DE69936538T2

DE69936538T2 - Neue methode zur erkennung eines stoffes, der die interaktion zwischen einem tnf-liganden und seinem rezeptor auf b-zellen moduliert

Info

Publication number: DE69936538T2
Application number: DE69936538T
Authority: DE
Inventors: Stuart Neville Glaxo Wellco Stevenage FARROW; Allard Glaxo Wellco Stevenage KAPTEIN; Jeremy David Alisdair Glaxo Wellco Stevenage KITSON; Alison Janet Glaxo Wellco Stevenage WINDER
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2019-10-06
Also published as: US8216576B2; US8784814B2; EP1847608B1; ES2621858T3; US20090098129A1; DE69936538D1; AU6332399A; ATE366812T1; US7399593B1; US20140056900A1; EP1141283A1; ES2289825T3; EP1847608A1; US20150197565A1; WO2000039295A1; EP1141283B1; GB9828628D0

Description

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Protein der TNF-Ligandensuperfamilie, Nukleotide, die dieses codieren, Vektoren und Wirtszellen, die diese enthalten, bereit, und darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Durchmusterung nach Modulatoren der Wechselwirkung zwischen dem Protein und seinem Rezeptor, und die Modulatoren zur Verwendung in der Therapie von verschiedenen Störungen, die uneingeschränkt Krebs, Entzündung, Infektion und Autoimmunstörung einschließen. Ebenfalls wird die direkte Verwendung des Liganden in der Therapie bereitgestellt, zum Beispiel gegen viralen Krankheiten oder als ein potentielles Impfstoffadjuvans.
15 andere Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie wurden bereits kloniert und publiziert, und für die meisten wurde gezeigt, daß sie an Zelloberflächenrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie binden. Die Interaktion zwischen einem TNF-Liganden und seinem Rezeptor ist das Schlüsselsignal, um eine Folge von Ereignissen einzuleiten, die zu einer Reihe von Antworten führt, die so facettenreich sind wie T-Zellproliferation, Apoptose und Induzierung der Cytokinproduktion. Einige Aktivitäten, wie zum Beispiel die Induzierung der T-Zellproliferation, sind üblich bei vielen Mitgliedern der Familie, während manche nur von wenigen geteilt werden, und andere sind einzigartig. Die Interaktion zwischen diesen Liganden und ihren Rezeptoren stellt ein attraktives Ziel für die Entwicklung neuer Therapien bereit.
Das Dokument WO 98/18921 beschreibt ein Mitglied der TNF-Proteinfamlie.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Protein bereit, das i) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der 1 umfaßt. Die Erfindung stellt ebenfalls ein isoliertes Protein bereit, das ein Polypeptid mit der in 2 bereitgestellten Aminosäuresequenz umfaßt. Das Protein mit der in 2 bereitgestellten Aminosäuresequenz ist aus Menschen erhältlich und ist ein Typ-II-Membranprotein mit einer Signaltransmembrandomäne nahe dem N-Terminus, das zwei potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen und eine Proteasespaltstelle enthält, die zwischen den Aminosäuren Arginin 133 und Alanin 134 liegt. Das Polypeptid mit der in 1 bereitgestellten Aminosäuresequenz ist löslich und bildet einen Teil der extrazellulären Region des Polypeptids, das die in 2 bereitgestellten Aminosäuresequenz besitzt. Vorzugsweise ist das Protein aus Säugetieren erhältlich, besonders bevorzugt aus Mäusen und Menschen, und am meisten bevorzugt aus Menschen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Protein bereit, das ein Polypeptid umfaßt, das die in 2 bereitgestellte Sequenz, ausgehend von der Aminosäure 134 fortschreitend, oder die in 6 bereitgestellte Sequenz, ausgehend von der Aminosäure 127 fortschreitend, besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Protein bereit, das ein Polypeptid umfaßt, das die in 2 bereitgestellte Sequenz, ausgehend von der Aminosäure 122 fortschreitend, besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Protein bereit, das ein Polypeptid umfaßt, das die in 6 bereitgestellte Sequenz, ausgehend von der Aminosäure 115 fortschreitend, besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein isoliertes Protein bereit, das ein Polypeptid mit der in 5 bereitgestellten Aminosäuresequenz umfaßt. Darüber hinaus stellt die Erfindung ein isolierte Protein bereit, das ein Polypeptid mit der in 6 bereitgestellten Aminosäuresequenz umfaßt. Das Protein mit der in 6 bereitgestellten Aminosäuresequenz ist aus Mäusen isolierbar und ist ein Typ-II-Membranprotein mit einer Signaltransmembrandomäne nahe dem N-Terminus, wobei das Protein eine potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstelle und eine Proteasespaltstelle enthält, die zwischen den Aminosäuren Arginin 126 und Alanin 127 liegt. Das Polypeptid mit der in 5 bereitgestellten Aminosäuresequenz ist löslich und bildet einen Teil der extrazellulären Region des Polypeptids mit der in 6 bereitgestellten Aminosäuresequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die die Wechselwirkung zwischen einem TNF-Ligandenprotein, das das Polypeptid der SEQ ID NO:1 umfaßt, und seinem Rezeptor, der auf B-Zellen exprimiert wird, moduliert, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens des Proteins und des Rezeptors in Gegenwart einer Testverbindung und das Überwachen auf Modulation der Wechselwirkung umfaßt.
Proteine der Erfindung, die aus Menschen isolierbar sind, und Proteine der Erfindung, die aus Mäusen isolierbar sind, sind hochgradig homolog, wobei sie eine 67%ige Aminosäureidentität über ihre gesamte Sequenz aufzeigen. In der C-terminalen Region, die an der Rezeptorbindung beteiligt ist, ist die Aminosäureidentität weitaus höher (87%). Ein signifikanter Unterschied zwischen Proteinen der Erfindung, die aus Menschen oder Mäusen isolierbar sind, ist das Vorkommen eines zusätzlichen Exons in der Maussequenz, das zusätzlich 31 Aminosäuren codiert, was die Gesamthomologie zwischen den beiden Proteinen reduziert.
Fragmente schließen Teile des Proteins ein, die ausreichend Identität zu dem ursprünglichen Protein beibehalten, um effektiv zum Beispiel in einer Durchmusterung zu sein.
Derivate schließen abweichende Formen der Proteinsequenz ein, die Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren haben können. Es ist selbstverständlich für einen Fachmann, daß bestimmte Substitutionen, Deletionen oder Additionen von Aminosäuren erzeugt oder in der Tat natürlich vorkommen können, ohne dabei die Funktion des Proteins substantiell zu verändern.
Analoga schließen uneingeschränkt Vorläuferproteine, die durch Spaltung des Vorläuferproteins aktiviert werden können um ein aktives reifes Protein herzustellen, oder ein Fusionsprotein mit einer Leader- oder sekretorischen Sequenz zur Hilfe bei der Aufreinigung ein.
Das Protein kann ein rekombinantes Protein, ein natürliches Protein oder ein synthetisches Protein sein.
