DE69824755T2

DE69824755T2 - Cytokinähnliches polypeptid-10 aus säugetieren

Info

Publication number: DE69824755T2
Application number: DE69824755T
Authority: DE
Inventors: C. Darrell CONKLIN; A. Betty HALDEMAN; Angelika Grossmann
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2018-11-26
Also published as: EP1424393A3; EA010741B1; HUP0100436A3; KR100574387B1; NO326561B1; JP2001524313A; EP1424393A2; CA2312000A1; EA200000565A1; AU739420B2; HUP0100436A2; BR9814904A; HU227703B1; EP1032671A1; CN1618969A; ATE269902T1; JP5191619B2; NZ504751A; ES2218872T3; WO1999027103A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Proliferation und Differenzierung von Zellen multizellulärer Organismen werden durch Hormone und Polypeptidwachstumsfaktoren kontrolliert. Diese diffusionsfähigen Moleküle ermöglichen Zellen, miteinander zu kommunizieren und gemeinsam zu agieren, um Zellen und Organe zu bilden und um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu regenerieren. Beispiele von Hormonen und Wachstumsfaktoren schließen Steroidhormone (z. B. Östrogen, Testosteron), Parathyroidhormon, Follikel stimulierendes Hormon, Interleukine, den Platelet Derived Growth Factor (PDGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF), Erythropoietin (EPO) und Calcitonin ein.
Hormone und Wachstumsfaktoren beeinflussen den zellulären Metabolismus durch Binden an Proteine. Proteine können integrale Membranproteine sein, die mit Signalwegen innerhalb der Zelle wie Second Messenger Systemen gekoppelt sind. Andere Proteinklassen sind lösliche Moleküle.
Von besonderem Interesse sind Cytokine-Moleküle, welche die Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen fördern. Beispiele von Cytokinen schließen Erythropoietin (EPO), welches die Entwicklung von roten Blutzellen stimuliert, Thrombopoietin (TPO), welches die Entwicklung von Zellen der Megakaryocytenlinie stimuliert, und den Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktor (G-CSF), welcher die Entwicklung von Neutrophilen stimuliert, ein. Diese Cytokine sind bei der Wiederherstellung von normalen Blutzellspiegeln in Patienten nützlich, die an Anämie leiden oder die eine Chemotherapie gegen Krebs erhalten. Die gezeigten Aktivitäten dieser Cytokine in vivo erläutern deren enormes klinisches Potenzial und den Bedarf für andere Cytokine, Cytokinagonisten und Cytokinantagonisten.
Von vielen unterschiedlichen Cytokinen ist bekannt, dass sie in den Vorgang der Entzündung verwickelt sind und werden in dem Aufsatz von Slavin [EOS – J. Immunol. Immunopharmacol., Band XVII, Nr. 1, 25–29 (1997)] diskutiert. Slavin gibt einen Überblick über die Rollen einer Anzahl an Cytokinen bei der Wundheilung nach Hautverletzung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem Bedürfnis zu, indem ein neues Polypeptid und damit in Beziehung stehende Zubereitungen und Verfahren bereitgestellt werden. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isolierteres Polynucleotid bereit, das ein vier Alphahelices enthaltendes Säugercytokin kodiert, das als Zcyto10 bezeichnet wird. Das menschliche Zcyto10-Polypeptid besteht aus einer Sequenz aus 176 Aminosäuren mit dem anfänglichen Met, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2. Es wird angenommen, dass die Aminosäurereste 1–24 eine Signalsequenz sind und dass das reife Zcyto 10-Polypeptid von der Aminosäuresequenz repräsentiert wird, die aus den Resten 25, einem Leucin, bis zu dem Aminosäurerest 176, einem Glutaminsäurerest, besteht, ebenso definiert durch die SEQ ID Nr. 12. Ein anderes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird durch die Sequenzen der SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 definiert. Das Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 ist aus 151 Aminosäureresten zusammengesetzt, worin die Aminosäuren 1–24 eine Signalsequenz umfassen und worin die reife Sequenz aus den Aminosäureresten 25, einem Leucin, bis zur Aminosäure 151, einer Glutaminsäure, besteht, auch definiert durch die SEQ ID Nr. 13. Eine andere aktive Variante besteht aus den Aminosäureresten 33, einem Cystein, bis zum Aminosäurerest 176 der SEQ ID Nr. 2. Diese Variante wird auch durch die SEQ ID Nr. 26 definiert.
Maus-Zcyto10 ist auch ein Polypeptid, bestehend aus 176 Aminosäureresten, wie definiert durch die SEQ ID Nrn. 18 und 19. Maus-Zcyto10 hat eine Signalsequenz, die sich von dem Aminosäurerest 1, einem Methionin, bis zu und einschließlich dem Aminosäurerest 24, einem Glycin, der SEQ ID Nr. 19 erstreckt. Folglich erstreckt sich das reife Maus-Zcyto10 vom Aminosäurerest 25, einem Leucin, bis zu und einschließlich dem Aminosäurerest 176, einem Leucin, von SEQ ID Nr. 19, auch definiert durch SEQ ID Nr. 20. Von einer anderen aktiven Variante wird angenommen, dass sie sich von der Aminosäure 33, einem Cystein, bis zur Aminosäure 176 von SEQ ID Nr. 19 erstreckt. Diese Variante wird auch durch SEQ ID Nr. 25 definiert. In einem zusätzlichen Ausführungsbeispiel umfasst das Polypeptid weiterhin einen Affinitätsanhang.
Eine Variante von Maus-Zcyto10 wird durch die SEQ ID Nrn. 33 und 34 definiert. Diese Variante ist 154 Aminosäurereste lang und hat eine Signalsequenz, die sich von der Aminosäure 1, einem Methionin, bis und einschließlich zum Aminosäurerest 24, einem Glycin, der SEQ ID Nr. 34 erstreckt. Folglich erstreckt sich die reife Sequenz vom Aminosäurerest 25, einem Leucin, bis und einschließlich zum Aminosäurerest 154, einem Leucin, der SEQ ID Nr. Nr. 34. Die reife Sequenz wird auch durch die SEQ ID Nr. 35 definiert.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend (a) einen Transkriptionspromotor; (b) ein DNA-Segment, welches das Zcyto10-Polypeptid kodiert; und (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, wobei der Promotor, das DNA-Segment und die Terminationssequenz operabel gekoppelt sind.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird eine kultivierte eukaryotische oder prokaryotische Zelle bereitgestellt, in welche ein Expressionsvektor, wie er oben offenbart ist, eingeführt worden war, wobei diese Zelle ein Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein chimäres Polypeptid bereitgestellt, das im Wesentlichen aus einem ersten Teil und einem zweiten Teil besteht, die durch eine Peptidbindung verbunden werden. Der erste Teil des chimären Polypeptids besteht im Wesentlichen aus (a) einem Zcyto10-Polypeptid, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 2; (b) Allelvarianten von SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 25, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 34 oder SEQ ID Nr. 35; und (c) Proteinpolypeptiden, die wenigstens zu 90% identisch sind mit (a) oder (b). Der zweite Teil des chimären Polypeptids besteht im Wesentlichen aus einem anderen Polypeptid wie einem Affinitätsanhang. In einem Ausführungsbeispiel ist der Affinitätsanhang ein Immunglobulin-F_c-Polypeptid. Die Erfindung stellt auch Expressionsvektoren bereit, die die chimären Polypeptide kodieren, und Wirtszellen, die transfiziert worden sind, um die chimären Polypeptide herzustellen.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der an ein Zcyto10-Polypeptid, wie es oben offenbart ist, spezifisch bindet, und es wurde auch ein antiidiotypischer Antikörper bereitgestellt, der den Antikörper für ein Zcyto10-Polypeptid neutralisiert.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die gereinigtes Zcyto10-Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Solche Zubereitungen können bei der Herstellung von Medikamenten für die Modulierung der Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Cytokinproduktion bei der Vorbeugung oder Behandlung von Zuständen, die durch eine untaugliche Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Cytokinproduktion, wie weiter hierin diskutiert, nützlich sind.
Zcyto10-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch das Immunsystem stimulieren, um besser mikrobielle oder virale Infektionen zu bekämpfen. Insbesondere kann Zcyto10 systemisch verabreicht werden, um die Blutplättchenproduktion eines Individuums zu erhöhen. Ferner können Zcyto10-Polypeptide der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung von Medikamenten für Luftröhren-spezifische und tracheobronchialspezifische Anwendungen verwendet werden, wie bei der Aufrechterhaltung oder Wundreparatur des tracheobronchialen Epitheliums oder von Zellen, die demselben zu Grunde liegen, bei der Regulierung der Schleimproduktion oder der mucociliären Beseitigung von Debris oder bei der Behandlung von Asthma, Bronchitis oder anderen Erkrankungen des Tracheobronchialtrakts. Es kann auch die Wundheilung verbessern und die Regeneration angegriffener Gewebe fördern, was besonders nützlich bei der Behandlung von Periodontalerkrankung sein kann.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Peptid oder Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines epitop-tragenden Teils eines Zcyto10-Polypeptids hat, wobei das letzteres die oben beschriebene Aminosäuresequenz aufweist. Peptide oder Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines epitop-tragenden Teils eines Zcyto10-Polypeptids der vorliegenden Erfindung schließen Teile solcher Polypeptide ein, mit wenigstens 9, vorzugsweise wenigstens 15 und am bevorzugtesten wenigstens 30 bis 50 Aminosäuren, obwohl epitop-tragende Polypeptide von jeder Länge bis zu und einschließlich der gesamten Aminosäuresequenz eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wie es oben beschrieben ist, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Ebenfalls werden alle diese Polypeptide beansprucht, die mit einem anderen Polypeptid oder einem Trägermolekül verschmolzen sind. Solche Epitopvarianten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die SEQ ID Nrn. 25 bis 32. Antikörper, die von diesen epitop-tragenden Teilen von Zcyto10 hergestellt werden, können bei der Aufreinigung von Zcyto10 aus Zellkulturmedium verwendet werden.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angehängte Zeichnung offensichtlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Lehren aller hierin zitierten Bezugnahmen werden in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme einschlossen.
Bevor die Erfindung im Detail vorgestellt wird, kann es für deren Verständnis hilfreich sein, die folgenden Begriffe zu definieren:
Der Begriff "Affinitätsanhang" wird hierin verwendet, um ein Polypeptidsegment zu bezeichnen, das an ein zweites Polypeptid angehängt werden kann, um für die Reinigung oder den Nachweis des zweiten Polypeptides zu sorgen oder um Stellen für das Anhängen des zweiten Polypeptides an ein Substrat bereitzustellen. Prinzipiell kann jedes Peptid oder Protein, für welches ein Antikörper oder anderes spezifisches Bindungsmittel erhältlich ist, als ein Affinitätsanhang verwendet werden. Affinitätsanhänge schließen ein Polyhistidinsystem, Protein A, Nilsson et al., EMBO J., 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198: 3 (1991), Glutathion-S-Transferase, Smith und Johnson, Gene, 67: 31 (1988), Glu-Glu-Affinitätsanhang, Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7952–4 (1985), Substanz P, Flag^TM-Peptid, Hopp et al., Biotechnology, 6: 1204–1210 (1988), Streptavidin-Bindungspeptid oder ein anderes Antigenepitop oder Bindungsdomäne ein. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification, 2: 95–107 (1991). DNAs, die Affinitätsanhänge kodieren, sind von gewerblichen Versorgern erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Der Begriff "Allelvariante" wird hierin verwendet, um jede von zwei oder mehr alternativen Formen eines Gens, das denselben Chromosomenort besetzt, zu bezeichnen. Allelvariation entsteht durch Mutation natürlich und kann in einem phänotypischen Polymorphismus innerhalb von Populationen resultieren. Genmutationen können stumm sein (keine Änderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide kodieren, die eine geänderte Aminosäuresequenz haben. Der Begriff Allelvariante wird hierin auch verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, das durch eine Allelvariante eines Gens kodiert wird.
Die Begriffe "aminoterminal" und "carboxyterminal" werden hierin verwendet, um Positionen innerhalb von Polypeptiden zu bezeichnen. Wo es der Zusammenhang erlaubt, werden diese Begriffe unter Bezugnahme auf eine bestimmte Sequenz oder einen Teil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel ist eine gewisse Sequenz, die carboxyterminal zu einer Bezugssequenz in einem Polypeptid angeordnet ist, in der Nähe des Carboxyterminus der Bezugssequenz lokalisiert, befindet sich jedoch nicht notwendigerweise am Carboxyterminus des gesamten Polypeptids.
Der Begriff "Komplement/Antikomplement-Paar" bezeichnet nicht identische Einheiten, die ein nicht kovalent assoziiertes, stabiles Paar unter geeigneten Bedingungen bilden. Zum Beispiel sind Biotin und Avidin (oder Streptavidin) Modellmitglieder eines Komplement/Antikomplement-Paares. Andere beispielhafte Komplement/Antikomplement-Paare schließen Rezeptor/Liganden-Paare, Antikörper/Antigen-(oder Hapten- oder Epitop-)Paare, Sinn/Gegensinn-Polynucleotidpaare und Ähnliche ein. Wo die nachfolgende Dissoziierung des Komplement/Antikomplement-Paares wünschenswert ist, hat das Komplement/Antikomplement-Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von < 10⁹ M^–1.
Der Begriff "Komplemente eines Polynucleotidmoleküls" ist ein Polynucleotidmolekül mit einer komplementären Basensequenz und umgekehrten Orientierung im Vergleich zu einer Referenzsequenz. Zum Beispiel ist die Sequenz 5'-ATGCACGGG-3' komplementär zu 5'-CCCGTGCAT-3'.
Der Begriff "Contig" bezeichnet ein Polynucleotid, das eine zusammenhängende Strecke einer mit einem anderen Polynucleotid identischen oder komplementären Sequenz hat. Von zusammenhängenden Sequenzen wird gesagt, dass sie mit einer gegebene Strecke einer Polynucleotidsequenz entweder in ihrer Gesamtheit oder entlang einer Teilstrecke des Polynucleotids "überlappen". Zum Beispiel sind die repräsentativen Contigs für die Polynucleotidsequenz 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 5'-TAGCTTgagtct-3' und 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Der Begriff "degenerierte Nucleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz aus Nucleotiden, die eines oder mehrere degenerierte Codons einschließen (im Vergleich zu einem Referenz-Polynucleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten unterschiedliche Triplets an Nucleotiden, kodieren jedoch denselben Aminosäurerest (das heißt GAU- und GAC-Triplets kodieren jeweils Asp).
Der Begriff "Expressionsvektor" wird verwendet, um ein DNA-Molekül, linear oder zirkulär, zu bezeichnen, das ein Segment umfasst, das ein Polypeptid von Interesse enthält, welches an zusätzliche Segmente operabel gekoppelt ist, die für seine Transkription sorgen. Solche zusätzlichen Segmente schließen Promotor- und Terminationssequenzen ein und können auch einen oder mehrere Replikationsstartpunkte, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal etc. einschließen. Expressionsvektoren werden im Allgemeinen aus Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder können Elemente von beiden enthalten.
