱导分化，方法如下：
(1)小鼠树突状细胞的诱导：向小鼠骨髓单细胞悬液中添加重组细胞因子—集落刺激因子(GM-CSF)l和白细胞介素4(IL-4)，GM-CSF的工作浓度为50ng/ml，IL-4的工作浓度为2.5ng/ml，在细胞培养箱培养；
(2)树突状细胞的收集：2天后换液，加入含GM-CSF 50ng/ml和IL-4 2.5ng/ml的完全培养基，7天后轻柔吹下培养皿中悬浮着的集团细胞，切勿大力吹落贴壁的细胞，贴壁细胞多为巨噬细胞，吹下影响树突状细胞的纯度；
(3)树突状细胞的检测：采用流式细胞仪检测树突状细胞的阳性率。
结果如图2所示，其中a为阴性对照，b为CD11c阳性比例，由图2可知收集的细胞约90％为CD11c+，说明骨髓细胞经过诱导后，树突状细胞的相对百分数约为90％。其中CD11c+是树突状细胞表面的一个特异性标志，检测到CD11c+的相对百分数即可代表树突状细胞的阳性率。
4、树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA
(BMDCs-ALD-DNA细胞)，方法如下:
将收集到的树突状细胞与处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA(ALD-DNA)在细胞培养箱中共孵育12小时后，收集细胞，用PBS洗两遍后置于冰上保存，其中处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的工作浓度为5μg/ml。
5、将BMDCs-ALD-DNA注射到小鼠体内，方法如下:
将小鼠分为实验组和对照组，其中实验组的处理方法为：用PBS重悬BMDCs-ALD-DNA细胞后，尾静脉注射到小鼠体内，每只小鼠注射的细胞数目为5×105，注射体积为200μL。
对照组分为阳性对照组和阴性对照组，其中阳性对照组的处理方法为：向小鼠皮下注射ALD-DNA与佐剂的混合物；阴性对照组的组的处理方法为：向小鼠尾静脉分别注射PBS、BMDCs细胞；对照组的注射体积和细胞数目均与实验组相同。
6、ELISA检测小鼠血清中自身抗体水平
定期在无菌条件下对小鼠进行眼眶取血分离血清，于-80℃冰箱保存，ELISA检测小鼠血清中自身抗体水平,主要是抗小鼠双链DNA抗体水平，ELISA方法的实验步骤如下：
(1)扣九十六孔板，200μg/ml鲑鱼精(Salmon)DNA，100μL/孔；
(2)用锡纸膜包住，37℃过夜；
(3)洗板机用0.05％PBST洗四遍；
(4)100μL阻断液/孔，阻断液为含10％FBS的PBS；
(5)室温静置1小时；
(6)洗板机用0.05％PBST洗一遍；
(7)加收集的血清样品，100μL/孔，样品血清用1％BSA 1:100稀释；
(8)室温静置2小时；
(9)洗板机用0.05％PBST洗一遍；
(10)孵二抗，Anti-mIgG-小时RP，用含1％FBS的PBS 1:3000稀释，100μL/孔；
(11)室温静置1小时；
(12)洗板机用0.05％PBST洗七遍；
(13)加显色液，100μL/孔TMB；
(14)用锡纸包住，室温静置10分钟；
(15)加终止液，100μL/孔0.5mol硫酸；
(16)酶标仪读数OD450。
结果如图3所示，在第四周时对小鼠体内自身抗体水平检测发现，实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠的自身抗体水平较阳性对照组(ALD-DNA组)还高，而阴性对照组(PBS，BMDCs组)则无自身抗体的产生，研究小鼠体内自身抗体水平与转输的细胞数目的关系，结果如图4所示，发现小鼠体内自身抗体水平与转输的细胞数目成正相关。
7、小鼠肾脏病变的观测，具体步骤如下：
对小鼠进行蛋白尿试纸检测小鼠肾脏有无发生病例改变，结果如5所示，发现实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠的尿蛋白水平均比对照组(PBS，BMDCs组)高。
8、小鼠病理组织学观察与检测，具体步骤如下：
(1)转输细胞的第20周后二氧化碳窒息法处死小鼠；
(2)取小鼠淋巴组织脾脏和颈部淋巴结并进行观察；
(3)取小鼠淋巴组织脾脏和颈部淋巴结并进行称重。
对小鼠淋巴组织脾脏和颈部淋巴结并进行观察，结果如图6所示，发现实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠的脾脏以及淋巴结外观均比阴性对照组(PBS组，BMDCs组)大；对小鼠淋巴组织脾脏进行称重，结果如图7所示，发现实验组(BMDCs-ALD-DNA组)组小鼠的脾脏比阴性对照组(PBS组，BMDCs组)重；对小鼠颈部淋巴结进行称重，结果如图8所示，发现实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠的淋巴结也比阴性对照组(PBS组，BMDCs组)重；研究小鼠的脾脏重量与小鼠转输的细胞数目的关系，结果如图9所示，发现小鼠的脾脏以重量与小鼠转输的细胞数目成正相关；研究小鼠的淋巴结重量与小鼠转输的细胞数目的关系，结果如图10所示，发现小鼠的淋巴结以重量与小鼠转输的细胞数目成正相关。
9、小鼠病理组织切片观察，具体步骤如下：
(1)转输细胞的第20周后二氧化碳窒息法处死小鼠；
(2)取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染色，显微镜下观察；
结果如图11所示，其中：
a为对照组小鼠肾脏组织HE染色图(40×)，
b为实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠肾脏组织HE染色图(40×)；
c为对照组IgG即免疫球蛋白免疫组化染色图(40×)，
d为实验组(BMDCs-ALD-DNA组)IgG(即免疫球蛋白免疫组化染色图(40×)；
e为对照组C3即补体C3免疫组化染色图(40×)，
f为实验组(BMDCs-ALD-DNA组)C3即补体C(免疫组化染色图(40×)。