Die Proteine können in allen Ausführungsformen in einer trimeren Form vorliegen, und solche Trimere bilden eine wie in Anspruch 1 definierte Ausführungsform der Erfindung. Die Proteine binden typischerweise als ein Trimer an ihren Rezeptor, wodurch das Nahebringen zweier oder mehrerer Rezeptormoleküle ermöglicht wird. Ein Trimer kann ein Heterotrimer sein, worin mehr als ein Untereinheitstyp vorliegt, oder es kann ein Homotrimer sein, worin alle Untereinheiten gleich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Antikörper bereit, die für das Protein der Erfindung spezifische sind. Der Begriff Antikörper wie hier verwendet schließt alle Immunglobuline und Fragmente davon ein, die Erkennungsstellen für antigene Determinanten von Proteinen der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, und können intakte Antikörpermoleküle oder Fragmente sein, die die aktive Bindungsregion des Antikörpers enthalten, z.B. Fab oder F(ab)₂. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Chimäre, einzelkettige und humanisierte Antikörper und Fusionsmoleküle mit Nicht-Immunglobulinmolekülen bereit. Verschiedene fachbekannte Verfahren können zum Herstellen solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Die Proteine oder Zellen, die diese exprimieren, können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper gegen diese herzustellen. Antikörper, die gegen das Protein erzeugt werden, können durch direkte Injektion des Polypeptids in ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann das Protein selbst binden. Auf diese Weise kann sogar ein Fragment des Proteins der Erfindung verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die das ganze native Protein binden.
Die Antikörper können verwendet werden, um das Protein der Erfindung in Gewebe, das das Protein exprimiert, zu lokalisieren. Sie sind ebenfalls zum Beispiel zur Aufreinigung eines Proteins nützlich, und entsprechend wird ein Verfahren zum Aufreinigen eines Proteins der Erfindung bereitgestellt, wobei das Verfahren die Verwendung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung umfaßt. Die Antikörper können ebenfalls selber als therapeutische Mittel verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Polynukleotid bereit, daß ein Protein der Erfindung codiert. Ebenfalls werden durch die Erfindung Antisense-Nukleotide oder Komplementärstränge bereitgestellt. Vorzugsweise codiert das Nukleotid ein Protein, das aus einer Maus oder einem Menschen isolierbar ist. Besonders bevorzugt umfaßt das isolierte Polynukleotid den Polynukleotidteil mit der Nukleotidsequenz, die in 3 dargestellt ist, die das in 1 gezeigte Polypeptid codiert, oder einen Komplementärstrang. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein isoliertes Polynukleotid bereit, das die in 4 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid der 2 codiert.
Die Nukleotidsequenz kann aus einer Zelle (vorzugsweise eine humane Zelle) durch Durchmustern mit einer Sonde, die von dem Protein abgeleitet ist, oder durch andere fachbekannte Methodiken isoliert werden, wie zum Beispiel Polymerasekettenreaktion (PCR) von z.B. genomischer DNA mit geeigneten Oligonukleotidprimern, die von dem Protein der Erfindung abgeleitet sind oder auf dessen Grundlage entworfen wurden. Eine bakterielle künstliche Chromosomenbibliothek kann unter Verwendung von Maus- oder Human-DNA für die Zwecke einer Durchmusterung erzeugt werden.
Die Nukleotidsequenzen können in der Form einer RNA oder in der Form einer DNA sein, zum Beispiel cDNA, genomischer DNA und synthetischer DNA. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz der Erfindung cDNA. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und, falls einzelsträngig, kann sie der codierende Strang oder nicht-codierende (antinsense) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das Protein der Erfindung codiert, kann identisch zu einer der in den Figuren dargelegten codierenden Sequenzen sein, oder sie kann eine andersartige codierende Sequenz sein, die als Resultat der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes das gleiche Protein wie die hier dargelegten Sequenzen codiert.
Eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert, kann folgendes einschließen: eine codierende Sequenz für das Protein; eine codierende Sequenz für das Protein und eine zusätzliche codierende Sequenz, wie zum Beispiel eine Leader- oder sekretorische Sequenz, oder eine Proproteinsequenz; eine codierende Sequenz für das Protein (und gegebenenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz) und nicht-codierende Sequenzen, wie zum Beispiel Introns oder nicht-codierende Sequenzen 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für das Protein voller Länge.
Die Erfindung stellt ebenfalls Nukleotidvarianten, Analoga, Derivate und Fragmente bereit, die ein Protein codieren. Nukleotide sind eingeschlossen, die vorzugsweise mindestens 65% Identität über ihre gesamte Länge zu dem Nukleotid mit der Sequenz der 3 haben. Besonders bevorzugt solche Sequenzen, die mindestens 75% Identität über ihre gesamte Länge zu dem Nukleotid mit der Sequenz der 3 haben. Ganz besonders bevorzugt sind Polynukleotide, die mindestens 90%, zum Beispiel 95%, 97%, 98% oder 99% Identität über ihre gesamte Länge zu dem Nukleotid mit der Sequenz der 3 aufzeigen.
Die Nukleotidsequenzen können ebenfalls die codierende Sequenz im Leseraster zu einer oder mehreren Markersequenzen fusioniert haben, die die Aufreinigung des Proteins der vorliegenden Erfindung ermöglichen, wie zum Beispiel ein FLAG-Epitop, eine myc-Sequenz oder ein sekretorisches Signal.
Die Nukleotidsequenzen können zum Herstellen des Proteins durch rekombinante Techniken eingesetzt werden. Daher kann die Nukleotidsequenz zum Beispiel in jedem aus einer Vielzahl von Expressionsvehikeln oder Klonierungsvehikeln eingeschlossen sein, insbesondere von Vektoren oder Plasmiden zum Exprimieren eines Proteins. Solche Vektoren schließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein. Beispiele für geeignete Vektoren schließen Derivate von bakteriellen Plasmiden; Phagen-DNA; Hefeplasmidvektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, und virale DNA ein. Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange diese im Wirt reproduzierbar und existenzfähig sind.
Ganz besonders stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls einen Vektor bereit, der eine oder mehrere der oben beschriebenen Nukleotidsequenzen umfaßt. Die Vektoren sind zum Beispiel ein Expressionsvektor, wie zum Beispiel ein Plasmid oder ein viraler Vektor, in den ein isoliertes Polynukleotid, in einer Vorwärts- oder Umkehrorientierung, eingefügt wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfaßt der Vektor ferner eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, um RNA-Synthese zu regeln, einschließlich zum Beispiel ein Promotor, der funktionsbereit mit der Sequenz verknüpft ist. Geeignete Promotoren schließen ein: CMV-, LTR- oder SV40-Promotor und andere Promotoren, für die bekannt ist, daß sie Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Vektor kann einen Enhancer und eine Ribosomenbindestelle für die Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator enthalten.
Eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren/Enhancern ist den Fachleuten bekannt, jedoch kann jedes Plasmid oder jeder Vektor, Promotor/Enhancer verwendet werden solange diese im Wirt reproduzierbar und funktionsfähig sind.
Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren, die mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten verwendet werden können, schließen Expressionsvektoren für Säugetiere, Expressionsvektoren für Insekten, Expressionsvektoren für Hefe, bakterielle Expressionsvektoren und virale Expressionsvektoren ein und werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A labaratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben. Ein bevorzugter Vektor ist pFLAG-CMV-1 oder pcDNA3.
Der Vektor kann ebenfalls geeignete Sequenzen für die Selektion und/oder Amplifikation der Expression einschließen. Hierfür umfaßt der Vektor einen oder mehrere phänotypische selektierbare/amplifizierbare Marker. Solche Marker sind ebenfalls den Fachleuten bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, die einen Vektor umfassen, und die in der Lage sind eine hier beschriebene Nukleotidsequenz zu exprimieren. Die Wirtszellen können zum Beispiel eine Zelle eines höheren Eukaryonten, wie zum Beispiel Säugetierzellen, oder eine Zelle eines niederen Eukaryonten, wie zum Beispiel eine Hefezelle, oder eine prokaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine bakterielle Zelle. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation schließen E. coli ein. Geeignete eukaryontische Wirte schließen HEK293T-Zellen und HeLa-Zellen ein.
Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zum Herstellen solcher Proteine unter Verwendung von RNAs, die von den oben beschriebenen DNA-Konstrukten abgeleitet sind, eingesetzt werden.
Routineverfahren können eingesetzt werden, um das Protein aus rekombinanten Zellkulturen aufzureinigen. Solche Verfahren sind für die Fachleute selbstverständlich.
Die Proteine und Nukleotidsequenzen werden in einer isolierten Form bereitgestellt. Der Begriff "isoliert" ist vorgesehen, um auszudrücken, daß das Material nicht in seinem nativen Zustand ist. Daher ist die natürlich vorkommende Nukleotidsequenz oder das natürlich vorkommende Protein, die/das in einem lebenden Tier vorliegt, in ihrem/seinem nativen Zustand und ist nicht isoliert, jedoch ist die gleiche Nukleotidsequenz oder das gleiche Protein, getrennt von einigen oder allen der Materialien, die mit dieser/diesem im natürlichen System coexistieren, isoliert. In gleicher Weise ist ein Protein, das durch synthetische Mittel hergestellt wurde, zum Beispiel durch rekombinante Verfahren, "isoliert". Solch eine Nukleotidsequenz kann Teil eines Vektors sein. Solch eine Nukleotidsequenz oder solch ein Protein kann Teil einer Zusammensetzung sein, und dennoch isoliert sein, als daß solch ein Vektor oder solch eine Zusammensetzung nicht Teil ihrer/seiner natürlichen Umgebung ist. Die Proteine und Nukleotidsequenzen werden ebenfalls vorzugsweise in aufgereinigter Form bereitgestellt, und sind vorzugsweise aufgereinigt zu mindestens 50% Reinheit, besonders bevorzugt ungefähr 75% Reinheit, am meisten bevorzugt 90% Reinheit oder höher, wie zum Beispiel 95%, 98% rein.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine in Durchmusterungsverfahren. Solche Verfahren identifizieren Verbindungen, die als Modulatoren der Wechselwirkung zwischen Proteinen und ihrem Rezeptor wirken. In allgemeiner Hinsicht umfassen solche Durchmusterungen das Inkontaktbringen eines Proteins, vorzugsweise in trimerer Form, und seines Rezeptors in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung, und das Messen der Zunahme oder Abnahme der Bindungsstärke, oder das Messen der Zunahme oder Abnahme in einer Antwort, zum Beispiel NF-κB-Aktivierung oder CD40-Aktivierung, wenn die Testverbindung vorliegt. Die hier beschriebenen Proteine können in Hoch-Durchsatz-Durchmusterungen verwendet werden, wodurch es ermöglicht wird, eine große Anzahl an Verbindungen zu untersuchen. Die Durchmusterungsverfahren der Erfindung sind im allgemeinen den Fachleuten wohlbekannt. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls in ihrem Schutzumfang solche Verbindungen ein, die durch die Durchmusterungsverfahren der Erfindung als Verbindung identifiziert wurden, die nützliche Aktivität besitzen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verbindungen bereit, die Modulatoren der Wechselwirkung zwischen einem Protein der Erfindung und seinem Rezeptor sind, zur Verwendung in der Therapie, zum Beispiel der Immuntherapie. Die Verbindungen werden zur Verwendung in der Behandlung von zum Beispiel einer Autoimmunerkrankung, einer Entzündung und anderen Erkrankungen, die mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB assoziiert sind, zum Beispiel rheumatoide Arthritis, neuronale Entzündung, Asthma, in der Behandlung von Krebsarten, in der Behandlung von Infektionen, wie zum Beispiel septischen Schock und in der Behandlung von Atherosklerose bereitgestellt. Die Verbindungen können Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors sein, an dem die Proteine der Erfindung binden, jedoch vorzugsweise sind sie Antagonisten. Die Verbindungen schließen zum Beispiel Aptamere, Polypeptide und kleine Moleküle ein.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung der Verbindungen, die durch die Durchmusterungstechniken der Erfindung identifiziert wurden, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung oder zur Prophylaxe von Störungen bereit, die auf die Modulation der Wechselwirkung zwischen dem Protein der Erfindung und seinem Rezeptor reagieren.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Behandlung einer Störung bereit, die auf die Modulation der Wechselwirkung zwischen dem Protein der Erfindung und seinem Rezeptor reagiert, wobei das Verfahren das Verabreichen einer effektiven Menge einer Verbindung, die durch die Durchmusterunstechniken der Erfindung identifizierbar ist, oder eine effektive Menge des Proteins der Erfindung an einen Patienten umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner das Protein der Erfindung zur Verwendung in der Therapie, zum Beispiel zur Verwendung in der Immuntherapie, insbesondere während viraler Infektionen, als ein Impfstoff oder als ein Impfstoffadjuvans bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung des Proteins der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Immuntherapie, zum Beispiel während viraler Infektionen, oder als ein Impfstoffadjuvans bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Behandlung einer Störung bereit, die auf eine angestiegene Menge des Proteins der Erfindung reagiert, das das Verabreichen einer effektiven Menge des Proteins der Erfindung an einen Patienten umfaßt.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine wie hier definierte Nukleotidsequenz zur Verwendung in der Gentherapie oder als einen Impfstoff bereit, zum Beispiel um die Produktion des Proteins der Erfindung in Störungen zu steigern, die auf eine angestiegene Menge des Proteins der Sequenz der 1 oder 2 reagiert. Ein Patient kann mit dem Nukleotid als ein nacktes Polynukleotid in der Form eines Expressionsvektors, wie zum Beispiel eines Plasmids oder mit einem viralen Vektor, der das Nukleotid umfaßt, oder mit einer Zelle, die das Nukleotid oder den Vektor umfaßt, versehen werden.