Der Begriff "isoliert" gibt an, wenn er für ein Polynucleotid angewendet wird, dass das Polynucleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt worden ist und folglich frei ist von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen, und dass es in einer Form vorliegt, die geeignet ist für die Verwendung in gentechnisch veränderten Proteinherstellungssystemen. Solche isolierten Moleküle sind jene, die von ihrer natürlichen Umgebung getrennt worden sind, und schließen cDNA und genomische Klone ein. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind von anderen Genen frei, mit denen sie gewöhnlich verknüpft sind, können jedoch natürlich vorkommende, nicht translatierte 5'- und 3'-Regionen wie Promotoren und Terminationssequenzen einschließen. Die Identifizierung verknüpfter Regionen wird für einen Durchschnittsfachmann augenscheinlich sein (siehe z. B. Dynan und Tijan, Nature, 316: 774–78 (1985)).
Ein "isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, welches unter anderen Umständen als in seiner natürlichen Umgebung gefunden wird, wie fern von Blut und tierischen Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, die Polypeptide in einer hoch gereinigten Form bereitzustellen, das heißt zu mehr als 95% rein, bevorzugter zu mehr als 99% rein. Wenn er in diesem Zusammenhang verwendet wird, schließt der Begriff "isoliert" die Anwesenheit desselben Polypeptids in alternativen physikalischen Formen wie Dimeren oder alternativ glykosylierten oder derivatisierten Formen nicht aus.
Der Begriff "operabel verknüpft", wenn er sich auf DNA-Segmente bezieht, zeigt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie gemeinsam für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, z. B. beginnt die Transkription in dem Promotor und schreitet durch das kodierende Segment bis zur Terminationssequenz voran.
Der Begriff "ortholog" bezeichnet ein aus einer Art gewonnenes Polypeptid oder Protein, welches der funktionelle Gegenspieler eines Polypeptids oder eines Proteins aus einer anderen Art ist. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Ergebnis der Artenbildung.
"Paraloga" sind unterschiedliche, jedoch strukturell verwandte Proteine, die von einem Organismus hergestellt werden. Von Paraloga wird angenommen, dass sie durch Gen-Duplikation entstehen. Zum Beispiel sind α-Globin, β-Globin und Myoglobin Paraloga voneinander.
Ein "Polynucleotid" ist ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidbasen, die vom 5'- zum 3'-Ende gelesen werden. Polynucleotide schließen RNA und DNA ein und können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination natürlicher und synthetischer Moleküle zubereitet werden. Polynucleotidgrößen werden als Basenpaare (abgekürzt "bp"), Nucleotide ("nt") oder Kilobasen ("kb") ausgedrückt. Wo es der Zusammenhang erlaubt, können die letzten beiden Begriffe Polynucleotide beschreiben, die einzelsträngig oder doppelsträngig sind. Wenn der Begriff auf doppelsträngige Moleküle angewendet wird, wird er verwendet, um die Gesamtlänge zu bezeichnen und wird als äquivalent zu dem Begriff "Basenpaare" verstanden werden. Es wird von Fachleuten erkannt werden, dass sich die beiden Stränge eines doppelsträngigen Polynucleotids geringfügig in der Länge unterscheiden können und dass deren Enden als ein Ergebnis enzymatischer Spaltung versetzt sein können; folglich können alle Nucleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynucleotidmoleküls nicht gepaart sein. Solche ungepaarten Enden werden im Allgemeinen 20 nt in der Länge nicht überschreiten.
Ein "Polypeptid" ist ein Polymer aus Aminosäureresten, die durch Peptidbindungen verbunden sind, ob natürlich oder synthetisch hergestellt. Auf Polypeptide mit weniger als ungefähr 10 Aminosäureresten wird allgemein Bezug genommen als "Peptide".
Der Begriff "Promotor" wird hierin verwendet für seine im Stand der Technik erkannte Bedeutung, einen Teil eines Gens zu bezeichnen, der DNA-Sequenzen enthält, die für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiierung der Transkription sorgen. Promotorsequenzen werden gewöhnlich, jedoch nicht immer in den nicht kodierenden 5'-Bereichen von Genen gefunden.
Ein "Protein" ist ein Makromolekül, das eine oder mehrere Polypeptidketten enthält. Ein Protein kann auch nicht-peptidische Bestandteile wie Kohlenwasserstoffgruppen umfassen. Kohlenwasserstoffe und andere nicht-peptidische Substituenten können zu einem Protein durch die Zelle, in welcher das Protein erzeugt wird, hinzugefügt werden und werden mit dem Zelltyp variieren. Proteine sind hierin in Begriffen ihrer Aminosäuregerüststrukturen definiert; Substituenten wie Kohlenwasserstoffgruppen werden im Allgemeinen nicht spezifiziert, können jedoch nichtsdestotrotz vorhanden sein.
Der Begriff "Rezeptor" bezeichnet ein zellassoziiertes Protein, das an ein bioaktives Molekül (das heißt einen Liganden) bindet und die Wirkung des Liganden an die Zelle übermittelt. Die Bindung eines Liganden an den Rezeptor resultiert in einer konformatorischen Änderung in dem Rezeptor, der eine Wechselwirkung zwischen der Effektordomäne und anderen Molekül(en) in der Zelle bewirkt. Diese Wechselwirkung führt wiederum zu einer Änderung in dem Zellmetabolismus. Metabolische Ereignisse, die mit Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen gekoppelt sind, schließen Gen-Transkription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Zunahmen in der Produktion von cyclischem AMP, Mobilisierung von zellulärem Calcium, Mobilisierung von Membranlipiden, Zelladhäsion, Hydrolyse von Inositollipiden und Hydrolyse von Phospholipiden ein. Im Allgemeinen können Rezeptoren membrangebunden, cytosolisch oder nukleär; monomer (z. B. der Rezeptor für Schilddrüsen stimulierendes Hormon, β-adrenerger Rezeptor) oder multimer (z. B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormonrezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietinrezeptor und IL-6-Rezeptor) sein.
Der Begriff "sekretorische Signalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die in Polypeptid (ein "sekretorisches Peptid") kodiert, das als ein Bestandteil eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen Sekretionsweg einer Zelle, in der es synthetisiert wird, führt. Das größere Polypeptid wird im Allgemeinen gespalten, um das sekretorische Peptid während dem Transit durch den Sekretionsweg zu entfernen.
Der Begriff "Splice-Variante" wird hierin verwendet, um alternative Formen an von einem Gen transkribierter RNA zu bezeichnen. Eine Splice-Variation entsteht natürlich durch die Verwendung von alternativen Splice-Stellen in einem transkribierten RNA-Molekül oder, weniger gewöhnlich, zwischen getrennt transkribierten RNA-Molekülen und kann in etlichen mRNA-Molekülen resultieren, die aus demselben Gen transkribiert wurden. Splice-Varianten können Polypeptide mit einer geänderten Aminosäuresequenz kodieren. Der Begriff Splice-Variante wird hierin auch verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, das durch eine Splice-Variante einer von einem Gen transkribierten mRNA zu kodieren.
Molekulargewichte und Längen von Polymeren, die durch unpräzise analytische Verfahren (z. B. Gelelektrophorese) bestimmt worden waren, werden als ungefähre Werte verstanden werden. Wenn solch ein Wert ausgedrückt wird als "ungefähr" X oder "annähernd" X, wird der angeführte Wert von X dahingehend verstanden werden, dass er genau ±10% ist.
Konservierte Aminosäuren in der Helix D von Zcyto10 können als ein Werkzeug für die Identifizierung neuer Familienmitglieder verwendet werden. Helix D ist die am höchsten konservierte mit einer Identität von ungefähr 32% mit der Helix D von IL-10. Zum Beispiel kann eine Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) verwendet werden, um Sequenzen, welche die konservierte Sequenz (die Domäne, der Bereich oder das Motiv von oben) aus RNA kodieren, welche aus einer Reihe an Gewebequellen oder Zelllinien erhalten wurde, zu amplifizieren. Insbesondere sind hoch degenerierte Primer, gestaltet aus den Zcyto10-Sequenzen, für diesen Zweck nützlich.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die isolierten Polynucleotide mit ähnlich großen Bereichen der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ. ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 33 oder einer dazu komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie ungefähr 5°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) der spezifischen Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Der T_m-Wert ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei welcher 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Typische stringente Bedingungen sind jene, in welchen die Salzkonzentration ungefähr 0,02 M oder weniger bei einem pH-Wert von 7 ist und die Temperatur beträgt wenigstens ungefähr 60°C. Wie zuvor festgestellt, schließen die isolierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA ein. Verfahren zur Isolierung von DNA und RNA sind im Stand der Technik wohl bekannt. Gesamt-RNA kann unter Verwendung von Guanidin-HCl-Extrahierung, gefolgt von der Isolierung durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten zubereitet werden [Chirgwin et al., Biochemistry, 18: 52–94 (1979)]. Poly-(A)⁺-RNA wird aus Gesamt-RNA unter Verwendung des Verfahrens von Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1408–1412 (1972), zubereitet. Komplementäre DNA (cDNA) wird aus Poly-(A)⁺-RNA unter Verwendung von bekannten Verfahren zubereitet. Polynucleotide, die Zcyto10-Polypeptide kodieren, werden dann identifiziert und z. B. durch Hybridisierung oder PCR isoliert.
Zusätzlich können die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes synthetisiert werden. Gegenwärtig ist das Verfahren der Wahl der Phosphoramiditverfahren. Falls chemisch synthetisierte doppelsträngige DNA für eine Anwendung wie die Synthese eines Gens oder eines Gen-Fragmentes benötigt wird, dann wird jeder komplementäre Strang gesondert hergestellt. Die Erzeugung von kurzen Genen (60 bis 80 bp) ist technisch unkompliziert und kann durch Synthetisieren der komplementären Stränge und ihrem anschließenden Annealing durchgeführt werden. Für die Erzeugung von längeren Genen (> 300 bp) müssen jedoch spezielle Strategien zu Hilfe genommen werden, da die Kopplungseffizienz jedes Zyklus während der chemischen DNA-Synthese selten 100% beträgt. Um über dieses Problem hinweg zu kommen, werden synthetische Gene (doppelsträngig) in Modulform aus einzelsträngigen Fragmenten zusammengebaut, die 20 bis 200 Nucleotide lang sind. Siehe Glick, R. Bernard und Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D. C., 1994), K. Itakura et al., Synthesis and Use of Synthetic Oligonucleotides, Annu. Rev. Biochem., 53: 323–356 (1984), und S. Climie et al., Chemical Synthesis of the Thymidylate Synthase Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 633–637 (1990).
Fachleute werden erkennen, dass die in den SEQ ID Nrn. 1, 2, 3 und 4 offenbarten Sequenzen zwei Allelen des Menschen und die SEQ ID Nrn. 18, 19, 33 und 34 zwei Allelen der Maus repräsentieren. Es können zusätzliche Allelvarianten dieser Sequenzen durch Sondieren von cDNA- oder genomischen Bibliotheken aus unterschiedlichen Individuen gemäß Standardverfahren kloniert werden. Allelvarianten dieser Sequenz können durch Sondieren von cDNA- oder genomischen Bibliotheken aus unterschiedlichen Individuen gemäß Standardverfahren kloniert werden. Allelvarianten der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz, einschließlich jenen, die stumme Mutationen enthalten, und jenen, in welchen Mutationen in Aminosäuresequenzänderungen resultieren, befinden sich im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Proteine, die Allelvarianten der SEQ ID Nr. 2 sind. cDNA, die aus alternativ gesplicten mRNA erzeugt wurden, welche die Eigenschaften des Zcyto10-Polypeptids beibehalten, sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, ebenso wie Polypeptide, die durch solche cDNA und mRNA kodiert werden. Allelvarianten und Splice-Varianten dieser Sequenzen können durch Sondieren von cDNA- oder genomischen Bibliotheken aus unterschiedlichen Individuen oder Geweben gemäß im Stand der Technik bekannten Standardverfahren kloniert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Gegenproteine und Polynucleotide anderer Arten ("Spezies-Orthologa") bereit. Von besonderem Interesse sind Zcyto10-Polypeptide aus anderen Säugerarten, einschließlich Maus-, Schwein-, Schaf-, Rind-, Hund-, Katzen-, Pferdearten und anderen Primaten. Spezies-Orthologa des menschlichen Zcyto10-Proteins können unter Verwendung der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Information und Zusammensetzungen in Kombination mit gewöhnlichen Klonierungstechniken kloniert werden. Zum Beispiel kann eine cDNA unter Verwendung von mRNA, gewonnen aus einem Gewebe oder Zelltyp, der das Protein exprimiert, kloniert werden. Geeignete mRNA-Quellen können durch Sondieren von Northern Blots mit Sonden, die aus den hierin offenbarten Sequenzen gestaltet sind, identifiziert werden. Es wird dann eine Bibliothek aus mRNA eines positiven Gewebes oder einer positiven Zelllinie zubereitet. Dann kann eine Protein kodierende cDNA durch eine Reihe an Verfahren isoliert werden, wie durch Sondieren mit einer vollständigen oder teilweisen menschlichen oder Maus-cDNA oder mit einem oder mehreren Sätzen degenerierter Sonden, basierend auf den offenbarten Sequenzen. Es kann auch eine cDNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion oder PCR (Multis et al., US-Patent Nr. 4,683,202) unter Verwendung von Primern kloniert werden, die aus den hierin offenbarten Sequenzen gestaltet sind. Mit einem zusätzlichen Verfahren kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren, und die Expression der cDNA von Interesse kann mit einem Antikörper für das Protein nachgewiesen werden. Ähnliche Techniken können auch für die Isolierung genomischer Klone verwendet werden. Wie verwendet und beansprucht, schließt die Sprache "ein isoliertes Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, wobei dieses Polynucleotid durch die SEQ ID Nrn, 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35 definiert wird" sämtliche Allelvarianten und Spezies-Orthologa dieser Polypeptide ein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte Proteinpolypeptide bereit, die im Wesentlichen identisch sind mit den Proteinpolypeptiden von SEQ ID Nr. 2 und seiner Spezies-Orthologa. Mit "isoliert" ist ein Protein oder Polypeptid gemeint, das unter anderen Umständen als seiner natürlichen Umgebung gefunden wird, wie entfernt von Blut oder tierischem Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es ist bevorzugt, die Polypeptide in einer hoch gereinigten Form, das heißt zu mehr als 95% rein, bevorzugter zu mehr als 99% rein, bereitzustellen. Der Begriff "im Wesentlichen identisch" wird hierin verwendet, um Polypeptide mit 50%, bevorzugt 60%, bevorzugter wenigstens 80% Sequenzidentität mit der in den SEQ ID Nrn. 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35 gezeigten Sequenz oder ihren Spezies-Orthologa zu bezeichnen. Solche Polypeptide werden bevorzugter zu wenigstens 90% und am bevorzugtesten zu 95% oder mehr mit SEQ ID Nr. 2 oder ihren Spezies-Orthologa identisch sein. Die prozentuale Sequenzidentität wird durch gewöhnliche Verfahren bestimmt. Siehe z. B. Altschul et al., Bull. Math. Bio., 48: 603–616 (1986), und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915–10919 (1992). Kurz, zwei Aminosäuresequenzen werden so angeordnet, dass die Anordnungstreffer optimiert werden, unter Verwendung eines Lückenöffnungs-Penalty von 10, eines Lückenausdehnungs-Penalty von 1 und der "Blossom 62"-Treffermatrix von Henikoff und Henikoff (ebenda), wie in Tabelle 1 gezeigt (Aminosäuren werden durch die Ein-Buchstaben-Standard-Kodes angezeigt). Die prozentuale Identität wird dann berechnet als:
Tabelle 1
Die Sequenzidentität der Polynucleotidmoleküle wird durch ähnliche Verfahren unter Verwendung eines oben offenbarten Verhältnisses bestimmt.

