DE102005044102A1

DE102005044102A1 - Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch Aktivierung einer Anti-Tumor-Immunantwort

Info

Publication number: DE102005044102A1
Application number: DE102005044102A
Authority: DE
Inventors: Von Strandmann Elke Pogge; Andreas Engert
Original assignee: Engert Andreas Prof Dr; Pogge von Strandmann Elke Dr
Current assignee: Engert Andreas Prof Dr; Pogge von Strandmann Elke Dr
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2007-03-22

Abstract

Die Erfindung ist ein Mittel zur Behandlung des malignen Myeloms und anderer CD138 positiver Tumore, das durch die Aktivierung einer anti-Tumor-Immunantwort nach Stimulierung des NKG2D Rezeptors wirkt. Es handelt sich um eine physiologisch wirksame Menge des Proteins ULBP2/antiCD138 in einem annehmbaren Trägermaterial. DOLLAR A Außerdem kann die Erfindung auch zur Behandlung CD138 negativer Tumore nach dem identischen Prinzip verwendet werden. Hierzu wird der antiCD138 Anteil mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen ausgetauscht und das entsprechende Mittel wird zur Therapie von Tumoren eingesetzt, die dieses Tumorantigen exprimieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, mit einer physiologisch wirksamen Menge des Proteins ULBP2 in Verbindung mit einem tumorspezifischen Antikörperfragment, sowie die Verwendung von ULBP2, der dafür codierenden DNA und/oder RNA zur Herstellung solch eines Mittels.
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen des Menschen unter Verwendung des rekombinanten Proteins ULBP2, das über einen geeigneten Linker in Verbindung mit einem single chain Antikörperfragment des monoklonalen Mausantikörpers B-B4, der gegen das tumorspezifische Antigen CD138 gerichtet ist, synthetisiert wird.
ULBP2 ist ein zellulärer Ligand von NKG2D, der als aktivierender und co-aktivierender Immunrezeptor auf bestimmten Effektorzellen des Immunsystems (Natürliche Killer (NK)-Zellen, T Zellen) exprimiert ist. Der NKG2D Rezeptor ist ein zentraler Regulator der Aktivität von NK-Zellen, die als Bestandteil des innaten Immunsystems maligne Zellen erkennen, direkt bekämpfen und zur Bildung einer adaptiven Immunantwort gegen die Tumorzellen beitragen.
Die Stimulierung des NKG2D Rezeptors auf NK-Zellen kann durch Interaktion mit den korrespondierenden Liganden auf malignen Zellen erfolgen und die Lyse der Zielzellen auslösen.. Der homodimere C-type lektin-ähnliche NKG2D Rezeptor interagiert mit verschiedenen Liganden, die auf Tumorzellen exprimiert sind. Hierzu gehören (MHC)-class I-verwandte Moleküle MICA und MICB und die Glycosylphophatidylinositol (GPI)-verankerten UL16-bindenden Proteine (ULBPs), zu denen auch ULBP2 gehört (1–3). Bezüglich aller relevanten Strukturdaten wird auf die Veröffentlichungen und darin zitierte Arbeiten verwiesen.
Die Expression der NKG2D spezifischen Liganden auf Tumorzellen korreliert direkt mit ihrer Empfindlichkeit gegenüber NK-Zellen (4,5), so dass proteolytisches Shedding eine Strategie der Tumorzellen der Kontrolle durch das Immunsystem zu entkommen, darstellt (6–8).

So liegen bereits gentherapeutische prä-klinische Daten vor, die zeigen dass die Überexpression von NKG2D Liganden zur erfolgreichen Bekämpfung des entsprechenden Tumors durch das Immunsystem führt (9–11). Diese Aktivierung ist unabhängig von der Aktivität der inhibierenden NK-Rezeptoren, die normalerweise einen Angriff der NK-Zellen auf körpereigene Zellen verhindern (12).

Es besteht ein großer Bedarf an Therapien für Tumorpatienten, die geeignet sind eine anti-Tumor-Immunantwort des Patienten auszulösen. So sind in den letzten Jahren eine Vielzahl von immuntherapeutischen Strategien, vorwiegend basierend auf dem Einsatz von Antikörpern, entwickelt worden oder befinden sich zur Zeit in der klinischen Prüfung.

