CN111394308B

CN111394308B - 一种脐带血淋巴细胞cik的培养方法

Info

Publication number: CN111394308B
Application number: CN201911255306.0A
Authority: CN
Inventors: 谢海涛; 薛卫巍; 钟家炜; 谢天仲; 王斌; 王乃会
Original assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN111394308A

Abstract

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别公开了一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。本发明以脐带血为处理对象，经过脐带血单个核细胞的分离，CIK细胞的提纯诱导，CIK细胞的培养扩增，最后离心收集成熟的脐带血CIK细胞，得到产品。本发明通过用添加IFN‑γ和α‑半乳糖神经酰胺对CIK细胞进行激活，培养前期加入CD3单克隆抗体、IL‑1α、IL‑2及IL‑1β连续刺激，省去包被时间，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。

Description

一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养技术领域，特别是涉及脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。

背景技术

过继性免疫细胞疗法是将具有特异免疫力的淋巴细胞或其产物输给细胞免疫功能失调(如肿瘤病人以及免疫力过高或过低导致的其他疾病)，调节患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK )是将人外周血或者脐带血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2、α-半乳糖神经酰胺、IL-1β和IFN-γ等 )诱导增殖后获得的一群异质细胞。由于其同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，同时具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。然而NKT细胞在正常的脐带血中含量极低，仅为1％左右。因此，在体外培养中，提高CIK细胞的数量及其效应细胞NKT细胞的比例对提高临床治疗效果有着至关重要的作用。

有研究表明，脐带血来源的CIK细胞和外周血来源的CIK细胞相比，有更高的增殖能力、更强的杀伤肿瘤活性和较低的免疫原性。

肿瘤细胞的免疫逃逸性就是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而适得其在体内生存和增殖。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些异常细胞，抵御肿瘤的发生和发展，进而使正常人躲避肿瘤的发生。然而，恶变细胞在一定情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。总的来说，一方面，机体可通过机体免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞在增殖的过程中发生变异同时通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。对于免疫T细胞包括 CIK细胞，其分子机理在于其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一旦与其肿瘤或其他想逃避免疫识别和攻击的细胞的相应配体结合，就能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。而这种逃避免疫识别和攻击最先是生物体用来控制T细胞的避免杀伤自身细胞而产生自身免疫反应。因此对于肿瘤患者或免疫性疾病的患者来讲，自身的免疫细胞CIK扩增进入体内后仍然会因为癌细胞等靶细胞的免疫逃避机制而表现出低杀伤或无杀伤能力，而脐带血免疫细胞CIK虽然也有靶细胞躲避杀伤的受体，但因为异体错配而使得机体的癌细胞或靶细胞无法逃脱脐带血CIK免疫识别和杀伤，进而使得脐带血免疫细胞CIK杀伤能力较自体免疫细胞CIK强。

目前现有的CIK技术的不足：

(1 )一般的CIK制备方法是将分离的脐带血单个核细胞( PBMC )用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增值倍数和有效细胞含量都不够理想。

(2)现有CIK细胞培养前需去除贴壁的单核细胞，步骤较为繁琐且在细胞转移培养的过程中增加了染菌的风险。

(3)自体免疫细胞CIK容易容易引起癌细胞或靶细胞免疫逃逸而降低或失去杀伤癌细胞癌细胞或靶细胞。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种通用使用、步骤简单、有效细胞含量多的脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，以脐带血为原始材料，其特征为，包括如下步骤：

（1）从脐带血中分离出脐带血单个核细胞；

（2）将步骤 (1)中制得的单个核细胞（PBMC）用添加了IFN-γ、自体血浆和α-半乳糖神经酰胺的无血清完全培养基重悬，转移至培养瓶中，37℃5%CO₂培养箱静置培养24h；

（3）静置培养24h后加CD3 单克隆抗体、IL-1α、IL-2及IL-1β；

（4）静置培养第3天加入当天含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0~2.0ⅹ10⁶/ml；

（5）静置培养第5天加入当天含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

（6）静置培养第7天转至培养袋中培养，添加含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

（7）静置培养第9天、添加含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0~2.0ⅹ10⁶/ml；

（8）静置培养第11天、添加含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0~2.0ⅹ10⁶/ml；