Zcyto10-Polypeptidvarianten oder im Wesentlichen identische Proteine und Polypeptide sind charakterisiert als eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisend. Diese Änderungen sind vorzugsweise von einer geringeren Art, das heißt konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle 2) und andere Substitutionen, die nicht signifikant die Faltung oder Aktivität des Proteins oder Polypeptides angreifen; kleine Deletionen, typischerweise eine bis ungefähr 30 Aminosäuren; und kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleineres Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten oder eine kleinere Verlängerung, die die Aufreinigung erleichtert (ein Affinitätsanhang), wie ein Polyhistidinsystem, Protein A, Nilsson et al., EMBO J., 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198: 3 (1991), Glutathion-S-Transferase, Smith und Johnson, Gene, 67: 31 (1988), oder ein anderes Antigenepitop oder Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification, 2: 95–107 (1991). DNA kodierende Affinitätsanhänge sind von kommerziellen Zulieferern erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Tabelle 2 Konservative Aminosäuresubstitutionen

basisch:	Arginin Lysin Histidin
sauer:	Glutaminsäure Asparaginsäure
polar:	Glutamin Asparagin
hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
aromatisch:	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
klein:	Glycin Alanin Serin Threonin Methionin

Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Reihe an anderen Polypeptidfusionen (und verwandten multimeren Proteinen, die ein oder mehrere Polypeptidfusionen umfassen) bereit. Zum Beispiel kann ein Zcyto10-Polypeptid als eine Fusion mit einem Dimere bildenden Protein, wie offenbart in den US-Patenten Nrn. 5,155,027 und 5,567,584, zubereitet werden. Bevorzugte Dimere bildende Proteine in diesem Zusammenhang schließen Domänen aus konstanten Bereichen von Immunglobulinen ein. Immunglobulin-Zcyto10-Polypeptid-Fusionen können in gentechnisch veränderten Zellen exprimiert werden (um eine Reihe an multimeren Zcyto10-Analoga zu erzeugen). Hilfsdomänen können mit Zcyto10- Polypeptiden verschmolzen werden, um sie gegen spezifische Zellen, Gewebe oder Makromoleküle (z. B. Collagen) zu richten. Z. B. könnte ein Zcyto10-Polypeptid oder -Protein auf einen vorbestimmten Zelltyp gerichtet werden durch Verschmelzen eines Polypeptids mit einem Liganden, der an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzelle spezifisch bindet. Auf diesem Weg können Polypeptide und Proteine für therapeutische oder diagnostische Zwecke zum Ziel genommen werden. Ein Zcyto10-Polypeptid kann mit zwei oder mehr Einheiten verschmolzen werden, wie mit einem Affinitätsanhang für die Aufreinigung und einer Zieldomäne. Polypeptidfusionen können auch eine oder mehrere Spaltstellen umfassen, insbesondere zwischen den Domänen. Siehe Tuan et al., Connective Tissue Research, 34: 1–9 (1996).
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können auch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste umfassen. Nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste schließen ohne Begrenzung ein: trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanprolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, n-Methylglycin, Allothreonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolinsäure, Thiazolidincarboxylsäure, Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin, 3,3-Dimethylprolin, tert-Leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin und 4-Fluorphenylalanin. Es sind im Stand der Technik zahlreiche Verfahren bekannt, nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste in Proteine einzubauen. Zum Beispiel kann ein in vitro System verwendet werden, worin Unsinnmutationen unter Verwendung von chemisch aminoacylierten Suppressor-tRNAs unterdrückt werden. Verfahren für die Synthese von Aminosäuren und für das Aminoacylieren von tRNA sind im Stand der Technik bekannt. Es können essenzielle Aminosäuren in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung gemäß im Stand der Technik bekannten Vorgängen wie der ortsgerichteten Mutagenese oder der Alanin-Scanning-Mutagenese identifiziert werden (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)]; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4498–4502 (1991). Bei der letzteren Technik werden einzelne Alaninmutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische Aktivität (z. B. Ligandenbindung und Signalweiterleitung) untersucht, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Ligand-Protein-Wechselwirkung können auch durch Analyse der Kristallstruktur, wie sie durch solche Techniken wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt wurde, bestimmt werden. Siehe z. B. de Vos et al., Science, 255: 306–312 (1992); Smith et al., J. Mol. Biol., 224: 899–904 (1992); Wlodaver et al., FEBS Lett., 309: 59–64 (1992). Die Identitäten essenzieller Aminosäuren können auch aus Analysen der Homologien mit verwandten Proteinen abgeleitet werden.
Multiple Aminosäuresubstitutionen können hergestellt und untersucht werden unter Verwendung von bekannten Verfahren der Mutagenese und des Screenings, wie z. B. jene, offenbart durch Reidhaar-Olson und Sauer, Science, 241: 53–57 (1988) oder Bowie und Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2152–2156 (1989). Kurz, diese Autoren offenbaren Verfahren für das simultane zufällige Verändern von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid, das Selektieren auf ein funktionelles Polypeptid und dann das Sequenzieren des Polypeptids, an dem Mutationen ausgelöst wurden, um das Spektrum zu erlaubender Substitutionen in jeder Position zu bestimmen. Andere Verfahren, die verwendet werden können, schließen Phagendisplay (z. B. Lowman et al., Biochem., 30: 10832–10837 (1991); Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung WO 92/06204) und bereichsgerichtete Mutagenese, Derbyshire et al., Gene, 46: 145 (1986); Ner et al., DNA 7: 127 (1988) ein.
Mutageneseverfahren, wie sie oben offenbart sind, können mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren kombiniert werden, um die Aktivität klonierter Proteine, an denen Mutationen ausgelöst wurden, in Wirtszellen nachzuweisen. Bevorzugte Tests diesbezüglich schließen Zellproliferationstests und auf Biosensoren basierte Ligandenbindungstests ein, die unten beschrieben werden. DNA-Moleküle, an denen Mutationen ausgelöst wurden und die aktive Proteine oder Teile davon (z. B. Ligandenbindungsfragmente) kodieren, können aus den Wirtszellen wiedergewonnen werden und unter Verwendung von moderner Ausrüstung schnell sequenziert werden. Diese Verfahren erlauben die schnelle Bestimmung der Wichtigkeit einzelner Aminosäurereste in einem Polypeptid von Interesse und können auf Polypeptide unbekannter Struktur angewendet werden.
Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Durchschnittsfachmann eine Reihe von Polypeptiden zubereiten, die im Wesentlichen identisch sind mit den SEQ ID Nrn. 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35 oder mit Allelvarianten davon und welche die Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bewahren. Wie es hier ausgedrückt und beansprucht wird, schließt der Ausdruck "ein Polypeptid, wie definiert durch SEQ ID Nr. 2" alle Allelvarianten und Spezies-Orthologa des Polypeptids ein.
Die Proteinpolypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich Proteinen voller Länge, Proteinfragmenten (z. B. Ligandenbindungsfragmente) und Fusionspolypeptiden, können in gentechnisch veränderten Wirtszellen gemäß üblichen Techniken herstellt werden. Geeignete Wirtszellen sind jene Zelltypen, die mit exogener DNA transformiert oder transfiziert werden können und die man in Kultur wachsen lassen kann, und schließen Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere eukaryotische Zellen ein. Eukaryotische Zellen, insbesondere kultivierte Zellen vielzelliger Organismen werden bevorzugt. Techniken für die Manipulierung klonierter DNA-Moleküle und für das Einführen exogener DNA in eine Reihe von Wirtszellen sind offenbart durch Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), und Ausubel et al., ebenda.
Polynucleotide, im Allgemeinen eine cDNA-Sequenz, der vorliegenden Erfindung kodieren die oben beschriebenen Polypeptide. Eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, ist aus einer Reihe an Codons zusammengesetzt, wobei jeder Aminosäurerest des Polypeptids durch ein Codon kodiert wird und wobei jedes Codon aus drei Nucleotiden zusammengesetzt ist. Die Aminosäurereste werden durch ihre jeweiligen Codons wie folgt kodiert.
Alanin (Ala) wird kodiert durch GCA, GCC, GCG oder GCT;
Cystein (Cys) wird kodiert durch TGC oder TGT;
Asparaginsäure (Asp) wird kodiert durch GAC oder GAT;
Glutaminsäure (Glu) wird kodiert durch GAA oder GAG;
Phenylalanin (Phe) wird kodiert durch TTC oder TTT;
Glycin (Gly) wird kodiert durch GGA, GGC, GGG oder GGT;
Histidin (His) wird kodiert durch CAC oder CAT;
Isoleucin (Ile) wird kodiert durch ATA, ATC oder ATT;
Lysin (Lys) wird kodiert durch AAA oder AAG;
Leucin (Leu) wird kodiert durch TTA, TTG, CTA, CTC, CTG oder CTT;
Methionin (Met) wird kodiert durch ATG;
Asparagin (Asn) wird kodiert durch AAC oder AAT;
Prolin (Pro) wird kodiert durch CCA, CCC, CCG oder CCT;
Glutamin (Gln) wird kodiert durch CAA oder CAG;
Arginin (Arg) wird kodiert durch AGA, AGG, CGA, CGC, CGG oder CGT;
Serin (Ser) wird kodiert durch AGC, AGT, TCA, TCC, TCG oder TCT;
Threonin (Thr) wird kodiert durch ACA, ACC, ACG oder ACT;
Valin (Val) wird kodiert durch GTA, GTC, GTG oder GTT;
Tryptophan (Trp) wird kodiert durch TGG; und
Tyrosin (Tyr) wird kodiert durch TAC oder TAT.
Es muss erkannt werden, dass gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn eine cDNA wie oben beschrieben beansprucht wird, zu verstehen ist, dass das, was beansprucht wird, sowohl der Sinnstrang als auch der Gegensinnstrang sind und auch die DNA als Doppelstrang mit sowohl dem Sinn- als auch dem Gegensinnstrang, die durch ihre jeweiligen Wasserstoffbindungen miteinander den Doppelstrang bilden. Ebenfalls wird die Boten-RNA (mRNA) beansprucht, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodiert, und welche mRNA durch die oben beschriebene cDNA kodiert wird. Eine Boten-RNA (mRNA) wird ein Polypeptid unter Verwendung derselben Codons, wie sie oben definiert sind, kodieren, mit der Ausnahme, dass jedes Thyminnucleotid (T) durch ein Uracilnucleotid (U) ersetzt ist.
Im Allgemeinen ist eine DNA-Sequenz, die ein Zcyto10-Polypeptid kodiert, operabel mit anderen genetischen Elementen, die für seine Expression benötigt werden, in einem Expressionsvektor verknüpft, im Allgemeinen einschließend einen Transkriptionspromotor und -terminator. Der Vektor wird gewöhnlich auch einen oder mehrere selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikationsstartpunkte enthalten, obwohl Fachleute bemerken werden, dass in gewissen Systemen selektierbare Marker auf gesonderten Vektoren bereitgestellt werden können und dass für die Replikation der exogenen DNA durch Integration in das Wirtszellgenom gesorgt werden kann. Die Auswahl von Promotoren, Terminationssequenzen, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist eine Angelegenheit der Routinegestaltung auf dem Niveau des Durchschnittskönnens. In der Literatur werden viele solche Elemente beschrieben und sind durch kommerzielle Lieferanten erhältlich.
Um ein Zcyto10-Polypeptid in den Sekretionsweg einer Wirtszelle zu dirigieren, wird eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als eine Leitsequenz, Präpro-Sequenz oder Prä-Sequenz) im Expressionsvektor bereitgestellt. Die sekretorische Signalsequenz kann die des Proteins sein oder kann aus einem anderen sezernierten Protein (z. B. t-PA) derivatisiert sein oder de novo synthetisiert sein. Die sekretorische Signalsequenz wird mit der Zcyto10-DNA-Sequenz im korrekten Leserahmen verbunden. Sekretorische Signalsequenzen werden 5' von der DNA-Sequenz positioniert, die das Polypeptid von Interesse kodiert, obwohl gewisse Signalsequenzen anderswo in der DNA-Sequenz von Interesse positioniert werden können (siehe z. B. Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; Holland et al., US-Patent Nr. 5,143,830).
Verfahren für das Einführen exogener DNA in Säugerwirtszellen schließen die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, Wigler et al., Cell, 14: 725 (1978); Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics, 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology, 52: 456 (1973), die Elektroporation, Neumann et al., EMBO J., 1: 841–845 (1982), die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), und die Liposomen-vermittelte Transfektion, Hawley-Nelson et al., Focus, 15: 73 (1993); Ciccarone et al., Focus, 15: 80 (1993), ein. Die Produktion rekombinanter Polypeptide in kultivierten Säugerzellen wurde z. B. durch Levinson et al., US-Patent Nr. 4,713,339; Hagen et al., US-Patent Nr. 4,784,950; Palmiter et al., US-Patent Nr. 4,579,821 and Ringold, US-Patent Nr. 4,656,134, offenbart. Geeignete kultivierte Säugerzellen schließen die COS-1- (ATCC Nr. CRL 1650), COS-7- (ATCC Nr. CRL 1651), BHK- (ATCC Nr. CRL 1632), BHK-570- (ATCC Nr. CRL 10314), 293- [ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59–72 (1977)] und chinesische Hamster-Ovar-Zelllinien (z. B. CHO-K1; ATCC Nr. CCL 61) ein. Weitere geeignete Zelllinien sind im Stand der Technik bekannt und durch öffentliche Hinterlegungsstellen, wie die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich. Im Allgemeinen werden starke Transkriptionspromotoren bevorzugt, wie die Promotoren von SV-40 oder dem Cytomegalovirus. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,956,288. Andere geeignete Promotoren schließen jene aus Metallothioneingenen (US-Patent Nrn. 4,579,821 und 4,601,978) und den starken späten Adenoviruspromotor ein.