由图11中的a和b可观察到实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠肾皮质细胞增生，并出现肿胀和玻璃样变形，此外还有淋巴细胞浸润，肾小球边界模糊，滤过间隙消失，肾小球内可见毛细血管出血，表现为典型的肾小球炎症性改变，而阴性对照组均表现为正常的肾脏组织结构，未见炎症改变。
由图11中的c和d可观察到实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠肾间质和肾小球均可见免疫球蛋白沉积，且在肾小球中的沉积比在肾间质的沉积水平更严重，表明肾小球炎症程度比肾间质炎症程度更重，而阴性对照组均表现为正常的肾脏组织结构，未见免疫球蛋白沉积现象。
由图11中的e和f可观察到实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠肾间质和肾小球均可见补体C3沉积，且在肾小球中的沉积比在肾间质的沉积水平更严重，表明肾小球炎症程度比肾间质炎症程度更重，而阴性对照组均表现为正常的肾脏组织结构，未见补体C3沉积现象。
10、ELISA检测巨噬细胞系P388D1体外包被ALD-DNA与BMDCs体外包被ALD-DNA转输给小鼠后，小鼠体内抗双链DNA抗体水平分析
为了明确树突状细胞的疾病诱导功能，本发明还做了巨噬细胞系P388D1细胞体外包被ALD-DNA后转输入小鼠体内与实验组(BMDCs-ALD-DNA组)小鼠做对比，分析二者双链抗体水平，结果如图12所示，发现巨噬细胞体外包被ALD-DNA后转输入小鼠体内并不能诱导小鼠系统性红斑狼疮症状。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (11)

1.一种系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA；
(2)制备小鼠骨髓单细胞悬液；
(3)树突状细胞的诱导分化；
(4)树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA；
(5)将步骤(4)中制得的体外包被有处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的树突状细胞注射到小鼠体内；
(6)监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况。
2.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，制备小鼠骨髓单细胞悬液的方法为：处死小鼠，分离小鼠的股骨和胫骨各两根，剪断骨骺端，吹散骨髓细胞，离心，裂解红细胞后，用完全培养基重悬，得到小鼠骨髓单细胞悬液。
3.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，树突状细胞的诱导分化的方法为：向步骤(2)中得到的小鼠骨髓单细胞悬液中添加细胞因子，因子进行细胞诱导分化培养，换液，待树突状细胞成熟后进行收集，检测树突状细胞的阳性率。
4.如权利要求3所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，添加的细胞因子为重组细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4，其中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的工作浓度为50ng/ml，白细胞介素4的工作浓度为2.5ng/ml。
5.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，树突状细胞体外包被处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA的方法为：将步骤(3)中经过诱导分化的树突状细胞树突状细胞与步骤(1)中处于凋亡状态下的淋巴细胞DNA共孵育12小时，收集共孵育后的细胞，经过洗涤后置于冰上保存。
6.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中，注射方法为：用PBS重悬树突状细胞后，尾静脉注射到小鼠体内，每只小鼠注射的细胞数目为5×105,注射体积为200μL。
7.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：对小鼠进行眼眶取血分离血清，ELISA检测小鼠血清中自身抗体水平。
8.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：对小鼠进行蛋白尿的测定，观测小鼠肾脏有无病损。
9.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠淋巴组织脾脏和颈部淋巴结分别进行观察并称重。
10.如权利要求1所述系统性红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染色，观察小鼠炎症症状的改变。
11.根据权利要求1-10任一项所述方法构建的系统性红斑狼疮动物模型在系统性红斑狼疮的机理研究方面的应用。
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Induction of systemic lupus erythematosus-like syndrome in syngeneic mice by immunization with activated lymphocyte-derived DNA;B. Qiao, et al.;《Rheumatology》;20050419;第44卷(第9期);第1108-1114 *

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