Komplementär- oder Antisense-Stränge der Nukleotidsequenzen der Erfindung können ebenfalls in der Gentherapie verwendet werden. Zum Beispiel könnte eine cDNA-Sequenz oder Fragmente davon in Gentherapiestrategien verwendet werden, um die Expression des Proteins herunterzuregeln. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Tripel-Helix-Formation einer Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide dieser Verfahren auf dem Binden einer Nukleotidsequenz an DNA oder RNA basiert.
Geeignete Techniken zum Einführen des nackten Polynukleotids oder Vektors in einen Patienten schließen eine topische Anwendung mit einem geeigneten Träger ein. Das nackte Polynukleotid oder der Vektor können zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exizpienten, wie zum phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), vorliegen. Eine Technik beinhaltet ein Partikelbombardement (das ebenfalls als "Gene Gun"-Technologie bekannt ist und im US-Patent Nr. 5371015 beschrieben ist). Hierbei werden inerte Partikel (wie zum Beispiel Goldperlen) mit einer Nukleinsäure beschichtet und auf Geschwindigkeiten beschleunigt, die es diesen ausreichend ermöglichen durch eine Oberfläche eines Empfängers (zum Beispiel Haut) zu penetrieren, zum Beispiel durch Ausstoß unter hohem Druck aus einer Projektierungsapparatur. Andere Verfahren der direkten Verabreichung der Nukleinsäure an einen Empfänger schließen Ultraschall, elektrische Stimulation, Elektroporation und Microseeding, die in US-5,697,901 beschrieben ist, ein.
Nukleinsäuremolküle können ebenfalls durch spezialisierte Zufuhrvektoren, die nützlich in der Gentherapie sind, verabreicht werden. Gentherapieansätze sind zum Beispiel durch Verme et al., Nature 1997, 389:239-242 diskutiert. Sowohl virale als auch nicht-virale Systeme können verwendet werden. Viral basierende Systeme schließen retroviral, lentiviral, adenoviral, adeno-assoziierte viral, Herpes viral und Vakzine viral basierende Systeme ein. Nicht-viral basierende Systeme schließen die direkte Verabreichung von Nukleinsäuren und Liposom-basierende Systeme ein.
Eine Nukleinsäuresequenz kann durch transformierte Zellen verabreicht werden. Solche Zellen schließen Zellen ein, die von einem Probanden entnommen wurden. Das nackte Polynukleotid oder der Vektor kann in solche Zellen in vitro eingeführt werden, und die transformierten Zellen können später in den Probanden zurückgeführt werden. Das Polynukleotid kann in eine Nukleinsäure, die bereits in einer Zelle vorliegt, durch homologe Rekombinationsereignisse integriert werden. Eine transformierte Zelle kann, falls erwünscht, in vitro kultiviert werden, und eine oder mehrere der daraus resultierenden Zellen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zellen können an einer geeigneten Stelle in einem Patienten durch bekannte chirurgische oder mikrochirurgische Techniken (z.B. Verpflanzung, Mikroinjektion, etc.) eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen bereit, die das Polypeptid, das Polynukleotid, den Vektor oder die transfizierte Zelle der Erfindung zusätzlich zu solchen umfaßt, die durch "Gene-Gun" verabreicht werden können. Daher können die Polypeptide in Kombination mit einem nicht-sterilen oder sterilen Träger oder Trägern zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie zum Beispiel ein pharmazeutischer Träger, der für die Verabreichung an einen Probanden geeignet ist. Solchen Zusammensetzungen umfassen zum Beispiel einen Mittelzusatz oder eine therapeutisch effektive Menge eines Polypeptids und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten. Solche Träger können uneingeschränkt Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die Formulierung sollte der Art der Verabreichung angepaßt sein.
Die Erfindung stellt ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits bereit, die eine oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzung der Erfindung gefüllt sind. Mit solchen Behältern kann eine Vorschrift durch eine Regierungsbehörde verbunden sein, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, die die Genehmigung der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs des Produkts für die Humanverabreichung durch die Behörde widerspiegelt.
Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie solche, die durch die oben beschriebenen Durchmusterungsverfahren identifizierbar sind, können alleine oder in Verknüpfung mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel therapeutische Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder effektiven, angenehmen Weise verabreicht werden, einschließlich zum Beispiel Verabreichung durch unter anderem topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einer Menge verabreicht, die effektiv zur Behandlung oder Prophylaxe einer speziellen Indikation oder spezieller Indikationen ist. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen in einer Menge von mindestens ca. 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden diese in einer Menge verabreicht, die nicht höher als ca. 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag ist. Vorzugsweise ist die tägliche Dosis in den meisten Fällen von ca. 10 μg/kg bis ca. 1 mg/kg Körpergewicht. Es ist verständlich, daß die optimale Dosierung für jede Behandlungsmodalität und Indikation durch Standardverfahren bestimmt wird, wobei die Indikation, jeder Ernsthaftigkeit, der Weg der Verabreichung, erschwerende Bedingungen und dergleichen berücksichtigt werden.
In der Therapie oder als ein Prophylaktikum kann der Wirkstoff an ein Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, zum Beispiel als eine sterile wäßrige Dispersion, vorzugsweise als eine isotonische Lösung.
Alternativ kann die Zusammensetzung zur topischen Anwendung zum Beispiel in der Form von Salben, Cremen, Lotionen, Augensalben, Augentropfen, Ohrtropfen, Mundwäsche, imprägnierten Verbänden, Nahtmaterialien und Aerosole formuliert sein, und können geeignete herkömmliche Zusätze enthalten, einschließlich zum Beispiel Konservierungsmittel, Lösungsmittel, die die Arzneimittelpenetration unterstützen, und erweichende Mittel in Salben und Cremen. Solche topische Formulierungen können ebenfalls kompatible konventionelle Träger enthalten, zum Beispiel Cremen- oder Salbenbasen, und Ethanol oder Oleylalkohol für Lotionen. Solche Träger können ca. 1 bis ca. 98 Gew.% der Formulierung darstellen, besonders üblich stellen sie bis zu ca. 80 Gew.% der Formulierung dar.
Zur Verabreichung an Säugetiere, und insbesondere an Menschen, wird erwartet, daß die tägliche Dosierungsmenge des Wirkstoffs von 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg sein wird, typischerweise ca. 1 mg/kg. Der Arzt wird bei jeder Begebenheit die eigentliche Dosierung, die für ein Individuum am geeignetsten ist, bestimmen, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des entsprechenden Individuums variieren. Die oben aufgeführten Dosierungen sind für den Durchschnittsfall exemplarisch. Es kann selbstverständlich einzelne Fälle geben, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche geleistet werden, und solche sind innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins der Erfindung bereit, wobei das Verfahren das Einführen eines Vektors, der ein hier definiertes Polynukleotid umfaßt, in eine geeignete Zellinie unter Bedingungen, die geeignet sind, eine Expression des Proteins zu erhalten, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen von Trimeren bereit, die das Protein der Erfindung umfassen, wobei das Verfahren das Einführen eines Vektors, der ein hier definiertes Polynukleotid umfaßt, in eine geeignete Zelllinie unter Bedingungen umfaßt, die geeignet sind, eine Expression des Proteins zu erhalten, und die es ermöglichen, daß das hergestellte Protein Trimere ausbildet.
