CN113684180A

CN113684180A - 一种提高骨髓瘤杀伤活性的nk细胞制备方法

Info

Publication number: CN113684180A
Application number: CN202111009846.8A
Authority: CN
Inventors: 郑成云; 任婧; 姜杨
Original assignee: Second Hospital of Shandong University
Current assignee: Second Hospital of Shandong University
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN113684180B

Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞制备方法：NK细胞中加入GSK‑3β抑制剂孵育。本发明提供的提高NK细胞杀伤活性的方法，采用GSK‑3β抑制剂处理，可以增强NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤能力。本发明制备过程简单、可操作性强，为临床医学应用提供了可行的办法。

Description

一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞配制方法。

背景技术

自然杀伤（Natural Killer cell，NK细胞）细胞是先天性淋巴细胞，能够介导免疫监视和清除病毒感染和肿瘤转化的细胞。NK细胞具有类似于T细胞在适应性免疫中发挥作用，但缺乏CD3和T细胞受体的细胞毒性能力。人体免疫系统中的这两种效应细胞，尽管有许多相似之处，但与效应T细胞相比，NK细胞对肿瘤的细胞毒性更强，反应更快，免疫原性更低。

NK细胞主要在血液中循环，约占外周血单核细胞(PBMC)的5-10%，存在于骨髓和脾脏等淋巴组织中，并根据CD56和CD16的不同表面分布细分为不同的亚群。与其他先天样细胞类似，NK细胞起源于骨髓中的共同淋巴祖细胞（CLP），平均更新周期约为2周。NK细胞与主要组织相容性复合体-I（MHC-I）的相互作用，使得NK细胞避免攻击健康的正常细胞。有趣的是，肿瘤细胞总是缺乏或仅表达低水平的MHC-I以逃避T细胞介导的细胞毒性，而NK细胞则能够被激活。然而，肿瘤细胞也同时表达激活NK细胞的分子，例如MHC I类多肽相关序列A（MICA）和MICB，支持使用NK细胞作为抗癌剂。越来越多的实验和临床证据强调了NK细胞在控制癌症进展或促进免疫抑制肿瘤微环境发生方面的双重作用。

作为先天免疫中的主要效应细胞类型，NK细胞能够在很早的阶段杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞。由于NK细胞缺乏丰富的受体来区分抗原，通过功能性受体在激活共刺激和抑制信号之间保持平衡来识别靶细胞。这些相互作用的信号最终决定了NK细胞的激活和功能状态。激活信号包括细胞因子结合受体、整合素、杀伤受体（CD16、NKp40、NKp30、NKp44和NKG2D）、识别非自身抗原的受体（Ly49H）和其他受体等。总的来说，NK细胞的激活受体根据各自的配体可分为至少三种类型，包括MHC-I特异性受体、MHC-I相关受体和MHC-I非相关受体。抑制信号主要包括程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3（TIM-3）、T细胞免疫受体具有Ig和免疫受体酪氨酸基抑制基序结构域（TIGIT）、CD96和淋巴细胞激活基因3（LAG-3）等。活化的NK细胞可以产生各种类型的细胞因子，包括颗粒酶，IFN-γ和TNF-α，这与通过膜表达受体提供的抑制和活化信号的复杂整合而引发细胞毒性有关。当NK细胞与细胞接触时，通过NK细胞的激活和抑制受体检测到不同的抑制和激活配体表达模式，这些配体和受体的平衡决定了NK细胞的功能。活化的NK细胞可以向靶细胞发送信号，并通过颗粒酶和穿孔素的直接胞吐作用诱导细胞裂解。受刺激的NK细胞也被证明可以通过凋亡途径（即Fas或TRAIL）和细胞因子产生杀死癌细胞，对先天性和适应性免疫反应都很重要。

血液肿瘤是指瘤细胞起源于血液、骨髓或淋巴结的恶性肿瘤，主要包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。其中多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种恶性浆细胞瘤，多发性骨髓瘤的特征是恶性浆细胞的积聚，导致血液和尿液中的单克隆蛋白增加。多发性骨髓瘤在老龄化人群中患病率更高，平均生存时间3-5年。MM大约占1%的癌症和血液系统恶性肿瘤的13%，且发病率呈逐年上升趋势，已成为第二常见的血液肿瘤。在过去的20年中，几种治疗多发性骨髓瘤的新型药物，如免疫调节药物（IMiD）、蛋白酶体抑制剂（PIs）、组蛋白去乙酰基酶抑制剂（HDADi）以及CD38单克隆抗体（mAb）等在内的新型药物使患者的中位生存期从3年延长至8-10年。然而，组成性和持续性的遗传复杂性和不稳定性，加上肿瘤促进、免疫抑制性骨髓微环境，仍然是治愈的障碍。MM被认为是一种免疫系统疾病。NK细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞（DC）的逐渐免疫失调和损伤使恶性浆细胞逃避免疫监视。如何更好地了解MM的免疫环境，重新激活免疫系统以抑制MM的生长，可能会成为替代治疗策略。