Arzneimittelselektion wird allgemein verwendet, um kultivierte Säugerzellen dahingehend zu selektieren, in welche Fremd-DNA eingefügt worden ist. Auf solche Zellen wird allgemein Bezug genommen als "Transfektanten". Auf Zellen, die in der Anwesenheit des Selektionsmittels kultiviert worden sind und die in der Lage sind, das Gen von Interesse an ihre Nachfahren weiterzugeben, wird Bezug genommen als "stabile Transfektanten". Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist ein Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Selektion wird in der Anwesenheit eines Arzneimittels vom Neomycintyp, wie G-418 oder Ähnliches, durchgeführt. Selektionssysteme können auch verwendet werden, um den Expressionsspiegel des Gens von Interesse zu erhöhen, ein Vorgang, auf den Bezug genommen wird als "Amplifikation". Amplifikation wird durchgeführt, indem Transfektanten in der Anwesenheit eines niedrigen Spiegels des Selektionsmittels kultiviert werden und indem dann die Menge des Selektionsmittels erhöht wird, um auf Zellen zu selektieren, die hohe Spiegel der Produkte der eingeführten Gene erzeugen. Ein bevorzugter amplifizierbarer, selektierbarer Marker ist Dihydrofolatreduktase, welches Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Andere Arzneimittelresistenz-Gene (z. B. Hygromycinresistenz, Kombinationsarzneimittelresistenz, Puromycinacetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden. Alternative Marker, die einen geänderten Phänotypen einführen, wie grünes fluoreszierendes Protein, oder Zelloberflächenproteine wie CD4, CD8, Klasse I MHC, alkalische Phosphatase aus Plazenta, können verwendet werden, um transfizierte Zellen von untransfizierten Zellen auszusortieren durch solche Mittel wie die FACS-Sortier- oder die Magnetperlen-Separationstechnologie.
Andere höhere eukaryotische Zellen können ebenfalls als Wirte verwendet werden, einschließlich Insektenzellen, Pflanzenzellen und Vogelzellen. Die Transformation von Insektenzellen und die Produktion von fremden Polypeptiden darin ist offenbart von Guarino et al., US-Patent Nr. 5,162,222; Bang et al., US-Patent Nr. 4,775,624 und in der WIPO-Veröffentlichung WO 94/06463. Die Verwendung von Agrobacterium rizogenes als ein Vektor für die Expression von Genen in Pflanzenzellen wurde zusammengefasst von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore), 11: 47–58 (1987). Insektenzellen können mit rekombinantem Baculovirus infiziert werden, gewöhnlich abgeleitet von dem Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV). Siehe L. A. King und R. D. Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); D. R. O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (University Press, New York, Oxford, 1994); und C. D. Richardson, Hrsg., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology (Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Ein zweites Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Zcyto10-Baculovirus verwendet ein transposon-basiertes System, beschrieben von V. A. Luckow et al., J. Virol., 67: 4566–79 (1993). Dieses System, welches Transfervektoren verwendet, wird in dem Bac-to-Bac^TM-Kit (Life Technologies, Rockville, MD) verkauft. Dieses System verwendet einen Transfervektor, pFastBac1^TM (Life Technologies), der ein Tn7-Transposon enthält, um die DNA, die das Zcyto10-Polypeptid kodiert, in das Baculovirusgenom zu bringen, das in E. coli als ein großes Plasmid aufrecht erhalten wird, welches ein "Bacmid" genannt wird. Siehe M. S. Hill-Perkins und R. D. Possee, J. Gen. Virol., 71: 971–6, (1990); B. C. Bonning et al., J. Gen. Virol., 75: 1551–6 (1994); und G. D. Chazenbalk und B. Rapoport, J. Biol. Chem., 270: 1543–9 (1995). Zusätzlich können Transfervektoren eine Fusion im Leseraster mit DNA enthalten, die einen Epitopanhang am C- oder N-Terminus des exprimierten Zcyto10-Polypeptids, z. B. einen Glu-Glu-Epitopanhang, kodiert, T. Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 7952–4 (1985). Unter Verwendung einer im Stand der Technik bekannten Technik wird ein Transfervektor, der Zcyto10 enthält, in E. coli übertragen und auf Bacmide gescreent, die ein unterbrochenes lacZ-Gen enthalten, was für das rekombinante Baculovirus kennzeichnend ist. Die Bacmid-DNA, die das rekombinante Baculovirusgenom enthält, wird unter Verwendung von gewöhnlichen Techniken isoliert und wird verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen, z. B. Sf9-Zellen, zu transfizieren. Daraufhin wird ein rekombinantes Virus, das Zcyto10 exprimiert, produziert. Durch im Stand der Technik gewöhnlich verwendete Verfahren werden rekombinante virale Materialien hergestellt.
Das rekombinante Virus wird verwendet, um Wirtszellen zu infizieren, typischerweise eine Zelllinie, die von dem Heerwurm, Spodoptera frugiperda, abgeleitet ist. Siehe im Allgemeinen Glick und Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C. (1994). Eine andere geeignete Zelllinie ist die High FiveO^TM-Zelllinie (Invitrogen), abgeleitet von Trichoplusia ni (US-Patent Nr. 5,300,435). Im Handel erhältliche serumfreie Medien werden verwendet, um die Zellen wachsen zu lassen und aufrechtzuerhalten. Geeignete Medien sind Sf900 II^TM (Life Technologies) oder ESF 921^TM (Expression Systems) für die Sf9-Zellen; und ExcellO405^TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder Express FiveO^TM (Life Technologies) für die T. ni-Zellen. Die Zellen werden von einer Inokulationsdichte von ungefähr 2–5 × 10⁵ Zellen bis zu einer Dichte von 1–2 × 10⁶ Zellen wachsen gelassen, zu welchem Zeitpunkt ein rekombinanter viraler Stamm in einer Multiplizität einer Infektion (MOI) von 0,1 bis 10, typischerweise in der Nähe von 3, hinzugefügt wird. Die verwendeten Vorgänge werden allgemein beschrieben in zugänglichen Laborhandbüchern (L. A. King und R. D. Possee, ebenda; D. R. O'Reilly et al., ebenda; C. D. Richardson, ebenda). Die nachfolgende Aufreinigung des Zcyto10-Polypeptides aus dem Überstand kann unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren erreicht werden.
Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, und insbesondere Zellen der Art Saccharomyces, können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie für die Herstellung von Proteinfragmenten oder Polypeptidfusionen. Verfahren für die Transformation von Hefezellen mit exogener DNA und für die Herstellung von rekombinanten Polypeptiden daraus, werden z. B. offenbart durch Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311; Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,931,373; Brake, US-Patent Nr. 4,870,008; Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; und Murray et al., US-Patent Nr. 4,845,075. Transformierte Zellen werden über den Phänotyp ausgewählt, der durch den selektierbaren Marker bestimmt wird, gewöhnlich Arzneimittelresistenz, oder die Fähigkeit, in der Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes (z. B. Leucin) zu wachsen. Ein bevorzugtes Vektorsystem für die Verwendung von Hefe ist das POT1-Vektorsystem, offenbart von Kawasaki et al. (US-Patent Nr. 4,931,373), welches transformierten Zellen ermöglicht, durch Wachstum in Glucose enthaltenden Medien selektiert zu werden. Geeignete Promotoren und Terminationssequenzen zur Verwendung in Hefe schließen jene aus glykolytischen Enzymgenen (siehe z. B. Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311; Kingsman et al., U.S. Patent Nr. 4,615,974; und Bitter, US-Patent Nr. 4,977,092) und Alkoholdehydrogenase-Genen ein. Siehe auch US-Patente Nrn. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 und 4,661,454. Transformationssysteme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132: 3459–3465 (1986), und Cregg, US-Patent Nr. 4,882,279. Aspergillus-Zellen können gemäß den Verfahren nach McKnight et al., US-Patent Nr. 4,935,349, verwendet werden. Verfahren für die Transformation von Acremonium chrysogenum werden durch Sumino et al., US-Patent Nr. 5,162,228. Verfahren für die Transformation von Neurospora werden von Lambowitz, US-Patent Nr. 4,486,533, offenbart.
Die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Herstellung rekombinanter Proteine ist in den WIPO-Veröffentlichungen WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565 offenbart. DNA-Moleküle für die Verwendung bei der Transformation von P. methanolica werden gewöhnlich als doppelsträngige, zirkuläre Plasmide zubereitet werden, die vorzugsweise vor der Transformation linearisiert werden. Für die Polypeptidproduktion in P. methanolica wird bevorzugt, dass der Promotor und die Terminationssequenz in dem Plasmid jene eines P. methanolica-Gens, wie eines P. methanolica-Alkoholverwendungsgens (AUG1 oder AUG2) ist. Andere nützliche Promotoren schließen jene der Dihydroxyacetonsynthase-(DHAS)-, Formatdehydrogenase-(FMD)- und Catalase-(CAT)-Gene ein. Um die Integration der DNA in das Wirtschromosom zu erleichtern, wird bevorzugt, dass das gesamte Expressionssegment des Plasmids an beiden Enden durch Wirt-DNA-Sequenzen flankiert wird. Ein bevorzugter selektierbarer Marker für die Verwendung in Pichia methanolica ist ein P. methanolica-ADE2-Gen, welches Phosphoribosyl-5-aminoimidazolcarboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) kodiert, welches ade2-Wirtszellen ermöglicht, in Abwesenheit von Adenin zu wachsen. Für industrielle Prozesse im großen Maßstab, wo es wünschenswert ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, wird bevorzugt, Wirtszellen zu verwenden, bei denen beide Methanolverwendungsgene (AUG1 und AUG2) deletiert worden sind. Für die Herstellung sezernierter Proteine werden Wirtszellen, denen Vakuolenproteasegene (PEP4 und PRB1) fehlen, bevorzugt. Elektroporation wird verwendet, um das Einführen eines Plasmids, das DNA enthält, welche ein Polypeptid von Interesse kodiert, in P. methanolica-Zellen zu erleichtern. Es wird bevorzugt, P. methanolica-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung eines exponentiell abnehmenden, gepulsten elektrischen Feldes mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise ungefähr 3,75 kV/cm, und mit einer Zeitkonstante (τ) von 1 bis 40 Millisekunden, am bevorzugtesten ungefähr 20 Millisekunden, zu transformieren.
Prokaryotische Wirtszellen, einschließlich der Bakterien Escherichia coli, Bacillus und anderen Arten sind ebenfalls nützliche Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung. Techniken für die Transformation dieser Wirte und das Exprimieren fremder DNA-Sequenzen, die darin kloniert sind, sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., ebenda). Wenn ein Zcyto10-Polypeptid in Bakterien wie E. coli exprimiert wird, kann das Polypeptid im Zytoplasma zurückgehalten werden, typischerweise als unlösliche Granula, oder kann auf dem periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz gerichtet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert und die Granulae werden wiedergewonnen und unter Verwendung von z. B. Guanidinisothiocyanat oder Harnstoff denaturiert. Das denaturierte Polypeptid kann dann rückgefaltet und dimerisiert werden durch Verdünnen des Denaturierungsmittels, wie z. B. durch Dialyse gegen eine Lösung aus Harnstoff und eine Kombination aus reduziertem und oxidiertem Glutathion, gefolgt von der Dialyse gegen eine gepufferte Salzlösung. Im letzteren Fall kann das Polypeptid aus dem periplasmatischen Raum in einer löslichen und funktionellen Form durch Aufbrechen der Zellen (durch z. B. Beschallung oder osmotischen Schock) wiedergewonnen werden, um die Inhalte des periplasmatischen Raums zu entlassen, und durch Wiedergewinnen des Proteins, wobei die Notwendigkeit für Denaturierung und Rückfaltung überflüssig gemacht wird.
Transformierte oder transfizierte Wirtszellen werden gemäß gewöhnlichen Vorgängen in einem Kulturmedium, das Nährstoffe und andere Bestandteile enthält, die für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen benötigt werden, kultiviert. Eine Reihe an geeigneten Medien, einschließlich definierten Medien und Komplexmedien, sind im Stand der Technik bekannt und schließen im Allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essenzielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien ein. Medien können auch solche Bestandteile wie Wachstumsfaktoren oder Serum, soweit benötigt, enthalten. Das Wachstumsmedium wird allgemein nach Zellen selektieren, welche die exogen hinzugefügte DNA enthalten, durch z. B. Arzneimittelselektion oder der Ermangelung eines essenziellen Nährstoffes, was durch den selektierbaren Marker, der auf dem Expressionsvektor getragen wird oder in die Wirtszelle co-transfiziert wurde, ergänzt wird. P. methanolica-Zellen werden in einem Medium, welches geeignete Quellen an Kohlenstoff, Stickstoff und Spuren von Nährstoffen umfasst, bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 35°C kultiviert. Flüssige Kulturen werden mit ausreichend Belüftung durch gewöhnliche Mittel, wie durch Schütteln kleiner Kolben oder dem Einperlen in Fermentern, versorgt. Ein bevorzugtes Kulturmedium für P. methanolica ist YEPD (2% D-Glukose, 2% Bacto^TM-Pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto^TM-Hefeextrakt (Difco Laboratories), 0,004% Adenin und 0,006% L-Leucin).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues Protein durch eine kultivierte Zelle hergestellt und die Zelle wird verwendet, um auf einen Rezeptor oder Rezeptoren für das Protein, einschließlich dem natürlichen Rezeptor, ebenso wie Agonisten oder Antagonisten des natürlichen Liganden zu screenen.
PROTEINISOLIERUNG
Es ist bevorzugt, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bis zu einer Reinheit von ≥ 80%, bevorzugter ≥ 90% und sogar noch bevorzugter ≥ 95% aufzureinigen, und besonders bevorzugt ist ein pharmazeutisch reiner Zustand, welcher zu mehr als 99,9% bezüglich kontaminierender Makromoleküle, insbesondere anderen Proteinen und Nucleinsäuren, rein ist und der frei von infektiösen und pyrogenen Mitteln ist. Vorzugsweise ist ein gereinigtes Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs.