Überraschenderweise wurde nun nachgewiesen, dass der NKG2D Rezeptor auf NK-Zellen mit einem Fusionsprotein aus dem rekombinanten Liganden ULBP2 und einem Antikörperfragment zur Erkennung des tumorzell-Antigens CD138, stimuliert werden kann. So führt der Einsatz dieses rekombinanten Fusionsproteins in vitro zu einer Aktivierung von NK-Zellen und im Mausmodell zur Abstoßung von CD138 positiven Tumoren. Das rekombinante Fusionsprotein ULBP2/anti-CD138 soll daher therapeutisch eingesetzt werden, um eine Anti-Tumor-Immunantwort bei Patienten mit multiplem Myelom zu unterstützen. Das eingesetzte B-B4 single chain Antikörperfragment mit Spezifität für CD138 (Syndecan 1) ist grundsätzlich für diese Anwendung sehr gut geeignet. CD138 ist ein Mitglied der Syndecan Familie, Heparan-Sulfat-Proteoglycane, die eine Rolle für die Zelladhesion, Differenzierung und Proliferation spielen und ist vielfach auf den malignen multiplen Myelomzellen überexprimiert, während es auf anderen hämotopoetischen Zellen fehlt (13–17). Außerdem gibt es bisher noch keine befriedigende Therapieoption zur Behandlung des multiplen Myeloms. Die Lebenserwartung für betroffene Patienten beträgt nach Erstdiagnose nur wenige Monate.

Für bisher untersuchte lösliche Liganden des NKG2D Rezeptors, die noch in keinem Fall wie hier in Verbindung mit einem tumorzellspezifischen Antikörperfragment hergestellt wurden, ist anders als für ULBP2/antiCD138 keine Aktivierung einer anti-Tumor Immunantwort beschrieben (18–21).

Ein Targeting des NKG2D Rezeptors über seine Liganden ist bereits in verschiedenen gentherapeutischen Ansätzen im Mausmodell verfolgt worden (9–11). Der Vorteil unserer Erfindung ist, dass ein Gentransfer nicht erfolgen muss. Weiterer Vorteil ist die Gewinnung einer tumorzellspezifischen Antwort, da das ULBP2 Protein mit einem tumorspezifischen Antikörperfragment verbunden wird.

Gegenstand der Erfindung ist also ein Mittel zur Therapie von Patienten mit multiplen Myelom, bei dem eine physiologisch wirksame Menge des Proteins ULBP2/antiCD138 als Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial enthalten ist. Weitere mögliche Einsatzbereiche sind Tumore die wie das multiple Myelom durch eine Überexpression von CD138 gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel das Colon-, Lungen- oder Prostatakarzinom. Darüber hinaus ist der Ansatz des NKG2D Targetings mit ULBP2 auch für CD138 negative Tumore geeignet, vorrausgesetzt ein entsprechendes tumorzellspezifisches Antikörperfragment ist verfügbar, das anstelle des B-B4 single chains verwendet werden kann.

Das erfindungsgemäße Mittel enthält das eine Anti-Tumor-Immunantwort unterstützende Protein ULBP2/antiCD138 als Wirkstoff.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen enthält den Wirkstoff in einem üblichen pharmazeutisch annehmbaren und verträglichen Trägermaterial. Es kann sinnvoll sein, den Wirkstoff systemisch zu verabreichen, wie es beispielsweise bei der Interferon-Therapie der multiplen Sklerose oder auch zur Behandlung von Diabetes bekannt ist.

Weiter ist auf die Möglichkeit einer ex-vivo Anwendung im Rahmen von zellulären Immuntherapien verwiesen.

Es versteht sich, dass das Protein bzw die dafür codierende DNA und/oder RNA zur Lagerung und zur Vermeidung von vorzeitiger Wirkungsminderung stabilisiert werden kann. Die Stabilisierung kann durch Beimischung üblicher Zusätze erreicht werden, so z.B. Puffersubstanzen, Salze anderer Proteine wie auch von DNA und RNA erreicht werden. Beispiele sind Albumin, Heringsperma, DNA, tRNA und Detergentien wie Triton, Alkali- und Erdalkaliionen und dergleichen. Eine Lagerung des Mittels und/oder Wirkstoffs in getrockneter oder gefriergetrockneter Form oder nach Schockfrieren im flüssigen Stickstoff kann ebenfalls sinnvoll sein..

Das erfindungsgemäße Mittel kann den Wirkstoff selbstverständlich in modifizierter Form enthalten, d.h. als Protein, in dem einzelne Aminosäuren ausgetauscht sind oder fehlen. Voraussetzung ist, dass der so modifizierte Wirkstoff die von ihm verlangte Wirkung bei der Stimulierung der Immuneffektorzellen zur Behandlung von Patienten mit malignen Erkrankungen nach wie vor liefert. Gründe für solche Modifikationen können die Stabilisierung des Wirkstoffes, produkttechnische oder formulierungstechnische Gründe oder auch eine Verbesserung der Wirkung oder des Wirkungsspektrums sein. In Frage kommen Mutation und Fusion nach chemischen oder gentechnischen Methoden und Fusionierungen mit N- und C-terminalen Proteinen oder Peptiden. Dies kann beispielsweise zu einer Verbesserung der Halbwertszeit des Proteins führen. Aus Gründen einer besseren Reinigung mittels Affinitätschromatographie können z.B. Histidintags oder Gst-Fusionen vorgenommen werden. Durch Phosphorylierung oder Glykosilierung an geeigneten Resten können Modifikationen vorgenommen werden, die dem Abbau durch körpereigene Proteanen vorbeugen.