NK细胞过继输注的NK细胞来源包括外周血、干细胞及NK细胞株等，但是由于不同来源NK细胞的表型及杀伤活性差异较大，其临床研究应用方案及疗效仍有待深入研究。由于自体NK细胞由于识别自身HLA信号而遭受抗性，选择HLA错配的NK细胞供体将消除传递给同种异体NK细胞的抑制信号，从而导致有效的肿瘤溶解。一些试验表明，供体NK细胞和受体之间的KIR配体错配与更好的NK细胞治疗相关。将KIR不匹配的NK细胞注入10名复发性多发性骨髓瘤患者，并在14天后进行了自体干细胞移植；一半的患者几乎完全缓解。在儿科AML患者中，KIR-HLA错配的NK细胞延长了无病生存期和总生存率。此外，已经表明，KIR不匹配的NK细胞可以移植到高危AML的老年患者中，这些患者不是干细胞移植的候选者，并且与毒性无关。NK细胞移植后，老年患者的白血病得到缓解。最近，研究表明半相合NK细胞可诱导非霍奇金淋巴瘤患者的缓解。这些研究指出同种异体NK细胞移植在多种癌症的抗肿瘤反应中的效用。

糖原合酶激酶3（GSK-3）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可充当多种信号通路的汇合点（例如Wnt/β-catenin和NFκB），并调节许多细胞过程，例如代谢，分化，增殖，凋亡和免疫反应中起着核心作用。GSK-3具有两种由不同基因编码的同工型，即GSK-3α和GSK-3β，GSK-3β它在网织细胞，硬脑膜，淋巴结和胰腺中的表达要少得多，而在血液NK细胞和骨髓粒细胞中则以较高的水平表达。在一项对AML患者研究中，显示糖原合酶激酶β（GSK3β）表达在AML-NK细胞中升高。高水平的GSK3β可以损害NK细胞功能外，还观察到了功能缺陷的AML患者的NK细胞中GSK3β表达的升高。这些研究表明，来自AML患者的NK细胞中这种升高的GSK3β蛋白可能是导致NK细胞功能异常的原因之一，因此，阻断GSK-3β对NK细胞的活化可能有重要意义。

发明内容

针对为了解决现有技术的问题，提高NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的效率，本发明提供一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞制备方法，通过添加GSK-3β抑制剂能够有效提高NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞制备方法，包括以下步骤：NK细胞中加入GSK-3β抑制剂共培养。

优选地，所述共培养的时间为24-48h。

优选地，所述GSK-3β抑制剂包括但不限于TDZD-8、CHIR-99021和tws119。

更为优选地，所述GSK-3β抑制剂为tws119；所述共培养的浓度为2.5-20 μM/10⁶细胞。

优选地，所述NK细胞可以是从血液中分离获得、嵌合抗原受体NK细胞或商业化NK细胞系，如，NK-92细胞系。

优选地，从血液中分离获得NK细胞的步骤如下：

（1）分离获得单个核细胞，调整浓度至1×10⁶/mL，加入5μg/mL的CD16抗体和500U/mL的重组人白介素-2孵育至第5天；

（2）每2天半量更换培养液，调整细胞浓度1×10⁶/mL，并补充重组人白介素-2至500U/mL，培养21天，获得NK细胞。

上述NK细胞的纯度不低于75%。

一种上述NK细胞制备方法获得的NK细胞。

上述NK细胞可用于治疗多发性骨髓瘤。

本发明具有以下优点：

本发明提供的提高NK细胞杀伤活性的方法，采用GSK-3β抑制剂处理，可以增强NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤能力。GSK-3β抑制剂阻止β-catenin磷酸化降解，使β-catenin在细胞质内浓度升高。β-catenin继而转入核内激活Wnt/β-catenin信号通路，活化下游靶基因的表达，使NK细胞杀伤活性增加。本发明制备过程简单、可操作性强，为临床医学应用提供了可行的办法。