Exprimierte rekombinante Polypeptide (oder chimäre Polypeptide) können unter Verwendung von Fraktionierung und/oder gewöhnlichen Reinigungsverfahren und -medien gereinigt werden. Ammoniumsulfatfällung und saure oder chaotrope Extraktion können für die Fraktionierung von Proben verwendet werden. Beispielhafte Reinigungsschritte können Hydroxyapatit, Größenausschluss-Chromatographie, FPLC- und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie einschließen. Geeignete Anionaustauschermedien schließen derivatisierte Dextrane, Agarose, Zellulose, Polyacrylamid, Spezialkieselsäuren und Ähnliches ein. PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate werden bevorzugt, wobei DEAE Fast-Flow-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) besonders bevorzugt wird. Exemplarische chromatographische Medien schließen jene Medien, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octylgruppen derivatisiert sind, wie Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) und Ähnliches; oder Polyacrylharze wie Amberchrom CG 71 (Toso Haas) und Ähnliche ein. Geeignete feste Träger schließen Glasperlen, auf Kieselsäure basierende Harze, Zelluloseharze, Agaroseperlen, quervernetzte Agaroseperlen, Polystyrolkugeln, quervernetzte Polyacrylamidharze und Ähnliche ein, die unter den Bedingungen, bei welchen sie verwendet werden sollen, unlöslich sind. Diese Träger können mit reaktiven Gruppen modifiziert werden, die das Anhängen von Proteinen durch Aminogruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Kohlenhydrateinheiten erlauben. Beispiele der Kopplungschemie schließen Cyanogenbromidaktivierung, N-Hydroxysuccinimidaktivierung, Epoxidaktivierung, Sulfhydrylaktivierung, Hydrazidaktivierung und Carboxyl- und Aminoderivate für Carbodiimidkopplungschemie ein. Diese und andere feste Medien sind wohl bekannt und werden im Stand der Technik weit verwendet und sind von gewerblichen Lieferanten erhältlich. Verfahren, um Rezeptor-Polypeptide an Trägermedien zu binden, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens ist eine Angelegenheit der Routinegestaltung und wird zum Teil durch die Eigenschaften des gewählten Untergrundes bestimmt. Siehe z. B. Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch das Ausnutzen ihrer Eigenschaften isoliert werden. Zum Beispiel kann die immobilisierte Metall-Affinitäts-(IMAC)-Chromatographie verwendet werden, um histidinreiche Proteine zu reinigen. Kurz, ein Gel wird zuerst mit divalenten Metallionen beladen, um ein Chelat zu bilden (E. Sulkowski, Trends in Biochem., 3: 1–7 (1985)). Histidinreiche Proteine werden auf dieser Matrix mit unterschiedlichen Affinitäten adsorbiert werden, in Abhängigkeit von dem verwendeten Metallion, und werden durch kompetitive Elution, Erniedrigung des pH-Wertes oder die Verwendung von starken Komplexbildnern eluiert werden. Andere Verfahren der Aufreinigung schließen die Reinigung glykosylierter Proteine durch Lectin-Affinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie ein (Methods in Enzymol., Band 182 "Guide to Protein Purification", M. Deutscher (Hrsg.), S. 529–539 (Acad. Press, San Diego, 1990). Alternativ kann eine Fusion des Polypeptides von Interesse mit einem Affinitätsanhang (z. B. Polyhistidin, Maltose bindendes Protein, Immunglobulindomäne) konstruiert werden, um die Aufreinigung zu erleichtern.
Verwendungen
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat die strukturellen Eigenschaften eines Vier-Helix-Bündel-Cytokins. Ein Protein ist im Allgemeinen charakterisiert als ein Cytokin auf Grund seiner Löslichkeit und der Fähigkeit, über Zelloberflächenrezeptoren zu wirken, um Zellproliferation zu signalisieren und zu modulieren. Cytokine fallen in etliche Klassen tertiär-struktureller Faltung, einschließlich cysteinreichen Dimeren (z. B. Insulin, PDGF), Beta-Kleeblattfaltungen (z. B. FGF, IL-1) und reine Alpha-Vier-Helix-Bündel. Die letzteren sind durch vier Helices charakterisiert, bezeichnet als A, B, C und D, in einer einheitlich Auf-Auf-Ab-Ab-Topologie, wo zwei Schleifen von oben die Helices A und B und die Helices C und D verbinden. Siehe z. B. Manavalan et al., Journal of Protein Chemistry, 11 (3): 321–31 (1992). Die Vier-Helix-Bündel-Cytokine sind manchmal weiter in kurzkettig (z. B. IL-4, IL-2, GM-CSF) und langkettig (z. B. TPO, Wachstumshormon, Leptin, IL-10) unterteilt, wobei die letzteren im Allgemeinen längere A- und D-Helices und Schleifen von oben zeigen. Von nun an sollen wir den Begriff "Cytokin" synonym verwenden mit "Vier-Helix-Bündel-Cytokin". Helix A von Zcyto10 schließt den Aminosäurerest 35, ein Isoleucin, bis zum Aminosäurerest 49, ein Isoleucin, ein, auch definiert durch SEQ ID Nr. 14; Helix B schließt die Aminosäure 91, ein Leucin, bis zur Aminosäure 105, ein Threonin, ein, auch definiert durch SEQ ID Nr. 15; Helix C schließt den Aminosäurerest 112, ein Leucin, bis zum Aminosäurerest 126, ein Cystein, ein, auch definiert durch SEQ ID Nr. 16; Helix D schließt den Aminosäurerest 158, ein Valin, bis zum Aminosäurerest 172, ein Methionin, ein, auch definiert durch SEQ ID Nr. 17.
Menschliches Zcyto10 hat eine intramolekulare Disulfidbindung zwischen Cys33 und Cys126. Von den anderen vier Cysteinen, Cys80, Cys132, Cys81 und Cys134 wird vorhergesagt, dass sie zwei intramolekulare Disulfidbindungen in der Anordnung Cys80-Cys132 und Cys81-Cys134 bilden. Reste, von denen vorhergesagt wird, dass sie für die strukturelle Stabilität von Zcyto10 unabdingbar sind, schließen Cys33, Cys126, Cys80, Cys132, Cys81 und Cys134 ein. Von der Mutation jeder dieser Reste zu irgendeinem anderen Rest wird erwartet, dass sie die Funktion von Zcyto10 inaktivieren wird.
Die strukturelle Stabilität von Zcyto10 hängt auch von der Aufrechterhaltung einer verborgenen hydrophoben Fläche auf den vier Alphahelices ab. Die Reste Ile42, Phe46, Ile49, Leu91, Val94, Phe95, Tyr98, Leu112, Phe116, Ile119, Leu123, Val158, Leu162, Leu165, Leu168, Leu169 und Met172 wird vorhergesagt, dass sie in dem Kern des Proteins verborgen sind und dass, falls sie geändert werden, der substituierte Aminosäurerest eine hydrophobe Aminosäure sein muss.
Reste, von denen erwartet wird, dass sie in die Bindung von Zcyto10 an einen Zelloberflächenrezeptor verwickelt sind, schließen Asp57, auf der Schleife von oben zwischen Helix A und B, und Lys160 und Glu164 ein, geladene Reste, von denen vorhergesagt wird, dass sie auf der Oberfläche der Helix D exponiert sind. Auf der Oberfläche des Proteins, auf den Schleife-AB- und Helix-D-Bereichen, befindet sich ein hydrophober Oberflächenfleck, umfassend die Reste Ile62, Leu71, Ile167 und Trp171. Diese Reste können mit einem hydrophoben Oberflächenfleck auf einem Zelloberflächenrezeptor in Wechselwirkung treten.
Das menschliche Zcyto10-Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat ungefähr eine Identität von 28% mit Interleukin-10 (IL-10). Maus-Zcyto10-Polypeptid hat eine ungefähr 24%ige Identität mit menschlichen IL-10 und eine ungefähr 27%ige Identität mit dem Maus-IL-10. Menschliches Zcyto10-Polypeptid hat eine ungefähr 76%ige Identität mit dem Maus-Zcyto10-Polypeptid.
Die Helix A von Maus-Zcyto10 schließt den Aminosäurerest 35, ein Isoleucin, bis zum Aminosäurerest 49, ein Arginin, der SEQ ID Nr. 19 ein, ebenso definiert durch SEQ ID Nr. 21. Die Helix B von Maus-Zcyto10 schließt den Aminosäurerest 91, ein Leucin, bis zum Aminosäurerest 105, ein Threonin, der SEQ ID Nr. 19 ein, ebenso definiert durch die SEQ ID Nr. 22. Die Helix C von Maus-Zcyto10 schließt den Aminosäurerest 112, ein Leucin, bis zum Aminosäurerest 126, ein Cystein, von SEQ ID Nr. 19 ein, ebenso definiert durch SEQ ID Nr. 23. Helix D von Maus-Zcyto10 schließt den Aminosäurerest 158, ein Valin, bis zum Aminosäurerest 172, ein Methionin, der SEQ ID Nr. 19 ein, ebenso definiert durch die SEQ ID Nr. 24.
IL-10 ist ein Cytokin, das die Produktion anderer Cytokine inhibiert, die Proliferation und die Differenzierung aktivierter B-Lymphozyten induziert, die HIV-I-Replikation inhibiert und antagonistische Wirkungen auf Gamma-Interferon ausübt. IL-10 scheint als ein Dimer vorzukommen, gebildet aus zwei alphahelikalen Polypeptidbereichen, die zueinander durch eine 180°-Rotation in Beziehung stehen. Siehe z. B. Zdanov et al., Structure: 3 (6): 591–601 (1996). Von IL-10 wurde berichtet, dass es ein Produkt aktivierter Th2-T-Zellen, B-Zellen, Keratinocyten und Monocyten/Makrophagen ist, das in der Lage ist, eine Thl-T-Zellantwort zu modulieren. Solch eine Modulation kann durch die Inhibition der Cytokinsynthese durch Thl-T-Zellen bewirkt werden. Siehe z. B. Hus et al., Int. Immunol., 4: 563 (1992), und D'Andrea et al., J. Exp. Med., 178: 1042 (1992). Von IL-10 wurde auch berichtet, dass es die Cytokinsynthese durch natürliche Killerzellen und Monocyten/Makrophagen inhibiert. Siehe z. B. Hus et al., zitiert oben, und Fiorentino et al., Int. Immunol., 146: 3444 (1991). Zusätzlich wurde von IL-10 gefunden, dass es eine schützende Wirkung bezüglich insulinabhängigem Diabetes Mellitus hat.
Bei der Analyse der Gewebeverteilung der mRNA, die dieser neuen DNA entspricht, wurde ein einzelnes Transkript in einer Größe von annähernd 1,2 kb beobachtet. Unter Verwendung von Clontech Multiple Tissue Northerns wurde das menschliche Transkript in der Luftröhre, der Plazenta, den Hoden, der Haut, den Speicheldrüsen, der Prostata, der Schilddrüse ersichtlich, wobei eine geringere Expression im Magen und im Pankreas beobachtet wurde. Zcyto10 wurde in den folgenden Mausgeweben exprimiert: Niere, Skelettmuskel, Speicheldrüse, Leber und Haut.
Die Gewebespezifität der Zcyto10-Expression legt nahe, dass Zcyto10 ein Wachstums- und/oder Aufrechterhaltungsfaktor in der Luftröhre und den Speicheldrüsen, in Magen, Pankreas und Muskel ist und dass es in lokalen Immunantworten wichtig sein könnte. Auch zeigt die Lokalisierung des Zcyto10-Gens auf dem Chromosom lg32.2, dass Zcyto10 ein Wachstum-/Differenzierungsfaktor ist oder dass es wichtig ist bei der Regulierung der Immunantwort von IL-10.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien bereit, die in diagnostischen Anwendungen Nutzen finden werden. Eine Sonde, umfassend die Zcyto10-DNA oder -RNA oder eine Untersequenz davon, kann verwendet werden, um festzustellen, ob das Zcyto10-Gen auf dem Chromosom 1 vorhanden ist oder ob eine Mutation geschehen ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien mit signifikantem therapeutischen Wert bereit. Das Zcyto10-Polypeptid (natürlich vorkommend oder rekombinant), Fragmente davon, Antikörper und antiidiotypische Antikörper dafür, gemeinsam mit Verbindungen, die als eine Bindungsaffinität für das Zcyto10-Polypeptid aufweisend erkannt wurden, sollten bei der Behandlung von Zuständen nützlich sein, die mit anormaler Physiologie oder Entwicklung, einschließlich anormaler Proliferation, z. B. Krebszuständen, oder degenerativen Zuständen oder geänderter Immunität verbunden sind.
Antikörper gegen das Zcyto10-Polypeptid können aufgereinigt und dann einem Patienten verabreicht werden. Diese Reagenzien können für die therapeutische Verwendung mit zusätzlichen aktiven oder inerten Bestandteilen, z. B. in pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln, gemeinsam mit physiologisch unbedenklichen Stabilisierungsmitteln und Auszugsmitteln, kombiniert werden. Diese Kombinationen können steril filtriert und in Dosierungsformen gegeben werden, z. B. durch Lyophilisierung in Dosierungsfläschchen oder durch Lagerung in stabilisierten wässrigen Zubereitungen. Diese Erfindung bedenkt auch die Verwendung von Antikörpern, Bindungsfragmenten davon oder einzelkettigen Antikörpern der Antikörper, einschließlich Formen, die nicht Komplement-bindend sind.
Die Mengen an Reaktionsmittel, die für die wirksame Therapie notwendig sind, werden von vielen unterschiedlichen Faktoren abhängen, einschließlich den Mitteln der Verabreichung, der Zielstelle, dem physiologischen Zustand des Patienten und anderen verabreichten Medikationen. Folglich sollten die Behandlungsdosierungen titriert werden, um Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise werden in vitro verwendete Dosen eine nützliche Führung für die Mengen bereitstellen, die für die in vivo-Verabreichung dieser Reagenzien nützlich sind. Tierversuche von wirksamen Dosen für die Behandlung bestimmter Störungen werden weiter eine vorhersagende Indikation der menschlichen Dosierung bereitstellen. Verfahren für die Verabreichung schließen die orale, intravenöse, peritoneale, intramuskuläre, transdermale oder die Verabreichung in die Lunge oder die Luftröhre in Sprayform mittels eines Vernebelungs- und Sprühapparates ein. Pharmazeutisch annehmbare Träger werden Wasser, Salzlösung, Puffer, um nur einige zu nennen, einschließen. Dosierungsbereiche werden gewöhnlich in einem Bereich von 1 μg bis 1000 μg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag erwartet werden. Diese Dosen können jedoch höher oder niedriger sein, wie durch einen medizinischen Doktor mit gewöhnlichem Fachwissen bestimmt werden kann. Für eine vollständige Diskussion der Arzneimittelformulierungen und Dosierungsbereiche siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl. (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996), und Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9. Aufl. (Pergamon Press 1996).
Nukleinsäure-basierte therapeutische Behandlung
Falls ein Säuger ein mutiertes Zcyto10-Gen hat oder es ihm fehlt, kann das Zcyto10-Gen in die Zellen des Säugers eingeführt werden. In einem Ausführungsbeispiel wird ein Gen, das ein Zcyto10-Polypeptid kodiert, in vivo in einen viralen Vektor eingeführt. Solche Vektoren schließen ein abgeschwächtes oder defektes DNA-Virus ein, wie z. B., jedoch nicht begrenzt auf Herpes simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus (AAV) und Ähnliche. Fehlerhafte Viren, denen vollständig oder annähernd vollständig virale Gene fehlen, werden bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach der Einführung in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwendung defekter viraler Vektoren ermöglicht die Verabreichung an Zellen in einem spezifischen, lokalen Bereich, ohne Sorge, dass der Vektor andere Zellen infizieren könnte. Beispiele besonderer Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf einen defekten Herpesvirus-1-(HSV1)-Vektor [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320–330 (1991)], einen abgeschwächten Adenovirusvektor, wie der Vektor, der beschrieben wurde durch Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626–630 (1992), und einen defekten adeno-assozierten Virus-Vektor [Samulski-et al., J. Viral., 61: 3096–3101 (1987); Samulski et al., J. Viral., 63: 3822–3828 (1989)].
In einem anderen Ausführungsbeispiel kann das Gen in einen retroviralen Vektor eingeführt werden, z. B. wie beschrieben in Anderson et al., US-Patent Nr. 5,399,346; Mann et al., Cell, 33: 153 (1983); Temin et al., US-Patent Nr. 4,650,764; Temin et al., US-Patent Nr. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988); Temin et al., US-Patent. Nr. 5,124,263; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358, veröffentlicht am 16. März 1995 durch Dougherty et al.; und Blood, 82: 845 (1993). Alternativ kann der Vektor durch Lipofektion in vivo unter Verwendung von Liposomen eingeführt werden. Synthetische kationische Lipide können verwendet werden, um Liposomen für die in vivo-Transfektion eines Gens, das einen Marker kodiert, zuzubereiten [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987); siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027–8031 (1988)]. Die Verwendung der Lipofektion, um exogene Gene in spezifische Organe in vivo einzuführen, hat gewisse praktische Vorteile. Das molekulare Targeting von Liposomen auf spezifische Zellen bildet einen Nutzbereich ab. Es ist klar, dass das Richten der Transfektion auf bestimmte Zellen einen Nutzbereich abbildet. Es ist klar, dass das Richten der Transfektion auf bestimmte Zelltypen besonders vorteilhaft in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität wie dem Pankreas, der Leber, der Niere und dem Gehirn sein würde. Lipide können chemisch an andere Moleküle zum Zwecke des Targeting gekoppelt werden. Gerichtete Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter, und Proteine wie Antikörper oder Nicht-Peptid-Moleküle könnten an Liposomen chemisch gekoppelt werden. Diese Liposomen können auch in Sprayform der Lunge oder Luftröhre mittels eines Sprüh- oder Verdunstungsapparates verabreicht werden.