（9）静置培养第14天将培养好的脐带血免疫细胞CIK细胞离心收集，并用0 .9wt％生理盐水洗涤，再向收集好的细胞中加入人血清白蛋白，并用0 .9wt％生理盐水定容，得到产品。

本发明的更优技术方案为：

（1）从脐带血中分离出脐带血单个核细胞；

（2）将步骤 (1)中制得的单个核细胞（PBMC）用无血清完全培养基重悬，添加浓度为200ng/ml的IFN-γ、浓度为10%（v/v）自体血清和浓度为100ng/mlα-半乳糖神经酰胺的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基中，使得细胞浓度在1.0×10⁶个/ml，37℃、5%CO₂培养箱静置培养24h；

（3）24h后补加浓度为100ng/ml的CD3 单克隆抗体、浓度为100ng/ml的IL-1α、浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度为100ng/ml的IL-1β；

（4）第3天、第5天分别加入含1000IU/ml的IL-2和自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0×10⁶个/ml；

（5）第7天转至培养袋中培养，添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0×10⁶个/ml；

（6）第9天、添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.2×10⁶个/ml；

（7）第11天、添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在2×10⁶个/ml；

（8）第14天将培养好的脐带血免疫细胞CIK细胞离心收集，并用0 .9wt％生理盐水洗涤三次，再向收集好的细胞中加入10ml的20%(v/v)的人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定容至200ml，得到产品。

本发明中一些常用的术语说明如下：

IL-2：白细胞介素2；

IFN-γ：干扰素γ；

CD3单抗：细胞表面分子3单克隆抗体；

与常规的培养方法相比，本发明的有益效果表现在以下几方面：

( 1 )本发明所述用于单个核细胞的分离来源于脐带血，脐带血单个核不会受到细菌、病毒等有害因素的影响，细胞更纯，安全性更高。和外周血来源的CIK细胞相比，脐带血免疫细胞 CIK有更高的增殖倍数、更强的杀瘤活性和低的免疫原性；

( 2 )本发明所述用于扩增CIK的方法省去了包被和去除单核细胞的步骤，操作方便。

附图说明

图1为脐带血免疫细胞CIK生长曲线；

图2位脐带血免疫细胞CIK培养14天的CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例：

本实施例所采用的用于扩增脐带血免疫细胞CIK的方法：

1 .脐带血单个核的分离和培养

（1）粗分离：

将血液分装到50mL离心管中，每管最多分装35mL，并计算血液体积。用巴氏吸管吸取血样，将其滴2滴到EP管中，进行血细胞分析仪检测细胞数量。将50mL离心管中的血液离心，650g，10min，升8档，降8档。准备与装全血一样数目的50mL离心管，每只加入15mL淋巴细胞分离液。

（2）血浆制备：

离心结束后，将离心管转移至安全柜台面，用25mL移液管吸取上层血浆至新的离心管中。取1mL血浆作为留样，标记并放置于-20℃冰箱储存。剩余血浆离心管封口膜封口，放置水浴锅56℃，30min。灭活结束后，立即将血浆放置在-20℃冰箱中15min。最后离心1200g，10min。将血浆上清倒入至新离心管中，封口，置于2℃-8℃冰箱待用。

（3）单个核细胞制备：

用0 .9wt％生理盐水1:1稀释剩余下层血细胞并混匀。对应的将血细胞稀释液加入到淋巴细胞分离液中：倾斜45°淋巴分离液的离心管，用电动移液器将少量血细胞悬液加入到分离液上方1cm处，把细胞悬液铺开。倾斜离心管使悬液与分离液接触，再继续沿管壁缓慢加入剩余细胞悬液。切勿打乱液面界面，每管最多加到45mL。保持离心管竖直放置，小心转移放置到离心机中。650g离心30分钟，升1档，降0档。离心结束，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层。缓慢转移到安全柜中。用10mL移液管将上层残留血浆去除剩余2mL，再吸取每只离心管中第二层白膜细胞约10mL加入到新的对应离心管中。加生理盐水到50mL。离心650g，10min，升8档，将8档。离心结束后，分别向离心管内加入5~10mL生理盐水重悬细胞，将细胞沉淀合并到一个50mL离心管中，生理盐水补足到50mL，用10mL移液管吹打均匀后，滴2滴到EP管中，进行计数。计数结束，从细胞液中取5×10⁷数目单个核细胞单独装入一只50mL离心管（标记种瓶管）中并重悬到50mL。离心300g，10min，升8档，降8档。离心结束后，弃去上清，沉淀即所需单个核细胞。