Wie in Beispiel 6 gezeigt, bindet das Protein der Erfindung an B-Zelllinien, wie zum Beispiel die Kurkitt-Lymphoma-Zelllinie Raji, die B Lymphoma-Zelllinie ROMI 8866 und PRMI8826. Wie in Beispiel 7 gezeigt, bindet das Protein der Erfindung in Vollblutzubereitungen nur an B-Zellen, jedoch nicht an T-Zellen. Diese Beispiele bestätigen das Vorliegen des Rezeptors für das Protein der Erfindung auf B-Zellen, und unterstützt die Rolle des Proteins der Erfindung in der Regulation des Immunsystems und in den oben beschriebenen Krankheiten. Dies wird ebenfalls durch die Tatsache unterstützt, daß das Protein der Erfindung stark in Zellen und Geweben des Immunsystems exprimiert wird, wie in Beispiel 5 gezeigt.
Eines der ersten Ereignisse, die durch die meisten Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie induziert wird, ist die Aktivierung von NF-κB. Mukhopadhyay et al. (Journal of Biological Chemistry Bd. 274, issue 23, 4. Juni 1999, S. 15978-15981) haben gezeigt, daß das Protein der Erfindung NF-κB in einer dosis- und zeitabhängigen Weise aktivieren kann. Der verwendete Bereich der Dosierungen war 1 bis 1000 pM. Die Behandlung von Zellen mit wenigstens 1 pM des Proteins der Erfindung erzeugte einen Anstieg in der NF-κB-Aktivierung im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Aktivierung diese wichtigen Transkriptionsfaktors weist darauf hin, daß das Protein der Erfindung an der Aktivierung von entzündungsbetreffenden Stoffwechselwegen beteiligt sein kann, und Moleküle, die die Wechselwirkung des Proteins der Erfindung mit seinem Rezeptor modulieren, können daher in der Lage sein, die Aktivierung von NF-κB zu modulieren und sind deshalb nützlich in jeglichen Krankheiten, die auf die Modulation der Aktivitätsstärke von NE-κB reagieren, zum Beispiel Krankheiten des Immunsystems, wie zum Beispiel Autoimmunerkrankung, Entzündungserkrankungen, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, neuronale Entzündung und Asthma und die proliferativen Krankheiten, wie zum Beispiel Krebs. Mukhophadhyay et al. haben ferner gezeigt, daß die Aktivierung von NF-κB durch Antikörper, die spezifisch für das Protein der Erfindung sind, im gleichen System inhibiert werden kann. Gemäß Mukhophadhyay et al. wurde das Protein der Erfindung mit spezifischen Antikörpern vor dessen Verwendung im Behandeln von Zellen inkubiert. Im Gegensatz zu dem vorherigen Experiment wurde eine reduzierte Aktivierung von NF-κB beobachtet.
Es wird postuliert, daß die Gegenwart des Antikörpers das Binden des Proteins der Erfindung an seinen Rezeptor beeinflußt, wodurch die Erzeugung eines Signals und die folgliche Reduzierung der NF-κB-Aktivierung verhindert wird. Diese Feststellungen weisen darauf hin, daß andere Verbindungen, zum Beispiel kleine Moleküle, die die Wechselwirkung zwischen dem Protein der Erfindung und seinem Rezeptor modulieren, in einer Durchmusterung identifiziert und verwendet werden können, die NF-κB-Aktivierung und andere Stromabwärts-Effekte zu modulieren.
In Beispiel 9 zeigen Experimente zur chromosomalen Lokalisierung, daß das Gen, das das Protein der Erfindung codiert, auf dem humanem Chromosom 13, Region a33, kartiert ist. Keine anderen Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie wurden in dieser Region kartiert. Abnormalitäten in diesem Lokus wurden in Burkitt Lymphoma als der zweithäufigste Defekt charakterisiert (Berger et al., Genes Chromosomes Cancer, 1:115-118). Ebenfalls wie in Beispiel 6 gezeigt, bindet das Protein der Erfindung stark an die Burkitt-Lyphoma-Zelllinie Raji, und Schneider et al. (Bezugnahme wie oben) haben gezeigt, daß die lösliche Form des Proteins der Erfindung stark an andere Burkitt-Lymphoma-Zelllinien bindet, wie zum Beispiel BJAB, Namalawa, Ramos und JIYOYE.
Mukhophardhy et al. (Bezugnahme wie oben) haben gezeigt, daß das Protein der Erfindung in der Lage ist, das Wachstum von humanen Tumorzelllinien zu inhibieren. Die Aktivierung von NF-κB ist eine frühe zelluläre Antwort, die im allgemeinen durch cytotoxische Effekte auf Tumorzellen gefolgt wird. Durch Behandeln verschiedener Zelllinien mit dem Protein der Erfindung und durch deren Untersuchung auf Lebensfähigkeit, waren die Autoren in der Lage zu zeigen, daß eine dosisabhängige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart des Proteins der Erfindung vorliegt. Dies wurde für eine humane histocytische Lymphomazelllinie, für eine Prostatakrebszelllinie, für eine Darmkrebszelllinie, für eine Gebärmutterhalscarcinomazelllinie und für eine Brustcarcinomazelllinie gezeigt.
Diese Tatsachen deuten darauf hin, daß das Protein der Erfindung eine wichtige Rolle in der Regulierung der Tumorentwicklung spielen kann, und daß Moleküle, die die Wechselwirkung des Proteins der Erfindung mit seinem Rezeptor modulieren können, nützlich in der Behandlung von Krebs sein können. Ebenfalls kann das Protein der Erfindung selbst in seiner Membrangebundenen oder seiner löslichen Form in der Behandlung von Krebs nützlich sein.
Schneider et al. (Journal of Experimental Medicine, Band 189, Nr. 11, 7. Juni 1999, S. 1747-1756) haben gezeigt, daß das B-Zell-Wachstum durch das Protein der Erfindung voller Länge (d.h. die Membran-gebundene Form) als auch durch die lösliche Form des Proteins der Erfindung co-stimuliert werden kann. Daher kann jede der Formen in der Therapie verwendet werden oder kann die Basis für eine Durchmusterung auf kleine Moleküle, die die Wechselwirkung zwischen dem Protein der Erfindung und seinem Rezeptor modulieren können, bilden.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1 zeigt die Sequenz ID NO 1 – die Aminosäuresequenz der löslichen humanen Form des Proteins der Erfindung. Die Rezeptorbindungsstellen sind in fettgedruckt angegeben, und potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind mit einem Punkt markiert.