Zur Stabilisierung des Proteins kann es sinnvoll sein Änderungen vorzunehmen etwa auf der Ebene der DANN um beispielsweise Restriktionsstellen, chemische Instabilität oder Angriffspunkte von Nukleasen zu beseitigen.

Das Protein kann auf übliche Weise nach Klonierung des Gens in geeignete Vektoren rekombinant aus Bakterien oder Eukaryonten nach Standardmethoden erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch die Aktivierung der Immuneffektorzellen enthält den Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial, das einerseits aus mehreren üblichen Bestandteilen bestehen kann. Zweckmäßigerweise enthält das Trägermaterial wiederum ein für den Wirkstoff geeignetes Transfermedium. Das Mittel ist in erster Linie für die systemische Verabreichung und die ex-vivo Therapie im Rahmen von zellulären Immuntherapien vorgesehen.

Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher erläutert, in denen experimentell die Wirksamkeit des rekombinanten Proteins nachgewiesen wird.

1. ULBP2/antiCD138 verstärkt die Empfindlichkeit von multiplen Myelomlinien gegen die NK-zellabhängige Zelllyse.
NK-Zellen, die aus dem Blut von gesunden Spendern isoliert wurden, wurden als Effektorzellen in einem Europium Release Assay eingesetzt. Hierbei werden Targetzellen (humane Tumorzelllinien) mit Europium markiert und mit NK-Zellen in den angegebenen Effektor:Target Verhältnissen inkubiert. Anschließend wird im Überstand die Menge freigesetztes Europium bestimmt, die als Maß für die NK-vermittelte Zelllyse dient. Der Wert für eine 100% Lyse ergibt sich nach Inkubation der Zellen mit einem Detergenz, das zur Lyse führt. Zusätzlich wird die Spontanlyse berücksichtigt, die in Ansätzen ohne NK-Zellen ermittelt wird.
(A-C) Die NK-Zellen (Effektor) wurden für den Europium Release Assay in den angegebenen Verhältnissen mit den humanen multiplen Myelomlinien U266 (A) und RPMI-8226 (B), sowie mit der humanen Nierenzelllinie 293T (C) nach Zugabe von ULBP2/antiCD138 (5 μg/ml, gefüllte Kreise) oder dem B-B4 Fragment (5 μg/ml, offene Kreise) inkubiert. Es zeigt sich bei den CD138 positiven Zellen (U266, RPMI8226) eine verstärkte NK-zellabhängige Lyse. Diese ist spezifisch, da sie bei der CD 138 negativen Linie 293T nicht zu beobachten ist. Außerdem kann der Effekt durch einen NKG2D spezifischen Antikörper gehemmt werden. Analoge Ergebnisse zeigen primäre multiple Myelomzellen im heterologen und autologen Ansatz (NK-Zellen und Myelomzellen von einem Patienten).
2. ULBP2/antiCD138 zeigt beeindruckende Anti-Tumor Aktivität in einem Xenograft Nacktmausmodell für humane multiple Myelome.
Nacktmäuse mit subkutanen RPMI-8226 Tumoren wurden mit humanen peripheren Blutlymphozyten und ULBP2/antiCD138 (gefüllte Kreise), mit peripheren Blutlymphozyten (PBL, Dreiecke) oder gar nicht behandelt (Kontrolle, offene Kreise). Es zeigt sich, dass die Behandlung mit ULBP2/antiCD138 das Tumorwachstum vollständig verhindert.
Literatur