附图说明

图1为不同处理NK细胞的流式检测结果（CD3/CD56）；

图2为不同处理的NK细胞流式检测CD107a脱颗粒变化；

图3为不同处理的NK细胞效靶比1:1共培养流式检测Annexin V/pkh26凋亡变化；

图4为不同处理的NK细胞效靶比1:1共培养ELISA检测上清中γ-干扰素分泌情况；

图5为不同处理的NK-92细胞流式检测CD107a脱颗粒变化；

图6为不同处理的NK-92细胞效靶比1:1共培养流式检测Annexin V/pkh26凋亡变化。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 分离外周血单个核细胞（PBMCs）及NK细胞扩增

1. 分离外周血单个核细胞（PBMCs）

抽取健康人外周静脉血，肝素抗凝，加入等体积NS与外周血混匀；

在15mL离心管中加入与稀释后的外周血总体积相等的淋巴细胞分离液，将稀释后的外周血缓慢加于淋巴细胞分离液上层；1800rpm，离心20min，升速为9，降速为7，细胞分层；

小心吸取白膜层于新的离心管中，加NS混合后洗涤细胞，离心速度为1800rpm，10min；弃上清，1200rpm，6min，NS洗一遍；弃上清，DC完全培养液重悬，台盼蓝染色后在显微镜下计数，根据计数，DC全培养液重悬细胞至单个核细胞至1×10⁶/mL，种于六孔板中（记为D0）。

2. NK细胞扩增

将通过上述分离步骤得到的D0细胞，种于六孔板后，向培养体系中加入CD16（5μg/mL）抗体及的重组人白介素-2（IL-2，500U/mL），37℃、5% CO₂的培养箱中孵育至第5天，计数，根据计数结果，定期半量更换培养液，调整细胞浓度1×10⁶/mL，补充IL-2，直至第22天培养周期结束，获得D21。其中，在培养扩增过程的第0天，第14天，第21天使用流式抗体CD3、CD56标记NK细胞检测所培养细细胞的纯度。经检测，NK细胞纯度达到77.7%。

3. NK细胞处理

收集D21的NK细胞，调整浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液，种于6孔板中，每孔2mL细胞悬液，加入tws119 (终浓度分别为0.5μM、2.5μM、5μM)，同时设置加入DMSO的NK细胞作为对照组。置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养48h。使用流式抗体CD3、CD56标记NK细胞检测所培养细细胞的纯度。经检测（图1），NK细胞纯度DMSO组72.6%，tws119 0.5μM组77.5%，tws119 2.5μM组75.5%、tws119组5μM 76.5%。说明不同处理对NK细胞纯度基本没有影响。

实施例2 不同处理NK细胞脱颗粒

将实施例1中DMAO组、tws119 0.5μM、tws119 2.5μM组、tws119 5μM组的NK细胞调整细胞浓度为1×10⁶/mL，吸取200 μL细胞悬液，接入48孔板中；再分别加入200 μL浓度为1×10⁶/mL的RPMI8226细胞悬液；然后加入4 μL FITC-107a抗体，同时设置NK细胞对照和CD107a单染组，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养3.5h；染色后进行流式检测，结果如图2所示。根据结果可知，加入靶细胞刺激后CD107a表达，DMSO组为42.7%，tws119 0.5 μM组为45.1%，tws119 2.5 μM组为54.4%、tws119 5 μM组为59.9%。可见，tws119浓度为0.5 μM培养的NK细胞脱颗粒水平增加不明显，而浓度为2.5 μM、5 μM的tws119培养的NK细胞脱颗粒水平明显增加，杀伤骨髓瘤细胞功能明显提高。

实施例3 不同处理NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤

将实施例1中DMAO组、tws119 0.5μM、tws119 2.5μM组、tws119 5μM组的NK细胞调整细胞浓度为1×10⁶/mL，吸取200 μL细胞悬液，接入48孔板中；再分别加入200 μL浓度为1×10⁶/mL的pkh26染色RPMI8226细胞悬液；并设置对照组和pkh26单染组，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养4h；染色后进行流式检测，结果如图3所示：RPMI8226细胞裂解率分别为：DMSO组27.8%，tws119 0.5 μM组28.8%，tws119 2.5 μM组36.5%、tws119组5 μM40.2%。RPMI8226细胞裂解率反映出NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的水平，其中浓度0.5 μM的tws119培养的NK细胞杀伤骨髓瘤细胞功能没有明显提高，浓度2.5 μM、5 μM的tws119培养的NK细胞杀伤骨髓瘤细胞功能明显提高。