2 zeigt die Sequenz ID NO 2 – die Aminosäuresequenz der humanen Membran-gebundenen Form des Proteins der Erfindung, die in sich die lösliche Form des SEQ ID NO:1 umfaßt. Erläuterungen sind wie für 1. Die Transmembransequenz ist unterstrichen.
3 zeigt die Sequenz ID NO 3 – die cDNA Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 codiert, angeglichen an die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1. Rezeptorbindungsregionen sind eingerahmt, und potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind mit einem Punkt markiert.
4 zeigt die Sequenz ID NO 4 – die cDNA-Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 codiert, angeglichen mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2. Erläuterungen sind wie für 3. Die Transmembransequenz ist unterstrichen.
5 zeigt die Sequenz ID NO 5 – die Aminosäuresequenz der löslichen Mausform des Proteins der Erfindung. Die N-verknüpfte Glycosylierungsstelle ist mit einem Punkt markiert.
6 zeigt die Sequenz ID NO 6 – die Aminosäuresequenz der murinen Membran-gebundenen Form des Proteins der Erfindung. Erläuterungen sind wie für 5. Die Transmembranregion ist unterstrichen.
7 zeigt die Sequenz ID NO 7 – die cDNA-Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 codiert, angeglichen an die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5. Erläuterungen sind wie für 5.
8 zeigt die Sequenz ID NO 8 – die cDNA-Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:6 codiert, angeglichen an die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:6. Erläuterungen sind wie für 6.
9 zeigt eine Angleichung zwischen den murinen und humanen Formen der Form voller Länge des Proteins der Erfindung. (SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:6)
10 zeigt die Analyse der Induktion von CD40 in Gegenwart (schartiert) oder in Abwesenheit (nicht schartiert) der rekombinanten löslichen humanen Form des Proteins der Erfindung (A) oder IL-4(B).
11 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der gewebespezifischen Expression des Proteins der Erfindung in normalen murinen (A) und humanen Tumorzelllinien (B). (B) Gewebe.
12 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der gewebespezifischen Expression des Proteins der Erfindung in einem immunbezogenen Gewebe (A) und humanen Tumorzelllinien (B).
13 zeigt Zellbindungsdaten von FLAG-sD7 (wie nachfolgend in Beispiel 3 definiert). Die schartierte Fläche bezeichnet das Binden an die B-Zell-Lymphomazellline RPMI8866. In Abwesenheit von FLAG-sD7 ist kein Binden zu beobachten (gestrichelte Linie).
14 zeigt das Binden von FLAG-sD7 an CD19+ B-Zellen (A) und CD3+-Zellen (B) im Vollblut, darlegend, daß die Bindungsspezifität nur für B-Zellen vorliegt.
15 zeigt eine Gelfiltration von rekombinantem FLAG-sD7 und die nachfolgende SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen, die Protein enthielten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die lösliche Form des Proteins der Erfindung in der Lage ist zu trimerisieren.
In den ganzen Beispielen:
wird das Protein mit der in 1 dargelegten Aminosäuresequenz als löslicher D7-Ligand bezeichnet, und das Protein mit der in 2 dargelegten Aminosäuresequenz wird als D7-Ligand bezeichnet.
Beispiel 1: Verwendung des löslichen D7-Liganden in einer Durchmusterung zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen dem D7-Liganden und seinem Rezeptor modulieren
Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Costar RIA/EIA Hoch-Bindungsplatten werden mit Ziegen-Anti-Mensch-IgG (Sigma 13382) bei 2 μg/ml in PBS über Nacht beschichtet. Der Beschichtungsantikörper wird entfernt und die Platten für mindestens 2 Stunden in PBS/2% (G/V) BSA blockiert. Die Platten werden dann dreimal mit PBS/0,1% (V/V) Tween20 gewaschen.
100 μl Rezeptor/Fc (1 μg/ml) in PBS/1% (G/V) BSA/0,1% (V/V) Tween20 wird hinzugegeben, und die Platten werden für 1 Stunde inkubiert. Die Platten werden 5-mal mit PBS/0,1% (V/V) Tween20 gewaschen.
Verdünnungen in PBS/1% BSA/0,1% Tween20 des Biotin-löslicher D7-Ligand werden hinzugegeben, und die Platten werden für eine Stunde inkubiert. Die Platten werden 5-mal mit PBS/0,1% (V/V) Tween20 gewaschen.
Streptavidin-alkalische Phosphatase (1:1000) (Amersham RPN1234) wird hinzugegeben und die Platten für 1 Stunde inkubiert. Die Platten werden 5-mal mit PBS/0,1% (V/V) Tween20 gewaschen.
Binden wird unter Verwendung von Life Technologies-Amplifizierungslösungen (19589-019) detektiert.
Beispiel 2: Eine zellbasierende Durchmusterung zum Identifizieren von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen dem löslichen D7-Liganden und seinem Rezeptor modulieren
Ein allgemeines Protokoll für die Verwendung einer zellbasierenden Durchmusterung zum Identifizieren von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen dem löslichen D7-Liganden und einem Rezeptor modulieren, ist wie folgt:
Eine B-Zelllinie, für die bekannt ist, daß sie an den D7-Liganden bindet und auf diesen reagiert, wird exemplarisch mit einem rekombinanten löslichen humanen D7-Liganden (z.B. FLAG-shD7 wie nachfolgend exemplifiziert) für eine definierte Zeit behandelt.
Die Zellen werden geerntet und die Antwort untersucht (die Antwort kann eventuell Proliferation, Apoptose, NF-κB-Aktivierung oder Cytokinproduktion sein). Der Test ermöglicht die Bestimmung ob die Zugabe von Verbindungen die Induktion einer Antwort in Zielzellen inhibiert.
Ein spezifisches Beispiel ist wie folgt:
Löslicher D7-Ligand hochreguliert CD40
L3055 Burkitt-Lymphomazelllinie wurde auf einer Feeder-Schicht humaner fötaler Fibroblastenzellen (HFF515) in L3-Medium (RPMI1640 + 10% Serum Supreme + Antibiotika) kultiviert. HEK293-Zellen wurden in DMEM, das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika zugesetzt war, kultiviert. L3055-Zellen wurden entweder mit Kontrollmedium (vier Teile L3-Medium plus ein Teil HEK 293T-Zellüberstand) oder mit sD7-Medium (vier Teile L3-Medium plus ein Teil Zellüberstand von HEK293T-Zellen, die 24 Stunden nach transienter Transfektion mit sD7 geerntet wurden) oder mit IL-4 (Kontrollmedium plus 200 U/ml rekombinantem humanen IL-4 [Sigma]) behandelt und bei 37°C für 72 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und einmal in Bindungspuffer gewaschen, gefolgt von Anfärben mit FITC-konjugiertem Maus-Anti-Mensch-CD40 (Transduction Laborstories) bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden dann zweimal in Bindungspuffer gewaschen, bevor sie durch Durchflußcytometrie analysiert wurden. Die Induktion von CD40 wurde nach Behandlung mit sD7 für 72 Stunden im Vergleich zu der Kontrolle beobachtet. Dieser Test wird wiederholt in Gegenwart eines Moleküls, das die Induktion der Antwort in den Zielzellen inhibiert oder steigert, und die Resultate werden verglichen. Inhibierung/Anstieg der Antwort kann eindeutig gezeigt werden. Das Endergebnis der CD40-Hochregulierung ist, daß B-Zellen für Wachstum und Differenzierung signalisiert sind. Daher unterstützt dieses Experiment eine Rolle des D7-Liganden in der Leitung von Immunantworten und in Krankheiten des Immunsystems, wie zum Beispiel in einer Entzündung.