1. Bauer S, Groh V, Wu J, et al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science. 1999;285:727–729.
2. Cao W, He W. UL16 binding proteins. Immunobiology. 2004;209:283–290.
3. Cosman D, Mullberg J, Sutherland CL, et al. ULBPs, novel MHC class I-related molecules, bind to CMV glycoprotein UL16 and stimulate NK cytotoxicity through the NKG2D receptor. Immunity. 2001;14:123–133.
4. Pende D, Cantoni C, Rivera P, et al. Role of NKG2D in tumor cell lysis mediated by human NK cells: cooperation with natural cytotoxicity receptors and capability of recognizing tumors of nonepithelial origin. Eur J Immunol. 2001;31:1076–1086.
5. Pende D, Rivera P, Marcenaro S, et al. Major histocompatibility complex class I-related chain A and UL16-binding protein expression on tumor cell lines of different histotypes: analysis of tumor susceptibility to NKG2D-dependent natural killer cell cytotoxicity. Cancer Res. 2002;62:6178–6186.
6. Salih HR, Antropius H, Gieseke F, et al. Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia. Blood. 2003;102:1389–1396.
7. Salih HR, Rammensee HG, Steinle A. Cutting edge: down-regulation of MICA on human tumors by proteolytic shedding. J Immunol. 2002;169:4098–4102.
8. Groh V, Wu J, Yee C, Spies T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. Nature. 2002;419:734–738.
9. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Ectopic expression of retinoic acid early inducible-1 gene (RAE-1) permits natural killer cell-mediated rejection of a MHC class I-bearing tumor in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:11521–11526.
10. Diefenbach A, Jensen ER, Jamieson AM, Raulet DH. Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity. Nature. 2001;413:165–171.
11. Friese MA, Platten M, Lutz SZ, et al. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Res. 2003;63:8996–9006.
12. Moretta A, Bottino C, Vitale M, et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. Annu Rev Immunol. 2001;19:197–223.
13. Vooijs WC, Post J, Wijdenes J, et al. Efficacy and toxicity of plasma-cell-reactive monoclonal antibodies B-B2 and B-B4 and their immunotoxins. Cancer Immunol Immunother. 1996;42:319–328.
14. Dhodapkar MV, Sanderson RD. Syndecan-1 (CD 138) in myeloma and lymphoid malignancies: a multifunctional regulator of cell behavior within the tumor microenvironment. Leuk Lymphoma. 1999;34:35–43.
15. Wijdenes J, Vooijs WC, Clement C, et al. A plasmocyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol. 1996;94:318–323.
16. Wijdenes J, Dore JM, Clement C, Vermot-Desroches C. Cd138. J Biol Regul Homeost Agents. 2002;16:152–155.
17. Beauvais DM, Rapraeger AC. Syndecans in tumor cell adhesion and signaling. Reprod Biol Endocrinol. 2004;2:3.
18. Jamieson AM, Diefenbach A, McMahon W, Xiong N, Carlyle JR, Raulet DH. The role of the NKG2D immunoreceptor in immune cell activation and natural killing. Immunity. 2002; 17: 19–29.
19. Diefenbach A, Tomasello E, Lucas M, et al. Selective associations with signaling proteins determine stimulatory versus costimulatory activity of NKG2D. Nat Immunol. 2002;3:1142–1149.
20. Kriegeskorte AK, Gebhardt FE, Porcellini S, Schiemann M, Stemberger C, Franz TJ, Huster KM, Carayannopoulos LN, Yokoyama WM, Colonna M, Siccardi AG, Bauer S, Busch DH. NKG2D-independent suppression of T cell proliferation by H60 and MICA. 2005; 102: 11805–10.
21. Ehrlich LI, Ogasawara K, Hamerman JA, Takaki R, Zingoni A, Allison JP, Lanier LL. Engagement of NKG2D by cognate ligand or antibody alone is insufficient to mediate costimulation of human and mouse CD8+ T cells. J. Immunol. 2005; 174: 1922–31.

Claims

Mittel zur Behandlung des malignen Myeloms durch die Aktivierung einer anti-Tumor-Immunantwort nach Stimulierung des NKG2D Rezeptors, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine physiologisch wirksame Menge des Proteins ULBP2/antiCD138 in einem annehmbaren Trägermaterial enthält.
Mittel nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein den wirkstofftransportierendes Transfermedium enthält.
Mittel nach einen der Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass es als Injektionsformulierung vorliegt und eingesetzt wird.
Mittel nach einem der Ansprüche 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass es als Formulierung für eine ex-vivo Anwendung im Rahmen einer zellulären Immuntherapie bei Tumorpatienten vorliegt und eingesetzt wird.
Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Therapie von CD138 exprimierenden Tumoren eingesetzt wird, wie zum Beispiel Colon-, Lungen- oder Prostatakarzinom.
Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nach Austausch des antiCD138 Anteils mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen, zur Therapie von Tumoren eingesetzt wird, die dieses Antigen exprimieren.
Verwendung des Proteins ULBP2/antiCD138 als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
Verwendung der ULBP2 DNA und/oder RNA zur Herstellung von ULBP2/antiCD138 analogen Konstrukten in denen der CD138 bindende Anteils mit einem Antikörperfragment gegen ein beliebiges Tumorantigen als Wirkstoff zur Herstellung eines Mittels nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung von malignen Erkrankungen, die das betreffende Tumorantigen exprimieren.