Es ist möglich, die Zellen aus dem Körper zu entfernen und den Vektor als ein nacktes DNA-Plasmid einzuführen und dann die transformierten Zellen in den Körper zu reimplantieren. Ein nackter DNA-Vektor für die Gentherapie kann in die gewünschten Wirtszellen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingeführt werden, z. B. durch Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatfällung, die Verwendung einer Genkanone oder die Verwendung eines DNA-Vektortransporters [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963–967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 14621–14624 (1988)].
Zcyto10-Polypeptide können auch verwendet werden, um Antikörper zuzubereiten, die spezifisch an Zcyto10-Polypeptide binden. Diese Antikörper können dann verwendet werden, um antiidiotypische Antikörper herzustellen. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Antigen bindende Fragmente davon wie F(ab')₂- und Fab-Fragmente und Ähnliches ein, einschließlich gentechnisch veränderter Antikörper. Antikörper werden als spezifisch bindend seiend definiert, falls sie an ein Zcyto10-Polypeptid mit einem K_a-Wert von mehr als oder gleich 10⁷/M binden. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers kann leicht von einem Durchschnittsfachmann bestimmt werden (siehe z. B. Scatchard, ebenda).
Verfahren für die Zubereitung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (Cold Spring Harbor, NY, 1989); und J. G. R. Hurrell, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982), die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen werden).
Wie für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich sein würde, können polyklonale Antikörper aus einer Reihe warmblütiger Tiere wie Pferde, Kühe, Ziegen, Schafe, Hunde, Hühner, Kaninchen, Mäuse und Ratten erzeugt werden. Die Immunogenität eines Zcyto10-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans wie Freund's vollständiges oder unvollständiges Adjuvans erhöht werden. Eine Reihe an Tests, die Fachleuten bekannt sind, kann verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch an Zcyto10-Polypeptide binden. Beispielhafte Tests werden im Detail in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988), beschrieben. Repräsentative Beispiele solcher Untersuchungen schließen die gleichzeitige Immunelektrophorese, Radioimmununtersuchungen, Radioimmunfällungen, enzymgekoppelte Immunabsorptionsuntersuchungen (ELISA), Dot-Blot-Untersuchungen, Inhibitions- oder Kompetitionsuntersuchungen und Sandwichuntersuchungen ein.
Antikörper gegen Zcyto10 können für das Markieren von Zellen verwendet werden, die das Protein exprimieren, für die Affinitätsaufreinigung, in diagnostischen Tests für die Bestimmung zirkulierender Spiegel löslicher Proteinpolypeptide und als Antagonisten, um die Ligandenbindung und Signaltransduktion in vitro und in vivo zu hemmen.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zubereitung bereitgestellt, umfassend gereinigtes Zcyto10-Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel. Solche Zubereitungen können für die Modulierung der Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Cytokinproduktion bei der Vorbeugung oder Behandlung von Zuständen, die durch unrichtige Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Cytokinproduktion gekennzeichnet sind, wie weiter hierin diskutiert werden wird, nützlich sein. Weiterhin können Zcyto10-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in harnröhrenspezifischen oder tracheobronchialspezifischen Anwendungen verwendet werden, wie bei der Erhaltung oder Wundreparatur des tracheobronchialen Epitheliums oder von Zellen, die selbigem zu Grunde liegen, bei der Regulierung der Schleimproduktion oder der mucociliären Räumung von Debris oder bei der Behandlung von Asthma, Bronchitis oder anderen Erkrankungen des Tracheobronchialtraktes. Es wird erwartet werden, dass das Zcyto10-Polypeptid in einer Dosis verabreicht werden würde, die sich im Bereich derselben Dosen bewegt, wie sie für das Zcyto10-Fc-Konstrukt verwendet wurde, bis zu Dosen, die 100-fach höher sind, in Abhängigkeit von der Stabilität des Zcyto10-Polypeptides. Therapeutische Dosen von Zcyto10 würden sich in einem Bereich von 5 bis 5000 μg/kg/Tag bewegen.
Das Zcyto10-Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird hochexprimiert in der Speicheldrüse und der Luftröhre und wurde im Speichel durch Western-Blot-Analyse gefunden. Die Speicheldrüsen synthetisieren und sezernieren eine Anzahl von Proteinen mit verschiedenen biologischen Funktionen. Solche Proteine erleichtern die Befeuchtung der Mundhöhle (z. B. Mucine und prolinreiche Proteine), die Remineralisierung (z. B. Statherin und ionische prolinreiche Proteine) und die Verdauung (z. B. Amylase, Lipase und Proteanen) und stellen Fähigkeiten für die antimikrobielle (z. B. prolinreiche Proteine, Lysozym, Histatine und Lactoperoxidase) und die mukosale (z. B. Mucine) Aufrechterhaltung der Integrität bereit. Zusätzlich ist Speichel eine reiche Quelle für Wachstumsfaktoren, die durch die Speicheldrüsen synthetisiert werden. Zum Beispiel ist von Speichel bekannt, dass er epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Transformierender Wachstumsfaktor Alpha (TGF-α), Transformierender Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), Insulin, insulinähnliche Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I und IGF-II) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) enthält. Siehe z. B. Zelles et al., J. Dental. Res., 74 (12): 1826–32, 1995. Von der Synthese von Wachstumsfaktoren durch die Speicheldrüse wird angenommen, dass sie androgen-abhängig ist und dass sie für die Gesundheit der Mundhöhle und des Gastrointestinaltraktes notwendig ist.
Folglich können Zcyto10-Polypeptide, Agonisten oder Antagonisten davon therapeutisch für die Herstellung von Medikamenten für die Regeneration des Gastrointestinaltraktes oder der Mundhöhle nützlich sein. Um diese Anwesenheit dieser Fähigkeit in Zcyto10-Polypeptiden, Agonisten oder Antagonisten der vorliegenden Erfindung zu verifizieren, werden Zcyto10-Polypeptide, Agonisten oder Antagonisten bezüglich ihrer Fähigkeit beurteilt, Stärke gemäß im Stand der Technik bekannten Vorgängen zu spalten. Zcyto10-Polypeptide, Agonisten oder Antagonisten davon können auch verwendet werden bei der Herstellung von Medikamenten, die den Muskeltonus im Tracheobronchialtrakt modulieren.
Strahlungshybridmarkierung ist eine genetische Technik für somatische Zellen, entwickelt für die Konstruktion hoch auflösender, überlappender Karten von Säugerchromosomen [Cox et al., Science, 250: 245–250 (1990)]. Die teilweise oder vollständige Kenntnis einer Gensequenz ermöglicht die Gestaltung von PCR-Primern, die geeignet sind für die Verwendung mit chromosomalen Strahlungshybridkartierungsplatten. Im Handel erhältliche Strahlungshybridkartierungsplatten, die das gesamte menschliche Genom abdecken, wie das Stanford-G3-RH-Panel und das GeneBridge-4-RH-Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), sind erhältlich. Diese Platten ermöglichen, die schnellen, auf PCR-basierenden, chromosomalen Lokalisierungen und Anordnung von Genen, sequenzmarkierten Stellen (STSs) und anderen nicht polymorphen und polymorphen Markern innerhalb eines Bereiches von Interesse. Dies schließt die Etablierung direkt proportionaler physikalischer Abstände zwischen neu entdeckten Genen von Interesse und zuvor kartierten Markern ein. Die genaue Kenntnis der Position eines Gens kann nützlich sein bei einer Anzahl an Wegen, einschließlich: 1) der Bestimmung, ob eine Sequenz Teil eines existierenden Contigs ist und der Gewinnung zusätzlicher umgebender Gensequenzen in verschiedenen Formen wie YAC-, BAC- oder cDNA-Klonen, 2) der Bereitstellung eines möglichen Kandidatengens für eine vererbbare Erkrankung, die eine Verknüpfung mit demselben Chromosomenbereich zeigt, und 3) um Modellorganismen wie die Maus über Kreuz in Beziehung zu setzen, was von Nutzen sein kann dabei zu helfen, zu bestimmen, welche Funktion ein bestimmtes Gen haben könnte.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Zcyto10-Gen 889.26 cR 3000 von dem oberen Ende der Kopplungsgruppe des menschlichen Chromosoms 1 auf der WICGR-Strahlungshybridkarte kartiert. Proximate und distale Gerüstmarker waren D1S504 bzw. WI-9641 (D1S2427). Die Verwendung der umgebenden Marker positioniert das Zcyto10-Gen in dem lg32.2-Bereich auf der integrierten LDB-Karte des Chromosoms 1 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW-Server: httpa/cedar.genetics.soton.ac.uk/public_–html/). Zahlreiche Gene wurden für den lg32.2-Bereich des Chromosoms 1 kartiert. Insbesondere wurde gefunden, dass Mutationen in diesem Bereich in dem van-der-Woude-Syndrom resultieren, verbunden mit Fehlbildung der Unterlippe, die manchmal verbunden ist mit einer Gaumenspalte. Folglich kann das Zcyto10-Gen, das in der Speicheldrüse exprimiert wird, bei der Gentherapie dieses Syndroms verwendet werden. Falls ein Säuger ein mutiertes Zcyto10-Gen hat oder es ihm fehlt, kann das Zcyto10-Gen in die Zellen des Säugers eingeführt werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Gegensinn-Polynucleotid-Zubereitungen ein, die komplementär sind zu einem Segment des Polynucleotids, wie es in den SEQ ID Nrn. 1, 3, 18 und 33 angeordnet ist. Solche synthetische Gegensinn-Oligonucleotide werden gestaltet, um an mRNA zu binden, die Zcyto10-Polypeptide kodiert, und um die Translation solcher mRNA zu inhibieren. Solche Gegensinn-Oligonucleotide sind nützlich, die Expression von Genen, die das Zcyto10-Polypeptid kodieren, in Zellkultur oder in einem Patienten zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien bereit, die Nutzen in diagnostischen Anwendungen finden werden. Zum Beispiel kann das Zcyto10-Gen eine Sonde, umfassend Zcyto10-DNA- oder -RNA oder eine Untersequenz davon, verwenden, um festzustellen, ob das Zcyto10-Gen auf dem Chromosom 1 vorhanden ist oder ob eine Mutation geschah. Nachweisbare chromosomale Chromosomenaberrationen am Zcyto10-Gen-Locus schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Aneuploidie, Änderungen der Anzahl der Genkopien, Insertionen, Deletionen, Änderungen der Restriktionsstelle und Umordnungen. Solche Aberrationen können unter Verwendung von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, indem molekulargenetische Techniken wie die Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse, die Short-Tandem-Repeat (STR)-Analyse unter Verwendung von PCR-Techniken und andere Analysetechniken der genetischen Kopplung, die im Stand der Technik bekannt sind [Sambrook et al., ebenda; Ausubel et al., ebenda; A. J. Marian, Chest, 108: 255–265 (1995)] angewendet werden.
Fachleute werden bemerken, dass die in den SEQ ID Nrn. 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35 offenbarten Sequenzen einzelne Allelen der menschlichen und Maus-Zcyto10-Gene und -Polypeptide repräsentieren und dass erwartet wird, dass Allelvariation und alternatives Splicing geschehen werden. Allelvarianten können kloniert werden durch Sondieren von cDNA oder von genomischen Bibliotheken unterschiedlicher Individuen gemäß Standardvorgängen. Allelvarianten der in SEQ ID Nrn. 1, 3, 18 und 33 gezeigten DNA-Sequenzen, einschließlich jenen, die stumme Mutationen enthalten, und jenen, in denen Mutationen in Aminosäuresequenzänderungen resultieren, befinden sich innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Sequenz von Zcyto10 hat 7 Boten-Instabilitätsmotive in dem 3'-nicht-translatierten Bereich an den Positionen 706, 813, 855 und 906 der SEQ ID Nr. 1. Die Behandlung von Zellen, die Zcyto10 exprimieren, mit Cycloheximid kann diese Boteninstabilität erleichtern. Siehe G. Shaw et al., Cell, 46: 659–667 (1986). Weiterhin kann der AT-reiche 3'-nicht-translatierte Bereich genetisch geändert werden oder entfernt werden, um die Botenstabilität weiter zu fördern.
VERWENDUNG VON ZCYTO10, UM DIE WUNDHEILUNG ZU FÖRDERN
Die Daten von Beispiel 4 zeigen, dass Zcyto10 eine Rolle spielt bei der Wundheilung. Folglich kann Zcyto10 bei der Herstellung von Medikamenten verwendet werden, die auf eine Wunde oder Brandwunde aufgetragen werden, um die Wundheilung zu fördern. Zcyto10 kann systemisch in einer Dosierung von 1 bis 100 μg pro Kilogramm Gewicht des Individuums verabreicht werden. Zcyto10 kann auch auf eine Wunde mittels einer Salbe oder eines Unguentum aufgetragen werden, welche von 1 ng bis 1 mg Zcyto10 auf 1 g Salbe oder Unguentum enthalten. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996). Zcyto10 sollte auf eine gereinigte Wunde auf einer täglichen Basis bis die Wunde verheilt ist gegeben werden.
VERWENDUNG VON ZCYTO10, UM DIE BLUTPLÄTTCHENZAHL ZU ERHÖHEN
Wie unten in Beispiel 7 gesehen werden kann, haben wir entdeckt, dass Zcyto10 bei der Herstellung von Medikamenten verwendet werden kann, um die Blutplättchenzahl zu erhöhen. Dies ist besonders wichtig für Krebspatienten, die eine Thrombocytenverminderung wegen Chemotherapie oder Strahlungstherapie erfahren. Zcyto10 kann therapeutisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht werden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Klonieren von Zcyto10
Die Sequenzen in voller Länge von Zcyto10x1 (die längere Form) und von Zcyto10x2 (die kürzere Form) wurden unter Verwendung von 3'-RACE^® und durch das Unterbreiten von zwei Fragmenten, welche erzeugt wurden, um zu sequenzieren (SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11), dann durch artifizielles Splicen mit dem Computer der in SEQ ID Nr. 5 gezeigten est-Sequenz gemeinsam mit der überlappenden Sequenz aus den beiden 3'-RACE-Fragmenten, aufgeklärt.
Es wurde ein Oligo, zc15907 (SEQ ID Nr. 6), für den Bereich, der sich gerade stromaufwärts (5') des mutmaßlichen Methionins für Zcyto10 befindet, gestaltet. Weiter stromabwärts wurde ein anderes Oligo, zc15906 (SEQ ID Nr. 7), für den Bereich gestaltet, der sich gerade stromaufwärts der Signalsequenzspaltstelle befindet. Diese Oligos wurden bei den 3'-RACE-Reaktionen an menschlicher Trachea-Marathon-cDNA verwendet. ZC15907 wurde in der primären 3'-RACE-Reaktion verwendet und zc15906 wurde in der ineinander geschachtelten 3'-RACE-Reaktion verwendet. Die Marathon-cDNA wurde hergestellt unter Verwendung des Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA), gemäß den Anweisungen des Herstellers, ausgehend von menschlicher Luftröhren-mRNA, erworben von Clontech.
Die PCR-Reaktionen wurden gemäß den Instruktionen des Herstellers in dem Marathon cDNA Amplification Kit mit einigen Modifikationen in den Parametern der thermischen Zyklisierung laufen gelassen. Die in der primären PCR-Reaktion verwendeten Zyklusparameter waren:

94°C, 1 Minute 30 Sekunden: 1×

94°C, 15 Sekunden, 68°C, 1 Minute: 30×

72°C, 7 Minuten: 1×
Die in der ineinander geschachtelten PCR-Reaktion verwendeten Zyklusparameter waren:

94°C, 1 Minute 30 Sekunden: 1×

94°C, 15 Sekunden, 68°C, 1 Minute 20 Sekunden: 30×

72°C, 7 Minuten: 1×
Die resultierenden Produkte wurden auf 1,2%igen Agarosegel (Gibco Agarose) laufen gelassen und es wurden zwei Hauptbanden gesehen, die ungefähr 80 Basenpaare voneinander entfernt waren. Die Banden wurden ausgeschnitten und unter Verwendung von QIAEX^TM-Harz (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gel-gereinigt. Diese Fragmente wurden dann dem Sequenzieren ausgesetzt, wodurch ermöglicht wurde, dass die Sequenz von Zcyto10 in voller Länge unterschieden werden kann.
Beispiel 2
Northern-Blot-Analyse
Menschliche multiple Gewebeblots I, II, III und ein RNA Master Dot Blot (Clontech) wurden sondiert, um die Gewebeverteilung von Zcyto10 zu bestimmen. Ein 45-mer Gegensinnoligo, SEQ ID Nr. 9, wurde unter Verwendung der est-Sequenz (SEQ ID Nr. 5, bp 100–145) gestaltet und für die Sonde verwendet.
15 pm von SEQ ID Nr. 9 wurden mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Gibco-BRL) endmarkiert. Die Markierungsreaktion enthielt 2 μl 5 × Vorwärtskinasereaktionspuffer (Gibco-BRL), 1 μl T4-Kinase, 15 pm SEQ ID Nr. 9, 1 μl 6000 Ci/mMol ³²P Gamma-ATP (Amersham) und Wasser auf 10 μl. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nicht eingebaute Radioaktivität wurde mit einer NucTrap-Sondenreinigungssäule (NucTrap Probe Purification Column) (Stratagene) entfernt.
Mehrfache Gewebe-Northern-Blots und ein menschlicher RNA Master Blot (Clontech) wurden bei 50°C 3 Stunden in 10 ml ExpressHyb (Clontech) vorhybridisiert, welches 1 mg Lachssperma-DNA und 0,3 mg menschliche cot1-DNA (Gibco-BRL) enthielten, wobei beides 3 Minuten gekocht wurde, 2 Minuten auf Eis gekühlt und dann zu dem ExpressHyb hinzugefügt wurde. Hybridisierungen wurden über Nacht bei 50°C durchgeführt. Die anfänglichen Waschbedingungen waren wie folgt: 2 × SSC, 0,1% SDS RT für 40 Minuten mit etlichen Änderungen der Waschlösungen, dann 1 × SSC, 0,1% SDS bei 64°C (Tm-10) für 30 Minuten. Die Filter wurden dann einem Film für zwei Tage ausgesetzt.
Die Expression von Zcyto10 auf den Northern Blots zeigten eine ungefähr 1,2 kb große Bande in der Luftröhre, eine schwache 1,5 kb große Bande im Magen und noch schwächere Banden beider Größen im Pankreas. Die Dotblots zeigten die Anwesenheit von Zcyto10 in der Luftröhre, der Speicheldrüse, der Plazenta, dem Hoden, der Haut, der Prostatadrüse, der Nebenniere und der Schilddrüse.
In der Maus wurde sie in der Niere, der Skelettmuskulatur, der Speicheldrüse, der Leber und der Haut gefunden.
Beispiel 3
Chromosomale Zuordnung und Platzierung von Zcyto10
Zcyto10 wurde auf dem Chromosom 1 unter Verwendung der im Handel erhältlichen Version des "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) kartiert. Das "Standford G3 RH Panel" enthält PCR-fähige DNA aus jeder der 83 Strahlungshybridklone des gesamten menschlichen Genoms plus zwei Kontroll-DNAs (der RM-Donor und der A3-Empfänger). Ein öffentlich zugänglicher WWW-Server (http://shgc- www.stanford.edu) erlaubt die chromosomale Lokalisierung der Marker.
Für das Kartieren von Zcyto10 mit dem "Stanford G3 RH Panel" wurden 20 μl Reaktionsansätze in eine PCR-fähige 96-Well-Mikrotiterplatte (Stratagene, La Jolla, CA) gegeben und in einem "RoboCycler Gradient 96"-Thermocycler (Stratagene) verwendet. Jede der 85 PCR-Reaktionen bestand aus 2 μl 10 × KlenTaq PCR-Reaktionspuffer (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 μl dNTP-Mischung (jeweils 2,5 mM, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 μl Sinnprimer, SEQ ID Nr. 6, 5' ATT CCT AGC TCC TGT GGT CTC CAG 3', 1 μl Gegensinnprimer, SEQ ID Nr. 8, 5' TCC CAA ATT GAG TGT CTT CAG T 3', 2 μl "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 μl 50 × Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA aus einem einzelnen Hybridklon oder einer Kontrolle und x μl ddH₂O für ein Gesamtvolumen von 20 μl. Die Reaktionen wurden mit einer äquivalenten Menge Mineralöl überschichtet und verschlossen. Die PCR-Cycler-Bedingungen waren wie folgt: ein anfänglicher Zyklus mit 5-minütiger Denaturierung bei 95°C, 35 Zyklen mit 1-minütiger Denaturierung bei 95°C, 1 Minute Annealing bei 66°C und 1,5 Minuten Verlängerung bei 72°C, gefolgt von einem Abschlusszyklus der Verlängerung von 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionen wurden durch Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel (Life Technologies, Gaithersburg, MD) getrennt.
Die Ergebnisse zeigten die Kopplung von Zcyto10 an den Gerüstmarker SHGC-36215 mit einer LOD-Wertung von > 10 und in einem Abstand von 14.67cR_10000 von dem Marker. Die Verwendung von umgebenden Markern positioniert Zcyto10 in den lg32.2-Bereich der vervollständigten LDB-Karte des Chromosoms 1 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW-Server http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/
Beispiel 4
Verwendung von Zcyto10, um die Wundheilung zu fördern
Es wurden normale erwachsene weibliche Balb/C-Mäuse in der vorliegenden Untersuchung verwendet. Sie wurden in Tierpflegeeinrichtungen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und während der Studie wurde ihnen Wasser und Nagerlabornahrung ad libitum gegeben. Sie wurden von dem Tag der Operation an einzeln in einem Käfig gehalten.
Am Tag der Operation wurden die Tiere mit 104 mg/kg Ketamin (Vetalar, Aveco Inc., Ft. Doge, IA) plus 7 mg/kg Xylazin (Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KS) in steriler (0,2 μ-gefilterter) phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Das Haar auf ihren Rücken wurde geschoren und die Haut wurde mit NAIR^® (Carter-Wallace, New York, NY) enthaart und dann mit Wasser abgespült. Es wurde 100%iges Aloeveragel aufgetragen, um die alkalische Verbrennung der NAIR^®-Behandlung zu neutralisieren, dann wurden die Tiere auf Heizkissen mit zirkulierendem Wasser platziert, bis die Haut und das umgebende Fell trocken waren.
Die Tiere wurden dann mit Metofan (Pittman Moore, Mundelein, NJ) anästhesiert und der enthaarte Rücken wurde mit 70% Ethanol abgerieben. Vier Einstiche, jeder 0,5 cm im Quadrat, wurden durch die Haut und die Panniculus carnosus über den paravertebralen Bereich in der Höhe der Brustlendenwirbel gemacht. Die Wunden und die umgebende enthaarte Haut wurden mit einem adhäsiven, semipermeabel verschließenden Verband, BIOCLUSIVE^® (Johnson & Johnson, Arlington, TX) bedeckt. Die Schnittkante des Einschnittes wurde durch das BIOCLUSIVE^® auf transparentem Acetat nachgezeichnet für die spätere Beurteilung der Wundverschlussparameter.
Kontrollhaut und verwundete Haut zu unterschiedlichen Zeitpunkten (7 Stunden, 15 Stunden und 24 Stunden) wurden unter Verwendung des RNeasy-Midi-Kits von Qiagen bearbeitet. Kurz, Haut (Kontrolle und verwundete Bereiche) wurden gewogen und in einem geeigneten Volumen Lysepuffer (RLT) homogenisiert. Die Lysate wurden rotiert, um Gewebsdebris zu entfernen und ein gleiches Volumen an 70%igem Ethanol wurde zu den Lysaten hinzugefügt, gut vermischt und auf eine Säule geladen. Die Proben wurden 5 Minuten rotiert und einmal mit 3,8 ml RW1-Puffer gewaschen, dann zweimal mit RPE (2,5 ml jeweils). Die Gesamt-RNA wurden mit RNAse-freiem Wasser eluiert. Das Expressionsmaß der Hautproben wurde unter Verwendung von Echtzeit-PCR (Perkin Elmer ABI Prism 7700 Sequence Detector) gemessen.
Das Experiment wurde mit einer Nicht-Matrizen-Kontrolle, einem Satz an Standards und den Hautproben gestaltet. Für die Standardkurve wurde Gesamt-RNA aus Mäusenieren verwendet. In diesem Experiment wurden drei Sätze an Gesamt-RNA aus der Haut (25 mg) nach 7 Stunden (Kontrolle und Verwundete), 15 Stunden (Kontrolle und Verwundete) und 24 Stunden (Kontrolle und Verwundete) verwendet. Jede Probe wurde dreifach durch Einschritt-RT-PCR auf dem 7700-Sequenzdetektionsgerät durchgeführt. In diesem Experiment wurden der hauseigene Vorwärtsprimer SEQ ID Nr. 36, Rückwärtsprimer SEQ ID Nr. 37 und die TaqMan-Sonde von Perkin Elmer (ZG-7-FAM) verwendet. Die Bedingungen der Einschritt-RT-PCR waren wie folgt: (RT-Schritt) 48°C für 30 Minuten (40 Zyklen PCR-Schritt), 95°C für 10 Minuten, 95°C für 15 Sekunden, 60°C für 1 Minute.
Die Expressionsmaße von cyto10 in den Kontrollhautproben nach 7 Stunden und 15 Stunden lagen vergleichbar bei 2,46 ng/ml bzw. 2,61 ng/ml. Aus der Kontrollhautprobe nach 24 Stunden war das Expressionsmaß von cyto10 Null. Das Expressionsmaß von cyto10 aus verwundeter Haut nach 7 Stunden lag bei 5,17 ng/ml (ein mehr als zweifacher Anstieg im Vergleich zu der Kontrollprobe). Das Expressionsmaß von cyto10 aus verwundeter Haut nach 15 Stunden lag bei 14,45 ng/ml (ein 5,5-facher Anstieg im Vergleich zu der Kontrollprobe). Das Expressionsmaß von cyto10 aus verwundeter Haut nach 24 Stunden lag bei 5,89 ng/ml. Ein Wiederholungsexperiment, das auch eine negative Kontrolle (Hefe-tRNA) einschloss, ergab die ähnliche Tendenz und das Ergebnis der Hefe-tRNA war annähernd Null. Das Ergebnis legte nahe, dass die Amplifikation real war und mausspezifisch.
Diese Daten legen nahe, dass Zcyto10 eine Rolle bei der Reparatur von Wunden spielt, da das Expressionsmaß von Zcyto10 aus verwundeter Haut im Vergleich zu jenem der Kontrollprobe erhöht war und es stieg an und nahm ab in Abhängigkeit von der Zeit. Folglich kann Zcyto10 auf Wunden aufgetragen werden, um die Wundheilung zu fördern.
Beispiel 5
Transgene Mäuse
Es wurden transgene Mäuse mit exprimiertem Zcyto10 entweder unter dem Albumin- oder dem Metallothioninpromotor hergestellt. Bei der Geburt hatten etliche der Mäuse eine durchscheinende Erscheinung und eine eingeschränkte Bewegung. Die Haut dieser Mäuse war eng und verschrumpelt, etliche hatten auch ein dem Schnurhaar ähnliches Haar auf der Unterlippe. Die Bereiche der Nüstern und des Mauls, die Extremitäten und der Schwanz waren angeschwollen.
Eine transgene Maus, in welcher der Albuminpromotor verwendet worden war, überlebte bis zum Tag 3 und war stark wachstumsverzögert. Es gab keine Ohr-Entwicklung und die Entwicklung der Zehen war vermindert. Alle Tiere wurden geopfert, wenn sie an den Tagen 1, 2 oder 3 dem Tode geweiht waren. Es wurden Schwanz- und Leberproben gesammelt und sie wurden in situ in 10% neutralem Formalin fixiert, eingebettet in Paraffin und in 3 Mikrometer dicke Scheiben geschnitten und mit H&E gefärbt. Alle Mäuse mit diesem Phänotyp waren transgen und hatten eine niedrige bis hohe Expression von Zcyto10.
In der Mehrheit der Gewebe, mit Ausnahme der Haut, wurden keine signifikanten Änderungen beobachtet. Die Haut der Jungen, die Zcyto10 exprimierten, insbesondere jener Mäuse, die ein hohes Expressionsmaß von Zcyto10 hatten, neigte dazu, dicker zu sein als die der nicht exprimierenden Jungen. Das Stratum granulosum in diesen Jungen schien in der Dicke reduziert zu sein im Vergleich zu den nicht exprimierenden Jungen, wohingegen das Stratum spinosum dicker war wegen den vermehrten Zellschichten und/oder erhöhtem Zelldurchmesser.
Zusätzlich zu den Änderungen in der Epidermis war die Dermis einer Maus mit einer mittleren Expression von Zcyto10 herdweise durch Schleimmaterial mäßig erweitert.
Beispiel 6
Aufreinigung von Zcyto10 aus Zellkulturmedium
Zcyto10, produziert von CHO-Zellen, wurde aus dem Zellkulturmedium unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Verfahrens isoliert, das eine Kationenaustausch-Chromatographie und eine Größenausschluss-Chromatographie einschloss.
A. Kationenaustausch-Chromatographie-Schritt
Verwendete Materialien
Eine Säule mit einem Durchmesser (D) von 2,2 cm auf eine Höhe (H) von 6 cm (AMICON), gepackt mit einem SP-650M-Kationenaustauschharz, welches ein TOYOPEARL-Ionenaustauschharz mit kovalent gebundenen Sulfopropyl-(SP)-Gruppen ist.
Fünfzehn (15) Liter Kulturmedium aus Baby-Hamster-Nieren (BHK)-Zellen, die mit einem Zcyto10 enthaltenden Plasmid transfiziert worden waren, wurden gesammelt. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde auf einen pH-Wert von 5 mit 2 N HCl angepasst. Die oben beschriebene gepackte Säule wurde mit 50 mM Natriumacetat, NaAc, pH 5,0, äquilibriert. Das Kulturmedium wurde auf die Säule mit der Rate von 20 Säulenvolumina (cv) pro h bei ungefähr 8 ml/Min. beladen. Nachdem das Beladen erfolgt war, wurde die Säule mit 10 cv 50 mM NaAc, pH 5,0, gewaschen. Das Material auf der Säule wurde dann mit 20 cv NaCl-Gradienten in 50 mM NaAc, pH 5,0, eluiert. Der NaCl-Gradient erstreckte sich in einem Bereich von 0 bis 0,5 M NaCl. Dies konzentrierte das Material in dem Kulturmedium von 15 Liter auf 170 ml auf.
Die resultierende Ernte von 170 ml wurde weiter auf ungefähr 5 ml mit einem Zentrifugenkonzentrationsgerät mit einem Trennvermögen von 5 Tausend (Millipore, Inc., Bedford, MA) konzentriert.
B. Größenausschluss-(S-100)-Gelfiltrationsschritt
Verwendete Materialien
S-100-Gelsäule, 1,6 cm (Durchmesser) × 93 cm (Höhe) (Pharmacia, Piscataway, NJ)
Die Ernte von 5 ml wurde dann auf die oben beschriebene Säule, die das S-100-Gel enthielt, geladen. Die Säule wurde mit 5 × phosphatgepufferter Salzlösung äquilibriert, um den pH-Wert der Säule auf ungefähr 7,0 zu bringen. Zcyto10 wurde von den Verunreinigungen unter Verwendung von 1 × PBS bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. isoliert. Fraktionen wurden in Schritten von 2 ml gesammelt. Das Zcyto10-Polypeptid kam aus den Fraktionen 52–64 ungefähr 90 Minuten, nachdem die Elution gestartet worden war, heraus, wie bestimmt durch Natriumdodecylsulfat (SDS)- Polyacrylamidgel-Elektrophorese, welche mit Coomassie-Blau gefärbt worden war. Das Gel zeigte eine Bande bei dem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 14 kDa.
Beispiel 7
Klonieren von Maus-Zcyto10
Es wurden eine 5'- und 3'-Race an Mäusehaut-MARATHON-RACE^TM-cDNA unter Verwendung der PCR-Primer des 5'-MARATHON-RACE^TM-Primersatzes (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID Nr. 38, angeheftet an den MARATHON^TM-AP1-Adapter, verschachtelt mit SEQ ID Nr. 39, die an den AP2-MARATHON^TM-Adapter angeheftet ist, mit dem 3'-MARATHON-RACE^TM-Primersatz, SEQ ID Nr. 40, angeheftet an den MARATHON RACE^TM-AP1-Adaptor, verschachtelt mit SEQ ID Nr. 41, angeheftet an den MARATHON RACE^TM-AP2-Adaptor, durchgeführt. Etliche Fragmente aus diesen Reaktionen wurden gel-gereinigt und sequenziert, wodurch die Aufklärung der vollständigen Länge der kodierenden Sequenz von Maus-Zcyto10 plus einigen 5'- und 3'-UTR-Sequenzen ermöglicht wurde. Es wurden zwei Maus-Zcyto10-Varianten entdeckt, nämlich SEQ ID Nrn. 18 und 19, und SEQ ID Nrn. 33 und 34. Die Klone wurden durch PCR unter Verwendung von Primern der SEQ ID Nrn. 42 und 43 amplifiziert.
Beispiel 8
Adenovirusapplikation von Zcyto10 an normalen Mäusen