Beispiel 3: Synthese und Aufreinigung des löslichen D7-Liganden
Eine Nukleinsäure, die den löslichen humanen D7-Liganden codiert (Aminosäuren 133 bis 285), wurde durch PCR unter Verwendung von klonierten offenen Leseraster voller Länge als Template erzeugt.
Eine Nukleinsäure, die den löslichen humanen D7-Liganden codiert, wurde in einen pFLAG-CMV-1-Vektor (Kodak) (enthaltend einen CMV-Promotor, eine Präprotrypsin-Leadersequenz, ein aminoterminales FLAG-Epitop und eine humane Wachstumshormonpoly-A-Zusatz-Sequenz) kloniert, um das Konstrukt pFLAG-CMV-1-hsD7 zu bilden.
5 × 10⁶ HEK 293T-Zellen wurden in 250 μl Cyto-Gemisch (120 mM KCl; 0,15 mM CaCl₂; 10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7,6, 25 mM Hepes, pH 7,6; 2 mM EGTA, pH 7,6; 5 mM MgCl₂; 2 mM ATP; 5 mM Glutathion; pH mit KOH eingestellt), das 25 μg pFLAG-CMV-2-hsD7 enthält, resuspendiert. Die Transfektion wurde unter Verwendung eines BioRad Gene-Pulsers (96 μF, 270 V) durchgeführt.
Nach erfolgter Transfektion wurden die Zellen auf Eis für 10 Minuten belassen und dann in einer 75 cm²-Gewebekulturflasche überführt, die 15 ml Medium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (5 μg/ml) und Streptomycin (5 μg/ml)) enthielt. Das Medium, das den sekretierten Liganden enthielt, wurde nach 48 h geerntet und auf eine Affinitäts-Chromatographiesäule geladen, die Anti-FLAG-M2-Antikörper gekoppelt an Agarose (Kodak) enthielt. Dies wurde mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) gewaschen, und Fraktionen wurden in 0,1 M Citratpuffer (pH 2,5) eluiert. Die Fraktionen wurden sofort mit 0,2 Volumina 1M Tris HCl (pH 7,6) neutralisiert.
Die Fraktionen, die einen humanen löslichen D7-Liganden enthielten, der an das FLAG-Epitop (FLAG-hsD7) geknüpft war, wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von M2-Anti-FLAG-Antikörper identifiziert. Diese Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung einer Centricon Plus-20 (NWML 500)-Säule (Millipore) aufkonzentriert. Der FLAG-hsD7-Ligand wurde bei –70°C gelagert.
Beispiel 4: Synthese und Aufreinigung des D7-Liganden
Das offene Leseraster des humanen D7-Liganden wird in einen pcDNA3-Vektor (enthaltend einen CMV-Promotor und ein bovines WachstumshormonpolyA-Zusatz-Signal) kloniert, um das Konstrukt pcDNA3-hD7 zu bilden.
Das Plasmid pcDNA3-hD7 wird transient durch Elektroporation in HEK 293T-Zellen transfiziert (Protokoll wie in Beispiel 3).
Zellen werden nach 48 h geerntet und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators in drei Volumina des Proteinextraktionspuffers (25 mM Hepes, pH 7,4, 0,5% Triton-X-100, 1 "Complete"-Protease-Inhibitor-Coctailtablette (Boehringer Mannheim) pro 50 ml Puffer) homogenisiert.
Der D7-Ligand wird durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines Anti-D7-Antikörpers gekoppelt an Agarose aufgereinigt.
Beispiel 5: Northern Blot-Analyse der Gewebeverteilung des D7-Liganden
cDNA, die für den humanen D7-Liganden codiert, wurde aus pCDNA3-hD7 (siehe Beispiel 4) mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI ausgeschnitten. Dieses cDNA-Fragment wurde mit ³²P dCTP unter Verwendung des Amersham Ready-Prime-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. Ein 5 μl-Aliquot dieses Gemischs wurde mit 10 ml Expresshyb-Lösung (Clontech 8015-1) gemischt, und das resultierende Gemisch wurde mit einem der folgenden Clontech-Blots für 2 Stunden bei 65°C unter Schütteln inkubiert: Maus (#7762-1), Mensch-1 (#7760), humane Krebszelllinie (#7757) oder humanes Immunsystem II (#7768-1); die Sondenlösung wurde dann entfernt und der Blot ausreichend mit 2 × SSC (Salinenatriumcitrat), 0,05% SDS bei Raumtemperatur für 3-mal 20 Minuten gewaschen, gefolgt von einer Wäsche mit 0,1 SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur. Der Blot wurde dann einem Kodak XAR-5-Film bei –70°C für 48 Stunden ausgesetzt.
Die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse zeigen, daß die D7-Ligand-RNA im Herzen, in der Lunge, in der Milz, in der Niere und im Skelettmuskel, jedoch nicht im Gehirn, sowohl in Mäusen (11A) als auch in Menschen (11B) exprimiert wird. Ein Blot von immunbezogenen Geweben zeigt starke Expression der D7-Ligand-RNA in der Milz, im Lymphknoten, im Thymus, im Blinddarm, im Knochenmark und in Leukozyten des peripheren Bluts (12A), was dessen potentielle Rolle als ein Regulator der Immunsystemfunktion unterstützt. Die Analyse von RNA aus einer Anzahl von humanen Tumorzelllinien zeigt die Expression der D7-Ligand-RNA in HL-60 promyelotischen Leukämiezellen, jedoch nicht in einer Anzahl von anderen Tumorzelllinien (12B). Die Gegenwart des D7-Liganden in einer leukämischen Zelllinie unterstützt ebenfalls die Tatsache, daß der D7-Ligand an der Regulierung des Immunsystems und in Störungen beteiligt ist.
Beispiel 6: Detektion der Zelloberflächenbindung von FLAG-sD7
10⁶ Zellen wurden mit 50 ng FLAG-hsD7-Liganden (siehe Beispiel 3) in Bindungspuffer (PBS/2,5% FCS/0,1% Natriumazid) für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einmaligem Waschen in Bindungspuffer wurden die Zellen mit 1 μg Anti-FLAG-M2-Antikörper für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden einmal in Bindungspuffer gewaschen, dann mit 150 μg Phycoerythrin-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erfolgtem zweimaligem Waschen in Bindungspuffer wurde eine Durchflußcytometrie unter Verwendung eines Coulter-XL-Benchtop-Durchflußcytometers durchgeführt, und die Daten wurden für 10⁴ lebensfähige Zellen gesammelt.