实施例4 不同处理NK细胞分泌γ-IFN水平

采用人γ-干扰素ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）检测不同处理NK细胞分泌γ-IFN水平：将实施例1中DMAO组、tws119 0.5μM、tws119 2.5μM组、tws119 5μM组的NK细胞调整细胞浓度为1×10⁶/mL，吸取200 μL细胞悬液，接入48孔板中；再分别加入200 μL浓度为1×10⁶/mL的RPMI8226细胞悬液，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养4h，离心获得上清液即为待测样。按照说明书进行操作，分别测定不同处理NK细胞的OD值，根据0-1000 pg/mL的标准品的浓度和OD值，进行回归拟合生成标准曲线，计算待测样中的γ-IFN浓度。

NK细胞上清中γ-干扰素分泌水平分别为：DMSO组798.0±34.19 pg/mL，tws119浓度2.5 μM组1266±37.25 pg/mL，tws119 5 μM组2379±157.4 pg/mL。与对照组相比，tws119组γ-干扰素分泌水平增加，其中浓度5 μM的tws119培养的NK细胞分泌γ-干扰素增加更为显著。

实施例5 不同处理NK-92细胞脱颗粒和对骨髓瘤细胞的杀伤

调整NK-92细胞至浓度为1×10⁶个/mL，种于6孔板中，每孔2mL细胞悬液，加入tws119 (终浓度分别为0.5μM、10μM、20μM)，同时设置加入DMSO的NK-92细胞作为对照组。置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养48h。洗涤重悬NK-92细胞至1×10⁶/mL，按照实施例2中的方式处理并检测细胞脱颗粒数，结果如图5。根据结果可知，加入靶细胞刺激后CD107a表达，DMSO组为27.4%，tws119 0.5 μM组为28.9%，tws119 10 μM组为43.2%、tws119 20 μM组为63.5%。可见，tws119浓度为0.5 μM培养的NK-92细胞脱颗粒水平增加不明显，而浓度为10 μM、20 μM的tws119培养的NK-92细胞脱颗粒水平明显增加，杀伤骨髓瘤细胞功能明显提高。

将DMAO组、tws119 0.5 μM、tws119 10 μM组、tws119 20μM组的NK-92细胞调整细胞浓度为1×10⁶/mL，吸取200 μL细胞悬液，接入48孔板中；再分别加入200 μL浓度为1×10⁶/mL的pkh26染色RPMI8226细胞悬液；并设置RPMI8226细胞对照和pkh26单染组，置于饱和湿度、37℃、5% CO₂恒温箱中培养4h；染色后进行流式检测，结果如图6所示：RPMI8226细胞裂解率分别为：DMSO组31.2%，tws119 0.5 μM组30.5%，tws119 10 μM组54.4%、tws119 20μM组64.8%。RPMI8226细胞裂解率反映出NK-92细胞杀伤骨髓瘤细胞的水平，其中浓度0.5 μM的tws119培养的NK-92细胞杀伤骨髓瘤细胞功能没有明显提高，浓度10 μM、20 μM的tws119培养的NK-92细胞杀伤骨髓瘤细胞功能明显提高。

Claims

1.一种提高骨髓瘤杀伤活性的NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：NK细胞中加入GSK-3β抑制剂共培养。

2.根据权利要求1所述的NK细胞制备方法，其特征在于，所述共培养的时间为24-48h。

3.根据权利要求1所述的NK细胞制备方法，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂包括但不限于TDZD-8、CHIR-99021和tws119。

4. 根据权利要求1所述的NK细胞制备方法，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂为tws119；所述共培养的浓度为2.5-20 μM/10⁶细胞。

5.根据权利要求1所述的NK细胞制备方法，其特征在于，所述NK细胞为从血液中分离获得、嵌合抗原受体NK细胞或商业化NK细胞系。

6.根据权利要求5所述的NK细胞制备方法，其特征在于，从血液中分离获得NK细胞的步骤如下：

7.根据权利要求1所述的NK细胞制备方法，其特征在于，所述NK细胞的纯度不低于75%。

8.一种如权利要求1-7任一所述NK细胞制备方法获得的NK细胞。

9.一种如权利要去8所述的NK细胞在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。