2. CIK细胞的培养

将5000万的单个核细胞（PBMC）加入到浓度为200ng/ml的IFN-γ、浓度为10%自体血清和浓度为100ng/mlα-半乳糖神经酰胺的50ml的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基中，静置培养24h；

24h后补加浓度为100ng/ml的CD3 单克隆抗体、浓度为100ng/ml的IL-1α、浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度为100ng/ml的IL-1β；

第3天加入含1000IU/ml的IL-2和10%（v/v）自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基50ml；

第5天加入含1000IU/ml的IL-2和10%（v/v）自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基150ml；

第7天转至培养袋中培养，添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基300ml；

第9天添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基800ml；

（7）第11天、添加浓度为1000IU/ml的IL-2的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基1200ml；

结果测试

(1)细胞增殖数量的测定

将取得的CIK细胞用台盼蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察细胞的增殖状况，具体情况见下曲线图，如图1。

脐带血免疫细胞CIK生长曲线图1结果显示：细胞经过14天的培养增殖了数量达到130亿。经过无包被因子连续刺激的方法，能够有效提高细胞的增殖倍数。

(2)细胞表型分析

第14天收集脐带血免疫细胞CIK细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10⁵个/ml，加入标记的单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，结果如图2脐带血免疫细胞CIK细胞表型分析。新的因子的组合使得CD3+CD56+细胞含量为50.79%，高于传统含量（20%）。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，以脐带血为原始材料，其特征为，所述脐带血淋巴细胞CIK的培养方法包括如下步骤：

（1）从脐带血中分离得到出脐带血单个核细胞；

（2）将步骤 (1)中制得的单个核细胞采用添加了IFN-γ、自体血清和α-半乳糖神经酰胺的淋巴细胞无血清培养基重悬，转移至培养瓶中，37℃、5%CO₂培养箱静置培养24h；

（3）静置培养24h后加CD3 单克隆抗体、IL-1α、IL-2及IL-1β；

（4）静置培养第3天加入含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

(5) 静置培养第5天继续加入当天含IL-2和自体血清的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

（7）静置培养第9天、添加含IL-2的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

（8）静置培养第11天、添加含IL-2的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度在1.0ⅹ10⁶~2.0ⅹ10⁶/ml；

（9）静置培养第14天将培养好的脐带血免疫细胞CIK细胞离心收集，并用0.9 wt %生理盐水洗涤，再向收集好的细胞中加入人血清白蛋白，并用0.9 wt %生理盐水定容，得到产品。

2.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：所述淋巴细胞无血清培养基是用于培养淋巴细胞的所有培养基。

3.根据权利要求2所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：所述淋巴细胞无血清培养基是GT-T551H3培养基或CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基或RPMI-1640培养基。

4.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：步骤 (2)中所述IFN-γ、自体血清和α-半乳糖神经酰胺于淋巴细胞无血清培养基中的浓度分别为IFN-γ50-1000ng/ml、自体血浆1%-10%(v/v)，α-半乳糖神经酰胺1-300ug/ml。

5.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：步骤 (3)中24h后加入的CD3 单克隆抗体、IL-1α、IL-2及IL-1β的浓度分别为： CD3 单克隆抗体10-500ng/ml、IL-1α 1-50ng/ml、IL-2 500-2000IU/ml、IL-1β 1-50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)、(5)、(6)、(7)、（8）中所述的IL-2的浓度均为500-2000IU/ml，以及自体血清的浓度均为1%-10%(v/v)；所述自体血清是经过56°灭活的自体血浆。

7.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：所述步骤(9)的具体操作为：采用0 .9wt％生理盐水洗涤收集的CIK细胞3次，然后向CIK细胞中加入10mL体积百分比为 20％（v/v）的人血清白蛋白，并用0 .9wt％生理盐水定容至200mL。

8.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于：所述静置培养的条件为在温度为37℃、CO₂体积百分比为含量为5％、相对饱和湿度为100％的CO₂培养箱中培养。