Die Ergebnisse für ein solches Experiment sind in 13 gezeigt. Es wurde kein signifikantes Signal detektiert, wenn jedes der getesteten Zelllinien mit Anti-FLAG-M2-Antikörper und R-Phycoerythrin-konjugiertem zweiten Antikörper alleine behandelt wurden, jedoch zeigt das Signal nach vorheriger Behandlung mit FLAG-sD7 eindeutig, daß FLAG-hsD7 an die B-Lymphoma-Zelllinie RPMI 8866 bindet. Experimente mit anderen Zelllinien haben gezeigt, daß FLAG-hsD7 zwei andere B-Zelllinien (RPMI 8226 und Raji), jedoch nicht an die T-Zelllinien H9 und Jurkat oder die myelomonocytischen Abstammungslinien HL-60, U937 oder THP-1 bindet. Diese Ergebnisse zeigen, daß die extrazelluläre Domäne des humanen D7-Liganden an B-Zellen bindet, was seine potentielle Rolle in der Regulation des Immunsystems unterstützt, und ebenfalls darauf hinweist, daß die Expression des D7-Rezeptors auf B-Zellen beschränkt ist.
Beispiel 7: Detektion der Zelloberflächenbindung von Flag-sD7 im Vollblut
Vollblut von gesunden Freiwilligen wurde 1:10 mit 3,8% (G/V) Natriumcitrat verdünnt. 100 μl wurden in jedem Bindungstest verwendet. Die Zelloberflächenbindung von FLAG-sD7 wurde wie in Beispiel 6 detektiert, mit der Ausnahme, daß der zweite Antikörper Alexa-788-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Molecular Probes) war und daß nach einmaliger Wäsche Zellen mit 1 μg PE-konjugiertem Maus-Anti-Mensch-CD3 (Becton Dickinson) oder PE-konjugiertem Maus-Anti-Mensch-CD19 (Coulter-Immunotech) inkubiert wurde. Dieses Experiment bestätigt die Spezifität der Bindung von FLAG-sD7, was in Beispiel 6 gezeigt wurde. Aus 13 wird ersichtlich, daß, obwohl sowohl B-Zellen als auch T-Zellen vorlagen, FLAG-sD7 nur die CD19+-B-Zellen (14A), jedoch nicht die CD3+-T-Zellen (14B) gebunden hat. Dies bestätigt die Spezifität der Bindung an B-Zellen, wie mit Zelllinien zu sehen, und weist erneut darauf hin, daß die Expression des D7-Rezeptors auf B-Zellen beschränkt ist.
Beispiel 8: FLAG-sD7 ist in der Lage zu trimerisieren
Aufgereinigter rekombinanter FLAG-sD7 wurde auf einer Superose-12-Säule (Pharmacia) fraktioniert. Die Proteine wurden in PBS eluiert, und Fraktionen (1 ml) wurden durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-FLAG-M2-Antikörpers (Sigma) analysiert. Die Säule wurde mit Standardproteinen kalibriert: Apoferritin (443 kDa), b-Amylase (200 kDa), ADH (150 kDa), BSA (66 kDa), Carboanhydrase (29 kDa) und Cytochrom C (12,5 kDa). 15A zeigt die Flution von der Säule. 15B zeigt die elektrophoretisch auf einem SDS-PAGE aufgetrennten Fraktionen, die die Peaks wie in 15A gezeigt enthielten. SDS-PAGE-Marker sind auf der linken Seite und weisen darauf hin, daß das denaturierte Protein bei ungefähr 22 kDa läuft. Die Marker am oberen Ende des Gels sind die Standardproteine, die für die Kalibrierung der Säule verwendet wurden, und zeigen, daß FLAG-sD7 in die Gelfiltrationsfraktionen eluiert, die mit einem Molekulargewicht von ungefähr 70 bis 25 kDa korrespondieren. Diese Experimente zeigen, daß FLAG-sD7 in der Lage ist, ein Homotrimer mit einem Molekulargewicht von ungefähr 3 × 22 kDa aufzubauen.
Beispiel 9: FISH-Kartierung des D7-Liganden
Lymphozyten, die aus humanen Blut isoliert wurden, wurden in einem a-Minimal-Essential-Medium (a-MEM) ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum und Phytohämagglutinin bei 37°C für 68 bis 72 Stunden kultiviert. Die Lymphozytenkulturen wurden mit BrdU (0,18 mg/ml, Sigma) behandelt, um die Zellpopulation zu synchronisieren. Die synchronisierten Zellen wurden dreimal mit serumfreien Medium gewaschen, um die Blockierung freizusetzen, und bei 37°C für 6 Stunden in a-MEM mit Thymidin (2,5 μg/ml, Sigma) rekultiviert. Die Zellen wurden geerntet, und Objektträger wurden unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt, einschließlich hypotonischer Behandlung, Fixierung und Lufttrocknung.
Die Objektträger wurden bei 55°C für 1 Stunde gebacken. Nach RNase-Behandlung wurden die Objektträger in 70% Formamid in 2 × SSC für 2 min bei 70°C denaturiert, gefolgt von Dehydrierung mit Ethanol. D7-D27-DNA-Sonde, die die D7-cDNA voller Länge ist (wie gezeigt in 4, plus 150 Nukleotide der 5'-nicht-translatierten Region und 50 Nukleotide der 3'-nicht-translatierten Region), wurde mit dATP biotinyliert, und die Proben wurden bei 75°C für 5 Minuten in einem Hybridisierungsgemisch hybridisiert, das aus 50% Formamid und 10% Dextransulfat bestand. Die Proben wurden auf die denaturierten chromosomalen Objektträger geladen. Nach Über-Nacht-Hybridisierung wurden die Objektträger gewaschen und detektiert sowie amplifiziert. FISH-Signale und das DAPI-Bandenmuster wurden separat durch Photographie aufgezeichnet, und die Zuordnung der FISH-Kartierungsdaten mit den chromosomalen Bandenmustern wurde durch Superüberlagerung der FISH-Signale mit den DAPI-gebänderten Chromosomen erreicht. Das DAPI-Bandenmuster zeigte, daß das Signal dem humanen Chromosom 13 zugeschrieben ist, und die FISH-Ergebnisse dieses ferner der Region q33 zuschrieben.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen einem TNF-Ligandenprotein, das das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 umfaßt, und seinem Rezeptor, der auf B-Zellen exprimiert ist, moduliert, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens des Proteins und des Rezeptors in Gegenwart einer Testverbindung und das Überwachen auf Modulation der Wechselwirkung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protein in einer trimeren Form ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Protein in einer homotrimeren Form ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Rezeptor auf einer B-Zelle exprimiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus RPMI 8866, RPMI 8226 und Raji besteht.
Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Testverbindung ein kleines Molekül, ein Aptamer oder ein Polypeptid ist.