Zcyto10 wurde durch Adenovirus, das das Zcyto10-Gen enthielt, verabreicht. Es gab drei Gruppen an Mäusen, wie unten beschrieben. Das Adenovirus wurde intravenös in männliche und weibliche C57B1/6-Mäuse injiziert. Alle Mäuse erhielten Bromdesoxyuridin (BrdU) in ihrem Trinkwasser drei Tage vor der Schlachtung. Dies ermöglichte den Nachweis der Zellproliferation durch histologische Verfahren. Die gemessenen Parameter schlossen Gewichtsänderung, vollständige Blutzählungen, Serumchemie, Histologie, Organgewichte und Zellproliferation durch BrdU ein. Gestaltung der Experimente

Gruppe 1	Zcyto10X1 (SEQ ID Nr. 18)/pAC-CMV/Adv 1 × 10¹¹ Partikel/Dosis (9 weibliche, 9 männliche Tiere, geopfert am Tag 21) (2 weibliche, 2 männliche Tiere, geopfert am Tag 11) Gesamtzahl = 22 Mäuse
Gruppe 2	Null CMV/Adv-Kontrolle 1 × 10¹¹ Partikel/Dosis (10 weibliche, 10 männliche Tiere, geopfert am Tag 21) (2 weibliche, 2 männliche Tiere, geopfert am Tag 11) Gesamtzahl = 24 Mäuse
Gruppe 3	keine Behandlung (5 weibliche, 5 männliche) Gesamtzahl = 10

Ergebnisse
Die beeindruckendste Wirkung war der signifikante Anstieg in der Blutplättchenzahl, der in männlichen und weiblichen Mäusen, die mit Zcyto10-Adenovirus behandelt worden waren, im Vergleich zu der leeren Adenoviruskontrolle beobachtet wurde. Dieser war in männlichen Mäusen von einer Abnahme des Hämatokrits begleitet und von einem erhöhten Milz- und Lebergewicht. Das Thymusgewicht war in männlichen Mäusen ebenfalls erniedrigt. Im Gegensatz dazu zeigten mit Zcyto10-Adenovirus behandelte weibliche Mäuse signifikant erhöhte Zahlen an weißen Blutzellen, die hauptsächlich aus erhöhten Lymphocyten- und Neutrophilenzahlen im Vergleich zu der leeren Viruskontrolle bestanden.
Diese Ergebnisse legen nahe, das Hämatopoese durch die Zcyto10-Behandlung bewirkt wird, jedoch sind mit der Ausnahme für die erhöhte Blutplättchenzahl, die in beiden Geschlechtern bewirkt worden war, die anderen Wirkungen geschlechtsspezifisch.
Andere Wirkungen schlossen die Folgenden ein.
Die weiblichen Glukosespiegel waren in den behandelten Gruppen niedriger, wohingegen jene der männlichen Tiere keine signifikante Änderung zeigten.
Blutharnstoffstickstoff (BUN) war sowohl in den männlichen als auch in den weiblichen behandelten Gruppen höher.
Die weibliche alkalische Phosphatase war in der behandelten Gruppe höher, wohingegen die männlichen Tiere keine signifikante Änderung zeigten.
Die Blutplättchenzahlen waren sowohl in den männlichen als auch in den weiblichen behandelten Gruppen höher.
Die weiblichen Weiße-Blutzellen-Gesamtzahlen (WBC) waren in den behandelten Gruppen höher, wohingegen die männlichen Tiere keine signifikante Änderung zeigten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid zu mindestens 80% identisch ist mit einem oder mehreren Polypeptiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35, oder ein isoliertes Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 14, der SEQ ID Nr. 15, der SEQ ID Nr. 16, der SEQ ID Nr. 17, der SEQ ID Nr. 21, der SEQ ID Nr. 22, der SEQ ID Nr. 23, der SEQ ID Nr. 24, der SEQ ID Nr. 27, der SEQ ID Nr. 28, der SEQ ID Nr. 29, der SEQ ID Nr. 30, der SEQ ID Nr. 31 und der SEQ ID Nr. 32.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, das ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid zu mindestens 90% identisch ist mit einem oder mehreren Polypeptiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, worin das Polynucleotid ein Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, worin das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 1, der SEQ ID Nr. 3, der SEQ ID Nr. 18 und der SEQ ID Nr. 33.
Isoliertes Polypeptid zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35, oder ein isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 14, der SEQ ID Nr. 15, der SEQ ID Nr. 16, der SEQ ID Nr. 17, der SEQ ID Nr. 21, der SEQ ID Nr. 22, der SEQ ID Nr. 23, der SEQ ID Nr. 24, der SEQ ID Nr. 27, der SEQ ID Nr. 28, der SEQ ID Nr. 29, der SEQ ID Nr. 30, der SEQ ID Nr. 31 und der SEQ ID Nr. 32.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 5, das zu mindestens 90% identisch ist mit einem oder mehreren Polypeptiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 5, worin das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34 und der SEQ ID Nr. 35.
Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid bindet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 4, der SEQ ID Nr. 12, der SEQ ID Nr. 13, der SEQ ID Nr. 19, der SEQ ID Nr. 20, der SEQ ID Nr. 25, der SEQ ID Nr. 26, der SEQ ID Nr. 34, der SEQ ID Nr. 35, der SEQ ID Nr. 14, der SEQ ID Nr. 15, der SEQ ID Nr. 16, der SEQ ID Nr. 17, der SEQ ID Nr. 21, der SEQ ID Nr. 22, der SEQ ID Nr. 23, der SEQ ID Nr. 24, der SEQ ID Nr. 27, der SEQ ID Nr. 28, der SEQ ID Nr. 29, der SEQ ID Nr. 30, der SEQ ID Nr. 31 und der SEQ ID Nr. 32.
Anti-idiotypischer Antikörper, der an einen Antikörper nach Anspruch 8 bindet.
Expressionsvektor, umfassend: (a) einen Transkriptionspromoter; (b) ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1–4 oder ein DNS-Segment, kodierend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 5 bis 7; und (c) einen Transkriptionsterminator, worin der Promoter, das Nukleotid oder das DNS-Segment und der Terminator operativ verknüpft sind.
Kultivierte eukaryontische oder prokaryontische Zelle, in die ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 10 eingeführt worden ist, worin die Zelle ein von dem DNS-Segment kodiertes Polypeptid oder das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5–7 exprimiert.
Verwendung eines Polypeptids, das zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid ist, ausgewählt unter den SEQ ID der Nummern 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35, bei der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung, gekennzeichnet durch unpassende Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Cytokinproduktion.
Verwendung eines Polypeptids, das zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid ist, ausgewählt aus den SEQ ID der Nummern 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35, bei der Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung.
Verwendung eines Polypeptids, das zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid ist, ausgewählt aus den SEQ ID der Nummern 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35, bei der Herstellung eines Medikaments zum Erhalt oder zur Wundheilung tracheobronchialer Epithelzellen oder diesen unterliegenden Zellen.
Verwendung eines Polypeptids, das zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid ist, ausgewählt aus den SEQ ID der Nummern 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35, bei der Herstellung eines Medikaments zum Steuern tracheaspezifischer oder tracheobronchialspezifischer Anwendungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Steuern der Mucus-Produktion und der mucociliären Reinigung von Bruchstücken.
Verwendung eines Polypeptids, das zu mindestens 80% identisch mit einem Polypeptid ist, ausgewählt aus den SEQ ID der Nummern 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 und 35, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mikrobiellen oder viralen Infektion in einem Individuum durch Steigern der Plättchenproduktion des Individuums.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 8, bei einem diagnostischen in-vitro-Test zur Bestimmung der zirkulierenden Level an löslichem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5–7.